TWI670271B - [1,2,4]三唑并[4,3-a]吡-6(5h)-酮衍生物 - Google Patents

[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡-6(5h)-酮衍生物 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種式I化合物： 式I， 其中X為H或視情況經羥基取代之C1-C3烷基； Y為H、羥基或甲基； R為乙基、正丙基、環丙基或

Description

[1,2,4]三唑并[4,3-A]吡-6(5H)-酮衍生物
本發明係關於某些人類PDE1抑制劑、包含化合物之醫藥組合物、使用化合物治療生理病症之方法以及適用於合成化合物之中間產物及方法。
磷酸二酯酶(PDE)為藉由控制此等環狀核苷酸水解速率調節cAMP及cGMP之細胞含量的酶類。PDE1 (鈣依賴型及鈣調蛋白依賴型PDE)為至少11種已知PDE家族中之一者。PDE1表現於許多組織中，包括大腦、心臟、肺、腎臟及平滑肌。另外，PDE1包含三種已知的同功異構物(PDE1A、PDE1B及PDE1C)之家族。
患有糖尿病之患者通常罹患稱為糖尿病性腎病(或糖尿病性腎病變)的慢性腎病形式。據估計，糖尿病性腎病可影響多達40%的糖尿病患者。用於糖尿病性腎病之治療選擇方案受到限制且包括使用降血壓之藥物、控制血糖含量、飲食及體重，且實施常規的身體活動。因此，對於患有慢性腎病(特定言之糖尿病性腎病)的患者而言需要額外的治療選項。
美國專利第8,299,080號揭示適用於治療諸如排尿困難及高血壓之各種病症的具有PDE9抑制活性的某些喹喏啉衍生物。另外，歐洲專利第0 040 401號揭示具有抗高血壓活性的某些經取代三唑喹喔啉-4-酮。
本發明提供作為人類PDE1抑制劑之某些新穎化合物。另外，本發明提供相對於諸如PDE3A、PDE4D及PDE6AB之其他人類PDE作為人類PDE1A、PDE1B及PDE1C之選擇性抑制劑的某些新穎化合物。此外，本發明提供可具有抗高血壓效果且亦可改善腎血流量之某些新穎化合物。另外，本發明之某些化合物可減少腎纖維化。
因此，本發明提供式I化合物： 式I 其中X為H或視情況經羥基取代之C1-C3烷基； Y為H、羥基或甲基； R為乙基、正丙基、環丙基或 ；且 A為甲基、環丙基或三氟甲基； 或其醫藥學上可接受之鹽； 其限制條件為在X及Y均為H且R為正丙基時，則A不為甲基。
本發明亦提供一種治療患者之慢性腎病的方法，其包含向需要此治療之患者投與有效量之式I化合物。
本發明亦提供一種治療患者之糖尿病性腎病的方法，其包含向需要此治療之患者投與有效量之式I化合物。
本發明亦提供一種治療患者之高血壓的方法，其包含向需要此治療之患者投與有效量之式I化合物。
另外，本發明提供一種用於療法之式I化合物。本發明進一步提供一種用於治療慢性腎病之式I化合物。另外，本發明提供一種用於治療糖尿病性腎病之式I化合物。另外，本發明提供一種用於治療高血壓之式I化合物。此外，本發明提供製造用於治療慢性腎病之藥物之式I化合物的用途。此外，本發明提供製造用於治療糖尿病性腎病之藥物之式I化合物的用途。本發明進一步提供製造用於治療高血壓之藥物之式I化合物的用途。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含式I化合物及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明進一步提供一種用於製備醫藥組合物之方法，其包含將式I化合物與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑摻合。本發明亦包涵用於合成式I化合物之新穎中間產物及方法。
如本文中所使用，術語「治療(treating/treatment)」或「以治療(to treat)」包括阻止、限制、減慢、遏止或逆轉現有症狀或病症之進展或嚴重程度。
如本文中所使用，術語「患者」係指哺乳動物，諸如犬或人類，其中人類較佳。
如本文中所使用，術語「有效量」係指在向患者投與單一或多種劑量後，在診斷或治療下於患者體內提供所需效果的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的量或劑量。
如本文中所使用，術語「C1-C3烷基」係指甲基、乙基、正丙基及異丙基。
有效量可容易地由熟習此項技術者使用已知技術及藉由在類似情況下所獲得的觀測結果來測定。在測定患者之有效量時，熟習此項技術者考慮多種因素，包括(但不限於)：患者之體型、年齡及一般健康狀況；所涉及的特定疾病或病症；涉及程度或疾病或病症之嚴重程度；個別患者之反應；所投與的特定化合物；投與模式；所投與之製劑之生物可用性特徵；所選擇之給藥方案；伴隨藥物的使用；以及其他相關情況。
本發明之化合物在屬於約0.01至約20 mg/kg體重之範圍內的每日劑量下有效。在一些情況下，低於前述範圍之下限值的劑量可已完全足夠，同時在其他情況下，在可接受的副作用之情況下仍可採用較大劑量，且因此以上劑量範圍並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。
本發明之化合物經調配為醫藥組合物，其藉由使得化合物生物可用之任何途徑投與，該途徑包括口服及非經腸途徑。最佳地，此等組合物用於經口投與。此等醫藥組合物及其製備方法在此項技術中熟知(參見例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, 編者, 第22版, Pharmaceutical Press, 2012)。
式I化合物尤其適用於本發明之治療方法，但某些基團、取代基及化合物為較佳的。以下段落描述此等較佳基團、取代基及化合物。應理解，此等優選項可適用於治療方法及本發明之新化合物。
較佳的，Y為H。
較佳的，X為甲基。
較佳的，R為正丙基。
較佳的，A為環丙基。
較佳的，式I化合物呈游離鹼形式。
更佳的，當Y為H時，X為甲基。
更佳的，當Y為H時，R為正丙基。
更佳的，當Y為H時，A為環丙基。
更佳的，當X為甲基時，R為正丙基。
更佳的，當X為甲基時，A為環丙基。
尤其較佳的，當Y為H時，X為甲基且A為環丙基。
尤其較佳的，當Y為H時，X為甲基且R為正丙基。
尤其較佳的，Y為H，R為正丙基且A為環丙基。
下式之化合物： 及其醫藥學上可接受之鹽為最佳的，其中正上方之化合物的游離鹼為尤其較佳的。
