TWI706136B - Ｆｇｆｒ突變基因組於鑑定對於ｆｇｆｒ抑制劑治療有反應之癌症患者的用途 - Google Patents

Ｆｇｆｒ突變基因組於鑑定對於ｆｇｆｒ抑制劑治療有反應之癌症患者的用途 Download PDF

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Abstract

本文所揭露者為鑑定將對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應的癌症患者的方法及治療癌症患者的方法。該等方法包含評估來自該患者的生物樣本存在有來自FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體。本文亦揭露用於鑑定生物樣本中存在有一或多個FGFR突變基因的套組及引子。

Description

FGFR突變基因組於鑑定對於FGFR抑制劑治療有反應之癌症患者的用途 相關申請案之交互參照
本申請案主張2014年9月26日申請之美國臨時專利申請案第62/056,159號的優先權，其所揭露之全文以引用方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，其已經以ASCII格式藉由電子方式提交且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII副本(建立於2015年8月6日)被命名為103693.000782_SL.txt且檔案大小為66,185位元組。
本文所提供者為鑑定將對纖維母細胞生長因子受體抑制劑的治療有反應的癌症患者的方法及治療該患者的方法。
基因異常的鑑定可用於為癌症患者選擇適當的治療。其亦可用於經該癌症類型主要的治療選擇(一線治療)失敗的癌症患者，特別是當第二線或更後線治療沒有公認的醫療照護標準。纖維母細胞生長因子受體(FGFR)係受體酪胺酸激酶中的一族，其參與調節細胞存活、增生、遷移及分化。FGFR的改變已經在某些癌症中被觀察 到。迄今為止，還沒有任何批准的治療是對FGFR改變的患者有效的。
本文所揭露者為鑑定將對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應的癌症患者的方法，包含：評估來自該患者的生物樣本中之來自FGFR突變基因組(mutant gene panel)的FGFR突變體，其中該FGFR突變體係FGFR融合基因或FGFR單核苷酸多型性，且其中該評估包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體的引子來擴增cDNA；及判定該樣本中是否存在有來自該基因組的一或多個FGFR突變體，其中該一或多個FGFR突變體的存在表示該患者將對該FGFR抑制劑的治療有反應。
亦揭露者為在患者中治療癌症的方法，包含：評估來自該患者的生物樣本存在有來自FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體；及若該樣本中存在有一或多個FGFR突變體則以FGFR抑制劑治療該患者。
本文進一步提供用於鑑定生物樣本中存在有一或多個FGFR突變基因的套組及引子。
當結合附圖閱讀時可進一步理解發明內容以及下文之實施方式。為了說明所揭露之方法、套組、及引子，在圖式中顯示出該方法、套組、及引子的例示性實施例；然而，該方法、套組、及引子不限於所揭露之具體實施例。在圖式中：圖1係例示性FGFR融合基因的示意圖，其中至少一者存在表示該患者將對FGFR抑制劑的治療有反應。亦繪示用於擴增融合基因的例示性引子位置(小箭頭)。
圖2(包含圖2A至圖2I)描繪來自FFPET樣本的桑格(Sanger)定序結果，其對下列為陽性：A)FGFR3：TACC3 v1；B)FGFR3：TACC3 v3；C)FGFR3：TACC3 Intron；D)FGFR3：BAIAP2L1；E)FGFR2：AFF3；F)FGFR2：BICC1；G)FGFR2：CASP7；H)FGFR2：CCDC6；及I)FGFR2：OFD1。
圖3繪示SNP特異性qRT-PCR的例示性策略，其係使用3’雙去氧野生型(WT)阻斷劑寡核苷酸。
圖4繪示檢測FGFR SNP的例示性分析驗證策略。實驗是在經基因工程改造以表現FGFR融合的RK3E細胞系進行，並以不含FGFR3/FGFR2融合的野生型細胞系稀釋。
圖5(包含圖5A至圖5D)繪示用於(a)G370C、(B)Y373C、(C)S249C、及(D)R248C的使用雙去氧WT阻斷劑的SNP特異性PCR。
圖6(包含圖6A至圖6I)描繪FGFR融合基因分析的效率標準曲線：A)FGFR3：TACC3 v1；B)FGFR3：TACC3 v3；C)FGFR3：TACC3 Intron；D)FGFR3：BAIAP2L1；E)FGFR2：AFF3；F)FGFR2：BICC1；G)FGFR2：CASP7；H)FGFR2：CCDC6；及I)FGFR2：OFD1。
圖7係膀胱癌(原發性及轉移性)、NSCLC(腺癌及鱗狀細胞癌)、卵巢癌、食道癌(原發性及轉移性)、頭頸癌(H&N；原發性及轉移性)、子宮內膜癌(轉移性)、乳癌、及前列腺癌中FGFR融合基因狀態的例示性圖像。
圖8係NSCLC腺癌及鱗狀細胞癌中FGFR融合基因及突變體狀態的例示性圖像。
圖9(包含圖9A至圖9D)描繪第一期患者樣本的例示性結果。使用合成模板分析對照(ST)、用於GAPDH(品質控制樣本)之引子、或用於下列之特異性引子來進行分析：A)FGFR2：BICC1融合；B)FGFR3：TACC3(外顯子18：外顯子1)融合；C) FGFR2：CCDC6融合；或D)FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、或FGFR2：CCDC6融合。患者樣本係如下述：A-泌尿上皮癌；B-膀胱癌；C-膽管癌；及D-腎上腺癌。
圖10描繪在患有晚期實質腫瘤的患者中JNJ-42756493首次應用於人體的試驗(First-In-Human Study)的例示性第一期研究設計。
圖11描繪劑量水平大於或等於6mg時目標病灶直徑總和縮減與基線相比的最大抑制百分比。以不同劑量的FGFR抑制劑JNJ-42756493治療實質腫瘤患者，給藥方式為每日方案或間歇給藥方案(7天給藥-7天休息)。劑量及腫瘤種類係如指明。按照RECIST標準測量腫瘤的縮減。腫瘤帶有FGFR基因轉位及突變的患者顯示出對FGFR抑制劑JNJ-42756493較為敏感。
圖12繪示經指明FGFR融合穩定轉染的RK3E細胞中之各種FGFR融合的表現。
圖13(包含圖13A至圖13B)繪示經指明FGFR融合穩定轉染的RK3E細胞的群落形成分析。(A)經0.1%甲苯酚結晶紫染色的6孔室及(B)長條圖繪示每100個塗布細胞的群落數。結果代表兩個獨立實驗。
圖14(包含圖14A至圖14H)繪示經指明FGFR融合穩定轉染的RK3E細胞中例示性下游目標的表現。
所揭露之方法、套組、及引子藉由參考下面的詳細描述結合附圖(其形成本揭露的一部分)可以更容易地理解。應當理解的是所揭露之方法、套組、及引子不限於本文中所描述及/或顯示之特定方法、套組、及引子，且本文中使用之術語目的是僅僅以示例的方式描述具體實施例並且不意圖限制所要求保護的方法、套組、及引子。
提及一具體數值時包括至少該具體值，除非上下文另有明確說明。當表示為一個值範圍時，另一個實施例包括從一個具體值 及/或到另一個具體值。此外，提及以範圍說明的值時包括該範圍內的每個值。所有範圍均被包括在內且為可組合的。
應當理解的是，為了清楚起見在本文中於不同實施例的內文中描述的所揭露之方法、套組、及引子的某些特徵亦可於單一實施例中組合提供。相反地，為了簡潔起見於單一實施例的內文中所述之方法、套組、及引子的各種特徵亦可單獨或以任何次組合來提供。
當用於本文時，單數形式「一」及「該」包括複數。
以下縮寫用於整個說明書中：FGFR(纖維母細胞生長因子受體)；LLOQ(定量下限)；FGFR3：TACC3(編碼FGFR3的基因與編碼含轉形酸性捲曲螺旋蛋白3(transforming acidic coiled-coil containing protein 3)的基因之間的融合)；FGFR3：BAIAP2L1(編碼FGFR3的基因與編碼似腦特異性血管生成抑制劑1相關蛋白2蛋白1(brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2-like protein 1)的基因之間的融合)；FGFR2：AFF3(編碼FGFR2的基因與編碼AF4/FMR2家族成員3的基因之間的融合)；FGFR2：BICC1(編碼FGFR2的基因與編碼雙尾C同源物1(bicaudal C homolog 1)的基因之間的融合)；FGFR2：CASP7(編碼FGFR2的基因與編碼凋亡蛋白酶7的基因之間的融合)；FGFR2：CCDC6(編碼FGFR2的基因與編碼含捲曲螺旋域6(coiled-coil domain containing 6)的基因之間的融合)；FGFR2：OFD1(編碼FGFR2的基因與編碼口顏指趾症候群1(oral-facial-digital syndrome 1)的基因之間的融合)；FFPET(福馬林固定的石蠟包埋組織)；SNP(單核苷酸多型性)；NSCLC(非小細胞肺癌)；ct(循環閾值)。
當用於本文時，「治療」及類似用語意指減少癌症症狀的嚴重性及/或頻率、消除癌症症狀及/或該症狀的潛在原因、減少癌症症狀及/或其潛在原因的頻率或可能性、及改善或補救癌症所直接或間接造成的損害。
「生物樣本」意指來自患者的任何樣本，在其中可取得癌細胞且可單離出RNA。合適的生物樣本包括但不限於血液、淋巴液、骨髓、實質腫瘤樣本、或彼等之任何組合。在一些實施例中，該生物樣本可為FFPET。
當用於本文時，「預先擴增」意指在擴增步驟之前進行的PCR程序，其係為了在擴增步驟中提高模板cDNA的量。預先擴增步驟可使用例如TaqMan®預先擴增主混合物(PreAmp Master Mix)(Life Technologies/Applied Biosystems®產品編號4391128)來進行。
當用於本文中時，「擴增」及類似用語意指產生許多核酸樣本的相同拷貝。擴增核酸樣本的合適技術包括但不限於聚合酶連鎖反應(PCR)及即時聚合酶連鎖反應(RT-PCR)。在一些實施例中，該擴增步驟包含RT-PCR。
FGFR突變體
當用於本文中時，詞組「FGFR突變體」意指FGFR融合基因、FGFR單核苷酸多型性、或兩者。
「FGFR融合」或「FGFR融合基因」意指編碼FGFR(例如FGRF2或FGFR3)(或其一部分)及本文所揭露之融合夥伴之一(或其一部分)的基因，其係由這兩個基因之間的轉位所產生。在來自患者的生物樣本中一或多個下列FGFR融合基因的存在可利用所揭露之方法來判定：FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。表1提供了該等FGFR融合基因及所融合之FGFR與融合夥伴的外顯子。圖1提供了各種FGFR融合基因的示意圖。個別FGFR融合基因的序列係揭露於表16中。
Figure 104131544-A0202-12-0007-1
「FGFR單核苷酸多型性」(SNP)意指FGFR2或FGFR3基因中有單一個核苷酸在個體之間不同。特別是，「FGFR單核苷酸多型性」(SNP)意指FGFR3基因中有單一個核苷酸在個體之間不同。在來自患者的生物樣本中一或多個下列FGFR SNP的存在可利用所揭露之方法來判定：FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。該等FGFR SNP的序列係提供於表2中。
Figure 104131544-A0202-12-0007-2
Figure 104131544-A0202-12-0008-3
當用於本文時，「FGFR突變基因組」包括一或多個上面所列之FGFR突變體。在一些實施例中，該FGFR突變基因組取決於患者的癌症類型。
在所揭露之方法的評估步驟中使用的FGFR突變基因組係部分基於患者的癌症類型。對膀胱癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
對轉移性膀胱癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
對卵巢癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
對頭頸癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
對轉移性頭頸癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
對食道癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR2：BICC1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
對轉移性食道癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
對非小細胞肺腺癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
對非小細胞肺鱗狀細胞癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、 FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
對轉移性子宮內膜癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
對乳癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
用於擴增FGFR突變體的引子
所屬技術領域中具有通常知識者知道擴增核酸需要具互補性且結合位於該核酸股尋求擴增區域兩側的5’區及3’區的引子。當用於本文時，「引子對」意指於擴增步驟中使用之正向及反向引子。適合用於進行所揭露之方法的引子對係列於表3中。
Figure 104131544-A0202-12-0010-4
Figure 104131544-A0202-12-0011-5
本文揭露具有以下核酸序列的引子：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、或彼等之任何組合。
本文亦揭露具有以下序列的引子組：SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38、或彼等之任何組合。
在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30的序列。在一些實 施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36的序列。在一些實施例中，該引子組可具有SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38的序列。在一些實施例中，該引子組可具有上述引子組的任何組合的序列。
用於所揭露之方法中的FGFR抑制劑
本文提供適合用於所揭露之方法中的FGFR抑制劑。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用揭露於美國專利公開案第2013/0072457 A1號(以引用方式併入本文中)的FGFR抑制劑來治療患者，包括其任何互變異構或立體化學異構形式，及其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物(適合的R基團亦揭露於美國專利公開案第2013/0072457 A1號中)。例如，在一些態樣中，可用N-(3,5-二甲氧苯基)-N'-(1-甲基乙基)-N-[3-(1-甲-1H-吡唑-4-基)喹
Figure 104131544-A0202-12-0013-178
啉-6-基]乙烷-1,2-二胺(在本文中稱為「JNJ-42756493」或「JNJ493」)治療該患者：
Figure 104131544-A0202-12-0013-6
 包括其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。在一些態樣中，該醫藥上可接受的鹽係HCl鹽。在一些態樣中，可用JNJ493鹼治療該患者。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係N-[5-[2-(3,5-二甲氧苯基)乙基]-2H-吡唑-3-基]-4-(3,5-二甲哌
Figure 104131544-A0202-12-0014-179
-1-基)苯甲醯胺(AZD4547)，如Gavine,P.R.等人在AZD4547：An Orally Bioavailable,Potent,and Selective Inhibitor of the Fibroblast Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Family,Cancer Res.April 15,2012 72；2045中所述：
Figure 104131544-A0202-12-0014-7
 包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式，及其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧苯基)-1-{6-[4-(4-乙哌
Figure 104131544-A0202-12-0014-180
-1-基)-苯胺基]-嘧啶-4-基}-1-甲脲(NVP-BGJ398)，如在國際專利公開案第WO2006/000420號中所述：
Figure 104131544-A0202-12-0014-8
 包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式，及其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係4-胺-5-氟-3-[6-(4-甲哌
Figure 104131544-A0202-12-0015-181
-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(多維替尼(dovitinib))，如在國際專利公開案第WO2006/127926號中所述：
Figure 104131544-A0202-12-0015-9
 包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式，及其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係6-(7-((1-胺基環丙基)-甲氧基)-6-甲氧喹啉-4-基氧基)-N-甲-1-萘甲醯胺(AL3810)(德立替尼(lucitanib)；E-3810)，如Bello,E.等人在E-3810 Is a Potent Dual Inhibitor of VEGFR and FGFR that Exerts Antitumor Activity in Multiple Preclinical Models,Cancer Res February 15,2011 71(A)1396-1405及國際專利公開案第WO2008/112408號中所述：
Figure 104131544-A0202-12-0015-10
 包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式，及其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係抗FGFR2抗體，如在WO2013/076186中所述。
