TWI661864B - 捕捉或分離白血球的聚合物、裝置、其製造方法及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種聚合物，用於捕捉或分離白血球。聚合物係以含醯胺基及羥基之單體進行聚合反應製備而得。此含醯胺基及羥基之單體具有式(1) 之結構：。在式(1)中， R1係獨立選自由氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12長碳鏈其中任一及苯環所組成的群組，R2係獨立選自由氫、甲基、乙基、C1至C6長碳鏈其中任一、氨基及苯環所組成的群組，以及n為1至5之整數。

Description

捕捉或分離白血球的聚合物、裝置、其製造方法及其應用
本發明實施例係關於一種捕捉或分離細胞的材料，特別是一種用於捕捉或分離白血球的聚合物。
輸血主要是藉由輸注來自捐贈者的血品至病人體內，以補充病人缺乏的血液成份。血品(或稱血液成份)種類主要包含全血(whole blood)、血漿、洗滌紅血球(washed erythrocyte)、紅血球濃厚液(erythrocyte concentrate)、白血球濃厚液(leukocyte concentrate)與血小板濃厚液(platelet concentrate)。輸血時可視病人需求選擇輸入的血液成份。
目前已知輸血後的許多不良反應，與白血球或白血球所釋放出之細胞介質(cytokines)有關。不良反應例如有：非溶血性發熱反應 (non-hemolytic febrile transfusion reactions,NHFTR)、異體免疫反應(alloimmunization)、病毒感染及與輸血相關移植體抗宿主疾病(transfusion-associated graft versus host disease,TA-GVHD)等。因此，目前已有許多國家將白血球減除列為輸血之必要程序，不論是紅血球或血小板的輸血皆須將血液中的白血球濃度減至一定程度，以避免病患產生不良反應。
習知白血球的分離係利用表面帶有電荷的過濾材料。然而，以帶電荷的表面來分離白血球，容易造成緩激肽(bradykinin)的濃度增加，易引發輸血時的急性低血壓反應(hypotensive transfusion reaction)。
此外，為避免於輸血或是血液處理的過程中引發凝血或活化血小板，一般在血液樣品中需要添加抗凝血劑，或於過濾材料表面進一步進行表面處理，以防止凝血或活化血小板。目前，在白血球減除技術領域中，尚未有一種適合的過濾材料，可有效解決上述習知技術的問題。
本發明之目的為提供具有高度白血球捕捉或分離能力的材料，較佳地是該材料具有可避免纖維蛋白原(fibrinogen)吸附及/或血小板貼附，從而 在白血球減除過程中具有高度的血小板保留率。
本發明之一態樣為一種聚合物，為用於捕捉或分離白血球的材料。此聚合物係以一含醯胺基及羥基之單體進行一聚合反應製備而得，其中該含醯胺基及羥基之單體具有式(1)之結構： 。在式(1)中，R1係獨立選 自由氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12長碳鏈其中任一及苯環所組成的群組，R2係獨立選自由氫、甲基、乙基、C1至C6長碳鏈其中任一、氨基及苯環所組成的群組，以及n為1至5之整數。
根據本發明的一些實施方式，其中式(1)中的R1為氫，R2為氫，以及n為1。
根據本發明的一些實施方式，該含醯胺基及羥基之單體為N-羥乙基丙烯醯胺((N-Hydroxyethyl acrylamide)，或N-(2-羥乙基)丙烯醯胺(N-(2-Hyroxyethyl)acrylamide)。
根據本發明的一些實施方式，聚合物係為共同聚合物(copolymer)，其係由該含醯胺基及羥基之單體及至少另一單體共同聚合而成。
根據本發明的一些實施方式，另一單體 係甲基丙烯酸甲酯(Butyl methacrylate,BMA)或甲基丙烯酸縮水甘油酯(Glycidyl methacrylate,GMA)。
根據本發明的一些實施方式，聚合物係為鏈段高分子。
根據本發明的一些實施方式，聚合物係為交聯聚合物。
根據本發明的一些實施方式，聚合反應包含使用一交聯劑，且該交聯劑具有雙丙烯酸酯之官能基。
根據本發明的一些實施方式，交聯劑係亞甲基雙丙烯醯胺及二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸共聚物或聚乙二醇二丙烯酸酯。
本發明之一態樣為一種用於捕捉或分離白血球的裝置，包含外殼以及本體。本體包含聚合 物，且此聚合物包含式(2)之結構。 在式(2)中，n為10至50之整數。
根據本發明的一些實施方式，聚合物具 有式(3)之結構：。在式(3)中， m為50至90之整數，且R1= ，其中p為2至6之整數，q為1至6之整數，r為1至6之整數，s為1至6之整數。
根據本發明的一些實施方式，聚合物具 有式(4)之結構：。在式(4)中，t為50 至90之整數，或。
根據本發明的一些實施方式，本體包括基材，其中聚合物係以塗佈(coating)、噴灑或浸漬的方式設置於基材上。
根據本發明的一些實施方式，本體包括基材，其中聚合物係以錨定(anchoring)之方式固定於基材上。
根據本發明的一些實施方式，過濾材料的表面元素包含碳、氧及氮，且碳、氧及氮之總莫耳百分比定義為100mol%，碳的莫耳百分比為約76.22%至約79.84%，氧的莫耳百分比為約18.1%至約21.04%，以及氮的莫耳百分比為約2.05%至約2.75%。
本發明之一態樣為一種含醯胺基及羥基之聚合物的用途，其係用於捕捉或分離白血球。含醯胺基及羥基之聚合物包含式(2)之結構： ，其中，n為10至50之整數。
根據本發明的一些實施方式，含醯胺基及羥基之聚合物其白血球的捕捉率不低於70%。
根據本發明的一些實施方式，含醯胺基及羥基之聚合物其血小板的保留率不低於85%。
本發明之一態樣為一種含醯胺基及羥基之單體的用途，其係用於製造捕捉或分離白血球的過濾材料。此含醯胺基及羥基之單體具有式(1)之結 構：。在式(1)中，R1係獨 立選自由氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12長碳鏈其中任一及苯環所組成的群組，R2係獨立選自由氫、甲基、乙基、C1至C6長碳鏈其中任一、氨基及苯環所組成的群組，以及n為1至5之整數。
根據本發明的一些實施方式，其中製造捕捉或分離白血球的過濾材料的步驟包含提供基材，以及將含醯胺基及羥基之單體修飾於此基材上。
根據本發明的一些實施方式，含醯胺基及羥基之單體修飾於基材上包含：提供含醯胺基及羥基之單體；提供至少一錨定單體(anchoring unit)；聚合含醯胺基及羥基之單體及錨定單體形成共聚物；以及透過錨定單體錨定共聚物於基材上。
根據本發明的一些實施方式，含醯胺基及羥基之單體佔共聚物之重量百分比為約百分之20至約百分之40。
根據本發明的一些實施方式，錨定單體佔共聚物之重量百分比為約百分之60至約百分之80。
根據本發明的一些實施方式，錨定單體係選自由甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯及其組合所組成的群組。
根據本發明的一些實施方式，其中將含醯胺基及羥基之單體修飾於基材上的步驟包含塗佈含醯胺基及羥基之單體於基板上，以及以紫外線處理基板上的含醯胺基及羥基之單體。
本發明之一態樣為一種白血球濃厚液的製備方法，包含：提供如前述用於捕捉或分離白血球的裝置；提供血液樣品，其中血液樣品包含白血 球及血小板；將血液樣品通過此裝置，使得白血球被捕捉於此裝置中，或自血液樣品中被分離至此裝置中；以及脫附被捕捉或分離的白血球。
本發明之一態樣為一種紅血球濃厚液的製備方法，包含：提供如前述用於捕捉或分離白血球的裝置；提供血液樣品，其中血液樣品包含紅血球、白血球及血小板；將血液樣品通過裝置而獲得濾液，其中白血球被捕捉於此裝置中或自該血液樣品中被分離出來；以及處理濾液為紅血球濃厚液。
本發明之一態樣為一種血漿製品儲存前之處理方法，包含：提供如前述用於捕捉或分離白血球的裝置；提供血液樣品，其中血液樣品包含血漿及白血球；以及將血液樣品通過裝置而獲得濾液，其中白血球於裝置中被捕捉或自血液樣品中分離出來。
本發明之一態樣為一種去除全血血液中白血球方法，包含：提供如前述用於捕捉或分離白血球的裝置；提供全血血液樣品，其中全血血液樣品包含紅血球、白血球及血小板；以及將全血血液樣品通過裝置而獲得濾液，其中白血球於裝置中被捕捉或自全血血液樣品中被分離出來。
