CN111116754A

CN111116754A - 一种针对egfr l858r基因突变的特异性tcr及其应用

Info

Publication number: CN111116754A
Application number: CN201811274259.XA
Authority: CN
Inventors: 杜学明; 霍冲; 邓丽刚; 邹庆薇
Original assignee: Tianjin Hengjia Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Tianjin Hengjia Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2020-05-08

Abstract

本发明提供一种针对EGFR L858R基因突变的特异性TCR及其应用，所述TCR具有结合衍生自EGFR L858R基因突变的新抗原肽KITDFGRAK‑HLA‑A1101复合物的特性，所述TCR包含α链和β链的可变区和恒定区。经过该类TCR修饰的T细胞具有对EGFR L858R基因突变的HLA‑A1101肿瘤细胞的特异性杀伤作用。另外，本发明还提供了用于治疗涉及表达所述基因突变的肿瘤的药物组合，具有特异性强，个体化治疗效果好的特点。

Description

一种针对EGFR L858R基因突变的特异性TCR及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程及肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种针对EGFR L858R基因突变的特异性TCR及其应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。TCR(T cell receptor)疗法即T细胞受体疗法，在该疗法中，分离出内源的T细胞，加以工程化改造，并输注回人体。这样一来，带有靶向癌细胞能力的T细胞数量将大增。这种方法除了能像细胞毒性化疗和靶向治疗快速杀灭肿瘤外，还避免了疫苗和免疫检查点抑制剂疗法的延迟效应。TCR-T是继肿瘤手术、放疗、化疗、靶向治疗之后的最有发展前景的肿瘤治疗技术之一，无论是国际还是国内都是目前肿瘤免疫治疗的研究热点。

TCR是所有T细胞表面的特征性标志，具有识别抗原呈递细胞(APC)上人类主要组织相容性复合体(MHC)分子-抗原肽复合体的能力。TCR是由α、β两条肽链构成的异二聚体，每条肽链分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR3可直接与抗原肽相结合。

TCR在识别APC或者靶细胞上的MHC分子所提呈的抗原肽时，既要识别抗原肽，同时也要识别自身MHC分子的多态性部分，此现象即MHC限制性。T细胞通过特异性T细胞受体识别肿瘤细胞表面抗原肽-MHC复合体而被激活，活化后的T细胞可以直接溶解肿瘤细胞，或通过分泌细胞因子如干扰素、肿瘤坏死因子等抑制肿瘤生长。CD8+T细胞介导的特异性MHC-I类分子限制细胞免疫功能，在抗肿瘤免疫中尤其重要。

HLA(human lymphocyte antigen，人类淋巴细胞抗原)，受控于MHC的基因簇，是具有高度多态性的同种异体抗原，是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统，有几十个基因座位，每个基因座位又有几十个等位基因，且呈共显性表达。HLA有A、B、C、D和DR 5个位点，分别称为HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-D和HLA-DR。

EGFR(epidermal growth factor receptor family)人类表皮生长因子受体家族属于酪氨酸激酶受体家族，也被称作HER家族或erbB家族。EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。EGFR诱导癌症至少通过3种机制：EGFR配体的过表达、EGFR的扩增或EGFR的突变活化，其中以EGFR的突变活化为主要机制。EGFR基因是由28个外显子组成，其中外显子18-21是最见的基因突变位点，也是与易瑞沙等EGFR-TKI最敏感的位点。通常来说，EGFR的外显子19缺失和21的L858R两个突变对于易瑞沙靶点是敏感的。因此EGFR的外显子19缺失的检测和21的L858R突变可以作为肿瘤患者是否适用EGFR-TKI的一个重要的判断标准。

肿瘤细胞会发生大量基因突变，有些突变会改变氨基酸编码序列，导致肿瘤细胞表达正常细胞所没有的异常蛋白。这些异常蛋白在细胞内(肿瘤细胞或抗原呈递细胞)被蛋白酶酶解成肽段(抗原表位)，与MHC-I类或MHC-II类分子高亲和力结合，并以复合物形式呈递到细胞表面，与T细胞受体结合，T细胞被激活；激活后的T细胞扩增，浸润肿瘤微环境，识别并杀伤肿瘤细胞。这种肿瘤细胞特异性的异常蛋白称为的新抗原(neoantigen)。

TCR-T细胞治疗包括肿瘤特异性TCR的选取、TCR表达载体构建、TCR-T改造后细胞回输、免疫进程监测等关键技术和治疗手段。与同类型的CAR-T细胞治疗技术相比，TCR-T具有更广泛抗原选择空间，因此，不仅能扩充其适用肿瘤范围，还有望减少脱靶效应。尽管TCR-T在临床前测试和小范围病人治疗中取得一定成功，但TCR-T的临床试验数据仍然匮乏。同时，由于TCR-T的研发仍在初级阶段，临床治疗品质的TCR-T和T细胞还有待改进，更重要的是，TCR-T的有效患者人群以及新型构造的TCR-T的临床治疗效果还有待验证。