其他適合的FGFR抑制劑包括BAY1163877(Bayer)、BAY1179470(Bayer)、TAS-120(Taiho)、ARQ087(ArQule)、ASP5878(Astellas)、FF284(Chugai)、FP-1039(GSK/FivePrime)、Blueprint、LY-2874455(Lilly)、RG-7444(Roche)、或彼等之任何組合，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係BAY1163877(Bayer)，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係BAY1179470(Bayer)，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係TAS-120(Taiho)，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係ARQ087 (ArQule)，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係ASP5878(Astellas)，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係FF284(Chugai)，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係FP-1039(GSK/FivePrime)，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係Blueprint，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係LY-2874455(Lilly)，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則可用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係RG-7444(Roche)，包括(當化學上可能的)其任何互變異構或立體化學異構形式、其N-氧化物、其醫藥上可接受的鹽、或其溶劑合物。
鹽可以藉由常規化學方法從含有鹼性或酸性部分的母化合物合成，如在Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use, P.Heinrich Stahl(Editor),Camille G.Wermuth(Editor),ISBN：3-90639-026-8,Hardcover,388 pages,August 2002中所述之方法，其係以引用方式併入本文中。通常，該等鹽可藉由將這些化合物的游離酸或鹼形式與合適的鹼或酸在水中或在有機溶劑中，或在該兩者的混合物中反應來製備；通常，會使用非水介質如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇、或乙腈。用於所揭露之方法中的FGFR抑制劑可存在為單鹽或二鹽，其係取決於形成該鹽的酸的pKa。
可用各式各樣的酸(無機和有機的)形成酸加成鹽。酸加成鹽的實例包括以酸形成的鹽，該酸包括但不限於乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗壞血酸(例如L-抗壞血酸)、L-天冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙醯胺苯甲酸、丁酸、(+)莰二酸、樟腦磺酸、(+)-(1S)-樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、桂皮酸、檸檬酸、環己胺磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羥乙烷磺酸、蟻酸、反丁烯二酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡萄庚酸、D-葡萄糖酸、葡萄醣醛酸(例如D-葡萄醣醛酸)、麩胺酸(例如L-麩胺酸)、α-側氧戊二酸、乙醇酸、馬尿酸、氫溴酸、鹽酸、氫碘酸、2-羥乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、順丁烯二酸、蘋果酸、(-)-L-蘋果酸、丙二酸、(±)-DL-苦杏仁酸、甲烷磺酸、萘磺酸(例如萘-2-磺酸)、萘-1,5-二磺酸、1-羥-2-萘甲酸、菸鹼酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、撲酸、磷酸、丙酸、L-焦麩胺酸、丙酮酸、水楊酸、4-胺基水楊酸、癸二酸、硬酯酸、琥珀酸、硫酸、單寧酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、甲苯磺酸(例如對甲苯磺酸)、十一烯酸及戊酸，以及醯化胺基酸及陽離子交換樹脂。
一具體鹽群組係由形成自以下酸的鹽組成：乙酸、鹽酸、氫碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、順丁烯二酸、蘋果酸、2-羥乙磺酸、反丁烯二酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸(甲磺酸鹽)、乙烷磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸及乳糖酸。另一酸加成鹽群組包括形成自以下酸的鹽：乙 酸、己二酸、抗壞血酸、天冬胺酸、檸檬酸、DL-乳酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、馬尿酸、鹽酸、麩胺酸、DL-蘋果酸、甲烷磺酸、癸二酸、硬酯酸、琥珀酸及酒石酸。
若該化合物係陰離子型或具有可以是陰離子型的官能基(例如-COOH可以為-COO-)，則可用合適的陽離子形成鹽。合適的無機陽離子的實例包括但不限於鹼金屬離子如Na+及K+、鹼土金屬陽離子如Ca2+及Mg2+、及其他陽離子如Al3+。合適的有機陽離子的實例包括但不限於銨離子(例如NH4 +)及經取代的銨離子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。
一些合適的經取代的銨離子的實例係衍生自：乙胺、二乙胺、二環己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌
Figure 104131544-A0202-12-0019-182
、苄胺、苯苄胺、膽鹼、葡甲胺(meglumine)、及緩血酸胺(tromethamine)、以及胺基酸如離胺酸及精胺酸。常見的四級銨離子的實例係N(CH3)4 +。
當化合物含有胺官能基時，這些化合物可根據所屬技術領域中具有通常知識者習知之方法藉由例如與烷化劑反應來形成四級銨鹽。該等四級銨化合物係在所揭露之化合物的範圍內。含有胺官能基的化合物亦可形成N-氧化物。本文提及的含有胺官能基的化合物亦包括該N-氧化物。當化合物含有若干胺官能基時，一個或一個以上的氮原子可以被氧化以形成N-氧化物。N-氧化物的具體實例係三級胺或含氮雜環上氮原子的N-氧化物。N-氧化物可藉由將相對應的胺以氧化劑如過氧化氫或過氧酸(例如過氧羧酸)處理來形成，參見例如Advanced Organic Chemistry,by Jerry March,4th Edition,Wiley Interscience,pages。更具體言之，N-氧化物可藉由L.W.Deady(Syn.Comm.(1977),7,509-514)之程序製造，其中胺化合物係與間氯過氧苯甲酸(MCPBA)在例如惰性溶劑如二氯甲烷中反應。
當用於本文時，用語「溶劑合物」意指化合物與一或多個溶劑分子的物理性結合。此物理性結合包含不同程度的離子或共價 鍵結，包括氫鍵。在某些情況下可單離該溶劑合物，例如當一或多個溶劑分子係結合於結晶固體之晶格中時。用語「溶劑合物」意欲涵括溶液相和可單離之溶劑合物兩者。合適的溶劑合物的非限制性實例包括與水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸、乙醇胺及其類似物結合之所揭露之化合物。儘管於溶液中，該化合物可發揮其生物作用。
溶劑合物在藥物化學中為習知的。它們對於物質的製備過程(例如關於其純化)、該物質的存儲(例如其穩定性)及該物質的易於處理可能是重要的，且常常形成為化學合成的單離或純化階段的一部分。所屬技術領域中具有通常知識者可藉由標準的和長期使用的技術來判定水合物或其他溶劑合物是否已經藉由用來製備給定化合物的單離條件或純化條件而形成。該等技術的實例包括熱重分析(TGA)、微差掃描熱量法(DSC)、X射線結晶學(例如單晶X射線結晶學或X射線粉末繞射)及固態核磁共振(SS-NMR，亦稱為魔角旋轉核磁共振(Magic Angle Spinning NMR)或MAS-NMR)。該等技術就像NMR、IR、HPLC及MS一樣為熟練化學家的標準分析工具的一部分。或者，所屬技術領域中具有通常知識者可故意使用結晶條件來形成溶劑合物，其中該結晶條件包括該具體溶劑合物所需的溶劑量。其後，可用上述的標準方法來確定溶劑合物是否已經形成。亦包含的是FGFR抑制劑的任何錯合物(例如與化合物如環糊精之包容錯合物(inclusion complex)或晶籠化合物，或與金屬之錯合物)。
此外，該化合物可具有一或多個多形體(結晶)或不定形形式。
該等化合物包括具有一或多個同位素取代的化合物，且提及一具體元素時其範圍包括所有該元素之同位素。例如，提及氫時其範圍包括1H、2H(D)、及3H(T)。同樣地，提及碳和氧時其範圍分別包括12C、13C及14C以及16O及18O。該等同位素可以是放射性的或非放射性的。在一實施例中，該等化合物不含放射性同位素。該等 化合物用於治療用途為較佳的。然而在另一實施例中，該化合物可含有一或多種放射性同位素。含有該等放射性同位素的化合物可用於診斷用途。
在一些實施例中，若樣本中存在有一或多個FGFR突變體，則用FGFR抑制劑治療患者，其中該FGFR抑制劑係N-(3,5-二甲氧苯基)-N'-(1-甲基乙基)-N-[3-(1-甲-1H-吡唑-4-基)喹
Figure 104131544-A0202-12-0021-183
啉-6-基]乙烷-1,2-二胺(本文中稱為「JNJ-42756493」)，或其醫藥上可接受的鹽或其溶劑合物。
在患者中治療癌症的方法
本文所揭露者為在患者中治療癌症的方法，包含：評估來自該患者的生物樣本是否存在有來自FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體；及若該樣本中存在有一或多個FGFR突變體則以FGFR抑制劑治療該患者。
所揭露之方法可用於治療各種癌症類型、包括但不限於膀胱癌、轉移性膀胱癌、卵巢癌、頭頸癌、轉移性頭頸癌、食道癌、轉移性食道癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、泌尿上皮癌、小細胞肺癌、乳癌、子宮內膜癌、轉移性子宮內膜癌、膽管癌、肝細胞癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、結腸癌、肉瘤、起源於鱗狀細胞的實質腫瘤、及多發性骨髓瘤。
在評估步驟中使用的FGFR突變基因組係部分基於患者的癌症類型。例如，對膀胱癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治 療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3 R248C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3 S249C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3 G370C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3 Y373C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有膀胱癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對轉移性膀胱癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3 R248C則以FGFR抑制劑治 療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3 S249C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3 G370C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有FGFR3 Y373C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性膀胱癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對卵巢癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR3 R248C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR3 S249C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR3 G370C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有FGFR3 Y373C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有卵巢癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對頭頸癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR3 R248C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR3 S249C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR3 G370C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR3 Y373C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有頭頸癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對轉移性頭頸癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有轉移性頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性頭頸癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對食道癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR2：BICC1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治 療。在一些實施例中，患有食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3 R248C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3 S249C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3 G370C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3 Y373C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有食道癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對轉移性食道癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 Intron則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CCD6則以 FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對非小細胞肺(NSCL)腺癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 Intron則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR3 R248C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR3 S249C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR3 G370C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有FGFR3 Y373C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL腺癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對非小細胞肺(NSCL)鱗狀細胞癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CCDC6則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 R248C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 S249C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 G370C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 Y373C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有NSCL鱗狀細胞癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對轉移性子宮內膜癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有 FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 Intron則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CCDC6則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對乳癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 Intron則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CCD6則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有 FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對肝細胞癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR2：OFD1、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 Intron則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CCDC6則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 R248C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 S249C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 G370C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 Y373C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患 有肝細胞癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
