TWI726920B

TWI726920B - 基因體規模的ｔ細胞活性陣列、其製造方法、其用於辨識免疫調節因子的方法及其用途

Info

Publication number: TWI726920B
Application number: TW105132369A
Authority: TW
Inventors: 麗平陳; 王　軍
Original assignee: 耶魯大學
Priority date: 2015-10-14
Filing date: 2016-10-06
Publication date: 2021-05-11
Also published as: CN108351344A; HK1259296A1; US20180306778A1; CN108351344B; KR20180064506A; US10895569B2; TW201727233A; AU2016338782B2; JP2018538240A; EP3362792A1; JP6916535B2; AU2016338782A1; EP3362792B1; WO2017066172A1

Abstract

本發明提供一種基因體規模的T細胞活性陣列(Genome-Scale T Cell Activity Arrays,GS-TCAA)、該陣列的製造方法、及使用該陣列辨識免疫調節因子的方法。

Description

基因體規模的T細胞活性陣列、其製造方法、其用於辨識免疫調節因子的方法及其用途

本申請案對2015年10月14日提出申請之美國專利臨時申請案第62/241,466號主張優先權，其全部內容併於本說明書中以為參考。

共同訊息表面受體-配體路徑(co-signaling surface receptor-ligand pathways)對於T細胞之活化及抑制為必須者，其密切地調控T細胞之生物網。在過去十年間，此領域已見證追蹤共同訊息分子及路徑並對抗包含自體免疫及多種癌症的眾多疾病之免疫調節療法之開發。且最近以PD-1/B7-H1(PD-L1)路徑為標的的抗體之臨床試驗已獲得成功並得到FDA法規的核可，而在多種晚期人類癌症試驗方面獲致空前的臨床結果且不良效果亦小(Brahmer,JR et al.,N Engl J Med 366(26)：2455-2465,2012、Topalian,SL et al.,N Engl J Med 366(26)：2443-2454,2012)。此種治療在療效、毒性、及持久性方面皆優於他種療法，並對於腫瘤治療顯現以T細胞免疫調節對策治療腫瘤部位的優點(Sznol M and Chen L,Clin Cancer Res 19(5)：1021-1034,2013)。然而，雖然已獲得的反應令人振奮，但卻有一大部分的癌症患者對對抗PD-1的療法並無反應。因此，亟須判斷其他涉及先天性及後天性免疫抗性之因子(Sznol M and Chen L,Clin Cancer Res 19(5)：1021-1034,2013)，以及除了PD-1/B7-H1路徑外負責免疫逃避的額外機制。廣泛地瞭解人類細胞表面分子如何調控T細胞反應將有助於辨識新的免疫調節因子，且顯現開發新免疫治療藥劑之重要方向。

膜蛋白在細胞功能上擔負重要的角色。訊息傳導為其中最重要的角色之一，而細胞表面蛋白在其中的作用係作為受體，可在細胞之間傳達訊息或者介導內部與外部環境之間的互相作用。除作為細胞獲得資訊及回應訊息的方式之外，膜蛋白亦有運輸蛋白之功能而與物質穿過細胞膜交換之控制相關。由於膜蛋白較易接近，因此又特別有意作為治療藥劑之標的。然而，對於大部分人類膜蛋白在免疫功能的瞭解並不多，而且並無建立完備的基因體層次之T細胞活性的分析系統。因此，對於能辨識具有藥物潛力之新穎免疫調控性膜蛋白，以便在抗腫瘤及自體免疫的免疫療法方面增高成功的比例並充分地利用的組成物及方法仍存在持續且未被滿足的需求。

本發明至少有部分係基於新穎之基因體規模T細胞活性陣列(GS-TCAA)之開發，該GS-TCAA允許辨識涉及T細胞生物網調控的人類細胞膜蛋白。GS-TCAA利用新穎的以細胞為基礎之螢光報導系統，得以研究90%以上的所有人類膜基因中不同的T細胞活性，諸如增生、抑制、及衰竭。此種方法於人類細胞表面分子如何調控T細胞反應方面提供廣泛地瞭解，並輔助辨識新的免疫調節因子。藉由GS-TCAA，可辨識自體免疫疾病及癌症中未知之共同訊息分子及路徑，以追蹤、辨識、及開發其治療。

因此，本發明之一態樣包括基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)，其包含含有複數個孔之固體支持構造且複數個孔之各孔含有：表現膜結合性之抗CD3抗體、或其抗原結合片段的第一細胞，其中該第一細胞係經編碼複數個人類膜基因之cDNA基因庫以下述方式轉染：使第一細胞上呈現由複數個人類膜基因之一者所編碼的蛋白質；表現在細胞表面的受體及報導基因的第二細胞；其中受體與抗CD3抗體、或其抗原結合片段之間的相互作用提供初級訊息而刺激第二細胞株之活性，其中報導基因的表現量增高，即表示所呈現的由複數個人類膜基因之一者編碼的蛋白質係作用為刺激性共同訊息分子而刺激第二細胞株的活性；且其中報導基因的表現量降低，即表示所呈現的由複數個人類膜基因之一者編碼的蛋白質係作用為抑制性共同訊息分子而抑制第二細胞株的活性。

於若干具體實施例，固體支持構造為多孔盤。於其他具體實施例，多孔盤係選自由96孔盤、384孔盤、及1536孔盤所組成之群組。

於若干具體實施例，第一細胞為人類293T細胞。於其他具體實施例，第一細胞為表現免疫相關銜接蛋白的人類293T.2A細胞。於若干具體實施例，免疫相關銜接蛋白係選自由DAP10、DAP12、FcR γ、及CD3E所組成之群組。

於若干具體實施例，第二細胞為免疫細胞。於其他具體實施例，免疫細胞為骨髓衍生抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)。於若干具體實施例，免疫細胞為T細胞。於若干具體實施例，T細胞係選自由Jurkat細胞、初始T細胞、效應T細胞、衰竭T細胞、失活型T細胞及調控性T細胞所組成之群組。

於若干具體實施例，報導基因係包含於選自由與細胞毒性相關之報導建構體、與細胞凋亡相關之報導建構體、及與增生相關之報導建構體所組成之群組的DNA建構體中。於其他具體實施例，與細胞毒性相關之報導建構體為基於螢光之報導建構體。於若干具體實施例，與細胞凋亡相關之報導建構體為基於螢光之報導建構體。於若干具體實施例，基於螢光之報導建構體包含與T細胞相關之轉錄反應單元，其後有最小CMV啟動子及GFP報導基因。於其他具體實施例，與T細胞相關之轉錄反應單元係選自由NF-κ B、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK及PI3K所組成之群組。於若干具體實施例，與增生相關的之報導建構體中的報導基因為細胞介素基因。於若干具體實施例，細胞介素係選自由IFN-γ、TNF-α及IL-10所組成之群組。

於若干具體實施例，複數個人類膜基因包含選自由受體基因、免疫球蛋白基因、運輸蛋白基因及訊息基因所組成之群組的基因。於若干具體實施例，複數個人類膜基因包含約1,000至7,000個基因。於其他具體實施例，複數個人類膜基因包含約2,000至5,000個基因。於另外其他具體實施例，複數個人類膜基因包含約4,000至7,000個基因。

於若干具體實施例，第二細胞之活性係選自由細胞增生、細胞抑制、細胞衰竭、細胞凋亡、及自細胞釋放細胞介素所組成之群組。

在一態樣，本發明係包含製造基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)之方法，該方法包含：提供含有複數個孔之固體支持構造；在複數個孔之各孔中培養表現膜結合性之抗-CD3抗體、或其抗原結合片段之第一細胞；以編碼複數個人類膜基因的cDNA基因庫以下述方式轉染第一細胞：使第一細胞呈現由複數個人類膜基因之一者所編碼的蛋白質；以及在複數個孔之各孔中共同培養表現在細胞表面的受體及報導基因的第二細胞，從而製作基因體規模的T細胞活性陣列，其中受體及抗-CD3抗體、或其抗原結合片段之間之相互作用提供初級訊息並刺激第二細胞株之活性，以及其中，報導基因表現量增高，表示所呈現的由複數個人類膜基因之一者編碼的蛋白質係作用為刺激性共同訊息分子而刺激第二細胞株之活性，且其中，報導基因表現量減低，表示所呈現的由複數個人類膜基因之一者編碼的蛋白質係作用為抑制性共同訊息分子而抑制第二細胞株之活性。

於若干具體實施例，固體支持構造係多孔盤。於若干具體實施例，多孔盤係選自由96孔盤、384孔盤及1536孔盤所組成之群組。

於若干具體實施例，第一細胞係人類293T細胞。於其他具體實施例，第一細胞係表現免疫相關銜接蛋白之人類293T.2A細胞。於若干具體實施例，免疫相關銜接蛋白係選自由DAP10、DAP12、FcR γ及CD3E所組成之群組。

於若干具體實施例，第二細胞係免疫細胞。於其他具體實施例，免疫細胞係骨髓衍生抑制細胞(MDSC)。於若干具體實施例，免疫細胞係T細胞。於若干具體實施例，T細胞係選自由Jurkat細胞、初始T細胞、效應T細胞、衰竭T細胞、失活型T細胞及調控性T細胞所組成之群組。

於若干具體實施例，報導基因係包含於選自由與細胞毒性相關之報導建構體、與細胞凋亡相關之報導建構體及與增生相關之報導建構體所組成之群組的DNA建構體。於其他具體實施例，與細胞毒性相關之報導建構體係基於螢光之報導建構體。於若干具體實施例，與細胞凋亡相關之報導建構體係基於螢光之報導建構體。於若干具體實施例，基於螢光之報導建構體包含與T細胞相關之轉錄反應單元，其後有最小CMV啟動子及GFP報導基因。於其他具體實施例，與T細胞相關之轉錄反應單元係選自由NF-κ B、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK及PI3K所組成之群組。於若干具體實施例，與增生相關之報導建構體中的報導基因為細胞介素基因。於若干具體實施例，細胞介素係選自由IFN-γ、TNF-α及IL-10所組成之群組。

於若干具體實施例，複數個人類膜基因包含選自由受體基因、免疫球蛋白基因、運輸蛋白基因及訊息基因所組成之群組之基因。於若干具體實施例，複數個人類膜基因包含約1,000至7,000個基因。於其他具體實施例，複數個人類膜基因包含約2,000至5,000個基因。於另外其他具體實施例，複數個人類膜基因包含約4,000至7,000個基因。

於若干具體實施例，第二細胞之活性係選自細胞增生、細胞抑制、細胞衰竭、細胞凋亡、及自細胞釋放細胞介素所組成之群組。

本發明之一態樣提供辨識免疫調節因子之方法，包含：提供本文所述之基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)；使第一細胞表現複數個人類膜基因之一者；共同培養第一細胞與第二細胞；偵測第二細胞中之報導基因的表現量；以及比較該報導基因的表現量與控制組第二細胞的報導基因表現量，其中該控制組第二細胞係與未轉染複數個人類膜基因之一者的控制組第一細胞共同培養；其中報導基因的表現量增高表示所呈現的由複數個人類膜基因之一者編碼的蛋白質係作用為刺激性共同訊息分子而刺激第二細胞株的活性，且其中報導基因的表現量減低表示所呈現之由複數個人類膜基因之一者編碼的蛋白質係作用為抑制性共同訊息分子而抑制第二細胞株的活性，從而辨識免疫調節因子。

於若干具體實施例，免疫調節因子係選自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2所組成之群組。於其他具體實施例，免疫調節因子係選自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6及GP1BA所組成之群組。於其他具體實施例，免疫調節因子係選自由FLT1、SEMA6a、SEC22b及GP1BA所組成之群組。

於若干具體實施例，該方法為自動化者。於其他具體實施例，該方法係使用機器人進行。於若干具體實施例，該方法係使用液體作業機器人之技術進行。於其他具體實施例，該方法係使用自動化孔盤作業系統進行。

於若干具體實施例，該方法進一步包括進行選自由體外功能分析、體內分析、受體陣列分析、生物資訊分析、或其組合所組成之群組的分析。

於若干具體實施例，體外功能分析包含以表現複數個人類膜基因之一者及膜結合性之抗-CD3抗體、或其抗原結合片段的第二細胞與初級T細胞培養；及進行選自由細胞增生分析、細胞凋亡分析及細胞介素釋放分析所組成之群組的體外功能分析。於若干具體實施例，初級T細胞為人類初級CD8細胞及/或人類初級CD4細胞。

