CN110914268B - [1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供用作人PDE1抑制剂的式(I)的化合物或其可药用盐：

其中X是H或任选被羟基取代的C1‑C3烷基；Y是H、羟基或甲基；R是乙基、正丙基、环丙基或式(II)

Description

[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮衍生物

本发明涉及某些人PDE1抑制剂，涉及包含所述化合物的药物组合物，涉及使用所述化合物治疗生理病症的方法，并涉及可用于合成所述化合物的中间体和方法。

磷酸二酯酶（PDE）是通过控制cAMP和cGMP的水解速率来调节这些环核苷酸的细胞水平的酶。PDE1是钙和钙调蛋白依赖性PDE，是至少11种已知PDE家族之一。PDE1在许多组织中表达，包括大脑、心脏、肺、肾和平滑肌。此外，PDE1由三种已知同种型PDE1A、PDE1B和PDE1C的家族构成。

糖尿病患者经常发展出一种形式的慢性肾病，被称为糖尿病肾病（或糖尿病性肾病）。已经估计，糖尿病肾病可能影响多达40%的糖尿病患者。糖尿病肾病的治疗选择有限并包括使用降低血压的药物、管理血糖水平、膳食和重量和定期进行体育活动。因此，慢性肾病，特别是糖尿病肾病的患者需要另外的治疗选择。

美国专利No.8,299,080公开了可用于治疗各种病症如排尿困难和高血压的具有PDE9抑制活性的某些喹喔啉衍生物。此外，欧洲专利No. 0 040 401公开了具有抗高血压活性的某些取代的三唑并喹喔啉-4-酮。

本发明提供作为人PDE1的抑制剂的某些新型化合物。此外，本发明提供相对于其它人PDE如PDE3A、PDE4D和PDE6AB作为人PDE1A、PDE1B和PDE1C的选择性抑制剂的某些新型化合物。本发明还提供可具有抗高血压作用并且也可改进肾血流量的某些新型化合物。此外，本发明的某些化合物可减轻肾纤维化。

相应地，本发明提供式I的化合物或其可药用盐：

其中X是H或任选被羟基取代的C1-C3烷基；

Y是H、羟基或甲基；

R是乙基、正丙基、环丙基或

A是甲基、环丙基或三氟甲基；

条件是当X和Y都是H且R是正丙基时，则A不是甲基。

本发明还提供一种治疗患者的慢性肾病的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物。

本发明还提供一种治疗患者的糖尿病肾病的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物。

本发明还提供一种治疗患者的高血压的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物。

此外，本发明提供用于治疗的式I的化合物。本发明还提供用于治疗慢性肾病的式I的化合物。本发明还提供用于治疗糖尿病肾病的式I的化合物。本发明还提供用于治疗高血压的式I的化合物。本发明还提供式I的化合物用于制备用于治疗慢性肾病的药物的用途。本发明还提供式I的化合物用于制备用于治疗糖尿病肾病的药物的用途。本发明还提供式I的化合物用于制备用于治疗高血压的药物的用途。

本发明进一步提供包含式I的化合物以及一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明进一步提供一种制备药物组合物的方法，其包括混合式I的化合物与一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。本发明还包括用于合成式I的化合物的新型中间体和方法。

本文所用的术语“治疗”包括抑制、遏制、减慢、停止或逆转已有症状或病症的进展或严重程度。

本文所用的术语“患者”是指哺乳动物，如犬或人类，人类是优选的。

本文所用的术语“有效量”是指在单剂或多剂给药于患者时在被诊断或治疗的患者中提供所需作用的本发明的化合物或其可药用盐的量或剂量。

本文所用的术语“C1-C3烷基”是指甲基、乙基、正丙基和异丙基。

本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果容易确定有效量。在确定对患者而言有效的量时，本领域技术人员考虑许多因素，包括但不限于：患者的体型、年龄和一般健康状况；涉及的特定疾病或病症；疾病或病症的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；给予的特定化合物；给药模式；给予的制剂的生物利用率特征；所选给药方案；伴随药物治疗的使用；和其它相关情况。

本发明的化合物在落在大约0.01至大约20 mg/kg体重范围内的每日剂量下有效。在一些情况下，在上述范围的下限以下的剂量水平可能绰绰有余，而在另一些情况下，仍可以在可接受的副作用下使用更大剂量，因此上述剂量范围无意以任何方式限制本发明的范围。

本发明的化合物配制成通过可使该化合物生物可利用的任何途径，包括口服和肠胃外途径给药的药物组合物。此类组合物最优选用于口服给药。此类药物组合物及其制备方法是本领域中公知的（参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy,L.V. Allen编辑，第22版，Pharmaceutical Press, 2012）。

式I的化合物特别可用于本发明的治疗方法，但某些基团、取代基和化合物是优选的。下列段落描述此类优选基团、取代基和化合物。要理解的是，这些优选既适用于本发明的治疗方法，又适用于本发明的新型化合物。

优选的是，Y是H。

优选的是，X是甲基。

优选的是，R是正丙基。

优选的是，A是环丙基。

优选的是，式I的化合物为游离碱形式。

进一步优选的是，当Y是H时，X是甲基。

进一步优选的是，当Y是H时，R是正丙基。

进一步优选的是，当Y是H时，A是环丙基。

进一步优选的是，当X是甲基时，R是正丙基。

进一步优选的是，当X是甲基时，A是环丙基。

尤其优选的是，当Y是H时，X是甲基且A是环丙基。

尤其优选的是，当Y是H时，X是甲基且R是正丙基。

尤其优选的是，Y是H，R是正丙基且A是环丙基。

下式的化合物：

及其可药用盐最优选，正上方的化合物的游离碱最尤其优选。

本发明的化合物的可药用盐可以例如通过使本发明化合物的适当的游离碱和适当的可药用酸在合适溶剂中在本领域中公知的标准条件下反应而形成。参见例如Gould,P.L., “Salt selection for basic drugs,”International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)；Bastin, R.J.等人, “Salt Selection andOptimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,”Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)；和Berge, S.M.等人,“Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)。