在一些實施例中，該評估步驟包含：自該生物樣本單離出RNA；自該單離的RNA合成cDNA；預先擴增該cDNA；及以一對引子擴增該預先擴增的cDNA，其中該對引子結合並擴增來自該EGFR突變基因組的一或多個EGFR突變體。
自該生物樣本單離RNA可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知之若干程序來進行。在一實施例中，可使用來自Qiagen的AllPrep DNA/RNA FFPE套組(產品編號80234)自該生物樣本單離RNA。
自單離的RNA合成cDNA可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知之若干程序來進行。在一實施例中，可使用來自ABI的具有核糖核酸酶抑制劑的高容量cDNA反轉錄酶套組(產品編號4374966)自單離的RNA合成cDNA。
預先擴增cDNA可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知之若干程序來進行。擴增程序係所屬技術領域中所習知。在一實施例中，可使用TaqMan®預先擴增主混合物(Life Technologies/Applied Biosystems®產品編號4391128)預先擴增cDNA。
在一些實施例中，該擴增步驟可包含進行即時PCR(qRT-PCR)。例示性qRT-PCR程序係於本文實例部分中討論。在一些態樣中，該qRT-PCR可為Taqman®即時PCR分析。qRT-PCR程序可涉及使用探針以增加該分析的特異性。適合用於qRT-PCR分析的探針包括任何本文中所揭露之探針，例如表15中所揭露之探針。例如，在一些實施例中，該即時PCR可以一或多個探針進行，該一或多個探針包含：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、及/或SEQ ID NO：55。在其他的實施例中，該即時PCR可以一或多個探針進行，該一或多個探針基本上由以下所組成：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、及/或SEQ ID NO：55。在其他的實施例中，該即時PCR可以一或多個探針進行，該一或多個探針係由以下所組成：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、及/或SEQ ID NO：55。在其他的實施例中，該即時PCR可以一或多個探針進行，該一或多個探針具有以下序列：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、及/或SEQ ID NO：55。
該qRT-PCR可以一或多個3’阻斷寡核苷酸進行。使用3’阻斷寡核苷酸的例示性qRT-PCR程序係揭露於本文實例部分中。合適的3’阻斷寡核苷酸包括例如揭露於表8中者。在一些實施例中，該qRT-PCR可以一或多個3’阻斷寡核苷酸進行，該一或多個3’阻斷寡核苷酸包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、及/或SEQ ID NO：42。在一些實施例中，該qRT-PCR可以一或多個3’阻斷寡核苷酸進行，該一或多個3’阻斷寡核苷酸基本上由以下所組成：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、及/或SEQ ID NO：42。在一些實施例中，該qRT-PCR可以一或多個3’阻斷寡核苷酸進行，該一或多個3’阻斷寡核苷酸係由以下所組成：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、及/或SEQ ID NO：42。在一些實施例中，該qRT-PCR可以一或多個3’阻斷寡核苷酸進行，該一或多個 3’阻斷寡核苷酸具有以下序列：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、及/或SEQ ID NO：42。
適合用於擴增步驟中的引子對包括於表3中所揭露者。例如，在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR3：TACC3 v1及具有SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為EGFR3：TACC3 v3及具有SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR3：TACC3 Intron及具有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR3：BAIAP2L1及具有SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：BICC1及具有SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：AFF3及具有SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：CASP7及具有SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：CCDC6及具有SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：OFD1及具有SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為R248C及具有SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為S249C及具有SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為G370C及具有SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36之胺基酸序列的引子。在 一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為Y373C及具有SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為上面揭露之FGFR突變體及對應引子對的任何組合。
在一些實施例中，該擴增步驟可以下面所述進行：a該引子對具有序列SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6且該探針具有序列SEQ ID NO：43；b.該引子對具有序列SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8且該探針具有序列SEQ ID NO：44；c.該引子對具有序列SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10且該探針具有序列SEQ ID NO：46；d.該引子對具有序列SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12且該探針具有序列SEQ ID NO：47；e.該引子對具有序列SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14且該探針具有序列SEQ ID NO：45；f.該引子對具有序列SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16且該探針具有序列SEQ ID NO：48；g.該引子對具有序列SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18且該探針具有序列SEQ ID NO：49；h.該引子對具有序列SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20且該探針具有序列SEQ ID NO：50；i.該引子對具有序列SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22且該探針具有序列SEQ ID NO：51；j.該引子對具有序列SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24且該探針具有序列SEQ ID NO：52；k.該引子對具有序列SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26且該探針具有序列SEQ ID NO：53； l.該引子對具有序列SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28且該探針具有序列SEQ ID NO：54；m.該引子對具有序列SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30且該探針具有序列SEQ ID NO：55；n.該引子對具有序列SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32，該探針具有序列SEQ ID NO：52，且該3’阻斷寡核苷酸具有序列SEQ ID NO：39；o.該引子對具有序列SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34，該探針具有序列SEQ ID NO：53，且該3’阻斷寡核苷酸具有序列SEQ ID NO：40；p.該引子對具有序列SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36，該探針具有序列SEQ ID NO：54，且該3’阻斷寡核苷酸具有序列SEQ ID NO：41；q.該引子對具有序列SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38，該探針具有序列SEQ ID NO：55，且該3’阻斷寡核苷酸具有序列SEQ ID NO：42；或r.彼等之任何組合。
所揭露之方法包含若該樣本中存在有一或多個FGFR突變體則治療患者。該樣本中一或多個FGFR突變體的存在可藉由例如定序該擴增的cDNA來判定。
適合用於該治療方法中的FGFR抑制劑包括本文先前所述者。
亦揭露者為用於在患者中治療癌症的FGFR抑制劑，其中該患者係藉由評估得自該患者的生物樣本是否存在有來自FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體來鑑定為對該FGFR抑制劑的治療有反應，其中在該樣本中檢測到該一或多個FGFR突變體的存在。
進一步揭露者為用於在患者中治療癌症的FGFR抑制劑，其中該患者係藉由評估得自該患者的生物樣本是否存在有來自 FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體來鑑定為對該FGFR抑制劑的治療有反應，其中該一或多個FGFR突變體係FGFR融合基因或FGFR SNP，其中在該樣本中檢測到該一或多個FGFR突變體的存在，且其中該評估包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體的引子來擴增cDNA。
進一步揭露者為用於在患者中治療癌症的FGFR抑制劑，其中該患者係藉由評估得自該患者的生物樣本是否存在有來自FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體來鑑定為對該FGFR抑制劑的治療有反應，其中該FGFR突變體係FGFR融合基因或FGFRSNP，其中在該樣本中檢測到一或多個FGFR突變體的存在，且其中該評估包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體的引子來擴增預先擴增的cDNA。
鑑定將對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應的癌症患者的方法
本文所揭露者為鑑定將對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應的癌症患者的方法，包含：評估來自該患者的生物樣本中之來自FGFR突變基因組的FGFR突變體，其中該FGFR突變體係FGFR融合基因或FGFR單核苷酸多型性，且其中該評估包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體的引子來擴增cDNA及判定該樣本中是否存在有來自該基因組的一或多個FGFR突變體，其中該一或多個FGFR突變體的存在表示該患者將對該FGFR抑制劑的治療有反應。
亦提供的是鑑定對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應的癌症患者的方法，包含：評估來自該患者的生物樣本中之來自FGFR突變基因組的FGFR突變體，其中該FGFR突變體係FGFR融合基因或FGFR單核苷酸多型性，且其中該評估包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體的 引子來擴增cDNA及判定該樣本中是否存在有來自該基因組的一或多個FGFR突變體，其中該一或多個FGFR突變體的存在表示該患者對該FGFR抑制劑的治療有反應。
進一步提供的是鑑定對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應的癌症患者的方法，包含評估來自該患者的生物樣本是否存在有來自FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體，其中該FGFR突變體係FGFR融合基因或FGFR單核苷酸多型性，其中該一或多個FGFR突變體的存在表示該患者對該FGFR抑制劑的治療有反應。
在一些實施例中，該評估可包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體的引子來擴增cDNA。在一些實施例中，該cDNA可為預先擴增的cDNA。
在一些實施例中，該評估步驟包含：自該生物樣本單離出RNA及自該單離的RNA合成cDNA。在一些態樣中，該評估步驟可在預先擴增的cDNA上進行。因此，該評估步驟可進一步包含在該擴增步驟之前預先擴增該cDNA。自生物樣本單離RNA可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知之若干程序來進行。在一實施例中，可使用來自Qiagen的AllPrep DNA/RNA FFPE套組(例如產品編號80234)自該生物樣本單離RNA。自單離的RNA合成cDNA可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知之若干程序來進行。在一實施例中，可使用來自ABI的具有核糖核酸酶抑制劑的高容量cDNA反轉錄酶套組(例如產品編號4374966)自單離的RNA合成cDNA。預先擴增cDNA可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知之若干程序來進行。擴增程序係所屬技術領域中所習知。在一實施例中，可使用TaqMan®預先擴增主混合物(Life Technologies/Applied Biosystems®產品編號4391128)預先擴增cDNA。
所揭露之方法可用於鑑定將對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應的患有若干不同癌症類型的患者，包括但 不限於膀胱癌、轉移性膀胱癌、卵巢癌、頭頸癌、食道癌、非小細胞肺腺癌、非小細胞肺鱗狀細胞癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、泌尿上皮癌、小細胞肺癌、乳癌、子宮內膜癌、膽管癌、肝細胞癌、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、結腸癌、肉瘤、起源於鱗狀細胞的實質腫瘤、及多發性骨髓瘤。
在評估步驟中使用的FGFR突變基因組係部分基於患者的癌症類型。例如，對膀胱癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v1是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v3是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：BAIAP2L1是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：BICC1是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：AFF3是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：CASP7是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 R248C是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 S249C是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 G370C是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 Y373C是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定上述FGFR突變體的任何組合是否存在於來自患有膀胱癌的患者的生物樣本中。
