RU2754468C9 - Антитела к тикагрелору и способы применения - Google Patents
Антитела к тикагрелору и способы применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2754468C9 RU2754468C9 RU2017114645A RU2017114645A RU2754468C9 RU 2754468 C9 RU2754468 C9 RU 2754468C9 RU 2017114645 A RU2017114645 A RU 2017114645A RU 2017114645 A RU2017114645 A RU 2017114645A RU 2754468 C9 RU2754468 C9 RU 2754468C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- ticagrelor
- antigen
- binding fragment
- Prior art date
Links
- OEKWJQXRCDYSHL-FNOIDJSQSA-N Ticagrelor Chemical compound C1([C@@H]2C[C@H]2NC=2N=C(N=C3N([C@H]4[C@@H]([C@H](O)[C@@H](OCCO)C4)O)N=NC3=2)SCCC)=CC=C(F)C(F)=C1 OEKWJQXRCDYSHL-FNOIDJSQSA-N 0.000 title claims abstract description 339
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 title claims abstract description 335
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 335
- 229960002528 ticagrelor Drugs 0.000 title claims abstract description 297
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 159
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 78
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 71
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 46
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 43
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 37
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 206010018987 Haemorrhage Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 230000000740 bleeding Effects 0.000 claims abstract description 29
- 231100000319 bleeding Toxicity 0.000 claims abstract description 29
- 208000010110 Spontaneous Platelet Aggregation Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000000702 anti-platelet Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000001154 acute Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000035693 Fab Effects 0.000 claims description 114
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 103
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 71
- 101700027814 CDR3 Proteins 0.000 claims description 68
- -1 regadenosone Chemical compound 0.000 claims description 32
- OIRDTQYFTABQOQ-GAWUUDPSSA-N 9-β-D-XYLOFURANOSYL-ADENINE Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-GAWUUDPSSA-N 0.000 claims description 29
- OIRDTQYFTABQOQ-SXVXDFOESA-N Adenosine Natural products Nc1ncnc2c1ncn2[C@@H]3O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]3O OIRDTQYFTABQOQ-SXVXDFOESA-N 0.000 claims description 29
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 29
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 29
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 21
- 230000036499 Half live Effects 0.000 claims description 19
- 230000036809 Fabs Effects 0.000 claims description 16
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 12
- GRHYHJAAOJVRSZ-UHFFFAOYSA-N Pantoprazole Chemical compound COC1=CC=NC(CS(=O)C=2N=C3[CH]C(OC(F)F)=CC=C3N=2)=C1OC GRHYHJAAOJVRSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960005019 pantoprazole Drugs 0.000 claims description 12
- 229960001080 Cangrelor Drugs 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N Linezolid Chemical compound O=C1O[C@@H](CNC(=O)C)CN1C(C=C1F)=CC=C1N1CCOCC1 TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 10
- PAEBIVWUMLRPSK-IDTAVKCVSA-N [dichloro-[[[(2R,3S,4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-[6-(2-methylsulfanylethylamino)-2-(3,3,3-trifluoropropylsulfanyl)purin-9-yl]oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]methyl]phosphonic acid Chemical compound C1=NC=2C(NCCSC)=NC(SCCC(F)(F)F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)C(Cl)(Cl)P(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O PAEBIVWUMLRPSK-IDTAVKCVSA-N 0.000 claims description 10
- 229960003907 linezolid Drugs 0.000 claims description 10
- FAIIFDPAEUKBEP-UHFFFAOYSA-N 3-methyl 5-propan-2-yl 2-cyano-6-methyl-4-(3-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate Chemical compound COC(=O)C1=C(C#N)NC(C)=C(C(=O)OC(C)C)C1C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 FAIIFDPAEUKBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- RRGUKTPIGVIEKM-UHFFFAOYSA-N Cilostazol Chemical compound C=1C=C2NC(=O)CCC2=CC=1OCCCCC1=NN=NN1C1CCCCC1 RRGUKTPIGVIEKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- BOCUKUHCLICSIY-QJWLJZLASA-N Cyclothiazide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(S(N2)(=O)=O)=C1NC2C1[C@H](C=C2)C[C@H]2C1 BOCUKUHCLICSIY-QJWLJZLASA-N 0.000 claims description 7
- QQODLKZGRKWIFG-QSFXBCCZSA-N Cyfluthrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](C=C(Cl)Cl)[C@H]1C(=O)O[C@@H](C#N)C1=CC=C(F)C(OC=2C=CC=CC=2)=C1 QQODLKZGRKWIFG-QSFXBCCZSA-N 0.000 claims description 7
- YMTINGFKWWXKFG-UHFFFAOYSA-N Fenofibrate Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C(=O)OC(C)C)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 YMTINGFKWWXKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960002297 Fenofibrate Drugs 0.000 claims description 7
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N Lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 claims description 7
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N Simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 claims description 7
- 229960004588 cilostazol Drugs 0.000 claims description 7
- 229960003176 cyclothiazide Drugs 0.000 claims description 7
- 229960001591 cyfluthrin Drugs 0.000 claims description 7
- 229960004844 lovastatin Drugs 0.000 claims description 7
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 claims description 7
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 claims description 7
- 229960005366 nilvadipine Drugs 0.000 claims description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 claims description 7
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N Bucladesine Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N 0.000 claims description 6
- 229960005263 bucladesine Drugs 0.000 claims description 6
- 229960001456 Adenosine Triphosphate Drugs 0.000 claims description 5
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 13
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 abstract description 12
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 4
- 230000003472 neutralizing Effects 0.000 abstract description 4
- 200000000002 platelet activation Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 abstract description 3
- 229960004676 ANTITHROMBOTIC AGENTS Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 91
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 91
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 90
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 73
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 71
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 43
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 37
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 34
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 31
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 description 31
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 27
- STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 24
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 24
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 23
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 21
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 20
- GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Threonine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 19
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 18
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 18
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 18
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 18
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N (2S)-1-[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 16
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 16
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 16
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 16
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 15
- LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO LDEBVRIURYMKQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 15
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 15
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 15
- 239000002609 media Substances 0.000 description 15
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 15
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 15
- VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Asparagine Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 14
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N L-tyrosyl-L-tyrosine Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 14
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 13
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 13
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 12
- PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 12
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 12
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 12
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 12
- CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O CKHWEVXPLJBEOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 12
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 12
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 12
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 12
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 12
- 210000004623 Platelet-Rich Plasma Anatomy 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 11
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 10
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 10
- HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N Asn-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HZYFHQOWCFUSOV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 10
- QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 10
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 10
- BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfizole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 10
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 10
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 10
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N (+)-methoprene Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 9
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 9
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine zwitterion Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 9
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 2-[[2-[[(2S)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 8
- PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N Arg-Gln Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N Gln-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 8
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 8
- YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N Ser-His Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 8
- VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N Val-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VEYJKJORLPYVLO-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 8
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 8
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 8
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 8
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 8
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 8
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 7
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 7
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 7
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 7
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 7
- GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N Europium cryptate Chemical compound [Eu+3].N=1C2=CC=CC=1CN(CC=1N=C(C=CC=1)C=1N=C(C3)C=CC=1)CC(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1C(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1CN3CC1=CC=CC2=N1 GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 7
- MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 7
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 7
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 7
- HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 7
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 7
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 7
- FFOKMZOAVHEWET-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Cysteine Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091006031 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000034387 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 7
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 7
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 230000002441 reversible Effects 0.000 description 7
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 7
- UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Serine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O UKKNTTCNGZLJEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KHTIUAKJRUIEMA-HOUAVDHOSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 KHTIUAKJRUIEMA-HOUAVDHOSA-N 0.000 description 6
- 125000005913 (C3-C6) cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 6
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N His-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 6
- DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Threonine Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine zwitterion Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N Met-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 6
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 6
- LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N Threoninyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)O LUMXICQAOKVQOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 6
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 6
- 108010044655 lysylproline Proteins 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 6
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 6
- NJMYZEJORPYOTO-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Proline Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O NJMYZEJORPYOTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N (2S)-2-[[(2S)-2,5-diamino-5-oxopentanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FAQVCWVVIYYWRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N (2S,3S)-2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)CNC(=O)C[NH3+] XMPXVJIDADUOQB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 5
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 5
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N Asp-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 5
- NTQDELBZOMWXRS-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N BNC210 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 BVRPESWOSNFUCJ-LKTVYLICSA-N 0.000 description 5
- 230000037227 Blood Loss Effects 0.000 description 5
- WXOFKRKAHJQKLT-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS WXOFKRKAHJQKLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 5
- 102000005632 Single-Chain Antibodies Human genes 0.000 description 5
- 108010070144 Single-Chain Antibodies Proteins 0.000 description 5
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 5
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 5
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 5
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 5
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 5
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 5
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 5
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]-4-[[(1S)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BUDNAJYVCUHLSV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 4
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- HAYVTMHUNMMXCV-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Alanine Chemical compound OC(=O)C(C)NC(=O)C(N)CS HAYVTMHUNMMXCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N His-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CN=CN1 LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 4
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 4
- LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N Leu-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N 0.000 description 4
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N N,N-Diethylethanamine Substances CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- LZPZPHGJDAGEJZ-AKAIJSEGSA-N Regadenoson Chemical compound C1=C(C(=O)NC)C=NN1C1=NC(N)=C(N=CN2[C@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C2=N1 LZPZPHGJDAGEJZ-AKAIJSEGSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 4
- MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 4
- QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Aspartate Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Serine Chemical compound OCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000002605 anti-dotal Effects 0.000 description 4
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 4
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 230000000271 cardiovascular Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- ALBYIUDWACNRRB-UHFFFAOYSA-N hexanamide Chemical compound CCCCCC(N)=O ALBYIUDWACNRRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 4
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutic aid Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 4
- 229960003614 regadenoson Drugs 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 4
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N val-gly Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000006700 (C1-C6) alkylthio group Chemical group 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NJDNDJPFOPBMTJ-UHFFFAOYSA-N 5-cyclopentyl-2H-triazolo[4,5-d]pyrimidine Chemical compound C1CCCC1C1=NC=C(NN=N2)C2=N1 NJDNDJPFOPBMTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N MeOtBu Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001322 Periplasm Anatomy 0.000 description 3
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 238000002297 emergency surgery Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 3
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 3
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 230000000275 pharmacokinetic Effects 0.000 description 3
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 3
- 125000004035 thiopropyl group Chemical group [H]SC([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000001732 thrombotic Effects 0.000 description 3
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- RSMIHCFQDCVVBR-CIUDSAMLSA-N (2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RSMIHCFQDCVVBR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N (2S)-2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]-4-methylpentanoate Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N (2S)-5-amino-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 1,3-Propanediol Chemical compound OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 1,4-Butanediol Chemical compound OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 2
- QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N Asn-Gln Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 229940086777 Brilinta Drugs 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 2
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 2
- 229920000453 Consensus sequence Polymers 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000463291 Elga Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methane sulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100014838 FCGRT Human genes 0.000 description 2
- 101710003435 FCGRT Proteins 0.000 description 2
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Aspartate Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 2
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 2
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N Lysyl-Asparagine Chemical compound NCCCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- JMEWFDUAFKVAAT-UHFFFAOYSA-N Methionyl-Asparagine Chemical compound CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O JMEWFDUAFKVAAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010125 Myocardial Infarction Diseases 0.000 description 2
- IHBHOVMTNFYYLE-FRSDEHEHSA-N NC1=C2N=CN(C2=NC=N1)[C@H]1[C@@H]([C@@H]([C@H](O1)CNC(CCCCCNC(CCCCCNC(CCCC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(N[C@@H]21)=O)=O)=O)=O)O)O Chemical compound NC1=C2N=CN(C2=NC=N1)[C@H]1[C@@H]([C@@H]([C@H](O1)CNC(CCCCCNC(CCCCCNC(CCCC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(N[C@@H]21)=O)=O)=O)=O)O)O IHBHOVMTNFYYLE-FRSDEHEHSA-N 0.000 description 2
- IDCFBDOEWGNZGE-FNOIDJSQSA-N NCCO[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](C1)N1N=NC2=C1N=C(N=C2N[C@H]1[C@@H](C1)C1=CC(=C(C=C1)F)F)SCCC)O)O Chemical compound NCCO[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](C1)N1N=NC2=C1N=C(N=C2N[C@H]1[C@@H](C1)C1=CC(=C(C=C1)F)F)SCCC)O)O IDCFBDOEWGNZGE-FNOIDJSQSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 description 2
- 108020005203 Oxidases Proteins 0.000 description 2
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M Potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 2
- UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N Ser-Gln Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Lysine Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO SBMNPABNWKXNBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N Thr-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KAFKKRJQHOECGW-JCOFBHIZSA-N 0.000 description 2
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N Trp-Val Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LWFWZRANSFAJDR-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- OYOQKMOWUDVWCR-RYUDHWBXSA-N Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OYOQKMOWUDVWCR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N Val-Gln Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O XXDVDTMEVBYRPK-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- XNOBOKJVOTYSJV-KQYNXXCUSA-N [[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-amino-2-methylsulfanylpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C12=NC(SC)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XNOBOKJVOTYSJV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 201000001320 atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atoms Chemical group C* 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 201000008739 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000001082 cryoprotectant Effects 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 2
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 2
- 230000002354 daily Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N gly ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N gly-val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 108010078326 glycyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 2
- 108010033719 glycyl-histidyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011068 load Methods 0.000 description 2
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N n-butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N n-heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 125000001820 oxy group Chemical group [*:1]O[*:2] 0.000 description 2
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 108060006184 phycobiliprotein family Proteins 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 2
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 229910052904 quartz Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000002165 resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001187 sodium carbonate Substances 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N α-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (-)-propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- ATYCFNRXENKXSE-MHPIHPPYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[6-[5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ATYCFNRXENKXSE-MHPIHPPYSA-N 0.000 description 1
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N (2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-(carboxymethylamino)-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CJNPEPJBIHGEMU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-6-chloro-1H-indol-3-yl) phosphate Chemical compound ClC1=C(Br)C=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 CJNPEPJBIHGEMU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N 1,6-Hexanediol Chemical compound OCCCCCCO XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 2-((2,6-Dichlorophenyl)imino)imidazolidine Chemical compound ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=NCCN1 GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 2-[[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WLEOHEIRUFTYCF-FYEBJQQMSA-N 2-[[(3aR,4S,6R,6aS)-6-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-difluorophenyl)cyclopropyl]amino]-5-propylsulfanyltriazolo[4,5-d]pyrimidin-3-yl]-2,2-dimethyl-4,5,6,6a-tetrahydro-3aH-cyclopenta[d][1,3]dioxol-4-yl]oxy]ethanol Chemical compound C1([C@@H]2C[C@H]2NC=2N=C(N=C3N([C@H]4[C@@H]5OC(C)(C)O[C@@H]5[C@@H](OCCO)C4)N=NC3=2)SCCC)=CC=C(F)C(F)=C1 WLEOHEIRUFTYCF-FYEBJQQMSA-N 0.000 description 1
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-Aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CN=C2[C]1C(Cl)=C(Br)C=C2 BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- KKJUPNGICOCCDW-UHFFFAOYSA-N 7-N,N-Dimethylamino-1,2,3,4,5-pentathiocyclooctane Chemical compound CN(C)C1CSSSSSC1 KKJUPNGICOCCDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGJLVQRLOVOJRF-WOUKDFQISA-N 9-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(aminomethyl)-2,2-dimethyl-3a,4,6,6a-tetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl]purin-6-amine Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](CN)[C@H]2OC(C)(C)O[C@H]21 RGJLVQRLOVOJRF-WOUKDFQISA-N 0.000 description 1
- 230000035533 AUC Effects 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010000891 Acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 XZWXFWBHYRFLEF-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 210000000702 Aorta, Abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 206010003246 Arthritis Diseases 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RGGVDKVXLBOLNS-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CC(N)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 RGGVDKVXLBOLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 239000005552 B01AC04 - Clopidogrel Substances 0.000 description 1
- 101700028102 BAGBG Proteins 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N Bis-tris methane Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000008787 Cardiovascular Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 1
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 1
- 229960003009 Clopidogrel Drugs 0.000 description 1
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N Clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108090000056 Complement Factor B Proteins 0.000 description 1
- 102000003712 Complement Factor B Human genes 0.000 description 1
- 208000004981 Coronary Disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004351 Coronary Vessels Anatomy 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010010349 Cytochrome Reductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N DCM Dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N DMSO dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 208000009190 Disseminated Intravascular Coagulation Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010015776 EC 1.1.3.4 Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 108091003147 Electron Transport Complex IV Proteins 0.000 description 1
- 102000011686 Electron Transport Complex IV Human genes 0.000 description 1
- 206010014498 Embolic stroke Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N EtOAc EtOAc Chemical compound CCOC(C)=O.CCOC(C)=O OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036826 Excretion Effects 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 229940116332 GLUCOSE OXIDASE Drugs 0.000 description 1
- 102100004985 GUSB Human genes 0.000 description 1
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N Gln-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JEFZIKRIDLHOIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 101710027122 H2B.10 Proteins 0.000 description 1
- 101700042506 HIRUD Proteins 0.000 description 1
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 206010062506 Heparin-induced thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 Hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940006607 Hirudin Drugs 0.000 description 1
- VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CN=CN1 VLDVBZICYBVQHB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102000015434 Humanized Monoclonal Antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108010064750 Humanized Monoclonal Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- 206010021972 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 210000004731 Jugular Veins Anatomy 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N L-tyrosyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N Luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 Lymphoid Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012359 Methanesulfonyl chloride Substances 0.000 description 1
- 206010027599 Migraine Diseases 0.000 description 1
- 208000008085 Migraine Disorders Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- 206010028576 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- AUROAXNTNOOGNL-FYEBJQQMSA-N N(=[N+]=[N-])CCO[C@H]1C[C@H]([C@H]2[C@@H]1OC(O2)(C)C)N1N=NC2=C1N=C(N=C2N[C@H]1[C@@H](C1)C1=CC(=C(C=C1)F)F)SCCC Chemical compound N(=[N+]=[N-])CCO[C@H]1C[C@H]([C@H]2[C@@H]1OC(O2)(C)C)N1N=NC2=C1N=C(N=C2N[C@H]1[C@@H](C1)C1=CC(=C(C=C1)F)F)SCCC AUROAXNTNOOGNL-FYEBJQQMSA-N 0.000 description 1
- 102100000864 NPIPA1 Human genes 0.000 description 1
- 101710016016 NPIPA1 Proteins 0.000 description 1
- 108010061543 Neutralizing Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 208000000770 Non-ST Elevated Myocardial Infarction Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 239000002172 P2Y12 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035980 PAA Effects 0.000 description 1
- 101710038792 PALG1 Proteins 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N PMSF Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220419227 PTRHD1 D92L Human genes 0.000 description 1
- 229940055729 Papain Drugs 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 208000005764 Peripheral Arterial Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010062585 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034636 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 229940072417 Peroxidase Drugs 0.000 description 1
- 108090000437 Peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JWBLQDDHSDGEGR-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 229960004063 Propylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 208000006117 ST Elevation Myocardial Infarction Diseases 0.000 description 1
- 102220460541 SVBP T47D Human genes 0.000 description 1
- 210000003752 Saphenous Vein Anatomy 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000007056 Sickle Cell Anemia Diseases 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N TFA trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N Thr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 208000005485 Thrombocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010043647 Thrombotic stroke Diseases 0.000 description 1
- 229940086772 Ticagrelor 90 MG Drugs 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010044390 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- IMMPMHKLUUZKAZ-WMZOPIPTSA-N Trp-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 IMMPMHKLUUZKAZ-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- UBAQSAUDKMIEQZ-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UBAQSAUDKMIEQZ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 1
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 208000010019 Vascular System Injury Diseases 0.000 description 1
- 206010047116 Vascular inflammations Diseases 0.000 description 1
- 206010027701 Vascular injury Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010062173 Venoocclusive disease Diseases 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine group Chemical group [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12 OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- 230000002009 allergen Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminum Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 1
- 230000000111 anti-oxidant Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002216 antistatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 1
- 238000002838 bio layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002612 cardiopulmonary Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 101700018328 ccdB Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 1
- 201000000522 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 238000010549 co-Evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000005712 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 125000004212 difluorophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide DMF Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N dioxetane Chemical class C1COO1 BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002618 extracorporeal membrane oxygenation Methods 0.000 description 1
- 235000020828 fasting Nutrition 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic Effects 0.000 description 1
- 238000007453 hemicolectomy Methods 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic Effects 0.000 description 1
- 201000001066 hemolytic-uremic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatoms Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 101700002672 his-22 Proteins 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-UHFFFAOYSA-N hydrogen atom Chemical compound [H] YZCKVEUIGOORGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005399 mechanical ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 125000002816 methylsulfanyl group Chemical group [H]C([H])([H])S[*] 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000926 neurological Effects 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atoms Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic Effects 0.000 description 1
- 230000036231 pharmacokinetics Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920001888 polyacrylic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 1
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational Effects 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003334 potential Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary Effects 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000000268 renotropic Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003530 single readout Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atoms Chemical group 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000005469 synchrotron radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 1
- WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran THF Chemical compound C1CCOC1.C1CCOC1 WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052716 thallium Inorganic materials 0.000 description 1
- BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N thallium Chemical compound [Tl] BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic Effects 0.000 description 1
- 201000007023 thrombotic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 108020003112 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon(0) Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к области иммунологии, в частности к антителам, которые специфически связываются с тикагрелором или активным метаболитом тикагрелора. Предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с тикагрелором или его активным метаболитом с IC50, равным около 100 нМ или ниже, и нейтрализуют его антитромбоцитарное действие. Предложены также молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектор экспрессии, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, клетка-хозяин для получения вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащая вектор. Антитело ингибирует действие или связывание тикагрелора или его активного метаболита с рецептором P2Y12, а также обеспечивает активацию ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов у пациента. Антитела являются применимыми в терапевтических способах для нейтрализации активности ингибиторов активации, агрегации и грануляции тромбоцитов, активаторов дезагрегации тромбоцитов и антитромботических средств, например, в способах лечения или профилактики острого кровотечения у пациента, которому вводили тикагрелор, или у пациента, который подвергался хирургическому вмешательству и которому вводили тикагрелор. 12 н. и 17 з.п. ф-лы, 12 ил., 9 табл., 14 пр.
Description
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[0001] Данная заявка включает посредством ссылки перечень последовательностей, поданный с настоящей заявкой в машино-читаемой форме (CRF) в виде текстового файла под названием "Ticagrelor_SeqList_ST25.TXT", созданного 1 октября 2014 года и имеющего размер 33900 байт.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Тикагрелор (BRILINTA™, BRILIQUE™) представляет собой активный при пероральном введении циклопентилтриазолопиримидин, селективный и обратимо связывающий антагонист рецепторов аденозиндифосфата (ADP). Было подтверждено, что у пациентов с острыми коронарными синдромами (ACS) прием 90 мг тикагрелора два раза в день в комбинации с низкой дозой аспирина приводит к уменьшению основных сердечно-сосудистых (CV) патологий. Тикагрелор оказывает действие по двойному пути, который опосредует как антитромбоцитарное действие (P2Y12), так и усиленный ответ на аденозин (ENT-1)(Cattaneo M et al. 2014. J Am Coll Cardiol. 63(23):2503-9). Хотя и не существует утвержденных критериев, в продолжающихся в настоящее время и запланированных исследованиях оценивают тикагрелор в отношении уменьшения частоты возникновения основных CV патологий у пациентов с первичным инфарктом миокарда, установленной болезнью периферических артерий и острым инсультом, а также у пациентов с сахарным диабетом и подтвержденным коронарным атеросклерозом.
[0003] Тикагрелор имеет два основных метаболита, активный метаболит тикагрелора (TAM) и неактивный метаболит тикагрелора (TIM)(Teng et al. 2010 Drug Metab. and Dispos. 38:1514-1521). TAM, также известный как AR-C124910XX, представляет собой основной циркулирующий метаболит тикагрелора и в равной степени эффективен в плане антагонистической активности по отношению к P2Y12. Как правило, TAM присутствует в количестве приблизительно 30-40% от концентрации исходного тикагрелора у пациентов, принимающих BRILINTA/BRILIQUE. Тикагрелор и TAM имеют периоды полувыведения из крови в 8 и 12 часов соответственно. TIM, также известный как AR-C133913XX, представляет собой неактивный агонист P2Y12, который составляет <10% от исходного тикагрелора, при этом его невозможно выявить через 8 часов, и он представляет собой основной метаболит, экскретируемый из организма с мочой.
[0004] Исследование "ингибирование тромбоцитов и результаты лечения пациентов" (PLATO) продемонстрировало более высокую эффективность тикагрелора без повышения случаев общего серьезного кровотечения в сравнении с клопидогрелем у обширной группы пациентов с ACS (UA, NSTEMI, STEMI) вне зависимости от стратегии ведения лечения (медикаментозного или с применением инвазивных процедур)(Wallentin et al. 2009 NEJM 361 (11): 1045-1057). Однако, как и в отношении всех антитромбоцитарных средств, у пациентов, использующих тикагрелор, существует вероятность кровотечения. Если у пациентов, получающих лечение с использованием двойной антитромбоцитарной терапии (DAPT), возникает тяжелое кровотечение, то существующие варианты лечения ограничены. Если эпизод кровотечения возникает у пациента с DAPT, то в попытке усиления гемостаза можно применять переливание тромбоцитов или введение факторов коагуляции. Однако на текущий момент не существует клинических данных, которые дают оценку, с точки зрения гемостатического преимущества, переливанию тромбоцитов или применению рекомбинантного фактор VIIa после или во время случаев серьезного кровотечения у субъектов, принимающих тикагрелор(Dalén M et al. 2013 J Cardiothorac Vasc Anesth. 27(5):e55-7).
[0005] Соответственно, доступность антидота, такого как специфичное к тикагрелору нейтрализующее антитело, предоставило бы лучшее клиническое ведение лечения с балансом между необходимым антитромботическим эффектом и контролем кровотечения. Поскольку тикагрелор представляет собой единственный реализуемый на рынке обратимо связывающий ингибитор тромбоцитов, антитело может обеспечить обратимость ингибирования тромбоцитов без потребности в переливании свежих тромбоцитов, предупреждая таким образом опасные явления, связанные с переливаниями тромбоцитов. Доступность средства, которое устраняет ингибирование ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов, обусловленной тикагрелором и TAM, будет удовлетворять важную нерешенную клиническую потребность, например, у пациентов с серьезным кровотечением или которые требуют неотложного хирургического вмешательства.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО РАСКРЫТИЯ
[0006] В одном аспекте данное раскрытие относится к антителу, которое специфически связывает циклопентилтриазолопиримидиновое соединение формулы (Ia):
где
R1 выбран из группы, состоящей из C1-C6алкокси и C1-C6алкилтио;
R2 выбран из группы, состоящей из H, C1-C6алкила, замещенного C1-C6алкила, C3-C6циклоалкила и замещенного C3-C6циклоалкила; и
R3 выбран из группы, состоящей из H, C1-C6алкила, C1-C6алкокси и C1-C6алканола.
[0007] В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с эпитопом в пределах части соединений, обозначенной квадратными скобками как формула (IIa),
где R1, R2, и R3 определены выше.
[0008] В дополнительных вариантах осуществления антитело связывается с эпитопом в пределах части соединений, обозначенной квадратными скобками как формула (IIIa),
где R2 и R3 определены выше, и R'1 выбран из групп, состоящей из C1-C4алкила.