发明内容

本发明旨在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。因此，本发明的目的在于提供一种针对EGFR L858R基因突变的特异性TCR及其应用。

一方面，本发明提供一种针对EGFR L858R基因突变的特异性TCR，所述TCR能够与KITDFGRAK-HLA-A1101复合物结合，所述TCR包含α链和β链，TCRα链包含：可变区序列(SEQID NO:05)和TRAC类型的恒定区序列；TCRβ链包含：可变区序列(SEQ ID NO:07)和TRBC1类型的恒定区序列；所述TCRα链可变区序列(SEQ ID NO:05)包含α链CDR3区，所述TCRβ链可变区序列(SEQ ID NO:07)包含β链CDR3区。

所述TCRα链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:05)的编码核苷酸序列为SEQ ID：06。

所述TCRβ链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:07)的编码核苷酸序列为SEQ IDNO:08。

所述TCR为α链，β链异源二聚体结构。

所述TCRα链CDR3区为与CASPAGNTDKLIF(SEQ ID NO:01)序列具有至少70％相同序列的氨基酸序列。

所述TCRβ链CDR3区为与CASSYSDRNQPQHF(SEQ ID NO:03)序列具有至少70％相同序列的氨基酸序列。

所述SEQ ID NO:01的氨基酸序列的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:02。

所述SEQ ID NO:03的氨基酸序列的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:04。

另一方面，本发明提供一种T细胞，为细胞膜表达所述TCR的T细胞。

所述T细胞，为CD8阳性T细胞。

所述T细胞，对EGFR L858R突变的HLA-A1101肿瘤细胞有特异性杀伤作用。

所述的T细胞，用于制备抗肿瘤药物或药物组合。

再一方面，本发明提供一种抗肿瘤药物或药物组合。

所述抗肿瘤药物或药物组合，包含TCR、T细胞或TCR-T的一种或几种。

所述药物或药物组合用于治疗HLA-A1101患者。

优选地，所述抗肿瘤药物及药物组合，用于治疗涉及表达EGFR L858R突变的恶性肿瘤。

优选地，所述肿瘤包括肺癌、中枢神经肿瘤、结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等。

本发明的有益效果是：

通过输注能够识别特异靶标的基因修饰T细胞，赋予免疫系统以新的非自然免疫活性。

应用本发明提供的TCR或T细胞制备的抗肿瘤药物及药物组合，具有特异性强，个体化治疗效果好的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A流式细胞术分析构建的TCR-T的TCR表达，PBMC中的淋巴细胞。

图1B流式细胞术分析构建的TCR-T的TCR表达，CD8+淋巴细胞。

图1C流式细胞术分析构建的TCR-T的TCR表达，四聚体和CD8双阳性TCT-T细胞。

图2A流式细胞术分析特异性TCR-T识别特异性抗原肽的能力，未负载抗原肽。

图2B流式细胞术分析特异性TCR-T识别特异性抗原肽的能力，负载对照抗原肽。

图2C流式细胞术分析特异性TCR-T识别特异性抗原肽的能力，负载特异性抗原肽。

图3A流式细胞术分析特异性TCR-T细胞对靶细胞的杀伤作用，阴性靶细胞。

图3B流式细胞术分析特异性TCR-T细胞对靶细胞的杀伤作用，阳性靶细胞。

具体实施方式：

主要材料：

实施例1流式细胞术分析构建的TCR-T的TCR表达

根据测序获得的TCR基因序列，全合成TCRα链和β链。Not1和EcoR1限制性内切酶酶切pMX-IRES-GFP质粒，胶回收空载体基因片段；病毒质粒以碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，反应体系为50ul：质粒20ul，10×Buffer 5ul，CIAP 2ul，无菌水23ul，于37℃孵育30min，通过乙醇沉淀法纯化质粒DNA。将TCR全长基因连接入pMX-IRES-GFP空载体质粒，于16℃连接过夜。将重组质粒转化XL-10感受态细胞，均匀涂布与含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h后，挑取单个菌落至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm/min震荡培养14-16h，抽提质粒。

