TWI615470B - 癌抗原特異性t細胞之受體基因及由該基因所編碼之肽以及該等之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供抗WT1蛋白質之WT1特異性細胞傷害性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)基因的CDR3區域的核苷酸序列及胺基酸序列。本發明亦提供使用該等核苷酸序列、胺基酸序列之癌檢查或癌治療之方法,含有該等核苷酸序列、胺基酸序列之用於癌檢查之晶片、引子組、套組、裝置等。
Description
本發明係有關含於癌抗原特異性T細胞受體基因之多核苷酸、由該基因所編碼之肽及使用該等之癌檢查(診斷、預後、治療監控等)或癌治療等。
癌治療有經由手術切除、放射線治療、經由抗癌劑之治療及免疫療法。其中,免疫療法由於對於癌之選擇性、特異性高,幾乎無副作用,近年來廣受注目。其中,盛行嚐試將豐富存在於多數癌細胞或白血病細胞之WT1蛋白質作為標的之癌或白血病之治療。研究該等將WT1作為標的之抗癌治療之機制,再者為了提高治療效果,需鑑定WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)基因的核苷酸序列及由該基因所編碼之受體肽的胺基酸序列。惟,至今不論進行幾個研究(參照非專利文獻1至5等),對於相關之受體基因及受體肽的序列幾乎都不知。況且對於將該等有效利用均無記載。
[非專利文獻1] Valmori D.et al., J.Immunol.168:4231-4240,2002
[非專利文獻2] Dietrich PY.et al., Cancer Res.61:2047-2054,2001
[非專利文獻3] Coulie PG.et al., Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.98:10290-10295,2001
[非專利文獻4] Godelaine D.et al., J.Immunol.171:4893-4897,2003
[非專利文獻5] Mandruzzato S.et al., J.Immunol, 169:4017-4024,2002
本發明之課題為解明對於WT1蛋白質之WT1特異性細胞傷害性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)的胺基酸序列及編碼該等序列之基因核苷酸序列,尤其是其CDR3區域的胺基酸序列及核苷酸序列,並將該等利用於癌檢查(診斷、預後、治療監控等)或癌治療。
本發明人等為了解決上述課題,經過不斷深入研究,首次決定健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)V β鏈之CDR3的核苷酸序列及胺基酸序列,因而完成本發明。
亦即,本發明提供以下者。
(1)為具有將WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T
細胞受體(TCR)V β鏈之CDR3編碼的核苷酸序列之多核苷酸,具有序列編號:1至1695表示之任一CDR3核苷酸序列的DNA、其互補的RNA或具有該等之互補序列的多核苷酸;(2)包含由包含序列編號:1至1695表示之任一CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA或該等之互補序列所成之(1)記載的多核苷酸;(3)為具有WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)V β鏈之CDR3胺基酸序列的肽,具有序列編號:1696至3389表示之任一CDR3胺基酸序列的肽;(4)包含序列編號:1696至3389表示之任一CDR3胺基酸序列之(3)記載的肽;(5)(1)或(2)記載的多核苷酸、(3)或(4)記載的肽作為癌標記(cancer marker)之用途;(6)以研究在治療前從HLA-A*2402陽性患者獲得之樣品中具有(1)或(2)記載之任一多核苷酸、(3)或(4)記載之任一肽之WT1特異性CTL同源叢生性(clonality)為特徵之癌診斷方法,該同源叢生性存在有複數WT1特異性CTL時,即判定該患者有罹癌之可能性之方法;(7)治療前之患者具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽之具有3以上同源叢生性之WT1特異性CTL之同源叢生性越大或具有3以上同源叢生性之WT1特異性CTL之種類越多,即判定該患者罹癌之可能性高之(6)記載的方法;
(8)以研究在治療前從HLA-A*2402陽性患者獲得之樣品中具有(1)或(2)記載之任一多核苷酸、(3)或(4)記載之任一肽之WT1特異性CTL之種類及同源叢生性為特徵,研究患者對於WT1肽免疫療法感受性之方法,該患者之同源叢生性為複數之WT1特異性CTL種類相較於對WT1肽免疫療法無反應者為多時,判定該患者對於WT1肽免疫療法具感受性之方法;(9)治療前患者之同源叢生性為複數之WT1特異性CTL純株種類越多或同源叢生性越大,則判定該患者對於WT1肽免疫療法感受性高之(8)記載的判定方法;(10)以研究在WT1肽免疫療法之前後,從HLA-A*2402陽性患者獲得之樣品中具有(1)或(2)記載之任一多核苷酸、(3)或(4)記載之任一肽之WT1特異性CTL純株之同源叢生性為特徵,對該患者之WT1肽免疫療法之監控方法,關於任一純株,在WT1肽免疫療法後相較於WT1肽免疫法前,該WT1特異性CTL之同源叢生性增加時,判定該患者對於WT1肽免疫療法有反應之判定方法;(11)在WT1肽免疫療法後,同源叢生性增加之比例越大或同源叢生性增加之純株種類越多,判定對於WT1肽免疫療法反應性高之(10)記載的判定方法;(12)抗(3)或(4)記載的肽之抗體;(13)含有(1)或(2)記載的多核苷酸、(3)或(4)記載的肽或(12)記載的抗體之晶片;(14)具有自序列編號:3391至3418表示之序列選出之
序列的CDR3多肽擴增用引子;(15)包含用於檢出具有(1)或(2)記載的多核苷酸、(3)或(4)記載的肽之WT1特異性CTL之手段的癌診斷套組、用於研究癌患者對於WT1肽免疫療法感受性之套組或WT1肽免疫療法監控用套組;(16)包含用於檢出具有(1)或(2)記載的多核苷酸、(3)或(4)記載的肽之WT1特異性CTL之手段的癌診斷裝置、用於研究癌患者對於WT1肽免疫療法感受性之裝置或WT1肽免疫療法之監控用裝置;(17)含有(13)記載的晶片或(14)記載的引子之(15)記載的套組;(18)使用(13)記載的晶片或(14)記載的引子之(16)記載的裝置;(19)導入含有(1)或(2)記載的多核苷酸序列之T細胞受體基因之HLA-A*2402陽性癌患者之淋巴球。
本發明亦提供使用導入含有CDR3多核苷酸之T細胞受體基因之HLA-A*2402陽性癌患者之淋巴球之癌治療。
本發明另提供抗CDR3肽之抗體及該抗體之用途。
根據本發明,明瞭WT1特異性CTL之TCR V β鏈基因中含有之核苷酸序列及由該等所編碼之肽之胺基酸序列,詳細而言,明瞭CDR3之核苷酸序列及胺基酸序列,使用該等多核苷酸或肽,可進行廣範圍之癌檢查(診斷、預後、治療監控等)、癌治療等。