本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽可例如藉由使本發明化合物之適當游離鹼在適合溶劑中在此項技術中熟知之標準條件下與適當醫藥學上可接受之酸反應而形成。參見例如，Gould, P.L., 「Salt selection for basic drugs」, International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)； Bastin, R.J., 等人, 「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities」, Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)；及Berge, S.M., 等人, 「Pharmaceutical Salts」, Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)。
個別異構體、對映異構體或非對映異構體可由一般熟習此項技術者在合成本發明化合物之任何適宜點處藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析之方法來分離或分解(參見例如J. Jacques, 等人, 「 Enantiomers , Racemates , and Resolutions」, John Wiley and Sons, Inc., 1981, 及E.L. Eliel及S.H. Wilen, 「 Stereochemistry of Organic Compounds」, Wiley-Interscience, 1994)。名稱「異構體1」及「異構體2」係指在指定條件下分別第一及第二自對掌性層析溶離之化合物。
某些縮寫定義如下：「ACN」係指乙腈；「AcOH」係指冰醋酸；「DBU」係指1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯；「DCM」係指二氯甲烷(dichloromethane/methylene chloride)；「DIPEA」係指N,N-二異丙基乙胺；「DMF」係指N,N-二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲亞碸；「EDCI」係指1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺；「ES/MS」係指電噴灑質譜分析；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「Et 2O」係指乙醚；「EtOH」係指乙醇；「HMDS」係指六甲基二矽氮烷(hexamethyldisilazane)；「HOBT」係指羥基苯并三唑；「IPA」係指異丙醇；「HATU」係指1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1 H-1,2,3-三唑并[4,5- b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽；「RBF」係指圓底燒瓶；「TR」係指滯留時間；「hr」係指小時數；「IC 50」係指該試劑可能產生50%最大抑制反應時的試劑濃度；「μmol」係指微莫耳數；「min」係指分鐘數；「MeOH」係指甲醇(methanol/methyl alcohol)；「MTBE」係指甲基-第三丁基醚；「NiNTA」係指具有瓊脂糖固定相之層析法，該瓊脂糖固定相使用氮基三乙酸作為螯合劑進行官能化；「POCl 3」係指氧氯化磷；「RT」係指室溫；「SNAr」係指親核性芳族取代基；「TEA」係指三乙胺；「THF」係指四氫呋喃；「Tris」係指2-胺基-2-羥基甲基-丙烷-1,3-二醇；「U/ml」係指每毫升之單位數；「wt」係指重量；且「Pd-PEPPSI-IHeptCl」係指二氯[1,3-雙(2,6-二-4-庚基苯基)咪唑-2-亞基](3-氯吡啶基)鈀(II)。
本發明化合物可藉由一般熟習此項技術者已知之多種程序製備，其中一些在以下流程、製備及實例中加以說明。一般熟習此項技術者咸了解，所描述每一種途徑之特定合成步驟可依不同方式組合，或與不同流程之步驟結合，以製備本發明化合物。下文各步驟之產物可藉由此項技術中熟知之習知方法回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。在以下流程中，除非另外指示，否則所有取代基均如先前所定義。試劑及起始材料為一般熟習此項技術者容易獲得的。在不限制本發明範圍的情況下，提供以下流程、製備及實例以進一步說明本發明。
製備 13- N-丁基-5-甲基-吡啶-2,3-二胺之合成。 向5-甲基吡啶-2,3-二胺(5.64 g，44.0 mmol)於DCM (300 mL)中之經攪拌懸浮液中添加丁醛(3.28 g，46 mmol)及AcOH (0.26 mL，4.5 mmol)。在RT下攪拌懸浮液50 min，接著音波處理1 min。三乙醯氧基硼氫化鈉(29.1 g，137 mmol)以5部分添加，且在室溫下攪拌反應混合物45 min。反應混合物用水(300 mL)淬滅，且分離各層。水溶液用飽和NaHCO 3水溶液稀釋且用DCM萃取。合併之有機相用飽和NaHCO 3水溶液、飽和NaCl水溶液洗滌，接著經無水Na 2SO 4乾燥，進一步經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，以產生呈粗製材料狀之標題化合物5.64 g。將NaHCO 3水溶液及飽和NaCl洗液合併，用飽和NaCl水溶液稀釋，且用3:1 CHCl 3/IPA (4×)及MTBE萃取。有機相經合併，用飽和NaCl水溶液洗滌，經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，以得到額外780 mg材料。材料經合併以得到粗製標題化合物(6.42 g)。MS (m/z):180 (M+H)。
以基本上類似於製備1之方法的方式由5-甲基吡啶-2,3-二胺及丙醛(針對製備編號2)；及5-溴-6-甲基-吡啶-2,3-二胺及丁醛(針對製備編號3)製備如表1中所展示之以下化合物。 表1.
製備編號 化學名稱 結構 MS ( m/z)
2 5-甲基-3- N-丙基-吡啶-2,3-二胺 166 (M+H)
3 5-溴-3- N-丁基-6-甲基-吡啶-2,3-二胺 258/260 (M+H)
流程 1