例如，對轉移性膀胱癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v1是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v3是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：BAIAP2L1是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：BICC1是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：AFF3是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：CASP7是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 R248C是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 S249C是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 G370C是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 Y373C是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定上述FGFR突變體的任何組合是否存在於來自患有轉移性膀胱癌的患者的生物樣本中。
例如，對卵巢癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組 合。因此，在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v1是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v3是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：BAIAP2L1是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：BICC1是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：AFF3是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：CASP7是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 R248C是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 S249C是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 G370C是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 Y373C是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定上述FGFR突變體的任何組合是否存在於來自患有卵巢癌的患者的生物樣本中。
例如，對頭頸癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：BAIAP2L1是否存在於來自患有頭頸癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：CASP7是否存在於來自患有頭頸癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 R248C是否存在於來自患有頭頸癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 S249C是否存在於來自患有頭頸癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 G370C是否存在於來自患有頭頸癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 Y373C是否存在於來自患有頭頸癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定上述FGFR突變體的任何組合是否存在於來自患有頭頸癌的患者的生物樣本中。
例如，對轉移性頭頸癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有轉移性頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性頭頸癌的患者若樣本中存在有FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性頭頸癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對食道癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR2：BICC1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v1是否存在於來自患有食道癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v3是否存在於來自患有食道癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：BICC1是否存在於來自患有食道癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：CASP7是否存在於來自患有食道癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 R248C是否存在於來自患有食道癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 S249C是否存在於來自患有食道癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 G370C是否存在 於來自患有食道癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 Y373C是否存在於來自患有食道癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定上述FGFR突變體的任何組合是否存在於來自患有食道癌的患者的生物樣本中。
例如，對轉移性食道癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 Intron則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CCD6則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性食道癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對非小細胞肺(NSCL)腺癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或 FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v1是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v3是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 Intron是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：BAIAP2L1是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：AFF3是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：CASP7是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 R248C是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 S249C是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 G370C是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 Y373C是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定上述FGFR突變體的任何組合是否存在於來自患有NSCL腺癌的患者的生物樣本中。
例如，對非小細胞肺(NSCL)鱗狀細胞癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v1是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3：TACC3 v3是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定 FGFR3：BAIAP2L1是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：BICC1是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：AFF3是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：CASP7是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR2：CCDC6是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 R248C是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 S249C是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 G370C是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定FGFR3 Y373C是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。在一些實施例中，該評估步驟包含判定上述FGFR突變體的任何組合是否存在於來自患有NSCL鱗狀細胞癌的患者的生物樣本中。
例如，對轉移性子宮內膜癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 Intron則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉 移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CCDC6則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有轉移性子宮內膜癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對乳癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 Intron則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CCD6則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有乳癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
例如，對肝細胞癌患者而言，合適的FGFR突變基因組可包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、 FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR2：OFD1、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。因此，在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 v3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：TACC3 Intron則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3：BAIAP2L1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：BICC1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：AFF3則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CASP7則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：CCDC6則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR2：OFD1則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 R248C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 S249C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 G370C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有FGFR3 Y373C則以FGFR抑制劑治療。在一些實施例中，患有肝細胞癌的患者若樣本中存在有上述FGFR突變體的任何組合則以FGFR抑制劑治療。
適合用於擴增步驟中的引子對包括於表3中所揭露者。例如，在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR3：TACC3 v1及具有SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR3：TACC3 v3及具有SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8之胺基酸序 列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR3：TACC3 Intron及具有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR3：BAIAP2L1及具有SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：BICC1及具有SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：AFF3及具有SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：CASP7及具有SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：CCDC6及具有SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為FGFR2：OFD1及具有SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為R248C及具有SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為S249C及具有SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為G370C及具有SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該EGFR突變體及引子對可為Y373C及具有SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38之胺基酸序列的引子。在一些實施例中，該FGFR突變體及引子對可為上面揭露之FGFR突變體及對應引子對的任何組合。
所揭露之方法包含判定該樣本中是否存在有來自該基因組的一或多個FGFR突變體。在一些實施例中，該判定步驟包含定序該擴增的cDNA。
在一些實施例中，該方法進一步包含若該樣本中存在有來自該基因組的一或多個FGFR突變體則以FGFR抑制劑治療該患者。適合用於該治療方法中的FGFR抑制劑包括本文先前所述者，尤其是JNJ-42756493。
用於鑑定FGFR突變基因之存在的套組
所進一步揭露者為用於鑑定生物樣本中存在有一或多個FGFR突變基因的套組，其包含：具有以下序列的引子對：SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、或彼等之任何組合；及用於進行分析以檢測一或多個FGFR突變基因的使用說明。
該套組可進一步包含一或多個探針、一或多個3’阻斷寡核苷酸、或兩者。在一些實施例中，該套組可進一步包含一或多個探針，例如一或多個任何於表15中所揭露之探針。在一些實施例中，該套組可進一步包含一或多個3’阻斷寡核苷酸，例如一或多個任何於表8中所揭露之3’阻斷寡核苷酸。在一些實施例中，該套組可進一步包含一或多個探針及一或多個3’阻斷寡核苷酸。例如，在一些實施例中，該套組可進一步包含：a.該引子對具有序列SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6且該探針具有序列SEQ ID NO：43； b.該引子對具有序列SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8且該探針具有序列SEQ ID NO：44；c.該引子對具有序列SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10且該探針具有序列SEQ ID NO：46；d.該引子對具有序列SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12且該探針具有序列SEQ ID NO：47；e.該引子對具有序列SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14且該探針具有序列SEQ ID NO：45；f.該引子對具有序列SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16且該探針具有序列SEQ ID NO：48；g.該引子對具有序列SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18且該探針具有序列SEQ ID NO：49；h.該引子對具有序列SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20且該探針具有序列SEQ ID NO：50；i.該引子對具有序列SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22且該探針具有序列SEQ ID NO：51；j.該引子對具有序列SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24且該探針具有序列SEQ ID NO：52；k.該引子對具有序列SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26且該探針具有序列SEQ ID NO：53；l.該引子對具有序列SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28且該探針具有序列SEQ ID NO：54；m.該引子對具有序列SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30且該探針具有序列SEQ ID NO：55；n.該引子對具有序列SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32，該探針具有序列SEQ ID NO：52，且該3’阻斷寡核苷酸具有序列SEQ ID NO：39； o.該引子對具有序列SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34，該探針具有序列SEQ ID NO：53，且該3’阻斷寡核苷酸具有序列SEQ ID NO：40；p.該引子對具有序列SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36，該探針具有序列SEQ ID NO：54，且該3’阻斷寡核苷酸具有序列SEQ ID NO：41；q.該引子對具有序列SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38，該探針具有序列SEQ ID NO：55，且該3’阻斷寡核苷酸具有序列SEQ ID NO：42；或r.彼等之任何組合。