第1-1圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-2圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-3圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-4圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-5圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-6圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-7圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-8圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-9圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-10圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-11圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-12圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-13圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-14圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-15圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表
示核苷酸序列各部分之由來。
第1-16圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-17圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-18圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-19圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-20圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-21圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-22圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-23圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-24圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-25圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-26圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-27圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-28圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-29圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-30圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-31圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-32圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-33圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第1-34圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-35圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸序列各部分之由來。
第1-36圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3核苷酸序列及胺基酸序列。圖中clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。Vname、Jname及Dname表示V區、J區及D區為何者。核苷酸序列上面之V-REGION…N1…D-REGION…(P)N2…J-REGION表示核苷酸
序列各部分之由來。
第2-1圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-2圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-3圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*
2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-4圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-5圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字
為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-6圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-7圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表
示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-8圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-9圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes
表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-10圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-11圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,
42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-12圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-13圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-14圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-15圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-16圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-
A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-17圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-18圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數
字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-19圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-20圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS
表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-21圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-22圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,
nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-23圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-24圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,
42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-25圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-26圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-27圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-28圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-29圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各
別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-30圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-31圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數
字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-32圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-33圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS
表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-34圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-35圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,
nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
第2-36圖係表示在本發明鑑定之健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)各別純株之同源叢生性。clone#為純株編號,黑點左邊之數字為V β鏈之家族編號,黑點右邊之數字為項目編號。HV表示健康正常人,AML表示急性骨髓性白血病患者,MDS表示骨髓異形成症候群患者。該等簡稱所附帶的數字為健康正常人編號及患者編號。Res表示對治療有反應者,nonRes表示對於治療無反應者。Pre表示治療前,4w表示治療第4週,8w表示治療第8週,12w表示治療第12週,42w表示治療第42週。Phase1表示臨床試驗第1期。PB(pre)表示治療前之末梢血。BM(pre)表示治療前之骨髓。
本發明人等用由WT1肽/HLA-A*2402之複合體所成之WT1四聚體(tetramer)將癌患者之末梢血淋巴球染色,用FACS將WT1四聚體陽性細胞1個1個分離,從各細胞作成cDNA,藉由適用PCR法,而決定WT1特異性細胞障礙性T細胞(以下亦稱為「WT1特異性CTL」)之T細胞受體(以下亦稱為「TCR」)V β鏈中含有之CDR3所編碼之核苷酸序列(第1-1圖至第1-36圖)。從該等結果亦決定該CDR3之胺基酸序列(第1-1圖至第1-36圖、序列編號:1696至
3389)。根據本發明,首次鑑定該等序列。
本發明之第1態樣為提供具有將健康正常人及HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)V β鏈之CDR3編碼的核苷酸序列之多核苷酸,具有序列編號:1至1695表示之任一CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA或具有該等之互補序列之多核苷酸。於本說明書將該等之DNA、RNA或該等之互補多核苷酸歸納稱為「CDR3多核苷酸」。例如CDR3多核苷酸不僅只含由序列編號:1至1695表示之核苷酸序列組成之DNA,亦包括含有該等序列之DNA。又,例如CDR3多核苷酸不僅包含與由序列編號:1至1695表示之核苷酸序列組成之DNA為互補之RNA,亦包括含有該等序列之RNA。另,例如CDR3多核苷酸亦包括具有上述DNA或RNA及RNA互補序列之多核苷酸。「CDR多核苷酸」亦包括具有編碼「CDR3肽」之縮聚序列者。
本發明之另一態樣為提供具有WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)V β鏈之CDR3之胺基酸序列之肽,係具有序列編號:1696至3389表示之任一CDR3胺基酸序列之肽。於本說明書中將該等肽歸納稱為「CDR3肽」。例如CDR3肽不僅包含由序列編號:1696至3389表示之任一CDR3胺基酸序列組成之肽,亦包括含有該等CDR3胺基酸序列之肽(例如V β鏈肽或其一部分等)。又,由序列編號:1696至3389表示之胺基酸序列中,有1個至數個,較好1個至3個、1個至2個或1個胺基酸係經
取代、附加、缺失之胺基酸序列組成者,或含有該等胺基酸序列之肽亦包含於「CDR3肽」。惟,該等肽之條件為具有與原本之肽同等機能。該等CDR3肽為經由上述CDR3多核苷酸編碼者。