[0009] В дополнительных вариантах осуществления антитело связывается с соединением, выбранным из группы, состоящей из:
[0010] В дополнительных вариантах осуществления указанных выше аспектов и вариантов осуществления антитело или его фрагмент содержит последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, и SEQ ID NO:72; и последовательность вариабельного участка легкой цепи (VL), выбранную из группы, состоящей изSEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, и SEQ ID NO:77. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит комбинацию последовательностей VH и VL, выбранную из группы, состоящей изSEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:42 и SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:67; и SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:77. В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит комбинацию VH и VL, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:67; и SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:77.
[0011] В дополнительных вариантах осуществления указанных выше аспектов и вариантов осуществления антитело или его фрагмент содержит каркасные участки (FR) и определяющие комплементарность участки (CDR) 1, 2, и 3 вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи, где последовательности CDR1, CDR2, и CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи предусматривают SEQ ID NO:3 (CDR1), SEQ ID NO:4 (CDR2), и SEQ ID NO:5 (CDR3); SEQ ID NO:13 (CDR1), SEQ ID NO:14 (CDR2), и SEQ ID NO:15 (CDR3); SEQ ID NO:23 (CDR1), SEQ ID NO:24 (CDR2), и SEQ ID NO:25 (CDR3); SEQ ID NO:33 (CDR1), SEQ ID NO:34 (CDR2), и SEQ ID NO:35 (CDR3); SEQ ID NO:43 (CDR1), SEQ ID NO:44 (CDR2), и SEQ ID NO:45 (CDR3); SEQ ID NO:53 (CDR1), SEQ ID NO:54 (CDR2), и SEQ ID NO:55 (CDR3); SEQ ID NO:63 (CDR1), SEQ ID NO:64 (CDR2), и SEQ ID NO:65 (CDR3); или SEQ ID NO:73 (CDR1), SEQ ID NO:74 (CDR2), и SEQ ID NO:75 (CDR3); и где последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного участка легкой цепи предусматривают SEQ ID NO:8 (CDR1), SEQ ID NO:9 (CDR2), и SEQ ID NO:10 (CDR3); SEQ ID NO:18 (CDR1), SEQ ID NO:19 (CDR2), и SEQ ID NO:20 (CDR3); SEQ ID NO:28 (CDR1), SEQ ID NO:29 (CDR2), и SEQ ID NO:30 (CDR3); SEQ ID NO:38 (CDR1), SEQ ID NO:39 (CDR2), и SEQ ID NO:40 (CDR3); SEQ ID NO:48 (CDR1), SEQ ID NO:49 (CDR2), и SEQ ID NO:50 (CDR3); SEQ ID NO:58 (CDR1), SEQ ID NO:59 (CDR2), и SEQ ID NO:60 (CDR3); SEQ ID NO:68 (CDR1), SEQ ID NO:69 (CDR2), и SEQ ID NO:70 (CDR3); или SEQ ID NO:78 (CDR1), SEQ ID NO:79 (CDR2), и SEQ ID NO:80 (CDR3). В дополнительных вариантах осуществления антитело содержит комбинацию участков CDR, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO:53 (VH CDR1), SEQ ID NO:54 (VH CDR2), SEQ ID NO:55 (VH CDR3), SEQ ID NO:58 (VL CDR1), SEQ ID NO:59 (VL CDR2), и SEQ ID NO:60 (VL CDR3); SEQ ID NO:63 (VH CDR1), SEQ ID NO:64 (VH CDR2), SEQ ID NO:65 (VH CDR3), SEQ ID NO:68 (VL CDR1), SEQ ID NO:69 (VL CDR2), и SEQ ID NO:70 (VL CDR3); и SEQ ID NO:73 (VH CDR1), SEQ ID NO:74 (VH CDR2), SEQ ID NO:75 (VH CDR3), SEQ ID NO:78 (VL CDR1), SEQ ID NO:79 (VL CDR2), и SEQ ID NO:80 (VL CDR3).
[0012] В указанных выше аспекте и вариантах осуществления антитело выбрано из поликлонального антитела, моноклонального антитела, гуманизированного антитела, антитела человека, одноцепочечного Fv (scFv), однодоменного антитела, Fab, F(ab')2, одноцепочечного диатела, миметика антитела и вариабельного домена антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело предусматривает scFv. В некоторых вариантах осуществления антитело предусматривает Fab.
[0013] В некоторых вариантах осуществления антитело, описанное выше, связывается с тикагрелором или активным метаболитом тикагрелора (TAM).
[0014] В дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное при IC50, составляющей приблизительно 200 нМ или ниже. В других дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное при IC50, составляющей от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 нМ, или при IC50, составляющей от приблизительно 10 нМ до приблизительно 1 нМ.
[0015] В дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное с Kd, составляющей приблизительно 50 нМ или ниже. В других дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное с Kd в диапазоне от приблизительно 250 пМ до приблизительно 1 пМ или в диапазоне от приблизительно 100 пМ до приблизительно 1 пМ.
[0016] В дополнительных вариантах осуществления антитело связывает тикагрелор или его метаболит или производное и не связывается с соединением, выбранным из группы, состоящей из фенофибрата, нилвадипина, цилостазола, букладезина, регаденозона, циклотиазида, цифлутрина, ловастатина, линезолида, симвастатина, кангрелора, пантопразола, аденозина, аденозиндифосфата, аденозинтрифосфата, 2-MeS-аденозиндифосфата и 2-MeS-аденозинтрифосфата. В вариантах осуществления антитело не ингибирует активность соединения, выбранного из группы, состоящей из фенофибрата, нилвадипина, цилостазола, букладезина, регаденозона, циклотиазида, цифлутрина, ловастатина, линезолида, симвастатина, кангрелора, пантопразола, аденозина, аденозиндифосфата, аденозинтрифосфата, 2-MeS-аденозиндифосфата и 2-MeS-аденозинтрифосфата. В дополнительных вариантах осуществления антитело характеризуется IC50, составляющей по меньшей мере приблизительно 1000 мкM по отношению к соединению, выбранному из группы, состоящей из фенофибрата, нилвадипина, цилостазола, букладезина, регаденозона, циклотиазида, цифлутрина, ловастатина, линезолида, симвастатина, кангрелора, пантопразола, аденозина, аденозиндифосфата, аденозинтрифосфата, 2-MeS-аденозиндифосфата и 2-MeS-аденозинтрифосфата.
[0017] В некоторых вариантах осуществления антитело имеет время полужизни in vivo, составляющее приблизительно 4-12 часов. В определенных вариантах осуществления антитело имеет время полужизни in vivo, составляющее приблизительно 12 часов.
[0018] В некоторых вариантах осуществления антитело нейтрализует антитромбоцитарное действие тикагрелора или активного метаболита тикагрелора. В дополнительных вариантах осуществления антитело нейтрализует антитромбоцитарное действие тикагрелора или активного метаболита тикагрелора в течение приблизительно 60 минут после введения.
[0019] В некоторых вариантах осуществления антитело имеет скорость диссоциации по отношению к тикагрелору или активному метаболиту тикагрелора, что допускает возобновление терапии, включающей тикагрелор.
[0020] В других аспектах настоящее раскрытие предлагает способ лечения острого кровотечения у пациента, нуждающегося в лечении, включающий введение пациенту эффективного количества антитела, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления способа пациент подвергался или подвергается хирургическое вмешательство и ему был введен тикагрелор. В некоторых вариантах осуществления способа пациент нуждается в неотложной помощи и/или неотложной травматологической помощи.
[0021] Другие аспекты настоящего раскрытия предлагают композицию, содержащую антитело по любому из предыдущих аспектов и вариантов осуществления в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
[0022] Некоторые дополнительные аспекты предлагают молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по любому из предыдущих пунктов. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71, и SEQ ID NO:76.
[0023] Дополнительные аспекты настоящего раскрытия предлагают композиции, векторы и клетки-хозяева, которые могут содержать по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композиции, векторы и клетки-хозяева содержат первую молекулу нуклеиновой кислоты и вторую молекулу нуклеиновой кислоты, которые кодируют один или несколько белков, раскрытых в данном документе.
[0024] Другие аспекты описания и иллюстративных графических материалов, следующих после описания, будут очевидными для специалиста в данной области техники.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0025] С целью иллюстрации настоящего раскрытия в графических материалах изображены отдельные аспекты настоящего раскрытия. Тем не менее, настоящее раскрытие не ограничено точными схемами и средствами из аспектов, изображенных на графических материалах.
[0026] На фигуре 1 изображено PK/PD моделирование тикагрелор-нейтрализующего Fab на основе III фазы данных PLATO. После введения тикагрелора в ударной дозе, составляющей 180 мг, и в дозе 90 мг два раза в день, в день ноль добавляли нейтрализующий Fab. Введение тикагрелора пациентам возобновляли в день 1. Прогнозируется, что Fab быстро нейтрализует тикагрелор и TAM, восстанавливая таким образом агрегацию тромбоцитов у 99% пациентов. ʹВозвышение' между днями 0 и 1 представляет перераспределение тикагрелора из других тканей у 1% пациентов, у которых тикагрелор выводится медленнее.
[0027] Фигура 2 - гаптены и специфичность Fab. На (A) представлены химические структуры тикагрелора, активного метаболита тикагрелора (TAM), неактивного метаболита тикагрелора (TIM) и аденозина. Уникальные R-группы, дифторфенилциклопропильные и тиопропильные заместители, выделены пунктирной линией. (B) Профиль специфичности для TICA0072. (C) Профиль специфичности для TICA0212 (MEDI 2452). Профили специфичности включают тикагрелор, TAM, TIM, аденозин, ADP, ATP и три из двенадцати родственных соединений на фиг. 4 (для наглядности; для какого-либо из двенадцати соединений в концентрациях до 0,1 мМ связывание не выявили). Данные представляют собой средние значения и SEM для трех параллелей.
[0028] На фигуре 3 проиллюстрирована корреляция связывания scFv с тикагрелором с биотинилированным линкером (ось x) и связывания с тикагрелором с биотинилированным линкером при 50-кратном избытке немодифицированного тикагрелора (ось y). Ингибирование связывания scFv в присутствии избытка немодифицированного тикагрелора показано линиями для 0%, 50%, 80% и 90% ингибирования.
[0029] На фигуре 4 показаны соединения, для которых идентифицированы определенные степени 2D-, 3D- или электростатического подобия с тикагрелором.
[0030] На фигуре 5 представлены исследования селективности для Fab TICA0049 и TICA0072. a-c - конкурирование за связывание Fab TICA0049 с биотинилированным тикагрелором для перечисленных соединений. d-f - конкурирование за связывание Fab TICA0072 с биотинилированным тикагрелором для перечисленных соединений. Данные нормализованы по DMSO.
[0031] На фигуре 6 представлены кривые конкурентного связывания для исходного TICA0072 и оптимизированных вариантов Fab TICA0152, Fab TICA0162 и Fab TICA0212 в анализе конкурентного связывания эпитопов второго поколения.
[0032] На фигуре 7 показаны результаты исследований селективности для TICA0162 и Fab TICA0212. а-c - конкурирование за связывание Fab TICA0162 с биотинилированным тикагрелором для перечисленных соединений. d-f - конкурирование за связывание Fab TICA0212 с биотинилированным тикагрелором для перечисленных соединений. Данные нормализованы по DMSO.
[0033] На фигуре 8 показаны результаты обратимости действия тикагрелора в зависимости от концентрации TICA0212/MEDI2452 или TICA0072. (A) Влияние TICA0212/MEDI2452 на ингибирование, опосредованное 1 мкM тикагрелора (▲) или 1 мкM TAM (•), агрегации, индуцированной 20 мкM ADP. (B) TICA0212/MEDI2452 демонстрирует снижение концентрации свободного тикагрелора в плазме крови в присутствии 1 мкM тикагрелора. Среднее значение (n=5) ± стандартная погрешность среднего значения. (C) TICA0072 вызывает обратимость ингибирования сигналов P2Y12, индуцированного тикагрелором и TAM.
[0034] На фигуре 9 показаны результаты для TICA0212-опосредованной, 250 мг/кг, обратимости ADP-индуцированной агрегации цельной крови ex vivo после введения дозы мышам, обработанным тикагрелором.
[0035] На фигуре 10 показаны частичные изображения кристаллических структур TICA0072 (A) и TICA0212/MEDI2452 (B) в комплексе с тикагрелором. Fab показаны в ленточном представлении с остатками аминокислот в пределах 7 Å от тикагрелора, показанного палочками. Некоторые атомы главной цепи опустили для упрощения. Легкие цепи показаны бежевым цветом, а тяжелая цепь показана голубым. CDR3 обеих цепей окрашены зеленым. Невозможно было смоделировать CDR3 VH в структуре TICA0072, и ориентировочное местоположение обозначено пунктирной линией. Оранжевой стрелкой указан сдвиг в CDR3 VL, отмеченный для TICA0212/MEDI2452, в сравнении с TICA0072. Остатки пронумерованы согласно Kabat и имеют приставку L или H для обозначения легкой или тяжелой цепи.
[0036] На фигуре 11 показано изменение ADP-индуцированной агрегации цельной крови ex vivo. (A) Отдельные данные для каждой группы лечения после прекращения инфузии тикагрелора. Контроль со средой (■), только тикагрелор (•), тикагрелор+TICA0212/MEDI2452 (○) и тикагрелор+изотипический контроль (Δ). В виде полосы представлены средние значения (n=4). AU=единицы агрегирования. Данные через 15 минут собирали только для группы тикагрелор+TICA0212/MEDI2452. (B) Процент обратимости, индуцированной TICA0212/MEDI2452, среднее значение (n=4) ± SEM.
[0037] На фигуре 12 показано изменение кровотечения, индуцированного тикагрелором. (A) Отдельные данные для общей потери крови и (B) для общего времени кровотечения. Контроль со средой (■), только тикагрелор (•) и тикагрелор+TICA0212/MEDI2452 (○). В виде полосы представлены средние значения (n=12).
[0038]
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0039] Прежде чем продолжить описание настоящего раскрытия более подробно, следует понимать, что настоящее раскрытие не ограничивается конкретными композициями или стадиями способа, поскольку они могут варьироваться. Следует отметить, что, как используется в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.
[0040] Если не определено иное, все технические и научные термины и выражения, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press и Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, обеспечивают специалиста общим словарем многих терминов и выражений, используемых в настоящем изобретении.
[0041] Аминокислоты могут называться в данном документе по их общеизвестным трехбуквенным символам либо по однобуквенным символам, рекомендованным комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично, нуклеотиды могут называться по их общепринятым однобуквенным кодам.
[0042] При нумерации аминокислот в вариабельном домене, определяющих комплементарность участках (CDR) и каркасных участках (FR) антитела следуют, если не указано иное, определению согласно Kabat, как изложено в публикации Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетезда, Мэриленд. (1991). При использовании этой системы нумерации настоящая неразветвленная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению FR или CDR вариабельного домена или вставке в них. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать в себя вставку одной аминокислоты (остаток 52a согласно Kabat) после остатка 52 в H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c и т. д., согласно Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat можно определить для данного антитела путем выравнивания последовательности антитела в участках гомологии со "стандартной" последовательностью с нумерацией по Kabat. Максимальное выравнивание остатков каркасных участков зачастую требует введения "спейсерных" остатков в систему нумерации, чтобы использовать ее для Fv-участка. Кроме того, идентичность определенных отдельных остатков в любом указанном сайте с нумерацией по Kabat может варьироваться от цепи антитела к цепи антитела из-за межвидовой или аллельной дивергенции.
[0043] Используемые в данном документе термины "антитело" и "антитела", также известные как иммуноглобулины, охватывают моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела, образованные по меньшей мере из двух различных эпитоп-связывающих фрагментов (например полиспецифические антитела, например, публикация PCT WO2009018386, заявка PCT № PCT/US2012/045229, включенные в данный документ посредством ссылки во всей их полноте), biMab, антитела человека, гуманизированные антитела, камелизированные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, доменные антитела, Fab-фрагменты, фрагменты F(аb')2, фрагменты антител, которые проявляют необходимую биологическую активность (например антиген-связывающий участок), дисульфидно-связанные Fv (dsFv) и антиидиотипические (anti-Id) антитела (в том числе, например, anti-Id-антитела к антителам по настоящему изобретению), внутриклеточные антитела и эпитоп-связывающие фрагменты любого из вышеупомянутого. В конкретных вариантах осуществления, представленных в данном документе, антитела относятся к активным связывающим фрагментам антитела, т. е., к молекулам, содержащим по меньшей мере один антиген-связывающий сайт, такой как, например scFv и Fab. Антитела также включают слияния пептидов с антителами или их частями, как, например, белок, слитый с Fc-доменом. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого изотипа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), субизотипа (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или аллотипа (например, Gm, например, G1m(f, z или x), G2m(n), G3m(g, b или c), Am, Em, и Km(1, 2 или 3)). Антитела могут быть получены от любого млекопитающего, включая без ограничения людей, обезьян, свиней, лошадей, кроликов, собак, котов, мышей и т. д., или других животных, как, например, птиц (например, кур).
[0044] Используемый в данном документе C1-C6алкил относится к алкилам с прямой и разветвленной цепью, имеющим от одного до шести атомов углерода, и включает метил, этил, пропил, н-бутил, изобутил, пентил, изопентил, неопентил и гексил.
[0045] Используемый в данном документе C1-C6алкокси относится к алкилу, как указано выше, содержащему кислород в группе. В некоторых вариантах осуществления атом кислорода расположен в положении, в котором он связывает группу заместителя с каркасной структурой (т. е., кольцевой структурой).
[0046] Используемый в данном документе C1-C6алкилтио относится к алкилу, как указано выше, содержащему серу в группе. В некоторых вариантах осуществления атом серы расположен в положении, в котором он связывает группу заместителя с коровой структурой (т. е., кольцевой структурой).
[0047] Используемый в данном документе C1-C6алканол относится к алкилу, как указано выше, содержащему гидроксильную группу на конце структуры заместителя.
[0048] Как используется в данном документе, C3-C6циклоалкил относится к циклопропилу, циклобутилу, циклопентилу и циклогексилу.
[0049] Используемые в данном документе "замещенный" C3-C6циклоалкил и C1-C6алкил относятся к алкильным и циклоалкильным группам, рассмотренным выше, которые замещены по меньшей мере в одном атоме углерода арильной группой, которая также замещена 1-3 атомами галогена.
[0050] Используемый в данном документе "тикагрелор" относится к обратимому ингибитору P2Y12 ((1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил]амино}-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил]-5-(2-гидроксиэтокси)циклопентан-1,2-диолу) и имеющему следующую химическую структуру:
[0051] Используемый в данном документе "активный метаболит тикагрелора" или "TAM" относится к основному активному метаболиту тикагрелора, также называемому AR-C124910XX, обратимому ингибитору P2Y12, и имеющему следующую химическую структуру:
[0052] Используемый в данном документе "неактивный метаболит тикагрелора" или "TIM" относится к неактивному метаболиту тикагрелора, также называемому AR-C133913XX, и имеющему следующую химическую структуру:
Антитела
[0053] В общем смысле настоящее раскрытие предлагает новые антитела, которые связывают циклопентилтриазолопиримидиновое соединение формулы (Ia):
где
R1 выбран из группы, состоящей из C1-C6алкокси и C1-C6алкилтио;
R2 выбран из группы, состоящей из H, C1-C6алкила, замещенного C1-C6алкила, C3-C6циклоалкила и замещенного C3-C6циклоалкила; и
R3 выбран из группы, состоящей из H, C1-C6алкила, C1-C6алкокси и C1-C6алканола.
[0054] В конкретных вариантах осуществления антитела специфично связывают соединение, выбранное из группы, состоящей из:
[0055] В конкретных аспектах настоящее раскрытие предлагает антитело, которое связывается с тикагрелором и TAM, при наличии какой-либо одной или нескольких из следующих характеристик, включающих высокую специфичность связывания, высокую аффинность связывания, быстрое время наступления действия и быстрое время окончания действия (например, обеспечивающее возможность необязательного продолжения терапии или терапии с совместным введением, включающей тикагрелор).
[0056] В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с тикагрелором и нейтрализует антиагрегантную активность тикагрелора и TAM, восстанавливая таким образом ADP-индуцированную агрегацию тромбоцитов в присутствии тикагрелора и TAM.
[0057] В некоторых вариантах осуществления время полужизни антитела у субъекта является приблизительно таким же, как и период полувыведения тикагрелора и TAM. В некоторых вариантах осуществления время полужизни антитела составляет от приблизительно 4 до 24 часов (например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часов). В некоторых вариантах осуществления время полужизни антитела составляет от приблизительно 4 до 12 часов (например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 часов).
[0058] В некоторых вариантах осуществления антитело обуславливает быстрое наступление действия. Например, в вариантах осуществления время наступления действия антитела или время, необходимое для нейтрализации ингибирования, опосредованного тикагрелором и TAM, составляет от приблизительно 15 минут до 120 минут или от приблизительно 15 минут до 60 минут. В некоторых вариантах осуществления время наступления действия составляет менее 60 минут.
[0059] В некоторых вариантах осуществления антитело характеризуется PK/PD-профилем, который обеспечивает быстрое проявление активности, вследствие чего, например, субъект, которому вводили данное антитело, может возобновить назначенную терапию тикагрелором. В некоторых вариантах осуществления субъект, который получал антитело, раскрытое в данном документе (например, путем i.v. инфузии), может получать тикагрелор или возобновить терапию тикагрелором в пределах двадцати четырех часов после введения антитела.
[0060] Как рассмотрено и проиллюстрировано в определенных вариантах осуществления в данном документе, антитело связывает тикагрелор или его метаболит и не связывается с другими соединениями, имеющими родственную структуру, или с соединениями, которые можно вводить в качестве средств для coвместной терапии с тикагрелором. Например, соответственно, антитело не ингибирует активность соединения выбранного из группы, состоящей из фенофибрата, нилвадипина, цилостазола, букладезина, регаденозона, циклотиазида, цифлутрина, ловастатина, линезолида, симвастатина, кангрелора, пантопразола, аденозина, аденозиндифосфата, аденозинтрифосфата, 2-MeS-аденозиндифосфата и 2-MeS-аденозинтрифосфата.
[0061] Антитела, описанные в данном документе, могут содержать антиген-связывающие фрагменты, содержащие только выбранные части молекулы антитела, такие как Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, фрагменты sdAb, и они могут использоваться в качестве диагностических или терапевтических средств. Кроме того, специфические остатки в вариабельных доменах можно изменять с целью улучшения специфичности связывания и/или стабильности антитела и фрагментов антитела. Другие остатки, не вовлеченные непосредственно в связывание с антигеном, были удалены для "гуманизации" участков антител, не являющихся человеческими, и снижения иммуногенности антитела.
[0062] В определенных аспектах антитело представляет собой Fab-фрагмент, например, Fab-фрагмент антитела или антиген-связывающий фрагмент, полученный рекомбинантным путем, содержащий часть вариабельного участка легкой цепи (VL), константного участка легкой цепи (CL), вариабельного участка легкой цепи (VH) и константного участка тяжелой цепи (CH1). Необязательно легкая и тяжелая цепи Fab могут быть связаны между собой посредством одной или нескольких дисульфидных связей, как, например, посредством подходящего шарнирного участка антитела. Как описано в данном документе, Fab связывается с эпитопом соединения из активных при пероральном введении средств класса циклопентилтриазолопиримидинов. В некоторых вариантах осуществления Fab связывается с тикагрелором или его метаболитом.
[0063] В определенных аспектах Fab может быть получен из или может быть на основе последовательности антитела, такого как традиционно используемое антитело мыши, гуманизированное антитело или антитело человека. В определенных аспектах Fab может быть получен из или может быть на основе одного или нескольких scFv, таких как scFv, подвергнутых скринингу и полученных из библиотеки. В таких вариантах осуществления Fab получен из последовательности традиционного используемого антитела или может быть на ее основе, или scFv сохраняет одну или несколько функциональных активностей традиционного используемого антитела (например, сохраняет по меньшей мере 80% или более (80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100%) функциональной активности). Например, в определенных аспектах Fab сохраняет аффинность к одному или нескольким антигенам (например, тикагрелору), ингибиторную активность и/или селективность антитела или scFv.
[0064] Хотя Fab-фрагмент может содержать последовательность, которая связывается с эпитопом циклопентилтриазолопиримидина, в конкретных вариантах осуществления Fab связывается с тикагрелором. В некоторых аспектах Fab связывается с активным метаболитом тикагрелора. В определенных аспектах Fab может связываться как с тикагрелором, так и с активным метаболитом тикагрелора.
[0065] В некоторых вариантах осуществления Fab может содержать комбинацию участков CDR из разных антител, которые связываются с тикагрелором или его активным метаболитом.
[0066] В определенных аспектах Fab содержит часть легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:77. В дополнительных вариантах осуществления Fab содержит часть легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:77. В определенных аспектах Fab содержит часть тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислоту, изложенную в любой из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:72. В дополнительных вариантах осуществления Fab содержит часть тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:72. В определенных аспектах Fab кодируется нуклеотидной последовательностью, кодирующей часть легкой цепи (VL), и нуклеотидной последовательностью, кодирующей часть тяжелой цепи (VH), например, нуклеотидной последовательностью, представляющей собой последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:61 или SEQ ID NO:71; и нуклеотидной последовательностью, представляющей собой последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:76.
[0067] В определенных аспектах антитело может представлять собой scFv. Подразумевают, что scFv охватывает полипептидную цепь, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) посредством подвижного полипептидного линкера. В некоторых аспектах полипептидный линкер между VH и VL содержит сайт для расщепления протеазами. Домены VH и VL scFv могут быть получены из одного и того же или из разных антител. В некоторых аспектах VH или VL scFv могут содержать один или нескольких CDR, которые связываются с представляющей интерес мишенью, тогда как остальная часть домена VH или VL получена из разных антител или синтезирована. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере один CDR антитела, например, антитела с активностью связывания с тикагрелором или его метаболитом. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере два CDR указанного антитела. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере три CDR указанного антитела. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере четыре CDR указанного антитела. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере пять CDR указанного антитела. В некоторых аспектах scFv содержит по меньшей мере шесть CDR указанного антитела.
[0068] Множество методик можно использовать по отдельности или в комбинации для улучшения стабильности молекулы scFv. Одна методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими другими методиками, представляет собой конструирование длины и/или композиции линкера, связывающего домены scFv для стабилизации части scFv.
[0069] Другая возможная методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими другими методиками, описанными в данном документе, представляет собой введение по меньшей мере двух аминокислотных замен (также называемых модификациями или мутациями) в домены VH и/или VL scFv с целью активации образования дисульфидных связей (см., например, Brinkmann et al., 1993, PNAS, 90:7538-42; Zhu et al., 1997, Prot. Sci. 6:781-8; Reiter et al., 1994, Biochem. 33:5451-9; Reiter et al., 1996, Nature 14: 1239-45; Luo et al., 1995, J. Biochem. 118:825-31; Young et al., 1995, FEBS Let. 377:135-9; Glockshuber et al., 1990, Biochem. 29:1362-7).