一種血小板濃厚液的製備方法，包含：提供如前述用於捕捉或分離白血球的裝置；提供一血液樣品，其中該血液樣品包含白血球及血小板； 將血液樣品通過此裝置而獲得一濾液，其中白血球被捕捉於此裝置中或自此血液樣品中分離出來；以及處理濾液為血小板濃厚液。其中，血液樣品可以為全血血液樣品，或者為經過離心處理去除紅血球之血液樣品。
綜上所述，本發明係提供一種用於捕捉或分離白血球的聚合物、裝置、其製造方法及其用途。以含醯胺基及羥基之化合物或其作為單體形成的聚合物，提供捕捉或分離白血球之功能。由於此類化合物及聚合物對白血球具有高的親和性，可透過捕抓、吸附、貼附或黏附白血球而使其例如自全血血品中分離出來，且重要的是，過程中幾乎不會吸附血漿蛋白質，亦幾乎不會造成血小板貼附，提高血小板的保留率。請參照第1圖，繪示白血球減除的兩種路徑，路徑A及路徑B。一般白血球減除的作用機制主要係藉由帶正電的過濾材料F，吸附血漿蛋白質P1後，引起血小板P2貼附。被貼附的血小板P2活化後，分泌作為訊號傳遞的細胞介質和生長因子(growth factor)會進一步引起白血球L貼附。由於血小板P2及白血球L帶負電，故過濾材料F表面一般修飾成帶正電荷。然而，使用帶正電的過濾材料F，易導致血小板P2活化，不易在除去白血球L的同時高效率回收血小板P2。本發明之白血球減除作用機制(如第1圖的路徑B)與習知機制(如第1圖的路徑A)不 同，利用本發明實施方式所製備的過濾材料F’可解決過去白血球減除所面臨的問題。據此，藉由本發明可有效分離白血球、避免活化血小板或凝血，亦可避免增加緩激肽的濃度，而導致輸血時的急性低血壓反應。
A‧‧‧路徑
B‧‧‧路徑
F‧‧‧過濾材料
F’‧‧‧過濾材料
L‧‧‧白血球
P1‧‧‧血漿蛋白質
P2‧‧‧血小板
1‧‧‧上殼體
2‧‧‧過濾材料
3‧‧‧下殼體
當結合附圖閱讀以下詳細描述時將更好地理解本揭露內容之態樣。但須注意依照本產業的標準做法，各種特徵未按照比例繪製。事實上，各種特徵的尺寸為了清楚的討論而可被任意放大或縮小。
第1圖係根據本發明一些實施方式，繪示白血球減除作用機制的示意圖。
第2圖係根據本發明一些實施方式，繪示一種用於分離或捕捉白血球的過濾裝置。
第3圖係根據本發明一些實施方式，繪示各種水膠材料之平衡含水量及油接觸角的結果圖。
第4圖係根據本發明一些實施方式，繪示各種水膠材料之平衡含水量、不凍水比例及無因次群的結果圖。
第5圖係根據本發明一些實施方式，繪示各種水膠於酵素結合免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試驗中，相對蛋白質吸 附的結果圖。
第6圖係根據本發明一些實施方式，繪示各種水膠材料表面上的蛋白質吸附量及細胞密度的結果圖。
第7圖係根據本發明一些實施方式，繪示各種水膠上之白血球貼附量的結果圖。
第8圖係根據本發明一些實施方式，為各單體、高分子化合物之結構式及其核磁共振圖譜訊號的化學位移。
第9圖係根據本發明一些實施方式，為各單體、高分子化合物之核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy,NMR)化學結構圖譜。
第10圖係根據本發明一些實施方式，為聚丙烯(polypropylene,PP)基材及聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)基材上的材料接枝披覆密度。
第11圖係根據本發明一些實施方式，為PP基材及PET基材表面的氮元素的光電子能譜儀分析圖譜。
第12圖係根據本發明一些實施方式，為各種PP基材上的白血球、血小板、與紅血球貼附影像之定性結果圖。
第13圖係根據本發明一些實施方式，為各種PP基材上其白血球、血小板、與紅血球貼附量之定量結果圖。
第14圖係根據本發明一些實施方式，為各種PET基材上的白血球、血小板、與紅血球貼附影像之定性結果圖。
第15圖係根據本發明一些實施方式，為各種改質的PET基材上其白血球、血小板、與紅血球貼附量之定量結果圖。
本揭露接下來將會提供許多不同的實施方式或實施例以實施本揭露中不同的特徵。各特定實施例中的組成及配置將會在以下作描述以簡化本揭露。這些為實施例僅作為式範並非用於限定本揭露。例如，一第一元件形成於一第二元件「上方」或「之上」可包含實施例中的第一元件與第二元件直接接觸，亦可包含第一元件與第二元件之間更有其他額外元件使第一元件與第二元件無直接接觸。此外，在本揭露各種不同的範例中，將重複地使用元件符號及/或字母。此重複乃為了簡化與清晰的目的，而其本身並不決定各種實施例及/或結構配置之間的關係。此外，各種特徵乃為了簡化與清晰可能會依不同比例做繪製。
更進一步，像是「之下」、「下面」、「較低」、「上面」、「較高」、以及其他類似之相對空間關係的用語，可用於此處以便描述圖式中一元件或特 徵與另一元件或特徵之間的關係。該等相對空間關係的用語乃為了涵蓋除了圖式所描述的方向以外，裝置於使用或操作中之各種不同的方向。舉例來說，若於圖中的裝置被翻轉過來，原先被描述為在其他元件或特徵「之下」或「下面」的元件則變成在其他元件或特徵「上面」。因此，範例用語「之下」皆能包含上面及之下之方位。上述裝置可另有其他導向方式(旋轉90度或朝其他方向)，此時的空間相對關係也可依上述方式解讀。
用語「捕捉」係指血液樣品中的血球細胞，接觸到材料表面上，受到材料與血球細胞之間的疏水、氫鍵、或靜電分子作用力的吸引，造成各式血球細胞可能直接吸貼附於材料表面上，或先吸附體積較小的血漿蛋白質與血小板，才導致較大型的血球細胞貼附，這些過程被定義成血球「捕捉」。
用語「分離」係指將含有白血球的樣品通過分離白血球之材料後，可將白血球由樣品中分離出來，亦指可減少樣品中的白血球含量，甚至可大量減少樣品中的白血球含量，而使得分離後的濾液之白血球濃度小於原來含有白血球的樣品。例如，可將含有白血球和血小板的樣品分離，以達到血小板的高回收率；或將白血球和紅血球的樣品分離，以達到紅血球的高回收率。
用語「減除白血球(leukocyte depletion)」 並非是指所有的或實質上所有的白血球被完全去除。該用語是用以廣義地指出白血球的數目在分離或過濾的過程中減少。
用語「血小板濃厚液(platelet concentrate)」並非是指限制在於血品中的血小板濃厚液，而是廣泛地包含將含有血小板的細胞懸浮液或血液樣品，經過分離材料或過濾材料處理過所得到的濾液。其中，濾液的體積與細胞懸浮液或血液樣品的體積相較，可能變多或變少。
用語「白血球濃厚液(leukocytes concentrate)」是廣泛地包含將含有白血球的細胞懸浮液或血液樣品，經過分離材料或過濾材料處理過，留在分離材料或是過濾材料上的物質經緩衝液、溶劑或其他溶液沖洗後的沖洗液。富有白血球的沖洗液之體積與細胞懸浮液或血液樣品的體積相較，可能變多或變少。
用語「紅血球濃厚液(erythrocyte concentrate)」並非是指限制在於血品中的紅血球濃厚液，而是廣泛地包含將含有紅血球的細胞懸浮液或血液樣品，經過分離材料或過濾材料處理過所得到的濾液。其中，濾液的體積與細胞懸浮液或血液樣品的體積相較，可能變多或變少。
本發明之一實施態樣係為一種聚合物，用於捕捉或分離白血球。聚合物可以作為製造捕捉 或分離白血球的材料，或者藉由設置於其他物質或基材上單獨或共同成為捕捉或分離白血球的材料。
聚合物係利用包含含醯胺基及羥基之單體進行聚合反應後製備而得，例如完全以含醯胺基及羥基之單體進行聚合反應，或是以含醯胺基及羥基之單體及其他化合物進行共同聚合反應。應說明的是，此聚合反應可使用任何適合的材料。適合的材料泛指任何尚未進行聚合反應的化合物，其係用於製造捕捉或分離白血球的聚合物。在一實施例中，聚合反應中可包括含醯胺基及羥基之單體，此含醯胺基及羥基之單體具有式(1)之結構： 在該式(1)中，R1係獨立選自由氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12長碳鏈其中任一及苯環所組成的群組，R2係獨立選自由氫、甲基、乙基、C1至C6長碳鏈其中任一、氨基及苯環所組成的群組，以及n為1至5之整數；以及至少一交聯劑。
在一實施例中，聚合物為共同高分子(copolymer)，其係由該含醯胺基及羥基之單體及至少另一單體共同聚合而成。在一實施例中，聚合物 為鏈段高分子。在一實施例中，聚合物為交聯共聚高分子。在一實施例中，含醯胺基及羥基之單體為N-羥乙基丙烯醯胺(N-Hydroxyethyl acrylamide)或稱為N-(2-羥乙基)丙烯醯胺(N-(2-Hyroxyethyl)acrylamide,HEAA)。舉例來說，含醯胺基及羥基之單體具有式(1)之結構，其中R1為氫，R2為氫，以及n為1，化學結構式如下：