本领域普通技术人员可以在本发明化合物的合成中的任何方便的点通过如选择性结晶技术或手性色谱法之类的方法分离或拆分单独的异构体、对映体和非对映体（参见例如J. Jacques等人, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley andSons, Inc., 1981和E.L. Eliel和S.H. Wilen, “Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994）。名称“异构体1”和“异构体2”分别是指在指定条件下首先和其次由手性色谱法洗脱的化合物。

某些缩写如下定义：“ACN”是指乙腈；“AcOH”是指冰醋酸；“DBU”是指1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；“DCM”是指二氯甲烷（dichloromethane或methylene chloride）；“DIPEA”是指N,N-二异丙基乙基胺；“DMF”是指N,N-二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“EDCI”是指1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；“ES/MS”是指电喷雾质谱法；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“Et₂O”是指乙醚；“EtOH”是指乙醇；“HMDS”是指六甲基二硅氮烷；“HOBT”是指羟基苯并三唑；“IPA”是指异丙醇；“HATU”是指1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；“RBF”是指圆底烧瓶；“TR”是指保留时间；“hr”是指小时；“IC₅₀”是指产生试剂可能的最大抑制响应的50%的该试剂浓度；“μmol”是指微摩尔；“min”是指分钟；“MeOH”是指甲醇或甲基醇；“MTBE”是指甲基-叔丁基醚；“NiNTA”是指具有用次氮基三乙酸作为螯合剂官能化的琼脂糖固定相的色谱法；“POCl₃”是指三氯氧磷（phosphorus oxychloride）；“RT”是指室温；“SNAr”是指亲核芳族取代；“TEA”是指三乙胺；“THF”是指四氢呋喃；“Tris”是指2-氨基-2-羟基甲基-丙-1,3-二醇；“U/ml”是指每毫升单位数；“wt”是指重量；且“Pd-PEPPSI-IHeptCl”是指二氯[1,3-双(2,6-二-4-庚基苯基)咪唑-2-叉基](3-氯吡啶基)钯(II)。

本发明的化合物可通过本领域普通技术人员已知的各种程序制备，其中一些阐述在下列方案、制备和实施例中。本领域普通技术人员会认识到，所述各途径的具体合成步骤可以不同方式组合，或与来自不同方案的步骤联合，以制备本发明的化合物。以下各步骤的产物可通过本领域中公知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱法、过滤、研制和结晶。在下列方案中，除非另行指明，所有取代基如上定义。试剂和原材料是本领域普通技术人员易得的。提供下列方案、制备和实施例以进一步例示本发明而不限制本发明的范围。

制备1

3-N-丁基-5-甲基-吡啶-2,3-二胺的合成

向5-甲基吡啶-2,3-二胺（5.64 g, 44.0 mmol）在DCM（300 mL）中的搅拌悬浮液中加入丁醛（3.28 g, 46 mmol）和AcOH（0.26 mL, 4.5 mmol）。悬浮液在室温下搅拌50分钟，然后声处理1分钟。分5份加入三乙酰氧基硼氢化钠（29.1 g, 137 mmol）并将反应混合物在室温下搅拌45 min。反应混合物用水（300 mL）淬灭并分离各层。水层用饱和NaHCO₃水溶液稀释并用DCM萃取。合并的有机物用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液洗涤，然后经无水Na₂SO₄干燥并进一步经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩以得到粗物质形式的标题化合物5.64 g。合并NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液洗液，用饱和NaCl水溶液稀释并用3:1 CHCl₃/IPA (4×)和用MTBE萃取。合并有机物，用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩以提供另外780 mg物质。合并物质以得到粗制标题化合物（6.42 g）。MS (m/z):180 (M+H)。

以基本类似于制备1的方法的方式由5-甲基吡啶-2,3-二胺和丙醛（用于制备编号2）；和5-溴-6-甲基-吡啶-2,3-二胺和丁醛（用于制备编号3）制备如表1中所示的下列化合物。

表1.

制备编号	化学名称	结构	MS (<i>m/z</i>)
				2	5-甲基-3-<i>N</i>-丙基-吡啶-2,3-二胺		166 (M+H)
3	5-溴-3-<i>N</i>-丁基-6-甲基-吡啶-2,3-二胺		258/260 (M+H)

方案1

制备4

6-甲氧基-N-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-硝基-吡啶-2-胺的合成

方案1，步骤A:将2-氯-6-甲氧基-3-硝基-吡啶（4.99 g, 26.515 mmol）在ACN（90mL）中的溶液在氮气下搅拌并加热到65℃。加入4-甲氧基苄胺（7.25 mL, 55.5 mmol）并形成固体沉淀物。反应在65℃下搅拌1小时。将反应混合物冷却到室温，经硅藻土垫过滤，减压浓缩，然后在高真空下进一步干燥整夜以得到粗制黄色固体标题化合物（8.638 g）。MS (m/z): 290 (M+H)。

制备5

6-甲氧基-2-N-[(4-甲氧基苯基)甲基]吡啶-2,3-二胺的合成

方案1，步骤B:将6-甲氧基-N-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-硝基-吡啶-2-胺（5.00g, 14.0 mmol）、双(频哪醇合)二硼（11.2 g, 43.2 mmol）和叔丁醇钾（1.93 g, 16.8mmol）合并在IPA（55 mL）中。将反应混合物在氮气下密封并在110℃下搅拌整夜。将反应冷却至室温并用EtOAc稀释。有机层用水、接着饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用30-50% EtOAc/己烷洗脱。合并纯色谱级分并减压浓缩，在高真空下干燥整夜以得到粗制蓝色残留标题化合物（4.88 g）。MS(m/z): 260 (M+H)。