[0070] В определенных аспектах одну мутацию вводят в каждый из доменов VH и VL scFv с целью активации образования дисульфидных связей между доменами VH и VL при экспрессии scFv. В другом аспекте две мутации вводят в один и тот же домен цепи. В определенном аспекте две мутации вводят в разные цепи. В определенных аспектах множественные пары двух мутаций вводят с целью активации образования множественных дисульфидных связей. В определенных аспектах цистеин вводят с целью активации образования дисульфидных связей. Иллюстративные аминокислоты, которые можно подвергнуть мутации с заменой на цистеин, включают аминокислоты 43, 44, 45, 46, 47, 103, 104, 105 и 106 VH2 и аминокислоты 42, 43, 44, 45, 46, 98, 99, 100 и 101 VL2. Изложенная выше нумерация основана на нумерации по Kabat, определяющей положение только по отношению к VH2 и VL2 scFv (а не по отношению к положению аминокислоты в полноразмерной последовательности антитела). Иллюстративные комбинации положений аминокислот, которые можно подвергнуть мутации с заменой на остатки цистеина, включают: VH44-VL100, VH105-VL43, VH105-VL42, VH44-VL101, VH106-VL43, VH104-VL43, VH44-VL99, VH45-VL98, VH46-VL98, VH103-VL43, VH103-VL44, и VH103-VL45. В некоторых аспектах аминокислота 44 VH и аминокислота 100 VL подвергнуты мутации с заменой на цистеины.
[0071] Дополнительная возможная методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими другими методиками, описанными в данном документе, представляет собой выбор порядка доменов scFv. В определенных аспектах ориентация домена VH по отношению к домену VL оптимизирована в целях стабильности. В определенных аспектах scFv находится в ориентации типа VH-линкер-VL. В определенных аспектах scFv находится в ориентации типа VL-линкер-VH.
[0072] Дополнительная методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими методиками, описанными в данном документе, представляет собой введение одной или нескольких стабилизирующих мутаций путем осуществления мутирования одного или нескольких поверхностных остатков scFv. В некоторых аспектах один, два, три, четыре, пять, шесть или больше шести остатков подвергнуты мутации в одном или обеих доменах VH и/или VL scFv. В определенных аспектах изменения проведены только в домене VH scFv. В определенных аспектах изменения проведены только в домене VL scFv. В определенных аспектах изменения проведены в обеих доменах VH и VL scFv. Можно осуществить одинаковое количество изменений в каждом домене или можно осуществить разное количество изменений в каждом домене. В определенных аспектах одно или несколько изменений представляют собой консервативную аминокислотную замену в остатке, присутствующем в немодифицированном исходном scFv. В других аспектах одно или несколько изменений представляет собой неконсервативную аминокислотную замену в остатке, присутствующем в немодифицированном исходном scFv. При проведении множественных замен в одном из доменов VH или VL scFv или в обеих доменах VH или VL scFv, каждая замена независимо представляет собой консервативную или неконсервативную замену. В определенных аспектах все замены представляют собой консервативные замены. В определенных аспектах все замены представляют являются неконсервативными. В определенных аспектах по меньшей мере одна из замен является консервативной. В определенных аспектах по меньшей мере одна из замен является неконсервативной.
[0073] Еще одна методика, которую можно использовать отдельно или в комбинации с одной или несколькими необязательными методиками, описанными в данном документе, представляет собой введение одной или нескольких замен путем мутирования по одному или нескольким остаткам, присутствующим в доменах VH и/или VL scFv, с целью сопоставления наиболее часто встречающегося остатка в указанном конкретном положении с консенсусной последовательностью домена VH и/или VL из известных подвергнутых скринингу и/или идентифицированных антител. В определенных аспектах замены вводят в одно, два, три, четыре, пять, шесть или более шести положений в одном или обеих доменах VH и/или VL scFv. Можно осуществить одинаковое количество изменений в каждом домене или можно осуществить разное количество в каждом домене. В определенных аспектах одно или несколько изменений в последовательности, соответствующих таким изменениям в указанной консенсусной последовательности, представляют собой консервативную аминокислотную замену в остатке, присутствующем в немодифицированных последовательностях VH и/или VL. В других аспектах одно или несколько изменений представляют собой неконсервативную аминокислотную замену в остатке, присутствующем в немодифицированных последовательностях VH и/или VL. При проведении множественных замен либо в одном из доменов VH или VL scFv, либо или в обеих этих доменах каждая замена независимо представляет собой консервативную или неконсервативную замену. В определенных аспектах все замены представляют собой консервативные замены. В определенных аспектах все замены представляют собой неконсервативные замены. В определенных аспектах по меньшей мере одна из замен является консервативной. В определенных аспектах по меньшей мере одна из замен является неконсервативной.
[0074] Следует отметить, что любые из модификаций, описанных в качестве применимых для модифицирования или стабилизации части scFv, можно использовать для модификации части Fab. Например, вариабельные домены Fab можно модифицировать с целью улучшения стабильности, связывания с антигеном и им подобного. Более того, либо часть Fab, либо часть scFv можно модифицировать для снижения иммуногенности.
[075] В определенных аспектах антитело может представлять собой scFv, который содержит вариабельную часть легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:77. В дополнительных вариантах осуществления scFv содержит часть легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:77. В определенных аспектах scFv содержит часть тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислоту, изложенную в любой из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:72. В дополнительных вариантах осуществления scFv содержит часть тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:72.
[076] Антитела, раскрытые в данном документе, могут дополнительно содержать один или несколько линкерных полипептидов. Линкер может связывать между собой домен тяжелой цепи с доменом легкой цепи (scFv) или связывать антитело или его антиген-связывающий фрагмент с другим средством, таким как метка, Fc-домен или им подобные. Линкеры могут варьироваться по длине и последовательности, и в целом они известны из уровня техники.
[077] Время полужизни антитела, содержащего Fc-участок, в сыворотке крови может быть увеличено с помощью увеличения аффинности связывания Fc-участка с FcRn. Термин "время полужизни антитела", используемый в данном документе, означает фармакокинетическое свойство антитела, которое представляет собой показатель среднего времени существования молекул антител после их введения. Время полужизни антитела можно выразить как время, необходимое для выведения 50 процентов известного количества иммуноглобулина из организма пациента (или другого млекопитающего) или его конкретного компартмента, например, измеренного в сыворотке крови, т.е., время полужизни в крови или в других тканях. Время полужизни может варьировать среди разных иммуноглобулинов или классов иммуноглобулинов. Как правило, увеличение времени полужизни антитела приводит в результате к увеличению среднего времени удержания (MRT) в кровотоке введенного антитела.
[078] Увеличение времени полужизни может позволить уменьшить количество средства, принимаемого пациентом, а также снизить частоту введения. Для увеличения периода полужизни антитела в сыворотке крови в состав антитела (в частности, фрагмента антитела) может быть введен эпитоп, связывающийся с рецептором реутилизации, как описано, например, в патенте США. № 5739277. Используемый в данном документе термин "эпитоп, связывающийся с рецептором реутилизации" относится к эпитопу Fc-участка молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который отвечает за увеличение in vivo периода полужизни в сыворотке крови молекулы IgG. В качестве альтернативы, антитела по настоящему раскрытию с увеличенным временем полужизни можно получить с помощью модификации аминокислотных остатков, идентифицированных как вовлеченные во взаимодействие между Fc- и FcRn-рецептором (смотри, например, патенты США №№ 6,821,505 и 7,083,784; и WO 09/058492). Кроме того, время полужизни антител по настоящему раскрытию можно увеличить путем конъюгирования с PEG или альбумином при помощи методик, широко используемых в данной области.
[079] Антитела, находящиеся в пределах объема настоящего раскрытия, можно идентифицировать с помощью любых структурных и/или функциональных характеристик, рассмотренных в данном документе. Например, антитела можно подвергнуть скринингу в отношении конкретных свойств связывания (например, Koff, Kd, IC50, специфичность к/селективность к тикагрелору и метаболитам тикагрелора) с использованием любых методик, проиллюстрированных в данном документе, или которые иным образом известны из уровня техники.
Метки, конъюгаты и фрагменты
[0080] Антитела по настоящему раскрытию могут быть конъюгированы с метками в диагностических целях и для других анализов, в которых антитела и/или их мишень(мишени) можно выявить. Метки включают без ограничения хромофор, флуорофор, флуоресцентный белок, фосфоресцентный краситель, тандемный краситель, частицу, гаптен, фермент и радиоактивный изотоп.
[0081] В определенных аспектах антитела конъюгированы с флуорофором. Выбор флуорофора, присоединяемого к антителу, будет определять свойства поглощения и испускания флуоресценции конъюгированным антителом. Физические свойства флуорофорной метки, которую можно использовать для антитела и связанных с антителом лигандов, включают без ограничения спектральные характеристики (поглощение, испускание и стоксов сдвиг), интенсивность, длительность, поляризацию флуоресценции и скорость обесцвечивания или их комбинацию. Все эти физические свойства можно использовать для того, чтобы отличить один флуорофор от другого, и, таким образом, обеспечить возможность мультиплексного анализа. Другие необходимые свойства флуоресцентной метки могут включать клеточную проницаемость и низкую токсичность, например, если мечение антитела необходимо проводить в клетке или модельном организме (например, живом животном).
[0082] В определенных аспектах фермент представляет собой метку и конъюгирован с антителом. Ферменты являются желательными метками, поскольку можно получить усиление поддающегося выявлению сигнала, приводящее к повышению чувствительности анализов. Сам фермент не вызывает поддающийся выявлению ответ, а действует путем разрушения субстрата, когда он вступает в контакт с соответствующим субстратом, так что превращаемый субстрат испускает флуоресцентный, колориметрический или люминесцентный сигнал. Ферменты усиливают поддающийся выявлению сигнал, поскольку один фермент в реактиве для мечения может приводить к превращению нескольких субстратов в поддающийся выявлению сигнал. Субстрат для фермента выбирают так, чтобы получить предпочтительный поддающийся измерению продукт, например, колориметрический, флуоресцентный или хемилюминесцентный. Такие субстраты широко используются в данной области, и хорошо известны специалисту в данной области, и включают, например, оксидоредуктазы, такие как пероксидаза хрена, и субстрат, такой как 3,3'-диаминобензидин (DAB); ферменты фосфатазы, такие как кислая фосфатаза, щелочная, и субстрат, такой как 5-бром-6-хлор-3-индолилфосфат (BCIP); гликозидазы, такие как бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза или бета-гликозидаза, и субстрат такой как 5-бром-4-хлор-3-индолил бета-D-галактопиранозид (X-gal); дополнительные ферменты включают гидролазы, такие как холинэстеразы и пептидазы, оксидазы, такие как глюкозооксидаза и цитохромоксидазы, и редуктазы, для которых известны подходящие субстраты.
[0083] Ферменты и их соответствующие субстраты, которые инициируют хемилюминесценцию, являются подходящими для некоторых анализов. Они включают без ограничения природные и рекомбинантные формы люцифераз и экворинов. Также применимы инициирующие хемилюминесценцию субстраты для фосфатаз, гликозидаз и оксидаз, как, например, содержащие стабильные диоксетаны, люминол, изолюминол и сложные эфиры акридиния.
[0084] В другом аспекте гаптены, такие как биотин, также используются в качестве меток. Биотин является подходящим, поскольку он может функционировать в ферментной системе с дополнительным усилением детектируемого сигнала, и он может выполнять функцию в качестве маркера для использования в аффинной хроматографии для целей выделения. В целях выявления используют конъюгат фермента, который характеризуется аффинностью к биотину, такой как авидин-HRP. Затем добавляют субстрат для пероксидазы для получения поддающегося выявлению сигнала.
[0085] Гаптены также включают гормоны, встречающиеся в природе и синтетические лекарственные средства, загрязнители, аллергены, эффекторные молекулы, факторы роста, хемокины, цитокины, лимфокины, аминокислоты, пептиды, промежуточные химические соединения, нуклеотиды и им подобные.
[0086] В определенных аспектах флуоресцентные белки могут быть конъюгированы с антителом в качестве метки. Примеры флуоресцентных белков включают зеленый флуоресцентный белок (GFP) и фикобилипротеины и их производные. Флуоресцентные белки, в частности, фикобилипротеин, особенно применимы в получении реагентов для мечения на основе тандемных красителей. Эти тандемные красители содержат флуоресцентный белок и флуорофор для целей получения большего стоксового сдвига, при котором спектр испускания смещен дальше от длины волны спектра поглощения флуоресцентного белка.
[0087] В определенных аспектах метка представляет собой радиоактивный изотоп. Примеры подходящих радиоактивных материалов включают без ограничения йод (121I, 123I, 125I, 131I), углерод (14C), серу (35S), тритий (3H), индий (111In, 112In, 113mIn, 115mIn,), технеций (99Tc, 99mTc), таллий (201Ti), галлий (68Ga, 67Ga), палладий (103Pd), молибден (99Mo), ксенон (135Xe), фтор (18F), 153SM, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc,186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh и 97Ru.
[0088] В некоторых аспектах лекарственные средства могут быть конъюгированы с антителом. Например, антитело, содержащее scFv, может быть конъюгировано с лекарственным средством для лечения сердечно-сосудистого заболевания и/или острых коронарных синдромов.
[0089] В определенных конструкциях лекарственные средства и другие молекулы можно на антитело через сайт-специфичные конъюгации. Например, антитело может содержать сконструированные цистеиновые домены (включая сконструированный(сконструированные) цистеин(цистеины) в связывающей единице и/или Fc-домене), что дает в результате свободные тиольные группы для реакций конъюгации. В определенных аспектах антитело сконструировано для встраивания специфичных сайтов конъюгации.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела
[090] Настоящее раскрытие предлагает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела или их антиген-связывающие фрагменты. Один аспект настоящего раскрытия предлагает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любые из антител, конкретно описанных в данном документе. Молекула нуклеиновой кислоты может кодировать вариабельный участок тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела.
[091] В некоторых аспектах антитело представляет собой Fab или scFv, где часть нуклеиновой кислоты, кодирующая Fab или scFv, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен VL, и нуклеотидную последовательность, кодирующую VH, и где нуклеотидная последовательность, кодирующая домен VL, необязательно связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей домен VH, через нуклеотидную последовательность, кодирующую подвижный полипептидный линкер.
[092] Дополнительный аспект предлагает клетку-хозяина, трансформированную с помощью любой из молекул нуклеиновых кислот, что описано в данном документе. В другом аспекте настоящего раскрытия предлагают клетку-хозяин, содержащую вектор, содержащий молекулы нуклеиновых кислот, что описано в данном документе. В одном аспекте клетка-хозяин может содержать больше одного вектора.
[093] Настоящее раскрытие представляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любое антитело по настоящему раскрытию, а также либо легкую цепь, либо тяжелую цепь антитела. Например, данное раскрытие представляет молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую одно или несколько из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, и SEQ ID NO:77. Настоящее раскрытие дополнительно представляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любое антитело по настоящему раскрытию, дополнительно содержащее дополнительные участки (например, Fc или модифицированный Fc). В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот могут быть выбраны из одного или нескольких из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41,, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:51,, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71, или SEQ ID NO:76. В дополнительных вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из одного или нескольких из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41,, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:51,, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71, или SEQ ID NO:76.
Способы получения антител, Fab и scFv
[094] Настоящее раскрытие обеспечивает способы получения антител и их фрагментов, которые описаны в данном документе. В некоторых аспектах антиген-связывающие фрагменты антител, которые распознают тикагрелор и специфические эпитопы тикагрелора и/или TAM, раскрытые в данном документе, можно создать с помощью любой методики, известной специалисту в данной области. Например, фрагменты Fab и F(ab')2 можно получить из антител путем протеолитического расщепления молекул иммуноглобулина с использованием таких ферментов, как папаин (для получения фрагментов Fab) или пепсин (для получения фрагментов F(ab')2). Кроме того, антитела, включая scFv и Fab, как описано в данном документе, можно создавать с использованием различных способов фагового дисплея, известных из уровня техники.
[095] Как правило, в способах фагового дисплея функциональные домены антител представлены на поверхности фаговых частиц, которые несут последовательности полинуклеотидов, кодирующие их. В частности, последовательности ДНК, кодирующие домены VH и VL, амплифицируют из библиотек кДНК животных (например, из библиотек кДНК лимфоидной ткани человека или мыши). Осуществляют рекомбинацию ДНК, кодирующей домены VH и VL, вместе с линкером scFv при помощи ПЦР и ее клонируют в фагмидный вектор. Вектор вводят в E. coli путем электропорации, и E. coli инфицируют фагом-помощником. Фаг, используемый в этих способах, может быть нитевидным фагом, в том числе fd и M13, и домены VH или VL могут быть слиты рекомбинантным путем либо с геном III, либо с геном VIII фага. Фаг, экспрессирующий антиген-связывающий домен, который связывается с тикагрелором и/или TAM, можно выбрать или идентифицировать с помощью антигена, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного с твердой поверхностью или гранулой или зафиксированного на них. Подобным образом, домены связывания, которые связываются с антигенами/гаптенами в дополнение к тикагрелору или отличному от тикагрелора и/или TAM, можно идентифицировать для отрицательного отбора. Примеры способов на основе фагового дисплея, которые можно использовать для создания антител по настоящему изобретению, включают раскрытые в Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; заявке по PCT № PCT/GB91/O1 134; в заявках по PCT №№ WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 и WO97/13844; и в патенте США №№ 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108; все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0096] Как описано в указанных выше источниках, после отбора фага кодирующие антитело участки можно выделять из фага и использовать их для получения полных антител, в том числе антител человека, или любого другого предпочтительного антиген-связывающего фрагмента (scFv и Fab), и экспрессировать у любого желаемого хозяина, в том числе в клетках млекопитающих, клетках насекомых, растительных клетках, у дрожжей и бактерий, например, как описано ниже. Также можно использовать методики рекомбинантного получения Fab-, Fab'- и F(ab')2-фрагментов, используя способы, известные из уровня техники, такие как раскрытые в публикации PCT № WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; и Better et al., 1988, Science 240:1041-1043 (указанные источники включены во всей своей полноте посредством ссылки).
[0097] В определенных аспектах нуклеиновые кислоты, раскрытые в данном документе, могут быть функционально связаны с одной или несколькими регуляторными нуклеотидными последовательностями в экспрессирующей конструкции. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие легкие и тяжелые цепи антител, можно клонировать в одном и том же векторе экспрессии при любой ориентации (например, легкая цепь перед тяжелой цепью или наоборот) или можно клонировать в двух разных векторах. Если экспрессию осуществляют с использованием одного вектора, то два кодирующих гена могут иметь свои собственные генетические элементы (например, промотор, RBS, лидерная последовательность, стоп-кодон, хвост полиА и т. д.) или они могут быть клонированы в одном отдельном наборе генетических элементов, но связаны с одним цистронным элементом. Регуляторные нуклеотидные последовательности будут, как правило, являться подходящими для клетки-хозяина, которую используют для экспрессии. Множество типов подходящих векторов экспрессии и подходящих регуляторных последовательностей являются известными из уровня техники для множества клеток-хозяев. Как правило, указанные одна или несколько регуляторных нуклеотидных последовательностей могут включать без ограничения промоторные последовательности, лидерные или сигнальные последовательности, сайты связывания рибосомы, последовательности инициации и терминации транскрипции, последовательности инициации и терминации трансляции и последовательности энхансеров и активаторов. Конститутивные или индуцируемые промотеры, известные из уровня техники, предтавлены в настоящем раскрытии. Промоторы могут быть либо промоторами, встречающимися в природе, либо гибридными промоторами, которые объединяют элементы более чем одного промотора. Экспрессирующая конструкция может присутствовать в клетке в эписоме, такой как плазмида, или экспрессирующая конструкция можно вставить в хромосому.
[0098] В определенных аспектах вектор экспрессии содержит ген селектируемого маркера, обеспечивающего возможность отбора трансформированных клеток-хозяев. Гены селектируемых маркеров являются хорошо известными из уровня техники и будут варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина. В определенных аспектах данное раскрытие относится к вектору экспрессии, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, и функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью. Регуляторные последовательности являются принятыми в данной области и выбраны для управления экспрессией кодируемого полипептида. Соответственно, термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспресиии. Иллюстративные неограничивающие регуляторные последовательности описаны в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Следует понимать, что конструирование вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, и/или тип белка, экспрессия которого требуется. Более того, также следует принять во внимание количество копий вектора, способность контролировать данное число копий и экспрессию любого другого белка, кодируемого вектором, такого как маркеры устойчивости к антибиотикам.
[0099] Способы получения антитела по настоящему раскрытию могут включать, например, клетку-хозяин, трансфицированную одним или несколькими векторами экспрессии, кодирующего антитело (например, отдельным вектором, кодирующим тяжелые и легкие цепи или их вариабельные участки, или двумя векторами: одним, кодирующим тяжелую цепь, и одним, кодирующим легкую цепь или их вариабельные участки), которую можно культивировать в подходящих условиях, чтобы обеспечивать возможность экспрессии антитела. Секретируемое антитело можно выделять из смеси клеток и среды, содержащей антитело. В качестве альтернативы, антитело может задерживаться в цитоплазме или в мембранной фракции, и клетки можно собирать, лизировать с последующим выделением белка. Культура клеток включает клетки-хозяева, среды и другие побочные продукты. Подходящие среды для культивирования клеток являются хорошо известными из уровня техники. Антитело можно выделить из среды для культивирования клеток, из клеток-хозяев или и того, и другого, с использованием методик очистки белков, антител и антиген-связывающих фрагментов антитела, известных из уровня техники, включая ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафильтрацию, электрофорез и иммуноаффинную очистку. В определенных аспектах антитело сконструировано в виде антиген-связывающего фрагмента антитела, который содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, что может повысить растворимость и облегчить очистку.
[00100] Рекомбинантную нуклеиновую кислоту можно получать путем лигирования клонированного гена или его части в вектор, подходящий для экспрессии либо в прокариотических клетках, либо эукариотических клетках (клетках дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих), или и в тех, и в других. Средства для экспрессии для получения рекомбинантного полипептида включают плазмиды и другие векторы. К примеру, подходящие векторы включают плазмиды следующих типов: pBR322-производные плазмиды, pEMBL-производные плазмиды, pEX-производные плазмиды, pBTac-производные плазмиды и pUC-производные плазмиды для экспрессии в прокариотических клетках, таких как E. coli. В определенных аспектах векторы экспрессии для млекопитающих содержат как прокариотические последовательности для облегчения размножения вектора в бактериях, так и одну или несколько эукариотических единиц транскрипции, которые экспрессируются в эукариотических клетках. Векторы-производные pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, пМSG, pSVT7, pko-neo и pHyg представляют собой примеры векторов экспрессии для млекопитающих, подходящих для трансфекции эукариотических клеток. Некоторые из данных векторов модифицируют последовательностями из бактериальных плазмид, как, например, pBR322, для облегчения репликации и отбора по устойчивости к лекарственному средству как у прокариотических, так и у эукариотических клеток. В качестве альтернативы, производные вирусов, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота (BPV-1) или вирус Эпштейна-Барр (pHEBo, производный pREP и p205), можно использовать для временной экспрессии белков в эукариотических клетках. Различные способы, используемые в получении плазмиды и трансформации организмов-хозяев, являются хорошо известными из уровня техники. В отношении других подходящих систем экспрессии как у прокариотических, так и у эукариотических клеток, а также общих процедур рекомбинации, см. Molecular Cloning Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Chapters 16 and 17. В некоторых случаях может быть необходимым экспрессировать рекомбинантный полипептид с использованием бакуловирусной системы экспрессии. Примеры подобных бакуловирусных систем экспрессии включают векторы-производные pVL (такие как pVL1392, pVL1393 и pVL941), векторы-производные pAcUW (такие как pAcUW1), и векторы-производные pBlueBac (такие как pBlueBac III, содержащие ген β-галактозидазы).
[00101] Методики создания генов слияния являются хорошо известными. В сущности, соединение различных фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих разные последовательности полипептида/антитела, осуществляют в соответствии с традиционными методиками, используя лигирование тупых концов или острых концов, расщепление с помощью ферментов рестрикции с получением подходящих концов, соединение липких концов при необходимости, обработку щелочной фосфатазы с целью предупреждения нежелательного соединения концов, а также ферментативное лигирование. В другом аспекте ген слияния можно синтезировать при помощи традиционных методик, включая автоматические синтезаторы ДНК. В качестве альтернативы, ПЦР-амплификацию фрагментов генов можно выполнять с использованием якорных праймеров, которые обуславливают образование комплементарных выступающих концов между двумя последовательными фрагментами нуклеиновой кислоты, которые можно впоследствии подвергнуть отжигу с образованием последовательности химерного гена (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
[00102] В некоторых аспектах вектор экспрессии, экспрессирующий любые нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе, можно использовать для экспрессии антитела в клетке-хозяине. Например, антитело может быть экспрессировано в бактериальных клетках, таких как E. coli, клетках насекомых (например, с использованием бакуловирусной системы экспрессии), клетках дрожжей или клетках млекопитающих. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области техники.
[00103] Непосредственно после переноса вектора экспрессии в клетку-хозяина с помощью традиционных методик трансфицированные клетки затем культивируют с помощью традиционных методик с получением антитела. Таким образом, настоящее раскрытие включает клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагменты, функционально связанные с гетерологичными промотором. В определенных аспектах как тяжелая, так и легкая цепь и/или вариабельные участки тяжелой и легкой цепей могут быть совместно экспрессированы (из одного и того же или из разных векторов) в клетке-хозяине для экспрессии целого антитела. В определенных аспектах как тяжелые, так и легкие цепи антитела экспрессируются с одного промотора. В определенных аспектах тяжелые и легкие цепи антитела экспрессируются со множества промоторов. В определенных аспектах тяжелые и легкие цепи антитела кодируются одним вектором. В определенных аспектах тяжелые и легкие цепи антитела кодируются множеством векторы.
[00104] Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных антител, хорошо известны из уровня техники и включают многие иммортализированные линии клеток, доступные в Американской коллекции типовых культур (ATCC), в том числе без ограничения клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомячка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), клетки почечного эпителия человека 293 и ряд других линий клеток. Разные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков, а также продуктов генов. Подходящие линии клеток или системы-хозяева можно выбрать для того, чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг экспрессируемого антитела или его части. В связи с этим можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным аппаратом для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают без ограничения клетки CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O и T47D, NS0 (линия клеток мышиной миеломы, которая не продуцирует эндогенно каких-либо функциональных цепей иммуноглобулинов), SP20, CRL7O3O и HsS78Bst. В одном аспекте линии клеток человека, разработанные путем иммортализации лимфоцитов человека, можно использовать для рекомбинантного продуцирования моноклональных антител. В одном аспекте линию клеток человека PER.C6. (Crucell, Нидерланды) можно использовать для рекомбинантного получения моноклональных антител.
[00105] Дополнительные линии клеток, которые можно использовать в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных антител, включают без ограничения клетки насекомых (например, Sf21/Sf9, Bti-Tn5b1-4 Trichoplusia ni) или клетки дрожжей (например, S. cerevisiae, Pichia, US7326681 и т. д.), растительные клетки (US20080066200) и куриные клетки (WO2008142124).