於若干具體實施例，進行受體陣列分析以辨識免疫調節因子之相互作用。於其他具體實施例，受體陣列包含含有複數個孔之固體支持構造，其中複數個孔之各孔中含有：經編碼複數個受體基因之cDNA基因庫以下述方式轉染的細胞：使細胞呈現由複數個受體基因之一者所編碼的受體；含有免疫調節因子融合標記(tag)之重組蛋白；對該標記有專一性之經螢光標示之抗體；其中，可偵測之螢光訊號為免疫調節因子與受體相互作用之指標。

於若干具體實施例，標記係選自由小鼠IgG2aFc標記、人類IgG1 Fc標記、FLAG標記及6×His標記所組成之群組。於若干具體實施例，免疫調節因子為免疫調節因子的全長蛋白質。於其他具體實施例，免疫調節因子為免疫調節因子之胞外結構域(domain)。

於其他具體實施例，體內分析包含以免疫調節因子投予用於自體免疫疾病或癌症之動物模式。於若干具體實施例，動物模式為注射人類黑色素腫瘤細胞及腫瘤反應T細胞的NOD-scid IL2R γ^null小鼠模式。於其他具體實施例，動物模式為人類化小鼠模式。於另外其他具體實施例，人類化小鼠模式為免疫患者衍生的異種移植(免疫-PDX)模式。

本發明之一態樣提供一種於有其需要之個體中治療自體免疫疾病或癌症的方法，包含以有效量之本文所述之方法所辨識的免疫調節因子投予個體，從而治療個體的自體免疫疾病或癌症。

於若干具體實施例，免疫調節因子係選自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2所組成之群組。於其他具體實施例，免疫調節因子係選自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1、LY6及GP1BA所組成之群組。

本發明之其他態樣之特徵在於一種於有其需要之個體中治療自體免疫疾病或癌症之方法，包含以有效量之本文所述之方法所辨識的免疫調節因子之調控因子投予個體，從而治療個體的自體免疫疾病或癌症。

於若干具體實施例，免疫調節因子係選自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2所組成之群組。於其他具體實施例，免疫調節因子係選自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1、LY6及GP1BA所組成之群組。於若干具體實施例，免疫調節因子之調控因子增高免疫調節因子之表現量及/或活性量。於若干具體實施例，免疫調節因子之調控因子減低免疫調節因子之表現量及/或活性量。

本發明以如下述之圖式及詳細說明所示，惟並不限制於本發明所述之申請專利範圍。

第1A圖繪示基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)之基本原理。簡言之，293T.2A細胞安定地表現膜結合性抗人類CD3抗體ScFv(293T.2A/m.抗CD3)，刺激Jurkat/報導細胞之T細胞活化，而產生可偵測之GFP訊息。來自cDNA基因庫之各膜基因之轉染潛在地影響T細胞活性結果。若分子無效果時，GFP訊息將保持相似。若分子為刺激性時，將偵測到較強之GFP訊息。若分子為抑制性時，將觀察到較弱之GFP訊息。第1B圖繪示膜結合性之抗人類CD3抗體ScFv之建構體，其包含CD5L基因之訊息胜肽序列，且兩端有抗CD3 ScFv及膜附接序列。第1C圖繪示GFP報導建構體，其包含T細胞相關之轉錄因子反應單元(TFRE)並連接最小CMV啟動子及GFP報導基因。

第2A圖繪示使用經m.抗-CD3建構體轉染的293T.2A細胞及表現GFP報導子的Jurkat細胞，偵測膜基因刺激T細胞活性之效果。簡言之，293T.2A細胞先短暫以模擬感染建構體(ctr)、具有或不具有其他T細胞相關膜基因(例如：B7.2、B7-H1、B7-H3及B7-H4)的m.抗-CD3質體轉染，然後以經純化之人類T細胞或PBMC共同培養。在經過48小時之後，胸腺嘧啶核苷之吸收即顯示T細胞增生。第2B圖之圖像，顯示經或未經m.抗-CD3質體轉染之293T.2A細胞與Jurkat/NF-Kb GFP細胞共同培養，在經過共同培養12小時後只在有m.抗-CD3之細胞中偵測到GFP訊息。數據取得自1536成像孔盤。

第3圖之一系列圖像，顯示由GS-TCAA辨識具有刺激或抑制T細胞功能之膜基因。簡言之，293T.2A細胞先以模擬感染建構體(ctr)、具有或不具有其他T細胞相關膜基因的m.抗-CD3質體轉染，然後與Jurkat/NF-Kb GFP細胞共同培養。在經過共同培養12小時後，偵測到GFP訊息。數據取得自1536孔成像孔盤。

第4圖描述以GS-TCAA辨識具有刺激或抑制T細胞活性功能之膜基因。簡言之，293T.2A細胞先以模擬感染建構體(ctr)、具有或不具有其他T細胞相關膜基因的m.抗-CD3質體轉染，然後與Jurkat細胞共同培養。定量所釋放之IFN-γ。

第5圖繪示以GS-TCAA偵測之代表性分析。經膜基因轉染之細胞對T細胞活性有刺激功能時，GFP讀數會高於控制組，而經膜基因之細胞對T細胞活性有抑制功能時GFP讀數會低於控制組。

第6圖繪示透過Oncomine資料庫(Oncomine，Thermo Fisher公司)分析，顯示FLT1於多種型之癌症中之表現量不同。

第7圖繪示透過Oncomine資料庫(Oncomine，Thermo Fisher公司)分析，顯示SEMA6a於多種型之癌症中之表現量不同。

第8圖繪示透過Oncomine資料庫(Oncomine，Thermo Fisher公司)分析，顯示SEC22b於多種型之癌症中之表現量不同。

第9圖繪示透過Oncomine資料庫(Oncomine，Thermo Fisher公司)分析，顯示GP1BA於多種型之癌症中之表現量不同。

本發明至少有部分係基於新穎之基因體規模T細胞活性陣列(GS-TCAA)之開發，該GS-TCAA可用以辨識新的免疫調節因子，例如調控T細胞的免疫調節因子。GS-TCAA利用新的以細胞為基礎之螢光報導系統，得以研究90%以上的所有人類膜基因中不同的T細胞活性，諸如增生、抑制、及衰竭。此種方法於人類細胞表面分子如何調控T細胞反應方面提供廣泛地瞭解，並輔助辨識新的免疫調節因子。藉由GS-TCAA，可辨識自體免疫疾病及癌症中未知之共同訊息分子及路徑，以追蹤、辨識、及開發其治療。

因此，於一具體實施例，本發明提供基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)、以及製造基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)的方法。本發明之其他具體實施例包含使用基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)，以辨識免疫調節相關蛋白之方法。於另外其他具體實施例，本發明包含藉由投予免疫調節因子及/或免疫調節因子之調控因子至個體，以治療自體免疫疾病或癌症的方法及組成物。

I.定義

為可更詳細地瞭解本發明，首先先對若干術語加以定義。

除非本文特別限定，否則本發明所使用的相關之科學及技術術語係一般本技術領域之技術熟知者所知之含意。術語應有明確之意義及範圍，然而，在有任何不明確時，本文提供之定義優先於任何辭典中或所衍生之定義。

說明本發明之內容(特別是下述申請專利範圍之內容)中所使用之術語"一個"、"一種"、"該"及類似者，除非本文特別指明或明顯與說明書相抵觸，所指係包含單數及複數(即一種或以上)。術語"包括"、"具有"、"包含"及"含有"，除非另外指明，係指開放性術語(亦即指"包含，但並不限定於")。本文所敘述的數值之範圍，除非本文有特別指明，僅是以簡化之方法指出個別敘述於或落於該範圍中的各個各別之數值，且各個各別之數值係如同其被個別記載地合併在說明書中。本文所提供之範圍，可以明瞭係簡化所有數值在該範圍中。例如，1至50之範圍，可以瞭解係包含來自於由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、3334、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50所組成之群組的任意數目、數目之組合，或者來自於由10至40、20至50、5至35等所組成之群組的子範圍。

如本文所述，術語"孔"一般係指在容器中的有界限之區域，可為離散(例如提供予經分離之樣品)或與一或多種其他有界限區域互通(例如提供予在孔中之一或多種樣品之間的液體互通)之任一種。例如，生長在基板上之細胞通常包含在孔中，其中亦可含有活細胞之培養基。基板可含有任何適當之物質，例如塑膠、玻璃等。塑膠通常使用於體外之細胞維持及/或生長。

"多孔盤"為含有多於一個單孔在陣列中之基板之實例。用於本發明中之多孔盤可為任何不同之標準規格(例如具有2、4、6、24、96、384、或1536孔等之盤)，但亦可為非標準規格，如在以下詳細說明者。

如本文使用，術語"細胞"包含原核及真核細胞。於一具體實施實施例，適於使用在本發明之陣列及方法中之細胞為細菌細胞。於其他具體實施例，適於使用在本發明之陣列及方法中之細胞為真菌細胞，舉例如酵母菌細胞。於其他具體實施例，適於使用在本發明之陣列及方法中之細胞為脊椎動物細胞，舉例如鳥類細胞或哺乳動物細胞。於較佳具體實施實施例，適於使用在本發明之陣列及方法中之細胞為哺乳動物細胞。

如本文使用，術語"免疫細胞"包含為造血性起源之細胞，且在免疫反應中之擔負要角。免疫細胞包含先天性免疫系統細胞及後天性免疫系統細胞。免疫細胞包含例如：淋巴細胞，如B細胞及T細胞；自然殺手細胞；及骨髓細胞，如單核球細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、嗜鹼性球、及顆粒球。

於一具體實施例，免疫細胞為先天性免疫系統細胞。"先天性免疫系統"為非專一性免疫系統，可控制身體對媒介物之反應至專一性更高的後天性免疫系統產生專一性抗體及/或T細胞(Modlin et al.,N.Engl.J.Med. 1999,340：1834-1835)。先天性免疫系統一般包含：吞噬細胞(例如：嗜中性球、單核球細胞、及巨噬細胞)；釋放發炎介質之細胞(例如：嗜鹼性球、肥大細胞、及嗜酸性球)；自然殺手細胞(NK細胞)；及樹突細胞(DC)。相對地，"後天性"、或"後天性免疫系統"，反應之專一性極高。稱為後天性系統係由於其係在個體生存期間隨著適應病原感染而發生。後天性免疫可藉由對疫苗(抗原)之反應或投予抗體而人為地獲得，或可藉由感染而自然地獲得。

如本文使用，"抗原呈現細胞"係指可在其表面呈現與主要組織相容性複合體(MHCs)複合的外源抗原之細胞，該外源抗原再被T細胞經由其T細胞受體所辨識。抗原呈現細胞包含持續表現MHC分子之細胞(例如：B淋巴細胞、單核球細胞、樹突細胞、及蘭格漢氏細胞(Langerhans cell))、以及其他不持續表現MHC分子的抗原呈現細胞(例如：角質細胞、內皮細胞、星狀細胞、纖維母細胞、及寡樹突細胞)。

如本文使用，術語"T細胞"(即T淋巴細胞)意指包含所有T細胞系譜中之細胞，即包含來自於哺乳動物(例如：人類)之胸腺細胞、未成熟T細胞、成熟T細胞等。T細胞包含成熟T細胞，其表現CD4或CD8之任一種，但不同時為兩者，以及T細胞受體。在本文所述之各種T細胞群組可依照其細胞介素概況及其功能細分。

如本文使用，術語"初始T細胞"包含尚未暴露在同源抗原(cognate antigen)中因而未經活化或記憶細胞之T細胞。初始T細胞並不循環而人類初始T細胞為CD45RA⁺。若初始T細胞辨識抗原，並依據但不限定於抗原之量、投藥之路徑及投藥之時機而接受另外的訊息，則可增生及分化為各亞群之T細胞，例如效應T細胞。

如本文使用，術語"效應T細胞"包含功能為消除抗原(例如：藉由產生細胞介素以調節其他細胞之活性或藉由細胞毒性)之T細胞。術語"效應T細胞"包含輔助性T細胞(例如：Th1及Th2細胞)及細胞毒性T細胞。Th1細胞調節遲發型過敏反應及巨噬細胞活化，而Th2細胞提供B細胞輔助且為過敏反應之關鍵(Mosmann and Coffman,1989,Annu.Rev.Immunol.7,145-173、Paul and Seder,1994,Cell 76,241-251、Arthur and Mason,1986,J.Exp.Med.163,774-786、Paliard et al.,1988,J.Immunol.141,849-855、Finkelman et al.,1988,J.Immunol.141,2335-2341)。

如本文使用，術語"調控性T細胞"包含產生低量IL-2、IL-4、IL-5、及IL-12之T細胞。調控性T細胞可產生TNF α、TGF β、IFN-γ、及IL-10，但量較效應T細胞為低。雖然TGF β為調控性T細胞所產生的主要之細胞介素，其產生之細胞介素量較Th1及Th2細胞為低，例如較Th1或Th2細胞低1次方大小。調控性T細胞可在CD4⁺CD25⁺群組細胞中發現(參考如：Waldmann and Cobbold.2001.Immunity.14：399)。調控性T細胞主動地抑制培養中經活化訊息(例如：抗原及抗原呈現細胞或模擬MHC背景中之抗原的訊息，如抗CD3抗體加上抗CD28抗體)刺激的 Th1、Th2或初始T細胞之增生及細胞介素的產生。