製備 46-甲氧基- N-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-硝基-吡啶-2-胺之合成。 流程 1 ， 步驟 A ：在氮氣下攪拌2-氯-6-甲氧基-3-硝基-吡啶(4.99 g，26.515 mmol)於ACN (90 mL)中之溶液且將其加熱至65℃。添加4-甲氧基苯甲基胺(7.25 mL，55.5 mmol)，且形成固體沈澱物。在65℃下攪拌反應物1小時。將反應混合物冷卻至RT，經由矽藻土墊過濾，在減壓下濃縮，且接著進一步在高真空下乾燥隔夜，以得到粗製黃色固體標題化合物(8.638 g)。MS (m/z): 290 (M+H)。
製備 56-甲氧基-2- N-[(4-甲氧基苯基)甲基]吡啶-2,3-二胺之合成。 流程 1 ， 步驟 B ：在IPA (55 mL)中合併6-甲氧基- N-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-硝基-吡啶-2-胺(5.00 g，14.0 mmol)、雙(頻哪醇根基)二硼(11.2 g，43.2 mmol)及第三丁醇鉀(1.93 g，16.8 mmol)。在氮氣下密封反應混合物且在110℃下攪拌隔夜。將反應物冷卻至RT且用EtOAc稀釋。有機層用水、隨後用飽和NaCl水溶液洗滌，經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由矽石上之急驟層析純化，用30-50% EtOAc/己烷溶離。純淨層析溶離份經合併且在減壓下濃縮，在高真空下乾燥隔夜，以得到粗製藍色殘餘標題化合物(4.88 g)。MS (m/z): 260 (M+H)。
流程 2
製備 6 外消旋 -N-(2-甲氧基丁基)-2-硝基吡啶-3-胺之合成。 流程 2 ， 步驟 A ：將TEA (4.3 mL，31 mmol)添加至3-氟-2-硝基吡啶(1.500 g，10.24 mmol)及(2-甲氧基丁基)胺鹽酸鹽(1.590 g，10.82 mmol)之懸浮液。在RT下攪拌反應物2.5小時。添加EtOAc，且材料用飽和NH 4Cl水溶液及飽和NaCl水溶液洗滌，接著經無水MgSO 4乾燥且過濾。濾液經濃縮且藉由矽石上之急驟層析純化，用DCM/MTBE溶離。純淨層析溶離份經合併且在減壓下濃縮，以得到作為標題化合物之橙黃色液體(2.223 g；外消旋物)。MS (m/z): 226.0 (M+H)。
製備 7 外消旋-3- N -[2-甲氧基丁基]吡啶-2,3-二胺之合成。 流程 2 ， 步驟 B ：在氮氣下將MeOH (100 mL)添加至具有5% Pd/C (0.452 g，4.25 mmol)之帕爾震盪器(Parr shaker)，接著添加 N-(2-甲氧基丁基)-2-硝基-吡啶-3-胺(2.22 g，9.86 mmol)於MeOH (100 mL)中之溶液。帕爾震盪器經密封，用氮氣吹掃，用氫氣吹掃，且用氫氣加壓(60 psig)，且接著在RT下攪拌4小時。材料經過濾且濃縮，以得到作為標題化合物之深色厚凝膠(1.794 g；外消旋物)。MS (m/z): 196.0 (M+H)。
流程 3
製備 8 N-(2-胺基-5-溴-3-吡啶基)丁醯胺之合成。 流程 3 ， 步驟 A ：將5-溴吡啶-2,3-二胺(5 g，27 mmol)隨後DIPEA (14 mL，80 mmol)添加至丁酸(2.7 mL，29 mmol)及HATU (15.01 g，40 mmol)於DMF (90 mL)中之溶液。在氮氣下密封反應物且在50℃下攪拌隔夜。將反應混合物冷卻至RT，用水稀釋且用EtOAc萃取。有機相經合併，用飽和NaHCO 3水溶液、5%氯化鋰水溶液及飽和NaCl水溶液洗滌，接著經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由矽石上之急驟層析純化，用40-100% EtOAc/己烷溶離，以得到白棕色固體。固體在EtOAc中經研磨，過濾，且在真空下在50℃下乾燥1小時，以得到標題化合物(3.607 g)。MS (m/z): 258/260 (M+H)。
製備 95-溴-3- N-丁基-吡啶-2,3-二胺之合成。 流程 3 ，步驟 B ：在經烘箱乾燥之三頸RBF中將氫化鋰鋁(30 mL，1 mol/L於THF中)於THF (40 mL)中之溶液冷卻至-78℃。歷經2小時逐滴添加含 N-(2-胺基-5-溴-3-吡啶基)丁醯胺(2.50 g，9.69 mmol)之THF (40 mL)。歷經3小時將反應混合物升溫至室溫，接著在RT下攪拌隔夜。在冰浴中將反應混合物冷卻至0℃。依序逐滴添加水(3.0 mL)、2N NaOH水溶液(3.75 mL)及水(9.0mL)，隨後添加無水MgSO 4，且攪拌反應混合物5 min。溶液經由矽藻土墊過濾，且用Et 2O沖洗。濾液用Et 2O稀釋且用飽和NaCl水溶液洗滌。有機層經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，以得到粗製標題化合物(2.28 g)。MS (m/z): 244/246 (M+H)。
流程 4
製備 101-丁基-7-甲基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮之合成。 流程 4 ：將含3- N-丁基-5-甲基-吡啶-2,3-二胺(5.64 g，16.0 mmol)之過量乙二酸二乙酯(30 mL，220.9 mmol)相等地分流於兩個微波小瓶之間，且在120℃下加熱，同時攪拌並在氮氣流下排至大氣1.75小時。將反應混合物冷卻至RT。固體經由真空過濾收集，且濾餅用MTBE (2 × 5 mL)沖洗。將固體風乾30 min，接著在50℃下在高真空下乾燥，以得到固體(2.198 g)。濾液經濃縮且藉由矽石上之急驟層析純化，用己烷/EtOAc溶離。純淨層析溶離份經合併且在減壓下濃縮，以得到額外固體。固體經合併，以得到標題化合物(2.677 g)。MS (m/z): 234 (M+H)。
以基本上類似於製備10之方法的方式使用莫耳過量之乙二酸二乙酯由6-甲氧基-2- N-[(4-甲氧基苯基)甲基]吡啶-2,3-二胺(針對製備編號11)；5-溴-3- N-丁基-吡啶-2,3-二胺(針對製備編號12)；5-溴-3- N-丁基-6-甲基-吡啶-2,3-二胺(針對製備編號13)；6-甲基吡啶-2,3-二胺(針對製備編號14)；5-甲基-3- N-丙基-吡啶-2,3-二胺(針對製備編號15)； 外消旋-3- N-[2-甲氧基丁基]吡啶-2,3-二胺(針對製備編號16)來製備表2中所展示的以下化合物。 表2.