寡核苷酸探針
亦揭露的是具有SEQ ID NO：43至55中任一序列的寡核苷酸探針。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：43。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：44。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：45。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：46。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：47。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：48。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：49。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：50。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：51。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：52。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：53。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：54。在一些實施例中，該寡核苷酸探針可具有序列SEQ ID NO：55。
3’阻斷寡核苷酸
本文亦揭露具有SEQ ID NO：39至42中任一序列的寡核苷酸。在一些實施例中，該3’阻斷寡核苷酸可具有序列SEQ ID NO：39。在一些實施例中，該3’阻斷寡核苷酸可具有序列SEQ ID NO：40。在一些實施例中，該3’阻斷寡核苷酸可具有序列SEQ ID NO：41。在一些實施例中，該3’阻斷寡核苷酸可具有序列SEQ ID NO：42。
實例 實例1-質體DNA的單離與純化
下面係用於製備FGFR融合質體DNA的例示性程序。
所需設備：離心力可達1500×g的離心機；微量離心機；正位移(positive-displacement)式或氣位移(air-displacement)式的移液器；漩渦震盪器(vortexer)；超微量分光光度計(nanodrop Spectrophotometer)；37℃振盪器/培養箱；及一設定為37℃的烤箱。
所需材料：含有質體DNA的冷凍甘油細菌原液；康黴素LB瓊脂平板(Teknova #L1155)；LB培養基(LB broth)(Life Technologies #10855-021)；康黴素(Sigma #K0254)；質體純化套組(Qiagen# 12123)；無水乙醇(Sigma Aldrich # E7023)；異丙醇(Sigma Aldrich #W292907)；不含核酸酶的水(不經DEPC處理)(來自IDT或Ambion # AM9932)；無核糖核酸酶的屏障式(內濾式)滴管尖(Barrier(Filter)Tip)；無核糖核酸酶的微量離心管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；血清移液管(serological pipette)；及14ml圓底管(VWR #352057)。
為了自該甘油原液提取細菌，使用無菌吸管尖自甘油原液試管的頂部刮下冷凍細菌，將其劃於LB瓊脂平板上，並倒置擺放於37℃烘箱中整夜。
使用Qiagen質體DNA純化實驗指南來純化DNA質體。簡言之，從該劃線的平板上挑出一個單一菌落並將其培養於含50μg/ml康黴素的5ml-LB培養基中於37℃大約300rpm的振盪器中培養整夜。藉由在4℃以6000×g離心15分鐘來獲取該細菌細胞，並將沉澱物重新懸浮於300μl的P1緩衝液中。加入300μl的P2緩衝液，藉由倒轉試管4至6次來混合，並在室溫培養5分鐘。加入300μl的冷卻緩衝液P3，立即倒轉4至6次來混合，在冰上培養5分鐘，並以最大速度離心10分鐘。迅速移出含有質體DNA的上清液。藉由施用1ml的QBT緩衝液平衡Qiagen管尖20並讓其以重力流方式流空。將該上清液加至該Qiagen管尖20並讓其藉由重力流方式進入樹脂。將該Qiagen管尖20以2×2ml的QC緩衝液清洗並將該DNA以800μl的QF緩衝液沖提並將沖提液收集於1.5ml微量離心管中。藉由加入0.7體積的異丙醇來沉澱DNA，混合並立即在微量離心機中以15000×g離心30分鐘。輕輕倒出上清液，及將DNA沉澱物在1ml的70%乙醇中清洗並以15000×g離心10分鐘。輕輕倒出上清液。將沉澱物風乾5至10分鐘並將該DNA重新溶解於100μl或合適體積的不含核酸酶的水中。藉由Nanodrop定量質體DNA並儲存於-20℃直至進一步使用。
實例2-NRK細胞系的生成
建構表現每個FGFR融合的表現載體。接著將表現載體轉染進正常大鼠腎上皮細胞(NRK)。轉染後在含有康黴素的培養基中挑選穩定的細胞系。接著使這些細胞生長並單離出mRNA進行FGFR融合分析以確認該等特定的FGFR融合mRNA之存在。
實例3-FGFR融合細胞系的維持
下面的實驗指南描述培養及維持該NRK FGFR融合過度表現細胞系的例示性程序。細胞系包括但不限於： NRK/FGFR3：TACC3v1、NRK/FGFR3：TACC3 v3、NRK/FGFR3：BAIAP2L1、NRK/FGFR2：BICC1、NRK/FGFR2：CASP7、NRK/FGFR2：CCDC6、NRK/FGFR2：AFF3、NRK/FGFR2：OFD1、及NRK/空載體(質體對照組)。
所需設備：生物安全櫃，裝有真空抽吸系統；CO2培養箱，設定為37℃有5% CO2；-80℃冷凍櫃；液氮罐；水浴，設定為37℃；及顯微鏡。
所需材料：血清移液管(serological pipette)；組織培養瓶(T75 VWR # BD353136及/或T150 VWR# 15705-074)；組織培養0.2μm過濾單元(Thermo Scientific #566-0020)；DMEM(杜爾貝科(Dulbecco)改良的伊格爾(Eagle)培養基)細胞培養基(Life Technologies,# 11965-084)；胎牛血清(FBS)，經認證(certified)，熱去活化(Life Technologies,# 10082147)；PenStrep抗生素溶液(Life Technologies #15140-122)；胰蛋白酶-EDTA 0.25%溶液(Life Technologies,# 25200-056)；DPBS(杜爾貝科(Dulbecco)磷酸鹽緩衝溶液，無鈣，無鎂)(Life Technologies,# 14190136)；用於超低溫冷凍保存的細胞冷凍容器；手持微量吸管(pipetman)；細胞冷凍培養基(Life Technologies,# 12648-010)；15ml錐形管(VWR # 62406-2)；及冷凍小管(cryovial)(VWR # 89094-800)。
藉由結合445ml的DMEM、50ml的FBS、及5ml的PenStrep來製備DMEM培養基以製備出該細胞培養基。將該製備的培養基通過0.2μm過濾單元並儲存於4℃。
為解凍冷凍的細胞，將製備的DMEM培養基於37℃水浴中溫熱至少15分鐘並將15ml的溫熱培養基置於T75燒瓶中。從液氮罐中取出細胞並立即放置於37℃水浴中直到剛好解凍。用70%酒精大量噴灑冷凍小管並用紙巾將多餘的酒精擦乾。將整個內容物等分分裝至含有DMEM的T75燒瓶中。將燒瓶輕輕旋轉以混合並置於培養箱中24小時。如果細胞還沒有準備好分裂，則將培養基改變為新鮮製 備的DMEM以去除殘留的冰凍培養基。如果細胞準備好分裂，一旦該燒瓶達到80%長滿後即繁殖每個細胞系(每個細胞系的分裂比係取決於實驗需要)。
為冷凍該等細胞系，將細胞自該培養瓶移出並在15ml錐形管中以1500RPM於室溫離心5分鐘。將培養基吸出並加入6ml的細胞冰凍培養基。將細胞藉由上下抽吸混合數次，並將1ml的細胞溶液等分分裝至5個冷凍小管。將帶有細胞的冷凍小管置於冷凍盒(cryofreezing container)中，將其存放於-80℃冷凍櫃整夜，然後長期儲存在液氮罐中。
實例4-FFPET SNP分析
用於進行FFPET SNP分析的例示性工作流程及實驗指南係描述如下。以類似的程序進行FFPET融合分析，其結果係顯示於圖2中。
FFPET的脫蠟
將玻片以增加量的二甲苯處理，接著以酒精處理以去除石蠟。
FFPET RNA萃取
從乳癌福馬林固定的石蠟包埋組織樣本萃取RNA以用於下游基因表現分析的程序係描述如下。
所需設備：具盤適配器(plate adapter)且離心力可達1500×g的離心機；微量離心機；正位移(positive-displacement)式或氣位移(air-displacement)式的移液器；漩渦震盪器(vortexer)；NanoDrop 8000；能於37℃、56℃及80℃培養的加熱組；及巴斯德吸管(pasteur pipette)(Pipet Trans EX-FT 1.5ml pk 500,VWR# 14670-329)。
所需材料：AllPrep DNA/RNA FFPE套組(Qiagen# 80234)；無水乙醇(Sigma Aldrich # E7023)；異丙醇；二甲苯；不含核酸酶的水(不經DEPC處理)(來自IDT或Ambion # AM9932)；無核糖核酸酶的屏障式(內濾式)滴管尖(Barrier(Filter)Tip)；無核糖核酸酶的微量離心管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；及Qiagen AllPrep DNA/RNA FFPE套組手冊。
使用該AllPrep DNA/RNA FFPE套組萃取RNA。簡言之，將一個1至10μm的切片置於1.5ml反應管中並加入800μl的HemoDe或二甲苯。將樣本漩渦震盪4秒3次，培養2分鐘，漩渦震盪4秒3次及培養5分鐘。
將樣本以最大速度(12,000-14,000×g)離心2分鐘並藉由抽吸捨棄上清液。將管立即加蓋以避免組織變乾。
重複上述步驟。
加入800μl無水乙醇，將管輕彈以移動沉澱物，漩渦震盪4秒3次，以最大速度(12,000-14,000×g)離心2分鐘，並藉由抽吸捨棄上清液。
加入800μl 70%乙醇，將管輕彈以移動沉澱物，漩渦震盪4秒3次，以最大速度離心2分鐘，並藉由抽吸捨棄上清液。移除70%乙醇後，將該管重新離心10至20秒並將殘餘的液體小心地用細口徑吸管去除。
將開口的試管在加熱組中於37℃培養5至15分鐘以風乾該組織沉澱物。
加入150μl PKD緩衝液以重新懸浮該沉澱物並輕彈該管以鬆動該沉澱物。加入10μl蛋白酶K並將該管藉由漩渦震盪來混合。
將管於56℃培養15分鐘，在冰上培養3分鐘，並以20,000×g離心15分鐘。
在不擾動到該沉澱物的情況下，將上清液小心地轉移至一個新的1.5ml微量離心管以用於RNA純化。將該上清液於80℃培養15分鐘。將管短暫離心以移除蓋子內部的液滴。加入320μl RLT緩衝液以調整結合條件，並將該管藉由漩渦震盪或移液管抽吸來混合。加入1120μl乙醇(96-100%)並將該管藉由漩渦震盪或移液管抽吸來充分混合。
將700μl的該樣本(包括任何可能已經形成的沉澱物)轉移至置於2ml收集管中的RNeasy MinElute離心管柱並以
Figure 104131544-A0202-12-0055-184
8000×g(
Figure 104131544-A0202-12-0055-185
10,000rpm)離心15秒。將流出物丟棄。重複該步驟直到全部的樣本均通過該RNeasy MinElute離心管柱。
將350μl FRN緩衝液加入至該RNeasy MinElute離心管柱並以
Figure 104131544-A0202-12-0055-186
8000×g(
Figure 104131544-A0202-12-0055-187
10,000rpm)離心15秒。將流出物丟棄。
將10μl DNA水解酶I原液加入至70μl RDD緩衝液，藉由輕輕顛倒試管來混合，並短暫離心以從試管兩側收集殘餘液體。
將該DNA水解酶I培養混合物(80μl)直接加入至該RNeasy MinElute離心管柱膜，並將其放置在工作台上(20-30℃)15分鐘。
將500μl FRN緩衝液加入至該RNeasy MinElute離心管柱並以
Figure 104131544-A0202-12-0055-188
8000×g(
Figure 104131544-A0202-12-0055-189
10,000rpm)離心15秒。保存流出物以用於下一步驟中，因為其含有小RNA。
將該RNeasy MinElute離心管柱放置在一個新的2ml收集管(提供的)中。將來自前一步驟之流出物加至該離心管柱並以
Figure 104131544-A0202-12-0055-190
8000×g(
Figure 104131544-A0202-12-0055-191
10,000rpm)離心15秒。將流出物丟棄。
將500μl RPE緩衝液加入至該RNeasy MinElute離心管柱並以
Figure 104131544-A0202-12-0055-192
8000×g(
Figure 104131544-A0202-12-0055-193
10,000rpm)離心15秒以清洗該離心管柱膜。將流出物丟棄。
將500μl RPE緩衝液加入至該RNeasy MinElute離心管柱並以
Figure 104131544-A0202-12-0056-194
8000×g(
Figure 104131544-A0202-12-0056-195
10,000rpm)離心15秒以清洗該離心管柱膜。丟棄帶有流出物的收集管。
將該RNeasy MinElute離心管柱放置在一個新的2ml收集管中並全速離心5分鐘。丟棄帶有流出物的收集管。
將該RNeasy MinElute離心管柱放置在一個新的1.5ml收集管中，將30μl不含核糖核酸酶的水直接加入至該離心管柱膜，於室溫培養1分鐘，並全速離心1分鐘以沖提出RNA。
將該RNA樣本立即儲存於-80℃冷凍櫃中。
cDNA的合成
下面揭露cDNA合成的程序以用於使用即時PCR(RT-PCR)分析的FFPET SNP分析。
所需設備：具盤適配器(plate adapter)且離心力可達1500×g的離心機；微量離心機；正位移(positive-displacement)式或氣位移(air-displacement)式的移液器(單通道和多通道移液器為較佳的)；漩渦震盪器(vortexer)；及GeneAmp® PCR系統9700(ABI# 4314879)或同等設備。
所需材料：具有核糖核酸酶抑制劑的高容量cDNA反轉錄酶套組(200次反應)(ABI# 4374966)；不含核酸酶的水(不經DEPC處理)(來自IDT)或相等物；無核糖核酸酶的屏障式(內濾式)滴管尖(Barrier(Filter)Tip)；無核糖核酸酶的微量離心管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；MicroAmpTM光學96孔反應盤(Life Technologies,#4306736)；及密封薄膜(VWR #60941-072)。
在RNA萃取(如上面所揭露)之後，將RNA樣本管保持在冰上。
使用該套組組件製備2x反轉錄(RT)主混合物(Reverse Transcription(RT)Master Mix)以用於所有反應，包括1陰性對照組 (水)。將組件在冰上解凍約15分鐘，輕輕倒轉以混合並短暫離心以帶下溶液。將所有試劑放回到冰上。試管不經漩渦震盪。
在冰上於1.5ml試管中製備主混合物以用於合適的反應數(#反應+10%，每個20-μL的反應)，其係藉由為每一次反應組合下述試劑量：2μl 10X RT緩衝液混合物；0.8μl 25X dNTP混合物；2μl 10X RT隨機引子；1μl 50U/μL MultiScribe反轉錄酶；1μl核糖核酸酶抑制劑；及3.2μl不含核酸酶/核糖核酸酶的H20。
將該主混合物漩渦震盪數次(5至10次)以混合並短暫離心(1500×g，5至10秒)。將10μl反應混合物加入至96孔盤的適當孔中。
將RNA樣本稀釋至濃度為20ng/μl。將10μL的各個RNA樣本(包括該水陰性對照組)加入至該96孔盤的適當相應孔中使最終反應體積為20μL。將孔用移液器上下吹吸3次輕輕混合，以盤式封膜(plate seal)密封，並短暫離心(1500×g持續60秒)。將盤保持在冰上直到準備裝入熱循環儀(thermocycler)。
在乾淨實驗室(Clean Lab)或工作站(Workstation)中將該反應盤裝入ABI 9700熱循環儀並用下述的反轉錄編程以20μl的反應體積來運行：
步驟1：25℃持續10分鐘
步驟2：37℃持續120分鐘
步驟3：85℃持續5秒
步驟4：4℃無限擱置
將合成的cDNA儲存於-20℃以用於下一個預先擴增的步驟。
預先擴增試料池(assay pool)混合物的製備
與FFPET SNP分析預先擴增實驗指南相關聯的預先擴增試料池混合物係如下述製備。
所需設備：微量離心機；正位移(positive-displacement)式或氣位移(air-displacement)式的移液器；及漩渦震盪器(vortexer)。
所需材料：不含核酸酶的水(不經DEPC處理)(來自IDT)或相等物；IDTE pH 8.0(1X TE溶液)(IDT Technologies)；無核糖核酸酶的屏障式(內濾式)滴管尖(Barrier(Filter)Tip)；及無核糖核酸酶的試管(1.5至2mL VWR# 10011-724)。
所有的TaqMan SNP試料係向Applied Biosystems,Life Technologies,Inc.訂購。
準備100μL的20X SNP試料。
將所有試料於冰上解凍約15分鐘以製備0.2X預先擴增試料池(Preamp Assay Pool)。將下列體積的組分加至1.5ml試管：
Figure 104131544-A0202-12-0058-11
將該0.2X預先擴增試料池短暫地漩渦震盪以混合(5至10秒)並短暫離心(1500×g，5至10秒)。將100μL的預先擴 增引子池(PreAmp Primer Pool)等分分裝進1.5ml試管中並儲存於-20℃。
用於使用即時PCR(RT-PCR)分析的乳癌福馬林固定的石蠟包埋組織SNP分析的預先擴增