[00106] В определенных аспектах антитело по настоящему раскрытию стабильно экспрессируется в линии клеток. Стабильную экспрессию можно использовать для длительного высокопродуктивного получения рекомбинантных белков, антител и их антиген-связывающих фрагментов. Например, можно создать линии клеток, стабильно экспрессирующих молекулу антитела. Клетки-хозяева можно трансформировать подходящим образом сконструированным вектором, содержащим элементы контроля экспрессии (например, промотор, энхансер, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т. д.) и ген селектируемого маркера. После введения чужеродной ДНК клеткам можно позволить расти в течение 1-2 суток на обогащенной среде, а затем их переносят на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к отбору и позволяет клеткам со стабильно интегрированной плазмидой в их хромосомах расти и образовывать очаги, которые, в свою очередь, можно клонировать и наращивать с получением линий клеток. Способы получения стабильных линий клеток с высокой продуктивностью хорошо известны из уровня техники, и реактивы, как правило, являются коммерчески доступными.
[00107] В определенных аспектах антитело по настоящему раскрытию временно экспрессируется в линии клеток. Транзиентная трансфекция представляет собой процесс, при котором нуклеиновая кислота, вводимая в клетку, не интегрируется в геномную или хромосомную ДНК такой клетки. Она фактически сохраняется в виде внехромосомного элемента, например, в виде эписомы, в клетке. Процессы транскрипции нуклеиновой кислоты эписомы не затрагиваются, и продуцируется белок, кодируемый нуклеиновой кислотой эписомы.
[00108] Линию клеток, подвергнутую стабильной или транзиентной трансфекции, поддерживают в среде для культивирования и условиях, хорошо известных из уровня техники, что приводит к экспрессии и продуцированию моноклональных антител. В определенных аспектах в основе среды для культивирования клеток млекопитающих лежат коммерчески доступные составы сред, в том числе, например, DMEM или среды Хема F12. В других аспектах среду для культивирования клеток модифицируют для поддержания как роста клеток, так и биологической экспрессии белка. Используемые в данном документе выражения "среда для культивирования", "культуральная среда" и "состав среды" относятся к питательному раствору для поддержания, роста, размножения или наращивания клеток в искусственном окружении in vitro за пределами многоклеточного организма или ткани. Среду для культивирования можно оптимизировать для использования в конкретной культуре клеток, в том числе, например, ростовую среду для культивирования клеток, которая составлена для стимуляции клеточного роста, или продуктивную среду для культивирования клеток, которая составлена для стимуляции выработки рекомбинантного белка. Термины "питательное вещество", "ингредиент" и "компонент", используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к составляющим компонентам, которые образуют среду для культивирования клеток.
[00109] Непосредственно после получения молекулы ее можно очистить любым способом, известным из уровня техники, для очистки молекулы иммуноглобулина или ее фрагментов, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной, аффинной, в частности, по аффинности к специфическим антигенам - белку A или белку G, и эксклюзионной колоночной хроматографией), центрифугирования, дифференциальной растворимости или любой другой стандартной методики очистки белков, антител и/или фрагментов антител. Кроме того, молекулы по настоящему раскрытию или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями (называемыми в данном документе как "маркеры", как, например, гистидиновый маркер) описанными в данном документе или иным образом известными из уровня техники, для облегчения очистки.
[00110] При использовании рекомбинантных технологий молекула может быть получена внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретировано в среду. Если молекула получена внутриклеточно, то в качестве первой стадии удаляют твердые остатки, или клетки-хозяева, или лизированные фрагменты, например путем центрифугирования или ультрафильтрации. В публикации Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) описана процедура выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство E. coli. Если молекула секретируется в среду, то надосадочные жидкости из таких систем экспрессии, как правило, вначале концентрируют с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белка, например, ультрафильтрационного блока Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеаз, такой как PMSF, может быть включен в любую из последующих стадий для ингибирования протеолиза, и антибиотики могут быть включены для предупреждения роста случайных загрязнителей.
[00111] Композицию, полученную из клеток, можно очищать с использованием, например, хроматографии с гидроксиапатитом, хроматографии с гидрофобным взаимодействием, ионообменной хроматографии, гель-электрофореза, диализа и/или аффинной хроматографии либо отдельно, либо в комбинации с другими стадиями очистки. Пригодность белка A в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, если он присутствует в молекуле, и будет понятна специалисту в данной области. Матрицей, к которой прикрепляется аффинный лиганд, чаще всего представляет собой агарозу, но доступны и другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол, обеспечивают более высокие скорости потока и меньшее время обработки, чем те, которые достигаются при использовании агарозы. Также доступны другие методики очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая HPLC, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарине, хроматография с использованием сефарозы на анионо- или катионообменной смоле (как, например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и осаждение сульфатом аммония, в зависимости от молекулы, которая подлежит извлечению.
[00112] После любой(любых) стадии(стадий) предварительной очистки смесь, содержащую молекулу, представляющую интерес, и загрязнители можно подвергнуть хроматографии гидрофобных взаимодействий при низком показателе pH с использованием элюирующего буфера при показателе pH в приблизительно 2,5-4,5, и проводимой при низких концентрациях солей (например, от приблизительно 0 до 0,25 M соли).
[00113] Антитело можно получить и очистить с использованием, например, какой-либо одной методики или комбинации методик, изложенных выше и/или в разделе примеры. Независимо от того, как именно очищается антитело, для подтверждения функционального связывания антитела по настоящему раскрытию можно проводить анализы связывания (до и/или после очистки). Например, можно использовать анализы на основе двойного ELISA. В некоторых аспектах первым антигеном (например, тикагрелор или его конкурент) покрывают лунку и связывание с этим антигеном иммобилизирует антитело, подготавливая его для выявления.
Фармацевтические составы
[00114] В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает фармацевтические композиции. Такие фармацевтические композиции могут представлять собой композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело. Такие фармацевтические композиции также могут представлять собой композиции, содержащие антитело или комбинацию антитела и фармацевтически приемлемый наполнитель. В отдельных аспектах фармацевтические композиции по настоящему раскрытию используют в качестве лекарственного препарата.
[00115] В отдельных аспектах антитело или комбинацию антитела (или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитело или комбинацию антитела) можно составлять с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или стабилизатором в виде фармацевтических композиций. В отдельных аспектах такие фармацевтические композиции являются подходящими для введения человеку или животному, не являющемуся человеком, посредством любого одного или нескольких путей введения с использованием способов, известных из уровня техники. Как будет понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения будет варьироваться в зависимости от необходимых результатов. Выражение "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или несколько нетоксичных материалов, которые не препятствуют эффективности биологической активности активных ингредиентов. Такие препараты, как правило, могут содержать соли, буферные средства, консерванты, совместимые носители и необязательно другие терапевтические средства. Такие фармацевтически приемлемые препараты также могут содержать совместимые твердые или жидкие наполнители, разбавители или инкапсулирующие вещества, которые являются подходящими для введения в организм человека. Другие представленные носители, наполнители и/или добавки, которые можно использовать в составах, описанных в данном документе, включают, например, ароматизирующие вещества, противомикробные средства, подсластители, антиоксиданты, антистатики, липиды, белковые наполнители, такие как сывороточный альбумин, желатин, казеин, солеобразующие противоионы, такие как натрий, и им подобные. Эти и дополнительные известные фармацевтические носители, наполнители и/или добавки, подходящие для использования в композициях, описанных в данном документе, известны в данной области, например, такие, которые перечислены в ʺRemington: The Science & Practice Pharmacyʺ, 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005), и в "Physician's Desk Reference", 60th ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (2005). Фармацевтически приемлемые носители нужно выбирать так, чтобы они были подходящими в плане желаемых или требуемых способа введения, растворимости и/или стабильности.
[00116] Составы, описанные в данном документе, содержат активные средства (например, антитела или фрагменты антител, такие как Fab или scFv) в концентрации, приведенной в масса/объем, подходящей для желаемой дозы. В определенных аспектах активное средство присутствует в составе в концентрации от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 50 мг/мл или от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 25 мг/мл. В определенных аспектах активное средство присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 25 мг/мл. В определенных аспектах концентрация активного средства в составе может варьироваться от приблизительно 0,1% до приблизительно 100% по весу. В определенных аспектах концентрация активного средства в отношении находится в диапазоне от 0,003 до 1,0 моль.
[00117] В одном аспекте составы по настоящему раскрытию являются апирогенными составами, которые практически свободны от эндотоксинов и/или аналогичных пирогенных веществ. Эндотоксины включают токсины, которые заключены внутри микроорганизма и выпускаются только тогда, когда микроорганизмы разрушаются или умирают. Пирогенные вещества также включают индуцирующий повышение температуры термостабильные вещества (гликопротеины) из внешней мембраны бактерий и других микроорганизмов. Оба эти вещества могут вызывать повышение температуры, гипотонию и шок при введении людям. Из-за возможных вредных эффектов даже низкие количества эндотоксинов должны быть удалены из фармацевтических лекарственных растворов для внутривенного введения. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США («FDA») установило верхний предел в 5 единиц эндотоксина (EU) на дозу на килограмм веса тела в период, продолжительностью один час, для внутривенных введений лекарственных средств (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). В отдельных конкретных аспектах уровни эндотоксинов и пирогенов в композиции составляют менее 10 EU/мг, или менее 5 EU/мг, или менее 1 EU/мг, или менее 0,1 EU/мг, или менее 0,01 EU/мг, или менее 0,001 EU/мг.
[00118] При использовании для введения in vivo составы по настоящему раскрытию должны быть стерильными. Составы по настоящему раскрытию можно стерилизовать различными способами стерилизации, в том числе стерилизацией фильтрованием, ионизирующим излучением и т. д. В одном аспекте состав является простерилизован фильтрацией с использованием предварительно простерилизованным 0,22-микронного фильтра. Стерильные композиции для инъекций могут быть составлены в соответствии со стандартной фармацевтической практикой, как описано в ʺRemington: The Science & Practice Pharmacyʺ, 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005).
[00119] Терапевтические композиции по настоящему раскрытию могут быть составлены для конкретных путей введения, таких как пероральное, назальное, легочное, местное (включая трансбуккальное и сублингвальное), ректальное, вагинальное и/или парентеральное введение. Формулировки "парентеральное введение" и "вводимый парентерально", используемые в данном документе, относятся к способам введения, отличным от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включают без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсульную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию. Составы по настоящему раскрытию, которые пригодны для местного или трансдермального введения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и средства для ингаляции. Антитела можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться (патент США № 7,378,110; 7,258,873; 7,135,180; заявка на патент США № 2004-0042972; и 2004-0042971).
[00120] Составы в целях удобства могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, и могут быть получены любым способом, известным в области фармации. Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему раскрытию можно изменять таким образом, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения необходимого терапевтического ответа у конкретного пациента, состава и способа введения, который не является токсичным для пациента (например, "терапевтически эффективное количество"). Выбранный уровень дозировки будет зависеть от разнообразных фармакокинетических факторов, включающих активность конкретных используемых композиций, путь введения, время введения, скорость экскреции конкретного используемого соединения, длительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и анамнез пациента, подлежащего лечению, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины. Подходящие дозировки могут варьироваться от приблизительно 0,0001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела или больше, например, приблизительно 0,1, 1, 10 или 50 мг/кг массы тела, при этом подходящими являются от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг массы тела.
[00121] Следует отметить, что раскрытие аналогично предусматривает, что можно создать составы, подходящие для применения в диагностике и исследованиях. Концентрацию активного средства в таких составах, а также присутствие или отсутствие наполнителей и/или пирогенов, можно выбирать, исходя из конкретной задачи запланированного применения.
Применения
[00122] Антитела, раскрытые в данном документе, являются применимыми в терапевтических способах, включая комбинированную терапию, для нейтрализации активности ингибиторов активации, агрегации и грануляции тромбоцитов, активаторов дезагрегации тромбоцитов и антитромботических средств. Таким образом, антитела, описанные в данном документе, находят применение во множестве задач, которые относятся к введению тикагрелора (включая сопутствующие способы) и соответственно применимы для нейтрализации действия тикагрелора и/или одного или нескольких метаболитов тикагрелора. В таких способах антитело может снижать, нейтрализовать, выводить или иным образом ингибировать активность тикагрелора, необязательно обратимо, и лечить или предупреждать любое число действий, нарушений и/или симптомов, связанных с введением тикагрелора и/или возникающих вследствие терапии, включающей тикагрелор.
[00123] Антитела можно вводить пациентам, которые получают лечение или которые нуждаются в лечении или профилактике показаний, которые поддаются лечению тикагрелором (BRILINTA) и/или при которых назначают этот препарат, включая, например, нестабильную стенокардию, первичные артериальные тромботические осложнения при атеросклерозе, такие как тромботический или эмболический инсульт, транзиторные ишемические приступы, заболевания периферических сосудов, инфаркт миокарда с тромболизом или без него, артериальные осложнения вследствие процедур при коронарной болезни, таких как коронарная ангиопластика (PTCA), эндартерэктомия, установка стента, хирургическое вмешательство по установке коронарного и другого сосудистого трансплантата, тромботические осложнения при хирургическом или механическом повреждении, такие как сохранение ткани после травмы при случайной или хирургической травме, реконструктивную хирургию, включающую кожные и мышечные лоскуты, состояния с вовлечением диффузного тромбозного/тромбоцитарного компонента, такие как диссеминированное внутрисосудистое свертывание, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитико-уремический синдром, тромботические осложнения при септицемии, респираторный дистресс-синдром у взрослых, антифосфолипидный синдром, гепарин-индуцированная тромбоцитопения и предэклампсия/эклампсия, или венозный тромбоз, такой как тромбоз глубоких вен, вено-окклюзионная болезнь, гематологические состояния, такие как миелопролиферативное заболевание, включая тромбоцитемию, серповидно-клеточную анемию; или в предотвращении активации тромбоцитов, индуцированной механическим путем in vivo, такой как сердечно-легочное шунтирование и экстракорпоральная мембранная оксигенация (предупреждение микротромбоэмболии), активации тромбоцитов, индуцированной механическим путем in vitro, такой как применение для хранения препаратов крови, например тромбоцитарной массы, или окклюзия шунта, как, например, при гемодиализе и плазмаферезе, тромбоз вследствие сосудистого повреждения/воспаления, такого как васкулит, артрит, гломерулонефрит, воспалительное заболевание кишечника и отторжение трансплантируемого органа, такие состояния, как мигрень.
[00124] В некоторых вариантах осуществления антитела, раскрытые в данном документе, можно вводить пациенту, который получает или который получал лечение, включающее тикагрелор, и который нуждается в лечении или будет нуждаться в лечении кровотечения или потенциального кровотечения, связанного с аортокоронарным шунтированием (CABG), кардиоторакальным хирургическим вмешательством, медиастинальным повторным зондированием, послеоперационным инсультом, механической вентиляцией, продолжительным пребыванием в отделении интенсивной терапии, неотложным хирургическим вмешательством, не связанным с сердцем (например, нейрологическим или офтальмологическим хирургическим вмешательством, хирургическим вмешательством на позвоночнике, интракраниальным хирургическим вмешательством, орбитальным хирургическим вмешательством, ортопедическим хирургическим вмешательством, нефрэктомией, гемиколэктомии и им подобными). В связи с этим, способы, представленные в данном документе, могут охватывать введение антитела в качестве совместного терапевтического средства с тикагрелором (одновременно) или в пределах периода времени после введения тикагрелора (например, минут, часов или дней). Например, в некоторых вариантах осуществления способ может включать введение антитела пациенту, которому вводили тикагрелор, в пределах 10-120 минут после введения тикагрелора. В некоторых вариантах осуществления способ может включать введение антитела пациенту, которому вводили тикагрелор, в пределах 1-48 часов после введения тикагрелора. В некоторых вариантах осуществления антитело водят субъекту, которому вводили тикагрелор в пределах периода времени, которое не будет достаточным для метаболизма и выведения тикагрелора и/или его метаболитов из субъекта.
[00125] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает способ ингибирования действия тикагрелор или его активного метаболита в отношении рецептора (P2Y12) у пациента.
[00126] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает способ ингибирования связывания тикагрелора или его активного метаболита с рецептором P2Y12 у пациента.
[00127] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает способ обеспечения активации ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов у пациента, которому вводили тикагрелор.
[00128] Антитела по настоящему раскрытию, такие как проиллюстрированы в примерах, можно использовать в диагностических целях. Например, одно или несколько целевых средств (тикагрелор или его метаболиты) можно выявлять в тканях или клетках субъекта с целью определения или скрининга циркулирующего в крови количества тикагрелора у субъекта. Диагностический набор может содержать одно или несколько антител и систему выявления, показывающую реакцию антитела с тикагрелором или его метаболитами, если она вообще присутствует.
[00129] Таким образом, настоящее раскрытие предусматривает ряд применений антител, включая применения в целях терапии, диагностики и исследований. Применения в целях диагностики и исследований могут быть in vivo или ex vivo.
Наборы
[00130] Другой аспект настоящего раскрытия представляет собой набор. В одном аспекте набор содержит любую из композиций или фармацевтических композиций на основе нуклеиновой кислоты, антитела, вектора экспрессии или клетки-хозяина, описанных выше, и инструкции или маркировку, указывающие на соответствующее применение или введение. Необязательно набор может также включать в себя один или нескольких контейнеров и/или шприцов или других устройств для облегчения доставки или применения. Настоящее раскрытие предполагает, что все компоненты или любое подмножество компонентов для проведения анализов с целью исследований, анализов с целью диагностики и/или введения терапевтически эффективных количеств можно поместить в набор. Аналогичным образом, данный набор может содержать инструкции для получения антитела путем, например, культивирования клетки-хозяина, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело по настоящему раскрытию в подходящих условиях. В качестве дополнительного примера набор для введения с целью терапии антитела по настоящему раскрытию может содержать раствор, содержащий фармацевтический состав на основе антитела, или лиофилизированный препарат на основе антитела, и инструкции для введению композиции пациенту, нуждающемуся в этом, и/или для восстановления лиофилизированного продукта. В определенных вариантах осуществления данный набор будет дополнительно содержать тикагрелор в составе, подходящем для введения субъекту (например, BRILINTA™, BRILIQUE™). В таких вариантах осуществления набор может дополнительно содержать инструкции для введения состава как с антителом, так и с тикагрелором пациенту, нуждающемуся в лечении антителом, тикагрелором или и антителом, и тикагрелором.
[00131] Настоящее раскрытие также охватывает готовый упакованный и маркированный фармацевтический продукт. Это готовое изделие включает соответствующую стандартную лекарственную форму в соответствующей емкости или контейнере, как, например, в стеклянном флаконе или другом контейнере, который герметично запечатан. В случае с лекарственными формами, подходящими для парентерального введения, активный ингредиент, например, вышеописанные антитела и/или состав на основе тикагрелора, является стерильным и подходящим для введения в виде не содержащего частиц раствора. В определенных аспектах данный состав является подходящим для инъекционного пути введения. В некоторых вариантах осуществления представляет собой подкожное введение. В некоторых вариантах осуществления введение представляет собой внутривенное введение. Таким образом, предусматриваются пути введения, включающие инъекцию или инфузию человеку или животному.
[00132] В конкретном аспекте составы по настоящему раскрытию составлены в отдельных однодозовых емкостях в виде стерильной жидкости. Иллюстративные контейнеры включают без ограничения флаконы, бутыли, предварительно наполненные шприцы, IV пакеты, блистерные упаковки (содержащие одну или несколько пилюль). Необязательно, совместно с таким(такими) контейнером(контейнерами) может прилагаться уведомление в форме, предписанной государственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, и такое уведомление отражает разрешение органа в отношении производства, применения или продажи для диагностики и/или введения человеку.
[00133] Как и в случае любого фармацевтического продукта, упаковочный материал и контейнер разработаны для защиты стабильности продукта во время хранения и транспортировки. Кроме того, продукты настоящего раскрытия включают инструкции для применения или другой информационный материал, который советует врачу, специалисту или пациенту, как правильно предупредить или лечить рассматриваемое заболевание или нарушение. Другими словами, готовое изделие включает инструктирующие средства, которые указывают или предлагают режим дозирования, включая без ограничения действующие дозы, процедуры мониторинга и т. д., и другую информацию о мониторинге.
[00134] Набор для диагностических анализов может предусматривать раствор, содержащий антитело или лиофилизированный препарат на основе антитела по настоящему раскрытию, где антитело специфично связывается с тикагрелором и/или его метаболитом, а также реагенты для выявления данного антитела. Антитело можно метить согласно способам, известным из уровня техники и описанным в данном документе, включая без ограничения метки, такие как низкомолекулярные флуоресцентные маркеры, белки, как, например, биотин, GFP или другие флуоресцентные белки, или эпитопные последовательности, такие как his или myc. Аналогично, основные антитела, используемые для выявления антитела, могут быть включены в набор. Первичные антитела могут быть направлены на последовательности антитела или метки, маркеры или эпитопы, которыми мечено антитело. В свою очередь, основные антитела могут быть маркированы для выявления или, если необходимо, дополнительного усиления сигнала, при этом первичные антитела могут быть выявлены по вторичным антителам, которые также могут быть включены в набор.
[00135] Также предусматриваются наборы для применения в исследованиях. Например, такие наборы могут иметь сходство с наборами, предназначенными для примений с целью диагностики или терапии, но дополнительно включают маркировку, уточняющую, что данный набор и его применение ограничиваются только исследовательскими целями.
Примеры
[00136] Список сокращений
Аббревиатура
Пояснение
ACN ацетонитрил
br широкий
BSA бычий сывороточный альбумин
CV объем колонки
d дублет
dd двойной дублет
DCM дихлорметан
DMF N,N-диметилформамид
DMSO диметилсульфоксид
DPBS физиологический раствор, забуференный фосфатом Дульбекко
EDC 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид)
EtOAc этилацетат
FA муравьиная кислота
HOAc уксусная кислота
HPLC высокоэффективная жидкостная хроматография
HRMS масс-спектрометрия высокого разрешения
HTS высокопроизводительный скрининг
HTRF® гомогенная флуоресценция с временным разрешением
HYFLO® вспомогательный фильтрующий материал, подвергнутый термощелочной обработке, обработанный карбонатом натрия
Hz герц
J константа взаимодействия
LC жидкостная хроматография
m мультиплет
MS масс-спектры
NMR ядерный магнитный резонанс
OAc ацетат
Pd/C палладий на угле
pM пикомолярный
PK/PD фармакокинетика/фармакодинамика
KF фторид калия
q квартет
r.t. комнатная температура
s синглет
sat. насыщенный
scFv одноцепочечный вариабельный фрагмент
t триплет
TFA трифторуксусная кислота
TEA триэтиламин
TBME трет-бутилметиловый эфир
THF тетрагидрофуран
TIM неактивный метаболит тикагрелора
TLC тонкослойная хроматография
TR-FRET Времяразрешенный флуоресцентный индуктивно-резонансный перенос энергии
Пример 1. Получение и характеристика гаптенов
[00137] В данном пример описаны способы синтеза, оптимизации, выделения и характеристики ряда гаптенов, которые использовали для создания иллюстративных антител, описанных в данном документе. Гаптены включают тикагрелор, метаболиты тикагрелора (TAM и TIM), биотинилированный тикагрелор и биотинилированный аденозин (см., например, фиг. 2 в отношении химических структур гаптенов в небиотинилированных формах). Тикагрелор синтезировали как описано в международной публикации патента WO 2000/034283 (Guile, et al., 2000), а TAM синтезировали как описано в международной публикации патента WO 1999/005143 (Guile, et al., 1999), каждая из которых включена посредством ссылки во всей своей полноте.
[00138] Прямофазную хроматографию проводили с использованием силикагеля 40S, 40M или 12i от Biotage или силикагеля 60 от Merck (0,063-0,200 мм). Флеш-хроматографию проводили с использованием либо стандартных стеклянных, либо пластиковых колонок, или на системе Biotage Horizon. Химические сдвиги приведены в ppm с использованием растворителя в качестве внутреннего стандарта. Протоны на гетероатомах, такие протоны как NH и OH, описывают только тогда, когда их выявляют с помощью ЯМР и, таким образом, они могут быть пропущены.
Пример 1.1. Биотинилированный тикагрелор
[00139] N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,3-дигидроксициклопентил)окси)этил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамид (1.1)
(1.1)
[00140] (i) Получение 2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)окси)этилметансульфоната (1.a)
(1.a)
[00141] Метансульфонил хлорид (0,086 мл, 1,10 ммоль) добавляли по каплям к раствору 2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)окси)этанола (см., Springthorpe, B. et. al. Bioorg.Med. Chem. Lett., 2007, 17, 6013-6018) (0,563 г, 1,0 ммоль) и TEA (0,209 мл, 1,50 ммоль) в DCM (5 мл) при 0°C. Смесь перемешивали при от 0°C до приблизительно 5°C на протяжении 3 ч. Реакционную смесь разбавляли DCM (30 мл) и промывали водой (5 мл). Смесь высушивали путем пропускания через разделитель фаз. Выпаривание растворителя и совместное выпаривание из толуола давали указанное в заголовке соединение (1.a) (714 мг, 111%) в виде густого масла желтого цвета, которое использовали необработанным без дополнительной очистки.
[00142] 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 1,02 (dd, 3H), 1,3-1,47 (m, 5H), 1,55 (s, 3H), 1,72 (d, 2H), 2,20 (d, 1H), 2,6-2,71 (m, 2H), 2,97 (s, 3H), 3-3,19 (m, 3H), 3,57-3,68 (m, 1H), 3,69-3,79 (m, 1H), 4,02 (td, 1H), 4,13-4,24 (m, 2H), 4,78 (dd, 1H), 5,13 (td, 1H), 5,57 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 7,03 (s, 1H), 7,07-7,16 (m, 2H).
[00143] 19F ЯМР (376 МГц, CDCl3) δ -141,37 (J=21,3), -138,10 (J=21,3).
[00144] (ii) Получение 3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-азидоэтокси)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)-N-((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-7-амина (1.b)
(1.b)
[00145] Смесь 2-(((3aR,4S,6R,6aS)-6-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)окси)этилметансульфоната (1.a) (0,641 г, 1 ммоль) и азида натрия (0,070 мл, 2,00 ммоль) в DMF (7 мл) нагревали до 60°C в течение 15,5 ч. в атмосфере азота. Образовывался белый осадок. Добавляли воду (20 мл) и продукт экстрагировали дважды с TBME (100 мл+40 мл). Органическую фазу сушили над Na2SO4. Органическую фазу фильтровали и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали при помощи флеш-хроматографии на кварцевой колонке 2×8 cм с использованием смеси гептан/EtOAc 1/1 в качестве элюента (TLC с использованием смеси гептан/EtOAc 1/1 (Rf продукта=0,5)). Сбор соответствующих фракций и выпаривание растворителей давали указанное в заголовке соединение (1.b) (514 мг, 87%) в виде чистого густого масла.
[00146] 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 1,00 (s, 3H), 1,33-1,42 (m, 5H), 1,59 (s, 3H), 1,73 (d, 2H), 2,17 (s, 1H), 2,68 (t, 2H), 2,96-3,17 (m, 3H), 3,19-3,33 (m, 2H), 3,52-3,63 (m, 1H), 3,72 (ddd, 1H), 4,03 (td, 1H), 4,79 (dd, 1H), 5,13 (td, 1H), 5,54 (dd, 1H), 6,43 (s, 1H), 6,96-7,23 (m, 3H).