方案2

制备6

rac-N-(2-甲氧基丁基)-2-硝基吡啶-3-胺的合成

方案2，步骤A:将TEA（4.3 mL, 31 mmol）添加到3-氟-2-硝基吡啶（1.500 g,10.24 mmol）和(2-甲氧基丁基)胺盐酸盐（1.590 g, 10.82 mmol）的悬浮液中。反应在室温下搅拌2.5小时。加入EtOAc，物质用饱和NH₄Cl水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，然后经无水MgSO₄干燥并过滤。将滤液浓缩并通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用DCM/MTBE洗脱。合并纯色谱级分并减压浓缩以得到橙黄色液体作为标题化合物（2.223 g；外消旋物）。MS (m/z): 226.0 (M+H)。

制备7

rac-3-N-[2-甲氧基丁基]吡啶-2,3-二胺的合成

方案2，步骤B:在氮气下将MeOH（100 mL）添加到含5% Pd/C（0.452 g, 4.25 mmol）的Parr摇动器中，然后加入N-(2-甲氧基丁基)-2-硝基-吡啶-3-胺（2.22 g, 9.86 mmol）在MeOH（100 mL）中的溶液。密封Parr摇动器，用氮气吹扫，用氢气吹扫并用氢气加压（60psig），然后在室温下搅拌4小时。过滤物质并浓缩得到深色浓稠凝胶作为标题化合物（1.794 g；外消旋物）。MS (m/z): 196.0 (M+H)。

方案3

制备8

N-(2-氨基-5-溴-3-吡啶基)丁酰胺的合成

方案3，步骤A:将5-溴吡啶-2,3-二胺（5 g, 27 mmol）、接着DIPEA（14 mL, 80mmol）添加到丁酸（2.7 mL, 29 mmol）和HATU（15.01 g, 40 mmol）在DMF（90 mL）中的溶液中。将反应在氮气下密封并在50℃下搅拌整夜。将反应混合物冷却至RT，用水稀释并用EtOAc萃取。合并有机相，用饱和NaHCO₃水溶液、5%氯化锂水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，然后经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用40-100%EtOAc/己烷洗脱以得到白-棕色固体。该固体在EtOAc中研制，过滤并在真空下在50℃下干燥1小时以得到标题化合物(3.607 g)。MS (m/z): 258/260 (M+H)。

制备9

5-溴-3-N-丁基-吡啶-2,3-二胺的合成

方案3，步骤B:在烘干三颈RBF中将氢化锂铝（30 mL, 1 mol/L在THF中）在THF（40mL）中的溶液冷却至–78℃。经2小时逐滴加入在THF（40 mL）中的N-(2-氨基-5-溴-3-吡啶基)丁酰胺（2.50 g, 9.69 mmol）。使反应混合物经3小时升温至室温，然后在室温下搅拌整夜。在冰浴中将反应混合物冷却至0℃。相继逐滴加入水（3.0 mL）、2N NaOH水溶液（3.75mL）和水（9.0 mL），接着无水MgSO₄，并将反应混合物搅拌5 min。溶液经硅藻土垫过滤，并用Et₂O冲洗。滤液用Et₂O稀释并用饱和NaCl水溶液洗涤。有机层经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩以得到粗制标题化合物(2.28 g)。MS (m/z): 244/246 (M+H)。

方案4

制备10

1-丁基-7-甲基-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮的合成

方案4:将在过量草酸二乙酯（30 mL, 220.9 mmol）中的3-N-丁基-5-甲基-吡啶-2,3-二胺（5.64 g, 16.0 mmol）等分在两个微波小瓶中并在搅拌的同时在120℃下加热，并在氮气流下排放到大气中1.75小时。将反应混合物冷却至室温。经真空过滤收集固体，滤饼用MTBE（2 × 5 mL）冲洗。将固体风干30分钟，然后在高真空下在50℃下干燥以提供固体（2.198 g）。浓缩滤液并通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用己烷/EtOAc洗脱。合并纯色谱级分并减压浓缩以提供另外的固体。合并固体以得到标题化合物(2.677g)。MS (m/z): 234(M+H)。

由6-甲氧基-2-N-[(4-甲氧基苯基)甲基]吡啶-2,3-二胺（用于制备编号11）；5-溴-3-N-丁基-吡啶-2,3-二胺（用于制备编号12）；5-溴-3-N-丁基-6-甲基-吡啶-2,3-二胺（用于制备编号13）；6-甲基吡啶-2,3-二胺（用于制备编号14）；5-甲基-3-N-丙基-吡啶-2,3-二胺（用于制备编号15）；rac-3-N-[2-甲氧基丁基]吡啶-2,3-二胺（用于制备编号16）以基本类似于制备10的方法的方式使用摩尔过量的草酸二乙酯制备表2中所示的下列化合物。

表2.