所需設備：具盤適配器(plate adapter)且離心力可達1500 x g的離心機；微量離心機；正位移(positive-displacement)式或氣位移(air-displacement)式的移液器；漩渦震盪器(vortexer)；GeneAmp® PCR系統9700(ABI# 4314879)或同等設備。
所需材料：TaqMan®預先擴增主混合物(2X)(Life Technologies # 4391128)；0.2X匯集的試料混合物(見試料製備及處理實驗指南)；1X IDTE緩衝液(10mM Tris/0.1mM EDTA，pH7.5，來自IDT)或相等物；不含核酸酶的水(不經DEPC處理)(來自IDT)或相等物；無核糖核酸酶的屏障式(內濾式)滴管尖(Barrier(Filter)Tip)；無核糖核酸酶的微量離心管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；MicroAmpTM光學96孔反應盤(Life Technologies,#4306736)；MicroAmp®光學膠膜(Applied Biosystems PN 4311971)；深孔盤(VWR# 47734-788)；鋁箔封膜(VWR # 60941-126)。
將該cDNA及0.2X試料混合物池置於冰上解凍約5分鐘，並將該盤短暫離心(1500×g，5至10秒)以製備樣本。
使用套組組件以製備2x預先擴增主混合物。讓該套組組件於冰上解凍約5分鐘。在所有試劑均被解凍後，將試管輕輕倒轉以混合並短暫離心以帶下溶液。將所有試劑放回到冰上。該等試管不經漩渦震盪。
在乾淨實驗室或生物安全通風櫃(Biosafety hood)中，於冰上製備用於適當反應數的各個主混合物，其係藉由組合如下面表5指明之所需試劑量(#反應+10%)：
Figure 104131544-A0202-12-0060-12
為了防止SNP試料的交叉啟動(cross-priming)，將全部5個試料分成每個樣本有3個預先擴增反應。
將各個主混合物漩渦震盪數次(5至10次)以混合，然後短暫離心(1500×g，5至10秒)。將18.75μL的各個主混合物等分分裝至96孔反應盤的適當孔中。將6.25μL的各個cDNA樣本(包括水陰性對照孔)轉移到主混合物反應盤中的適當孔中以進行各個預先擴增反應。將該樣本用移液器上下吹吸3次輕輕混合並蓋上蓋子。將該盤短暫離心(1500×g持續60秒)並保持在冰上直到準備裝入熱循環儀。
將該反應盤裝入ABI 9700熱循環儀並用下述編程來運行：
步驟1：95℃持續10分鐘
步驟2：95℃持續15秒
步驟3：60℃持續4分鐘
步驟4：設定步驟2-3進行10個循環 若使用金或銀樣品槽，則選擇最大模式並將升降溫速率(Ramp rate)設定為77%。若使用鋁樣品槽，則選擇標準模式(沒有速率變化)。
步驟5：4℃無限擱置
將反應體積設定為25μL
在完成預先擴增後，將該預先擴增反應盤短暫離心(1500×g持續60秒)。將100μl的IDTE加至一個新的深96孔盤的適當孔中並將25μL的各個預先擴增產物轉移至該等相應孔中使最終稀釋體積為125μL。將各孔以移液器上下吹吸3次混合，將該盤以鋁箔封膜密封，將該盤短暫離心(1500×g持續5至10秒)，並將該預先擴增產物儲存於-20℃直至進一步使用。
FFPET SNP分析-即時PCR
下面所揭露者為使用即時PCR分析的福馬林固定的石蠟包埋組織SNP分析程序。
所需設備：具盤適配器(plate adapter)且離心力可達1500×g的離心機；微量離心機；正位移(positive-displacement)式或氣位移(air-displacement)式的移液器(單通道和多通道移液器為較佳的)；漩渦震盪器(vortexer)；及ABI ViiA 7即時PCR儀器(Life Technologies)。
所需材料：TaqMan基因分型主混合物(Life Technologies # 4371355)；SNP試料；不含核酸酶的水(不經DEPC處理，來自IDT)或相等物；無核糖核酸酶的屏障式(內濾式)滴管尖(Barrier(Filter)Tip)；無核糖核酸酶的微量離心管(1.5至2mL VWR# 10011-724)；MicroAmp®光學膠膜(Applied Biosystems PN 4311971)；及MicroAmpTM光學384孔反應盤。
表15列出在即時PCR分析中使用的探針序列。
為製備樣本，在乾淨實驗室或工作站中，將SNP試料置於冰上解凍約5分鐘。將所有試劑避光以避免螢光探針曝光。在製 備基因分型主混合物後，於骯髒實驗室(Dirty Lab)或工作站中將稀釋的預先擴增盤置於冰上解凍。
為製備基因分型主混合物，將該基因分型主混合物置於冰上解凍約5分鐘。在冰上將該主混合物(MM)製備於所需數量的試管中。將所需的試劑體積在適當的標記試管中組合，如下面表6中所指明(#反應+10%)：
Figure 104131544-A0202-12-0062-13
將該主混合物漩渦震盪數次(5至10次)以混合並接著短暫離心(1500×g，5至10秒)。將15μl的各個主混合物加至MicroAmpTM光學384孔反應盤的適當孔中。將該反應盤用光學膠膜密封。
將帶有1：5稀釋的預先擴增產物的盤置於冰上約5至10分鐘以解凍。使用多通道移液器將5μL的各個稀釋的預先擴增產物轉移至該等適當的相應孔中。將該反應盤用光學膠膜密封並短暫離心(1500×g持續60秒)。將盤保持在冰上直到準備裝入熱循環儀(thermocycler)。
使用viiA 7軟體將體積設定為20μl來運行以下條件：
Figure 104131544-A0202-12-0062-14
FGFR SNP特異性qRT-PCR
在過量的野生型等位基因中檢測罕見的體細胞突變在癌症診斷上越來越重要。當感興趣的突變彼此接近時，檢測變得具有挑戰性。為了有助於自FFPET鑑定FGFR SNP，開發出SNP特異性qRT-PCR分析，其中使用SNP特異性擴增，其係使用3’雙去氧野生型(WT)等位基因阻斷劑再加上Taqman MGB探針。該分析防止了非特異性結合，增進在目標上擴增的數量，最小化來自該WT等位基因的假陽性信號，並且增加了該分析的靈敏度。此基於RNA的SNP檢測法加上該分析中的預先擴增步驟，提高了低或罕見的突變信號。
使用3’雙去氧WT阻斷劑寡核苷酸的SNP特異性qRT-PCR的例示性策略係顯示於圖3中，且例示性FFPE樣本驗證策略係繪示於圖4中。簡言之，使用該等FGFR SNP引子在3’雙去氧WT阻斷劑寡核苷酸的存在下進行qRT-PCR，該3’雙去氧WT阻斷劑寡核苷酸係與該WT等位基因互補並含有一段位於該WT等位基因兩側的短核苷酸。當該等FGFR SNP引子結合該FGFR SNP並將其特異性擴增時，該阻斷劑寡核苷酸與該WT等位基因的結合會防止該WT等位基因擴增。在該FGFR SNP特異性qRT-PCR中使用的3’雙去氧WT阻斷劑寡核苷酸係顯示於表8中。在該FGFR SNP特異性qRT-PCR中使用的FGFR SNP引子係：SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32(FGFR3 R248C)；SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34(FGFR3 S249C)；SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36(FGFR3 G370C)；及SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38(FGFR3 Y373)。表15列出在該即時PCR分析中使用的探針序列。
Figure 104131544-A0305-02-0065-1
Figure 104131544-A0305-02-0066-2
用於驗證研究的樣本係如表9中所示來製備。FGFR3 G370C、FGFR3 Y373、FGFR3 S249C、及FGFR3 R248C之使用3’雙去氧WT阻斷劑寡核苷酸的SNP特異性qRT-PCR的例示性驗證數據係分別繪示於圖5A至圖5D。FFPE樣本之使用3’雙去氧WT阻斷劑寡核苷酸的SNP特異性qRT-PCR的原始Ct(循環閾值)數據係顯示於表10中。使用不同的平台/技術自DNA及RNA得出的數據意味著使用3’阻斷寡核苷酸的SNP特異性PCR係一種強大、可靠及靈敏的分析。該驗證數據意味著一個突變等位基因/SNP可以在大量過量的WT承載基因組DNA中被檢測出，從而突出每個分析的靈敏度和特異性。
Figure 104131544-A0305-02-0066-3
 來自表現各FGFR3 SNP(R248C、S249C、G370C、Y373C)之穩定細胞系及FGFR3 WT的RNA
Figure 104131544-A0305-02-0066-4
Figure 104131544-A0202-12-0065-19
實例5-定製FGFR融合基因檢測法的驗證 為FGFR融合分析產生陽性對照
產生FGFR融合「合成的迷你基因」、編碼FGFR融合的質體、及含有FGFR融合的穩定細胞系。簡言之，合成的迷你基因係人工建構，其係藉由將一系列核苷酸(約100個鹼基對)彼此連接，該等核苷酸係對應於感興趣的基因的目標DNA序列。編碼FGFR融合的質體係藉由將編碼各種FGFR融合基因的cDNA選殖進表現載體來產生。含有FGFR融合的穩定細胞系係藉由將編碼FGFR基因的質體轉染進正常大鼠腎上皮細胞(NRK細胞)來產生。該穩定細胞系係在G418抗生素下挑選。在單離自該等細胞系的總RNA上進行FGFR融合Taqman分析以確認成功產生表現該FGFR融合的穩定細胞系。該表現FGFR融合的穩定細胞系係用作陽性對照。表15列出在該即時PCR分析中使用的探針序列。
FGFR融合分析的定量下限及效率分析
為了測定該FGFR融合基因分析的定量下限(LLOQ)及效率，以TaqMan PCR產生FGFR融合產物(如實例4中所述)並藉由桑格(Sanger)定序來確認(圖2)。將100pg的融合陽性DNA與正常人類cDNA(確認為融合陰性)混合，以1：10連續稀釋，並使用 Applied Biosystems ViiA7軟體v1.1來分析。效率標準曲線係顯示於圖6中。FGFR融合LLOQ及效率係顯示於表11中。
Figure 104131544-A0202-12-0066-20
接著在融合基因陽性細胞系中驗證該FGFR融合基因分析。藉由將融合蛋白陽性細胞系摻入融合蛋白陰性細胞系以製備FGFR融合基因表現的連續稀釋。例如，為FGFR3：TACC3v1及FGFR3：BAIAP2L1製備1：2的連續稀釋並摻入進一百萬個BAF細胞。單離出RNA(使用Qiagen Rneasy套組)，接著為目標FGFR融合基因進行RT-PCR，預先擴增cDNA，及進行TaqMan即時PCR。如表12中所示，該FGFR3：TACC3v1及FGFR3：BAIAP2L1融合基因TaqMan分析均能在一百萬個融合陰性細胞中檢測到31個細胞中的該融合標的(靈敏度為0.003%)。
Figure 104131544-A0202-12-0066-21
 RT112及SW780=市售的膀胱癌細胞系，其帶有該FGFR融合(來自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection))。
實例6-定製FGFR SNP檢測法的驗證 評估膀胱癌中的FGFR3突變
在所測試的膀胱癌樣本中分別觀察到約8%、約61%、及約19%有R248C、S249C、及Y373C SNP。
實例7-癌症樣本的分析
使用如實例4中所述之相同程序分析樣本。結果係顯示於表13及圖7中。表13顯示不同癌症中的FGFR融合盛行率。在來自不同癌症如膀胱癌(原發性及轉移性)、NSCLC(腺癌及鱗狀細胞癌)、卵巢癌、食道癌(原發性及轉移性)、頭頸癌(H&N；原發性及轉移性)、子宮內膜癌(轉移性)、乳癌、及前列腺癌的FFPE樣本中使用qRT-PCR方法來檢測FGFR融合。所有測試的FGFR融合在前列腺癌樣本中均為陰性。FGFR3：TACC3 Intron融合在膀胱癌(原發性)、NSCLC(鱗狀細胞癌)、卵巢癌及食道癌(原發性)、H&N(原發性及轉移性)及乳癌中為陰性。FGFR2：OFD1融合在膀胱癌(原發性及轉移性)、NSCLC(腺癌)、卵巢癌及食道癌(原發性及轉移性)中為陰性。FGFR2：CCDC6融合在膀胱癌(原發性及轉移性)、NSCLC(腺癌)、卵巢癌及食道癌(原發性)及H&N(原發性及轉移性)中為陰性。
圖8係NSCLC腺癌及鱗狀細胞癌中FGFR融合基因及突變狀態的例示性圖像。在FGFR融合陽性NSCLC腺癌樣本中，3/17個樣本為EGFR突變陽性，3/17個樣本為KRAS突變陽性，及1/17個樣本為cMET突變陽性。然而，在FGFR融合陽性NSCLC鱗狀細胞癌樣本中並未觀察到EGFR、KRAS、或cMET突變。
Figure 104131544-A0202-12-0068-22
實例8-晚期實質腫瘤患者的治療
進行一臨床試驗，其中具有表現該FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR2：CCDC6及FGFR2：BICC1融合基因的各種實質腫瘤的患者係以JNJ-42756493治療。圖9繪示了第一期患者樣本的例示性結果，其中使用qRT-PCR分析檢測在第一期JNJ-427493(EDI10001)試驗樣本中的FGFR融合。同時運行所有的FGFR融合分析與陽性對照(ST)及GAPDH以進行RNA的品質控制評估。A)pt#1000081所產生的qRT-PCR數據的圖示：只有FGFR2：BICC1融合呈現陽性(插圖顯示FGFR2：BICC1融合、ST陽性對照及GAPDH的詳細Ct值)。B)pt#33000158所產生的qRT-PCR數據的圖示：只有FGFR3：TACC3v1融合呈現陽性(插圖顯示FGFR3：TACC3v1融合、ST陽性對照及GAPDH的詳細Ct值)。C)pt#34000123所產生的qRT-PCR數據的圖示：只有FGFR2：CCDC6融合呈現陽性(插圖顯示FGFR2：CCDC6融合、ST陽性對照及GAPDH的詳細Ct值)。D)pt#340000115所產生的qRT-PCR數據的圖示：FGFR3：TACC3v1、FGFR3：TACC#v3及FGFR2：CCDC6融合呈現陽性(插圖顯示FGFR融合、ST陽性對照及GAPDH的詳細Ct值)。
圖10描繪在患有晚期實質腫瘤的患者中JNJ-42756493首次應用於人體的試驗(First-In-Human Study)的例示性第一期研究設計。所顯示者為用於該第一期臨床試驗的傳統3+3設計劑量遞增法的圖形表示。該劑量遞增階段的目的是確定最大耐受劑量(MTD)及建議的第二期劑量(RPD)。第1部分係用來確定間歇給藥時間表，即7天給藥和7天休息(10mg/kg及12mg/kg)。第2部分係用來測定PD生物標誌物(藥效動力學生物標誌物；供製造商檢查以將藥物的效果連接到目標及生物腫瘤反應)，其中活體組織切片和血液樣本被測試。第3部分係使用劑量延伸世代(dose expansion cohort)並包括累積額外的具不同資格標準(FGFR畸變：轉位/突變/擴增)的特定適應症 患者(NSCLC、SCLC、乳癌及實質腫瘤)以進一步描繪出JNJ493的毒性特徵。
臨床活性的估算
在具有FGFR融合基因的患者中觀察9mg給藥每天一次(QD)、12mg QD及12mg 7天給藥/7天休息的顯著臨床反應(RECIST)。(圖11；代表所有給藥方案)。
實例9-產生穩定轉染FGFR融合的RK3E細胞 FGFR融合過度表現細胞系
RK3E(大鼠腎上皮細胞)細胞係購自ATCC(Manassas,VA,USA)並培養在添加有FBS及抗生素的DMEM(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)中。設計FGFR融合基因構造體並將其選殖進含有HA標籤的pReceiver表現載體(Genecopoeia,Rockville,MD,USA)。按照製造商的實驗指南，使用Amaxa Cell Line Nucleofector(Lonza,Basel,Switzerland)將殖株轉染進RK3E細胞。在具有800ug/ml G418的完全培養基(Invitrogen)中選擇穩定轉染的細胞。藉由即時PCR及使用抗pFGFR抗體的免疫印漬術來證實該穩定轉染細胞過度表現該等融合(圖12)。如圖12所示，該穩定細胞系顯示出表現有活躍的FGFR融合激酶，如FGFR磷酸化的表現所展現。
群落形成分析
測試該穩定轉染FGFR融合的RK3E細胞的非錨定依賴性生長(anchorage-independent growth)。首先將帶有0.8%低熔點瓊脂糖的1ml培養基塗佈到六孔盤的三個孔中。瓊脂凝固後，每孔加入額外1ml含100個細胞的0.4%瓊脂培養基。14天後，固定群落並用0.1%甲苯酚結晶紫染色。由顯微鏡確定群落數，其係藉由人工計數每 個細胞系的三重複孔。各個融合過度表現細胞系的代表視圖係顯示於圖13A中。在該等穩定轉染FGFR融合的細胞中可檢測到在軟瓊脂中有非錨定依賴性生長，但在空載體對照組中則無。圖13B描繪穩定轉染FGFR融合的RK3E細胞及空載體對照組在軟瓊脂中群落的定量分析。所有實驗都重複兩次並且將結果表示為菌落/100個塗布細胞。所有測試的FGFR融合均誘導非錨定依賴性生長，彰顯出其轉形能力。
下游目標的表現
將穩定轉染FGFR融合的RK3E細胞塗布於完全生長培養基中，血清饑餓(serum starved)整夜，然後重新供給有0.5%FBS的生長培養基。在配體(ligand)的存在下，將細胞以1μM的JNJ-42756493、AZD4547或NVP-BGJ398處理1小時。關於免疫印漬術，在RIPA緩衝液(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)中收集全細胞溶解物並使用BCA蛋白質分析(Thermo Scientific)測定樣本的蛋白質濃度。將等量的蛋白質(每泳道30μg)上樣到4-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)，然後進行SDS-page。將蛋白質轉移到硝化纖維膜上並用抗p-FGFR、總FGFR2、p-MAPK、總MAPK、p-S6、總S6、B肌動蛋白(Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)、及總FGFR3(Santa Cruz,Dallas,TX,USA)的抗體探查。於室溫將該等膜以Odyssey阻斷緩衝液阻斷1小時並於4℃在一級抗體溶液(以Odyssey阻斷緩衝液稀釋(1：1000))中培養整夜。在0.1% Tween三乙醇胺緩衝鹽水溶液(TBST)中清洗三次後，於室溫將該等膜以於Odyssey阻斷緩衝液中的山羊抗小鼠或驢抗兔IR-Dye 670或800cw標記的二級抗血清探查1小時。在二次標記後重複清洗步驟並使用LiCor Odyssey掃描器及Odyssey 3.0分析軟體(LiCor,Lincoln,NE,USA)將該等膜成像。將JNJ-42756493的效果與AZD4547及NVP-BGJ398比較。如圖14A至圖14H所示，JNJ-42756493、AZD4547 及NVP-BGJ398的處理(每一個印漬的泳道2-4)抑制了FGFR及下游目標(亦即MAPK及S6)的磷酸化。
FGFR融合過度表現細胞系的藥物反應測試