重组逆转录病毒载体的包装：取2×10⁶对数生长期293FT细胞作为包装细胞，接种到T25组织培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，24h后细胞汇合度达到80-90％时可进行转染，吸出原培养液，PBS清洗1遍。加入消化液室温孵育1min消化细胞成单细胞悬液，将重组逆转录病毒载体质粒与混合包装载体质粒混匀，加入Opti-MEM无血清培养基中。室温孵育20min，用磷酸钙转染法共转染293FT细胞，轻柔混匀，37℃孵育4-6h。由于逆转录病毒载体自身带有绿色荧光蛋白报告基因，48h后置于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，确定逆转录病毒载体质粒是否转入293FT细胞。72h收集上清，3 000r/min离心20min，并经0.45um滤膜过滤后收集病毒上清，4℃，24500r/min离心90min，小心吸取上清，保留管底白色病毒沉淀，用0.5-1％原病毒上清重悬沉淀，分装保存于-80℃。48h后荧光显微镜下见大量绿色荧光，证实已有大量质粒转染入293FT细胞。

流式细胞术测定病毒滴度：感染前一天将NIH3T3细胞按2×10⁵每孔接种于6孔板，感染24h后更换新鲜培养液，于37℃、5％CO₂继续培养3天，流式细胞术检测GFP表达阳性率，计算滴度：病毒感染性滴度(GFU/ml)＝NIH3T3细胞数×GFP阳性率/病毒浓缩液体积(ml)×病毒稀释倍数。得到病毒滴度为(30％×200 000/0.1)×50＝3.0×10⁷GFU/ml。

实施例2流式细胞术分析特异性TCR-T识别特异性抗原肽的能力

取健康志愿者外周血，密度梯度离心法分离PBMC：外周血与PBS按1:1比例稀释，将稀释后的血液按1:1比例小心加在淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心1600rpm/min，25min。用吸管小心吸取单个核细胞层，无血清1640培养基洗涤细胞两次，重悬细胞进行计数。使用抗CD3抗体(20ng/mL)和白细胞介素2(IL-2；300IU/ml)活化人外周血单核细胞(PBMC)2天。感染前一天，将处于对数生长期的PBMC细胞吹打成单细胞悬液，计数5×10⁵个细胞接种在涂有纤连蛋白的6孔板中，感染当天将200ul浓缩的病毒悬液于800ulIMSF培养基(含IL-2；1000IU/ml)混匀后，加入细胞培养孔中，再加入1ul Polybrene(10ug/ml)。设置阴性对照孔。将板在37℃下在5％CO₂中温育，并在转导后24-48h，通过流式细胞术分析TCR基因的表达。见图1A，图1B，图1C。其中图1A为PBMC中的淋巴细胞，如图中圈出范围所示，图1B为CD8+淋巴细胞，图1C为四聚体和CD8双阳性TCT-T细胞，结果显示四聚体阳性的TCR-T细胞表达率为24.2％。

实施例3流式细胞术分析特异性TCR-T细胞对靶细胞的杀伤作用

构建HLA-A1101的T2细胞系，T2细胞系缺乏与抗原处理(TAP)相关的转运体，故可以有效地负载外源肽，作为抗原呈递细胞，将加载的抗原肽提呈给T细胞识别。将人工合成的抗原肽KITDFGRAK与T2细胞在37℃、5％CO₂条件下孵育24h(多肽的浓度为50μg/ml、T2细胞的浓度为1×10⁶个/ml)，洗涤去除未结合的抗原肽，然后收集细胞，即为负载抗原肽KITDFGRAK的T2细胞。

特异性TCR-T细胞与负载抗原肽KITDFGRAK的T2细胞在37℃、5％CO₂条件下孵育24h(细胞浓度均为1×10⁶个/ml)。对照细胞为未负载抗原肽的T2细胞和负载阴性对照抗原肽(KITDFGLAK)的T2细胞。通过流式细胞术检查TCR-T细胞内IFN-γ表达。流式细胞术分析特异性TCR-T细胞识别特异性抗原肽的能力，见图2A，图2B，图2C。其中图2A为未负载抗原肽，图2B为负载对照抗原肽，图2C为负载特异性抗原肽。结果表明负载抗原肽KITDFGRAK的T2细胞可以特异性引起TCR-T的IFN-γ表达，表达量为12.0％。

构建阳性靶细胞H2172-A1101(含有EGFR L858R基因突变)和阴性靶细胞A549-A1101(不含EGFR L858R基因突变)。将特异性TCR-T细胞(2.5×10⁶个)分别与阳性靶细胞H2172-A1101细胞(1×10⁵个)和阴性靶细胞A549-A1101细胞(1×10⁵个)在37℃下5％CO₂条件下孵育24h，通过流式细胞术检查特异性TCR-T细胞中的细胞内IFN-γ表达，见图3A，图3B。其中图3A为阴性靶细胞，图3B为阳性靶细胞。结果显示，比较特异性TCR-T对H2172-A1101和A549-A1101细胞的杀伤作用，对阳性靶细胞的特异性杀伤为9.8％。