如本文使用，術語"衰竭T細胞係指失能之T細胞，其以逐步且漸進地喪失T細胞的功能為特徵，並可在反應性細胞之實體刪除時告終。衰竭T細胞可在慢性感染或癌症期間增加。例如，衰竭在受慢性淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒感染期間明確地定義且通常是在抗原持續存在之條件下發展，該條件發生在許多重大公共衛生相關的慢性感染(包括B型肝炎病毒、C型肝炎病毒及人類後天免疫缺乏病毒感染)之後，以及發生在腫瘤過度生長期間(參見例如John Wherry,Nature Immunology 12,492-499,2011)。

如本文使用，術語"失活型T細胞"係指功能上不活化及即使在存在充分之共刺激下接觸抗原亦無法開始增生反應的T細胞(參見例如Macián F.et al.,Curr Opin Immunol.2004,16(2)：209-16.)。T細胞失活係一種耐性機制，其中淋巴細胞在接觸抗原後本質地功能上不活化，但在低反應狀態下仍維持生存一段延長期間。典型之T細胞失活同時影響CD4⁺及CD8⁺細胞分為2大類型。一類為細胞殖株失活，主要為生長停止狀態，而另一類為後天耐受性或體內失活，表現更廣義的增生及效應功能抑制(參考如：Schwartz RH.Annu Rev Immunol.2003；21：305-34)。

如本文使用，術語"免疫調節因子"係指任何使用GS-TCAA所辨識的可調控免疫系統之分子。例如，以本發明之陣列及方法所辨識的免疫調節因子係調控T細胞活性之分子。例如，免疫調節因子可增高T細胞之活性或可減低T細胞之活性。免疫調節因子可使用以治療自體免疫疾病及/或癌症。

如本文使用，術語"免疫調節因子之調控因子"係指任何可如上述調控免疫調節因子之表現及/或活性之媒介物。免疫調節因子的調控因子可增高或減低免疫調節因子的表現及/或活性。於一具體實施例，免疫調節因子的調控因子直接作用於免疫調節因子，例如其為抗體而結合至免疫調節因子並活化或者抑制其功能。免疫調節因子之調控因子亦可用以治療自體免疫疾病及/或癌症。

如本文使用，術語"培養"係指在各種類型培養基中或培養基上之體外增殖細胞或生物體。應理解，培養中細胞生長之子代可不完全(即在形態上、遺傳上、或表現型上)相同於親代。

如本文使用，術語"相互作用"係指包含分子間可偵測之相互作用，例如可利用如基於螢光之偵測方法、酵母菌雙雜合分析法、染色質免疫沉澱法、或免疫共沉澱法偵測。該術語"相互作用"亦指包含分子之間之"結合"的相互作用。自然情形下相互作用可為蛋白質-蛋白質或蛋白質-核酸。

如本文使用，術語"轉染"係指傳送核酸、蛋白質或其他巨分子至標的細胞，以在細胞內表現核酸、蛋白質或其他巨分子或者使其具有生物功能。

如本文使用，術語"發螢光的"係指可顯現"螢光"(或"光激螢光")的任意物質或媒介物，其係藉由分子吸收較短波長之光子而激發以放射光。因此螢光須依靠"激發光源"，即不同於較長波長的螢光之"放射"係由螢光體所發出。偵測放射的螢光，須要只對所放射的光而非對激發之光有反應之偵測器。

Ⅱ.基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)

本發明之一態樣，其特徵為基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)。本發明之陣列包含含有複數個孔之固體支持構造，其中該複數個孔之各孔含有第一細胞及第二細胞。該第一細胞表現膜結合性之抗CD3抗體、或其抗原結合片段，並經編碼複數個人類膜基因之cDNA基因庫以使第一細胞呈現由該複數個人類膜基因之一者所編碼的蛋白質之方式轉染。第二細胞表現在細胞表面之受體，該受體與存在於第一細胞上之抗CD3抗體、或其抗原結合片段相互作用，進而提供初級訊息以刺激第二細胞的活性。而且，第二細胞表現報導基因，其中報導基因表現量之增高表示轉染於第一細胞而由複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現的蛋白質係作用為刺激性共同訊息分子而刺激該第二細胞株之活性；而其中報導基因表現量之減低表示由複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現的蛋白質係作用為抑制性共同訊息分子而抑制該第二細胞株之活性。

本發明使用之固體支持構造可為適於固定且能使培養之細胞生長的任意支持物。適當使用作為固體支持物之材質包含但並不限定於：塑膠、玻璃、聚合物、金屬等。於一具體實施例，固體支持物為多孔盤。本發明中可使用之多孔盤可為任意之不同的標準規格，例如：4孔盤、6孔盤、24孔盤、96孔盤、384孔盤及1536孔盤。或者，本發明使用之多孔盤可為非標準規格者，例如：具有至少500孔、至少1000孔、至少1500孔、或至少2000孔之多孔盤。

適用於本發明之陣列之細胞包含各種類型之真核細胞及原核細胞。於較佳具體實施例，細胞為真核細胞，特別是哺乳動物細胞。於若干具體實施例，使用在本發明之陣列中的細胞為經基因工程操作之細胞，例如經至少一種異源核酸序列所轉形之細胞。該核酸分子可編碼T細胞受體、或任何人類膜蛋白。經基因工程操作之細胞可包含一種以上之異源核酸序列。本文所述之核酸序列、或分子可為：DNA、RNA、或者DNA或RNA之任一種的雜合體或衍生物。使用於本發明之陣列之核酸分子可包含調控核酸分子表現之調控區域(例如：轉錄或轉譯調控區域)、全部或部分之編碼區域、及其組合。應理解，核酸分子之任何部分可經由下述產生：(1)自其天然之環境中分離該分子；(2)利用重組DNA技術(例如：PCR擴增反應、選殖)；或(3)利用化學合成方法。基因係包含所有關於例如天然細胞表面受體基因的核酸序列，例如控制由該基因編碼之細胞表面受體之產生的調控區域(例如：轉錄、轉譯或轉譯後控制區域，但並不限定於此)以及編碼區域本身。

核酸分子可包含編碼蛋白質之天然核酸分子的功能相等物或能與蛋白質結合之天然核酸序列的功能相等物。天然核酸分子的功能相等物可包含但並不限定於：天然的對偶基因變體及經修飾之核酸分子，其中核苷酸經插入、刪除、取代及/或反轉於該分子中而對該序列編碼產物的功能無不良影響。於若干具體實施例，該核酸編碼人類膜蛋白。於若干具體實施例，核酸係報導基因。

適用於本發明之陣列中之異源核酸分子(例如：異源細胞表面受體編碼核酸分子)轉形可藉由使基因插入細胞中的任意方法完成。轉形技術包含但並不限定於：轉染、反轉錄病毒感染、電穿孔法、脂質體轉染法、以細菌之轉形及球形質體(spheroplast)融合。轉形至適用於本發明之陣列中的細胞之核酸分子可維持在染色體外載體(暫時之轉染)上或可嵌入細胞基因組(安定之轉染)中。為獲得安定之細胞株，所欲之基因及適當的病毒轉錄啟動子係插入如質體或反轉錄病毒之適當的載體，該載體含有對生長抑制化合物(例如抗生素，如新黴素)賦予耐受性的可選擇之標記。DNA建構體係導入細胞中，且安定地嵌入宿主細胞株的基因體，以提供安定之細胞株，其可在對經工程操作之細胞有耐受性之適當抗生素之存在下選擇性地培養。或者，暫時之轉染在宿主細胞中可適當地使用腺病毒載體進行。載體DNA分子並不嵌入宿主之染色質中，而以染色體外之分子存在，並視細胞類型而定，一般存在期間為24至96小時。

本發明之核酸分子在細胞中之表現可以本技術領域之技術熟知者所知的技術完成。簡言之，核酸分子係以使該核酸分子操作性地連接至轉錄控制序列之方式插入表現載體中，當基因轉形入宿主細胞時，該核酸分子可有效地持續性或調控性表現該基因。如本文使用，詞語"重組分子"係指操作性地連接至表現載體上的至少一個轉錄控制序列之基因。如本文使用，詞語"表現載體"係指可轉形宿主細胞、在宿主細胞內複製、及影響操作性連接基因之表現之DNA或RNA載體。表現載體視其固有特性而定，可以高或低之拷貝數複製。轉錄控制序列可控制所產生之蛋白質之量，包含控制開始、延伸、及終止的序列。特別重要的轉錄控制序列為控制轉錄開始者，如啟動子及上游活化序列。

表現系統之建構，可以本技術領域之技術熟知者已知的方法將任意已知的控制單元操作性地連接至核酸序列。參見如：Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press，其整體已併於本文中以為參考。

於較佳具體實施例，複數個人類膜基因係轉染至第一細胞中，且係以使該等基因可表現並各別地呈現在細胞表面之方式。為達如此，可使用在實施例部分中所述之經最佳化的反向轉染操作步驟。或者，基因之表現及各別呈現可以任何已知之基因轉形技術達成，包含但並不限定於：反轉錄病毒轉導、慢病毒轉導、脂質體轉染及CRISPR。

在本發明之固體支持構造中之第一細胞可為本技術領域已知之任何適於轉染及表現人類膜基因的標準細胞，例如人類293T細胞。或者，第一細胞為中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)細胞。另一第一細胞之實例為COS-7細胞。於較佳具體實施例，第一細胞為表現免疫相關銜接蛋白之人類293T.2A細胞。免疫相關銜接蛋白之實例包含但並不限定於：DAP10、DAP12、FcR γ、及CD3E。本發明之第二細胞係免疫細胞，其活性經與呈現在第一細胞之蛋白質相互作用而調節。於若干具體實施例，在本發明之陣列中的第二細胞為如T細胞之免疫細胞。T細胞之實例包含但並不限定於：Jurkat細胞、初始T細胞、效應T細胞、衰竭T細胞、失活型T細胞及調控性T細胞。或者，第二細胞可為骨髓衍生抑制細胞。

於若干具體實施例，本發明陣列中之第二細胞係經工程操作以安定地表現細胞分析之感測器或可偵測之報導子，例如由表現螢光蛋白或表現酵素之報導基因，藉以提供細胞分析讀值。於若干具體實施例，報導基因係包含在含有驅使報導基因表現的誘導性轉錄控制單元之報導建構體中。於若干具體實施例，報導建構體為與細胞毒性相關之報導建構體。於其他具體實施例，報導建構體為與細胞凋亡相關之報導建構體。於另外其他具體實施例報導建構體為與增生相關之報導建構體。

報導基因技術廣泛使用在監測與訊息傳導及基因表現有關之細胞事項。本發明說明書中，術語報導基因係用以指允許偵測人類膜基因對細胞(例如T細胞)活性的效應之基因，具有可快速測定之表現型而可容易地與背景區分。報導基因建構體包含誘導性轉錄控制單元，其驅使報導基因表現，例如使用T細胞相關之轉錄反應單元以表現綠色螢光蛋白(GFP)。例示性的T細胞相關之轉錄反應單元包含但並不限定於：NF-κ B、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK、及PI3K。本發明之陣列中適於使用之報導基因包含但並不限定於：酵素、螢光蛋白、光蛋白、融合蛋白及抗原決定基標記。酵素報導基因的實例包含但並不限定於：β-半乳醣酶、鹼性磷酸酶、β-內醯胺酶、螢光酶及硝基還原酶。螢光蛋白的實例包含但並不限定於：維多利亞多管發光水母(Aequorea victoria)綠色螢光蛋白(GFP)及其變體(例如：藍螢光蛋白及黃螢光蛋白)。合適之光蛋白包含但並不限定於水母素(aequorin)。或者，本發明之報導基因為細胞介素基因。例示性的細胞介素基因包含但並不限定於：IFN-γ、TNF-α及IL10。

可藉由本發明而進行之報導基因分析之一實例，使用藉由工程操作而導入有含有編碼衍生自GFP或其任意變體之螢光蛋白(如EGFP、YEP、或BFP(Shaner,N.C,et al,Nat.Methods,2005,2(12)：905-9))之核苷酸序列的核酸分子之細胞，該核酸分子操作性地連接至且在控制下的表現控制序列，例如T細胞相關之轉錄反應單元，包含但並不限定於：NF-κ B、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK及PI3K。然後藉由監測GFP或功能性GFP類似物所放射之螢光作為測定T細胞活性之手段。該方法可使用於偵測及比較轉染至第一細胞之膜基因對於第二細胞整體活性之效應。