制备编号	化学名称	结构	MS (<i>m/z</i>)	注释
					11	6-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)甲基]-1<i>H</i>-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2,3-二酮		314 (M+H)
12	7-溴-1-丁基-4<i>H</i>-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2,3-二酮		298/300 (M+H)
					13	7-溴-1-丁基-6-甲基-4<i>H</i>-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2,3-二酮		312/314 (M+H)
14	6-甲基-1,4-二氢吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2,3-二酮		178 (M+H)
					15	1-丙基-7-甲基-4<i>H</i>-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2,3-二酮		220 (M+H)	使用在EtOH中的钠(2当量)
16	<i>rac</i>-1-[2-甲氧基丁基]-4<i>H</i>-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2,3-二酮		250 (M+H)	使用在EtOH中的甲醇钠(25%，2当量)

制备17

1-(环丙基甲基)-6-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)甲基]吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮的合成

将6-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)甲基]-1H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（2.242g, 7.156 mmol）、碳酸铯（6.99 g, 21.5 mmol）、碘化钾（123 mg, 0.718 mmol）和溴甲基环丙烷（1.80 mL, 17.8 mmol）合并在DMF（56 mL）中。混合物在氮气下在80℃下搅拌整夜。将反应冷却至室温并与前一批（156 mg规模反应）合并。反应用水稀释并用EtOAc萃取。合并有机物，用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用30-80% EtOAc/己烷洗脱。合并纯色谱级分并减压浓缩，在高真空下干燥以得到粉色固体粗制标题化合物(1.97 g)。MS (m/z): 368 (M+H)。

制备18

1-(环丙基甲基)-6-甲氧基-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮的合成

在氮气下密封的微波小瓶中将1-(环丙基甲基)-6-甲氧基-4-[(4-甲氧基苯基)甲基]吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（1.80 g, 4.90 mmol）溶解在TFA（10 mL）中。反应在120℃下搅拌1小时。将反应减压浓缩并从DCM中浓缩一次。所得绿色泡沫在高真空下干燥以提供粗制标题化合物(50质量%)，(2.4 g, 99%)。MS (m/z): 248 (M+H)。

方案5

制备19

1-丁基-3-氯-7-甲基-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮的合成

方案5: 1-丁基-7-甲基-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（2.198 g, 8.951mmol）和DMF（0.05 mL, 0.6 mmol）在过量亚硫酰氯（15 mL, 205.9 mmol）中的搅拌溶液在回流下加热。在16小时后，将反应混合物冷却至室温，用DCM稀释并减压浓缩。将粗物质悬浮在甲苯中，声处理，并减压浓缩。将粗物质悬浮在10 mL冷DCM中并通过真空过滤收集。将该物质风干1.5小时以得到固体（1.655g）。滤液减压浓缩，悬浮在DCM中并置于冰浴中整夜。所得悬浮液经细玻璃料漏斗（fine frit funnel）过滤并风干1小时以得到固体（267 mg）。合并物质以得到标题化合物(1.922g)。MS (m/z): 252 (M+H)。

由1-(环丙基甲基)-6-甲氧基-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（用于制备20）；由7-溴-1-丁基-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（用于制备编号21）；由1-丙基-7-甲基-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（用于制备编号22）；和由7-溴-1-丁基-6-甲基-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（用于制备编号23）以基本类似于制备19的方法的方式使用摩尔过量的亚硫酰氯制备表3中所示的下列化合物。

表3.

制备编号	化学名称	结构	MS (<i>m/z</i>)
				20	3-氯-1-(环丙基甲基)-6-甲氧基-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2-酮		266/268 (M+H)
21	7-溴-1-丁基-3-氯-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2-酮		316/318 (M+H)
				22	3-氯-7-甲基-1-丙基-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2-酮		238 (M+H)
23	7-溴-1-丁基-3-氯-6-甲基-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2-酮		332 (M+H)

方案6

制备24

1-丁基-3-肼基-7-甲基-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮的合成

方案6:将1-丁基-7-甲基-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（0.268 g, 1.15mmol）在EtOH（7.0 mL）中的悬浮液脱气。加入肼（0.60 mL, 19 mmol）并将该反应在110℃下加热整夜。将反应浓缩并通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用DCM/MeOH洗脱。合并纯色谱级分并减压浓缩以得到深黄色固体形式的标题化合物（0.226 g, 80%）。MS (m/z): 248.0 (M+H)。

由rac-1-[2-甲氧基丁基]-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（用于制备编号 25）和由6-甲基-1,4-二氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-2,3-二酮（用于制备编号26）以基本类似于制备24的方法的方式使用摩尔过量的肼制备表4中所示的下列化合物。

表4.

制备编号	化学名称	结构	MS (<i>m/z</i>)
				25	<i>rac-</i>3-肼基-1-[2-甲氧基丁基]吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2-酮		264 (M+H)
26	3-肼基-6-甲基-1<i>H</i>-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-2-酮		192 (M+H)

方案7

制备27A

1-环丙基环丙烷碳酰肼盐酸盐的合成

向1-环丙基环丙烷甲酸（9.63 g, 76.3 mmol）和HATU（32.3 g, 83.2 mmol）在DMF（300 mL）中的搅拌溶液中加入肼基甲酸叔丁酯（5.00 g, 37.8 mmol），接着加入DIPEA（14.5 mL, 83.1 mmol），并将反应在室温下搅拌5天。反应混合物用乙酸乙酯稀释，用1.0 N盐酸、饱和NaHCO₃和水洗涤。有机物然后经硫酸镁干燥，过滤，并减压浓缩。将1,4-二氧杂环己烷（50 mL）添加到残留物中，经20分钟加入在1,4-二氧杂环己烷（100 mL, 400 mmol）中的盐酸（4 mol/L）并将反应在室温下搅拌1小时。过滤溶液，滤饼用MTBE洗涤，并减压干燥以得到标题化合物(8.01 g, 58.7%)。MS (m/z):141 (M+H)。

制备27B

1-甲基环丙烷碳酰肼盐酸盐的合成

向1-甲基环丙烷甲酸（5.25 g, 52.4 mmol）、DIPEA（7.3 mL, 42 mmol）和HATU（16.1 g, 41.5 mmol）在二氯甲烷（200 mL）中的搅拌溶液中加入肼基甲酸叔丁酯（5.00 g,37.8 mmol），并将反应在室温下搅拌整夜。反应混合物用1.0 N盐酸、饱和NaHCO₃和水洗涤。有机物然后经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将残留物冷却到0℃并溶解在盐酸（4 mol/L）/1,4-二氧杂环己烷（75 mL, 300 mmol）中。在5分钟后，反应混合物变成白色浆料并在室温下搅拌1小时。加入另外的盐酸（4 mol/L）/1,4-二氧杂环己烷（75 mL, 300 mmol）并将反应搅拌整夜。反应用MTBE稀释，过滤，滤饼用MTBE洗涤并风干以得到粗制标题化合物(6.42g)。1H NMR (DMSO-d6) δ 10.64 (s, 1H), 10.23 (br s, 2 H), 1.26 (s, 3H), 1.05-1.02 (m, 2H), 0.69-0.66 (m, 2H)。