N-羥乙基丙烯醯胺係為同時具有羥基官能基(-OH)和醯胺官能基(-RnC(O)xNR'2，其中R和R'指氫原子或有機基團)的化合物。在一實施例中，聚合物可單純只由N-羥乙基丙烯醯胺單體聚合而成，或是由N-羥乙基丙烯醯胺與其他化合物的經共聚合反應而形成的共聚物。
分離白血球材料中包含N-羥乙基丙烯醯胺單體，對白血球具有高的親和性，可專一性捕抓、吸附、貼附或黏附白血球，且幾乎不會吸附血漿蛋白質及貼附血小板(具體的實驗數據將詳述於後)。藉此，本發明之分離白血球材料即可有效分離白血球。另外，本發明之分離白血球材料可避免活化血小板或凝血，避免增加緩激肽的濃度，而導致輸血時的急性低血壓反應。
在一些實施例中，前述聚合反應中更包含使用交聯劑，例如但不限於使用小於10wt%的交聯劑。交聯劑是用於強化水膠材料的機械性質，與材料的血液相容性無關。交聯劑可與含醯胺基及羥基之單體(例如：N-羥乙基丙烯醯胺單體)混合進行聚合反應。此交聯劑可為單體化合物或聚合物。在一些實施例中，交聯劑為單體化合物時，其係選自由亞甲基雙丙烯醯胺(N,N’-Methylenebisacrylamide,NMBA)及二甲基丙烯酸乙二醇酯(Ethylene glycol dimethacrylate,EGDMA)所組成之群組。在一些實施例中，交聯劑為聚合物時，其係為聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLA-PEG-PLGA,PLA：Polylactic Acid,PEG：Polyethylene glycol,PLGA：poly(lactic acid-co-glycolic acid)或聚乙二醇二丙烯酸酯(Poly(ethylene glycol)diacylate,PEGDA)。在一些實施例中，交聯劑較佳選自NMBA，並於室溫25℃下進行聚合反應。
交聯劑的化學結構式如下：
(A)NMBA
(B)EGDMAC
(C)PEGDA
(D)PLA-PEG-PLGA
在一些實施例中，用於捕捉或分離白血球的聚合物可為水膠材料，例如經過交聯反應的交聯聚合物。在本發明其他一些實施例中，聚合物可為粉體材料，例如經過與其他單體進行共聚反應所形成的鏈段高分子共同聚合物。粉體材料可以溶於醇類溶液中形成液態，再進行塗佈、噴灑或浸漬等應用。有關交聯聚合物以及共同聚合物的具體實例請參考以下說明。
在一些實施例中，前述聚合反應中進一步包含使用起始劑(initiator)或催化劑(catalyst)。舉例來說，前述N-羥乙基丙烯醯胺單體可與起始劑(initiator)或催化劑(catalyst)混合，以加速聚合反 應。在一些實施例中，起始劑為過硫酸銨(ammonium peroxodisulfate,APS)。在一些實施例中，催化劑為四甲基乙二胺(N,N,N,N tetramethylethylenediamine,TEMED)。
在一實施例中，聚合反應完成後用於捕捉或分離的白血球材料，可依所需要的尺寸進行切割或塑型，以成為不同的形狀，例如為膜狀、板狀、塊狀、纖維狀、管狀、珠狀、顆粒狀、或粉狀，以供後續分離或過濾流程的進行。要補充的是，分離或過濾流程可為連續式或是批次式，例如分離白血球材料可為濾膜、濾板；或是充填於管柱中的纖維、顆粒或粉體。
本發明之一實施態樣係為一種用於捕捉或分離白血球的裝置。該裝置包括一外殼以及一本體。該本體可以為膜狀、板狀、塊狀、纖維狀、管狀、珠狀、顆粒狀、或粉狀，且該本體包括一基材以及上述之聚合物。其中基材為構成本體形狀的主要部分，而聚合物是可以透過全部或部分塗佈、噴灑或浸漬之方式設置於基材，例如塗佈於膜形基材的一面或兩面，或基材全部浸漬於聚合物中。透過聚合物，本體具有捕捉或分離白血球的功能，是以，在一些實施例或實施態樣中，本體可以稱之為過濾材料。
本發明之一實施態樣係為一種用於捕捉或分離白血球的裝置，包含外殼以及本體。在一些實施例中，本體包括基材以及設置於基材上的捕捉或分離白血球的聚合物，聚合物具有式(2)之結構： ，其中，n為10至50之整數。在一些 實施例中，聚合物可為水膠材料。在一些實施例中，用於捕捉或分離白血球的裝置可為過濾裝置。
如第2圖所示，係根據本發明的一些實施例，為用於捕捉或分離白血球的過濾器。外殼包含上殼體1及下殼體3，而過濾材料2則位於上殼體1及下殼體3之間。過濾器可為分離白血球的過濾器、血小板減除白血球過濾器、或是紅血球減除白血球過濾器。具體而言，分離白血球的過濾器係用以從一血液樣品中分離白血球。血小板減除白血球過濾器係將含有白血球和血小板的懸浮液樣品通過過濾器，使得白血球和血小板分離，進而達到血小板的高回收率。紅血球減除白血球過濾器則是將含有白血球和紅血球的懸浮液樣品通過過濾器，使得白血球和紅血球分離，進而達到紅血球的高回收率。在 一實施例中，血液樣品包含全血血液樣品、含有白血球及血小板的樣品、含有血漿蛋白質、血小板及白血球的樣品、含有白血球及紅血球的樣品、或其他含有細胞懸浮液的樣品。
輸血前或是血漿製品儲存前，可使用本發明之過濾材料以進行輸血前或是血漿製品儲存前的處理，以將全血、血小板濃厚液或紅血球濃厚液中的白血球濃度減至一定程度(白血球減除)，以避免或減少產生的不良反應，且符合各國法規規定。例如美國血庫協會(American Association of Blood Banks,AABB)規定，每單位血品的白血球含量必須小於5×106，歐洲普遍標準為每單位血品的白血球含量需低於1×106。
過濾材料2中的聚合物可藉由含醯胺基及羥基之單體與交聯劑混合進行聚合反應而得。在一些實施例中，前述用於捕捉或分離白血球的過濾器中，過濾材料2的聚合物具有式(3)之結構： 其中，m為50至90之整數，且R1= ，其中p為2至6之整數，q為1至6之整數，r為1至6之整數，s為1至6之整數。
此處所用的結構符號「」係用於表示 尚未鍵結的狀態。換言之，若一取代基連接此符號泛指此取代基可再行連接其他任何取代基。此處所用的結構符號「*」係用於表示取代基在化學結構中的連接位置。
過濾材料2中聚合物可藉由含醯胺基及羥基之單體與吸附單體混合進行聚合反應而得。在一些實施例中，前述用於捕捉或分離白血球的過濾器中，過濾材料2的聚合物具有式(4)之結構： 其中，t為50至90整數。或
在一些實施例中，過濾材料2可為膜改質基板。舉例來說，將前述具有式(2)、式(3)或式(4)的聚合物塗佈至基材上對基材表面進行改質。在一些實施例中，經改質後的基材表面元素包含碳、氧及氮，且碳、氧及氮之總莫耳百分比定義為100%， 其中碳的莫耳百分比為約76.22%至約79.84%，氧的莫耳百分比為約18.1%至約21.04%，以及氮的莫耳百分比為約2.05%至約2.75%。
本發明之一實施態樣係為一種含醯胺基及羥基之聚合物的用途，其係用於捕捉或分離白血球，含醯胺基及羥基之聚合物包含式(2)之結構： 其中，n為10至50整數。
舉例來說，在一些實施例中，前述含式(2)所示結構之聚合物係由N-羥乙基丙烯醯胺聚合而成。將帶有白血球的樣品通過含N-羥乙基丙烯醯胺的材料，以使得N-羥乙基丙烯醯胺能專一性捕抓、吸附、貼附或黏附白血球。在另一實施例中，分離白血球的用途則是將帶有白血球的樣品與用於捕捉或分離白血球的材料行接觸反應，而接觸方式可為通過(流過)、過濾或批次接觸，接觸後可收集液體，或取出用於捕捉或分離白血球的材料。利用前述含式(2)之聚合物，可使得白血球的捕捉率至少為87%。
本發明之一實施態樣係為一種如前述具有式(1)的含醯胺基及羥基之單體的用途，其係用於 製造捕捉或分離白血球的過濾材料。
在一些實施例中，製造捕捉或分離白血球的過濾材料的步驟包含提供基材，以及將含醯胺基及羥基之單體修飾於基材上。基材可為膜狀、板狀、塊狀、纖維狀、管狀、珠狀、顆粒狀、或粉狀基材。可視分離或過濾流程的用途及需求，而將含醯胺基及羥基之單體修飾至基材表面。舉例而言，N-羥乙基丙烯醯胺單體或N-羥乙基丙烯醯胺單體與其他化合物行聚合反應後可為一塗佈材料，隨後塗佈於基材的表面。要補充的是，後續分離或過濾流程可為連續式或是批次式，例如用於捕捉或分離白血球的過濾材料可為濾膜、濾板或是充填於管柱中的纖維、顆粒或粉體。在一些實施例中，基材為聚丙烯或聚乙烯對苯二甲酸酯。
此外，基材表面修飾的方法可為物理性修飾或化學性修飾。物理性修飾方法包含塗佈(coating)，係藉由物理作用力進行材料表面性質修飾，而塗佈吸附作用力包含凡德瓦力、氫鍵作用力、疏水作用力、靜電作用力等。化學性修飾方法則包含接枝(branching)或蝕刻(etching)，接枝方法為藉由化學鍵結進行材料表面性質修飾，化學接枝方法包含臭氧、紫外線、或電漿起始自由基聚合法。此外，亦可結合塗佈方法與接枝方法進行材料表面性質修飾，可先以塗佈將材料單體或共聚高分子吸附 於基材表面，再以臭氧、紫外線、或電漿處理進行化學接枝。表面修飾方法較佳為塗佈、接枝或其組合。