本發明之陣列亦包含複數個人類膜基因之cDNA基因庫。產生cDNA基因庫的方法為本技術領域中一般熟知者。簡言之，建構cDNA基因庫典型之方法，係首先自特定細胞分離mRNA並在之後的連續操作中以不同的酵素及鹼處理。同時，以可嵌入合成cDNA之方式處理載體(例如：質體pBR322)。在經過cDNA黏合並預處理載體之後，再以該載體-cDNA建構體轉形適當之宿主(例如：E.coli K12株)，並將該宿主塗布在適當之基板上並培育。以此方式所獲得之所有轉形細胞群落即構成cDNA基因庫(Gubler et al,Gene,25(2-3)：263-269,1983)。於若干具體實施例，複數個人類膜基因包含約1,000至7,000基因、約2,000至5,000基因、約4,000至7,000基因或約100至5,000基因。例如，複數個人類膜基因包含至少500、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000個人類膜基因。於若干具體實施例，複數個人類膜基因包含超過6,000個人類膜基因，其涵蓋超過90%之全部人類膜基因。

本發明之陣列中所使用之膜基因代表全部範圍的人類膜基因組。於若干具體實施例，膜基因為受體基因。於其他具體實施例，膜基因為訊息基因。於另外其他具體實施例，膜基因為免疫球蛋白基因。於若干具體實施例，膜基因為運輸蛋白基因。

本發明之陣列允許篩選多種T細胞活性，包含但並不限定於：細胞增生、抑制、衰竭、細胞毒性、凋亡、及細胞介素之釋放，其使T細胞上的T細胞受體與抗原呈現細胞上之抗原/MHC複合體或模擬MHC背景中之抗原的訊息(例如：抗CD3抗體)發生相互作用。如本文使用，T細胞之"活化"係指誘導T細胞之訊息傳導路徑導致T細胞增生、T細胞分化、及/或產生細胞產物(例如：細胞介素)。

根據本發明，如本文所述，T細胞受體(TCR)特別指T細胞之抗原受體。本技術領域中一般所知，有其他多種對T細胞反應而言為重要且由T細胞所表現之受體，包含但並不限定於：CD3、CD4、CD8、CD28、CTLA-4、CD45、CD43及Thy-1。T細胞受體可由編碼T細胞受體之天然存在的基因及/或轉形於細胞之異源核酸分子表現。同樣，如本文所述之膜蛋白可由天然存在的基因及/或轉形於細胞之異源核酸分子於細胞中表現。

本發明之陣列中，第一細胞(例如：人類293T.2A細胞，作為抗原呈現細胞)與第二細胞(例如：T細胞)在可保持該等細胞存活並可與其他細胞互相作用而活化訊息傳導路徑之條件(例如：培養基、溫度、氧氣、CO₂、培育時間)下一起培養。因此，細胞可在任意適當的培養基中培養，該培養基含有細胞生長所須之組分，例如碳、氮及微量營養成分。適合此類細胞之培養基及生長條件之測定是本技術領域所習知者。 Ⅲ.基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)之製造方法

本發明中亦提供製造基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)之方法。本發明包含提供含有複數個孔之固體支持構造，且在複數個孔之各孔中含有第一細胞及第二細胞。第一細胞係經轉染以安定地表現膜結合性之抗CD3抗體、或其抗原結合片段。第二細胞在細胞表面表現受體，其與呈現於第一細胞的抗CD3抗體、或其抗原結合片段相互作用，並提供刺激第二細胞之活性的初級訊息。本發明之方法亦包含：在複數個孔之各孔中培養表現膜結合性之抗CD3抗體、或其抗原結合片段之第一細胞；以編碼複數個人類膜基因之cDNA基因庫轉染第一細胞，以使第一細胞呈現由複數個人類膜基因之一者所編碼的蛋白質；以及在複數個孔之各孔中與表現在細胞表面之受體及報導基因之第二細胞共同培養。第二細胞表現報導基因，其中報導基因的表現量增高，即表示由轉染至第一細胞中之複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現的蛋白質係作用為刺激性共同訊息分子而刺激第二細胞之活性；且其中報導基因的表現量減低，即表示由複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現的蛋白質係作用為抑制性共同訊息分子而抑制第二細胞之活性。

本發明之方法中所使用之固體支持構造可為適於固定及使上述所培養之細胞生長的固體支持構造。於一具體實施例，固體支持構造為多孔盤。利於本發明使用之多孔盤可為各種標準規格之任意者，例如：4孔盤、6 孔盤、24孔盤、96孔盤、384孔盤及1536孔盤。或者，本發明中使用之多孔盤可為非標準規格，例如：含有至少500孔、至少1000孔、至少1500孔、至少2000孔之多孔盤。

適合本發明之方法中使用之細胞包含上述所有類型之真核及原核細胞。於較佳具體實施例，細胞為真核細胞，特別為哺乳動物細胞。於若干具體實施例，本發明之方法中所使用之細胞為經過基因工程操作之細胞，例如經至少一種異源核酸序列轉形之細胞。該核酸分子可編碼T細胞受體、人類膜蛋白、或報導子。該核酸分子可以本技術領域中所知之任意分子生物技術、或上述Ⅱ部分之任意方法產生。

該異源核酸分子(例如：編碼異源膜蛋白之核酸分子)轉形至適用於本發明之方法中之細胞，可藉由使基因嵌入前述細胞中的任意方法完成。於較佳具體實施例，複數個人類膜基因係轉染至第一細胞，其係藉由以使該等基因表現並各別呈現在細胞表面之方式。為達如此，可使用實施例部分中所述的經最佳化的反向轉染操作步驟。或者，使基因表現並各別呈現可藉由任意已知之轉基因技術達成，包含但並不限定於此：反轉錄病毒轉導、慢病毒轉導、脂質體轉染及CRISPR。

本發明之固體支持構造中的第一細胞可為本技術領域中任意之已知適於轉染及表現人類膜基因之標準細胞，例如人類293T細胞的。或者，第一細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。第一細胞之另一實例為COS-7細胞。於較佳具體實施例，第一細胞為人類293T.2A細胞，其表現免疫相關銜接蛋白。免疫相關銜接蛋白之實例包含但並不限定於：DAP10、DAP12、FcR γ及CD3E。本發明之第二細胞為免疫細胞，其活性依與第一細胞表面所呈現之蛋白相互作用而調節。於若干具體實施例，本發明之方法中之第二細胞為例如T細胞之免疫細胞。T細胞實例包含但並不限定於：Jurkat細胞、初始T細胞、效應T細胞、衰竭T細胞、失活型T細胞及調控性T細胞。或者，第二細胞可為骨髓衍生抑制細胞。

於若干具體實施例，本發明之方法中之第二細胞為經工程操作而安定地表現細胞分析之感測器或可偵測之報導子，例如表現螢光蛋白或表現酵素之報導基因，藉以提供細胞分析讀值。於若干具體實施例，報導基因係包含在含有驅使報導基因表現的誘導性轉錄控制單元之報導建構體中。於若干具體實施例，報導建構體為與細胞毒性相關之報導建構體。於其他具體實施例，報導建構體為與細胞凋亡相關之報導建構體。於另外其他具體實施例報導建構體為與增生相關之報導建構體。

用於偵測人類膜基因對T細胞的效果之報導基因可以本技術領域已知之標準方法產生。如上所述，報導建構體係包含驅動報導基因表現的誘導性轉錄控制單元，例如使用表現綠色螢光蛋白(GFP)的與T細胞相關之轉錄反應單元。與T細胞相關之轉錄反應單元之實例包含但並不限定於：NF-κ B、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK及PI3K。本發明中適當之報導子包含但並不限定於：酵素、螢光蛋白、光蛋白、融合蛋白及抗原決定基標記。酵素報導子之實例包含但並不限定於：β-半乳醣酶、鹼性磷酸酶、β-內醯胺酶、螢光酶及硝基還原酶。螢光蛋白之實例包含但並不限定於：維多利亞多管發光水母綠色螢光蛋白(GFP)及其變體(例如：藍螢光蛋白及黃螢光蛋白)。合適之光蛋白包含但並不限定於水母素。或者，本發明之報導基因可為細胞介素基因。細胞介素之實例包含但並不限定於：IFN-γ、TNF-α及IL10。

本發明之方法中，第一細胞(例如：作為抗原呈現細胞之人類293T.2A細胞)係與第二細胞(例如：T細胞)共同培養。術語"培養"係指在各種類型培養基之上或其中之體外增殖細胞或生物體。應理解，培養中細胞生長之子代可不完全相同於(例如：形態上、遺傳上、或表現型上)親代。細胞係在使該細胞可保持為活細胞並可與其他細胞相互作用而活化訊息傳遞路徑之條件下(例如培養基、溫度、氧氣、CO₂、培育期間)培養。因此，可將細胞培養於任何含有如碳、氮及微量營養成分的細胞生長所須之組分的適當培養基中。對此細胞為適當之培養基及生長條件之選定為本技術領域之熟知技術者所熟習。

本發明方法中所使用之細胞可在各種類型培養基中培養。可商購之培養基例如：Ham’s F10^TM(Sigma)、最少必須培養基(Minimal Essential Meduim^TM)(MEM)(Sigma)、RPMI-1640^TM(Sigma)、及Dulbecco修改Eagle氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagel’s Medium^TM)(Sigma)，亦適用於培養細胞。同時，在Ham et al.,Meth.Enz.58：44(1979)、Barnes et al.,Anal.Biochem.102：255(1980)、美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655、或第5,122,469號、國際專利WO 90/03430、WO 87/00195、或美國專利Re.30,985中記載之任意培養基亦可使用作為細胞之培養基，該等教示之整體係併於本說明書中以為參考。任意之此類培養基中視其須要亦可再補充：激素及/或其他之生長因子(例如：胰島素、運鐵蛋白、或表皮生長因子)、鹽類(例如：氯化鈉、鈣、鎂、及磷)、緩衝劑(例如：HEPES)、核苷酸(例如：腺嘌呤核苷及胸腺嘧啶核苷)、抗生素(例如：健他黴素(gentamycin)藥物)、微量元素(定義為通常以最終濃度為微莫耳存在之無機化合物)、及葡萄糖或同等之能量來源。其他必須之任意補充物亦可以本技術領域之技術熟知者所知的適當濃度而包含在內。培養條件，例如溫度、pH等，係先前使用以培養經選擇用於表現之宿主細胞者，亦為一般熟知技術者所知者。

Ⅳ.使用基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)之篩選分析

本發明亦提供辨識免疫調節因子的方法，其在治療自體免疫疾病及/或癌症方面有潛在醫療用途。該方法涉及提供Ⅱ部分所述之基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)，以使第一細胞表現複數個人類膜基因之一者；共同培養第一細胞與第二細胞；偵測第二細胞中的報導基因的表現量；以及比較該報導基因的表現量與控制組第二細胞的報導基因表現量，其中該控制組第二細胞係與未經複數個人類膜基因之一者轉染的控制組第一細胞共同培養。報導基因的表現量增高表示由複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現的蛋白質係作用為刺激性共同訊息分子而刺激第二細胞株之活性；而報導基因的表現量減低表示由複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現的蛋白質係作用為抑制性共同訊息分子而抑制第二細胞株之活性。

最佳之T細胞活化同時須要通過TCR/CD3複合體之抗原專一性初級訊以及涉及在次級訊息中之共同訊息。於一具體實施例，以本發明之方法所辨識的免疫調節因子調控免疫系統，特別是T細胞活性。例如，免疫調節因子可為調控T細胞活性之共同訊息分子。於若干具體實施例，免疫調節因子活化T細胞之活性。於其他具體實施例，免疫調節因子抑制T細胞之活性。於另外其他具體實施例，免疫調節因子可使用以治療自體免疫疾病及/或癌症。

於若干具體實施例，免疫調節因子係選自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2所組成之群組，其中免疫調節因子增高或促進T細胞之活性。或者，免疫調節因子係選自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6及GP1BA所組成之群組，其中免疫調節因子對T細胞之活性展現抑制性之效果。於若干具體實施例，免疫調節因子係選自由FLT1、SEMA6a、SEC22b及GP1BA所組成之群組。