製備編號 化學名稱 結構 MS ( m/z) 備註
11 6-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)甲基]-1 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮 314 (M+H)
12 7-溴-1-丁基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮 298/300 (M+H)
13 7-溴-1-丁基-6-甲基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮 312/314 (M+H)
14 6-甲基-1,4-二氫吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮 178 (M+H)
15 1-丙基-7-甲基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮 220 (M+H) 使用含鈉(2當量)之EtOH
16 外消旋-1-[2-甲氧基丁基]-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮 250 (M+H) 使用含甲醇鈉(25%，2當量)之EtOH
製備 171-(環丙基甲基)-6-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)甲基]吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮之合成。 在DMF (56 mL)中合併6-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)甲基]-1 H-吡啶并[2,3-b]吡-2,3-二酮(2.242 g，7.156 mmol)、碳酸銫(6.99 g，21.5 mmol)、碘化鉀(123 mg，0.718 mmol)及溴甲基環丙烷(1.80 mL，17.8 mmol)。在氮氣下在80℃下攪拌混合物隔夜。將反應物冷卻至RT且與先前批次(156 mg規模反應物)合併。反應物用水稀釋且用EtOAc萃取。有機相經合併，用飽和NaCl水溶液洗滌，經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由矽石上之急驟層析來純化，用30-80% EtOAc/己烷溶離。純淨層析溶離份經合併且在減壓下濃縮，在高真空下乾燥，以得到粉紅固體粗製標題化合物(1.97 g)。MS (m/z): 368 (M+H)。
製備 181-(環丙基甲基)-6-甲氧基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮之合成。 在氮氣下密封之微波小瓶中將1-(環丙基甲基)-6-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)甲基]吡啶并[2,3-b]吡-2,3-二酮(1.80 g，4.90 mmol)溶解於TFA (10 mL)中。在120℃下攪拌反應物1小時。反應物在減壓下濃縮，且自DCM濃縮一次。所得綠色發泡體在高真空下乾燥，以得到粗製標題化合物(50質量%) (2.4 g，99%)。MS (m/z): 248 (M+H)。
流程 5
製備 191-丁基-3-氯-7-甲基-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮之合成。 流程 5 ：在回流下加熱1-丁基-7-甲基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮(2.198 g，8.951 mmol)及DMF (0.05 mL，0.6 mmol)於過量亞硫醯二氯(15 mL，205.9 mmol)中之經攪拌溶液。在16小時之後，將反應混合物冷卻至RT，用DCM稀釋且在減壓下濃縮。將粗製材料懸浮於甲苯中，經音波處理，且在減壓下濃縮。將粗製材料懸浮於10 mL冷DCM中，且藉由真空過濾收集。將材料風乾1.5小時，以得到固體(1.655 g)。濾液在減壓下濃縮，懸浮於DCM中，且置放於冰浴中隔夜。所得懸浮液經由精細玻璃料漏斗過濾，且風乾1小時，以得到固體(267 mg)。材料經合併，以得到標題化合物(1.922 g)。MS (m/z): 252 (M+H)。
以基本上類似於製備19之方法的方式使用莫耳過量之亞硫醯二氯由1-(環丙基甲基)-6-甲氧基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮(針對製備20)；7-溴-1-丁基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮(針對製備編號21)；1-丙基-7-甲基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮(針對製備編號22)；及7-溴-1-丁基-6-甲基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮(針對製備編號23)來製備表3中所展示的以下化合物。 表3.
製備編號 化學名稱 結構 MS ( m/z)
20 3-氯-1-(環丙基甲基)-6-甲氧基-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮 266/268 (M+H)
21 7-溴-1-丁基-3-氯-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮 316/318 (M+H)
22 3-氯-7-甲基-1-丙基-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮 238 (M+H)
23 7-溴-1-丁基-3-氯-6-甲基-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮 332 (M+H)
流程 6
製備 241-丁基-3-肼基-7-甲基-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮之合成。 流程 6 ：將1-丁基-7-甲基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮(0.268 g，1.15 mmol)於EtOH (7.0 mL)中之懸浮液脫氣。添加肼(0.60 mL，19 mmol)，且在110℃下加熱反應物隔夜。反應物經濃縮且藉由矽石上之急驟層析純化，用DCM/MeOH溶離。純淨層析溶離份經合併且在減壓下濃縮，以得到作為標題化合物之暗黃色固體狀(0.226 g，80%)。MS (m/z): 248.0 (M+H)。
以基本上類似於製備24之方法的方式使用莫耳過量之肼由 外消旋-1-[2-甲氧基丁基]-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮(針對製備編號25)及6-甲基-1,4-二氫吡啶并[2,3- b]吡-2,3-二酮(針對製備編號26)製備表4中所展示的以下化合物。 表4.
製備編號 化學名稱 結構 MS ( m/z)
25 外消旋-3-肼基-1-[2-甲氧基丁基]吡啶并[2,3- b]吡-2-酮 264 (M+H)
26 3-肼基-6-甲基-1 H-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮 192 (M+H)
流程 7
製備 27A 1-環丙基環丙烷碳醯肼鹽酸鹽之合成。 向1-環丙基環丙烷羧酸(9.63 g，76.3 mmol)及HATU (32.3 g，83.2 mmol)於DMF (300 mL)中之攪拌溶液中添加肼基甲酸第三丁酯(5.00 g，37.8 mmol)，隨後添加DIPEA (14.5 mL，83.1 mmol)，且在室溫下攪拌反應物5天。反應混合物用乙酸乙酯稀釋，用1.0 N鹽酸、飽和NaHCO 3及水洗滌。有機相接著經硫酸鎂乾燥、過濾且在減壓下濃縮。將1,4-二噁烷(50 mL)添加至殘餘物，歷經20 min添加含鹽酸(4 mol/L)之1,4-二噁烷(100 mL，400 mmol)，且在室溫下攪拌反應物1 h。溶液經過濾，濾餅用MTBE洗滌且在減壓下乾燥，以得到標題化合物(8.01 g，58.7%)。MS (m/z):141 (M+H)
製備 27B 1-甲基環丙烷碳醯肼鹽酸鹽之合成。 向1-甲基環丙烷羧酸(5.25 g，52.4 mmol)、DIPEA (7.3 mL，42 mmol)及HATU (16.1 g，41.5 mmol)於二氯甲烷(200 mL)中之攪拌溶液中添加肼基甲酸第三丁酯(5.00 g，37.8 mmol)，且在RT下攪拌反應物隔夜。反應混合物用1.0 N鹽酸、飽和NaHCO 3及水洗滌。有機相接著經硫酸鈉乾燥、過濾且在減壓下濃縮。將殘餘物冷卻至0℃且溶解於含鹽酸(4 mol/L)之1,4-二噁烷(75 mL，300 mmol)中。在5 min之後，反應混合物變成白色漿料，且在室溫下攪拌1 h。再添加含鹽酸(4 mol/L)之1,4-二噁烷(75 mL，300 mmol)，且攪拌反應物隔夜。反應物用MTBE稀釋，經過濾，濾餅用MTBE洗滌且經風乾，以得到粗製標題化合物(6.42 g)。1H NMR (DMSO-d6) δ 10.64 (s, 1H), 10.23 (br s, 2 H), 1.26 (s, 3H), 1.05-1.02 (m, 2H), 0.69-0.66 (m, 2H)。
製備 27C N '-(1-丁基-7-甲基-2-側氧基-吡啶并[2,3- b]吡-3-基)-1-環丙基-環丙烷碳醯肼之合成。 流程 7 ：向具有4Å分子篩之經烘乾RBF添加1-丁基-3-氯-7-甲基-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮(1.50 g，6.0 mmol)及1-環丙基環丙烷碳醯肼鹽酸鹽(1.05 g，5.94 mmol)。容器經密封，接著抽空，且用氮氣(3×)回填。添加THF (40 mL)，且在50℃下攪拌混合物。在1小時之後，反應混合物經音波處理且在55℃下攪拌2小時。將反應混合物冷卻至RT，且所得固體經由真空過濾收集，風乾5 min，接著在高真空下乾燥1小時，以得到標題化合物(1.86 g)。MS (m/z): 356 (M+H)。
以基本上類似於製備27C之方法的方式分別由7-溴-1-丁基-3-氯-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮(針對製備編號28)；3-氯-7-甲基-1-丙基-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮(針對製備編號29)；7-溴-1-丁基-3-氯-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮及1-甲基環丙烷碳醯肼鹽酸鹽(針對製備編號30)來製備表5中所展示的以下化合物。 表5.