在一些實施例中，基材表面修飾的方法是採用物理性修飾方法。舉例來說，將含醯胺基及羥基之單體修飾於基材上包含下述步驟。首先，提供約20至約40重量份之含醯胺基及羥基之單體，及提供約60至約80重量份的吸附單體。接著，聚合含醯胺基及羥基之單體及吸附單體而形成共聚物。最後，塗佈此共聚物於基材表面上。在一些實施例中，吸附單體係選自由甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯及其組合所組成的群組。
在一些實施例中，基材表面修飾的方法是採用化學性修飾方法。舉例來說，將含醯胺基及羥基之單體修飾於基材上包含下述步驟。塗佈含醯胺基及羥基之單體於基板上。接著以紫外線處理基板及基板上的含醯胺基及羥基之單體進行接枝反應。應理解的是，額外的操作可用於本實施方式中，且操作可被取代、刪除或其順序可交替使用。在另一實施例中，將含醯胺基及羥基之單體修飾於基材上包含：以紫外線處理基板；以及塗佈含醯胺基及羥基之單體至以紫外線處理過後的基板上進行接枝反應。
為證實本發明實施方式捕捉或分離白血 球的效果，遂進行以下試驗。應注意的是，下述實施例僅提供作為示範目的，而非限制本發明。
實驗方法及材料
一、水膠材料之實驗
1.1 水膠製備之實驗材料
第一類型結構為僅具有羥基官能基(hydroxyl group)單體的丙烯酸羥乙酯(2-Hydroxyethyl acrylate,HEA)及甲基丙烯酸羥乙酯(2-Hdroxyethyl methacrylate,HEMA)，化學結構分別如下：
HEA
HEMA
第二類型結構為僅具有醯胺官能基(amide group)單體的丙烯醯胺(Acrylamide,AAm)及甲基丙烯醯胺(Methacrylamide,MAA)，化學結構分別如下：
AAm
MAA
第三類型結構為同時具有羥基官能基和醯胺官能基的N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺(N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide,HPMA)、N-羥乙基丙烯醯胺(N-Hydroxyethyl acrylamide，或稱N-(2-羥乙基)丙烯醯胺，N-(2-Hyroxyethyl)acrylamide,HEAA)，化學結構分別如下：
HPMA
HEAA
第四類型結構為具有雙離子性之化合物，為[3-(甲基丙烯醯氨基)丙基]二甲基(3-硫代丙基)氫氧化銨([3-(Methacryloylamino)propyl]dimethyl(3-sulfopropyl)ammonium hydroxide,SBAA)，以及[2-(甲基丙烯醯基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氫氧化銨([2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammonium hydroxide,SBMA)，化學結構分別如下：
SBAA
SBMA
過硫酸銨(Ammonium peroxodisulfate,APS)在本試驗中係作為起始劑，具有下列化學結構：(NH4)2S2O8
四甲基乙二胺(N,N,N,N tetramethylethylenediamine,TEMED)在本試驗中係作為催化劑，具有下列化學結構：
在本試驗中所使用的交聯劑為亞甲基雙丙烯醯胺(N,N’-Methylenebisacrylamide,NMBA)，化學結構如前述討論所示，在此不多做贊述。
1.2 水膠材料之製備
1.2.1醯胺官能基水膠
此步驟中提供兩種含醯胺官能基的水膠，即丙烯醯胺(AAm)水膠及甲基丙烯醯胺(MAA)水膠。首先，將AAm及MAA分別溶於去離子水後，分別加入交聯劑NMBA。AAm溶液於冰浴中攪拌10 分鐘，而MAA溶液則於室溫下攪拌10分鐘。待AAm及MAA分別於冰浴中及室溫下與交聯劑NMBA均勻混合後，加入起始劑APS反應10分鐘，再加入催化劑TEMED。接著，以針筒吸取上述混合液分別注入玻璃模具，於室溫進行自由基交聯聚合反應1小時形成親水性水膠。
1.2.2醯胺官能基水膠
此步驟中提供兩種含醯胺官能基的水膠，即丙烯酸羥乙酯(HEA)水膠及甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)水膠。首先，將HEA及HEMA分別溶解於甲醇(methanol)後，分別加入交聯劑NMBA攪拌10分鐘。待HEA及HEMA分別與交聯劑NMBA均勻混合後，加入起始劑APS反應10分鐘，再加入催化劑TEMED。接著，以針筒吸取溶液注入玻璃模具，於室溫進行自由基交聯聚合反應1小時形成親水性水膠。
1.2.3同時具有羥基官能基和醯胺官能基水膠
此步驟中提供兩種同時具有羥基官能基和醯胺官能基的水膠，即N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺(HPMA)水膠及N-羥乙基丙烯醯胺(HEAA)水膠。首先，將HPMA及HEAA分別溶解於去離子水後，分別加入交聯劑NMBA攪拌10分鐘。待HPMA及HEAA分別與交聯劑NMBA均勻混合後，加入起始劑APS反應 10分鐘，再加入催化劑TEMED。接著，以針筒吸取溶液注入玻璃模具，於室溫進行自由基交聯聚合反應1小時形成親水性水膠。
1.2.4雙離子性水膠
此步驟中提供兩種雙離子性水膠，即[3-(甲基丙烯醯氨基)丙基]二甲基(3-硫代丙基)氫氧化銨(SBAA)水膠及[2-(甲基丙烯醯基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氫氧化銨(SBMA)水膠。首先，將SBAA及SBMA分別溶於去離子水後，分別加入交聯劑NMBA攪拌10分鐘。待SBAA及SBMA分別與交聯劑NMBA均勻混合後，加入起始劑APS反應10分鐘，再加入催化劑TEMED，以針筒吸取溶液注入玻璃模具，於室溫進行自由基交聯聚合反應1小時形成雙離子性水膠。
1.3 水合能力(hydration ability)量測
親水性高分子材料於水溶液環境中能夠藉由氫鍵或離子鍵(雙離子性高分子)抓取水中的水分子與水產生水合層，不僅能夠降低材料與生物分子接觸介面上的自由能，亦產生物理上的障礙，使蛋白質無法接近及貼附，可避免蛋白質等生物分子沾黏(參考文獻Morisaku,T.,J.Watanabe,T.Konno,M.Takai and K.Ishihara,：Hydration of phosphorylcholine groups attached to highly swollen polymer hydrogels studied by thermal analysis. Polymer,2008.49(21)：p.4652-4657.Chen,S.,L.Li,C.Zhao and J.Zheng,：Surface hydration：Principles and applications toward low-fouling/nonfouling biomaterials.Polymer,2010.51(23)：p.5283-5293.)。藉由平衡含水率可判斷材料整體的親水程度，平衡含水率愈高表示材料整體愈親水。將水膠分別浸泡於去離子水和磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)中，每30分鐘更換浸泡溶液並重複3次，以確保水膠中的甲醇被置換。隨後，將水膠分別浸泡於去離子水和PBS放置於37℃烘箱24小時，並移除表面多餘水分後秤得濕重(WW)。接著，再將水膠移入新的24孔盤中，放置真空烘箱中，於40℃下抽乾24小時後，秤得乾重(WD)。平衡含水率(Equilibrium water content,EWC)可由下列公式(1)算得：
水合能力的強弱影響親水性高分子材料形成水合層的程度，更間接影響材料抵抗生物分子沾黏或蛋白質吸附的效果。平衡含水率雖可得到巨觀尺度下高分子材料與水分子的關係，但卻無法在微觀尺度下解釋高分子材料與水分子的親和力作用關係，遂進行下述試驗進一步佐證。
1.4 水分子型態之分析