本發明提供廣泛之以細胞為主的篩選方法，其適於與多種藥劑之辨識及發現的方案一起使用，使用在高通量篩選型態更佳。自動化之高通量篩選描述在如：Burbaum et al.,1997,Current Opinion in Chemical Biology,1：72-78、及Schullek et al.,1997,Analyt.Biochem.246：20-29。於若干具體實施例，本發明之方法係使用機器人進行，例如機器人之液體作業系統。作為非限定性實例，本發明之高通量篩選中，可以機器人之Tecan Freedom EVO200型液體作業平台進行液體作業之操作。其他篩選所須之儀器(例如：培養箱、孔盤之清洗機、孔盤之操作系統、孔盤之讀取機)為視須要時可適合於自動化運作、或商購作為自動化模組。例如，分析中試樣之移送可使用自動化孔盤操作系統(Matrix PlateMate Plus，Thermo科學儀器公司製造)進行。

如本文所使用之"高通量篩選"，係指提供用以同時篩選之多種候選藥劑、試樣或測試化合物之分析。此類分析之實例可包含使用微量滴定孔盤，由於可同時以少量藥劑及試樣進行大量分析，因此特別方便。本發明之方法可容易地以包含但並不限定於96孔、384孔、1536孔型之多孔規格自動化地實施。

於若干具體實施例，本發明之分析可於細胞上利用顯微影像偵測光譜(例如螢光)之性質變化進行。於其他具體實施例，可以多孔盤規格進行分析並使用微量多孔盤讀取機判斷光譜之特性。適於在本發明之方法中使用之儀器為可商購者，例如：來自於Molecular Devices(FLEXstation^TM微量多孔盤讀取機及送液系統或FLIPR^TM系統)、來自於Hamamatsu(FDSS 6000)、PerkinElmer Life and Analytical Sciences(CellLux^TM)、"VIPR"電壓離子探針讀取機(voltage ion probe reader)(Aurora,Bioscience Corp，美國加州)及InCell影像分析機(GE Healthcare Life Sciences)。於若干具體實施例，本發明之方法中所使用的GFP偵測儀器為InCell影像分析機。於其他具體實施例，本發明之方法中的影像分析係使用Cellprolifer軟體進行。

數個整合有液體作業的商業螢光影像系統係可商購者。此等包含但並不限定於Perkin Elmer之CellLux-Cellular Fluorescence Workstation及Hamamatsu之FDSS6000系統。由於各螢光體的激發/放射特性不同，因此，儀器係設置為偵測各分析中所選定的螢光體。選擇適當之螢光體及儀器設置以偵測各試驗所選定之螢光體為熟知技術者所知技術。

適用於本發明之方法中之細胞成像設置可涉及使用裝設有電腦系統之顯微鏡。該電腦可包含用以接收使用者的指令之適當軟體，該指令係呈使用者輸入之一組參數域，或例如事先經各種不同的特定操作之預先設定指令之形式。該軟體視需要轉換該指令為適當語言，以控制系統組件之操作(例如：控制液體作業單元、機器人單元及/或雷射)。電腦亦可接收來自其他系統組件(例如偵測器)的數據，並可轉譯該數據，以人類可以讀取之型式提供予使用者，或依照使用者之任意預先設定，利用該數據啟動另外的操作。該設置之一實例，來自Carl Zeiss之ATTO’s Attofluor^TM RatioVision^TM即時數位螢光分析儀係完整整合工作站(work station)以分析活細胞及製作之樣品的螢光探針(ATTO,Rockville,Md.)。

在以根據本發明之方法及陣列辨識出潛在有治療性之免疫調節因子之後，可再以體外功能分析及小鼠模式之體內分析進一步驗證。於若干具體實施例，本發明之方法包含進行與選自由體外功能分析、體內分析、受體陣列分析、生物資訊分析、或其組合之分析結合之基因體規模的T細胞活性陣列。

本發明之方法中適於使用之體外功能分析包含本技術領域中所知之任意標準T細胞分析，包含但並不限定於：增生分析、凋亡分析或細胞介素(例如：IFN-g、IL-2或IL-10)釋放分析。於若干具體實施例，體外功能分析包含以表現複數個人類膜基因之一者及膜結合性抗CD3抗體、或其抗原結合片段的第二細胞與初級T細胞培養，以及進行T細胞分析。本發明之方法中適於使用之初級T細胞包含任意類型之初級細胞。例示性第一細胞包含但並不限定於人類初級CD8細胞或人類初級CD4細胞。

本發明之方法可與受體陣列分析技術組合進行。受體陣列分析技術為篩選目標蛋白之對應受體(counter-receptor)之建立完備的技術(Zhu Y et al,Nat Commun,4：2043,2013、Yao S et al,Immunity,34(5)：729-740,2011)。簡言之，受體陣列包含含有複數個孔之固體支持構造，其中複數個孔之各孔中包含經編碼受體蛋白之基因轉染的細胞，目標基因(編碼分泌性蛋白)或目標基因的胞外區域(編碼跨膜蛋白，例如：免疫調節因子)係經基因操作與標記基因(小鼠IgG2a Fc、人類IgG1 Fc、FLAG或6xHIS)融合，以製備如前述之融合基因(Chapoval,AI.et al.,Mol Biotechnol 21(3)：259-264,2002)。在各融合基因轉染於293T細胞之後，再使用經過純化之重組融合蛋白針對受體陣列進行篩選。使用針對標記之經螢光標示的二次抗體偵測目標蛋白(例如根據本發明之方法所辨識之免疫調節因子)結合至經轉染之293T細胞，再使用Applied Biosystems 8200細胞偵測系統進行篩選並以CDS 8200軟體分析。前述所參考之整體內容係併於本說明書中作為參考。

以本發明之方法所辨識之免疫調節因子之醫療潛能可再經過體內試驗，例如免疫疾病或癌症之動物模式。於若干具體實施例，體內分析包含以免疫調節因子投予免疫疾病或癌症之動物模式。本發明之方法中所適用之免疫疾病或癌症之動物模式包含本技術領域所知之各種類型的自體免疫疾病或癌症之動物模式，例如，以人類黑色素腫瘤細胞及腫瘤反應性T細胞注射之NOD-scid IL2R γ^null小鼠模式。於其他具體實施例，動物模式為小鼠模式。或者，動物模式為大鼠模式、兔子模式、或猴子模式。於其他具體實施例，動物模式為人類化小鼠模式，例如免疫患者衍生的異種移植(免疫PDX)模式。

本發明之方法亦可與生物資訊分析組合進行。生物資訊方法可使用以縮減與自體免疫疾病或癌症相關之基因。選擇多個嚴苛條件之標準以辨識在疾病發展期間顯著變化之基因，即可能為疾病病因的特徵基因。於一具體實施例，建立分級系統以辨識只在特定之自體免疫疾病或癌症受到調控的特定基因。或者，選擇在不同之自體免疫疾病或癌症中共有之基因。為達如此，可使用在實施例部分中所述之特定的選定標準。

V.治療的方法

本發明之一態樣，係提供於有其需要之個體中治療自體免疫疾病或癌症之方法。該方法包含對有其需要之個體投予有效量之本發明的篩選方法所辨識之免疫調節因子，如前述，從而治療個體的自體免疫疾病或癌症。於其他具體實施例，對有其需要之個體投予有效量之本發明的篩選方法所辨識之免疫調節因子的調控因子，從而治療個體的自體免疫疾病或癌症。

於若干具體實施例，免疫調節因子係選自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2所組成之群組。於其他具體實施例，免疫調節因子係選自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、 TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6及GP1BA所組成之群組。

本發明之方法中適於使用的免疫調節因子之調控因子包含可調控上述免疫調節因子之表現及/或活性量的任意媒介物。於若干具體實施例，免疫調節因子之調控因子增高免疫調節因子之表現量及/或活性量。於若干具體實施例，免疫調節因子之調控因子減低免疫調節因子之表現量及/或活性量。於一具體實施例，免疫調節因子之調控因子結合至免疫調節因子，進而活化或者抑制其功能。免疫調節因子之調控因子之實例包含但並不限定於：免疫調節因子專一性抗體、或其抗原結合片段；免疫調節因子專一性小分子；及/或專一性結合至免疫調節因子的適體。於若干具體實施例，免疫調節因子之調控因子可使用以治療自體免疫疾病及/或癌症。

根據本發明之方法所辨識之免疫調節因子、及/或免疫調節因子的調控因子可以任意之適當的方式投予，包含非經腸投予(例如：注射、輸液)，亦可以皮下、腹膜內、肺內、及鼻內投予，且如須要局部治療時，亦可以病灶內投藥。非經腸輸液包含靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或皮下投藥。而且，根據本發明之方法所辨識之免疫調節因子、及/或免疫調節因子之調控因子亦適合於脈衝式輸液(pulse infusion)，特別是劑量遞減。劑量可經由注射給予，例如靜脈內或皮下注射。投予路徑可視各種因子，例如投予為短期投藥或慢性病投予而選擇。亦考慮其他之投予方法，包含：局部，特別是經皮、黏膜、直腸、口服或局部性投予，例如經由置於接近預定部位之導管。注射，特別是靜脈內更佳。

於一具體實施例，該方法包含以治療有效量之上述免疫調節因子投予個體。於若干具體實施例，該方法包含以治療有效量之免疫調節因子的調控因子投予個體。免疫調節因子或免疫調節因子的調控因子之治療有效量為足以治療個體疾病之量。如本文所述之免疫調節因子及/或免疫調節因子的調控因子的治療有效劑量因個體不同而異，且端視如年齡、體重、及個體之狀況以及傳送路徑之因子。該劑量可依據本技術領域之技術熟知者所知之程序判斷。

可以本發明之方法治療之疾病，包含但並不限定於自體免疫疾病或癌症。"治療"係指可予患者助益的任何型式之治療，該患者例如因疾病發展所苦或有疾病發展風險者。治療包含採用或避免採用而以改善患者之狀況(例如：解除一種或以上之症狀)、延緩疾病之發生或發展為目的之行動。

如本文所述，"自體免疫疾病"係指起因為對抗正常存在於體內之物質或組織的體內不正常之免疫反應的疾病，包含但並不限定於：風濕性關節炎(RA)、青少年慢性關節炎(JCA)、甲狀腺炎、移植物宿主排斥反應(GVHD)、硬皮症、糖尿病、格雷氏症、過敏症、與同種異體移植相關之急性或慢性免疫疾病，例如但並不限定於：腎臟移植、心臟移植、骨髓移植、肝臟移植、胰臟移植、小腸移植、肺臟移植及皮膚移植。

如本文所述，術語"癌症"係指由於無法控制、不正常生長而可蔓延至相鄰組織或身體的其他部分的細胞所引起的一類疾病之一。癌症會形成固態腫瘤，其中癌症細胞會大量聚集、或以分散之細胞存在，如白血病。本發明之方法適於治療之癌症之類型，包含但並不限定於：腎上腺癌、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦/中樞神經系統腫瘤、乳癌、卡斯特雷曼氏病(castleman disease)、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、眼癌、膽囊癌、腸胃道癌、腎臟癌、咽喉及下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、皮膚之淋巴瘤、惡性間皮細胞癌、多發性骨髓瘤、骨髓增生不良症候群、鼻腔及副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍吉金氏淋巴瘤(non-hodgkin lyphoma)、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、垂體腺腫瘤、攝護腺癌、視網膜神經細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮癌、陰道癌、外陰癌、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(waldenstrom's macroglobulinemia)、及威爾姆氏腫瘤(wilms tumor)。

醫藥製劑

醫藥製劑包含根據本發明之方法所辨識的免疫調節因子、及/或本發明之免疫調節因子的調控因子，其可以具有所欲純度之蛋白質或核酸與視需要之生理上可接受之載劑、賦形劑或安定劑混合(Remington藥劑科學，第16版，Osol,A.編輯(1980年))，呈水溶液、冷凍乾燥或其他之乾燥製劑形式製備並保存。可接受之載劑、賦形劑或安定劑為在使用之劑量及濃度對接受者無毒性者，包含：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如：十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；氯化烷基二甲基苄基銨(benzalkonium chloride)、氯化本索寧(benzethonium chloride)；酚、丁基或苯甲基醇；對羥基苯甲酸烷酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲苯酚)；低分子量(低於10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、或離胺酸；單醣、雙醣、及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露醣、或糊精；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醣醇、海藻醣或山梨醣醇；鹽形成之相對離子，如鈉；金屬錯合物(例如：鋅-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，如Tween^TM、Pluronics^TM或聚乙二醇(PEG)。