[00147] (iii) Получение промежуточного продукта 3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-аминоэтокси)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)-N-((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-7-амина (1.c)
(1.c)
[00148] 3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-азидоэтокси)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)-N-((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-7-амин (1.b) (62,0 мг, 0,11 ммоль) в EtOH (99,5%) (2 мл) добавляли в Pd/C (5% Pd, 50 вес. % Pd/C, 22,46 мг, 5,28 мкмоль) и cмесь гидрогенизировали при атмосферном давлении в течение 2 ч. Реакционную смесь фильтровали через HYFLO® и затем фильтр промывали EtOH (99,5%). Растворитель удаляли при пониженном давлении, остаток повторно растворяли в DCM (2×2 мл), и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали при помощи флеш-хроматографии на кварцевой колонке 2×8 cм с использованием смеси DCM/NH3 (нас.) в MeOH 95/5 в качестве элюента. Сбор соответствующих фракций давал указанное в заголовке соединение (1.c) (41 мг, 69%).
[00149] 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 0,98 (m, 3H), 1,28-1,46 (m, 7H), 1,54 (s, 3H), 1,62-1,81 (m, 2H), 2,15 (s, 1H), 2,48-2,81 (m, 4H), 3,07 (tt, 3H), 3,34-3,47 (m, 1H), 3,53 (ddd, 1H), 3,99 (td, 1H), 4,79 (dd, 1H), 5,12 (td, 1H), 5,52 (dd, 1H), 7,02 (s, 1H), 7,09 (dt, 2H), 7,23 (s, 1H).
[00150] 19F ЯМР (376 МГц, CDCl3) δ -141,43 (J=21,3), -138,13 (J=21,3).
[00151] (iv) Получение промежуточного продукта (1S,2S,3S,5R)-3-(2-аминоэтокси)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)циклопентан-1,2-диола (1.d)
(1.d)
[00152] Предварительно охлажденную, с температурой ледяной/водяной бани, cмесь TFA (8 мл, 103,84 ммоль) и воды (0,88 мл, 48,85 ммоль) добавляли в предварительно охлажденную колбу с 3-((3aS,4R,6S,6aR)-6-(2-аминоэтокси)-2,2-диметилтетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-4-ил)-N-((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-7-амином (1.c) (340 мг, 0,61 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0-5°C в течение 1 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении, а остаток растворяли в DCM (100 мл) и промывали NaHCO3 (нас. 10 мл). Солевой раствор (5 мл) добавляли в водную фазу и экстрагировали с EtOAc (30 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na2SO4. Фильтрация после выпаривания растворителей давала неочищенный продукт в виде твердого вещества грязно-белого цвета. Соединение очищали посредством препаративной HPLC на колонке XBridge C18 (10 мкм 250×50 ID мм) с использованием градиента 35-75% ACN в буфере H2O/ACN/NH3 95/5/0,2 на протяжении 20 минут при скорости потока 100 мл/мин. Соединения выявляли с помощью УФ-детектирования при 298 нм. Пиковые фракции выпаривали досуха при пониженном давлении. Остаток растворяли в DCM и фильтровали через разделитель фаз. Удаление растворителя при пониженном давлении давало указанное в заголовке соединение (1.d) (213 мг, 67,5%). LC-MS масса/заряд 522,3 (M+H)+.
[00153] (v) Получение соединения N-(2-(((1S,2S,3S,4R)-4-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)-2,3-дигидроксициклопентил)окси)этил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамида. (1.1)
[00154] 2,5-диоксопирролидин-1-ил 6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексаноат (21,77 мг, 0,04 ммоль) добавляли к раствору (1S,2S,3S,5R)-3-(2-аминоэтокси)-5-(7-(((1R,2S)-2-(3,4-дифторфенил)циклопропил)амино)-5-(пропилтио)-3H-[1,2,3]триазоло[4,5-d]пиримидин-3-ил)циклопентан-1,2-диола (20 мг, 0,04 ммоль) в сухом DMF (1,0 мл) и смесь помещали в атмосферу азота и перемешивали при r.t. в течение 6 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении при 40°C. Соединение очищали посредством препаративной HPLC на колонке Kromasil C18 (10 мкм 250×20 ID мм) с использованием градиента 20-60% ACN в буфере H2O/ACN/FA 95/5/0,2 на протяжении 20 минут со скоростью потока 19 мл/мин. Соединения выявляли с помощью УФ-детектирования при 298 нм. Пиковые фракции собирали, концентрировали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения (1.1) (21,4 мг, 57,3%).
[00155] 1H ЯМР (600 МГц, DMSO): Присутствуют два ротамера (соотношение 5:1), сигналы от основного ротамера при δ 0,81 (t, 3H), 1,15-1,64 (m, 20H), 2,03 (ddd, 7H), 2,12 (ddd, 1H), 2,57 (d, 1H), 2,59-2,67 (m, 1H), 2,77-2,89 (m, 2H), 2,93 (dd, 1H), 2,96-3,01 (m, 4H), 3,05-3,12 (m, 1H), 3,15 (td, 1H), 3,18-3,25 (m, 2H), 3,39-3,46 (m, 1H), 3,48 (tt, 1H), 3,7-3,76 (m, 1H), 3,92 (s, 1H), 4,08-4,14 (m, 1H), 4,30 (dd, 1H), 4,54 (dd, 1H), 4,95 (q, 1H), 5,06 (s, 1H), 5,13 (d, 1H), 6,35 (s, 1H), 6,42 (s, 1H), 7,07 (d, 1H), 7,31 (ddt, 2H), 7,71 (dt, 2H), 7,82 (t, 1H), 9,36 (d, 1H). Выбранные сигналы от минорного ротамера при δ 0,98 (CH 3 ), 8,95 (ArNH).
[00156] HRMS Calcd [C45H65F2N11O7S2]+: 974,4556; измеренное значение: 974.4585 (M+H)+
Пример 1.2. Биотинилированный аденозин
[00157] N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-3,4-дигидрокситетрагидрофуран-2-ил)метил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамид (1.2)
(1.2)
[00158] (i) Получение N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-2,2-диметилтетрагидрофуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил)метил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамида (1.e)
(1.e)
[00159] DMF (2 мл) добавляли к 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексаноату (55,6 мг, 0,10 ммоль) и 9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(аминометил)-2,2-диметилтетрагидрофуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил)-9H-пурин-6-амину (30 мг, 0,10 ммоль) (см. Austin, D.J. and Liu, F., Tetrahedr. Lett., 2001, 3153-3154) при r.t. и реакционную смесь помещали в атмосферу азота и перемешивали в течение 1 ч. и 45 мин. с получением (1.e). Растворитель затем удаляли при пониженном давлении. Использовали в виде необработанного продукта без дополнительной очистки. LC-MS масса/заряд 759 (M+H)+, 757 (M-H)-.
[00160] (ii) Получение конечного соединения N-(((2R,3S,4R,5R)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-3,4-дигидрокситетрагидрофуран-2-ил)метил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамида (1.2)
[00161] Смесь TFA (1,8 мл, 23,36 ммоль) и воды (0,2 мл, 11,10 ммоль) добавляли к неочищенному N-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-2,2-диметилтетрагидрофуро[3,4-d][1,3]диоксол-4-ил)метил)-6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)гексанамидо)гексанамиду (1.e) (76 мг, 0,1 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч. 25 минут. Растворители удаляли при пониженном давлении и остаток растворяли в DMSO. Соединение очищали посредством препаративной HPLC на колонке XBridge C18 (10 мкм 250×19 ID мм) с использованием градиента 5-45% ACN в буфере H2O/ACN/NH3 95/5/0,2 на протяжении 20 минут при скорости потока 19 мл/мин. Соединения выявляли с помощью УФ при 259 нм. Пиковые фракции концентрировали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения (1.2) (50 мг, 69,6%) в виде рыхлого твердого вещества белого цвета.
[00162] 1H ЯМР (600 МГц, DMSO, 40°C) δ 1,17-1,26 (m, 4H), 1,27-1,4 (m, 6H), 1,43-1,54 (m, 7H), 1,62 (ddt, 1H), 1,99-2,06 (m, 4H), 2,12 (t, 2H), 2,58 (d, 1H), 2,82 (dt, 1H), 2,96-3,05 (m, 4H), 3,05-3,14 (m, 1H), 3,36 (dt, 1H), 3,44 (dt, 1H), 3,96 (dd, 1H), 4,04 (dd, 1H), 4,11-4,15 (m, 1H), 4,29-4,33 (m, 1H), 4,67 (dd, 1H), 5,16 (d, 1H), 5,38 (d, 1H), 5,84 (d, 1H), 6,29 (s, 1H), 6,33 (d, 1H), 7,25 (s, 2H), 7,64 (dt, 2H), 8,11 (t, 1H), 8,16 (s, 1H), 8,31 (s, 1H). HRMS рассч. для [C32H50N10O7S]+: 719,3657; найденное значение: 719,3667 (M+H)+
Пример 2. Выделение и идентификация антител к тикагрелору/TAM
[00163] Данный пример иллюстрирует стратегии и методики, которые можно использовать в получении антител к тикагрелору и его метаболитам, соединениям, которые характеризуются структурным подобием с ATP, и содержат аденозин-подобный кор (Springthorpe et al 2007 Bioorg Med Chem Lett. 17:6013-6018). Химические структуры тикагрелора, активного метаболита тикагрелора (TAM) и неактивного метаболита тикагрелора (TIM) показаны на фиг. 2. Как рассматривается выше, антитела, раскрытые и созданные в данном документе, могут связывать и нейтрализовывать тикагрелор и TAM и могут связываться с TIM, но не связывают или в значительной степени не ингибируют другие соединения, имеющие родственную структуру, такие как аденозин. В то время, как активность связывания с TIM представляет собой необязательное свойство антитела, раскрытого в данном документе, антитела, которые характеризуется активностью связывания с TIM, как ожидается, не влияют на требуемую дозу антитела/антидота, поскольку TIM обычно представляет малую или незначительную фракцию метаболитов тикагрелора.
[00164] Общие эпитопы, т.е., уникальные R-группы для тикагрелора и TAM (дифторфенилциклопропильные и тиопропильные заместители), использовали с целью подтверждения специфичности связывания антитела и селективности в отношении данных соединений. Эпитоп, представляющий интерес, обведен пунктирной линией на фиг. 2. Гаптены, описанные в примере 1, использовали с целью определения эпитопа антитела дл групп дифторфенилциклопропильных и тиопропильных заместителей. Как описано в примере 1, линкеры для биотинилированных гаптенов (биотинилированного тикагрелора и биотинилированного аденозина) располагались на гликольной группе. Данная стратегия обеспечивала возможность получения антител, характеризующихся специфичностью связывания с немодифицированными дифторфенилциклопропильной и тиопропильной группами, биотинилированным тикагрелором/TAM, а также предоставляла возможность проведения скрининга и отрицательного отбора библиотек антител, которые связывают аденозин.
[00165] Используя известные методики, применяли библиотеку фагового дисплея scFv человека для создания scFv антител, и конкретные scFv выделяли из библиотеки в серии повторяющихся циклов отбора по отношению к биотинилированному тикагрелору с отрицательным отбором по биотинилированному аденозину, как описано в сущности в Lloyd et al 2009 PEDS 22:159-168, включенной в данный документ посредством ссылки. Отбирали определенное количество отдельных клонов из числа проведенных 2 раунда и 3 раунда отбора, scFv экспрессировали в бактериальной периплазме и подвергались скринингу в отношении специфичности в трех параллельных биохимических анализах. Данные анализы использовали для скрининга в отношении i) связывания с биотинилированным тикагрелором (анализ 1), ii) связывания с биотинилированным аденозином (анализ 2) и iii) связывания с биотинилированным тикагрелором в присутствии 50-кратного избытка немодифицированного тикагрелора (анализ 3) с целью подтверждения специфичности к тикагрелору, но не к биотинилированному линкеру.
Анализы 1, 2 и 3 осуществляли с использованием одинаковых общих методик и стратегии. Вкратце, HTS неочищенных образцов периплазматического scFv в отношении связывания с биотинилированным тикагрелором или с биотинилированным аденозином осуществляли с использованием технологии анализа HTRF®. HTRF® (гомогенная флуоресценция с временным разрешением) основана на принципе TR-FRET (времяразрешенного флуоресцентного индуктивно-резонансного переноса энергии). Вкратце, в TR-FRET используется перенос энергии от донорного флуорофора (в данном случае криптата европия) к акцепторному флуорофору (в данном случае XL665). С учетом того, что донорный и акцепторный флуорофоры находятся в непосредственной близости (примерно <10 нм), возбуждение донорного криптата европия (337 нм) вызывает перенос энергии на акцепторный XL665, который, в свою очередь, испускает сигнал флуоресценции при 665 нм. Данную технологию можно использовать для чувствительного измерения биомолекулярных взаимодействий путем присоединения донорного и акцепторного флуорофоров (либо непосредственно, либо опосредованно) к каждому партнеру по связыванию в конкретном взаимодействии. Формат HTS для связывания scFv с биотинилированным тикагрелором (анализ 1) представлен ниже и основан на присутствии химических меток как на биотинилированном тикагрелоре, так и на периплазматическом scFv, меченого гистидином:
стрептавидин, конъюгированный с криптатом европия:биотинилированный тикагрелор:scFv-His:XL665, конъюгированный с антителом к His
[00166] Анализ осуществляли в буфере, содержащем DPBS, pH 7,4 (Gibco 14190-086), KF (VWR 103444T) (0,4M), и Tween 20 (Sigma P9416) (0,05%) в объеме анализа, составляющем 10 мкл, с использованием 384-луночных планшетов для анализа с черными лунками уменьшенного объема (Corning/Costar 3676). Данный анализ проводили путем добавления 5 мкл биотинилированного тикагрелора (60 нМ с получением конечной концентрации в 30 нМ), 2 мкл образца периплазматического scFv (20% конечной концентрации) и 3 мкл раствора, содержащего как стрептавидин, меченный криптатом европия (CisBio 610SAKLB) (4,2 нМ с получением конечной концентрации в 1,26 нМ), так и антитело к His, меченное XL665 (CisBio 61HISXLB) (40 нМ с получением конечной концентрации в 12 нМ). Предусматривали лунки для отрицательного контроля связывания, которые содержали все перечисленные выше компоненты анализа за исключением того, что вместо периплазматического scFv добавляли 2 мкл буфера для анализа. Планшеты для анализа инкубировали в течение 4 ч. при RT перед тем как их считывали на планшет-ридере Envision с использованием стандартного протокола считывания HTRF, при котором возбуждение образцов происходит при 337 нм и времяразрешенное испускание флуоресценции измеряют как при 620 нм, так и при 665 нМ.
[00167] Необработанные импульсы при 665 нм и при 620 нм сперва конвертировали в значения соотношения 665 нм/620 нм, а затем результаты выражали в виде значений дельта F (%). Дельта F рассчитывали согласно следующему уравнению:
Дельта F (%)={((соотношение образцов 665/620)- (соотношение 665/620 для отрицательного контроля))/(соотношение 665/620 для отрицательного контроля)}x100
[00168] (Соотношения для отрицательного контроля получали от лунок отрицательного контроля связывания). scFv, представляющие значения дельта F выше 100%, определяли как хиты в данном анализе.
[00169] Тот же самый описанный выше протокол использовали для проведения анализа неочищенных образцов периплазматического scFv в отношении связывания с биотинилированным аденозином (конечная концентрация для анализа 30 нМ). Формат анализа 2 можно изобразить как показано ниже:
стрептавидин, конъюгированный с криптатом европия:биотинилированный аденозин:scFv-His:XL665, конъюгированный с антителом к His
[00170] В анализе 3 использовали тот же самый описанный выше протокол для проведения анализа HTS, при помощи которого идентифицировали неочищенные образцы периплазматического scFv, которые демонстрировали сниженное связывание с биотинилированным тикагрелором в присутствии избытка свободного немодифицированного тикагрелора. Данный протокол модифицировали из анализа 1 с отличием в том, что анализ 3 осуществляли в присутствии 50-кратного молярного избытка свободного немодифицированного тикагрелора (1500 нМ).
[00171] Хит определяли как связывание с биотинилированным тикагрелором (дельта F > 100% в анализе 1), отсутствие связывания с биотинилированным аденозином (дельта F < 25% в Анализе 2) и сниженное на >50% связывание с биотинилированным тикагрелором в присутствии избытка свободного немодифицированного тикагрелора. Пример корелляции данных анализов 1 и 3 показан на фиг. 3. Некоторое количество scFv продемонстрировало ограниченное ингибирование в присутствии избытка свободного немодифицированного тикагрелора, свидетельствуя о том, что они имели связывающее взаимодействие c определенным компонентом тикагрелора и линкером. Определили подмножество scFv, у которых связывание с биотинилированным тикагрелором ингибировалось (>50%) в присутствии избытка свободного немодифицированного тикагрелора. scFv ранжировали на основе % ингибирования связывания, наблюдаемого в анализе 3 против анализа 1 (50-80%, 80-90%, >90%), причем scFv, дающему >90% ингибирования (включая TICA0072), назначали приоритет для проведения дальнейшей характеристики. Хиты scFv с уникальными последовательностями превращали в Fab и экспрессировали в клетках CHO с использованием стандартных методик.
Экспрессия и очистка Fab
[00172] Отдельные плазмиды для экспрессии HC и LC использовали для транзиентной трансфекции на основе векторов экспрессии, описанных в Persic et al. 1997. Векторы модифицировали так, чтобы они содержали точку начала репликации EBV (OriP). Вектор Fab (HC) содержал только константный участок 1 (CH1) и шарнирные участки, а CH2 и CH3 удаляли. ДНК HC и LC добавляли к 150 мМ NaCl и 25 кДа линейного PEI (Polysciences Europe, Германия 23966), согласно рекомендациям производителя. Комплекс ДНК-PEI затем добавляли к клеткам яичника китайского хомячка дикого типа (CHO wt), которые происходят от клеточной линии CHOK1 (ECACC № 85051005), адаптированной для суспензионной культуры (Daramola O, et al 2014). Через 7 дней клетки собирали путем центрифугирования и надосадочные жидкости фильтровали. Надосадочную жидкость культуры клеток, содержащую белок Fab, загружали непосредственно в колонку для хроматографии, заполненную 5 мл IgG-CH1 CaptureSelect (Life Technologies, Карлсбад, США), при скорости потока 5 мл/мин. с использованием Äkta Purifier (GE Healthcare). Колонки уравновешивали и промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), pH 7,2, и элюировали с использованием 20 мМ цитрата натрия, 150 мМ хлорида натрия, pH 3,5 (IgG-CH1 CaptureSelect), согласно инструкциям производителя смолы. Элюированные Fab доводили до pH 5,5 и фильтровали (0,22 мкм Steriflip, Millipore EMD, Бетесда, США) перед анализом. Концентрацию белка определяли посредством абсорбции при 280 нм с использованием спектрофотометра DU520 UV/vis (Beckman Coulter, Брея, США). Чистоту образцов определяли с использованием колонки TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, Токио, Япония) и системы 1100 HPLC (Agilent Technologies, Санта Клара, США) работающих при 1,0 мл/мин.
Пример 3. Fab к тикагрелору/TAM
[00173] Структурную базу данных ("DrugsDB", Oprea T.I et al 2011 Mol. Inform. 30(2-3), 100-111, включена в данный документ посредством ссылки), содержащую имеющиеся на рынке лекарственные средства, проверяли с целью определения молекул, которые характеризуются определенным структурным подобием с тикагрелором. При определении данные структурно подобные молекулы использовали для изучения специфичности связывания Fab помимо аденозина и его фосфорилированных форм (например, ADP и ATP). Базу данных проверяли в отношении молекул, характеризующихся 2D-подобием по фингерпринтам, подобием 3D-формы и электростатическим подобием с тикагрелором на основе cтруктур, определенных при помощи ЯМР- и рентгеновского анализа. Из этого анализа in silico выбирали панель из 12 соединений, которая включала шесть потенциальных сопутствующий препаратов. Структуры этих соединений показаны на фиг. 4.
[00174] Специфичность изучали в анализе в формате конкурентного связывания, в котором исследовали способность или иное свойство каждого исследуемого соединения конкурентно ингибировать взаимодействие биотинилированного тикагрелора с соответствующим Fab. Конкурентный анализ в формате HTRF® использовали как показано ниже, в котором целью являлось измерение конкурентного связывания биотинилированного тикагрелора с каждым His-Fab из панели исследуемых соединений:
антитело к His, конъюгированное с криптатом европия: исследуемый His-Fab: биотинилированный тикагрелор: стрептавидин, меченный XL665.
[00175] Данный анализ в базовом формате использовали для оценки профиля селективности лидерных Fab в конце как фазы выделения лидера, так и фазы оптимизации лидера, и для целей данных исследований Fab получали с использованием вектора экспрессии His-Fab.
[00176] Анализ осуществляли в буфере, содержащем DPBS, pH 7,4 (Gibco 14190-086), KF (VWR 103444T) (0,4 M) и BSA (PAA K05-013) (0,1%), в объеме анализа 20 мкл в 384-луночных планшетах для анализа с черными лунками уменьшенного объема (Corning/Costar 3676). Протокол анализа включал добавление 5 мкл биотинилированного тикагрелора, 5 мкл титра каждого исследуемого в отношении селективности соединения, 5 мкл соответствующего His-Fab и 5 мкл объединенного раствора, содержащего как антитело к His, меченное криптатом европия (CisBio 61HISKLB) (5,33 нМ с получением конечной концентрации в 1,33 нМ), так и стрептавидин, меченный XL665 (CisBio 611SAXLB) (40 нМ с получением конечной концентрации в 10 нМ). Предусматривали лунки общего контроля связывания, которые содержали все перечисленные выше компоненты для анализа за исключением того, что вместо исследуемого в отношении селективности соединения добавляли 5 мкл буфера для анализа. Подготавливали лунки отрицательного контроля связывания, которые содержали все компоненты для анализа, включенные в лунки с контролем общего связывания, за исключением того, что вместо His-Fab добавляли 5 мкл буфера для анализа. Серийные титры исследуемого соединения составляли либо 1/2, либо 1/3, в зависимости от конкретного эксперимента, и наибольшие конечные концентрации соединения в анализе оптимизировали в зависимости от конкретного соединения. Концентрацию биотинилированного тикагрелора и His-Fab оптимизировали в зависимости от конкретного Fab в отдельных экспериментах. Для четырех исследованных Fab в конце фазы выделения лидера (TICA0010, TICA0049, TICA0053 и TICA0072) использованные конечные концентрации реагентов для анализа изложены в таблице 1 ниже:
Таблица 1
ID антитела | [Антитело] (нМ) | [Биотинилированный тикагрелор] (нМ) |
TICA0039 | 16,0 | 139,9 |
TICA0049 | 16,0 | 37,9 |
TICA0053 | 16,0 | 70,7 |
TICA0072 | 8,0 | 17,6 |
[00177] В отношении двух Fab, исследованных в конце фазы оптимизации лидера (TICA0162 и TICA0212), использованные конечные концентрации реагентов для анализа составляли: 5 нМ биотинилированного тикагрелора и 1 нМ His-Fab в обоих случаях. Множество исследуемых в отношении селективности соединений, используемых в данных экспериментах, растворяли в 100% DMSO, а возникновение снижения анализируемого сигнала, обусловленного средой-носителем, может начаться при концентрациях выше примерно 1% DMSO. С целью обеспечения последующей нормализации данных для устранения любых подобных эффектов, обусловленных средой-носителем, в большинство экспериментов, в которых конечные концентрации DMSO в анализе отражали концентрации серийных разведений исследуемых соединений, включали параллельные титры отдельно DMSO. В конце проведения процедуры данную пробу инкубировали в течение 3 ч. при RT перед считыванием на планшет-ридере Envision с использванием стандартного протокола для считывания.
[00178] Для последующего анализа данных необработанные импульсы при 665 нм и при 620 нм сперва конвертировали в значения соотношения 665 нм/620 нм, которые затем использовали для подсчета значений дельта F в % согласно уравнению, изложенному в анализе 1. Значение соотношения для отрицательного контроля, использованное в подсчете дельта F в %, получали для лунок отрицательного контроля связывания. Значения дельта F в % использовали для подсчета значений в % специфичного связывания согласно уравнению ниже:
Специфичное связывание (%)={(дельта F образца-дельта F для отрицательного
контроля связывания)/
(Дельта F общего связывания-дельта F для отрицательного контроля связывания)}x100
[00179] Для стандартных подсчетов % специфичного связывания значение дельта F общего связывания брали из лунок с контролем общего связывания, которые содержали все из вышеперечисленных компонентов анализа, но без включения какого-либо конкурирующего исследуемого соединения.
[00180] В тех экспериментах, где использовали нормализацию по DMSO, % специфичного связывания подсчитывали в сущности согласно уравнению выше за исключением того, что в данном случае значение дельта F для общего связывания брали из лунок, содержащих все из компонентов в лунках с контролем общего связывания, а также DMSO в концентрации, эквивалентной концентрации в соответствующей лунке с образцом.
[00181] Результаты первичных экспериментов данного типа обобщены в таблице 2. В трех из четырех первичных Fab, которые были изучены (TICA0010, TICA0049 и TICA0053), соединение кангрелор продемонстрировало конкурентное ингибирование связывания Fab с биотинилированным тикагрелором. В данном случае с TICA0049 как пантопразол, так и линезолид демонстрировали частичное конкурентное ингибирование. Как показано в таблице 2, Fab TICA0072 не демонстрировал ингибирования в случае с одиннадцатью из двенадцати соединений, а в случае с пантопразолом показал слабое частичное ингибирование.
[00182] Ингибирование с немодифицированным тикагрелором и TAM наблюдали для всех четырех Fab, исследованных в данной серии экспериментов, при значениях IC50, находящихся в диапазоне от 0,1 мкM до 0,5 мкM. Конкурентное ингибирование также выявляли с TIM для двух их четырех Fab (TICA0049 и TICA0072), однако при значениях IC50 >50 мкM, указывая на наличие значительно сниженной аффинности TIM относительно немодифицированного тикагрелора и TAM. На основе результатов в таблице 2 TICA0072 идентифицировали как средство, которре характеризуется наиболее благоприятным профилем селективности. TICA0049 идентифицировали как потенциальное резервное средство на основе тех критериев, что данный Fab продемонстрировал наименьшее связывание с кангрелором среди оставшихся трех Fab.
Таблица 2. Относительные значения IC50 для каждого из 12 исследуемых соединений (фиг. 4) и немодифицированного тикагрелора, TAM и TIM в отношении ингибирования связывания с биотинилированным тикагрелором для каждого исследуемого Fab
IC50 (мкM) для разных соединений в отношении лидерного his-Fab | ||||
Соединение | TICA0010 | TICA0049 | TICA0053 | TICA0072 |
Фенофибрат | NI | NI | NI | NI |
Нилвадипин | NI | NI | NI | NI |
Цилостазол | NI | NI | NI | NI |
Букладезин | NI | NI | NI | NI |
Регаденозон | NI | NI | NI | NI |
Циклотиазид | NI | NI | NI | NI |
Цифлутрин | NI | NI | NI | NI |
Ловастатин | NI | NI | NI | NI |
Линезолид | NI | 467,1 | NI | NI |
Симвастатин | NI | NI | NI | NI |
Кангрелор | 102,4 | 207,9 | 17,5 | NI |
Пантопразол | NI | 263,7 | NI | 498,0 |
Тикагрелор | 0,122 | 0,257 | 0,109 | 0,113 |
TAM | 0,124 | 0,412 | 0,134 | 0,299 |
TIM | NI | 53,4 | NI | 54,4 |
NI означает отсутствие ингибирования.