在微觀尺度下水分子與親水高分子結構接觸時會產生三種不同的水分子型態：(1)不凍水(nonfreezable bound water)，不凍水與高分子有強烈的作用力，即使在-100℃仍不會形成冰晶，根據文獻不凍水是主要抵抗生物分子沾黏的主因；(2)結凍水(freezable bound water)，結凍水位於不凍水的外側，結凍水與高分子或不凍水為間歇性作用，使其形成冰晶的溫度低於0℃；(3)流動水(free water)，流動水在結凍水的外側，流動水受到高分子或不凍水的影響非常輕微，甚至不受影響，故如同一般的水會在0℃形成冰晶(參考文獻Higuchi,A.and T.Iijima,：D.s.c.investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid)membranes.Polymer,1985.26(12)：p.1833-1837.Higuchi,A.and T.Iijima,：D.s.c.investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid)membranes.Polymer,1985.26(8)：p.1207-1211.Tanaka,M.and A.Mochizuki,：Effect of water structure on blood compatibility-thermal analysis of water in poly(meth)acrylate.Journal of Biomedical Materials Research Part A,2004.68(4)：p.684-695.)。
藉由微分掃描熱量計(differential scanning calorimetry,DSC)可測量水膠中冰晶融化 的焓變化量(△Hf)以判別各型態水分子，故可進一步鑑定不同水分子型態之間的含量(參考文獻Tanaka,M.and A.Mochizuki,：Effect of water structure on blood compatibility-thermal analysis of water in poly(meth)acrylate.Journal of Biomedical Materials Research Part A,2004.68(4)：p.684-695.)。高分子周圍形成不凍水的比例越高，表示在微觀尺度下有較強的水合能力，形成的水合層較為緻密，應較能抵抗生物分子沾黏或蛋白質吸附(參考文獻Morisaku,T.,J.Watanabe,T.Konno,M.Takai and K.Ishihara,：Hydration of phosphorylcholine groups attached to highly swollen polymer hydrogels studied by thermal analysis.Polymer,2008.49(21)：p.4652-4657.)。
將水膠分別置於去離子水中，每30分鐘更換浸泡溶液並重複3次，以確保水膠中的甲醇被置換。隨後，浸泡於去離子水中1天，並移除表面多餘水分，取3~4毫克水膠於微分掃描熱量計(differential scanning calorimetry,DSC)專用鋁盤中，將DSC溫度範圍及條件設定為由25℃降溫至-40℃後，以每分鐘5℃升溫至40℃。
計算水膠吸熱峰(endothermic peak)曲線下的積分面積為冰晶融化時相變化之吸熱焓變化量(△Hf)，一般冰溶化吸熱焓(△Hw)為333.5J/g。以下 列公式(2)計算結凍水(freezable bound water)的重量百分率(Wfreezable)：
另外，習知平衡含水率是由不凍水和結凍水組成，因此可對應下列公式(3)及公式(4)，而得不凍水的重量百分率(wnonfreezable)：EWC=w nonfreezable +w freezable (3)
w nonfreezable =EWC-w freezable (4)
每單位重量的水膠高分子所含單位重量的不凍水及結凍水，可由下列公式(5)及公式(5)獲得，其中wpolymer為水膠中高分子的重量百分率：
Wnonfreezable係為高分子鏈所能形成不凍水的比例(gH2O/g polymer)。接著可由下列公式轉換成每莫耳高分子重複單元所鍵結不凍水的莫耳數，以無因次群NW表示。Mp是每個高分子重複單元的分子量，Mw是水分子的分子量：
1.5酵素結合免疫吸附(ELISA)
將前述所製備而得的各種水膠分別置於去離子水及PBS中，每30分鐘更換PBS並重複3次，以確保水膠中之甲醇被置換。接著移入24孔盤中(24 well-tissue culture polystyrene plate，即24孔之TCPS盤)再用PBS清洗3次。在每個水膠樣品以及空的TCPS孔位加入1毫升PBS於37℃烘箱浸泡2小時後，移除PBS。
在每個水膠樣品中加入欲測試之目標蛋白質(HSA、γ-globulin及fibrinogen)或血小板稀少血漿(poor platelet plasma,PPP)，其中單一蛋白質濃度為1毫克/毫升(mg/ml)。接著靜置於37℃烘箱30分鐘後，移除欲測試之目標蛋白質(或PPP)，並用PBS清洗3次後移除溶液。
於每個水膠樣品加入1毫升濃度為1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)於37℃烘箱靜置30分鐘，以填補水膠樣品上未吸附目標蛋白質的部分，再用PBS清洗3次，以去除多餘之BSA。
於每個水膠樣品中加入對目標蛋白質具有專一性的第一抗體(1st antibody)，放置於37℃烘箱30分鐘，再以PBS清洗3次後移除溶液。
於每個水膠樣品再加入1毫升濃度為1mg/ml的BSA，於37℃烘箱靜置30分鐘，再以PBS清洗3次後移除溶液。
於每個水膠樣品加入1毫升的第二抗體(2sec antidoby)，其對第一抗體具有專一性只會與第一抗體產生鍵結，放入37℃烘箱30分鐘，再以PBS清洗5次後移除溶液(測試γ-globulin吸附無須此步驟)。
移除PBS之後，將水膠樣品移置新的24孔TCPS盤中，於每個水膠樣品中加入0.5毫升顯色劑3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)，等待6分鐘使其顯色後，再於每個水膠樣品中加入0.5毫升1M的硫酸以終止反應。由每個水膠樣品中(包括TCPS空孔位)吸取200微升溶液於96孔盤中，藉由Bio-tek型號PowerWare XS的微量盤式分析儀(microplate reader)在UV波長450nm下檢視讀值，經回推得知水膠對於蛋白質的吸附程度。
1.6 血細胞貼附測試
將製得的各種水膠分別浸泡於PBS，每30分鐘更換PBS並重複3次，以確保水膠中的甲醇被置換。接著把水膠浸泡在PBS，放置於37℃烘箱1天。移除PBS並於水膠中分別加入1毫升血小板濃厚液與白血球濃厚液，放入37℃烘箱30分鐘。然後以PBS沖洗水膠以去除未貼附的血球。將2.5wt%戊二醛(glutaraldehyde)溶液加入24孔盤中，置於4℃冰箱1天，以固定血球。隔日以Nikon型號A1R的共軛焦雷 射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀察血球貼附情況，並計算單位面積下的血球貼附數量。
二、水膠材料之檢測結果
2.1水膠的平衡含水率分析
如第3圖所示，橫座標為各種不同的水膠，縱座標為平衡含水率(%)。首先，親水性水膠(AAm、MAA、HEA、HEMA、HPMA及HEAA)在去離子水環境下的平衡含水率皆高於在PBS環境下的平衡含水率，這是因為親水性水膠的醯胺官能基或羥基官能基皆能充分與水分子產生氫鍵，而PBS中的鹽類與水分子的離子作用力會和親水性水膠的氫鍵作用力互相競爭，導致親水性水膠在PBS中的平衡含水率普遍低於在去離子水溶液的平衡含水率。其次，雙離子性水膠(SBAA及SMBA)在去離子水環境下的平衡含水率皆低於在PBS環境下的平衡含水率，這是因為雙離子性水膠結構中的正負電荷是依據離子鍵方式抓取水分子，因而能夠抵抗PBS的鹽類離子作用力，而使雙離子水膠在PBS中有較高的平衡含水率。此外，親水性水膠的平衡含水率由低至高依序是羥基官能基水膠(HEA、HEMA)、醯胺官能基水膠(AAm、MAA)以及同時具有羥基官能基和醯胺官能基水膠(HPMA、HEAA)。據此可知，醯胺官能基水膠比羥基官能基水膠更為親水，故若在水 膠包含羥基官能基的情形下，進一步包含醯胺官能基可增加產生氫鍵的位置。因此，HPMA單體水膠和HEAA單體水膠的平衡含水率最高。
2.2水膠的水分子型態分析
如第4圖所示，繪示各種不同水膠中在去離子水中的平衡含水率、不凍水所佔的比例及其無因次群。橫座標為各種不同的水膠，左邊的縱座標為平衡含水率(%)，右邊的縱座標則分別對應至不凍水所佔的比例(gH2O/g polymer)及無因次群Nw。
