TWI674106B

TWI674106B - 柳蘭萃取物用於提升轉谷氨醯胺酶（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ１，ＴＧＭ）基因、角蛋白（Ｋｅｒａｔｉｎ，ＫＲＴ）基因、水通道蛋白（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ，ＡＱＰ）基因及聚角蛋白微絲（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ，ＦＬＧ）基因表現量之用途

Info

Publication number: TWI674106B
Application number: TW107111692A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 張蓉
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2018-04-02
Publication date: 2019-10-11
Also published as: CN110339220A; TW201941781A

Abstract

本發明提供一種柳蘭萃取物用於提升角質細胞中TGM、KRT、AQP及FLG基因表現量，以及促進角質細胞分泌玻尿酸並舒緩皮膚敏感、泛紅之醫藥組合物的用途，能有效維持角質細胞排列，使皮膚角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能以及使皮膚形成更多保濕因子。其中該柳蘭萃取物係柳蘭以水、醇、或醇水混合物之溶劑所萃取而得。

Description

柳蘭萃取物用於提升轉谷氨醯胺酶(Transglutaminase1,TGM)基因、角蛋白(Keratin,KRT)基因、水通道蛋白(Aquaporin,AQP)基因及聚角蛋白微絲(Filaggrin,FLG)基因表現量之用途

本發明係關於一柳蘭萃取物之用途，尤其是一種柳蘭萃取物用於提升轉谷氨醯胺酶(Transglutaminase,TGM)基因、角蛋白(Keratin,KRT)基因、水通道蛋白(Aquaporin,AQP)基因及聚角蛋白微絲(Filaggrin,FLG)基因表現量之醫藥組合物之用途。

表皮層為皮膚的最外層，由外往內依序為角質層、顆粒層、有棘層及基底層，表皮層主要由基底層中未分化之圓柱型角質細胞持續向上進行分化形成，此過程稱為角質化。角質細胞內含水量高，隨著細胞向上代謝分化，角質細胞形狀會逐漸變成扁平狀，且細胞核及胞器開始退化萎縮，並在角質層形成不具細胞核與胞器之死細胞。表皮層的主要功能為使皮膚保水，並形成皮膚屏障以抵禦各種外來傷害，其中表皮層最外層由一弱酸性的皮脂膜以及如磚牆結構的角質層所構成，此屏障能鎖住皮膚的水分和油脂、抵抗皮膚表面病菌入侵，及對抗外界異物及紫外光等傷害，對人體有非常重要的保護作用。

表皮層中的角質層，其角質細胞雖然為死細胞，但其主要成分為角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮膚保持濕潤，角質細胞也會分泌如玻尿酸等物質作為細胞間質，以維持表皮層皮膚屏障之結構完整，以防止皮膚水分散失及形成完整防護。當皮膚接觸過冷或過熱之環境以及照射紫外光等刺激，會導致角質細胞無法維持正常的代謝循環，並使得皮膚表皮層屏障受損，而讓皮膚變得粗糙、乾燥脫屑、脆弱易受刺激、敏感泛紅且會使皮膚保水能力下降，因此角質層的健康對於皮膚保濕以及抵禦外來傷害著實非常重要。

綜合上面所述，為了改善因角質細胞受損導致皮膚變得脆弱、易敏，以及皮膚保水能力下降的問題，開發一種能有效維持角質細胞排列、維持角質層結構完整以及使角質細胞分泌更多保濕因子，以提升皮膚屏障以及保濕功能之醫藥組成物，著實有其必要性。

緣此，本發明之一目的在提供一種柳蘭萃取物用於製備提升轉谷氨醯胺酶(Transglutaminase,TGM)基因、角蛋白(Keratin,KRT)基因、水通道蛋白(Aquaporin,AQP)基因及聚角蛋白微絲(Filaggrin,FLG)基因表現量之醫藥組合物的用途。