制备27C

N'-(1-丁基-7-甲基-2-氧代-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-1-环丙基-环丙烷碳酰肼的合成

方案7:向具有4Å分子筛的烘干RBF中加入1-丁基-3-氯-7-甲基-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮（1.50 g, 6.0 mmol）和1-环丙基环丙烷碳酰肼盐酸盐（1.05 g, 5.94 mmol）。密封该容器，然后抽空并用氮气回填(3×)。加入THF（40 mL）并在50℃下搅拌混合物。在1小时后，声处理反应混合物并在55℃下搅拌2小时。将反应混合物冷却至室温并经真空过滤收集所得固体，风干5分钟，然后在高真空下干燥1小时以得到标题化合物(1.86g)。MS (m/z):356 (M+H)。

以基本类似于制备27C的方法的方式分别由7-溴-1-丁基-3-氯-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮（用于制备编号28）；由3-氯-7-甲基-1-丙基-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮（用于制备编号29）；由7-溴-1-丁基-3-氯-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮和1-甲基环丙烷碳酰肼盐酸盐（用于制备编号30）制备表5中所示的下列化合物。

表5.

制备编号	化学名称	结构	MS (<i>m/z</i>)
				28	<i>N’</i>-[(7-溴-1-丁基-2-氧代-4<i>H</i>-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-3-叉基)氨基]-1-环丙基-环丙烷碳酰肼		420/422 (M+H)
29	<i>N</i>'-(1-丙基-7-甲基-2-氧代-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-1-(环丙基)环丙烷碳酰肼		342 (M+H)
				30	<i>N</i>'-(7-溴-1-丁基-2-氧代-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-3-基)-1-甲基-环丙烷碳酰肼		394/396 (M+H)

方案8

制备31

N'-(1-丁基-7-甲基-2-氧代-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-1-(三氟甲基)环丙烷碳酰肼的合成

方案8:将TEA（0.44 mL, 3.2 mmol）添加到1-丁基-3-肼基-7-甲基-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮（0.224 g, 0.906 mmol）、1-(三氟甲基)环丙烷甲酸（0.157 g, 1.01 mmol）、HOBT（0.192 g, 1.39 mmol）和EDCI盐酸盐（0.258 g, 1.35 mmol）在THF（9.1 mL）中的混合物中并在室温下搅拌整夜。通过用DCM和水稀释获得溶液，然后经硅藻土垫过滤。用DCM洗涤该垫并弃置。将滤液浓缩并通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用DCM/MeOH洗脱。合并纯色谱级分并减压浓缩以得到白色固体形式的标题化合物（0.288 g）。MS (m/z): 348.0 (M+H)。

由rac-3-肼基-1-[2-甲氧基丁基]吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮（用于制备编号32）和由3-肼基-6-甲基-1H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮（用于制备编号33）以基本类似于制备31的方法的方式使用1-环丙基环丙烷甲酸制备表6中所示的下列化合物。

表6.

制备编号	化学名称	结构	MS (<i>m/z</i>)
				32	<i>rac-</i>1-环丙基-<i>N'</i>-[1-[2-甲氧基丁基]-2-氧代-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-3-基]环丙烷碳酰肼		372 (M+H)
33	1-环丙基-<i>N'</i>-(6-甲基-2-氧代-1<i>H</i>-吡啶并[2,3-<i>b</i>]吡嗪-3-基)环丙烷碳酰肼		300 (M+H)

方案9

制备34

9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-(环丙基甲基)-2-甲氧基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮的合成

方案9:将3-氯-1-(环丙基甲基)-6-甲氧基-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮（1.025 g,2.315 mmol）和1-环丙基环丙烷碳酰肼盐酸盐（520 mg, 2.5023 mmol）溶解在THF（15 mL）中。在氮气下将溶液密封在微波小瓶中并在60℃下搅拌整夜。将反应冷却至室温并与前一批（1 g规模反应）合并。物质用EtOAc稀释并用饱和NaHCO₃水溶液、接着饱和NaCl水溶液洗涤。有机层经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用50-100% EtOAc/己烷洗脱。合并纯色谱级分并减压浓缩。橙色固体在高真空下干燥以得到粗制标题化合物(1.068 g)。MS (m/z): 352 (M+H)。

由7-溴-1-丁基-3-氯-6-甲基-吡啶并[2,3-b]吡嗪-2-酮以基本类似于制备34的方法的方式制备表7中所示的下列化合物。

表7.