將穩定轉染FGFR融合的RK3E細胞以三重複種入96孔盤(每孔1000個細胞)中的完全生長培養基及配體FGF-1與FGF-2中。24小時後，將細胞血清飢餓整夜，然後重新供給有0.5% FBS的生長培養基。塗盤的72小時後，將細胞用各種濃度的JNJ493、AZD4547(AZD)、及NVP-BGJ398(NVS)的18點1：3系列稀釋(起始於10μM)處理。接著將微量滴定盤培養72小時並使用Cell Titer-Glo®冷光細胞存活分析(Promega Corp.,Madison,WI,USA)按照製造商的說明進行修改來測定腺苷三磷酸(ATP；代謝活性細胞的標誌物)含量。簡言之，使細胞達到室溫，在該時間加入Cell Titer-Glo®試劑的1：1混合物。接著將細胞放置於定軌振盪器上2分鐘並於室溫培養10分鐘以穩定冷光信號。使用Envision多標記盤讀取器(Perkin Elmer；Waltham,MA,USA)定量冷光並進行測量。使用GraphPad Prism 5.0計算IC50值(顯示於表14中)。如表14所示，帶有該等FGFR融合的細胞在體外顯示出對FGFR抑制劑JNJ-42756493、AZD4547及NVP-BGJ398有敏感性，當與AZD4547及NVP-BGJ398比較時，JNJ-42756493展現出更強的敏感性(奈米莫耳濃度級的濃度範圍)，而空載體對照組則沒有顯示出敏感性。
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所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解到可以對本發明的較佳實施例做出許多變化及修改且可在不背離本發明精神的情況下做出該等變化及修改。因此，文後所附申請專利範圍是要含括所有此類相等變異，其係屬於本發明的真實精神及範疇。
本文件中所引用或描述之各個專利、專利申請案、及公開案之揭露內容其全文皆以引用方式併入本文中。
FGFR融合基因的核苷酸序列
工程改造進表現載體的FGFR融合cDNA的核苷酸序列係提供於表16中。下劃線的序列對應FGFR3或FGFR2，正常字體的序列代表融合夥伴且斜體字體的序列代表FGFR3基因的內含子序列。
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Figure 104131544-A0202-12-0076-27
Figure 104131544-A0202-12-0077-28
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具體實施例
下面的實施例列表係意在補充而非代替或取代先前的描述。
具體實施例1.一種鑑定對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應之癌症患者的方法，其包含：評估來自該患者的一生物樣本中之來自FGFR突變基因組的一FGFR突變體，其中該FGFR突變體係一FGFR融合基因或一FGFR單核苷酸多型性，且其中該評估包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體的引子來擴增cDNA；及判定該樣本中是否存在有來自該FGFR突變基因組的該一或多個FGFR突變體，其中該一或多個FGFR突變體的存在表示該患者對該FGFR抑制劑的治療有反應。
具體實施例2.一種鑑定對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應之癌症患者的方法，其包含：評估來自該患者的一生物樣本存在有來自一FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體，其中該FGFR突變體係一FGFR融合基因或一FGFR單核苷酸多型性，其中該一或多個FGFR突變體的存在表示該患者對該FGFR抑制劑的治療有反應。
具體實施例3.如具體實施例1或2之方法，其中該FGFR融合基因包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
具體實施例4.如具體實施例1或2之方法，其中該FGFR單核苷酸多型性包含R248C、S249C、G370C、或Y373C、或彼等之任何組合。
具體實施例5.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係膀胱癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
具體實施例6.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係轉移性膀胱癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
具體實施例7.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係卵巢癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
具體實施例8.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係頭頸癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
具體實施例9.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係轉移性頭頸癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
具體實施例10.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係食道癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR2：BICC1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
具體實施例11.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係轉移性食道癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
具體實施例12.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係非小細胞肺癌腺癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
具體實施例13.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係非小細胞肺癌鱗狀細胞癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
具體實施例14.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係轉移性子宮內膜癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
具體實施例15.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係乳癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
具體實施例16.如具體實施例1或2之方法，其中該癌症係肝細胞癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR2：OFD1、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
具體實施例17.如具體實施例2至16中任一具體實施例之方法，其中該評估包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體的引子來擴增cDNA。
具體實施例18.如具體實施例17之方法，其中該cDNA係預先擴增的cDNA。
具體實施例19.如前述具體實施例中任一具體實施例之方法，其中該FGFR突變體及引子對係：FGFR3：TACC3 v1及具有SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6之胺基酸序列的引子；FGFR3：TACC3 v3及具有SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8之胺基酸序列的引子；FGFR3：TACC3 Intron及具有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之胺基酸序列的引子；FGFR3：BAIAP2L1及具有SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12之胺基酸序列的引子； FGFR2：BICC1及具有SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之胺基酸序列的引子；FGFR2：AFF3及具有SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16之胺基酸序列的引子；FGFR2：CASP7及具有SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18之胺基酸序列的引子；FGFR2：CCDC6及具有SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20之胺基酸序列的引子；FGFR2：OFD1及具有SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22之胺基酸序列的引子；R248C及具有SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32之胺基酸序列的引子；S249C及具有SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之胺基酸序列的引子；G370C及具有SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36之胺基酸序列的引子；Y373C及具有SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：3之胺基酸序列8的引子；或彼等之任何組合。
具體實施例20.如前述具體實施例中任一具體實施例之方法，其中該評估包含：自該生物樣本單離出RNA及自該單離的RNA合成cDNA。
具體實施例21.如具體實施例20之方法，其進一步包含在該擴增步驟之前預先擴增該cDNA。
具體實施例22.如具體實施例1或3至21中任一具體實施例之方法，其中該cDNA被預先擴增。
具體實施例23.如具體實施例1或3至22中任一具體實施例之方法，其中該擴增步驟包含進行即時PCR。
具體實施例24.如具體實施例23之方法，其中該即時PCR係以一或多個探針來進行，該一或多個探針包含SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、及/或SEQ ID NO：55。
具體實施例25.如具體實施例23或24之方法，其中該即時PCR係以一或多個3’阻斷寡核苷酸來進行，該一或多個3’阻斷寡核苷酸包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、及/或SEQ ID NO：42。
具體實施例26.如具體實施例1或3至25中任一具體實施例之方法，其中該判定步驟包含定序該擴增的cDNA。
具體實施例27.一種用於鑑定生物樣本中存在有一或多個EGFR突變基因的套組，其包含：具有以下序列的引子對：SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38、或彼等之任何組合；及 用於進行一分析以檢測一或多個FGFR突變基因的使用說明。
具體實施例28.如具體實施例27之套組，其進一步包含一或多個探針、一或多個3’阻斷寡核苷酸、或兩者。
具體實施例29.如具體實施例28之套組，其中a.該引子對具有序列SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6且該探針具有SEQ ID NO：43之序列；b.該引子對具有序列SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8且該探針具有SEQ ID NO：44之序列；c.該引子對具有序列SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10且該探針具有SEQ ID NO：46之序列；d.該引子對具有序列SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12且該探針具有SEQ ID NO：47之序列；e.該引子對具有序列SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14且該探針具有SEQ ID NO：45之序列；f.該引子對具有序列SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16且該探針具有SEQ ID NO：48之序列；g.該引子對具有序列SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18且該探針具有SEQ ID NO：49之序列；h.該引子對具有序列SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20且該探針具有SEQ ID NO：50之序列；i.該引子對具有序列SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22且該探針具有SEQ ID NO：51之序列；j.該引子對具有序列SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24且該探針具有SEQ ID NO：52之序列；k.該引子對具有序列SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26且該探針具有SEQ ID NO：53之序列； l.該引子對具有序列SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28且該探針具有SEQ ID NO：54之序列；m.該引子對具有序列SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30且該探針具有SEQ ID NO：55之序列；n.該引子對具有序列SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32，該探針具有SEQ ID NO：52之序列，且該3’阻斷寡核苷酸具有SEQ ID NO：39之序列；o.該引子對具有序列SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34，該探針具有SEQ ID NO：53之序列，且該3’阻斷寡核苷酸具有SEQ ID NO：40之序列；p.該引子對具有序列SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36，該探針具有SEQ ID NO：54之序列，且該3’阻斷寡核苷酸具有SEQ ID NO：41之序列；q.該引子對具有序列SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38，該探針具有SEQ ID NO：55之序列，且該3’阻斷寡核苷酸具有SEQ ID NO：42之序列；或r.彼等之任何組合。
具體實施例30.一種引子，其具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或彼等之任何組合。
具體實施例31.一種引子組，其具有以下序列：SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38、或彼等之任何組合。
具體實施例32.一種寡核苷酸探針，其具有SEQ ID NO：43至55中任一者之序列、或彼等之任何組合。
具體實施例33.一種寡核苷酸，其具有SEQ ID NO：39至42中任一者之序列、或彼等之任何組合。
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 45
Figure 104131544-A0305-02-0117-59
<210> 46
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 46
Figure 104131544-A0305-02-0117-60
<210> 47
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 47
Figure 104131544-A0305-02-0117-61
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 48
Figure 104131544-A0305-02-0117-62
<210> 49
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 49
Figure 104131544-A0305-02-0117-63
<210> 50
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 50
Figure 104131544-A0305-02-0118-64
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 51
Figure 104131544-A0305-02-0118-66
<210> 52
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 52
Figure 104131544-A0305-02-0118-67
<210> 53
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 53
Figure 104131544-A0305-02-0118-68
<210> 54
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 54
Figure 104131544-A0305-02-0118-69
<210> 55
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成探針"
<400> 55
Figure 104131544-A0305-02-0119-71
<210> 56
<211> 2850
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成多核苷酸"
<400> 56
Figure 104131544-A0305-02-0119-73
Figure 104131544-A0305-02-0120-74
<210> 57
<211> 2955
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成多核苷酸"
<400> 57
Figure 104131544-A0305-02-0121-75
Figure 104131544-A0305-02-0122-76
<210> 58
<211> 4462
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成多核苷酸"
<400> 58
Figure 104131544-A0305-02-0122-77
Figure 104131544-A0305-02-0123-78
Figure 104131544-A0305-02-0124-79