製備編號 化學名稱 結構 MS ( m/z)
28 N'-[(7-溴-1-丁基-2-側氧基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-3-亞基)胺基]-1-環丙基-環丙烷碳醯肼 420/422 (M+H)
29 N'-(1-丙基-7-甲基-2-側氧基-吡啶并[2,3-b]吡-3-基)-1-(環丙基)環丙烷碳醯肼 342 (M+H)
30 N'-(7-溴-1-丁基-2-側氧基-吡啶并[2,3- b]吡-3-基)-1-甲基-環丙烷碳醯肼 394/396 (M+H)
流程 8
製備 31 N '-(1-丁基-7-甲基-2-側氧基-吡啶并[2,3- b]吡-3-基)-1-(三氟甲基)環丙烷碳醯肼之合成。 流程 8 ：將TEA (0.44 mL，3.2 mmol)添加至1-丁基-3-肼基-7-甲基-吡啶并[2,3-b]吡-2-酮(0.224 g，0.906 mmol)、1-(三氟甲基)環丙烷羧酸(0.157 g，1.01 mmol)、HOBT (0.192 g，1.39 mmol)及EDCI鹽酸鹽(0.258 g，1.35 mmol)於THF (9.1 mL)中之混合物中，且在RT下攪拌隔夜。在經由矽藻土墊過濾之前，溶液藉由用DCM及水稀釋來獲得。墊用DCM洗滌且丟棄。濾液經濃縮且藉由矽石上之急驟層析純化，用DCM/MeOH溶離。純淨層析溶離份經合併且在減壓下濃縮，以得到呈白色固體狀之標題化合物(0.288 g)。MS (m/z): 348.0 (M+H)。
以基本上類似於製備31之方法的方式使用1-環丙基環丙烷羧酸由 外消旋-3-肼基-1-[2-甲氧基丁基]吡啶并[2,3- b]吡-2-酮(針對製備編號32)及3-肼基-6-甲基-1 H -吡啶并[2,3- b]吡-2-酮(針對製備編號33)來製備表6中所展示的以下化合物。 表6.
製備編號 化學名稱 結構 MS ( m/z)
32 外消旋-1-環丙基- N'-[1-[2-甲氧基丁基]-2-側氧基-吡啶并[2,3- b]吡-3-基]環丙烷碳醯肼 372 (M+H)
33 1-環丙基- N'-(6-甲基-2-側氧基-1 H-吡啶并[2,3- b]吡-3-基)環丙烷碳醯肼 300 (M+H)
流程 9
製備 34 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-(環丙基甲基)-2-甲氧基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮之合成。 流程 9 ：將3-氯-1-(環丙基甲基)-6-甲氧基-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮(1.025 g，2.315 mmol)及1-環丙基環丙烷碳醯肼鹽酸鹽(520 mg，2.5023 mmol)溶解於THF (15 mL)中。溶液在氮氣下密封於微波小瓶中，且在60℃下攪拌隔夜。將反應物冷卻至RT且與先前批次(1 g規模反應物)合併。材料用EtOAc稀釋且用飽和NaHCO 3水溶液、隨後飽和NaCl水溶液洗滌。有機層經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由矽石上之急驟層析純化，用50-100% EtOAc/己烷溶離。純淨層析溶離份經合併且在減壓下濃縮。橙色固體在高真空下乾燥，以得到粗製標題化合物(1.068 g)。MS (m/z): 352 (M+H)。
以基本上類似於製備34之方法的方式由7-溴-1-丁基-3-氯-6-甲基-吡啶并[2,3- b]吡-2-酮來製備表7中所展示之以下化合物。 表7.
製備編號 化合物名稱 結構 MS ( m/z)
35 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-3-溴-5-丁基-2-甲基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 416/418 (M+H)
流程 10
實例 1 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-丁基-3-甲基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮之合成。 流程 10：向具有4Å分子篩之經烘乾微波小瓶中添加 N'-(1-丁基-7-甲基-2-側氧基-吡啶并[2,3- b]吡-3-基)-1-環丙基-環丙烷碳醯肼(1.83 g，5.15 mmol)。小瓶經密封，接著抽空，且用氮氣(3×)回填。添加HMDS (17 mL，81.2 mmol)、隨後DBU (0.16 mL，1.1 mmol)，以得到懸浮液，在125℃下在攪拌下加熱該懸浮液。在4小時之後，將反應溶液轉移至具有甲醇之RBF且在50℃下加熱1小時。在減壓下濃縮粗製混合物，且使所得殘餘物分配於DCM與水之間。分離各層，且水層用DCM及3:1 CHCl 3/IPA萃取。有機相經合併，用飽和NaCl水溶液洗滌，經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。將殘餘物溶解於EtOH (17 mL)中，且歷經30 mi經由加料漏斗添加水(100 mL)，接著在冰浴中冷卻15 min。固體藉由真空過濾分離，用水洗滌，風乾15 min，且在50℃下於真空下乾燥隔夜，以得到標題化合物(1.14 g)。MS (m/z): 338 (M+H)。
以基本上類似於實例1之方法的方式由 N '-(1-丁基-7-甲基-2-側氧基-吡啶并[2,3- b]吡-3-基)-1-(三氟甲基)環丙烷碳醯肼(針對實例2)； N'-(7-溴-1-丁基-2-側氧基-吡啶并[2,3- b]吡-3-基)-1-甲基-環丙烷碳醯肼(針對製備編號36)； N'-(1-丙基-7-甲基-2-側氧基-吡啶并[2,3- b]吡-3-基)-1-(環丙基)環丙烷碳醯肼(針對實例3)； N '-[(7-溴-1-丁基-2-側氧基-4 H-吡啶并[2,3- b]吡-3-亞基)胺基]-1-環丙基-環丙烷碳醯肼(針對製備編號37)；1-環丙基- N '-(6-甲基-2-側氧基-1H-吡啶并[2,3- b]吡-3-基)環丙烷碳醯肼(針對製備編號38)； 外消旋-1-環丙基- N '-[1-[2-甲氧基丁基]-2-側氧基-吡啶并[2,3- b]吡-3-基]環丙烷碳醯肼(針對實例4)來製備表8中所展示的以下化合物(製備及實例)。 表8.