CDR3為富有最多樣性之區域,係抗原辨識的特異性最強關連的部分。本發明之CDR3多核苷酸序列及本發明之CDR3肽序列認為在HLA-A*2402陽性患者之WT1特異性CTL具有特有的序列。所以,只要是某一T細胞TCR之V β鏈基因之CDR3區域編碼之多核苷酸或該CDR3區域之肽具有本發明之多核苷酸或本發明之肽之序列,該T細胞則有WT1特異性。本發明之CDR3多核苷酸及CDR3肽作為廣範圍癌之標記,可用於癌之診斷、該患者對於WT1肽免疫療法之感受性之診斷、該患者對於WT1肽免疫療法之反應性之檢查等。
本發明之CDR3多核苷酸及CDR3肽,只要是起因於具有WT1之細胞之癌,在不論何種癌患者之淋巴球亦會出現。已知WT1在多種癌或血液惡性腫瘤中成為癌抗原。因此,本發明之CDR3多核苷酸及CDR3肽及以下說明之本發明之方法幾乎可適用於所有種類之癌,可適用於例如急性骨膸性白血病、急性淋巴性白血病、惡性淋巴腫、多發性骨髓腫、慢性骨髓性白血病、骨髓異形成症候群、同種造血幹細胞移殖後復發等血液惡性疾病;舌癌、齒齦癌、口腔底癌、咽喉癌、喉頭癌、唾液腺癌、甲狀腺癌等實體癌;乳癌、肺癌、胸腺癌等胸部癌;大腸癌、小腸癌、胃
癌、胰臟癌、肝癌、膽管癌、消化器內分泌腫瘤、消化道類癌瘤等消化器官癌;腎癌、尿道上皮癌、胚細胞腫、病毒腫瘤、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮肉腫、卵巢惡性腫瘤等尿道生殖器系癌;骨原發性惡性腫瘤(骨肉腫、Ewing肉腫等)、軟部肉腫等肌‧骨骼系之惡性腫瘤;其他之皮膚癌、神經芽細胞腫、惡性神經膠母細胞瘤(glioblastoma)、中樞神經原發惡性淋巴腫、髓芽腫.PNET等,惟,不僅限於該等癌或腫瘤。
製造CDR3多核苷酸或CDR3肽時可使用一般之基因工學手法及/或化學合成法。例如可將CDR3多核苷酸從細胞分離,亦可化學合成。CDR3多核苷酸可經PCR法等公知之方法擴增。又,例如將CDR3多核苷酸(可經公知之方法擴增至適當量)放入適當之載體(vector),導入適當之細胞中或經由基因槍或電穿孔(Electroporation)等導入適當之細胞中,接著,培養經導入CDR3多核苷酸之細胞,經由表現可獲得CDR3多核苷酸及CDR3肽。可使用之載體或細胞、基因導入條件、培養條件、基因或肽之分離方法等對業者為公知,可適當選擇使用。為了製造CDR3多核苷酸或CDR3肽,亦可使用化學合成法。該等化學合成法為公知,基因之化學合成法為根據阿米代德(Amidite)法之DNA固相合成或1.4膦酸鹽(phosphonate)法,肽之化學合成法為Fmoc法等。
本發明之另一態樣為提供以研究在從治療前之HLA-A*2402陽性患者獲得之樣品中具有任一CDR3多核苷酸或
任一CDR3肽之WT1特異性CTL之同源叢生性為特徵之在該患者之癌診斷方法,該同源叢生性以複數存在時,判定該患者有罹患癌之可能性之方法。本說明書之「同源叢生性」係指檢出具有同一核苷酸序列或胺基酸序列之細胞之頻率。為了研究同源叢生性,通常使用可將細胞1個1個識別之細胞分類機(cell sorter)。「患者」包括懷疑罹癌之人或已罹癌之人。
本發明人發現經由研究患者具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽之WT1特異性CTL之同源叢生性,可判定該患者是否罹患癌症。如第2-1圖至第2-36圖所示,在健康正常人(HV1至HV4),對於具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽之WT1特異性CTL之同源叢生性,相關於純株者大部分為1,少見到2或3者,相對地,在治療前之所有癌患者(AML(急性骨髓性白血病)為1至4、MDS(骨髓異形成症候群)為1至5),具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽之WT1特異性CTL之同源叢生性必定以複數存在,該同源叢生性數及該等細胞之種類亦比健康正常人多。在治療前患者之同源叢生性增加或同源叢生性為複數之細胞種類增加,則表示患者對於癌細胞之防禦‧攻擊有開始之可能性。
根據該等情況研究被驗者樣品時,只要具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽之WT1特異性CTL中同源叢生性以複數存在者,可判定該被驗者有罹癌之可能性。在治療前之被驗者具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽之
WT1特異性CTL之同源叢生性越大,或具有複數同源叢生性之WT1特異性CTL之種類越多,則可判定被驗者罹癌之可能性高。在上述判定方法,治療前患者具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽具有3以上之同源叢生性之WT1特異性CTL之同源叢生性越大,或具有3以上之同源叢生性之WT1特異性CTL之種類越多,亦可判定患者罹癌之可能性高。
本發明之另一態樣為提供以研究治療前從HLA-A*2402陽性患者獲得之樣品中,具有申請專利範圍第1項之任一CDR3多核苷酸或申請專利範圍第2項之任一肽之WT1特異性CTL純株之種類數及同源叢生性為特徵之患者對於WT1肽免疫療法之感受性之方法,該患者之同源叢生性為複數之WT1特異性CTL純株之種類相較對於WT1肽免疫療法無反應者多時,判定該患者對於WT1肽免疫療法有感受性之方法。
對抗患者之癌細胞,具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽之WT1特異性CTL產生作用。此時在治療前所有同源叢生性為複數之純株經由WT1免疫療法,同源叢生性更增加或有維持該同源叢生性之傾向。又,儘可能多種類純株存在者,全體之有效之WT1特異性CTL純株數及種類增加,認為WT1免疫療法成功之可能性高。更嚴格而言,患者之同源叢生性為複數之WT1特異性CTL純株種類相較於無反應者為多時,可判定患者對於WT1肽免疫療法之感受性高。
如第2-1圖至第2-36圖所示,在對於WT1肽免疫療法有反應之AML患者,治療前之同源叢生性為複數之純株種類數相較於健康正常人及無反應者為多。AML1(有反應者):10種(該等之同源叢生性合計58)、AML2(有反應者):12種(該等之同源叢生性合計93)、AML3(無反應者):9種(該等之同源叢生性合計27)、AML4(無反應者):3種(該等之同源叢生性合計10)。又,在健康正常人HV1至5,同源叢生性為複數之純株種類在0至2種之範圍。
本發明之另一態樣為提供以研究在WT1肽免疫療法之前後,從HLA-A*2402陽性患者獲得之樣品中,具有申請專利範圍第1項之任一多核苷酸或申請專利範圍第2項之任一肽之WT1特異性CTL純株之同源叢生性為特徵之在該患者之WT1肽免疫療法之監控方法,關於任一純株,該WT1特異性CTL純株之同源叢生性,WT1肽免疫療法後相較WT1肽免疫療法前為增加時,判定該患者對於WT1肽免疫療法有反應之方法。