制备编号	化合物名称	结构	MS (<i>m/z</i>)
				35	9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-3-溴-5-丁基-2-甲基吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		416/418 (M+H)

方案10

实施例1

9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-丁基-3-甲基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮的合成

方案10: 向具有4Å分子筛的烘干微波小瓶中加入N'-(1-丁基-7-甲基-2-氧代-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-1-环丙基-环丙烷碳酰肼（1.83 g, 5.15 mmol）。密封小瓶，然后抽空并用氮气回填(3×)。加入HMDS（17 mL, 81.2 mmol），接着加入DBU（0.16 mL, 1.1mmol）以得到悬浮液，其在搅拌下在125℃下加热。在4小时后将反应溶液转移到含甲醇的RBF中并在50℃下加热1小时。将粗制混合物减压浓缩并使所得残留物在DCM和水之间分配。分离各层，水层用DCM和3:1 CHCl₃/IPA萃取。合并有机物，用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。将残留物溶解在EtOH（17mL）中并经加料漏斗经30分钟加入水（100 mL），然后在冰浴中冷却15分钟。通过真空过滤分离固体，用水洗涤，风干15分钟，并在真空下在50℃下干燥整夜以得到标题化合物(1.14g)。MS (m/z): 338 (M+H)。

由N'-(1-丁基-7-甲基-2-氧代-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-1-(三氟甲基)环丙烷碳酰肼（用于实施例2）；由N'-(7-溴-1-丁基-2-氧代-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-1-甲基-环丙烷碳酰肼（用于制备编号36）；由N'-(1-丙基-7-甲基-2-氧代-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)-1-(环丙基)环丙烷碳酰肼（用于实施例3）；由N'-[(7-溴-1-丁基-2-氧代-4H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-叉基)氨基]-1-环丙基-环丙烷碳酰肼（用于制备编号37）；由1-环丙基-N'-(6-甲基-2-氧代-1H-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基)环丙烷碳酰肼（用于制备编号38）；由rac-1-环丙基-N'-[1-[2-甲氧基丁基]-2-氧代-吡啶并[2,3-b]吡嗪-3-基]环丙烷碳酰肼（用于实施例4）以基本类似于实施例1的方法的方式制备表8中所示的下列化合物（制备和实施例）。

表8.

制备/实施例编号	化合物名称	结构	MS (<i>m/z</i>)
				实施例2	5-丁基-3-甲基-9-(1-(三氟甲基)环丙基)吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		366 (M+H)
制备36	3-溴-5-丁基-9-(1-甲基环丙基)吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		376/378(M+H)
				实施例3	9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-3-甲基-5-丙基吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		324 (M+H)
制备37	9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-3-溴-5-丁基吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		402/404(M+H)
				制备38	9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-2-甲基吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		282 (M+H)
实施例4	<i>rac-</i>9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-(2-甲氧基丁基)吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		354 (M+H)

实施例4a

9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-(2-甲氧基丁基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（异构体1）的合成

使用MeOH（2.0 mL）、DCM（1.0 mL）溶解rac-9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-(2-甲氧基丁基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（0.148, 0.42 mmol）以供手性分离，然后用DCM（2.0 mL）和MeOH（1.0 mL）冲洗。过滤6 mL进料溶液，并以1.0 mL增量注入，总共注射6次。柱是(S,S) Whelk-01 10um，流速为80mL/分钟，40% MeOH/60% CO₂流动相以得到异构体1作为标题化合物（57 mg；第一洗脱异构体）。(S,S) Whelk-01 10um,40% MeOH/CO₂, 5mL/min, 225nm: TR = 2.22 min, >99%ee. MS (m/z): 354.2 (M+H)；[α]_D ²⁰ -8.1° (c 0.20, 甲醇)。

实施例4b

9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-(2-甲氧基丁基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（异构体2）的合成

基本通过实施例5的方法分离实施例6的化合物以得到异构体2作为标题化合物（61 mg；第二洗脱异构体）。(S,S) Whelk-01 10um, 40% MeOH/CO2, 5mL/min, 225nm: TR= 3.08 min, >99%ee. MS (m/z): 354.2 (M+H)；[α]_D ²⁰ +7.1° (c 0.20, 甲醇)。

实施例5

9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-(环丙基甲基)-2-羟基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮的合成

合并9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-(环丙基甲基)-2-甲氧基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（460 mg, 1.309 mmol）、乙硫醇钠（487 mg, 5.210mmol）和1-甲基-2-吡咯烷酮（5 mL, 51.90 mmol）并在氮气下密封在微波小瓶中。反应在200℃下在微波中照射12小时。将反应混合物与来自前一批的反应混合物（30 mg规模反应）合并并用水稀释。水层用1N HCl水溶液酸化至pH ~3，并用EtOAc萃取。合并有机物, 用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在C18上的反相快速色谱法提纯，用10-100% ACN/水（10 mM (NH₄)HCO₃ w/ 5% MeOH）洗脱。合并纯色谱级分并减压浓缩到水相，用DCM萃取，用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。灰白色固体在真空下干燥得到标题化合物(84 mg)。MS (m/z): 338 (M+H)。

实施例6

5-丁基-3-甲基-9-(1-甲基环丙基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3- a]吡嗪-6(5H)-酮的合成

在微波小瓶中将[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)（9 mg, 0.012 mmol）添加到3-溴-5-丁基-9-(1-甲基环丙基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（90 mg, 0.2392 mmol）在THF（0.6 mL, 7 mmol）中的溶液中。在搅拌10 min后，加入甲基氯化锌（350 μL, 0.7 mmol, 2 mol/L在THF中），抽空容器并用氮气吹扫。反应混合物在80℃下搅拌2小时，冷却至室温并与另一批次(run)（37 mg规模反应）合并，用饱和NH₄Cl水溶液稀释。水层用EtOAc萃取，合并有机物，用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩。通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用0-100% EtOAc/己烷洗脱以得到标题化合物(75 mg)。MS (m/z): 312 (M+H)。

由9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-3-溴-5-丁基-2-甲基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮以基本类似于实施例7的方法的方式制备表9中所示的下列化合物。

表9.