製備/實例編號 化合物名稱 結構 MS ( m/z)
實例2 5-丁基-3-甲基-9-(1-(三氟甲基)環丙基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 366 (M+H)
製備36 3-溴-5-丁基-9-(1-甲基環丙基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 376/378 (M+H)
實例3 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-3-甲基-5-丙基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 324 (M+H)
製備37 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-3-溴-5-丁基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 402/404 (M+H)
製備38 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-2-甲基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 282 (M+H)
實例4 外消旋-9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-(2-甲氧基丁基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 354 (M+H)
實例 4a 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-(2-甲氧基丁基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(異構體1)之合成。 異構體1 外消旋-9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-(2-甲氧基丁基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(0.148，0.42 mmol)經溶解以供使用MeOH (2.0 mL)、DCM (1.0 mL)進行對掌性分離，接著用DCM (2.0 mL)及MeOH (1.0 mL)沖洗。6 mL進料溶液經過濾且以1.0 mL增量注射，總共注射6次。蒸餾塔為( S,S) Whelk-01 10um，具有80毫升/分鐘之流速、40% MeOH/60% CO 2移動相，以得到作為標題化合物之異構體1 (57 mg，第一溶離異構體)。(S,S) Whelk-01 10 um, 40% MeOH/CO 2, 5 mL/min, 225 nm: TR = 2.22 min, ＞99%ee。MS (m/z): 354.2 (M+H); [α] D 20-8.1° (c 0.20，甲醇)。
實例 4b 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-(2-甲氧基丁基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(異構體2)之合成。 異構體2 實例6之化合物藉由實例5之方法基本上分離，以得到作為標題化合物之異構體2 (61 mg；第二溶離異構體)。 ( S,S) Whelk-01 10 um, 40% MeOH/CO 2, 5 mL/min, 225 nm: TR = 3.08 min, ＞99%ee。MS (m/z): 354.2 (M+H); [α] D 20+7.1° (c 0.20，甲醇)。
實例 59-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-(環丙基甲基)-2-羥基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮之合成。 將9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-(環丙基甲基)-2-甲氧基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(460 mg，1.309 mmol)、乙硫醇鈉(487 mg，5.210 mmol)及1-甲基-2-吡咯烷酮(5 mL，51.90 mmol)合併且在氮氣下密封於微波小瓶中。在200℃下於微波中輻照反應物12小時。將反應混合物與來自先前批次(30 mg規模反應物)之反應混合物合併，且用水稀釋。將水層用1N HCl水溶液酸化至pH ~ 3，且用EtOAc萃取。有機相經合併，用飽和NaCl水溶液洗滌，經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由C18上之反相急驟層析純化，用10-100% ACN/水(10 mM (NH 4)HCO 3w/5% MeOH)溶離。純淨層析溶離份經合併且在減壓下濃縮為水溶液，用DCM萃取，用飽和NaCl水溶液洗滌，經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。灰白色固體在真空下乾燥，以得到標題化合物(84 mg)。MS (m/z): 338 (M+H)。
實例 65-丁基-3-甲基-9-(1-甲基環丙基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮之合成。 在微波小瓶中將[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(II) (9 mg，0.012 mmol)添加至3-溴-5-丁基-9-(1-甲基環丙基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(90 mg，0.2392 mmol)於THF (0.6 mL，7 mmol)中之溶液中在攪拌10 min之後，添加甲基氯化鋅(350 μL，0.7 mmol，2 mol/L於THF中)，且將容器抽空並用氮氣吹掃。在80℃下攪拌反應混合物2小時，冷卻至RT，且與用飽和NH 4Cl水溶液稀釋之額外批次(37 mg規模反應物)合併。水層用EtOAc萃取，有機相經合併，用飽和NaCl水溶液洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由矽石上之急驟層析純化、用0-100% EtOAc/己烷溶離，以得到標題化合物(75 mg)。MS (m/z): 312 (M+H)。
以基本上類似於實例7之方法的方式由9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-3-溴-5-丁基-2-甲基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮來製備表9中所展示之以下化合物。 表9.
實例編號 化合物名稱 結構 MS ( m/z)
7 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-丁基-2,3-二甲基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 352 (M+H)
實例 85-丁基-3-乙基-9-(1-甲基環丙基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮之合成。 在微波小瓶中合併3-溴-5-丁基-9-(1-甲基環丙基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(89 mg，0.2366 mmol)、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵-二氯化鈀(II)二氯甲烷複合物(11 mg，0.0132 mmol)及1,4-二噁烷(1.0 mL)。在氮氣下密封瓶，且添加二乙基鋅(0.50 mL，0.50 mmol，1 mol/L/己烷)並在RT下攪拌隔夜。反應混合物用飽和NaCl水溶液淬滅且與額外批次(23 mg規模反應物)合併。混合物用EtOAc及水稀釋，分離各層，且水層用EtOAc、隨後3:1 CHCl 3/IPA萃取。有機相經合併，用飽和NaCl水溶液洗滌，經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由矽石上之急驟層析純化，用0-7% MeOH/DCM溶離，以得到藉由C18上之反相急驟層析進一步純化之粗製材料，溶離於10-100% ACN/水(10 mM (NH 4)HCO 3w/5% MeOH)中，以得到標題化合物(60 mg，60%)。MS (m/z): 326 (M+H)。
以基本上類似於實例9之方法的方式由9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-3-溴-5-丁基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮來製備表10中所展示之以下化合物。 表10.