如第2-1圖至第2-36圖所示,在AML患者,WT1肽免疫療法期間同源叢生性增加(包含同源叢生性為0至1以上者)之WT1特異性CTL。相關舉動表示之典型例列舉AML(Pt1)中之純株(clone)編號#02.28、#05.034、#05.135、#05.219、#09.65、#12.04、#13.13、#27.016、#28.83等及在AML(Pt2)中之純株#02.27、#05.035、#05.141、#05.219、#06.009、#12.04、#12.20、#15.44、#20.068、#27.032等。經由WT1肽免疫療法,同源叢生性增加之純株存在表示對
於WT1肽免疫療法有反應。亦即,認為同源叢生性增加表示WT1肽免疫療法在一定期間奏效。該等同源叢生性之增加可為暫時性增加,亦可為持續性增加。某一純株之同源叢生性暫時性增加,即使之後減少,其他之WT1特異性CTL之同源叢生性增加,填補其效果。對於癌細胞之效果,則同源叢生性增加之比例越大越佳。在WT1肽免疫療法後同源叢生性增加之比例越大,或同源叢生性增加之純株之種類越多,則可判定對於WT1肽免疫療法之反應性高。對應癌的種類、部位等,使用適當之方法可研究癌細胞數或性質。
上述治療監控方法為在WT1肽免疫療法之前後比較同源叢生性,該前後之時間間隔可為任意。例如可為數日、1星期、2星期、3星期、4星期、2個月、3個月或3個月以上。
在以上說明之本發明之方法中,研究同源叢生性之手段.方法、研究純株種類(亦即,決定CDR3肽之胺基酸序列或編碼該序列之核苷酸序列)之手段.方法為業者公知,業者可適當地進行該等操作。例如本說明書實施例所示,可使用FACSAria裝置等公知之分類裝置及例如PCR法等公知之基因擴增方法(例如使用表1記載者作為引子組合)等。為了使本發明之CDR3多核苷酸或CDR肽之解析更嚴密或更確定地進行,只要確認V β鏈基因中之CDR3多核苷酸序列、IMGT、J區域及D區域是否為第1-1圖至第1-36圖所示者即可,相關之確認可為業者通常進行者。
WT1肽免疫療法亦為公知。例如對於HLA-A*2402陽性患者,可根據將HLA-A*2402拘束性WT1肽天然型(胺基酸序列:CMTWNQMNL)或改變型(胺基酸序列:CYTWNQMNL)經皮投予進行。通常1日之投予量可為μg/body至mg/body之等級,以1週至數週間隔投予。
本發明之另一態樣為提供含有CDR3多核苷酸或其互補之多核苷酸之晶片、含有CDR3肽之晶片、含有抗CDR3肽之抗體之晶片。該等晶片可為微晶片、微陣列等形態。該等晶片之製作可根據常法進行,例如可將CDR3多核苷酸或抗CDR3肽之抗體固定在玻璃基盤上。固定在晶片上之CDR3多核苷酸、其互補之多核苷酸、CDR3肽、抗CDR3肽之抗體之種類為1種至全種類,較好將全種類固定、網羅,進行解析。例如可將與序列編號:1至1695表示之核苷酸序列為互補之核苷酸序列組成之全種類多核苷酸固定在晶片上,又,例如可將特異性地辨識並結合由序列編號:1696至3389表示之胺基酸序列組成之全種類肽的抗體固定在晶片上。晶片上之CDR3多核苷酸、其互補之多核苷酸、CDR3肽、抗CDR3肽之抗體之配置為任意。
該等晶片可在上述癌之診斷方法等中使用。樣品可為患部組織、血液、淋巴液等體液、黏膜等,較好為末梢血。例如分析對象為CDR3多核苷酸時可根據常法將核酸從細胞中抽出,使用固定有與序列編號:1至1695表示之核苷酸序列為互補之核苷酸序列組成之全種類多核苷酸之晶片,可研究經雜交(hybridization)之樣品中DNA之種類及
量。例如分析對象為CDR3肽時,使用固定有特異性地辨識並結合由序列編號:1696至3389表示之胺基酸序列組成之全種類肽之抗體之晶片,可研究經特異性結合之樣品中肽之種類及量。
於該點,本發明提供特異性地辨識並結合於CDR3肽之抗體。較好相關之抗體為特異性地辨識序列編號:1696至3389表示之任一胺基酸序列者。相關抗體之作成方法為業者公知者。
通常,在樣品中之DNA或晶片上之DNA序列附上可表示有無雜交及雜交量之標識。例如將抗序列編號:1696至3389之CDR3之各抗體排列在晶片上,研究與樣品中CDR3肽之特異性結合,可鑑定樣品中CDR3肽之存在及種類。通常係在樣品中之肽或晶片上之抗體附上可判定有無特異性結合之標識。可表示有無雜交或特異性結合及量之標識為公知,例如有螢光標識、放射性標識、酵素標識、含有發色基者,可適當選擇使用。經由使用上述之晶片,可同時分析多種檢體。
本發明之CDR3多核苷酸及CDR3肽除了使用該等晶片之外,亦可使用例如南方墨點、北方墨點、純株雜交、ELISA等公知之方法進行分析、鑑定。
如上所述,本發明之CDR3 DNA為使用實施例表示之引子,尤其是表1表示之引子組合鑑定者。所以,本發明提供具有自用於擴增CDR多核苷酸之序列編號:3391至3418表示之序列之序列選出之引子。例如在CDR3多核苷
酸之擴增,使用含有序列編號:3393至3417表示之引子之引子組合。
本發明提供包括用於檢出CDR3多核苷酸或CDR肽之WT1特異性CTL之方法,癌之診斷工具、用於研究癌患者對於WT1肽免疫療法感受性之工具或WT1肽免疫療法之監控工具。本發明亦提供用於檢出具有CDR3多核苷酸或CDR肽之WT1特異性CTL之方法、癌診斷裝置、用於研究癌患者對於WT1肽免疫療法感受性之裝置或WT1肽免疫療法之監控裝置。上述引子組合等基因擴增方法、可將上述之晶片、從上述之晶片獲得之資訊解析方法等作為相關工具之構成成分或可用於相關之裝置。
本發明之另一態樣為關於導入含有CDR3多核苷酸序列之T細胞受體基因之HLA-A*2402陽性癌患者之淋巴球。較佳為相關之淋巴球為含有本發明之多核苷酸,CDR3多核苷酸之WT1特異性CTL之TCR V β鏈基因及導入WT1特異性CTL之TCR V α鏈基因之癌患者末梢血淋巴球。各該等末梢血淋巴球之調製,從提昇治療效果之點而言以使用1種該等WT1特異性CTL之TCR V β鏈基因,獲得複數種之末梢淋巴球,並將該等淋巴球導入患者,或使用複數種WT1特異性CTL之TCR V β鏈基因,獲得複數種末梢淋巴球,並將該等淋巴球導入患者較佳。又,根據患者或癌種類等,治療上有效之基因中之核苷酸序列亦有不同者,以對應個個狀況選擇導入之基因核苷酸序列較佳。
適合導入之基因之調製方法及在末梢血淋巴球導入基
因之方法在業者為公知。例如可將適合導入之基因組入適當之載體,並導入至適當之細胞,亦可經由基因槍或電穿孔等導入適當之細胞中。其他之基因導入條件或細胞之培養條件等,業者可適當選擇。
如上所述,將導入基因之淋巴球在患者體外培養,可獲得大量的WT1特異性CTL。因此,經由將獲得之CTL導入癌患者,可傷害表現WT1之癌,可進行癌之治療。導入獲得之CTL之理想患者與獲得末梢血淋巴球之患者為同一人。
上述之癌治療可與抗癌劑或放射線療法等其他之癌治療併用。上述之癌治療可適用於廣範圍之癌,例示於上,但不只限於該等例。
本發明之另一態樣為提供抗CDR3肽之抗體及其使用方法。相關抗體之作成方法在業者為公知。使用相關之抗體,可檢出或鑑定例如對象樣品中具有本發明之CDR3肽之胺基酸序列或在V β鏈中具有該等胺基酸序列之淋巴球。例如,使用抗由序列編號:1696至3389中任一胺基酸序列組成之肽之抗體,可檢出或鑑定癌特異性之淋巴球。可使用該等之抗體,進行上述本發明之方法,例如癌之診斷。
將相關之抗體與抗該抗體之具有本發明之CDR3胺基酸序列之淋巴球接觸,可使活性化。經由此操作,可將經活性化之淋巴球在癌之治療中使用。較好將從癌患者獲得之淋巴球活化,必要時增殖,經由回到該患者,可進行癌
治療。又,使用相關之抗體,可將作為目的之WT1特異性T細胞豐富化。例如,使用相關之抗體,在癌患者將WT1特異性T細胞豐富化,有助於癌治療。