根據欲治療的特別適應症所需，本文之製劑亦可含有一種以上之活性物質。例如，在治療自體免疫疾病時，在本發明含免疫調節因子或免疫調節因子之調控因子的製劑可與治療自體免疫疾病的已知藥劑組合，如：甲基培尼皮質醇(methyl prednisolone)、丙酮化去炎松(kenalog)、美卓佑(medrol)、培尼皮質醇(prednisolone)、琥珀酸鈉皮質醇(cortef)、氫化可體松(hydrocortisone)、可體松(cortisone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、倍他米松磷酸酯鈉(celestone soluspan)、乙酸甲基培尼皮質醇(methylprednisolone acetate)、潑尼松龍磷酸鈉(orapred ODT)、潑尼松龍veripred 20、舒汝美卓佑(solu-medrol)或甲基培尼皮質醇鈉(methylprednisolone sodium)。在治療癌症時，在本發明含免疫調節因子或免疫調節因子之調控因子的製劑可與治療癌症的已知藥劑組合，如：澤珂(Abiraterone Acetate)、必除癌(ABITREXATE)(胺甲葉酸(Methotrexate))、亞伯杉(ABRAXANE)(白蛋白安定之奈米微粒劑型紫杉醇(Paclitaxel))、雅詩力(ADCETRIS)(Brentuximab Vedotin)、賀癌平(Ado-Trastuzumab Emtansine)、亞德里亞黴素(ADRIAMYCIN)(鹽酸多柔比星(Doxorubicin Hydrochloride))、ADRUCIL(氟尿嘧啶(Fluorouracil))、妥復克(Afatinib Dimaleate)、癌伏妥(AFINITOR)(Everolimus)、樂得美(ALDARA)(咪喹莫特(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、阿來組單抗(Alemtuzumab)、愛寧達(ALIMTA)(Pemetrexed Disodium)、嘔立舒(ALOXI)(鹽酸帕洛諾司瓊Palonosetron Hydrochloride)、瘤可寧(AMBOCHLORIN)(氮芥苯丁酸(Chlorambucil))、瘤可寧(AMBOCLORIN)(氮芥苯丁酸(Chlorambucil))、胺基左旋醣酸(Aminolevulinic Acid)、安美達錠(Anastrozole)、止敏吐(Aprepitant)、雷狄亞(AREDIA) (PamidronateDisodium)、安美達(ARIMIDEX)(Anastrozole)、諾曼癌素(AROMASIN)(Exemestane)、奈拉濱(ARRANON)(Nelarabine)、三氧化二砷(Arsenic Trioxide)、亞舍拉(ARZERRA)(Ofatumumab)、天冬醯胺酶歐文氏菌屬(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、癌思停(AVASTIN)(Bevacizumab)、抑癌特(Axitinib)、阿扎胞苷(Azacitidine)、鹽酸苯達莫司汀(Bendamustine Hydrochloride)、癌思停(Bevacizumab)、貝沙羅汀(Bexarotene)、百克沙(BEXXAR)(托西莫(Tositumomab)單株抗體與I¹³¹碘托西莫單株抗體複方製劑)、博來黴素(Bleomycin)、萬科(Bortezomib)、伯舒替尼(BOSULIF)(博舒替尼(Bosutinib))、去癌達(Cabazitaxel)、蘋果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate)、坎帕斯(CAMPATH)(Alemtuzumab)、抗癌妥(CAMPTOSAR)(Irinotecan Hydrochloride)、截瘤達(Capecitabine)、佳鉑帝(Carboplatin)、蛋白酶抑制劑(Carfilzomib)、治先優(CEENU)(Lomustine)、紅比黴素(CERUBIDINE)(Daunorubicin Hydrochloride)、爾必得舒注射液(Cetuximab)、氮芥苯丁酸(Chlorambucil)、順鉑(Cisplatin)、CLAFEN(環磷醯胺Cyclophosphamide)、宜保安(Clofarabine)、卡博替尼(COMETRIQ)(Cabozantinib-S-Malate)、可美淨COSMEGEN)(Dactinomycin)、截剋瘤(Crizotinib)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、好克癌(CYFOS)(Ifosfamide)、賽德薩(Cytarabine)、泰伏樂(Dabrafenib)、達卡巴仁(Dacarbazine)、達珂(DACOGEN)(Decitabine)、可美淨(Dactinomycin)、柏萊膜衣錠(Dasatinib)、鹽酸柔紅黴素 (Daunorubicin Hydrochloride)、氮杂胞苷(Decitabine)、地加瑞克(Degarelix)、地尼白介素-2(Denileukin Diftitox)、保骼麗(Denosumab)、右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride)、歐洲紫杉醇(Docetaxel)、鹽酸艾黴素(Doxorubicin Hydrochloride)、艾欣宜膚滌(EFUDEX)(氟尿嘧啶(Fluorouracil))、拉布立酶注射劑(ELITEK)(拉司尿酸氧化酶(Rasburicase))、ELLENCE(鹽酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride))、益樂鉑(ELOXATIN)(Oxaliplatin)、乙醇胺(Eltrombopag Olamine)、止敏吐(EMEND)(Aprepitant)、安可坦(Enzalutamide)、鹽酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride)、爾必得舒(ERBITUX)(Cetuximab)、甲磺酸艾日布林(Eribulin Mesylate)、愛維德(ERIVEDGE)(Vismodegib)、鹽酸厄洛替尼(Erlotinib Hydrochloride)、天門冬醯胺酶菊歐氏桿菌(ERWINAZE)(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、伊妥普賽(Etoposide)、癌伏妥(Everolimus)、鈣穩(EVISTA)(Raloxifene Hydrochloride)、諾曼癌素(Exemestane)、弗瑞斯(FARESTON)(Toremifene)、法洛德(FASLODEX)(Fulvestrant)、復乳納(FEMARA)(Letrozole)、惠爾血添(Filgrastim)、福達樂(FLUDARA)(Fludarabine Phosphate)、氟阿腺苷磷酸鹽(Fludarabine Phosphate)、FLUOROPLEX(氟尿嘧啶(Fluorouracil))、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、醛葉酸(Folinic acid)、服瘤停(FOLOTYN)(Pralatrexate)、法洛德注射液(Fulvestrant)、艾瑞莎(Gefitinib)、鹽酸吉西他濱(Gemcitabine Hydrochloride)、滅髓瘤(Gemtuzumab Ozogamicin)、健擇(GEMZAR)(Gemcitabine Hydrochloride)、妥復克(GILOTRIF)(二馬來酸阿法替尼(Afatinib Dimaleate))、基立克(GLEEVEC)(甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate))、賀樂維(HALAVEN)(Eribulin Mesylate)、賀癌平(HERCEPTIN)(Trastuzumab)、癌康定(HYCAMTIN)(Topotecan Hydrochloride)、替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)、普纳替尼(ICLUSIG)(Ponatinib Hydrochloride)、好克癌注射劑(Ifosfamide)、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)、樂得美(Imiquimod)、抑癌特(INLYTA)(Axitinib)、因治隆(INTRON A)(重組干擾素α-2b)、I¹³¹托西莫單株抗體與托西莫單株抗體複方製劑、Ipilimumab、艾瑞莎(IRESSA)(Gefitinib)、抗癌妥(Irinotecan Hydrochloride)、ISTODAX(羅米地辛(Romidepsin))、Ixabepilone、捷可衛(JAKAFI)(Ruxolitinib Phosphate)、去癌達(JEVTANA)(Cabazitaxel)、賀癌寧(Kadcyla)(Ado-Trastuzumab Emtansine)、鹽酸雷洛西芬(KEOXIFENE)(Raloxifene Hydrochloride)、帕利夫明(KEPIVANCE)(Palifermin)、卡非佐米(KYPROLIS)(Carfilzomib)、二甲苯磺酸(Lapatinib Ditosylate)、威克瘤(Lenalidomide)、復乳納(Letrozole)、若克瘤(LeucovorinCalcium)、乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)、Lomustine、柳菩林(LUPRON)(乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、馬奇波(MARQIBO)(硫酸長春新鹼微脂體(Vincristine Sulfate liposome))、丙卡巴肼(MATULANE)(甲基苯肼鹽酸鹽(Procarbazine Hydrochloride))、鹽酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)、麥格斯(MEGACE)(乙酸孕甾酮(Megestrol Acetate))、乙酸孕甾酮(Megestrol Acetate)、曲美替尼(MEKINIST)(Trametinib)、巰基嘌呤(Mercaptopurine)、美司鈉(Mesna)、替莫唑胺(METHAZOLASTONE)(Temozolomide)、甲胺蝶呤(Methotrexate)、絲裂黴素(Mitomycin)、普樂沙福(MOZOBIL)(Plerixafor)、氮芥(MUSTARGEN)(Mechlorethamine Hydrochloride)、排多癌(MUTAMYCIN)(絲裂黴素C(Mitomycin C))、MYLOSAR(阿扎胞苷(Azacitidine))、滅髓瘤(MYLOTARG)(Gemtuzumab Ozogamicin)、奈米微粒紫杉醇(Nanoparticle Paclitaxel)(白蛋白安定化奈米微粒劑型紫杉醇)、溫諾平(NAVELBINE)(酒石酸長春瑞濱(Vinorelbine Tartrate))、奈拉濱(Nelarabine)、NEOSAR(環磷醯胺(Cyclophosphamide))、惠爾血添(NEUPOGEN)(Filgrastim)、蕾莎瓦(NEXAVAR)(甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib Tosylate))、泰息安(Nilotinib)、諾瓦得士(NOLVADEX)(Tamoxifen Citrate)、恩沛板(NPLATE)(Romiplostim)、奧法木單抗(Ofatumumab)、高三尖杉酯鹼(Omacetaxine Mepesuccinate)、培門冬酶(ONCASPAR)(Pegaspargase)、ONTAK(地尼白介素(Denileukin Diftitox))、益樂鉑(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、白蛋白安定化奈米微粒劑型紫杉醇、帕立夫明(Palifermin)、鹽酸帕洛諾司瓊(Palonosetron Hydrochloride)、裴米卓耐特(Pamidronate Disodium)、Panitumumab、鹽酸帕唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride)、培門冬酶(Pegaspargase)、聚乙二醇干擾素α-2b(Peginterferon α-2b)、派樂能(PEG-INTRON)(Peginterferon alfa-2b)、培美曲塞二鈉 (PemetrexedDisodium)、賀疾妥單株抗體(Pertuzumab)、鉑帝爾(PLATINOL)(順鉑(Cisplatin))、鉑帝爾-AQ(PLATINOL-AQ)(順鉑(Cisplatin))、普樂沙福(Plerixafor)、泊馬度胺(Pomalidomide)、鉑美特(POMALYST)(Pomalidomide)、鹽酸普納替尼(Ponatinib Hydrochloride)、普拉曲沙(Pralatrexate)、培尼皮質酮(Prednisone)、鹽酸甲基苄肼(Procarbazine Hydrochloride)、普留淨(PROLEUKIN)(Aldesleukin)、保骼麗(PROLIA)(Denosumab)、艾曲波帕(PROMACTA)(Eltrombopag Olamine)、普羅文奇(PROVENGE)(Sipuleucel-T)、補利血素(PURINETHOL)(巰基嘌呤(Mercaptopurine))、二氯化鐳-223、鹽酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride)、拉布立酶(Rasburicas)、重組干擾素α-2b、瑞戈非尼(Regorafenib)、瑞復美(REVLIMID)(Lenalidomide)、RHEUMATREX(甲胺蝶呤(Methotrexate))、利妥昔單抗(Rituximab)、羅米地辛(Romidepsin)、羅米司亭(Romiplostim)、紅衛黴素(RUBIDOMYCIN)(Daunorubicin Hydrochloride)、磷酸鲁索替尼(Ruxolitinib Phosphate)、前列腺癌疫苗(Sipuleucel-T)、甲苯磺酸(Sorafenib Tosylate)、柏萊(SPRYCEL)(Dasatinib)、癌瑞格(STIVARGA)(Regorafenib)、舒尼替尼蘋果酸鹽(Sunitinib Malate)、舒癌特(SUTENT)(舒尼替尼蘋果酸鹽(Sunitinib Malate))、SYLATRON(聚乙二醇干擾素α-2b(Peginterferon α-2b))、SYNOVIR(沙利度胺(Thalidomide))、SYNRIBO(高三尖杉酯鹼(Omacetaxine Mepesuccinate))、泰伏樂(TAFINLAR)(Dabrafenib)、枸櫞酸他莫昔芬(Tamoxifen Citrate)、阿糖包苷(TARABINE PFS)(Cytarabine)、得舒緩(TARCEVA)(Erlotinib Hydrochloride)、TARGRETIN(Bexarotene)、泰息安(TASIGNA)(Nilotinib)、汰癌勝(TAXOL)(紫杉醇(Paclitaxel))、剋癌易(TAXOTERE)(歐洲紫杉醇(Docetaxel))、帝盟多(TEMODAR)(替莫唑胺(Temozolomide))、替莫唑胺(Temozolomide)、特癌適(Temsirolimus)、沙利度胺(Thalidomide)、TOPOSAR(依託泊苷(Etoposide))、鹽酸拓撲替康(Topotecan Hydrochloride)、托瑞米芬(Toremifene)、特癌適(TORISEL)(Temsirolimus)、托西莫(Tositumomab)與I¹³¹碘托西莫單株抗體複方製劑、右雷佐生(TOTECT)(Dexrazoxane Hydrochloride)、曲美替尼(Trametinib)、賀癌平(Trastuzumab)、苯達莫司汀(TREANDA)(Bendamustine Hydrochloride)、TRISENOX(三氧化二砷)、泰佳錠(TYKERB)(拉帕替尼二對甲苯磺酸盐(Lapatinib Ditosylate))、凡德他尼(Vandetanib)、維必施(vectibix)(Panitumumab)、岱蜜克龍(VelP)、敏畢瘤(VELBAN)(Vinblastine Sulfate)、萬科(VELCADE)(Bortezomib)、艾必克凝(VELSAR)(Vinblastine Sulfate)、日沛樂(Vemurafenib)、滅必治(VEPESID)(Etoposide)、VIADUR(乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、委丹扎(VIDAZA)(Azacitidine)、硫酸敏伯斯登(Vinblastine Sulfate)、硫酸文克斯汀(Vincristine Sulfate)、酒石酸溫諾平(Vinorelbine Tartrate)、維莫德吉(Vismodegib)、VORAXAZE(穀卡匹酶(Glucarpidase))、伏立諾他(Vorinostat)、福退癌(VOTRIENT)(Pazopanib Hydrochloride)、瘤可維(WELLCOVORIN) (LeucovorinCalcium)、截剋瘤(XALKORI)(Crizotinib)、截瘤達(XELODA)(Capecitabine)、癌骨瓦(XGEVA)(Denosumab)、鐳治骨(XOFIGO)(二氯化鐳²²³)、安可坦(XTANDI)(恩雜魯胺(Enzalutamide))、益伏(YERVOY)(Ipilimumab)、柔癌捕(ZALTRAP)(Ziv-Aflibercept)、日沛樂(ZELBORAF)(Vemurafenib)、澤娃靈(ZEVALIN)(Ibritumomab Tiuxetan)、右丙亞胺(ZINECARD)(Dexrazoxane Hydrochloride)、柔癌捕(Ziv-Aflibercept)、唑来膦酸(Zoledronic Acid)、容立莎(ZOLINZA)(Vorinostat)、卓骨祂(ZOMETA)(唑來膦酸(Zoledronic Acid))、及澤珂(ZYTIGA)(Abiraterone Acetate)。