实施例编号	化合物名称	结构	MS (<i>m/</i><i>z</i>)
				7	9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-丁基-2,3-二甲基吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		352 (M+H)

实施例8

5-丁基-3-乙基-9-(1-甲基环丙基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮的合成

在微波小瓶中合并3-溴-5-丁基-9-(1-甲基环丙基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（89 mg, 0.2366 mmol）、1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)二氯甲烷络合物（11 mg, 0.0132 mmol）和1,4-二氧杂环己烷（1.0 mL）。在氮气下密封小瓶，加入二乙基锌（0.50 mL, 0.50 mmol, 1 mol/L在己烷中）并在室温下搅拌整夜。反应混合物用饱和NaCl水溶液淬灭并与另一批次(run)（23 mg规模反应）合并。混合物用EtOAc和水稀释，分离各层，水层用EtOAc、接着3:1 CHCl₃/IPA萃取。合并有机物，用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用0-7% MeOH/DCM洗脱以得到粗物质，其通过在C18上的反相快速色谱法进一步提纯，用10-100%ACN /水（10 mM (NH₄)HCO₃ w/ 5% MeOH）洗脱以得到标题化合物(60 mg, 60%)。MS (m/z):326 (M+H)。

由9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-3-溴-5-丁基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮以基本类似于实施例9的方法的方式制备表10中所示的下列化合物。

表10.

实施例编号	化合物名称	结构	MS (<i>m/</i><i>z</i>)
				9	9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-丁基-3-乙基吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		324 (M+H)

实施例10

9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-丁基-3-异丙基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮的合成

将Pd-PEPPSI-IHeptCl（3 mg, 0.003071 mmol）和9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-3-溴-5-丁基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（100 mg, 0.2486mmol）添加到RBF中，吹扫并用氮气回填。加入甲苯（2.5 mL）并将溶液冷却至0℃。加入溴化2-丙基锌（600 μL, 0.3 mmol, 0.5 mol/L在THF中）并使反应达到RT。加入另外的Pd-PEPPSI-IHeptCl（3 mg, 0.003071 mmol, 100质量%），抽空容器，用氮气吹扫并在室温下搅拌整夜。反应用饱和NH₄Cl水溶液淬灭并用DCM稀释。分离各相，水相用DCM萃取。合并有机物，经无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用0-100%EtOAc/己烷洗脱以得到标题化合物(30 mg, 33%)。MS (m/z): 366 (M+H)。

方案11

实施例11

9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-丁基-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮的合成

方案11, 步骤A:在微波小瓶中合并9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-3-溴-5-丁基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（597 mg, 1.484 mmol）、三氟(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)硼酸钾（430 mg, 1.8054 mmol）、甲磺酸根合(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)（133 mg, 0.154249mmol）、2-二环己基膦基-2'6'-二异丙氧基-1,1'-联苯（74 mg, 0.150651 mmol）和碳酸铯（1.48 g, 4.54 mmol）。在氮气下密封小瓶，加入1,4-二氧杂环己烷（5.0 mL）和水（0.50mL）的溶液并将反应混合物在100℃下搅拌整夜。加入另外的2-二环己基膦基-2'6'-二异丙氧基-1,1'-联苯（32 mg）和甲磺酸根合(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)（65 mg）并将反应在105℃下搅拌2天。将反应混合物与另一批次(run)（100 mg规模反应）合并，混合物用EtOAc稀释，并用水、接着饱和NaCl水溶液洗涤。有机层经无水Na₂SO₄干燥，滗析并减压浓缩。残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用40-65% EtOAc/己烷洗脱以得到9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-丁基-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（370 mg）。MS (m/z): 454。

方案11, 步骤B:在微波小瓶中合并9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-丁基-3-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮（370 mg, 0.5710 mmol）和DCM（3 mL）。在氮气下密封小瓶并在冰浴中冷却至0℃。逐滴加入三氟化硼乙醚络合物（0.36 mL, 2.8 mmol）并使反应混合物升温至RT整夜。反应用饱和NaHCO₃水溶液淬灭并用DCM稀释。有机物用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯，用50-100% EtOAc/己烷洗脱以得到残留物。残留物通过在C18上的反相快速色谱法提纯，在10-100% ACN/水中洗脱以得到标题化合物(49 mg)。MS (m/z): 354 (M+H)。

由3-溴-5-丁基-9-(1-甲基环丙基)吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮以基本类似于实施例12的方法的方式制备如表11中所示的下列化合物。

表11.

实施例编号	化学名称	结构	MS (<i>m/z</i>)
				12	5-丁基-3-(羟甲基)-9-(1-甲基环丙基)吡啶并[3,2-<i>e</i>][1,2,4]三唑并[4,3-<i>a</i>]吡嗪-6(5<i>H</i>)-酮		328 (M+H)

实施例13

9-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-5-丁基-2-甲基吡啶并[3,2-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-6(5H)-酮的合成

将双(三甲基甲硅烷基)氨基化锂（2.1 mL, 2.1 mmol, 1 mol/L在MTBE中）添加到在DMF（7 mL）中的1-([1,1'-双(环丙烷)]-1-基)-7-甲基吡啶并[2,3-e][1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-4(5H)-酮（199 mg, 0.7074 mmol）中并将反应在室温下搅拌1小时。加入1-溴丁烷（380 μL, 3.539 mmol）和碘化钾（12 mg, 0.07229 mmol）并将反应在50℃下搅拌3天。将反应冷却至室温并与另外2个批次(run)（各50 mg规模）合并。溶液用3:1 CHCl₃/IPA萃取，有机层经无水MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。将残留物溶解在EtOH中并添加到水中，并通过过滤收集所得沉淀物。收集的固体通过在C18上的反相快速色谱法提纯，用15-100% ACN/水洗脱以得到标题化合物(145 mg)。MS (m/z): 338 (M+H)。