於另一態樣,本發明提供以在上述說明之在可檢出本發明末梢血淋巴球附上可檢出之標識,投予於患者,接著,研究標識存在之位置及量為特徵之實體癌之位置及大小之特定方法。標識可使用鎝99放射性標識、螢光標識等公知之標識。細胞之標識化方法亦為公知。標識之檢出及信號之定量亦為業者公知者,可經由放射線計數器、螢光測定或根據生物檢查採取組織等進行。
以下,顯示實施例,對於本發明作更詳細之說明,惟,本發明並不只限於該等實施例等。
從5名健康志願者(HV1至HV5)及4名HLA-A*2402陽性AML患者(AML1至AML4)獲得末梢血樣品。從5名HLA-A*2402陽性MDS患者(MDS1至MDS5)獲得骨髓樣品或末梢血樣品。亦即,從AML1,在治療前、治療開始之第4、8、12、42週獲得末梢血。從AML2,在治療前、治療開始之第4週、第8週、第12週及第42週獲得末梢血。從AML3,在治療前、治療開始之第4週、第8週獲得末梢血。從AML4,在治療前、治療開始之第4週獲得末梢血。從MDS1,在治療前之骨髓、治療前之末梢血、治療
開始之第4週、第8週及第12週獲得末梢血。從MDS2至5,獲得治療前之末梢血及治療前之骨髓。獲得之末梢血樣品供給使用Ficoll-Hypaque(Pharmacia,Uppsala,Sweden)之密度梯度離心分離,將末梢血單核細胞(PBMCs)分離,在-170℃冷凍至使用為止。對於上述患者之治療進行WT1肽免疫療法。治療使用之WT1肽之胺基酸序列為Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu(序列編號:3390),以2週之間隔經由皮內注射投予。
首先,將每1樣品為2×106個之PBMCs在37℃,在FACS緩衝液(含有2%牛胎兒血清之PBS)中用PE接合HLA-A*2402-WT1 235-243四聚物(MBL,東京,日本)染色30分鐘。接著,在下述5色螢光標識單株抗體,在暗處、在冰上染色25分鐘:FITC-標識抗-CD4、CD14、CD16、CD19及CD56、抗-CD3-PerCP、抗-CD8-APC-Cy7(BD Bioscience,San Jose,CA)、抗-CD45RA-APC及抗-CCR7-PE-Cy7(BDPharmingen,San Diego,CA)。將經染色之細胞用FACS緩衝液洗淨2次。使用FACSAria裝置(BD Biosciences)進行篩選,用FACSDiva程序系統(BD Biosciences)進行數據解析,獲得CD4-CD14-CD16-CD19-CD56-細胞部分中之單一HLA-A*2402-WT1 235-243四聚物+CD3+CD8+細胞,定義為WT1-Tet+細胞。
為了進行DNA無污染,且充分之單一細胞之
RT-PCR,進行cDNA之合成,所有之PCR步驟在個別之無塵無菌操作檯內進行。將單一WT1-Tet+細胞在放入15μL之cDNA反應混合物之PCR管中直接篩選。該cDNA反應混合物為將下述者含於溶解緩衝液(含有0.5% Triton X-100之1XcDNA緩衝液)中:反轉錄酵素(SuperScript III,Invitrogen,Carlsbad,CA)、0.5mM dNTPs(Invitrogen)、20單位(U)之Rnase抑制劑(Invitrogen)、100μg/mL之明膠(Roche,Indianapolis,IN)、100μg/mL之tRNA(Roche)及200nM之TCR-β鏈恆定區域特異性引子(5'-CACCAGTGTGGCCTT TTG-3'(序列編號:3391))。篩選後為了合成cDNA,將樣品在50℃保溫90分鐘,接著為了使反應停止,於95℃保溫。
將根據上述順序獲得之10μL合成cDNA生成物添加於40μL之反應混合物中。該反應混合物含有1XPCR緩衝液、2mM MgCl2、0.25mM dNTPs、1.25U DNA聚合酶(Platinum Taq DNA Polymerase,Invitrogen)、5nM之24種V β家族特異性前置引子之混合物(示於表1)及5nM之3'C β反置引子(5'-GCTTCTGATGGCTCAAACACAGC-3'(序列編號:3392))。PCR順序如下所述:將由95℃ 2分鐘之預-PCR加熱步驟、接著於95℃ 45秒之變性(denature)步驟、57℃ 45秒之黏合(annealing)步驟及72℃ 50秒之延長(elongation)步驟形成之循環,進行40次循環。
接著,將上述PCR之生成物供應至篩選PCR。將上述PCR生成物1μL個別放入8支不同之管中,在各管中放入24μL之反應混合物。該反應混合物含有1XPCR緩衝液、2mM MgCl2、0.2mM dNTPs、1.0U Platinum Taq DNA聚合酶、表1表示之S1至S8之8個篩選組中1組之前置引子及5'C β反置引子(5'-GGAACACGTTTTTCAGGTCCT-3'(序列編號:3418))(各150nM)。PCR順序如下所述:將由在95℃2分鐘之預-PCR加熱步驟、94℃ 45秒之變性步驟、57℃ 45秒之黏合步驟及72℃ 40秒之延長步驟形成之循環,進行35次循環。
為了確認在該8個篩選PCR之陽性反應,將5μL之各篩選PCR生成物供給至2%瓊脂凝膠電泳。接著,再進行PCR。該PCR使用確認為陽性之篩選組之V β特異性前置引子各150nM,進行35次循環。用2%瓊脂凝膠電泳確認陽性反應。作為陰性對照,使用未含細胞之系統,與上述相同,調製3個孔,用相同之順序進行實驗。
將經擴增之TCR-β基因片段經由PCR純化套組((Purification Kit)(Qiagen,Valencia,CA)純化。使用對應TCR V β特異性之前置引子,決定序列。序列決定使用ABI PRIAM BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA),在ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)進行分析。與IMGT人類TCR基因資料庫之位址(http://imgt.cines.fr)比較,分析CDR3之序列數據。
源自健康正常人及癌患者(AML1至4、MDS1至5)之WT1特異性CTL之V β鏈基因之序列、J區域之序列、D區域之序列、N區域之序列、CDR3核苷酸序列及CDR3胺基酸序列表示於第1-1圖至第1-36圖。各個WT1特異性CTL之同源叢生性表示於第2-1圖至第2-36圖。又,CDR3核苷酸序列表示於序列編號:1至1695(由於純株#24.29與28.92之CDR3核苷酸序列相同,將純株#24.29記載於序列表)、CDR3胺基酸序列表示於序列編號:1696至3389(由
於純株#2.53與#28.58之CDR3胺基酸序列相同,純株#24.29與#28.92之CDR3胺基酸序列相同,將純株#2.53、純株#24.19記載於序列表)。又,AML患者中,AML1及AML2對於治療有反應,AML3及AML4則無反應。在MDS患者,未判定對於治療之反應。
如第2-1圖至第2-36圖所示,對於在健康正常人(HV1至HV4),具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽之WT1特異性CTL之同源叢生性,真正相關之純株看到1,少有2或3,在治療前之所有癌患者(AML及MDS),具有任一CDR3多核苷酸或任一CDR3肽之WT1特異性CTL之同源叢生性必定以複數存在,其同源叢生性數及該等細胞之種類亦比健康正常人多。