本發明之又一目的在提供一種柳蘭萃取物用於製備提升角質細胞中水通道蛋白之蛋白質表現之醫藥組合物的用途。

本發明之又一目的在提供一種柳蘭萃取物用於製備促進角質細胞分泌玻尿酸之醫藥組合物的用途。

本發明之另一目的在提供一種柳蘭萃取物用於製備舒緩皮膚敏感、泛紅之醫藥組合物的用途。

本發明之柳蘭萃取物係以一溶劑萃取一柳蘭所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，該溶劑與該柳蘭之液固比為5~20：1~5，且該萃取步驟係在50℃~100℃進行。

在本發明之一實施例中，該轉谷氨醯胺酶基因係轉谷氨酰胺酶1(Transglutaminase 1,TGM1)基因；該角蛋白基因包含角蛋白1(Keratin1,KRT1)基因、角蛋白10(Keratin10,KRT10)基因及角蛋白14(Keratin14,KRT14)基因；該水通道蛋白係水通道蛋白3(Aquaporin 3,AQP 3)。

在本發明之一實施例中，該醫藥組合物會維持角質細胞之排列，使皮膚角質層結構完整。

同時，本發明用於提升TGM、KRT、AQP及FLG基因表現量，以及促進角質細胞分泌玻尿酸並舒緩皮膚敏感、泛紅之醫藥組合物，亦可包含一有效量之柳蘭萃取物及一醫藥上可接受之載體，該組合物係以粉末狀、顆粒狀、液狀、膠狀或膏狀存在。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1係為本發明實施例之柳蘭萃取物於提升轉谷氨醯胺酶1(Transglutaminase 1,TGM1)基因、角蛋白1(Keratin1,KRT1)基因、角蛋白10(Keratin10,KRT10)基因及角蛋白14(Keratin14,KRT14)基因表現量之長條圖。

圖2係為本發明實施例之柳蘭萃取物於提升水通道蛋白3(Aquaporin 3,AQP 3)基因表現量之長條圖。

圖3係為本發明實施例之柳蘭萃取物於提升聚角蛋白微絲(Filaggrin,FLG)基因表現量之長條圖。

圖4係為本發明實施例之柳蘭萃取物於角質細胞中提升水通道蛋白之蛋白質表現之免疫螢光染色圖。

圖5係為本發明實施例之柳蘭萃取物於促進角質細胞分泌玻尿酸的效果之長條圖。

圖6係為本發明實施例之柳蘭萃取物於舒緩皮膚泛紅的效果之長條圖。

實施例1本發明之柳蘭萃取物的製備方法

柳蘭(Epilobium angustifolium)為柳葉菜科(Onagraceae)多年生草本植物，生於海拔3100~4250米的山坡林緣、林下及河谷濕草地，莖為直立狀高約1米，葉為披針形且無葉柄，邊緣有細鋸齒，兩面被微毛，花穗長且為紅紫或淡紅色，花期為6~8月，是理想的夏季花卉，目前已知柳蘭具有調經活血、消腫止痛、治療月經不順、骨折、關節扭傷之功效。

在本發明一實施例中，將柳蘭整株清洗，取洗淨後之柳蘭整株與水之萃取溶劑以5~20：1~5之液固比混合，在溶劑中進行萃取0.5~3小時後，加入酒精去除懸浮物質，以獲得粗萃取物。萃取後冷卻至室溫，將該粗萃取物經由0.45~0.2micron之濾網過濾以獲得濾液。最後，將該濾液於45~70℃進行減壓濃縮並加入防腐劑，得到本發明之柳蘭萃取物。

實施例2 本發明柳蘭萃取物提升角質細胞中TGM1、KRT1、KRT10、KRT14、APQ3及FLG的基因表現量

本發明以人類初代皮膚角質細胞(human primary epidermal keratinocytes,HPEK)進行TGM1、KRT1、KRT10、KRT14、APQ3及FLG之基因分析。該人類初級皮膚角質細胞購自CELLnTEC公司(瑞士)編號HPEK-50，將該細胞培養於無血清之角質細胞培養液(keratinocyte-SFM)(Gibco公司，編號為#10724-011，美國)。