實例編號 化合物名稱 結構 MS ( m/z)
9 9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-丁基-3-乙基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 324 (M+H)
實例 109-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-丁基-3-異丙基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮之合成。 將Pd-PEPPSI-IHeptCl (3 mg，0.003071 mmol)及9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-3-溴-5-丁基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(100 mg，0.2486 mmol)添加至RBF，用氮氣吹掃且回填。添加甲苯(2.5 mL)，且將溶液冷卻至0℃。添加2-丙基溴化鋅(600 μL，0.3 mmol，0.5 mol/L於THF中)，且使反應物達至RT。再添加Pd-PEPPSI-IHeptCl (3 mg，0.003071 mmol，100質量%)，將容器抽空，用氮氣吹掃，且在RT下攪拌隔夜。反應物用飽和NH 4Cl水溶液淬滅且用DCM稀釋。分離各相且用DCM萃取水溶液。有機相經合併，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由矽石上之急驟層析純化，溶離於0-100% EtOAc/己烷中，以得到標題化合物(30 mg，33%)。MS (m/z): 366 (M+H)。
流程 11
實例 119-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-丁基-3-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮之合成。 流程 11 ， 步驟 A ：在微波小瓶中合併9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-3-溴-5-丁基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(597 mg，1.484 mmol)、三氟(2-三甲基矽烷基乙氧基甲基)硼酸鉀(430 mg，1.8054 mmol)、甲磺酸根基(2-二環己基膦-2',6'-二-異丙氧基-1,1'-聯苯基)(2'-胺基-1,1'-聯二苯-2-基)鈀(II)(133 mg，0.154249 mmol)、2-二環己基膦基-2'6'-二異丙氧基-1,1'-聯二苯(74 mg，0.150651 mmol)及碳酸銫(1.48 g，4.54 mmol)。小瓶在氮氣下密封，添加1,4-二噁烷(5.0 mL)及水(0.50 mL)之溶液，且在100℃下攪拌反應混合物隔夜。再添加2-二環己基膦基-2'6'-二異丙氧基-1,1'-聯二苯(32 mg)及甲磺酸根基(2-二環己基膦-2',6'-二-異丙氧基-1,1'-聯苯基)(2'-胺基-1,1'-聯二苯-2-基)鈀(II) (65 mg)，且在105℃下攪拌反應物2天。反應混合物與額外批次(100 mg規模反應物)合併，且混合物用EtOAc稀釋並用水、隨後飽和NaCl水溶液洗滌。有機層經無水Na 2SO 4乾燥，傾析且在減壓下濃縮。殘餘物藉由矽石上之急驟層析純化，用40-65% EtOAc/己烷溶離，以得到9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-丁基-3-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(370 mg)。MS (m/z): 454。
流程 11 ， 步驟 B ：在微波小瓶中合併9-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-丁基-3-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮(370 mg，0.5710 mmol)及DCM (3 mL)。小瓶在氮氣下密封且在冰浴中冷卻至0℃。逐滴添加三氟化硼合二乙醚(0.36 mL，2.8 mmol)，且將反應混合物升溫至RT隔夜。反應物用飽和NaHCO 3水溶液淬滅且用DCM稀釋。有機相用飽和NaCl水溶液洗滌，經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由矽石上之急驟層析純化，用50-100% EtOAc/己烷溶離，以得到殘餘物。殘餘物藉由C18上之反相急驟層析純化，溶離於10-100% ACN/水中，以得到標題化合物(49 mg)。MS (m/z): 354 (M+H)。
以基本上類似於實例12之方法的方式由3-溴-5-丁基-9-(1-甲基環丙基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6( 5H)-酮來製備表11中所展示之以下化合物。 表11.
實例編號 化學名稱 結構 MS ( m/z)
12 5-丁基-3-(羥基甲基)-9-(1-甲基環丙基)吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮 328 (M+H)
實例 139-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-5-丁基-2-甲基吡啶并[3,2- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-6(5 H)-酮之合成。 將雙(三甲基矽烷基)胺基鋰(2.1 mL，2.1 mmol，1 mol/L於MTBE中)添加含1-([1,1'-雙(環丙)]-1-基)-7-甲基吡啶并[2,3- e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡-4(5 H)-酮(199 mg，0.7074 mmol)之DMF (7 mL)，且在RT下攪拌反應物1小時。添加1-溴丁烷(380 μL，3.539 mmol)及碘化鉀(12 mg，0.07229 mmol)，且在50℃下攪拌反應物3天。將反應物冷卻至RT且與兩個額外批次(各自50 mg規模)合併。溶液用3:1 CHCl 3/IPA萃取，有機層經無水MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。將殘餘物溶解於EtOH中且添加至水，且所得沈澱物藉由過濾收集。所收集固體藉由C18上之反相急驟層析純化，溶離於15-100% ACN/水中，以得到標題化合物(145 mg)。MS (m/z): 338 (M+H)。
PDE 蛋白質之產生編碼全長人類PDE1A (NP_001003683.1)及PDE1C (NP_005011.1)之核苷酸序列藉由N端HIS標記插入至pFastBac1 (Invitrogen)載體中。編碼全長人類PDE4D (NP_006194.2)及PDE3A (NP_000912.3)之催化區(殘餘物641-1141)的核苷酸序列藉由C端HIS標記插入至pFastBac1 (Invitrogen)載體中。編碼全長人類PDE6A (NP_000431.2)及PDE6B (AAH00249.1)之核苷酸序列藉由N端HIS標記及N端Flag標記分別插入至pFastBacDual (Invitrogen)載體中，以用於製造PDE6A/6B二聚體。Sf9細胞中之桿狀病毒產生及蛋白質表現根據Bac-to-Bac桿狀病毒表現系統(Invitrogen)進行。編碼全長人類PDE1B (NP_000915.1)之核苷酸序列藉由C端HIS標記插入至pIEX4 (Novagen)中，且Sf9細胞中之兩種蛋白質產生根據供應商方案(Novagen)實施。經His標記之PDE蛋白質使用Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)純化，接著在儲存緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，10%丙三醇)中之SUPERDEX ®200管柱(GE Healthcare)上進行尺寸排外層析。包括PDE6A/6B之經Flag標記之PDE蛋白質使用抗Flag M2-瓊脂糖(Sigma)純化，之後經由NiNTA管柱層析純化且在儲存緩衝液(50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，10%丙三醇，0.1 mg/mL Flag肽)中溶離。將所有經純化蛋白質以較小等分試樣儲存於80℃下。