活性成分亦可藉由如凝聚技術或界面聚合而包覆在微膠囊，分別製作為如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，成為膠體藥劑傳送系統(例如：微脂體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或成為巨乳液。此類技術亦揭示在Remington’s Pharmaceutical Science，第16版，Osol,A.編輯(1980年)。

供使用在體內投予之製劑必須為無菌。此方面可容易地透過無菌之過濾膜過濾達成。

一般而言，組成物成分可分別或者一起混合補充在單位劑型，例如冷凍乾燥之乾燥粉末或無水濃縮物密封在如安瓿或標示活性藥劑含量之容器中。在投予方式為輸液時，可將組成物分裝在含有無菌藥劑等級之水或生理食鹽水的輸液瓶中。在投予方式為注射時，可提供注射用之無菌水或生理食鹽水之安瓿，使成分可於投予前混合。於另外具體實施例，一種或多種之本發明之醫藥組成物係以液體形式補充密封於標示藥劑含量及濃度之容器中。

可將活性藥劑併入適於非經腸投藥之醫藥組成物中，通常製作成可注射之溶液。可注射之溶液可以液體或冷凍乾燥之任一種劑型裝在白色或棕色小瓶、安瓿或預充式注射器中。液體或冷凍乾燥之藥劑可進一步包含：緩衝劑(例如：L-組胺酸、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀、氯化鈉)、抗凍劑(例如：蔗糖、海藻醣或乳醣)、膨脹劑(例如：甘露糖醇)、安定劑(例如：L-甲硫胺酸、甘胺酸、精胺酸)、佐劑(玻尿酸酶)。

本發明之組成物可呈各種形式。其中包含如：液體、半固體及固體劑型，諸如：液體溶液(例如：可注射或可輸液之溶液)、微乳液、分散液、脂質體或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及塞劑。較佳之形式視所欲之投藥方式及醫藥用途而定。一般投藥之方式包含：非經腸(例如：靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)注射或口服投藥。

包含本文所述之免疫調節因子或免疫調節因子之調控因子的醫藥組成物，可調配成用於投予至特定組織。例如，於若干具體實施例，所欲者可為將免疫調節因子或免疫調節因子之調控因子投予至各種器官之結締組織及/或腫瘤部位。

於一具體實施例，本文述之醫療方法係實施於人類。於其他具體實施例，本文所述之方法不實施於小鼠或非人類動物。

以下實施例將更進一步說明本發明，惟對本發明並無任何之限定。本申請案中所引用之所有參考文獻、專利及公開之專利申請案、以及圖樣的內容，均併入本文以資參考。

實施例實施例1.基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)之建構

為實施用於未來免疫療法的標的之人類基因體廣度搜尋，開發基因體規模的T細胞活性陣列。使用Qiagen miniprep套組，製備包含90%之人類膜基因體的6402人類膜cDNA，並經過定量及稀釋建構GS-TCAA。

最佳化之T細胞活化同時須要經由TCR/CD3複合體之抗原專一性初級訊息、及參與在次級訊息之共同訊息。為建立功能性T細胞分析，設計出刺激基態T細胞活化之293T細胞系人工抗原呈現細胞株，並使用螢光報導子作為T細胞活性之指標(第1A圖)。具體地，使用293T.2A細胞在活性陣列。該293T.2A細胞係經工程操作之293T細胞，其表現主要之免疫相關銜接蛋白(DAP10/DAP12/FcR γ/CD3E)，以最佳化免疫相關膜基因之表現。而且，293T.2A細胞再進一步經工程操作以表現膜結合性之抗CD3抗體ScFv，其係連接在CD14 GPI錨定物的OKT-3單株抗體之膜形態scfv(第1B圖)。此293T.2A/m.抗CD3細胞同時作為抗原呈現細胞以及表現個別膜基因之細胞。

許多建構體為此分析而被設計為含有由GFP報導子所控制之T細胞相關的轉錄因子反應單元(transcription factor responsive element)(TFRE)(例如：NF-κ B、NF-AT、AP-1、或EGR2)，且該等建構體使用作為T細胞活性之指標(第1C圖)。例如，所獲得之Jurkat細胞株安定地表現NF-κ B-GFP。該等細胞在與293T.2A共同培養時並不產生可見之GFP訊息。然而，在與表現膜之抗CD3抗體及免疫相關膜基因的293T.2A細胞共同培養過夜之後，即可觀察到顯著的GFP訊息(第2A及2B圖)。除Jurkat細胞株外，亦可包含初級免疫細胞，包括：初始或效應T細胞、衰竭、失活型T細胞或調控性T細胞。

活性陣列之讀出包含增生相關之報導子，包括：細胞介素(IFN-γ、TNF-α或IL-10)、及基於螢光之T細胞之細胞毒性或細胞凋亡之訊息偵測。對於增生之分析，在正要與T細胞共同培養之前，照射(10,000雷得(rad))293T.2A/m.抗CD3細胞。經過約72小時之後，於多孔盤之各孔中填充1μL之CCK-8試劑(Dojindo)，然後在以Envision多孔盤讀取機(Perkin Elmer)讀取450nm之吸光度之前，先進行培養2小時。對於細胞毒性，使用安定地表現RFP之293T.2A/m.抗CD3細胞。簡言之，GS-TCAA多孔盤中之基因質體反向轉染至懷有RFP之293T.2A/m.抗CD3細胞。在經過24小時之後，再於多孔盤中添加IncuCyte^TM動力學之凋亡蛋白酶-3/7細胞凋亡分析試劑(Essen Bioscience)與以OKT3預活化或以異體PBMC活化之人類PBMC。在進行共同培養之後，以InCell影像分析機(GE)於不同時間點分別偵測RFP及GFP訊息。對於T細胞凋亡分析，在填充至多孔盤中之前，將經OKT3預活化或以異體PBMC活化之人類PBMC以cellTrace紫色染色劑(Thermo Fisher)標示，並與IncuCyte^TM動力學之凋亡蛋白酶-3/7細胞凋亡分析試劑(Essen Bioscience)混合。在進行共同培養之後，以InCell影像分析機(GE)於不同時間點分別偵測RFP及GFP訊息以及Celltrace之紫色訊息。T細胞之細胞毒性係以(% RFP⁺GFP⁺細胞/RFP⁺細胞)計算，而T細胞凋亡係以(%之Celltrace紫色訊息⁺GFP⁺細胞/Celltrace紫色訊息⁺細胞)計算。

實施例2.基因體規模的T細胞活性陣列之偵測及篩選

為將T細胞活性陣列之篩選最佳化，先測試1536孔盤中之293T.2A/m.抗CD3細胞的轉染效率，並判斷在該2種細胞共同培養系統中對T細胞活性的最佳培養條件。此外，亦將使用inCell成影系統之GFP偵測最佳化。

使用經最佳化操作步驟的自動孔盤作業系統(Matrix PlateMate Plus，Thermo Scientific)，將基因選殖株移送至Greiner之1536成像孔盤中。各GS-TCAA組包含4個1536成像孔盤。對於陣列篩選，使用最佳化之反向轉染操作步驟，以使此等基因分別呈現在293T.2A/m.抗CD3細胞之細胞表面。cDNA基因庫之質體係個別地以小規模製作，然後以OptiMEM(4μg/mL)稀釋後移送至384深孔多孔盤(VWR)中，各孔中有200μL質體溶液。再藉由液體作業系統(PlateMate，Thermo Scientific)機器人，將含各種基因之4組384孔盤中之2μL之質體溶液移送至淺底之1536孔盤(Greiner)之各孔中，以產生受體之陣列孔盤。所有之人類膜受體之陣列包含4組1536孔之多孔盤。除非特別指明，否則該1536孔之多孔盤係以鋁箔包覆並保存在-80℃以進行後續實驗。

對於基因體規模的T細胞活性陣列之設置，係將一組含4組1536孔多孔盤之人類受體陣列由-80℃取出，並放入培養箱中至溶液完全解凍。然後離心(600g，2分鐘)該陣列孔盤，之後反向轉染。簡言之，先藉由分注機器人(Multidrop Combi，Thermo Scientific)在1536孔之陣列孔盤的各孔中分注含lipofectamine 3000(7μL脂質體/mL)之2μL的optiMEM，並以超高速旋轉振盪機快速振盪1分鐘。之後將所有孔盤保存在室溫20分鐘，再藉由Multidrop加入293T.2A/m.抗CD3細胞以刺激T細胞(每孔4μL含2000細胞)。其後，再次離心(1000g，4分鐘)孔盤以去除在各孔中之氣泡，然後於37℃培養。在轉染經過24小時之後，再於陣列孔盤中填充T細胞之報導子細胞或初級T細胞(4000細胞)，諸如經工程操作而含有不同GFP報導子之Jurkat細胞株。在T細胞與293T系T細胞刺激物共同培養12小時之後，以InCell影像分析機(GE)進行孔盤成像。在使用Cellprofiler軟體進行最佳化影像分析之後，辨識可能具有調控功能之候選基因。例如，若分子對T細胞活性之調節並非有效時，則GFP訊息仍維持相似。若分子作用為T細胞活性之刺激性訊息時，將偵測到相對較強的GFP訊息。或者，若分子為抑制性時，將觀察到更弱的GFP訊息。如第3圖所示，293T.2A/m.抗CD3細胞單獨刺激T細胞活化，並產生可偵測之GFP訊息，其可作為基本訊息。B7.1、B7.2、OX40L、或4-1BBL之表現增高螢光訊息，顯示其等各為T細胞活性之刺激性訊息。相對地，以B7-H1或B7-H4轉染293T.2A/m.抗CD3細胞時，導致減低之螢光訊息，顯示此些分子抑制T細胞之活性。

或者，所釋放的特異細胞介素亦可使用作為報導子，而可作為T細胞活性之指標。對於偵測細胞介素，係在共同培養24及48小時之後收集上清液並藉由ELISA(eBoscience)定量。如第4圖所示，表現GJB1及FOLH1刺激T細胞釋放IFN-γ，而表現FLT1、SEMA6a、SEC22b及GP1BA減低IFN-γ之釋放。