[00183] Во второй серии экспериментов получали дополнительные данные о селективности Fab TICA0049 и TICA0072, в которой подмножество четырех из двенадцати соединений, перечисленных в фиг. 4, повторно исследовали вместе с тикагрелором, TAM и TIM и рядом соединений, родственных аденозину. В данном случае, в качестве уточнения результатов ранее проведенных исследований в таблице 2, эксперименты разрабатывали с целью обеспечить возможность нормализации процентных значений специфичного связывания для устранения любых неспецифических эффектов, обусловленных средой-носителем с DMSO. Нанесенные на график данные из примера второй этой серии экспериментов показаны на фиг. 5 вместе со сведенными в таблицу 3 значениями IC50.
Таблица 3. Результаты из примера в отношении IC50 для подмножества четырех из двенадцати соединений, перечисленных на фиг. 4, тикагрелора, TAM, TIM и ряда родственных аденозину соединений в исследованиях селективности конкурентного связывания (нормализованы по DMSO)
Соединение | TICA0049 | TICA0072 |
Аденозин | NI | NI |
ADP | NI | NI |
2MeS ADP | NI | NI |
ATP | NI | NI |
2 MeS ATP | NI | NI |
Букладезин | 864,9 | NI |
Линезолид | 902,0 | NI |
Кангрелор | 188,4 | NI |
Пантопразол | 243,5 | 1546,0 |
Тикагрелор | 0,368 | 0,356 |
TAM | 0,366 | 0,483 |
TIM | 74,8 | 119,5 |
[00184] Как и в более ранних экспериментах TICA0072 показал наиболее благоприятный профиль селективности, и только в случае с пантопразолом показывал слабое частичное ингибирование (IC50 > 1500 мкM) среди четырех исследованных соединений. В случае с TICA0049 наблюдали значительное ингибирование в отношении кангрелора и пантопразола при наблюдаемом слабом ингибировании в отношении линезолида и букладезина. Следует отметить, что незначительные отличия в абсолютных значениях IC50 между первой и второй серией экспериментов для конкретного исследуемого соединения, по сути, не изменяют общих заключений. Такие различия могут исходить из того факта, что нормализацию по DMSO включали во вторую серию экспериментов в комбинации с тем фактом, что в ряде случаев авторы настоящего изобретения пытались измерить очень слабое ингибирование.
[00185] Измеренные как для TICA0049, так и для TICA0072 значения IC50 в отношении тикагрелора и TAM находились в диапазоне от 0,3 мкM до 0,5 мкM, при этом значения IC50 для TIM при значениях выше 2 log были выше при 74,8 мкM и 119,5 мкM, соответственно. Остаточное ингибирование наблюдали в случае с аденозином, ADP, ATP и метилтио-производными последних двух соединений как для Fab TICA0049, так и для Fab TICA0072, однако его выявляли только при наиболее высоких концентрациях исследуемых соединений и его считали значимым.
[00186] Мы пришли к выводу, что TICA0072 являлся единственным Fab, который рассматривается в качестве специфичного для тикагрелора и TAM.
Пример 4. Измерение аффинности Fab к тикагрелору/TAM
[00187] Аффинность Fab к тикагрелору, полученных выше, определяли с использованием интерферометрии биослоя на Octet Red384. Для измерения аффинности Fab-антитела к тикагрелору разбавляли до концентрации 2x конечной концентрации для анализа в буфере для анализа (PBS, Tween20 0,05%, BSA 0,02%), например, 200 нМ. 2-кратное серийное разведение тикагрелора по 10 точкам готовили в 96-луночном полпропиленовом планшете Greiner. Равные объемы (например 70 мкл плюс 70 мкл) разведеного антитела и свободного тикагрелора затем переносили во второй полипропиленовый планшет Greiner. Образцы перемешивали путем пипетирования, накрывали пленкой для планшетов и позволяли им уравновеситься в течение 3-5 дней при комнатной температуре. После уравновешения 60 мкл титров антитела/тикагрелора переносили в двух параллелях в 384-луночный черный полипропиленовый планшет. Биотинилированный тикагрелор разводили до 250 нМ в буфере для анализа и добавляли в чередующиеся лунки из первых 2 колонок 384-луночного планшета для анализа, при этом оставшиеся лунки содержали только буфер для анализа. Стрептавидиновые биосенсоры предварительно выдерживали в буфере для анализа в течение по меньшей мере 10 минут. Планшеты с образцами и биосенсоры затем загружали в платформу OctetRed384.
[00188] Все анализы проводили при комнатной температуре. После уравновешения на исходном уровне в течение 60 с. в буфере для анализа биотинилированный тикагрелор загружали на стрептавидиновые биосенсоры в течение 300 с., с последующим добавлением буфера для анализа в течение 600 с. для установления нового исходного уровня. Смесям антитело/тикагрелор затем позволяли связаться с поверхностью сенсора с биотинилированным тикагрелором в течение 30-600 с., в зависимости от используемой концентрации антитела. Полученные в результате данные фазы ассоциации анализировали с использованием программного обеспечения для анализа OctetRed Data. Сигналы выравнивали по исходному уровню и сигнал от эталонного сенсора (контроль без антитела) вычитали для каждого образца, затем данные экспортировали для анализа с использованием программного обеспечения для анализа KinExA n-Curve. Используя анализ Constant Partner, определяли равновесную KD для Fab-антител к тикагрелору. Данные продемонстрировали, что Fab TICA0072 и TICA0049 характеризовались аффинностью к тикагрелору при 7,4 нМ и 11,6 нМ, соответственно (таблица 4).
Таблица 4. Анализ равновесной аффинности для Fab к тикагрелору
ID антитела | Гаптен | Равновесная KD | Доверительный интервал 95% |
TICA0072 | Тикагрелор | 7,43 нМ | 1,75-21,46 нМ |
TICA0049 | Тикагрелор | 11,6 нМ | 1,7-66,5 нМ |
Пример 5. Оптимизация антитела к тикагрелору/TAM TICA0072
[00189] Антитело TICA0072 оптимизировали с использованием отборов с помощью фаговых дисплеем на основе аффинности. Большие фаговые библиотеки scFv, полученные из лидерных последовательностей scFv, создавали с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза определяющих комплементарность участков (CDR) 1, 2 или 3 вариабельного участка тяжелой (VH) цепи или CDR 1, 2 или 3 вариабельного участка легкой (VL) цепи с использованием стандартных методик молекулярной биологии, как описано в (Clackson and Lowman 2004 Practical Approach Series 266). Библиотеки подвергали отборам с использованием фагового диспля на основе аффинности, чтобы выбрать варианты с более высокой аффинностью к тикагрелору и TAM. Вкратце, частицы scFv-фаг инкубировали в растворе со уменьшающимися концентрациями биотинилированного тикагрелора (типичным примером будет от 20 нМ до 20 пМ за четыре раунда отбора), как описано, по сути, ранее (Thompson et al 1996 J Mol Biol. 256 (1):77-88). Неочищенные периплазматические экстракты, содержащие scFv, получали для репрезентативного числа отдельных scFv из направленных на CDR продуктов отбора и подвергали скринингу в формате конкурентного анализа связывания с эпитопом HTRF®, разработанного для скрининга на наличие улучшений в отношении аффинности относительно TICA072.
[00190] Вкратце, с целью скрининга вариантов scFv и Fab с улучшенной аффинностью конкурентный анализ связывания с эпитопом HTRF® использовали на основе конкуренции в отношении исследуемых вариантов scFv, по взаимодействию между исходным IgG TICA0072 и биотинилированным тикагрелором. Данный анализ использовали в качестве первичного одноточечного HTS для скрининга образцов неочищенных периплазматических экстрактов scFv, а также в качестве многоточечного вторичного анализа профиля с целью измерения улучшений по значениям IC50 для очищенных как scFv-, так и Fab-вариантов к исходному TICA0072. Хотя анализы конкурентного связывания эпитопов, как, например, описанный в данном документе, обычно не используют для определения значений абсолютной аффинности, такие анализы можно использовать в качестве базы для HTS на основе аффинности. Кроме того, кратности повышения IC50 для очищенных вариантов scFv/Fab (относительно исходных scFv/Fab) могут предоставить хороший индикатор общей кратности усиления аффинности и могут представлять собой эффективный путь оценки аффинности для вариантов scFv/Fab в циклах по оптимизации лидерных молекул. Формат описанного в данном документе конкурентного анализа связывания эпитопа для исходного IgG TICA0072 изложен ниже:
стрептавидин, меченный европием:биотинилированный тикагрелор: IgG TICA0072: антитело к Fc-фрагменту человека, меченное XL665
[00191] Анализ осуществляли в буфере, содержащем DPBS, pH 7,4 (Gibco 14190-086), KF (VWR 103444T) (0,4M) и Tween 20 (Sigma P9416) (0,05%) с использованием 384-луночных планшетов для анализа с черными лунками уменьшенного объема (Corning/Costar 3676). Для одноточечного исследования неочищенных периплазматических вариантов scFv использовали объем пробы в 10 мкл, однако объем пробы в 20 мкл использовали при исследовании очищенных scFv и Fab в многоточечных вторичных анализах профиля IC50.
[00192] Для одноточечного HTS анализ осуществляли путем добавления 3 мкл IgG TICA0072 (53,3 нМ с получением конечной концентрации в 16 нМ), 2 мкл образца неочищенного периплазматического экстракта scFv, 2,5 мкл биотинилированного тикагрелора (8 нМ с получением конечной концентрации в 2 нМ) и 2,5 мкл объединенного раствора, содержащего стрептавидин, меченный европием (CisBio 610SAKLB) (3 нМ для конечной концентрации для анализа 0,75 нМ), и антитело к Fc-фрагменту человека, меченное XL665 (CisBio 61HFCXLB) (30 нМ с получением конечной концентрации для анализа в 7,5 нМ). Исходный неочищенный периплазматический scFv TICA0072 использовали для сравнения и HTS настраивали для идентификации вариантов, дающих улучшенное ингибирование относительно исходного. Лунки контроля общего связывания содержали все компоненты для анализа за исключением того, что вместо образца scFv добавляли 2 мкл буфера для анализа. Лунки отрицательного контроля связывания содержали все компоненты из контрольных лунок общего связывания за исключением того, что вместо IgG TICA0072 добавляли 3 мкл буфера для анализа.
[00193] Для многоточечного исследования IC50 в отношении очищенных вариантов scFv/Fab анализ осуществляли путем добавления 5 мкл IgG TICA0072 (53,3 нМ с получением конечной концентрации в 16 нМ), 5 мкл титра в 1/3 очищенного исследуемого варианта scFv или Fab, 5 мкл биотинилированного тикагрелора (8 нМ с получением конечной концентрации в 2 нМ (профилирование scFv), 4 нМ с получением конечной концентрации для анализа в 1 нМ (профилирование Fab)) и 5 мкл объединенного раствора, содержащего стрептавидин, меченный европием (CisBio 610SAKLB) (3 нМ для конечной концентрации для анализа 0,75 нМ) и антитело к Fc-фрагменту человека, меченное XL665 (CisBio 61HFCXLB) (30 нМ с получением конечной концентрации для анализа в 7,5 нМ). Очищенный исходный TICA0072 (scFv или Fab) использовали для сравнения во всех экспериментах, в результате чего улучшения в IC50, измеренные с оптимизированными вариантами (scFv или Fab), можно было выразить в виде кратных улучшений по сравнению с исходным TICA0072. Лунки контроля общего связывания содержали все компоненты для анализа за исключением того, что вместо образца очищенного scFv или Fab добавляли 5 мкл буфера для анализа. Лунки отрицательного контроля связывания содержали все компоненты из контрольных лунок общего связывания за исключением того, что вместо IgG TICA0072 добавляли 5 мкл буфера для анализа.
[00194] Как в одноточечной HTS, так и в многоточечной профилирующих версиях анализа IC50 планшеты для анализа инкубировали в течение 3 ч. при RT перед тем, как их считывали на планшет-ридере Envision с использованием стандартного протокола для считывания HTRF, в ходе выполнения которого возбуждение образцов происходит при 337 нм и испускание флуоресценции с временным разрешением измеряют как при 620 нм, так и при 665 нМ.
[00195] Необработанные импульсы при 665 нм и 620 нм использовали для подсчета значений дельта F (%) и % специфического связывания согласно уравнениям, описанным ранее в анализах 1 и 4, соответственно. Для многоточечных вторичных профилирующих экспериментов значения IC50 определяли с помощью программного обеспечения Graphpad Prism, используя аппроксимацию кривой (4-параметрическое логистическое уравнение) зависимости доза-ответ (с изменяемым наклоном).
[00196] Хиты, идентифицированные в ходе скрининга, т. е. варианты scFv, которые показали значительно улучшенный ингибиторный эффект по сравнению с исходным scFv TICA0072, подвергали секвенированию ДНК, а затем получали отдельные варианты продуктов из библиотеки CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи и CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельного участка легкой цепи в виде очищенного scFv и повторно исследовали в том же анализе для определения кривых зависимости концентрация-ответ для IC50. Затем варианты scFv, демонстрирующие наиболее улучшенные значения IC50, получали в виде Fab и исследовали в анализе конкурентного связывания эпитопов второго поколения, описанном ниже.
Анализ конкуретного связывания эпитопов второго поколения для скрининга/ранжирования Fab с наивысшей аффинностью
[00197] С целью эффективного разделения очищенных Fab с очень высокой аффинностью в конце цикла оптимизации лидерных молекул осуществляли дополнительный HTRF® анализ конкурентного связывания эпитопа, однако в данном случае анализ основывался на конкурентном ингибировании связывания промежуточно оптимизированного по аффинности IgG линии TICA0072 (TICA0159) с биотинилированным тикагрелором в противоположность исходному IgG TICA0072. Данный анализ использовали только в формате многоточечного профилирующего анализа IC50 (в противоположность формату HTS) и осуществляли, по сути, аналогично способу, приведенному в анализе 5 (выше) для многоточечного IC50 профилирующего анализа очищенных Fab-вариантов в конкурентом анализе связывания с эпитопом исходного IgG TICA0072. Единственное отличие заключалось в том, что вместо IgG TICA0072 использовали IgG TICA0159 в соответствующий момент анализа, но при той же конечной концентрации для анализа в 16 нМ. Во всех других отношениях данный анализ осуществляли точно также, как описано выше для версии многоточечного вторичного профилирующего анализа для очищенного Fab.
[00198] В анализе второго поколения TICA0072 заменяли на частично оптимизированное антитело TICA0159 для обеспечения более эффективного установления различия и ранжирования Fab по наивысшей аффинности, чем это было возможно в анализе конкурентного связывания эпитопа с TICA0072.
[00199] Наилучшие VH идентифицировали как вариант CDR3 TICA0162. Наилучшие VL идентифицировали как вариант CDR3 TICA0152. Для достижения дополнительного улучшения аффинности разные CDR от улучшенных антител объединяли в новые Fab с использованием стандартных методик молекулярной биологии В результате данной работы по рекомбинации комбинация TICA0162 и TICA0152 образовывала новый Fab TICA0212 с дополнительно улучшенным профилем конкуренции за связывание с эпитопом. Нанесенные на график кривые конкурирования для Fab TICA0072, TICA0152, TICA0162 и TICA0212 в конкурентном анализе связывания эпитопов второго поколения показаны на фиг. 6 с измеренными значениями IC50 в таблице 5. TICA0212 демонстрирует улучшение примерно на 2 log в IC50 относительно исходного Fab TICA0072.
Таблица 5. Данные IC50 для перечисленных оптимизированных Fab к тикагрелору в анализе конкурентного связывания эпитопов второго поколения
Fab | IC 50 (нМ) | Кратность улучшения |
TICA0072 | 1714,0 | 0 |
TICA0152 | 73,5 | 23,3 |
TICA0162 | 16,3 | 105,2 |
TICA0212 | 12,0 | 142,8 |
Пример 6. Измерение аффинности оптимизированных Fab к тикагрелору/TAM
[00200] Аффинность Fab к тикагрелору/TAM, полученных в примере 5, определяли с использованием KinExA3200. Для измерения аффинности с помощью KinExA гранулы (600 мг гранулы азлактона) сперва подготавливали путем воздействия на них в течение ночи 1 мг стрептавидина в 50 мМ NaHCO3. После блокирования посредством 2 замен буфера Tris (1 M Tris pH 8,7, 10 мг/мл BSA) гранулы, покрытые стрептавидином, ресуспендировали с общим объемом 8 мл. Гранулы (1,33 мл, эквивалентно 100 мг исходных сухих гранул азлактона) целиком промывали PBS, позволяя им затем связываться с примерно 2,5 мкг биотина-тикагрелора в 1 мл PBS в течение 10 минут с периодическим помешиванием. Полученные в результате гранулы, покрытые биотином-тикагрелором, промывали PBS, затем ресуспендировали в 50 мл PBS, содержащем 0,1% BSA и 0,02% NaN3, и хранили при комнатной температуре до переноса во флакон для гранул KinExA.
[00201] Подготовку образцов антитело/тикагрелор в целом проводили как описано в предыдущем способе. Fab-антитела к тикагрелору рахзводили в 2 раза до конечной концентрации для анализа в буфере для анализа (PBS, Tween20 0,05%, BSA 0,02%, 0,02% NaN3), например, 200 нМ. 2-кратное серийное разведение тикагрелора по 10 точкам получали в 50 мл полипропиленовых пробирках Falcon. Равные объемы, например, 5 мл с 5 мл, разбавленного антитела и свободного тикагрелора затем переносили во вторую полипропиленовую пробирку Falcon. Образцы перемешивали путем пипетирования и позволяли им уравновеситься в течение 3-5 дней при комнатной температуре. После уравновешения пробирки с образцами переносили на KinExA 3200 для анализа.
[00202] Все анализы проводили при комнатной температуре. Из смесей антитело/тикагрелор отбирали образцы и обеспечивали возможность их смешивания с гранулами био-тикагрелора, тогда как несвязанный свободный тикагрелор отмывали. Связанное антитело затем выявляли с использованием антитела мыши, меченного DyLight649, к тяжелой и легкой цепям Ig человека. Объем образцов (300 мкл - 1300 мкл) и время введения образца (90 с. -120 с.) варьировались по концентрациям, и 2-3 считывания варьировались на образец. Данные анализировали с использованием программного обеспечения для анализа KinExA n-Curve. Используя анализ Constant Partner, определяли равновесную KD для Fab-антител к тикагрелору.
[00203] Как и в предыдущем примере, Fab позволяли уравновеситься при комнатной температуре в присутствии либо немодифицированного тикагрелора, либо TAM в концентрациях от 20-кратного избытка. Биотинилированным тикагрелором нагружали поверхность гранул, покрытых стрептавидином. После уравновешения оставшемуся свободному антителу позволяли связаться с биотинилированным тикагрелором. Связанное антитело затем выявляли с использованием антитела мыши для выявления, меченного DyLight649, к тяжелой и легкой цепям Ig человека. Титры свободного тикагрелора или TAM готовили по меньшей мере с тремя различными фиксированными концентрациями антитела с получением отдельных профилей титров по меньшей мере с 10-кратным сдвигом в измеряемой KD. Данные анализировали с использованием программного обеспечения для анализа KinExA Pro n-Curve для определения равновесной KD для свободного тикагрелора или TAM. Fab TICA0212 характеризовался аффинностью к немодифицированному тикагрелору и TAM, составляющей около 20 пМ (таблица 6). Исходя из равновесных данных, TICA0212 демонстрирует эквивалентно высокую аффинность (~20 пМ) при связывании с тикагрелором и TAM.
Таблица 6. Анализ равновесной аффинности для Fab к тикагрелором/TAM
ID антитела | Посл. CDR3 (SEQ ID NO) | Гаптен | Равновесная KD | 95% доверительный интервал (C. I.) |
TICA0072 | VH GSHLY99DFW100bSASHPPNDALAI (35) VL GTW91D92I93S94LSAGL (40) |
Тикагрелор | 7,4 нМ | 1,8-21,5 нМ |
TICA0152 | VH GSHLYDFWSASHPPNDALAI (65) VL GTWLYDRAVGL (70) |
Тикагрелор | 43,17 пМ | 2,8-119,2 пМ |
TICA0162 | VH GSFDYYFWSASHPPNDALAI (55) VL GTWDISLSAGL (60) |
Тикагрелор | 162,48 пМ | 125,4-206,3 пМ |
TICA0212 (MEDI2452) |
VH GSFDYYFWSASHPPNDALAI (75) VL GTWLYDRAVGL (80) |
Тикагрелор | 19,6 пМ | 13,0-28,7 пМ |
TAM | 19,7 пМ | 4,9-44,7 пМ | ||
TIM | ~ 20 нМ |
Изменения в остатках последовательностей из исходного TICA0072 выделены жирным, а номера по Kabat идентифицированы для определенных остатков в TICA0072.
Пример 7. Специфичность Fab TICA0162 и TICA0212 к тикагрелору/TAM
[00204] Специфичность Fab, TICA0162 и TICA0212 исследовали как в примере 3 и нормализовали по DMSO. Итоговая таблица всех доступных данных селективности для TICA0162 и TICA0212 включена в таблицу 7. Кроме того, иллюстративные данные, нанесенные на график, из эксперимента, в котором пять из двенадцати соединений, перечисленных на фиг. 4, исследовали помимо тикагрелора, TAM, TIM и нескольких родственных аденозину соединений, показаны на фиг. 7.
Таблица 7. Относительные значения IC50 для двенадцати структурно родственных соединений в дополнение к тикагрелору, TAM, TIM и соединений семейства аденозина в отношении ингибирования связывания биотинилированного тикагрелора с Fab TICA0162 и TICA0212.
IC50 (мкM) для разных соединений в отношении лидерного his-Fab | ||
Соединение | TICA0162 | TICA0212 |
Фенофибрат | NI | NI |
Нилвадипин | NI | NI |
Цилостазол | NI (n=2) | NI (n=2) |
Букладезин | NI | NI |
Регаденозон | NI (n=2) | NI (n=2) |
Циклотиазид | > 1000 (n=2) | NI (n=2) |
Цифлутрин | NI | NI |
Ловастатин | NI | NI |
Линезолид | NI | NI |
Симвастатин | NI (n=2) | NI (n=2) |
Кангрелор | NI | NI |
Пантопразол | > 1000 (n=2) | NI (n=2) |
Аденозин | NI | NI |
ADP | NI | NI |
2MeS-APD | NI | NI |
ATP | NI | NI |
2MeS-ATP | NI | NI |
Тикагрелор | 0,023 (n=2) | 0,035 (n=2) |
TAM | 0,032 (n=2) | 0,031 (n=2) |
TIM | 19,8 (n=2) | 28,8 (n=2) |
NI означает отсутствие ингибирования.
[00205] Как проиллюстрировано посредством данных, TICA0212 (MEDI2452) характеризуется, по сути, эквивалентной специфичностью связывания с тикагрелором и TAM и более слабым связыванием с TIM. Кроме того, MEDI2452/TICA0212 не показал значительного связывания с любыми другими структурно родственными лекарственными средствами или родственными аденозину соединениями.
Пример 8. Кристаллография белков
[00206] TICA0072 с C-концевой his-меткой концентрировали в PBS до 9 мг/мл. Образования комплекса достигали путем добавления 1 мМ тикагрелора, растворенного в DMSO. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов перед проведением испытаний по кристаллизации с использованием способа диффузии паров в "сидячей" капле. Обширный скрининг осуществляли с использованием 3 коммерческих наборов для скрининга и получали ряд хитов. Кристаллы с наилучшим показателем рассеивания получали в результате оптимизации решеток хита с помощью Morpheus® (Molecular Dimensions, Соединенное Королевство). Кристаллы, использованные для определения структуры, выращивали при 20°C путем перемешивания равных объемов комплекса TICA0072-тикагрелор и резервуарного раствора из 12,8% PEG 3350, 12,8% PEG 1000, 12,8% MPD, 1,7% 1,6-гександиола, 1,7% 1-бутанола, 1,7% 1,2-пропандиола, 1,7% 2-пропанола, 1,7% 1,4 бутандиола, 1,7% 1,3-пропандиола, 25 мМ имидазола, 25 мМ карбоната натрия, 25 мМ MES и 25 мМ Bis-Tris, pH 6,5. Кристаллы быстро замораживали в жидком азоте без добавления какого-либо криопротектора.
[00207] TICA0212/MEDI2452 в PBS в концентрации около 15 мг/мл смешивали с тикагрелором до концентрации 1 мМ и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре перед осуществлением обширного скрининга. Спонтанных хитов не получали. Кристаллы-затравки TICA0072-тикагрелор получали путем дробления множества кристаллов в 30 мкл раствора в лунке и использовали их в ММS (скрининге по методу микропереноса кристаллов) в обширном коммерческом скрининге. Получали множество хитов, но кристаллы, используемые для определения структуры, выращивали при 20°C в среде из 20% глицерина, 20% PEG 4000, 10% 2-пропанола, 0,1 M NaCl и 0,5 M ацетата Na, pH 4,6. Формирование капель затем проводили с 0,2 мкл белка, 0,18 мкл раствора в лунке и 0,02 мкл затравочных кристаллов. Кристаллы быстро замораживали в жидком азоте без добавления какого-либо криопротектора.
[00208] Данные собирали в канале ID23-1 Европейской установки синхротронного излучения, Гренобль, Франция. Данные обрабатывали, сопоставляли и дополнительно сводили с использованием схемы AutoProc [Vonrhein, C., et al., Acta Cryst. 2011; D67: 293-302], статистические данные см. в таблице 8. Для TICA0072 первичное фазирование проводили посредством молекулярной замены с использованием структуры Fab высокого разрешения (PDB id code 1aqk, [Faber C., et al., Immunotechnology. 1998; 3:253-70]) в качестве стартовой модели. Для TICA0212/MEDI2452 структуру TICA0072 использовали в качестве стартовой модели. Реконструирование модели осуществляли с использованием Coot [Bricogne G., et al., (2011). BUSTER версии 2.11.4., Кембридж, Соединенное Королевство: Global Phasing Ltd] и уточнение структуры осуществляли с использованием autobuster [Emsley, P., et al., Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2004, D60, 2126-2132]. В отношении статистических данных для финальных моделей см. таблицу 8.