Figure 104131544-A0305-02-0125-80
<210> 59
<211> 3765
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成多核苷酸"
<400> 59
Figure 104131544-A0305-02-0125-81
Figure 104131544-A0305-02-0126-82
Figure 104131544-A0305-02-0127-83
<210> 60
<211> 4989
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成多核苷酸"
<400> 60
Figure 104131544-A0305-02-0127-84
Figure 104131544-A0305-02-0128-85
Figure 104131544-A0305-02-0129-86
Figure 104131544-A0305-02-0130-87
<210> 61
<211> 5109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成多核苷酸"
<400> 61
Figure 104131544-A0305-02-0130-88
Figure 104131544-A0305-02-0131-89
Figure 104131544-A0305-02-0132-90
Figure 104131544-A0305-02-0133-91
<210> 62
<211> 3213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成多核苷酸"
<400> 62
Figure 104131544-A0305-02-0133-92
Figure 104131544-A0305-02-0134-93
Figure 104131544-A0305-02-0135-94
<210> 63
<211> 3423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成多核苷酸"
<400> 63
Figure 104131544-A0305-02-0135-95
Figure 104131544-A0305-02-0136-96
Figure 104131544-A0305-02-0137-97
<210> 64
<211> 5229
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成多核苷酸"
<400> 64
Figure 104131544-A0305-02-0137-98
Figure 104131544-A0305-02-0138-99
Figure 104131544-A0305-02-0139-100
Figure 104131544-A0305-02-0140-101
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成寡核苷酸"
<400> 65
Figure 104131544-A0305-02-0140-102
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成寡核苷酸"
<400> 66
Figure 104131544-A0305-02-0140-103
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述；合成寡核苷酸"
<400> 67
Figure 104131544-A0305-02-0140-104
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成寡核苷酸"
<400> 68
Figure 104131544-A0305-02-0141-105
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成寡核苷酸"
<400> 69
Figure 104131544-A0305-02-0141-106
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成寡核苷酸"
<400> 70
Figure 104131544-A0305-02-0141-107
<210> 71
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成寡核苷酸"
<400> 71
Figure 104131544-A0305-02-0141-108
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成寡核苷酸"
<400> 72
Figure 104131544-A0305-02-0141-110
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /note="人工序列的敘述：合成寡核苷酸"
<400> 73
Figure 104131544-A0305-02-0142-111

Claims (33)

  1. 一種鑑定對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應之癌症患者的方法，其包含：評估來自該患者的一生物樣本中之來自一FGFR突變基因組(gene panel)的一或多個FGFR突變體，其中該一或多個FGFR突變體係包含一FGFR融合基因或一FGFR單核苷酸多型性，且其中該評估包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體的引子來擴增cDNA；及判定該樣本中是否存在有來自該FGFR突變基因組的該一或多個FGFR突變體，其中該一或多個FGFR突變體的存在表示該患者對該FGFR抑制劑的治療有反應，且其中該FGFR抑制劑包含具有式(I)結構之化合物，
    Figure 104131544-A0305-02-0143-5
    ，其N-氧化物，其醫藥上 可接受的鹽或其溶劑化物。
  2. 一種鑑定對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑的治療有反應之癌症患者的方法，其包含：評估來自該患者的一生物樣本存在有來自一FGFR突變基因組的一或多個FGFR突變體，其中該一或多個FGFR突變體係包含一FGFR融合基因或一FGFR單核苷酸多型性，其中該一或多個FGFR突變體的存在表示該患者對該FGFR抑制劑的治療有反應，且其中該FGFR抑制劑包含具有式(I)結構之化合物，
    Figure 104131544-A0305-02-0144-6
    ，其N-氧化物，其醫藥上可接受的 鹽或其溶劑化物。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中該FGFR融合基因包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
  4. 如請求項1或2所述之方法，其中該FGFR單核苷酸多型性包含R248C、S249C、G370C、或Y373C、或彼等之任何組合。
  5. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係膀胱癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
  6. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係轉移性膀胱癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
  7. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係卵巢癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、 FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
  8. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係頭頸癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
  9. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係轉移性頭頸癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
  10. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係食道癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR2：BICC1、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
  11. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係轉移性食道癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
  12. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係非小細胞肺癌腺癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
  13. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係非小細胞肺癌鱗狀細胞癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
  14. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係轉移性子宮內膜癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
  15. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係乳癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCD6、或FGFR2：OFD1、或彼等之任何組合。
  16. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌症係肝細胞癌且該FGFR突變基因組包含FGFR3：TACC3 v1、FGFR3：TACC3 v3、FGFR3：TACC3 Intron、FGFR3：BAIAP2L1、FGFR2：BICC1、FGFR2：AFF3、FGFR2：CASP7、FGFR2：CCDC6、FGFR2：OFD1、FGFR3 R248C、FGFR3 S249C、FGFR3 G370C、或FGFR3 Y373C、或彼等之任何組合。
  17. 如請求項2所述之方法，其中該評估包含以一對結合並擴增來自該FGFR突變基因組的該一或多個FGFR突變體的引子來擴增cDNA。
  18. 如請求項17所述之方法，其中該cDNA係預先擴增的cDNA。
  19. 如請求項1所述之方法，其中該一或多個FGFR突變體及引子對係：FGFR3：TACC3 v1及具有SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6之胺基酸序列的引子；FGFR3：TACC3 v3及具有SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8之胺基酸序列的引子；FGFR3：TACC3 Intron及具有SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之胺基酸序列的引子； FGFR3：BAIAP2L1及具有SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12之胺基酸序列的引子；FGFR2：BICC1及具有SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之胺基酸序列的引子；FGFR2：AFF3及具有SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16之胺基酸序列的引子；FGFR2：CASP7及具有SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18之胺基酸序列的引子；FGFR2：CCDC6及具有SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20之胺基酸序列的引子；FGFR2：OFD1及具有SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22之胺基酸序列的引子；R248C及具有SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32之胺基酸序列的引子；S249C及具有SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34之胺基酸序列的引子；G370C及具有SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36之胺基酸序列的引子；Y373C及具有SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38之胺基酸序列的引子；或彼等之任何組合。
  20. 如請求項1所述之方法，其中該評估包含：自該生物樣本單離出RNA及自該單離的RNA合成該cDNA。
  21. 如請求項20所述之方法，其進一步包含在該擴增步驟之前預先擴增該cDNA。
  22. 如請求項1所述之方法，其中該cDNA被預先擴增。
  23. 如請求項1所述之方法，其中該擴增步驟包含進行即時PCR。
  24. 如請求項23所述之方法，其中該即時PCR係以一或多個探針來進行，該一或多個探針包含SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、及/或SEQ ID NO：55。
  25. 如請求項23所述之方法，其中該即時PCR係以一或多個3’阻斷寡核苷酸來進行，該一或多個3’阻斷寡核苷酸包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、及/或SEQ ID NO：42。
  26. 如請求項1所述之方法，其中該判定步驟進一步包含定序該擴增的cDNA。
  27. 一種用於鑑定一生物樣本中存在有一或多個FGFR突變基因的套組，其包含：具有以下序列的引子對：SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38、或彼等之任何組合；及用於進行一分析以檢測該一或多個FGFR突變基因的使用說明。
  28. 如請求項27所述之套組，其進一步包含一或多個探針、一或多個3’阻斷寡核苷酸、或兩者。
  29. 如請求項28所述之套組，其中 a.該引子對具有序列SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6且該探針具有SEQ ID NO：43之序列；b.該引子對具有序列SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8且該探針具有SEQ ID NO：44之序列；c.該引子對具有序列SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10且該探針具有SEQ ID NO：46之序列；d.該引子對具有序列SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12且該探針具有SEQ ID NO：47之序列；e.該引子對具有序列SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14且該探針具有SEQ ID NO：45之序列；f.該引子對具有序列SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16且該探針具有SEQ ID NO：48之序列；g.該引子對具有序列SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18且該探針具有SEQ ID NO：49之序列；h.該引子對具有序列SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20且該探針具有SEQ ID NO：50之序列；i.該引子對具有序列SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22且該探針具有SEQ ID NO：51之序列；j.該引子對具有序列SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24且該探針具有SEQ ID NO：52之序列；k.該引子對具有序列SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26且該探針具有SEQ ID NO：53之序列；l.該引子對具有序列SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28且該探針具有SEQ ID NO：54之序列；m.該引子對具有序列SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30且該探針具有SEQ ID NO：55之序列； n.該引子對具有序列SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32，該探針具有SEQ ID NO：52之序列，且該3’阻斷寡核苷酸具有SEQ ID NO：39之序列；o.該引子對具有序列SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34，且該探針具有SEQ ID NO：53之序列；p.該引子對具有序列SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36，該探針具有SEQ ID NO：54之序列，且該3’阻斷寡核苷酸具有SEQ ID NO：41之序列；q.該引子對具有序列SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38，該探針具有SEQ ID NO：55之序列，且該3’阻斷寡核苷酸具有SEQ ID NO：42之序列；或r.彼等之任何組合。
  30. 一種引子，其具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或彼等之任何組合。
  31. 一種引子組，其具有以下序列：SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38、或彼等之任何組合。
  32. 一種寡核苷酸探針，其具有SEQ ID NO：43至55中任一者之序列、或彼等之任何組合。
  33. 一種寡核苷酸，其具有SEQ ID NO：39至42中任一者之序列、或彼等之任何組合。
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