PDE蛋白的生成

将编码全长人PDE1A (NP_001003683.1)和PDE1C (NP_005011.1)的核苷酸序列插入具有N末端HIS标签的pFastBac1 (Invitrogen)载体中。将编码全长人PDE4D (NP_006194.2)和PDE3A (NP_000912.3)的催化域（残基641-1141）的核苷酸序列插入具有C末端HIS标签的pFastBac1 (Invitrogen)载体中。将编码全长人PDE6A (NP_000431.2)和PDE6B(AAH00249.1)的核苷酸序列插入分别具有N末端HIS标签和N末端Flag标签的pFastBacDual(Invitrogen)载体中以生成PDE6A/6B二聚体。根据Bac-to-Bac Baculovirus Expressionsystem (Invitrogen)的程序进行Sf9细胞中的杆状病毒生成和蛋白表达。将编码全长人PDE1B (NP_000915.1)的核苷酸序列插入具有C末端HIS标签的pIEX4 (Novagen)中，并且根据供应商的程序（Novagen）进行Sf9细胞中这两种蛋白的生成。使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)、接着在SUPERDEX^® 200柱（GE Healthcare）上在储存缓冲液（20 mM Tris-HCl,pH7.5, 150 mM NaCl, 10%甘油）中的尺寸排阻色谱法提纯His标记的PDE蛋白。在通过NiNTA柱色谱法提纯后使用抗-Flag M2-琼脂糖(Sigma)提纯包括PDE6A/6B的Flag标记PDE蛋白，并在储存缓冲液（50 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 10%甘油, 0.1 mg/mlFlag肽）中洗脱。所有纯化蛋白以小等分试样储存在-80℃下。

磷酸二酯酶酶检测

用基于SPA检测系统（闪烁迫近分析法）的放射酶检测法测量所有3', 5'环核苷酸磷酸二酯酶（PDE）酶活性。受试化合物在纯二甲亚砜（DMSO）中使用十点浓度响应曲线稀释。反应混合物中的最大化合物浓度为10或100 µM。化合物在适当浓度下用任一PDE酶预孵育30分钟，然后通过加入底物启动反应。使反应在室温下进行60分钟。接着，通过添加SPA珠停止反应。在12小时后在MICROBETA^TM TRILUX^®计数器中读取样品。“IC₅₀”是指产生化合物可能的最大抑制响应的50%的该化合物浓度。通过绘制归一化数据 vs. log [化合物]和使用四参数逻辑方程拟合数据来计算IC₅₀值。

Ca²⁺- 钙调蛋白依赖性PDE酶检测

PDE1B、PDE1A和PDE1C根据标准蛋白生成程序克隆和纯化。制备检测缓冲液以得到在pH 7.5下在水中50 mM Tris-HCl、50 mM MgCl₂、4 mM CaCl₂、0.1%牛血清白蛋白和6 U/ml钙调蛋白的在检测中的最终浓度。对PDE1A、PDE1B和PDE1C，最终酶浓度分别为0.25、0.074和0.0012 nM。通过添加底物[³H]cAMP启动反应，以得到47 nM的最终浓度。

表12: 实施例1-13对人PDE1A、PDE1B和PDE1C的体外效力

表12中的数据证实实施例1-13的化合物体外抑制人PDE1A、PDE1B和PDE1C酶活性。

使用[³H]cAMP作为底物的PDE酶检测

使用[³H]cAMP作为反应底物测量下列磷酸二酯酶活性：人PDE3A（催化域）和人PDE4D。这两种酶都根据标准程序克隆和纯化。制备检测缓冲液以得到在pH 7.5下50 mMTris-HCl、8.3 mM MgCl₂、1.7 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.1%牛血清白蛋白的在检测中的最终浓度。对PDE3A和PDE4D，最终酶浓度分别为0.008和0.021 nM。通过添加底物[³H]cAMP启动反应，以得到47 nM的最终浓度。

表13: 实施例1-13对人PDE3A（催化域）和PDE4D的体外效力

使用[³H]cGMP作为底物的PDE酶检测

使用[³H]cGMP作为反应底物测量下列磷酸二酯酶活性：人PDE6A/6B。人PDE6的催化活性形式是由α（人PDE6A）和β亚基（人PDE6B）构成的二聚体。通过共表达和纯化策略（使用两个纯化步骤，即NiNTA和抗-FLAG Sepharose色谱法）制备人PDE6A/6B的二聚体。制备检测缓冲液以得到在pH 7.5下50 mM Tris-HCl、8.3 mM MgCl₂、1.7 mM EDTA和0.1%牛血清白蛋白的在检测中的最终浓度。最终酶浓度为5 nM。通过添加底物[³H]cGMP启动反应，以得到80 nM的最终浓度。

表14:实施例1-13对PDE6AB的体外效力

表12、13和14中的数据证实，实施例1-13的化合物在体外相对于人PDE3A、PDE4D和PDE6AB是人PDE1A、PDE1B和PDE1C的选择性抑制剂。

Claims (14)

1.下式的化合物或其可药用盐：

其中X是H或任选被羟基取代的C1-C3烷基；

Y是H、羟基或甲基；

R是乙基、正丙基、环丙基或

A是甲基、环丙基或三氟甲基；

条件是当X和Y都是H且R是正丙基时，则A不是甲基。

2.根据权利要求1的化合物或盐，其中X是甲基。

3.根据权利要求1或权利要求2的化合物或盐，其中Y是H。

4.根据权利要求1或权利要求2的化合物或盐，其中R是正丙基。

5.根据权利要求1或权利要求2的化合物或盐，其中A是环丙基。

6.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中所述化合物为游离碱形式。

7.根据权利要求1的化合物或盐，其中所述化合物具有下式：

。

8.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物具有下式：

。

9.根据权利要求1的化合物或盐，其中所述化合物具有下式：

。

10.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物具有下式：

。

11.根据权利要求1至10任一项的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗慢性肾病的药物的用途。

12.根据权利要求1至10任一项的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗糖尿病肾病的药物的用途。

13.药物组合物，其包含根据权利要求1至10任一项的化合物或其可药用盐以及一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。

14.制备药物组合物的方法，其包括混合根据权利要求1至10任一项的化合物或其可药用盐与一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。