治療前患者之同源叢生性之增加或同源叢生性為複數之細胞種類增加,表示在患者對於癌細胞之防禦.攻擊有已開始之可能性,認為有癌細胞存在於患者之可能性。
如第2-1圖至第2-36圖所示,在對於WT1肽免疫療法有反應之AML患者,治療前同源叢生性為複數之純株種類數相較健康正常人及無反應者為多。AML1(反應者):10種(該等同源叢生性合計58)、AML2(反應者):12種(該等同源叢生性合計93)、AML3(無反應者):9種(該等同源叢生性合計27)、AML4(無反應者):3種(該等同源叢生性合計10)。又,在健康正常人HV1至5,同源叢生性為複數之純株種類在0至2種之範圍。
治療前同源叢生性為複數之純株經由WT1肽免疫療
法,同源叢生性更增加或維持其同源叢生性之傾向。又,儘可能多種類純株存在者,全體之有效WT1特異性CTL純株數及種類增加,認為WT1免疫療法成功之可能性高。
如第2-1圖至第2-36圖所示,發現在AML患者,WT1肽免疫療法期間暫時性或持續性同源叢生性增加之WT1特異性CTL(包含同源叢生性從0至1以上者)。相關舉動顯示之典型例列舉在AML(患者1-反應者)之純株#02.28、#05.034、#05.135、#05.219、#09.65、#12.04、#13.13、#27.016、#28.83等及AML(患者2-反應者)之純株#02.27、#05.035、#05.141、#05.219、#06.009、#12.04、#12.20、#15.44、#20.068、#27.032等。明瞭例如只要看到AML患者1純株#02.28之同源叢生性變動,則治療開始時及第4週之治療效果大。
某一純株之同源叢生性增加表示WT1肽免疫療法在一定期間發揮效果。某一純株之同源叢生性暫時性增加,之後即使減少,其他純株之同源叢生性增加,認為補償效果。對於癌細胞若有效,則同源叢生性之增加比例越大越佳。所以,WT1肽免疫療法後同源叢生性增加之比例越大或同源叢生性增加之純株之種類越多,則對於WT1肽免疫療法之反應性越高。
本發明係提供有用之抗癌治療用醫藥、癌檢查用套組或試劑、癌研究試劑等。因此,本發明可利用在用於治療癌之醫藥品領域、癌檢查用套組及試劑之領域及癌研究領域等。
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<211> 14
<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人類
<210> 3390
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類
<210> 3391
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-β鏈恆定區域特異性引子
<210> 3392
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3’C β反置引子
<210> 3393
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3394
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3395
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3396
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3397
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3398
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3399
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3400
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3401
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3402
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3403
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3404
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3405
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3406
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3407
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3408
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3409
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3410
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3411
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3412
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3413
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3414
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3415
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3416
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3417
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V β家族特異性前置引子
<210> 3418
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5’C β反置引子
由於本案的圖為試驗化合物的結果數據,並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。
Claims (7)