將人類初代角質細胞分成兩組：(1)加入本發明之柳蘭萃取物的實驗組以及(2)空白控制組，接著將角質細胞加入裂解液(lysis buffer)收集成管後，使用RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)分別收集兩組角質細胞內之RNA，接著利用SuperScript® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)以2000ng之萃取RNA為模板並以引子產生mRNA反轉錄之相應cDNA產物，接著利用ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國)以及KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)將兩組反轉錄後產物分別以表一之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)試驗，定量TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因、APQ3基因及FLG基因之mRNA表現量，條件為95℃反應1秒，60℃反應20秒，總共40個迴圈，其中定量數值係取由閾值循環數(Ct)，而目標基因的mRNA相對量係推導自方程式2^- _△ ^Ct，其中△Ct=Ct_目標基因-Ct_TBP(TATA結合蛋白，TATA box binding protein)，再利用Excel軟體進行非成對單尾student t-test以決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本發明之柳蘭萃取物對於提升角質細胞中TGM1、KRT1、KRT10、KRT14、APQ3及FLG的基因表現之效果的實驗結果如圖1、圖2及圖3所示，先前研究指出轉谷氨醯胺酶(Transglutaminase1,TGM)會使角質化細胞之細胞膜與結構蛋白間形成強力鍵結，並能增加表皮層的強度與穩定性；角蛋白(Keratin,KRT)會形成角蛋微絲，而聚角蛋白微絲(Filaggrin,FLG)會幫助角蛋白微絲組裝成堅固的網絡，為皮膚提供強度和彈性；水通道蛋白(Aquaporin,AQP)則會加角質細胞內水的通透性，以提高角質細胞的含水量。角質細胞經柳蘭萃取物處理後，相較於空白控制組，TGM1基因表現量提升約1.8倍、KRT1基因表現量提升約2.4倍、KRT10基因表現量提升約2倍、KRT14基因表現量提升約2.3倍、APQ3基因表現量提升約4.3倍，以及FLG基因表現量提升約1.6倍，此結果顯示本發明之柳蘭萃取物具有優異之提升TGM、KRT、APQ及FLG基因表現量的能力，能有效維持皮膚角質細胞排列，使皮膚角質層結構完整，亦能有效提升皮膚屏障功能亦能使皮膚形成更多保濕因子。

實施例3本發明之柳蘭萃取物提升角質細胞中水通道蛋白的蛋白質表現量

本發明進一步檢測角質細胞中水通道蛋白的表現情形，藉由檢測水通道蛋白之蛋白質表現，以得知本發明之柳蘭萃取物提升角質細胞含水量的情形。首先，將2x10³個人類初代角質細胞培養在蓋玻片上(該蓋玻片置於6孔培養盤中)，並於37℃培養16至18小時，其中將人類初代角質細胞分成兩組：(1)加入本發明之柳蘭萃取物的實驗組以及(2)空白控制組，接著以免疫螢光染色分析(Immunofluorescence Assay)以及共軛焦影像顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy)觀察初代角質細胞中水通道蛋白之蛋白質表現情形。將蓋玻片上之角質細胞以300μl之4%仲甲醛(Paraformaldehyde)於室溫下固定15分鐘，並以500μl磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline,PBS)沖洗三次，再以300μl含0.5% Triton X-100之磷酸鹽緩衝溶液將細胞於室溫下穿孔(penetrate)十分鐘後移除，接著加入300μl之阻斷溶液(含1%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)之磷酸鹽緩衝溶液)於室溫下作用1小時，以降低後續實驗中雜質與抗體之非專一性結合，並以500μl磷酸鹽緩衝溶液沖洗三次，接著加入200μl之以阻斷溶液配製的APQ3多株捕捉抗體(Polyclonal anti-AQP3 antibody，購自Bosterimmunoleader，美國，編號PA1488)溶液，於37℃下作用2小時，並以500μl磷酸鹽緩衝溶液沖洗三次，接著加入200μl之以阻斷溶液配製的Alexa Fluor-488偶聯的抗鼠二級抗體(購自Thermo，美國，編號A11032)溶液，於37℃下作用1小時，並以500μl磷酸鹽緩衝溶液沖洗三次，接著加入200μl之20000倍稀釋後的赫斯特(Hoechst 33342，購自Thermo，美國，編號62249)將細胞於室溫下使核染色3~5分鐘，並以500μl磷酸鹽緩衝溶液沖洗三次，接著將蓋玻片固定於一載玻片上，並在共軛焦雷射掃描顯微鏡(ZEISS LSM 700)下進行觀察。