不凍水含量以Wnonfrezzable表示，在親水性水膠中具有醯胺官能基水膠(AAm、MAA)所鍵結的不凍水含量明顯高於羥基官能基水膠(HEA、HEMA)，由於醯胺官能基是氫鍵受體也是氫鍵予體，對於水分子的結合能力和結合機率高於僅是氫鍵受體的羥基官能基。據此，具有HPMA單體及HEAA單體的水膠由於同時具有羥基官能基和醯胺官能基可提供更多產生氫鍵作用的位置，故能鍵結更多的水分子於高分子鏈周圍，進而形成更致密的水合層。
須說明的是，由於在水膠系統中難以計算其分子量和聚合程度，所以使用無因次群NW，其物理意義為每莫耳高分子重複單元所鍵結不凍水的莫耳數，故NW值越高表示每莫耳單體所形成的不凍水量越多。NW值由高到低是雙離子性水膠(SBAA、 SBMA)、同時具有羥基和醯胺基水膠(HPMA、HEAA)、醯胺基水膠(AAm、MAA)、羥基水膠(HEA、HEMA)。雙離子性水膠的化學結構因具有正負電荷，產生的離子作用力非常強，故雙離子性水膠有良好的親水性及水合能力。然而，具有HPMA單體及具有HEAA單體的水膠於化學結構上具有羥基官能基和醯胺官能基能增加水分子發生氫鍵的位置和機率，故其水膠的水合能力不亞於雙離子性水膠。
2.3水膠與單一血漿蛋白質的吸附
常見的血漿蛋白質係為人類血清白蛋白(human serum albumin,HSA)、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)及纖維蛋白原(fibrinogen)，其中，免疫球蛋白又可分為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而IgG中大多數為γ-globulin。γ-globulin除了與免疫系統息息相關之外，其結構中具有醣基(saccharide residues)會與血小板之酵素醣基轉化酶作引起血小板聚集。因此，本實驗係以HSA、γ-globulin和fibrinogen為目標蛋白質，來觀察水膠對於血漿蛋白質中的目標蛋白質的吸附效果。
本實驗分別配置1mg/ml HSA、γ-globulin和fibrinogen後，以ELISA測試蛋白質吸附，因每次經由ELISA測試相對吸附的蛋白質溶液僅含有一種蛋白質，環境中缺少其他蛋白質在吸附作用的競爭，因此，可顯示出不同水膠材料對於各 種蛋白質的最大吸附量。如第5圖所示，橫座標為各種不同的水膠，縱座標為蛋白質的相對吸附量。羥基官能基水膠(HEA、HEMA)、醯胺官能基水膠(AAm、MAA)、同時具有羥基官能基和醯胺官能基水膠(HPMA、HEAA)及雙離子性水膠(SBAA、SBMA)的血漿蛋白質相對吸附值皆在10%以下。值得注意的是，HEAA單體水膠不論是對HSA、γ-globulin或fibrinogen的吸附量皆相當低，遠小於3%，甚至吸附率趨近於0。
2.4水膠與纖維蛋白原(fibrinogen)及血小板的吸附或貼附實驗
本實驗係使用1mg/ml fibrinogen及1毫升血小板進行吸附實驗，如第6圖所示，橫座標為各種不同的水膠，fibrinogen的相對吸附量對應至左方的縱座標，血小板的細胞密度(cells/mm2)則對應至右方的縱座標。另外，為使數值之間的差異更為清楚地呈現，圖中的小圖係為虛線所示意的部分的放大示意圖。
聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(N,N-dimethylaminoethyl methacrylate,DMAEMA)和偏苯三酸酐(Trimellitic anhydride,TMA)係為二種帶正電荷水膠，對於fibrinogen的吸附量和血小板的貼附量皆相當高，因血小板表面帶負電，故接觸帶正電的DMAEMA水膠和TMA水膠時會因靜電作用 力造成不可逆吸附，吸附大量的血小板。本發明的羥基官能基水膠、醯胺官能基水膠、同時具有羥基官能基和醯胺官能基水膠及雙離子性水膠在fibrinogen的吸附量和血小板的貼附量皆相當低，且遠小於DMAEMA水膠和TMA水膠對fibrinogen和血小板的吸附量。令人值得注意的是，HEAA單體水膠對於fibrinogen的吸附量係小於3%(較佳係小於2%，更佳係小於1%)，而在第6圖中fibrinogen和血小板的貼附量甚至皆趨近於0。由此可知，HEAA單體水膠幾乎不會吸附fibrinogen，進而也幾乎不會貼附血小板，故可減少血小板的活化。血小板活化的減少進而可減少與血液接觸時的凝血反應，故用於回收血小板製程時，甚至可不需添加抗凝血劑。另，習知帶電荷表面的過濾材料容易使得緩激肽濃度增加。利用表面不帶電荷的HEAA單體水膠亦可避免因緩激肽濃度的增加，而導致輸血時的急性低血壓反應。
2.5水膠與白血球的吸附或貼附實驗
本實驗係以白血球濃厚液進行白血球吸附或貼附實驗，且由共軛焦雷射掃描式顯微鏡(CLSM)觀測白血球貼附於水膠表面的螢光訊號並計算白血球的螢光訊號數量。結果如第7圖所示，醯胺官能基水膠(AAm、MAA)和雙離子性水膠(SBAA、SBMA)的白血球貼附量低於其他水膠，羥 基官能基水膠(HEA、HEMA)、同時具有羥基官能基和醯胺官能基水膠中的HEAA單體水膠及帶正電荷水膠(DMAEMA、TMA)則有較多白血球貼附，其中帶正電荷水膠(DMAEMA、TMA)係藉由與白血球之間的靜電作用力，而使白血球大量貼附。令人值得注意的是，同時具有羥基官能基和醯胺官能基水膠的HPMA單體水膠和HEAA單體水膠的白血球貼附量卻具有顯著差異。具體來說，HPMA單體水膠的白血球貼附量非常低，HEAA單體水膠的白血球貼附量卻非常高，甚至高於帶正電荷水膠DMAEMA，顯示HEAA單體水膠對白血球具有極高的親和性。
另外，由前述提及的水合層理論、血漿蛋白質吸附實驗及血小板貼附實驗皆顯示HPMA單體水膠和HEAA單體水膠具有良好的抗生物分子沾黏效果。值得注意的是，HPMA單體水膠並不會貼附白血球，但HEAA單體水膠卻有大量白血球貼附且幾乎不會吸附血漿蛋白質，亦幾乎不會貼附血小板。換言之，利用HEAA單體或/及與其他化合物聚合而成的聚合物，可使得白血球大量貼附於此聚合物上，且不需經由血漿蛋白質及血小板來協助吸附白血球。推測可能是含HEAA之聚合物可直接與白血球的表面有親和性吸附，或者可能是因為有微量的ICAMs分子(intercellular adhesion molecules)吸附於含HEAA之聚合物上，進而協助白血球的親和性吸 附。
三、基材改質之實驗方法
3.1 基材改質之實驗材料
本試驗對基材表面進行改質，進一步驗證本實施方式之捕捉或分離白血球的能力。
實施例之試驗材料為前述同時具有羥基官能基和醯胺官能基N-羥乙基丙烯醯胺(N-Hydroxyethyl acrylamide,HEAA)，具有化學結構如下：
比較例之試驗材料為帶正電荷的聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(N,N-dimethylaminoethyl methacrylate,DMAEMA)，具有化學結構如下：
另外，甲基丙烯酸丁酯(Butyl methacrylate,BMA)及甲基丙烯酸縮水甘油酯(Glycidyl methacrylate,GMA)則是用於待測聚合物中的咬合端，使得待測聚合物能以物理方式吸附於基材表面。BMA及GMA分別具有化學結構如下：
BMA
GMA
4,4'-偶氮雙(4-氰戊酸)(4,4'-Azobis(4-cyanovaleric acid),ACVA)做為起始劑，具有化學結構如下：
基材的材料則為聚丙烯(polypropylene,PP)及聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)。PP及PET分別具有化學結構如下：
PP
PET
3.2 基材改質之高分子製備
以BMA與GMA作為基材咬合端，以HEAA與DMAEMA作為功能作用端，依比例(咬合端約70%，作用端約30%)混合，並加入起始劑ACVA，而溶劑為乙醇。接著，在70℃的環境下進行聚合反應 24小時，製備出BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA、BMA-r-GMA-r-HEAA、BMA-r-GMA-r-DMAEMA高分子。待反應完成後，以去離子水作為析出劑將產物析出並乾燥。
3.3 基材表面改質
選用PP與PET作為欲改質之基材。
3.3.1 物理吸附作用力改質PP基材