磷酸二酯酶分析所有3',5'環核苷酸磷酸二酯酶(PDE)酶活性藉由基於SPA偵測系統(閃爍近接分析(scintillation proximity assay))之輻射量測酶分析來量測。使用十點濃度反應曲線將待測試之化合物稀釋於純二甲亞碸(DMSO)中。反應混合物中之最大化合物濃度為10或100 µM。將適當濃度之化合物與PDE酶中之任一者一起預培育30分鐘，之後藉由添加受質開始反應。在室溫下使反應進行60分鐘。隨後，藉由添加SPA珠粒停止反應。在12小時後在MICROBETA TMTRILUX ®計數器中讀取樣品。「IC 50」係指化合物可能產生50%最大抑制反應時的化合物濃度；IC 50值藉由繪製標準化資料與對數[化合物]且使用四個參數邏輯斯蒂方程式擬合資料來計算。
Ca 2 + - 鈣調蛋白依賴型 PDE 酶分析遵循標準蛋白質產生程序選殖且純化PDE1B、PDE1A及PDE1C。製備分析緩衝液，以在分析中得到最終濃度50 mM Tris-HCl、50 mM MgCl 2、4 mM CaCl 2、含0.1%牛血清白蛋白及6 U/ml鈣調蛋白之水，pH 7.5。PDE1A、PDE1B及PDE1C之最終酶濃度分別為0.25、0.074及0.0012 nM。藉由添加受質([ 3H]cAMP)開始反應，以得到47 nM之最終濃度。 表 12 ：針對 人類 PDE1A 、 PDE1B 及 PDE1C 之 實例 1 至 13 的活體外效能
實例 PDE 1A IC 50(nM) PDE 1B IC 50(nM) PDE 1C IC 50(nM)
1 0.366±0.765 (n=4) 0.406±1.08 (n=3) ＜0.508 (n=3)
2 8.62±2.53 (n=2) 12.1±1.06 (n=2) 1.62±0.231 (n=2)
3 2.59±1.69 (n=2) 3.41±1.52 (n=2) 2.77±0.636 (n=2)
4 13.9±2.06 (n=2) 33.5±6.26 (n=2) 0.609±0.128 (n=2)
4a 26.8 40.1 1.49
4b 15.1±2.84 (n=2) 25.8±0.614 (n=2) 1.46±0.642 (n=2)
5 2.75±2.11 (n=3) 2.41±0.846 (n=3) 0.931±0.132 (n=3)
6 11.6±7.55 (n=2) 15.4±0.0529 (n=2) 2.57±0.544 (n=2)
7 0.343±0.765 (n=2) 0.400±0.867 (n=2) ＜0.5 (n=2)
8 8.01±3.55 (n=2) 9.34±4.33 (n=2) 2.14±0.997 (n=2)
9 0.214±0.291 (n=2) 0.419±0.713 (n=2) ＜0.5 (n=2)
10 0.260±0.589 (n=2) 0.396±0.749 (n=2) ＜0.5 (n=2)
11 0.996±1.79 (n=2) 0.928±1.56 (n=2) ＜0.5 (n=2)
12 23.0±3.62 (n=2) 17.4±10.0 (n=2) 4.02±0.167 (n=2)
13 0.816±0.198 (n=3) 1.13±0.254 (n=3) ＜0.5 (n=3)
表12中之資料表明實例1-13之化合物活體外抑制人類PDE1A、PDE1B及PDE1C酶活性。
使用 [ 3 H ] cAMP 作為受質 之 PDE 酶分析使用[ 3H]cAMP作為反應受質量測以下磷酸二酯酶活性：人類PDE3A (催化域)及人類PDE4D。遵循標準程序選殖及純化兩種酶。製備分析緩衝液，以在分析中得到最終濃度50 mM Tris-HCl、8.3 mM MgCl 2、1.7 mM乙二胺四乙酸(EDTA)及0.1%牛血清白蛋白，pH 7.5。PDE3A及PDE4D之最終酶濃度分別為0.008及0.021 nM。藉由添加受質([ 3H]cAMP)開始反應，以得到47 nM之最終濃度。 表 13 ：針對 人類 PDE3A ( 催化域 ) 及 PDE4D 之 實例 1 - 13 的 活體外效能
實例 PDE 3A IC 50(µM) PDE 4D IC 50(µM)
1 ＞50 (n=3) 1.59±0.217 (n=2)
2 ＞100 26
3 ＞100 2.12
4 ＞100 33.6
4a ＞100 ＞100
4b ＞100 ＞100
5 22.9±1.14 (n=2) 14.7±8.24 (n=3)
6 ＞100 6.01
7 71.2 3.02
8 ＞100 0.957
9 ＞100 0.675
10 ＞100 0.972
11 ＞100 5.56
12 ＞93.4 (n=3) 5.13±2.14 (n=3)
13 19.2 2.09
使用 [ 3 H ] cGMP 作為 受質之 PDE 酶分析使用[ 3H]cGMP作為反應受質來測量以下磷酸二酯酶活性：人類PDE6A/6B。人類PDE6之催化活性形式為由α (人類PDE6A)及β子單元(人類PDE6B)構成的二聚體。人類PDE6A/6B之二聚體藉由共表現及純化策略，使用兩個純化步驟(亦即，NiNTA層析及抗FLAG瓊脂糖層析)來製備。製備檢定緩衝液，以在分析中得到最終濃度50 mM Tris-HCl、8.3 mM MgCl 2、1.7 mM EDTA及0.1%牛血清白蛋白，pH 7.5。最終酶濃度為5 nM。藉由添加受質([ 3H]cGMP)開始反應，以得到80 nM之最終濃度。 表 14 ：針對 PDE6AB 之 實例 1 - 13 的活體外效能
實例 PDE 6AB IC 50(µM)
1 ＞3.45 (n=2)
2 ＞10.0
3 ＞10.0
4 ＞10.0
4a ＞10.0
4b ＞10.0
5 ＞10.0 (n=3)
6 9.59
7 1.2
8 3.29
9 0.982
10 0.611
11 3.85
12 3.06±1.45 (n=2)
13 2.99
表12、13及14中之資料表明實例1-13之化合物為相對於人類PDE3A、PDE4D及PDE6AB的人類PDE1A、PDE1B及PDE1C之活體外選擇性抑制劑。

Claims (14)

  1. 一種下式化合物：
    Figure TWI670271B_C0001
    或其醫藥學上可接受之鹽，其中X為H或視情況經羥基取代之C1-C3烷基；Y為H、羥基或甲基；R為乙基、正丙基、環丙基或
    Figure TWI670271B_C0002
    ；且A為甲基、環丙基或三氟甲基；其限制條件為在X及Y均為H且R為正丙基時，則A不為甲基。
  2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中X為甲基。
  3. 如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y為H。
  4. 如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R為正丙基。
  5. 如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中A為環丙基。
  6. 如請求項1或請求項2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物呈游離鹼形式。
  7. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物具有下式：
    Figure TWI670271B_C0003
  8. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係具有下式之化合物：
    Figure TWI670271B_C0004
  9. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物具有下式：
    Figure TWI670271B_C0005
  10. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係具有下式之化合物：
    Figure TWI670271B_C0006
  11. 一種如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療慢性腎病之藥物。
  12. 一種如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療糖尿病性腎病之藥物。
  13. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  14. 一種製備醫藥組合物之方法，其包含將如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑摻合。
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