本發明之柳蘭萃取物對於提升水通道蛋白之蛋白質於角質細胞中表現量的實驗結果如圖4所示，經過柳蘭萃取物處理後，相較於空白控制組，水通道到蛋白3之蛋白質的表現量明顯提升。此結果顯示本發明之柳蘭萃取物具有優異之提升角質細胞中水通道蛋白之蛋白質表現量，並能有效提升角質細胞之含水量以及形成更多保濕因子，具有效提升角質層結構完整之能力。

實施例4本發明之柳蘭萃取物促進角質細胞分泌玻尿酸之效果

進一步測試本發明之柳蘭萃取物對促進角質細胞分泌玻尿酸之效果，由於已知角質細胞會分泌玻尿酸等物質作為細胞間質，以維持表皮層屏障之完整，及防止皮膚水分散失及形成完整防護，因此。首先於96孔培養盤中，每孔加入200μl之上述培養液並植入1x10⁴個角質細胞，並於37℃培養16-18小時，接著將細胞分成三組：(1)加入0.0625mg/mL或(2)0.03125mg/mL本發明之柳蘭萃取物以及(3)空白控制組，於37℃培養24小時，時間到後在不擾動貼附細胞的情況下，每孔收集120μl之培養液。

接著利用玻尿酸(Human Hyaluronic Acid,HA又稱人類透明質酸)之ELISA分析檢測試劑套組(購自Cusabio Biotech公司，中國，編號CSB-E04805h)進行分析。首先於在底部覆蓋一層人類透明質酸捕捉抗體之96孔培養盤中，加入100μl之各孔收集之培養液，或溶於含1%牛血清白蛋白之磷酸鹽緩衝溶液的標準品，於37℃下與捕捉抗體進行結合2小時，時間到後將液體移除，並直接於每孔中加入100μl之偵測抗體，於37℃下偵測捕捉抗體1小時後，以200μl之清洗溶液(含0.05%聚氧乙烯無水山梨醇單月桂酸酯(tween 20)之磷酸鹽緩衝溶液)沖洗96孔培養盤中每個孔洞共三次，再加入100μl之辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素(Streptavidin-HRP)於37℃下作用1小時，與偵測抗體進行結合，接著以200μl之清洗溶液沖洗96孔培養盤中每個孔洞共三次，並加入90μl之呈色溶液，於37℃下作用15~30分鐘並且避光，再加入50μl之終止溶液以中止反應，最後以酵素免疫分析儀測量其5分鐘內於450nm之吸光值。再以Excel軟體進行student t-test以決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本發明之柳蘭萃取物對促進角質細胞分泌玻尿酸的效果之實驗結果如圖5所示，經過柳蘭萃取物處理後，角質細胞分泌之玻尿酸量顯著增加，相較於空白控制組的玻尿酸分泌量，以0.0625mg/mL柳蘭萃取物處理之組別增加9.6%，而以0.03125mg/mL柳蘭萃取物處理之組別增加23.8%，此結果顯示本發明之柳蘭萃取物具有優異之促進角質細胞分泌玻尿酸的能力，能有效使皮膚角質層結構完整並提升皮膚屏障功能，並使皮膚保水力提升。