分別取BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA、BMA-r-GMA-r-HEAA、BMA-r-GMA-r-DMAEMA高分子，以乙醇為溶劑，配製成高分子溶液。取PP基材，裁剪為合適大小，浸泡於高分子溶液中1分鐘，再以去離子水洗去表面殘餘溶液並乾燥。據此，可分別獲得經BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA、BMA-r-GMA-r-HEAA、BMA-r-GMA-r-DMAEMA塗佈(coating)之表面改質的PP基材。
3.3.2 UV處理方式改質PET基材
取HEAA、DMAEMA單體，以乙醇為溶劑，分別配製成單體溶液。取PET基材，裁剪為合適大小，浸泡於單體溶液中，置於7200W的UV光照下反應2分鐘，再以去離子水洗去表面殘餘溶液並乾燥。據此，可分別獲得經HEAA及DMAEMA單體接枝(grafting)之表面改質的PET基材。
3.4 核磁共振(NMR)之鑑定
將上述高分子各秤取10mg，分別溶於1mL的甲醇(d-MeOH)中，配置為濃度10mg/mL之溶液並裝入NMR試管，送交國立中央大學貴重儀器中心委測。再由圖譜之特徵峰，分析並計算高分子的化學結構與單體比例。
3.5 表面改質密度量測
進行改質前，先將PP、PET基材以微量天平秤量其重量。當表面完成改質後，將基材乾燥後並經由微量天平秤量該表面之重量。經由計算實驗前後之基材的重量差，可得到改質於基材表面的高分子重量。最後經由換算可得每單位面積之高分子重量，即為表面披覆密度。
3.6 X射線光電子能譜分析儀(XPS)之量測
將經由HEAA改質之PP、PET表面利用X射線光電子能譜分析儀(XPS)進行表面組成元素分析。再由圖譜之特徵峰比較各改質表面之氮元素含量。
3.7 血細胞貼附測試
首先將基材浸泡於PBS buffer中半小時。接著，將液體吸乾後，分別取1ml紅血球、白血球及血小板濃厚液覆蓋於基材表面，並置於37℃烘箱中貼附2小時。接著以PBS buffer沖洗基材表面未貼附之血球細胞，浸泡於戊二醛(glutaraldehyde) 中一天進行固定，以共軛焦雷射掃瞄式電子顯微鏡(LSCM)觀察血球細胞於聚丙烯盤表面的貼附情形。
3.8 血液過濾測試
將改質後的基材，裁剪成直徑2.6cm之圓形並堆疊5層，置於壓克力過濾器中鎖緊(類似於第2圖中所例示性的實施例)。取5ml血小板濃厚液進行過濾。接著使用血球計數儀對過濾前、過濾後之血品進行檢驗，計算出白血球移除率以及血小板保留率。
四、基材改質之檢測結果
3.1 核磁共振(NMR)之分析結果
第8圖為各單體、高分子化合物之結構式及其化學位移。另外，如下表一所示，為方便後續說明，在此將高分子化合物如BMA-r-HEAA、BMA-r-DMAEMA、BMA-r-GMA-r-HEAA、BMA-r-GMA-r-DMAEMA各縮寫為B-r-H、B-r-D、B-r-G-r-H、B-r-G-r-D。第9圖為各單體及高分子結構之NMR圖譜。經核磁共振分析後，HEAA之特徵峰主要體現於a處，DMAEMA之特徵峰主要體現於b處。藉由核磁共振之圖譜可得知本試驗所用的高分子化合物已成功進行合成。
表一
3.2 PP、PET基材披覆密度量測結果
如第10圖所示，為各種高分子化合物的披覆密度結果圖。PP膜係為塗佈高分子化合物B-r-H、B-r-D、B-r-G-r-H及B-r-G-r-D之PP基材。PET膜係為單體接枝HEAA及DMAEMA之PET基材。藉由對改質前後的基材重量進行秤量，並量測基材之表面積，可算得基材表面之各高分子披覆密度，介於約0.1至約0.25mg/cm2。
3.3 X射線光電子能譜分析儀(XPS)之量測結果
經改質後之基材表面可利用X射線光電子能譜分析儀進行表面元素分析，從氮元素的分析可看出改質前後之差異。如第11圖所示，為基材上表面之氮元素的分析圖譜。PP控制組及PET控制組皆為未經改質的PP基材及PET基材。HEAA改質前後之表面元素的比例詳細彙整於下表二中。參照第11圖及下表二可知，未經改質之PP基材表面並無氮之訊號產生。反之，經HEAA單體或高分子改質之PET、PP基材表面氮元素比例均明顯升高，且在 399~402eV位置均出現氮元素之特徵峰。
3.4 血細胞貼附測試結果
第12圖至第15圖為PP及PET基材表面改質前後的血液細胞貼附影像及其計數。
首先請參照第12圖及第13圖，為PP基材經物理性塗佈改質後其血液細胞貼附的結果圖。第12圖中可明顯看出含HEAA之PP基材(PP B-r-H及PP B-r-G-r-H)上的血小板血漿及紅血球細胞影像較淺，意即較不易貼附血小板血漿及紅血球細胞。除此之外，含B-r-H之PP基材上的白血球細胞影像明顯較深，意即較易貼附白血球細胞。第13圖中，上圖為白血球貼附量的結果圖，下圖為紅血球貼附量的結果圖。由此可知，含有含HEAA之PP基材含HEAA之PP基材表面可以有效捕捉白血球，並且血小板與紅血球之貼附量較低。而含DMAEMA之PP基材(PP B-r-D及PP B-r-G-r-D)表面不僅會捕捉白血球，其血小板與紅血球之貼附量亦相對較高。
請繼續參照第14圖及第15圖，為PET基材 經化學性接枝改質後其血液細胞貼附的結果圖。第14圖中可明顯看出接枝HEAA之PET基材(PET HEAA(UV))上的血小板血漿及紅血球細胞影像較淺，意即較不易貼附血小板血漿及紅血球細胞。除此之外，接枝HEAA之PET基材上的白血球細胞影像明顯較深，意即較易貼附白血球細胞。第14圖中，上圖為白血球貼附量的結果圖，下圖為紅血球貼附量的結果圖。由此可知，經UV處理過後，接枝HEAA的PET基材表面具有捕捉白血球之能力，同時可以降低血小板與紅血球之貼附量。反之，3種血液細胞均會貼附於接枝DMAEMA之PET基材表面。
除此之外，在血細胞貼附試驗中，紅血球濃厚液中實際上仍含有微量白血球，而在前述第12圖及第14圖的貼附影像中，含HEAA之基材仍能在充滿紅血球濃厚液體中捕捉其中的微量白血球。顯示經HEAA改質之基材表面對於白血球捕捉具有專一性。
3.5 血液過濾測試結果
如前述試驗方法中所提之血液過濾測試，利用改質後的基材對血小板濃厚液進行過濾。經由血球計數儀檢測後可得知過濾前與過濾後之血品中各種血液細胞含量，依此計算出白血球移除率與血小板保留率。
如下表三所示，WBC係為白血球(White blood cell)，PLT係指血小板(Platelet)。根據表三可知經HEAA改質後之基材對白血球的捕捉率至少達到87%，並且能保留86%以上之血小板。意即，血小板濃厚液(含有白血球之血小板濃厚液)流經改質後之基材時，大部分白血球會貼附於基材上，剩下的濾液中能保留大部分的血小板。據此，本發明之實施例對於白血球捕捉有極高的專一性(不會造成紅血球與血小板的捕捉或貼附)，是作為血小板濃厚液減除白血球的良好材料。當然，在其他實施態樣中，亦可以使用例如全血血液樣品通過上述基材，再通過去除紅血球之技術，直接製備血小板濃厚液。
相對於使用B-r-D、B-r-G-r-D以及DMAEMA等聚合物進行改質的習知捕捉、分離或過濾白血球的方式而言，不僅是白血球捕捉率提高，更重要的是同時維持極高的血小板保留率，是故明顯可知，透過B-r-H、B-r-G-r-H以及HEAA係透過不同於過去的作用機轉來達成功效。
前文概述數個實施例之特徵以使得熟習該項技術者可更好地理解本揭露之態樣。熟習該項技術者應瞭解，可容易地將本揭露內容用作設計或修改用於實現相同目的及/或達成本文引入之實施例的相同優點之其他製程及結構之基礎。熟習該項技術者亦應認識到，此類等效物構造不違背本揭露內容之精神及範疇，且可在不違背本揭露內容之精神及範疇之情況下於此作出各種變化、替代以及變更。

Claims (32)

  1. 一種聚合物，用於捕捉或分離白血球，該聚合物係以包含一含醯胺基及羥基之單體進行聚合反應製備而得，其中該含醯胺基及羥基之單體具有式(1)之結構：
    Figure TWI661864B_C0001