Таблица 8. Совокупность данных и статистические данные по уточнению структур сокристалла Fab и тикагрелора. Значения в скобках относятся к единицам измерения значений наивысшего разрешения. Описание | TICA0072 | TICA0212 (MEDI2452) |
Код доступа в PDB | ||
Статистика для совокупности данных | ||
Источник ионизирующего излучения | ESRF/ID23-1 | ESRF/ID23-1 |
Детектор ионизирующего излучения | Pilatus | Pilatus |
Пространственная группа симметрии | P21 | P21212 |
Постоянные решетки | a=41,2, b=72,6, c=67,8 β=98,9 | a=69, b=173, c=42 |
Разрешение (Å) | 49-1,7 (1,87-1,7) | 41-2,16 (2,27-2,16) |
Наблюдаемые отражения | 143002 | 232480 |
Уникальные отражения | 41888 | 36570 |
Завершенность (%) | 97,0 (95,3) | 99,4 (94,7) |
Среднее значение I/σI | 13,6 (1,7) | 10,7 (1,2) |
Rсимм.%b | 4,8 (74,4) | 9,7 (27,7) |
Статистические данные по уточнению структур | ||
Разрешение (Å) | 49-1,7 | 41-2,16 |
Количество атомов белка+лигандов | 3308 | 3371 |
Количество атомов растворителя | 142 | 87 |
R (%), Rсвободный (%) | 19,8, 23,7 | 21,7, 25,7 |
Фактор Wilson B (Å2), уточнено <B> (Å2) | 45,6, 48,5 | 42,1, 44,6 |
Идеальная длина связи Rmsd (Å) | 0,008 | 0,010 |
Валентные углы (°) | 1,10 | 1,25 |
[00209] Структуру TICA0072 в комплексе с тикагрелором определяли до разрешения 1,7 Å (фиг. 10). CDR образуют сильно вогнутую поверхность и тикагрелор встраивается глубоко в участке спроикосновения доменов VH и VL. Данный тип связывания чаще всего наблюдают для небольших гаптенов. Все CDR за исключением CDR2 VL непосредственно участвуют в связывании с тикагрелором и большая часть CDR3 VH является неупорядоченной. Дифторфенильная группа тикагрелора располагается в полости, выстроенной из гидрофобных остатков, включая остатки зоны Вернье Trp47 VH, Phe98 VL и остаток Leu100L CDR3 VH. Главным остатком при взаимодействии с тикагрелором является VL Trp91, который вовлечен как в формирование пи-стэкинга к аденозин-подобному кору, так и водородной связи с одной из гидроксильных групп рибозы при циклопентильном фрагменте. Дополнительные взаимодействия с аденозин-подобным кором обеспечиваются His35 CDR1 VH и Tyr99 CDR3 VH. Тиопропильный заместитель расположен перпендикулярно главной цепи петли CDR2 VH. Гидроксиэтильный заместитель на циклопентильном фрагменте выступает в растворитель и не участвует в каких-либо взаимодействиях с Fab.
[00210] В структуре Fab с улучшенной аффинностью, TICA0212/MEDI2452, связывания с тикагрелором аналогично такому связыванию для TICA0072 с сохранением всех упомянутых выше взаимодействий, но с некоторыми важными отличиями (фиг. 10B). Комбинация мутаций Asp92Leu и Ser94Asp в CDR3 VL разрушает водородную связь в пределах петли CDR3 VL с образованием более "слабой" структуры. Новая конформация коррелирует с углом в 15° пиримидинового кольца рядом с местом присоединения циклопропилдифторфенильного заместителя. Новое положение пиримидинового кольца подводит его примерно на 0,2 Å ближе к Tyr99 CDR3 VH в TICA0212/MEDI2452 по сравнению с Fab 72. Более того, Ile93Tyr VL предоставляет донора водородной связи, который взаимодействует с петлей CDR3 VH, определяя таким образом дополнительный сайт связывания.
[00211] Кристаллическая структура TICA0212/MEDI2452 показывает, что тикагрелор связывается в глубоком зазоре между поверхностями VH и VL. Стратегия, касающаяся разработки мечения тикагрелора и биотина посредством триамидного линкера с гидроксиэтильной группой, является обоснованной, поскольку кристаллическая структура демонстрирует, что гидроксиэтильная группа не участвует в каких-либо взаимодействиях с TICA0212/MEDI2452. Это дополнительно подтверждается тем фактом, что Fab также связывает TAM c идентичной аффинностью, у которого отсутствует гидроксиэтильная группа. TICA0212/MEDI2452 демонстрирует слабое связывание с TIM, у которого отсутствует циклопропилдифторфенильная группа. В комплексе TICA0212/MEDI2452-тикагрелор циклопропилдифторфенильная группа погружена на дно гидрофобного кармана и должна играть ключевую структурную роль в выравнивании аденозин-подобного кора тикагрелора с остатком Trp L91 CDR3 VL. Поскольку химической начальной точкой для тикагрелора являлся ATP и он сохраняет аденозин-подобный кор, то ключевым атрибутом для специфичности антидота является демонстрация отсутствия связывания аденозина. Ведущая стратегия выделения включала как высокопроизводительный, так и детализированный анализ специфичности, и обнаруживали отсутствие связывания аденозина либо посредством анализа конкурентного связывания, либо анализа прямого связывания. По результатам структурного анализа можно ожидать, что пуриновое кольцо и группа аденозина рибозы имитируют взаимодействие аденозин-подобного кора тикагрелора. Однако отсутствие связывания можно объяснить отсутствием двух гидрофобных групп R (циклопропилдифторфенильной и тиопропильной), которые значительно снижают как относительную комплементарность формы, так и гидрофобность связывающего взаимодействия.
[00212] Анализ структуры исходных TICA0072 и TICA0212/MEDI2452 демонстрирует значимость ряда изменений, введенных в ходе созревания аффинности. Очевидно, мутации в CDR3 VL обладают особенно высоким влиянием, что приводит в результате к различной конформации петель и к образованию дополнительной водородной связи в TICA0212/MEDI2452, что определяет полость связывания. Напротив, вклады мутаций в CDR3 VH структурно менее очевидны. Данные наблюдения структуры частично подтверждаются данными для модифицированных антител, содержащими модификации только в CDR3 VL (TICA0152) или CDR3 VH (TICA0162), что приводило в результате к 200-кратному и 50-кратному улучшению по сравнению с TICA0072, соответственно. Однако, хотя изменения в CDR3 VL, по-видимому, характеризуются большим эффектом, обе серии мутаций привносят значительное улучшение. Следует отметить, что кристаллическая структура представляет собой статическое изображение комплекса и не способна фиксировать какие-либо динамические свойства белка и лиганда, вовлеченных в связывание.
Пример 9. Восстановление агрегации тромбоцитов
in vitro
в зависимости от концентрации TICA0212/MEDI2452 в присутствии тикагрелора или TAM
[00213] Степень и активность TICA0212/MEDI2452 в отношении обратимости опосредованного тикагрелором или TAM ингибирования ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов определяли в плазме крови человека, богатой тромбоцитами (PRP), с использованием световой трансмиссионной агрегометрии.
[00214] Для анализа in vitro с PRP человека кровь отбирали у здоровых добровольцев натощак посредством венепункции латеральной подкожной вены руки. Первые 2 мл крови удаляли перед отбором аликвот в пробирки, содержащие 0,109 M цитрата натрия, 1+9 (цитрат+кровь), с конечной концентрацией 10,9 мМ. Несвернувшуюся кровь человека центрифугировали при 240 x g в течение 15 мин. PRP осторожно отбирали и переносили в чистый флакон. Обедненную тромбоцитами плазму (PPP) получали посредством центрифугирования PRP при 2000 x g в течение 15 мин. PRP оценивали при помощи световой трансмиссионной агрегометрии (LTA) с использованием Platelet Aggregation Profiler (PAP-8E, Bio/Data Corporation, Пенсильвания, США). Агрегацию с нулевым % определяли как световую трансмиссию для PRP, а 100% агрегацию определяли как световую трансмиссию для PPP.
[00215] PRP предварительно инкубировали с 1 мкM тикагрелора или TAM за 1 час до совместного инкубирования с различными концентрациями TICA0212 или изотипического контрольного Fab в течение 30 минут. Агрегацию тромбоцитов инициировали посредством добавления 20 мкM ADP и ее непрерывно регистрировали в течение 6 мин. Данные степени конечной агрегации (FA) анализировали на 6 мин.
[00216] Подсчитывали концентрации TICA0212/MEDI2452, которые вызывали полумаксимальную обратимость (IC50). TICA0212/MEDI2452 вызывали зависимую от концентрации обратимость опосредованного 1 мкM тикагрелора и 1 мкM TAM ингибирования агрегации тромбоцитов, индуцированной 20 мкM ADP, с рассчитанными средними значениями (n=5) IC50 в 0,64 мкM и 0,78 мкM, соответственно (фиг. 8). При оценке в условиях 1:1 (1 мкM TICA0212/MEDI2452: 1 мкM тикагрелора или TAM) среднее значение степени обратимости составляло 78% и 62%, соответственно. Изотипический контрольный Fab не вызывал значительной обратимости ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов в присутствии тикагрелора и TAM. Например, после 30 мин. инкубирования изотипический контрольный Fab приводил в результате к -3% и 2% обратимости для тикагрелора и TAM, соответственно.
[00217] Исходя из этого, данные демонстрируют, что TICA0212/MEDI2452 может вызывать обратимость как опосредованного тикагрелором, так и опосредованного TAM ингибирования ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов in vitro зависимым от концентрации способом. Максимального эффекта и эффекта с практически полной обратимость достигали при оценке с параметрами эксперимента 1:1, что, как предсказано, наблюдается, когда TICA0212/MEDI2452 связывается с тикагрелором или TAM при стехиометрии 1:1.
Пример 10. TICA0212/MEDI2452 эффективно и быстро восстанавливает агрегацию тромбоцитов
in vitro
в присутствии тикагрелора или TAM
[00218] При использовании TICA0212/MEDI2452 время до начала обращения эффекта, вызванного тикагрелором или TAM, определяли в плазме крови человека, богатой тромбоцитами (PRP), с использованием световой трансмиссионной агрегометрии, как и в примере 8. PRP предварительно инкубировали с 1 мкM тикагрелора или TAM в течение 1 часа перед добавлением 1 мкM TICA0212/MEDI2452 и совместного инкубирования в течение 5, 10, 15, 30 и 60 мин., или добавлением изотипического контрольного Fab в течение 30 мин. Агрегацию тромбоцитов инициировали посредством добавления 20 мкM ADP и ее непрерывно регистрировали в течение 6 мин. Данные степени конечной агрегации (FA) анализировали на 6 мин.
[00219] TICA0212/MEDI2452 вызывали аналогичную степень обратимости опосредованного тикагрелором ингибирования независимо от времени совместной инкубации, причем среднее значение (n=3) степени обращения составляло 85%, 69%, 74%, 80% и 81% после 5, 10, 15, 30 и 60 минут, соответственно. Аналогичным образом, среднее значение (n=3) степени обратимости эффекта TAM, индуцированной TICA0212/MEDI2452, составляло 53%, 56%, 58%, 69%, 74% через 5, 10, 15, 30 и 60 минут, соответственно. TICA0212/MEDI2452 вызывали быструю и эффективную обратимость опосредованного тикагрелором ингибирования ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов. Обратимость эффекта, среднее значение (n=3) -2%, отсутствовала после 30 мин. совместного инкубирования с изотипическиим контрольным Fab.
На основе этих данных было показано, что TICA0212/MEDI2452 вызывают быструю и эффективую обратимость ингибирования, опосредованного как тикагрелором, так и TAM, ADP-индуцированной агрегации при оценке с параметрами эксперимента 1:1.
Пример 11. TICA0212/MEDI2452 эффективно и быстро восстанавливает агрегацию тромбоцитов
in vivo
после введения мышам, обработанным тикагрелором
[00220] Скорость наступления и степень TICA0212/MEDI2452-опосредованной обратимости ингибирования, опосредованного тикагрелором, ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов в цельной крови (импедансная агрегометрия) определяли ex vivo после внутривенного (i.v.) введения тикагрелора мышам. Мышам вводили тикагрелор i.v. в виде болюса 1200 мкг/кг, на протяжении 5 минут, после чего его вводили посредством непрерывной инфузии в течение 15 мин. в дозе 30 мкг/кг/мин. После завершения инфузии тикагрелора, когда измеренное содержание тикагрелора в плазме крови составляло в среднем 1,4 мкM, мышам вводили i.v. болюс TICA0212/MEDI2452 в дозе 250 мг/кг. Через 5, 30 и 60 мин. после введения TICA0212/MEDI2452 мышей умерщвляли и отбирали образцы крови. В данном исследовании реакцию в виде ADP-индуцированной агрегации измеряли в течение 6 мин. и данные выражали в виде среднего значения площади под фармакокинетической кривой для единиц агрегации (AU), регистрируемого в динамике (AU*мин).
[00221] При проведении анализа импедансной агрегометрии мышей умерщвляли и отбирали образцы крови в 7 мкM гирудина. Кровь (175 мкл) добавляли к предварительно нагретому NaCl2 (37°C, 175 мкл) в Multiplate Mini Test Cells и перемешивали в течение 3 мин. перед добавлением 12 мкл ADP до конечной концентрации 6,5 мкM. Одноразовые Multiplate Mini Test Cells содержат магнитный якорь и имеют пару отдельных электродов, которые погружают в образец крови.
[00222] При добавлении агониста (ADP) и при индуцировании сдвига посредством перемешивания тромбоциты начинали прилипать и агрегировать на электродах. Это приводило к увеличению импенданса над электродами, что регистрировали непрерывно в динамике с помощью импендансного агрегометра Multiplate (DynaByte, Мюнхен, Германия).
[00223] Обработка тикагрелором вызывала практически полное ингибирование ADP-индуцируемой агрегации, поскольку среднее значение (n=4) ответа на агрегацию снижалось от 432 до 2 AU*мин, от 474 до 6 AU*мин и от 494 до 14 AU*мин через 5, 30 и 60 мин. после инфузии тикагрелора и болюса с PBS, соответственно (фиг. 9). TICA0212/MEDI2452 опосредовали обратимость in vivo ингибирования агрегации, опосредованного тикагрелором, поскольку среднее значение (n=4) ответа на агрегацию повышалось от 2 до 147 AU*мин., от 6 до 448 AU*мин. и от 14 до 413 AU*мин. через 5, 30 и 60 минут после инфузии тикагрелора и болюса c TICA0212, соответственно (фиг. 9). Эффект обратимости отсутствовал через 30 минут после введения изотипического контроля, поскольку среднее значение (n=4) ответа на агрегацию оставалось неизменным от 6 до 4 AU*мин.
[00224] Эти данные демонстрируют, что TICA0212/MEDI2452 могут быстро и эффективно восстанавливать ADP-индуцированную агрегацию тромбоцитов, когда их вводят в виде i.v. болюса мышам, которым вводили тикагрелор, с концентрацией тикагрелора в плазме крови, составляющей 1,4 мкM, при этом такая концентрация обеспечила полное ингибирование ADP-индуцированой агрегации.
Пример 12. Кровотечение у мышей, обработанных тикагрелором
[00225] Поскольку одно из заявляемых показаний для использования TICA0212/MEDI2452 представляет собой использованием в качестве антидота у получающих тикагрелор пациентов, требующих неотложного хирургического вмешательства, то TICA0212/MEDI2452 оценивали в эксперименте c кровотечением у мышей, разработанным для имитации клинических условий, в которых перед началом хирургического вмешательства необходимо достичь полной обратимости эффекта.
[00226] Мышей предварительно обрабатывали посредством непрерывной инфузии тикагрелора, 300 мкг/кг/мин., или среды-носителя в течение 20 минут. После остановки инфузии, t=0, вводили болюсную дозу TICA0212/MEDI2452 (600 мг/кг) или среду-носитель (буфер, содержащий сахарозу и гистидин) на протяжении 45 секунд, и в t=30 минут индуцировали кровотечение путем отрезания 5 мм кончика хвоста. Кончик хвоста промывали водой (2 мл/мин.) и смесь крови и воды собирали в маленькую камеру, в которой мешалка перемешивала жидкость для усиления гемолиза и получения однородного раствора. Световую трансмиссию, при 525 нм, регистрировали в течение 30 минут, когда итоговые образцы крови отбирали из брюшной аорты для агрегации тромбоцитов. Светопропускание трансформировали в поглощение и использовали для подсчета потери крови в виде площади под кривой поглощения (AUC, поглощение*с.) и общего времени кровотечения (BT, с.) путем нанесения на график показателя поглощения в зависимости от времени. Все пропускание ниже 95% определяли как кровотечение. Образцы для агрегации тромбоцитов и определения концентрации общего и свободного соединения в плазме крови также отбирали в конце инфузии тикагрелора (t=0) и в момент отрезания хвоста (t=30 минут).
[00227] Исследования были одобрены комиссией по этике исследований на животных при университете Гетеборга, Швеция. Мышей анестезировали газом изофлураном (Forene®, Abbot Scandinavia AB, Швеция). Вводили катетер в левую яремную вену для введения среды-носителя или лекарственного средства. Температуру тела поддерживали при 38°C с помощью внешнего источника тепла.
[00228] Для перевода эффекта TICA0212/MEDI2452 в отношении агрегации тромбоцитов в потенциальный эффект в отношении кровотечения осуществляли исследование профилактики кровотечения из хвоста мыши. Тикагрелор вливали до среднего значения концентрации общего тикагрелора и TAM в плазме крови, составляющей 7,6 мкM и 0,3 мкM, соответственно, для обеспечения диапазона значимого кровотечения, зависимого от лекарственного средства. Сразу после прекращения инфузии тикагрелора вводили дозу TICA0212/MEDI2452 в виде однократного болюса при 600 мг/кг за 30 секунд. Через 30 минут ADP-индуцированная агрегация полностью нормализовывалась и среднее значение свободного тикагрелора в плазме крови снизилось от 4,7 нМ до ниже 0,03 нМ (ниже предела количественного определения). Кровотечение инициировали посредством отрезания хвоста и наблюдение проводили в течение 30 минут. У мышей, обработанных средой-носителем, среднее значение концентрации общего тикагрелора и TAM в плазме крови в момент времени отрезания хвоста составляло 2,4 мкM и 0,6 мкM. Общая потеря крови и общее время кровотечения на протяжении 30 минут были значительно (p<0,05) увеличены за счет тикагрелора в приблизительно 3,8 раза и 1,6 раза, соответственно. С помощью TICA0212/MEDI2452 в значительной степени (p<0,05) устранялась потеря крови и сокращалось время кровотечения относительно только тикагрелора, при этом данные показатели восстанавливались до уровня, которые незначительно отличались от уровня у мышей, которых не обрабатывали тикагрелором (фиг. 12). При такой профилактике введение TICA0212/MEDI2452 нормализовывало кровотечение, обусловленное тикагрелором. Время наступления эффекта 30 минут переводили из модели ex vivo в данную модель in vivo с демонстрацией того, что TICA0212/MEDI2452 могут нормализовывать как потерю крови, так и время кровотечения в сравнении с такими показателями у мышей, не обработанных тикагрелором.
Пример 13. Общая концентрация в плазме крови тикагрелора и TAM
[00229] Образцы крови отбирали в пробирки с антикоагулянтом EDTA и центрифугировали в течение 5 мин. при 10000 x g при комнатной температуре для получения плазмы крови. Концентрацию в плазме крови тикагрелора и TAM определяли путем преципитации белков и жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS), как описано в опубликованном способе [Sillén H., et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2010;878:2299-306], со следующими отличиями. Преципитацию белков плазмы крови осуществляли в образце объемом 50 мкл со 180 мкл внутреннего стандарта (D7-ZD6140) в ацетонитриле. Система для жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии представляла собой устройство Acquity Ultra Performance LC, соединенное с масс-спектрометром Xevo TQ-S от Waters. Хроматографического разделения достигали на колонке Aquity UPLC® BEH C18 (2,1×50 мм, размер частиц 1,7 мкм). Использовали отрицательную ионизацию электрораспылением. Элюент А представлял собой воду с 10 ммоль/л ацетата аммония, pH 5, а элюент B представлял собой ацетонитрил с 10 ммоль/л ацетата аммония. Объем загружаемой пробы составлял от 1 мкл до 5 мкл, и аналитический градиент начинался от 4% для B с повышением до 95% за 1,5 мин., оставаясь неизменным до 2,3 мин. перед тем, как возвратиться до исходных условий в течении 2,4 мин., после чего следовало повторное уравновешивание в течение 0,3 мин. Образцов для контроля качества в данном анализе не использовали. Нижний предел количественного определения (LLOQ) составлял 0,005 мкмоль/л, а диапазон калибровки составлял от 0,005 мкM до 15,0 мкM.
[00230] Значения общей концентрации в плазме крови тикагрелора и TAM в присутствии TICA0212/MEDI2452 определяли путем добавления 1% муравьиной кислоты (FA: образец, 1:5) с последующей преципитацией белков и LC-MS/MS, как описано выше. Муравьиную кислоту добавляли к образцу для облегчения диссоциации тикагрелора и TICA0212/MEDI2452.
Пример 14. Концентрация свободного тикагрелора в плазме крови
[00231] Способ оптимизировали на основе ранее опубликованного способа [Sillén H., et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2011 Aug 1;879(23):2315-22]. Диализные мембраны (Spectrum Laboratories, Inc), которые позволяют молекулам с массой ниже от 6 кДа до 8 кДа проходить сквозь них, пропитывали в воде с ELGA в течение от 10 до 15 мин. и размещали их между половинами планшета для диализа (сделаны в самой лаборатории). Плазму крови, 130 мкл, вносили на одну сторону планшета для диализа, а 130 мкл фосфатного буфера, pH 7,0, вносили на противоположную сторону. Лунки на обеих сторонах герметично закрывали крышками и на каждой стороне планшета размещали алюминиевые пластины для предупреждения утечки. Планшет затем помещали в вертикальном положении в орбитальный шейкер при 100 об./мин. при 37°C на 24 ч. Диализ завершали посредством переноса 50 мкл ретентата со стороны с плазмой крови и 75 мкл диализата со стороны с буфером на чистый 96-луночный планшет с глубокими лунками для ПЦР Protein LoBind, содержащий 150 мкл и, соответственно, 75 мкл внутреннего стандарта (D7-ZD6140) в ацетонитриле. Образцы в планшете перемешивали в течение 1 мин., а затем центрифугировали в течение 20 мин., 1500 x g, при 4°C. После центрифугирования 50 мкл надосадочной жидкости из осажденного ретантата переносили и разбавляли с использованием 50 мкл H2O ELGA перед LC-MS/MS анализом (устройство Acquity Ultra Performance LC, соединенное с масс-спектрометром Xevo TQ-S, Waters). Образцов для контроля качества в данном анализе не использовали. Диапазон калибровки для ретантата составлял от 0,4 до 1000 нмоль/л, а для диализата от 0,003 до 50 нмоль/л. LLOQ для тикагрелора в диализате составлял 0,03 нмоль/л.
[00232] В таблице 9 ниже представлен обзор иллюстративных антител, описанных в указанных выше примерах и используемых для иллюстрации определенных вариантов осуществления данной технологии, раскрытой в данном документе.