實施例5本發明之柳蘭萃取物舒緩皮膚敏感、泛紅之效果

為證實本發明之柳蘭萃取物於舒緩皮膚泛紅之效果，首先，製備添加1%柳蘭萃取物之1%柳蘭精華液；以及不含柳蘭萃取物的精華液作為對照組精華液，其中該精華液成分皆為水、馨鲜酮、己二醇、1,3-丁二醇、三仙膠、增稠劑以及三乙醇胺。接著，募集8位受試者，每位受試者於每日早晚清洗完臉部後，將控制組精華液、含本發明之柳蘭萃取物精華液分別使用於左右半臉之肌膚，並以指腹稍加按摩促進吸收，於使用前與使用後4週以VISIA肌膚檢測儀(CIS-VISIA.7 VISIA Complexion Analysis System，Canfield scientific，美國，序號V71214)進行皮膚泛紅之膚質檢測。

本發明之柳蘭萃取物對舒緩皮膚泛紅的效果之實驗結果如圖6所示，使用含本發明之柳蘭萃取物之精華液後，比使用對照組舒緩皮膚泛紅7%(第零週91.5%，第四週84.5%)，此結果顯示本發明之柳蘭萃取物能有效舒緩皮膚泛紅，具有提升皮膚屏障以及保濕能力之效果。

綜上所述，本發明以水、醇類、或醇水混合物為溶劑所萃取得之柳蘭萃取物，能有效提升角質細胞中保濕相關基因表現量、提升水通道蛋白之蛋白質於角質細胞中表現量、促進角質細胞分泌玻尿酸的效果並能有效舒緩皮膚敏感、泛紅，以維持皮膚角質細胞排列，使皮膚角質層結構完整，以提升皮膚屏障功能以及使皮膚形成更多保濕因子。因此，本發明之柳蘭萃取物可用於製備柳蘭萃取物用於提升轉谷氨酰胺酶基因、角蛋白基因、水通道蛋白基因及聚角蛋白微絲基因表現量之醫藥組合物的用途，該組合物可為粉末狀、顆粒狀、液狀、膠狀或膏狀，且可製成食品、飲品、藥品、試劑或營養補充劑，藉由口服、皮膚塗抹等方式給予一個體。

<110> 大江生醫股份有限公司

<120> 柳蘭萃取物用於提升轉谷氨酰胺酶1基因、角蛋白基因、水通道蛋白基因及聚角蛋白微絲基因表現量之用途

<130> 106BO580-I1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成引子

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Claims

一種柳蘭萃取物用於製備提升角質細胞中水通道蛋白之蛋白質表現量之醫藥組合物的用途，其中該柳蘭萃取物係以一溶劑萃取一柳蘭所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，該溶劑與該柳蘭之液固比為5~20：1~5，且該萃取步驟係在50℃~100℃進行。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該水通道蛋白係水通道蛋白3(Aquaporin 3,AQP 3)。
一種柳蘭萃取物用於製備促進角質細胞分泌玻尿酸之醫藥組合物的用途，其中該柳蘭萃取物係以一溶劑萃取一柳蘭所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物，該溶劑與該柳蘭之液固比為5~20：1~5，且該萃取步驟係在50℃~100℃進行。
如申請專利範圍第1項或第3項所述之用途，其中該醫藥組合物進一步包含一醫藥上可接受之載體。
如申請專利範圍第1項或第3項所述之用途，其中該醫藥組合物之形式為粉末狀、顆粒狀、液狀、膠狀或膏狀之劑型。
如申請專利範圍第1項項或第3項所述之用途，其中該醫藥組合物會維持角質細胞之排列，使皮膚角質層結構完整。