    在該式(1)中，R1係獨立選自由氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12長碳鏈其中任一及苯環組成的群組，R2係獨立選自由氫、甲基、乙基、C1至C6長碳鏈其中任一、氨基及苯環所組成的群組，以及n為1至5之整數；其中，該聚合物具有所述醯胺基及所述羥基。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之聚合物，其中R1為氫，R2為氫，以及n為1。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之聚合物，其中該含醯胺基及羥基之單體為N-羥乙基丙烯醯胺((N-Hydroxyethyl acrylamide)，或N-(2-羥乙基)丙烯醯胺(N-(2-Hyroxyethyl)acrylamide)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之聚合物係為共同高分子(copolymer)，其係由該含醯胺基及羥基之單體及至少另一單體共同聚合而成。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之聚合物，其中該另一單體係甲基丙烯酸甲酯(Butyl methacrylate,BMA)或甲基丙烯酸縮水甘油酯(Glycidyl methacrylate,GMA)。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之聚合物係為鏈段高分子。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之聚合物係為交聯共聚高分子。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之聚合物，其中聚合反應包含使用一交聯劑，且該交聯劑具有雙丙烯酸酯之官能基。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之聚合物，其中該交聯劑係亞甲基雙丙烯醯胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸共聚物或聚乙二醇二丙烯酸酯。
  10. 一種用於捕捉或分離白血球的裝置，包含：一外殼；以及一本體，其中該本體包含一聚合物，該聚合物包含式(2)之結構：
    Figure TWI661864B_C0002
    其中，n為10至50之整數。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用於捕捉或分離白血球的裝置，其中該聚合物具有式(3)之結構：
    Figure TWI661864B_C0003
    其中，m為50至90之整數，且R1=
    Figure TWI661864B_C0004
    ，其中p為2至6之整數，q為1至6之整數，r為1至6之整數，s為1至6之整數。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之用於捕捉或分離白血球的裝置，其中該聚合物具有式(4)之結構：
    Figure TWI661864B_C0005
    其中，t為50至90之整數，R2=
    Figure TWI661864B_C0006
    或
    Figure TWI661864B_C0007
  13. 如申請專利範圍第10項所述之裝置，其中該本體包括一基材，該聚合物係塗佈(coating)、噴灑或浸漬的方式設置於該基材。
  14. 如申請專利範圍第10項所述之裝置，其中該本體包括一基材，該聚合物係以錨定(anchoring)之方式固定於該基材。
  15. 如申請專利範圍第10項所述之裝置，其中該本體的表面元素包含碳、氧及氮，且碳、氧及氮之總莫耳百分比定義為100mol%，碳的莫耳百分比為約76.22%至約79.84%，氧的莫耳百分比為約18.1%至約21.04%，以及氮的莫耳百分比為約2.05%至約2.75%。
  16. 一種含醯胺基及羥基之聚合物的用途，其係用於捕捉或分離白血球，該含醯胺基及羥基之聚合物包含式(2)之結構：
    Figure TWI661864B_C0008
    其中，n為10至50之整數。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之含醯胺基及羥基之聚合物的用途，其中白血球的捕捉率不低於70%。
  18. 如申請專利範圍第16項所述之含醯胺基及羥基之聚合物的用途，其中血小板的保留率不低於85%。
  19. 一種含醯胺基及羥基之單體的用途，其係用於形成捕捉或分離白血球的材料，該含醯胺基及羥基之單體具有式(1)之結構：
    Figure TWI661864B_C0009
    在該式(1)中，R1係獨立選自由氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12長碳鏈其中任一及苯環組成的群組，R2係獨立選自由氫、甲基、乙基、C1至C6長碳鏈其中任一、氨基及苯環所組成的群組，以及n為1至5之整數；其中，該單體以所述醯胺基及所述羥基捕捉或分離白血球。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之用途，其中形成捕捉或分離白血球的材料的步驟包含：提供一基材；以及將該含醯胺基及羥基之單體修飾於該基材上。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之用途，其中將該含醯胺基及羥基之單體修飾於該基材上包含：提供該含醯胺基及羥基之單體；提供至少一錨定單體(anchoring unit)；聚合該含醯胺基及羥基之單體及該錨定單體形成一共聚物；以及透過該錨定單體錨定該共聚物於該基材上。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之用途，其中該含醯胺基及羥基之單體佔該共聚物之重量百分比為約百分之20至約百分之40。
  23. 如申請專利範圍第21項所述之用途，其中該錨定單體佔該共聚物之重量百分比為約百分之60至約百分之80。
  24. 如申請專利範圍第21項所述之用途，其中該錨定單體係選自由甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯及其組合所組成的群組。
  25. 如申請專利範圍第20項所述之用途，其中將該含醯胺基及羥基之單體修飾於該基材上包含：塗佈該含醯胺基及羥基之單體於該基板上；以及以紫外線處理該基板及該基板上的該含醯胺基及羥基之單體。
  26. 一種白血球濃厚液的製備方法，包含：提供如申請專利範圍第10項所述之裝置；提供一血液樣品，其中該血液樣品包含白血球及血小板；將該血液樣品通過該裝置，使得白血球被捕捉於該裝置中或自該血液樣品中被分離至該裝置中；以及脫附被捕捉或分離出來的白血球。
  27. 一種紅血球濃厚液的製備方法，包含：提供如申請專利範圍第10項所述之裝置；提供一血液樣品，其中該血液樣品包含紅血球、白血球及血小板；將該血液樣品通過該裝置而獲得一濾液，其中白血球被捕捉於該裝置中或自該血液樣品中被分離出來；以及處理該濾液為該紅血球濃厚液。
  28. 一種血漿製品儲存前之處理方法，包含：提供如申請專利範圍第10項所述之裝置；提供一血液樣品，其中該血液樣品包含血漿及白血球；以及將該血液樣品通過該裝置而獲得一濾液，其中白血球於該裝置中被捕捉或自該血液樣品中分離出來。
  29. 一種去除全血血液中白血球的方法，包含：提供如申請專利範圍第10項所述之裝置；提供一全血血液樣品，其中該全血血液樣品包含紅血球、白血球及血小板；將該全血血液樣品通過該裝置而獲得一濾液，其中白血球被專一性地捕捉於該裝置中。
  30. 一種血小板濃厚液的製備方法，包含：提供如申請專利範圍第10項所述之裝置；提供一血液樣品，其中該血液樣品包含白血球及血小板；將該血液樣品通過該裝置而獲得一濾液，其中白血球被捕捉於該裝置中或自該血液樣品中分離出來；以及處理該濾液為該血小板濃厚液。
  31. 一種聚合物，用於捕捉或分離白血球，該聚合物是以包含一含醯胺基及羥基的單體進行聚合反應製備而得，其中該含醯胺基及羥基的單體具有式(1)的結構：
    Figure TWI661864B_C0010
    在式(1)中，R1是獨立選自由氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12長碳鏈其中任一及苯環組成的群組，R2是獨立選自由氫、甲基、乙基、C1至C6長碳鏈其中任一、氨基及苯環所組成的群組，以及n為1至5的整數，其中該聚合物的重複單元具有該醯胺基及該羥基。
  32. 一種聚合物的用途，用於捕捉或分離白血球，該聚合物是以包含一含醯胺基及羥基的單體進行聚合反應製備而得，其中該含醯胺基及羥基的單體具有式(1)的結構：
    Figure TWI661864B_C0011
    在式(1)中，R1是獨立選自由氫、甲基、乙基、羥基、C1至C12長碳鏈其中任一及苯環組成的群組，R2是獨立選自由氫、甲基、乙基、C1至C6長碳鏈其中任一、氨基及苯環所組成的群組，以及n為1至5的整數，其中該聚合物的重複單元具有該醯胺基及該羥基。
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