Таблица 9. Краткое описание последовательностей антитело/scFv/Fab
Последовательность реферетного антитела | Последовательность |
TICA0010 Vh ДНК
(SEQ ID NO:1) |
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagtac gacctgcaac ggcctttcgg gtttgacttc tggggcaagg ggacaatggt caccgtctcg agt |
TICA0010 Vh
(SEQ ID NO:2) |
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEYDLQRPFGFDFWGKGTMVTVSS |
TICA0010 Vh CDR1
(SEQ ID NO:3) |
SYAMS |
TICA0010 Vh CDR2
(SEQ ID NO:4) |
AISGSGGSTYYADSVKG |
TICA0010 Vh CDR3
(SEQ ID NO:5) |
EYDLQRPFGFDF |
TICA0010 Vl ДНК
(SEQ ID NO:6) |
tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctggggccc ccgggcagag ggctaccatc tcctgctctg gaagcagctc caacatcgga agtaatcttg tgaactggta ccaacaattc ccaggagagg cccccaagct cctcatcttt agtgacaatc aacgaccctc aggggtccct gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca acgtgggatg acagactgga tggttatgtg gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta |
TICA0010 Vl
(SEQ ID NO:7) |
SYVLTQPPSASGAPGQRATISCSGSSSNIGSNLVNWYQQFPGEAPKLLIFSDNQRPSGVPDRFSGSRSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDRLDGYVVFGGGTKLTVL |
TICA0010 Vl CDR1
(SEQ ID NO:8) |
SGSSSNIGSNLVN |
TICA0010 Vl CDR2
(SEQ ID NO:9) |
SDNQRPS |
TICA0010 Vl CDR3
(SEQ ID NO:10) |
ATWDDRLDGYVV |
TICA0049 Vh ДНК
(SEQ ID NO:11) |
caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt tcctgcaagg cttctggata caccttcatt acctatggta ttcactgggt gcgccaggcc cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcgaccccg ggcatggtta cacaaaatat tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac atggagatga gcagcctcag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagcggac ctgggtgact actggggccg gggaaccctg gtcaccgtct cgagt |
TICA0049 Vh
(SEQ ID NO:12) |
QVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFITYGIHWVRQAPGQGLEWMGWIDPGHGYTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMEMSSLRSEDTAVYYCARADLGDYWGRGTLVTVSS |
TICA0049 Vh CDR1
(SEQ ID NO:13) |
TYGIH |
TICA0049 Vh CDR2
(SEQ ID NO:14) |
WIDPGHGYTKYSQKFQG |
TICA0049 Vh CDR3
(SEQ ID NO:15) |
ADLGDY |
TICA0049 Vl ДНК
(SEQ ID NO:16) |
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aagaattatg tttcctggtt ccagcagctc ccaggtacag cccccaaact cctcatttat gacaatcata agcgaccctc agggattcct gaccgattct ctgcctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggtcatctc cggtctccag actggggacg aggcccatta ttactgcgga acatgggata ccagactgag tgctggggtg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta |
TICA0049 Vl
(SEQ ID NO:17) |
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGKNYVSWFQQLPGTAPKLLIYDNHKRPSGIPDRFSASKSGTSATLVISGLQTGDEAHYYCGTWDTRLSAGVFGGGTKVTVL |
TICA0049 Vl CDR1
(SEQ ID NO:18) |
SGSSSNIGKNYVS |
TICA0049 Vl CDR2
(SEQ ID NO:19) |
DNHKRPS |
TICA0049 Vl CDR3
(SEQ ID NO:20) |
GTWDTRLSAGV |
TICA0053 Vh ДНК
(SEQ ID NO:21) |
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgg ccatgatagt agtggttact cctactcctt tgacttctgg gggcggggga ccacggtcac cgtctcgagt |
TICA0053 Vh
(SEQ ID NO:22) |
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGHDSSGYSYSFDFWGRGTTVTVSS |
TICA0053 Vh CDR1
(SEQ ID NO:23) |
SYAMS |
TICA0053 Vh CDR2
(SEQ ID NO:24) |
AISGSGGSTYYADSVKG |
TICA0053 Vh CDR3
(SEQ ID NO:25) |
DSSGYSYSFDF |
TICA0053 Vl ДНК
(SEQ ID NO:26) |
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc tcttgttctg gcaacatctc caacatcgga agtaacactg tcaactggta tcaacacgtc ccaggagcgg cccccagact cctcatctat gttaatgatc agcggccgtc aggggtccct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag tctgaagatg aggctgatta ttactgtgca acgtgggatg acaccctgaa tggaggggtc ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta |
TICA0053 Vl
(SEQ ID NO:27) |
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGNISNIGSNTVNWYQHVPGAAPRLLIYVNDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDTLNGGVFGGGTKLTVL |
TICA0053 Vl CDR1
(SEQ ID NO:28) |
SGNISNIGSNTVN |
TICA0053 Vl CDR2
(SEQ ID NO:29) |
VNDQRPS |
TICA0053 Vl CDR3
(SEQ ID NO:30) |
ATWDDTLNGGV |
TICA0072 Vh ДНК
(SEQ ID NO:31) |
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggtcc catctttacg atttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt |
TICA0072 Vh
(SEQ ID NO:32) |
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFDSYSIHWVRQAPGQGLEWMGGIIPAFGTLSSAQDFQARVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCARGSHLYDFWSASHPPNDALAIWGQGTLVTVSS |
TICA0072 Vh CDR1
(SEQ ID NO:33) |
SYSIH |
TICA0072 Vh CDR2
(SEQ ID NO:34) |
GIIPAFGTLSSAQDFQA |
TICA0072 Vh CDR3
(SEQ ID NO:35) |
GSHLYDFWSASHPPNDALAI |
TICA0072 Vl ДНК
(SEQ ID NO:36) |
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta |
TICA0072 Vl
(SEQ ID NO:37) |
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSNSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYCGTWDISLSAGLFGGGTKVTVL |
TICA0072 Vl CDR1
(SEQ ID NO:38) |
SGSNSDIGNNYVS |
TICA0072 Vl CDR2
(SEQ ID NO:39) |
DNNKRPS |
TICA0072 Vl CDR3
(SEQ ID NO:40) |
GTWDISLSAGL |
TICA0159 Vh ДНК
(SEQ ID NO:41) |
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggagc ttcgactaca ggttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt |
TICA0159 Vh
(SEQ ID NO:42) |
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFDSYSIHWVRQAPGQGLEWMGGIIPAFGTLSSAQDFQARVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCARGSFDYRFWSASHPPNDALAIWGQGTLVTVSS |
TICA0159 Vh CDR1
(SEQ ID NO:43) |
SYSIH |
TICA0159 Vh CDR2
(SEQ ID NO:44) |
GIIPAFGTLSSAQDFQA |
TICA0159 Vh CDR3
(SEQ ID NO:45) |
GSFDYRFWSASHPPNDALAI |
TICA0159 Vl ДНК
(SEQ ID NO:46) |
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta |
TICA0159 Vl
(SEQ ID NO:47) |
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSNSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYCGTWDISLSAGLFGGGTKVTVL |
TICA0159 Vl CDR1
(SEQ ID NO:48) |
SGSNSDIGNNYVS |
TICA0159 Vl CDR2
(SEQ ID NO:49) |
DNNKRPS |
TICA0159 Vl CDR3
(SEQ ID NO:50) |
GTWDISLSAGL |
TICA0162 Vh ДНК
(SEQ ID NO:51) |
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagaggctcc ttcgactact acttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt |
TICA0162 Vh
(SEQ ID NO:52) |
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFDSYSIHWVRQAPGQGLEWMGGIIPAFGTLSSAQDFQARVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCARGSFDYYFWSASHPPNDALAIWGQGTLVTVSS |
TICA0162 Vh CDR1
(SEQ ID NO:53) |
SYSIH |
TICA0162 Vh CDR2
(SEQ ID NO:54) |
GIIPAFGTLSSAQDFQA |
TICA0162 Vh CDR3
(SEQ ID NO:55) |
GSFDYYFWSASHPPNDALAI |
TICA0162 Vl ДНК
(SEQ ID NO:56) |
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta |
TICA0162 Vl
(SEQ ID NO:57) |
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSNSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYCGTWDISLSAGLFGGGTKVTVL |
TICA0162 Vl CDR1
(SEQ ID NO:58) |
SGSNSDIGNNYVS |
TICA0162 Vl CDR2
(SEQ ID NO:59) |
DNNKRPS |
TICA0162 Vl CDR3
(SEQ ID NO:60) |
GTWDISLSAGL |
TICA0152 Vh ДНК
(SEQ ID NO:61) |
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggtcc catctttacg atttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt |
TICA0152 Vh
(SEQ ID NO:62) |
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFDSYSIHWVRQAPGQGLEWMGGIIPAFGTLSSAQDFQARVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCARGSHLYDFWSASHPPNDALAIWGQGTLVTVSS |
TICA0152 Vh CDR1
(SEQ ID NO:63) |
SYSIH |
TICA0152 Vh CDR2
(SEQ ID NO:64) |
GIIPAFGTLSSAQDFQA |
TICA0152 Vh CDR3
(SEQ ID NO:65) |
GSHLYDFWSASHPPNDALAI |
TICA0152 Vl ДНК
(SEQ ID NO:66) |
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatggctgt acgaccgggc cgtcggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta |
TICA0152 Vl
(SEQ ID NO:67) |
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSNSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYCGTWLYDRAVGLFGGGTKVTVL |
TICA0152 Vl CDR1
(SEQ ID NO:68) |
SGSNSDIGNNYVS |
TICA0152 Vl CDR2
(SEQ ID NO:69) |
DNNKRPS |
TICA0152 Vl CDR3
(SEQ ID NO:70) |
GTWLYDRAVGL |
TICA0212/MEDI2452 Vh ДНК
(SEQ ID NO:71) |
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagaggctcc ttcgactact acttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt |
TICA0212/MEDI2452 Vh
(SEQ ID NO:72) |
QVQLQESGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFDSYSIHWVRQAPGQGLEWMGGIIPAFGTLSSAQDFQARVTISADKSTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCARGSFDYYFWSASHPPNDALAIWGQGTLVTVSS |
TICA0212/MEDI2452 Vh CDR1
(SEQ ID NO:73) |
SYSIH |
TICA0212/MEDI2452 Vh CDR2
(SEQ ID NO:74) |
GIIPAFGTLSSAQDFQA |
TICA0212/MEDI2452 Vh CDR3
(SEQ ID NO:75) |
GSFDYYFWSASHPPNDALAI |
TICA0212/MEDI2452 Vl ДНК
(SEQ ID NO:76) |
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatggctgt acgaccgggc cgtcggcttg ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta |
TICA0212/MEDI2452 Vl
(SEQ ID NO:77) |
QSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSNSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQAGDEADYYCGTWLYDRAVGLFGGGTKVTVL |
TICA0212/MEDI2452 Vl CDR1
(SEQ ID NO:78) |
SGSNSDIGNNYVS |
TICA0212/MEDI2452 Vl CDR2
(SEQ ID NO:79) |
DNNKRPS |
TICA0212/MEDI2452 Vl CDR3
(SEQ ID NO:80) |
GTWLYDRAVGL |
Ссылочный материал
1. Van Giezen JJ, Nilsson L, Berntsson P, et al. Ticagrelor binds to human P2Y(12) independently from ADP but antagonizes ADP-induced receptor signalling and platelet aggregation. J Thromb Haemost. 2009;7(9):1556-1565
2. Wallentin L, Becker RC, Budaj A, et al. Ticagrelor versus clopidogrel in patients with acute coronary syndromes. N Engl J Med. 2009;361:1045-1057.
3. Amsterdam EA, Wenger NK, Brindis RG, et al. 2014 ACC/AHA guideline for the management of patients with non-ST-elevation acute coronary syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. Circulation. 2014;000:000-000
4. Storey RF, Angiolillo DJ, Patil SB, et al. Inhibitory effects of ticagrelor compared with clopidogrel on platelet function in patients with acute coronary syndromes: the PLATO (PLATelet inhibition and patient Outcomes) PLATELET substudy. J Am Coll Cardiol. 2010;56(18):1456-1462.
5. Taylor G, Osinski D, Thevenin A, et al. Is platelet transfusion efficient to restore platelet reactivity in patients who are responders to aspirin and/or clopidogrel before emergency surgery? J Trauma Acute Care Surg. 2013;74:1367-1369.
6. Prüller F, Drexler C, Archan S, Macher S, Raggam RB, Mahla E. Low platelet reactivity is recovered by transfusion of stored platelets: a healthy volunteer in vivo study. J Thromb Haemost. 2011;9(8):1670-1673.
7. Hansson EC, Shams Hakimi C, Åström-Olsson K, et al. Effects of ex vivo platelet supplementation on platelet aggregability in blood samples from patients treated with acetylsalicylic acid, clopidogrel, or ticagrelor. Br J Anaesth. 2014;112(3):570-575.
8. Thiele T, Sümnig A, Hron G. Platelet transfusion for reversal of dual antiplatelet therapy in patients requiring urgent surgery: a pilot study. J Thromb Haemost. 2012;10:968-971.
9. Pehrsson S, Hansson K, Nylander S. Ticagrelor-induced bleeding in mice can be reversed by FVIIa (NovoSeven®) and FII. J Am Coll Cardiol. 2013;61(10S):E212.
10. Dolgin E. Antidotes edge closer to reversing effects of new blood thinners. Nat Med. 2013;19(3):251.
11. Crowther MA, Ageno W, Garcia D, et al. Oral vitamin K versus placebo to correct excessive anticoagulation in patients receiving warfarin: a randomized trial. Ann Intern Med. 2009;150:293-300.
12. Schiele F, van Ryn J, Canada K, et al.A specific antidote for dabigatran: functional and structural characterization. Blood. 2013;121:3554-3562.
13. Lu G, DeGuzman FR, Hollenbach SJ, et al. A specific antidote for reversal of anticoagulation by direct and indirect inhibitors of coagulation factor Xa. Nat Med. 2013;19:446-451.
14. Storey RF, Husted S, Harrington RA, et al. Inhibition of platelet aggregation by AZD6140, a reversible oral P2Y12 receptor antagonist, compared with clopidogrel in patients with acute coronary syndromes. J Am Coll Cardiol. 2007;50:1852-1856.
15. Husted SE, Storey RF, Bliden K, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of ticagrelor in patients with stable coronary artery disease: results from the ONSET-OFFSET and RESPOND studies. Clin Pharmacokinet. 2012;51(6):397-409.
16. Teng R, Oliver S, Hayes MA, Butler K. Absorption, distribution, metabolism, and excretion of ticagrelor in healthy subjects. Drug Metab Dispos. 2010;38(9):1514-1521.
17. Daramola O, Stevenson J, Dean G, et al. A high-yielding CHO transient system: coexpression of genes encoding EBNA-1 and GS enhances transient protein expression. Biotechnol Prog. 2014;30(1):132-141.
18. Oprea TI, Nielsen SK, Ursu O, et al. Associating Drugs, Targets and Clinical Outcomes into an Integrated Network Affords a New Platform for Computer-Aided Drug Repurposing. Mol Inform. 2011;30:100-111.
19. Springthorpe B, Bailey A, Barton P, et al. From ATP to AZD6140: the discovery of an orally active reversible P2Y12 receptor antagonist for the prevention of thrombosis. Bioorg Med Chem Lett. 2007;17:6013-6018.
20. Fanning SW1, Horn JR. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Sci. 2011;20:1196-1207.
21. Zhang K, Zhang J, Gao ZG, et al. Structure of the human P2Y12 receptor in complex with an antithrombotic drug. Nature. 2014;509:115-118.
22. Cattaneo M, Schulz R, Nylander S. Adenosine-mediated effects of ticagrelor: evidence and potential clinical relevance. J Am Coll Cardiol. 2014;63:2503-2509.
23. Sillén H, Cook M, Davis P. Determination of unbound ticagrelor and its active metabolite (AR-C124910XX) in human plasma by equilibrium dialysis and LC-MS/MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2011;879(23):2315-2322.
[00233] Все публикации и патенты, упомянутые в данном документе, настоящим включены в данное описание посредством ссылки в их полном объеме, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки.
[00234] Хотя обсуждались конкретные аспекты объекта настоящего раскрытия, вышеуказанное описание носит иллюстративный, а не ограничительный характер. Многие варианты настоящего раскрытия будут очевидны специалистам в данной области техники после рассмотрения настоящего описания и приведенной ниже формулы изобретения. Полный объем настоящего раскрытия должен определяться со ссылкой на пункты формулы изобретения вместе с полным объемом их эквивалентов, и описанием вместе с такими вариантами.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>
<120> Антитела к тикагрелору и способы их применения
<130> TICA-100WO1
<160> 80
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 363
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 1
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagtac 300
gacctgcaac ggcctttcgg gtttgacttc tggggcaagg ggacaatggt caccgtctcg 360
agt 363
<210> 2
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Tyr Asp Leu Gln Arg Pro Phe Gly Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 5
Glu Tyr Asp Leu Gln Arg Pro Phe Gly Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 6
<211> 333
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 6
tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctggggccc ccgggcagag ggctaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacatcgga agtaatcttg tgaactggta ccaacaattc 120
ccaggagagg cccccaagct cctcatcttt agtgacaatc aacgaccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca acgtgggatg acagactgga tggttatgtg 300
gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 7
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 7
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Leu Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Phe Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Arg Leu
85 90 95
Asp Gly Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 8
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Leu Val Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 10
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ala Thr Trp Asp Asp Arg Leu Asp Gly Tyr Val Val
1 5 10
<210> 11
<211> 345
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 11
caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcatt acctatggta ttcactgggt gcgccaggcc 120
cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcgaccccg ggcatggtta cacaaaatat 180
tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240
atggagatga gcagcctcag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagagcggac 300
ctgggtgact actggggccg gggaaccctg gtcaccgtct cgagt 345
<210> 12
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Gly His Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Leu Gly Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 13
Thr Tyr Gly Ile His
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 14
Trp Ile Asp Pro Gly His Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Asp Leu Gly Asp Tyr
1 5
<210> 16
<211> 330
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 16
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aagaattatg tttcctggtt ccagcagctc 120
ccaggtacag cccccaaact cctcatttat gacaatcata agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctgcctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggtcatctc cggtctccag 240
actggggacg aggcccatta ttactgcgga acatgggata ccagactgag tgctggggtg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 17
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 17
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Arg Leu
85 90 95
Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 18
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 19
Asp Asn His Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 20
Gly Thr Trp Asp Thr Arg Leu Ser Ala Gly Val
1 5 10
<210> 21
<211> 360
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 21
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgg ccatgatagt 300
agtggttact cctactcctt tgacttctgg gggcggggga ccacggtcac cgtctcgagt 360
<210> 22
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly His Asp Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Phe Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 23
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 24
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 25
Asp Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 26
<211> 330
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 26
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gcaacatctc caacatcgga agtaacactg tcaactggta tcaacacgtc 120
ccaggagcgg cccccagact cctcatctat gttaatgatc agcggccgtc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaagatg aggctgatta ttactgtgca acgtgggatg acaccctgaa tggaggggtc 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 27
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 27
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln His Val Pro Gly Ala Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Val Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Thr Leu
85 90 95
Asn Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 28
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 28
Ser Gly Asn Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 29
Val Asn Asp Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 30
Ala Thr Trp Asp Asp Thr Leu Asn Gly Gly Val
1 5 10
<210> 31
<211> 387
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 31
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc 180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat 240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggtcc 300
catctttacg atttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc 360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 387
<210> 32
<211> 129
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser His Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100 105 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 33
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 33
Ser Tyr Ser Ile His
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 34
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 35
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 35
Gly Ser His Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ile
20
<210> 36
<211> 330
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 36
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag 240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 37
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 37
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 38
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 38
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 39
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 40
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 40
Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu Ser Ala Gly Leu
1 5 10
<210> 41
<211> 387
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 41
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc 180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat 240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggagc 300
ttcgactaca ggttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc 360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 387
<210> 42
<211> 129
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Phe Asp Tyr Arg Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100 105 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 43
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 43
Ser Tyr Ser Ile His
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 44
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 45
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 45
Gly Ser Phe Asp Tyr Arg Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ile
20
<210> 46
<211> 330
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 46
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag 240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 47
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 47
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 48
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 48
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 49
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 50
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 50
Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu Ser Ala Gly Leu
1 5 10
<210> 51
<211> 387
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 51
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc 180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat 240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagaggctcc 300
ttcgactact acttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc 360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 387
<210> 52
<211> 129
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Phe Asp Tyr Tyr Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100 105 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 53
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 53
Ser Tyr Ser Ile His
1 5
<210> 54
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 54
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 55
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 55
Gly Ser Phe Asp Tyr Tyr Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ile
20
<210> 56
<211> 330
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 56
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag 240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatgggata tcagcctgag cgctggcttg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 57
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 57
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 58
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 58
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 59
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 59
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 60
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 60
Gly Thr Trp Asp Ile Ser Leu Ser Ala Gly Leu
1 5 10
<210> 61
<211> 387
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 61
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc 180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat 240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagggtcc 300
catctttacg atttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc 360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 387
<210> 62
<211> 129
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser His Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100 105 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 63
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 63
Ser Tyr Ser Ile His
1 5
<210> 64
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 64
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 65
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 65
Gly Ser His Leu Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ile
20
<210> 66
<211> 330
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 66
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag 240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatggctgt acgaccgggc cgtcggcttg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 67
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 67
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Leu Tyr Asp Arg
85 90 95
Ala Val Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 68
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 68
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 69
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 69
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 70
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 70
Gly Thr Trp Leu Tyr Asp Arg Ala Val Gly Leu
1 5 10
<210> 71
<211> 387
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 71
caggtgcagc tgcaggagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgac agttatagta tccattgggt gcgccaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg cctttgggac attaagcagc 180
gcacaggact tccaggccag agtcaccatt agcgcggaca agtccacgag cacagcctat 240
atggagctga gcggcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagaggctcc 300
ttcgactact acttttggag tgcttctcat ccccccaatg atgctcttgc tatttggggc 360
caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 387
<210> 72
<211> 129
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asp Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Phe Asp Tyr Tyr Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro
100 105 110
Asn Asp Ala Leu Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 73
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 73
Ser Tyr Ser Ile His
1 5
<210> 74
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 74
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Leu Ser Ser Ala Gln Asp Phe Gln
1 5 10 15
Ala
<210> 75
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 75
Gly Ser Phe Asp Tyr Tyr Phe Trp Ser Ala Ser His Pro Pro Asn Asp
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ile
20
<210> 76
<211> 330
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 76
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcaactc cgacattggc aacaattatg tgtcgtggta ccaacagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata aacgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag 240
gctggggacg aggccgatta ttactgcggg acatggctgt acgaccgggc cgtcggcttg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 77
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 77
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Leu Tyr Asp Arg
85 90 95
Ala Val Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 78
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 78
Ser Gly Ser Asn Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 79
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 79
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 80
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 80
Gly Thr Trp Leu Tyr Asp Arg Ala Val Gly Leu
1 5 10
<---
Claims (50)
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее комбинацию последовательностей VH и VL, выбранную из группы, состоящей из
SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:7;
SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:17;
SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:27;
SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:37;
SEQ ID NO:42 и SEQ ID NO:47;
SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO:57;
SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:67; и
SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:77,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с тикагрелором или его активным метаболитом и нейтрализуют его антитромбоцитарное действие, и
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с тикагрелором или его активным метаболитом с IC50, равным около 100 нМ или ниже.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит комбинацию VH и VL, выбранную из группы, состоящей из
SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO:57;
SEQ ID NO:62 и SEQ ID NO:67; и
SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:77.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее каркасные области (FR) и области, определяющие комплементарность (CDR), 1, 2 и 3, вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит комбинацию областей CDR, выбранную из группы, состоящей из:
SEQ ID NO:53 (VH CDR1), SEQ ID NO:54 (VH CDR2), SEQ ID NO:55 (VH CDR3), SEQ ID NO:58 (VL CDR1), SEQ ID NO:59 (VL CDR2), и SEQ ID NO:60 (VL CDR3);
SEQ ID NO:63 (VH CDR1), SEQ ID NO:64 (VH CDR2), SEQ ID NO:65 (VH CDR3), SEQ ID NO:68 (VL CDR1), SEQ ID NO:69 (VL CDR2), и SEQ ID NO:70 (VL CDR3); и
SEQ ID NO:73 (VH CDR1), SEQ ID NO:74 (VH CDR2), SEQ ID NO:75 (VH CDR3), SEQ ID NO:78 (VL CDR1), SEQ ID NO:79 (VL CDR2), и SEQ ID NO:80 (VL CDR3),
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с тикагрелором или его активным метаболитом и нейтрализуют его антитромбоцитарное действие, и
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с тикагрелором или его активным метаболитом с IC50, равным около 100 нМ или ниже.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбрано из моноклонального антитела, гуманизированного антитела, антитела человека, Fab и F(ab')2.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает scFv.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает Fab.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с тикагрелором или его метаболитом или производным при значении IC50, находящемся в диапазоне от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 нМ.
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с тикагрелором или активным метаболитом тикагрелора при значении IC50, находящемся в диапазоне от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 нМ.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с тикагрелором или его метаболитом или производным при значении Kd, составляющем приблизительно 50 нМ или ниже.
10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с тикагрелором или его метаболитом или производным при значении Kd, находящемся в диапазоне от приблизительно 250 пМ до приблизительно 1 пМ.
11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с тикагрелором или активным метаболитом тикагрелора при значении Kd, находящемся в диапазоне от приблизительно 100 пМ до приблизительно 1 пМ.
12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет значение IC50, составляющее не более чем приблизительно 50 мкM по сравнению с соединением, выбранным из группы, состоящей из фенофибрата, нилвадипина, цилостазола, букладезина, регаденозона, циклотиазида, цифлутрина, ловастатина, линезолида, симвастатина, кангрелора, пантопразола, аденозина, аденозиндифосфата, аденозинтрифосфата, 2-MeS-аденозиндифосфата и 2-MeS-аденозинтрифосфата.
13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет время полужизни in vivo, составляющее приблизительно 12 часов.
14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует антитромбоцитарное действие тикагрелора или активного метаболита тикагрелора в течение приблизительно 30 минут после введения.
15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент восстанавливает ADP-индуцированную агрегацию тромбоцитов в присутствии тикагрелора или активного метаболита тикагрелора.
16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается с эпитопом, содержащим гидроксиэтильную группу в циклопентильном кольце тикагрелора.
17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом, содержащим циклопропилдифторфенильную группу тикагрелора.
18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом, содержащим циклопропилдифторфенильную группу тикагрелора, но не связывается с эпитопом, содержащим гидроксиэтильную группу в циклопентильном кольце тикагрелора.
19. Способ лечения острого кровотечения у пациента, которому вводили тикагрелор, где способ включает введение пациенту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18.
20. Способ лечения тяжелого кровотечения у пациента, который подвергался или подвергается хирургическому вмешательству и которому вводили тикагрелор, где способ включает введение пациенту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18.
21. Cпособ профилактики кровотечения у пациента, которому вводили тикагрелор, где способ включает введение пациенту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18.
22. Способ ингибирования действия тикагрелора или его активного метаболита на рецептор P2Y12 у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18.
23. Способ ингибирования связывания тикагрелора или его активного метаболита с рецептором P2Y12 у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества антитела по любому из пп.1-18.
24. Способ обеспечения активации ADP-индуцированной агрегации тромбоцитов у пациента, которому вводили тикагрелор, включающий введение пациенту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18.
25. Способ по любому из пп.21-24, где пациенту запланировано хирургическое вмешательство.
26. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, для продукции антитела, которое связывается с тикагрелором или его метаболитом.
27. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.26.
28. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.27, где клетка-хозяин продуцирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с тикагрелором или его метаболитом.
29. Fab, содержащий области, определяющие комплементарность (CDR): SEQ ID NO:73 (VH CDR1), SEQ ID NO:74 (VH CDR2), SEQ ID NO:75 (VH CDR3), SEQ ID NO:78 (VL CDR1), SEQ ID NO:79 (VL CDR2), and SEQ ID NO:80 (VL CDR3),
где Fab специфически связываются с тикагрелором или его активным метаболитом и нейтрализуют его антитромбоцитарное действие, и
где Fab связывается с тикагрелором или его активным метаболитом с IC50, равным около 100 нМ или ниже.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462058458P | 2014-10-01 | 2014-10-01 | |
US62/058,458 | 2014-10-01 | ||
US201562114931P | 2015-02-11 | 2015-02-11 | |
US62/114,931 | 2015-02-11 | ||
PCT/EP2015/072606 WO2016050867A1 (en) | 2014-10-01 | 2015-09-30 | Antibodies to ticagrelor and methods of use |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2021125449A Division RU2021125449A (ru) | 2014-10-01 | 2015-09-30 | Антитела к тикагрелору и способы применения |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017114645A RU2017114645A (ru) | 2018-11-07 |
RU2017114645A3 RU2017114645A3 (ru) | 2019-05-07 |
RU2754468C2 RU2754468C2 (ru) | 2021-09-02 |
RU2754468C9 true RU2754468C9 (ru) | 2022-12-08 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03154867A (ja) * | 1989-11-13 | 1991-07-02 | Teijin Ltd | 1―メチルアデノシンの免疫学的測定方法,そのための測定試薬及び試薬キット |
RU2440987C2 (ru) * | 2006-03-16 | 2012-01-27 | Астеллас Фарма Инк. | Производное хинолона или его фармацевтически приемлемая соль |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03154867A (ja) * | 1989-11-13 | 1991-07-02 | Teijin Ltd | 1―メチルアデノシンの免疫学的測定方法,そのための測定試薬及び試薬キット |
RU2440987C2 (ru) * | 2006-03-16 | 2012-01-27 | Астеллас Фарма Инк. | Производное хинолона или его фармацевтически приемлемая соль |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LADENSON R. C. ET AL. "Isolation and Characterization of a Thermally Stable Recombinant Anti-Caffeine Heavy-Chain Antibody Fragment", ANALYTICAL CHEMISTRY, 2006, v.78, no.13, p.4501 - 4508, doi:10.1021/ac058044j. MEYER T. ET AL. "Production of anti-(ADP-ribose) antibodies with the aid of a dinucleotide-pyrophosphatase-resistant hapten and their application for the detection of mono(ADP-ribosy1)ated polypeptides", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 1986, v.155, no.1, p.157 - 165, doi:10.1111/J.1432-1033.1986.TB09471.X. SCHIELE F. ET AL. "A specific antidote for dabigatran: functional and structural characterization", BLOOD, 2013, v.121, no.18, p.3554 - 3562, doi:10.1182/blood-2012-11-468207. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11773186B2 (en) | Antibodies to ticagrelor and methods of use | |
CN102741283B (zh) | 具有高阻断活性的抗-C5a结合部分 | |
RU2662671C2 (ru) | АНТИТЕЛО К АДРЕНОМЕДУЛЛИНУ (ADM) ИЛИ ФРАГМЕНТ АНТИ-ADM АНТИТЕЛА, ИЛИ АНТИ-ADM HE-Ig КАРКАС ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ТЕРАПИИ | |
US20220064294A1 (en) | Antibodies to tigit | |
US20160159922A1 (en) | Novel Antibodies for the Diagnosis and Treatment of Rheumatoid Arthritis | |
RU2754468C9 (ru) | Антитела к тикагрелору и способы применения | |
US20230056815A1 (en) | Antibodies to feline mcdonough sarcoma (fms)-like tyrosine kinase 3 receptor ligand (flt3l) and uses thereof for treating autoimmune and inflammatory diseases | |
EP4153313A1 (en) | Anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof | |
CA3150462A1 (en) | Anti-cd19 antibodies and uses thereof | |
TW201245226A (en) | Binding proteins to inhibitors of coagulation factors | |
Class et al. | Patent application title: ANTIBODIES AGAINST HGF-RECEPTOR AND USES Inventors: Danielle Marie Di Cara (Cambridge, GB) John Mccafferty (Cambridgeshire, GB) Ermanno Gherardi (Pavia, IT) Anthony Richard Pope (Cambridge, GB) |