以上对本发明所提供的一种针对EGFR L858R基因突变的特异性TCR及其应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津亨佳生物科技发展有限公司

<120> 一种针对EGFR L858R基因突变的特异性TCR及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRα链CDR3区

<400> 1

Cys Ala Ser Pro Ala Gly Asn Thr Asp Lys Leu Ile Phe

1 5 10

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRα链CDR3区

<400> 2

tgtgcatctc ccgcggggaa caccgacaag ctcatcttt 39

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRβ链CDR3区

<400> 3

Cys Ala Ser Ser Tyr Ser Asp Arg Asn Gln Pro Gln His Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRβ链CDR3区

<400> 4

tgtgccagca gttactcgga cagaaatcag ccccagcatt tt 42

<210> 5

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRα链可变区

<400> 5

Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp

1 5 10 15

Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val

20 25 30

Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala

35 40 45

Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln

50 55 60

Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg

65 70 75 80

Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile

85 90 95

Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Pro

100 105 110

Ala Gly Asn Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Gln

115 120 125

Val Phe Pro

130

<210> 6

<211> 394

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRα链可变区

<400> 6

atgacatcca ttcgagctgt atttatattc ctgtggctgc agctggactt ggtgaatgga 60

gagaatgtgg agcagcatcc ttcaaccctg agtgtccagg agggagacag cgctgttatc 120

aagtgtactt attcagacag tgcctcaaac tacttccctt ggtataagca agaacttgga 180

aaaagacctc agcttattat agacattcgt tcaaatgtgg gcgaaaagaa agaccaacga 240

attgctgtta cattgaacaa gacagccaaa catttctccc tgcacatcac agagacccaa 300

cctgaagact cggctgtcta cttctgtgca tctcccgcgg ggaacaccga caagctcatc 360

tttgggactg ggaccagatt acaagtcttt ccaa 394

<210> 7

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRβ链可变区

<400> 7

Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu

20 25 30

Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His

35 40 45

Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu

50 55 60

Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro

65 70 75 80

Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg

85 90 95

Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Tyr Ser Asp Arg Asn Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg

115 120 125

Leu Ser Ile Leu

130

<210> 8

<211> 397

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCRβ链可变区

<400> 8

atgagcatcg gcctcctgtg ctgtgcagcc ttgtctctcc tgtgggcagg tccagtgaat 60

gctggtgtca ctcagacccc aaaattccag gtcctgaaga caggacagag catgacactg 120

cagtgtgccc aggatatgaa ccatgaatac atgtcctggt atcgacaaga cccaggcatg 180

gggctgaggc tgattcatta ctcagttggt gctggtatca ctgaccaagg agaagtcccc 240

aatggctaca atgtctccag atcaaccaca gaggatttcc cgctcaggct gctgtcggct 300

gctccctccc agacatctgt gtacttctgt gccagcagtt actcggacag aaatcagccc 360

cagcattttg gtgatgggac tcgactctcc atcctag 397

Claims

1.一种针对EGFR L858R基因突变的特异性TCR，其特征在于，所述TCR能够与KITDFGRAK-HLA-A1101复合物结合，所述TCR包含α链和β链，TCRα链包含：可变区序列（SEQID NO:05）和TRAC类型的恒定区序列；TCRβ链包含：可变区序列（SEQ ID NO:07）和TRBC1类型的恒定区序列；所述TCRα链可变区序列（SEQ ID NO:05）包含α链CDR3区，所述TCRβ链可变区序列（SEQ ID NO:07）包含β链CDR3区。

2.一种T细胞，其特征在于，为细胞膜表达所述TCR的T细胞。

3.根据权利要求书1所述的TCR，其特征在于，所述TCR为α链，β链异源二聚体结构。

4.根据权利要求书1所述的TCR，其特征在于，所述TCRα链CDR3区为与CASPAGNTDKLIF（SEQ ID NO:01）序列具有至少70%相同序列的氨基酸序列。

5.根据权利要求书1所述的TCR，其特征在于，所述TCRβ链CDR3区为与CASSYSDRNQPQHF（SEQ ID NO:03）序列具有至少70%相同序列的氨基酸序列。

6.根据权利要求书2所述的T细胞，其特征在于，为CD8阳性T细胞。

7.根据权利要求书6所述的T细胞，其特征在于，对EGFR L858R突变的HLA-A1101肿瘤细胞有特异性杀伤作用。

8.根据权利要求书2或6或7所述的T细胞用途，其特征在于，用于制备抗肿瘤药物或药物组合；

进一步地，所述的抗肿瘤药物或药物组合，对EGFR L858R突变的HLA-A1101患者的肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。