- 一種多核苷酸組,其係具有編碼WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3的核苷酸序列者,該多核苷酸組至少包含:(i)具有序列編號:79表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(ii)具有序列編號:240表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(iii)具有序列編號:341表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(iv)具有序列編號:564表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(v)具有序列編號:954表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(vi)具有序列編號:1339表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;及(vii)具有序列編號:1569表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸組,該多核苷酸組至少包含:(i)由序列編號:79表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(ii)由序列編號:240表示之CDR3核苷酸序列所構 成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(iii)由序列編號:341表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(iv)由序列編號:564表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(v)由序列編號:954表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;(vi)由序列編號:1339表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;及(vii)由序列編號:1569表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列。
- 一種肽組,其係具有WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3的胺基酸序列的肽組,至少包含:(i)具有序列編號:1774表示之CDR3胺基酸序列的肽;(ii)具有序列編號:1935表示之CDR3胺基酸序列的肽;(iii)具有序列編號:2036表示之CDR3胺基酸序列的肽;(iv)具有序列編號:2259表示之CDR3胺基酸序列的 肽;(v)具有序列編號:2649表示之CDR3胺基酸序列的肽;(vi)具有序列編號:3034表示之CDR3胺基酸序列的肽;及(vii)具有序列編號:3264表示之CDR3胺基酸序列的肽。
- 如申請專利範圍第3項所述之肽組,至少包含:(i)由序列編號:1774表示之CDR3胺基酸序列所構成的肽;(ii)由序列編號:1935表示之CDR3胺基酸序列所構成的肽;(iii)由序列編號:2036表示之CDR3胺基酸序列所構成的肽;(iv)由序列編號:2259表示之CDR3胺基酸序列所構成的肽;(v)由序列編號:2649表示之CDR3胺基酸序列所構成的肽;(vi)由序列編號:3034表示之CDR3胺基酸序列所構成的肽;及(vii)由序列編號:3264表示之CDR3胺基酸序列所構成的肽。
- 一種多核苷酸組或肽組的用途,係將申請專利範圍第1項或第2項所述之多核苷酸組或申請專利範圍第3項 或第4項所述之肽組使用作為癌標記。
- 一種淋巴球組,其係導入有含有多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球組,該多核苷酸序列係具有編碼WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3的核苷酸序列,該淋巴球組至少包含下述淋巴球:導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列具有:具有序列編號:79表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列具有:具有序列編號:240表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列具有:具有序列編號:341表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列具有:具有序列編號:564表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列 具有:具有序列編號:954表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列具有:具有序列編號:1339表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;及導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列具有:具有序列編號:1569表示之CDR3核苷酸序列之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列。
- 一種淋巴球組,其係導入有含有多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球組,該多核苷酸序列係具有編碼WT1特異性細胞障礙性T細胞(CTL)之T細胞受體(TCR)之V β鏈之CDR3的核苷酸序列,該淋巴球組至少包含下述淋巴球:導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列由下列者構成:由序列編號:79表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列由下列者構成:由序列編號:240表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互 補序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列由下列者構成:由序列編號:341表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列由下列者構成:由序列編號:564表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列由下列者構成:由序列編號:954表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列的多核苷酸序列;導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列由下列者構成:由序列編號:1339表示之CDR3核苷酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列;及導入有包含多核苷酸序列之T細胞受體基因的HLA-A*2402陽性癌患者的淋巴球,且該多核苷酸序列由下列者構成:由序列編號:1569表示之CDR3核苷 酸序列所構成之DNA、其互補的RNA、或其等之完全互補序列。
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