對於陣列篩選，各T細胞之報導子細胞係以多孔盤三重複篩選，再依據陣列中GFP密度為正的標的，計算各基因之平均值並排其順序。經膜基因轉染而對Jurkat T細胞活性具有刺激性功能之細胞將具有較控制組為高之GFP讀值，而經膜基因轉染而對T細胞活性具有抑制性功能之細胞導致較低之GFP讀值。所有的GFP訊息係藉由CellProfiler軟體(Broad Institute)以各孔之GFP正標的及總GFP密度兩者進行標準化及定量。如第5圖所示，辨識出數種對T細胞活性具有刺激性及抑制性功能之基因。將自這些GS-TCAA篩選出具有抑制性功能之最優異候選者，例如：FLT1、SEMA6a、SEC22b、及GP1Ba，集中在一起以進一步加以驗證。

實施例3.具有治療癌症/自體免疫疾病可能之新穎免疫調控性基因之驗證

為進一步驗證經由GS-TCAA檢驗所獲得之候選基因之功能，進行初級人類T細胞體外功能分析。此外，使用生物資訊方式縮減與自體免疫疾病及/或癌症相關之基因。亦針對數種最優異候選基因，以受體陣列系統篩選辨識可能之對應受體，並在選定後以人類化小鼠疾病模式(包含人類化小鼠PDX模式)進行體內檢驗以測試對於癌症/自體免疫疾病之治療潛力。

體外T細胞功能分析

經GS-TCAA分析所辨識的最優異候選基因以初級T細胞進行體外功能分析加以驗證。293T.2A/m.抗CD3細胞經候選基因轉染，並與人類初級CD8或CD4細胞共同培養。根據上述，進行T細胞增生、凋亡、及釋放細胞介素(例如：IFN-γ、IL-2或IL-10)之分析。

受體陣列技術(RAT)

為篩選未知之對應受體，根據前述(Zhu Y et al,Nat Commun,4：2043,2013、Yao S et al,Immunity,34(5)：729-740,2011)進行受體陣列技術。簡言之，先以基因工程將目標基因(編碼分泌蛋白質)或目標基因(編碼跨膜蛋白)之胞外結構域與標記基因(小鼠IgG2a Fc、人類IgG1 Fc、FLAG或6xHIS)融合，以製備如前述之融合基因(Chapoval,AI.et al.,Mol Biotechnol 21(3)：259-264,2002)。在將各融合基因轉染於293T細胞之後，使用經純化之重組融合蛋白在受體陣列進行篩選。利用對應標記之經螢光標示的二次抗體偵測目標蛋白對經轉染之293T細胞的結合，再使用Applied Biosystems 8200細胞偵測系統進行篩選並以CDS 8200軟體分析。

基於細胞之分析篩選接近90%之所有人類膜cDNA，其允許使用受體陣列之大規模篩選及篩選T細胞相關之表面分子的相互作用。建立用於基於細胞之高通量篩選之強力且安定之系統，且利用機器人擴大並將受體陣列由原來之384孔規格升級為1,536孔規格以開發此新穎系統為超高能受體-配體篩選系統。

利用自動式Tecan Freedom EVO 200型液體作業平臺，在篩選1,536孔規格時所使用之試劑減低4至5倍並達到更高之靈敏度。在將轉染操作調至最佳時，顯示在1,536孔規格中以5ng之各質體及lipofectamine混合物轉染而高量表現所欲蛋白。典型地，在經過轉染12小時之後，各孔中50至70%之293T細胞表現所轉染之質體。當系統中併入新質體時，藉由於隨機選定之具有專一性單株抗體之孔中檢測其等的表現而進行品質管制實驗。此最佳化及升級減少作業時間且在時間、成本及勞力上增高4倍之篩選效率而改良整體之篩選。

因此，藉由使用受體陣列技術，得以辨識由T細胞活性陣列所篩選之候選基因之相互作用的蛋白。辨識相互作用的蛋白將針對所辨識之候選基因之免疫功能提供進一步瞭解，而有助於篩選候選者以藉小鼠腫瘤模式的體內檢驗測試治療潛力。

人類癌症之小鼠體內模式

產生對經驗證之最優異目標或最優異候選者之重組蛋白具專一性之抗體，以在癌症模式中測試其之治療潛力。將624人類黑色素腫瘤(GP100⁺ HLA^-A2⁺)細胞及腫瘤反應性T細胞注射於NOD-scidIL2R γ^null小鼠。這些小鼠接受數回之候選基因及/或候選基因之抗體處理，並謹慎監測在腫瘤部位的腫瘤生長及免疫細胞的情況或作用因子之功能。

患者衍生的異種移植(PDX)

針對由治療前及治療中的癌症患者所收集之腫瘤樣品檢測腫瘤微環境(tumor microenvironment,TME)之異質性，並結合免疫組織化學分析(immunohistochemistry,IHC)、質譜影像分析(mass spectrometry,CyTOF)及多重染色免疫螢光分析(multiplex-immunofluorescence,multiplex-IF)。這些技術之結合可使用作為辨識人類之腫瘤微環境中之相互作用機制的工具。具體地，檢測TME中免疫成分之相異，並比較在基線及在後天產生抵抗力時之試樣。人類化之小鼠模式，亦即一般所知之免疫患者衍生的異種移植(免疫-PDX)模式，係已開發並可平行使用此等分析以研究人類的TME。此等研究對於了解疾病微環境的反應、抗性、及後天抵抗力的機制而言為必需的，其依據此微環境之特異性抗性機制而最終提供開發生物標誌物及額外療法之基礎。

生物資訊方法

利用生物資訊方法以縮減與自體免疫疾病及癌症相關之基因。選擇多種嚴苛之標準以辨識疾病發展期間顯著變化且對病因為潛在識別基因之基因。

在GS-TCAA及潛在候選基因之進一步功能驗證後，設置排定順序之系統以辨識只在特定自體免疫疾病或癌症中受調控的特定基因。或者，可選擇在不同的自體免疫疾病或癌症中之共同的基因。

例如，選擇只編碼跨膜及分泌性蛋白質之基因，主要係由於這類分子易於再進一步與治療性抗體或重組蛋白操作。而且，此選擇允許使用GS-TCAA及受體陣列技術之結合以辨識對應受體及功能。第二個標準係篩選一種以上之疾病共有的基因。所使用之排定順序系統中，向上調控之基因係存在於所關注之各標的疾病時，即記入 1點。數值越高表示基因係不同疾病所共有。此顯示在不同的自體免疫疾病或癌症種類中有相同的機制。

依據辨識與單一特定疾病相關但不與其他自體免疫疾病或癌症種類相關的基因之選擇標準，藉以篩選獨特地與單一疾病相關之基因。然後，以在特定疾病中向上調控或向下調控至少有2倍改變為區分而篩選基因。此主要係由於統計上之考慮。辨識出具有特定蛋白結構域而可能與特定免疫功能相關之基因清單，例如Ig超家族之分子。在最開始以此等標準辨識特定基因後，再對這些標的以受體陣列技術進行對應受體篩選，並以免疫相關之功能研究判斷這些分子及其對應受體是否為免疫調節之潛在標的。

辨識在自體免疫疾病或癌症之微環境中向上調控的基因及蛋白。使用大資料庫，例如：NCBI、Oncomine、TCGA癌症資料庫(TCGA cancer database)、耶魯內用癌症資料庫(Yale internal cancer databases)及人類蛋白手冊(human protein Atlas)，亦可辨識共同存在於多種疾病中而表現不同之基因。然後，使用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)，辨識與免疫系統、細胞介素/趨化介素訊息傳導、或干擾素訊息傳導、及抗原呈現路徑相關之基因，其在自體免疫疾病或癌症之發生及發展上扮演關鍵角色。最後，依照其等在次細胞之分布將向上調控、疾病共有之基因分類，並關注膜蛋白，因其等可更容易地成為治療劑。對於若干基因，進行分析以判斷跨膜基因是否為已知會影響自體免疫疾病或癌症的免疫球蛋白(Ig)超家族成員，包含：類FcR基因、HLA相關基因、及共同刺激分子(CD86、B7-H1 aka CD274、及CTLA4)。

為辨識在自體免疫疾病及在癌症之微環境中係向下調控的基因及蛋白質，進行類似於使用公開且可進入之資料庫之生物資訊分析之方法以辨識在各種疾病中共有之基因。

經由GS-TCAA篩選而辨識出之對T細胞活性有抑制性功能之候選者，例如：FLT1、SEMA6a、SEC22b、及GP1Ba，進一步再分析其在各種類癌症中的表現量。如第6圖至第9圖所示，FLT1、SEMA6a、SEC22b、及GP1Ba在不同種類之癌症中所受的調控不同。例如，SEC22b在若干癌症(例如：腎臟癌、攝護腺癌、肝癌、乳癌、頭頸癌、胃癌、大腸直腸癌及腎上腺癌)中的表現係向上調控，而SEC22b特別在肺癌中係向下調控(第8圖)。此生物資訊分析進一步證明GS-TCAA對辨識免疫調節因子之重要性，並顯示此等免疫調節因子可作為治療癌症及/或自體免疫疾病之潛在治療標的。

同等範圍

本文所述之發明之具體實施例之多種同等範圍，係本技術領域之技術熟知者所知，或無須使用非通常之實驗而可瞭解的。此同等範圍亦包含於下述之專利申請範圍。本申請案全文引用之所有參考文獻、專利及公開之專利申請係併入本文中以作資參考。

Claims

一種基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)，包含：含有複數個孔之固體支持構造，其中，該複數個孔之各孔含有：第一細胞，其表現膜結合性之抗CD3抗體、或其抗原結合片段，其中該第一細胞係經編碼複數個人類膜基因之cDNA基因庫以使該第一細胞呈現由該複數個人類膜基因之一者所編碼的蛋白質之方式轉染；第二細胞，其表現在細胞表面的受體及報導基因；其中，該受體與該抗CD3抗體、或其抗原結合片段之間之相互作用，提供初級訊息而刺激該第二細胞株之活性；以及其中，該報導基因的表現量增高表示由該複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現之蛋白質係作用為刺激性共同訊息分子而刺激該第二細胞株之活性；且其中，該報導基因的表現量減低表示由該複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現之蛋白質係作用為抑制性共同訊息分子而抑制該第二細胞株之活性。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該固體支持構造為多孔盤。
如申請專利範圍第2項所述之陣列，其中該多孔盤係選自由96孔盤、384孔盤、及1536孔盤所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該第一細胞為人類293T細胞。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該第一細胞為人類293T.2A細胞，其表現免疫相關銜接蛋白。
如申請專利範圍第5項所述之陣列，其中該免疫相關銜接蛋白係選自由DAP10、DAP12、FcR γ、及CD3E所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該第二細胞為免疫細胞。
如申請專利範圍第7項所述之陣列，其中該免疫細胞為骨髓衍生抑制細胞(MDSC)。
如申請專利範圍第7項所述之陣列，其中該免疫細胞為T細胞。
如申請專利範圍第9項所述之陣列，其中該T細胞係選自由Jurkat細胞、初始T細胞、效應T細胞、衰竭T細胞、失活型T細胞及調控性T細胞所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該報導基因係包含於選自由與細胞毒性相關之報導建構體、與細胞凋亡相關之報導建構體、及與增生相關之報導建構體所組成之群組的DNA建構體中。
如申請專利範圍第11項所述之陣列，其中該與細胞毒性相關之報導建構體為基於螢光之報導建構體。
如申請專利範圍第11項所述之陣列，其中該與細胞凋亡相關之報導建構體為報導基因蛋白為基於螢光之報導建構體。
如申請專利範圍第12項或第13項所述之陣列，其中該基於螢光之報導建構體包含與T細胞相關之轉錄反應單元，其後有最小CMV啟動子及GFP報導基因。
如申請專利範圍第14項所述之陣列，其中與T細胞相關之轉錄反應單元係選自由NF-κ B、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK、及PI3K所組成之群組。
如申請專利範圍第11項所述之陣列，其中該與增生相關之報導建構體中之報導基因為細胞介素基因。
如申請專利範圍第16項所述之陣列，其中該細胞介素係選自由IFN-γ、TNF-α、及IL-10所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該複數個人類膜基因包含選自由受體基因、免疫球蛋白基因、運輸蛋白基因及訊息基因所組成之群組之基因。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該複數個人類膜基因包含約1,000至7,000個基因。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該複數個人類膜基因包含約2,000至5,000個基因。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該複數個人類膜基因包含約4,000至7,000個基因。
如申請專利範圍第1項所述之陣列，其中該第二細胞之該活性係選自由細胞增生、細胞抑制、細胞衰竭、細胞凋亡、及自細胞釋放細胞介素所組成之群組。
一種製造基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)的方法，包含：提供含有複數個孔之固體支持構造；在該複數個孔之各孔中培養表現膜結合性之抗CD3抗體、或其抗原結合片段的第一細胞；以編碼複數個人類膜基因之cDNA基因庫轉染第一細胞，以使該第一細胞呈現由該複數個人類膜基因之一者所編碼的蛋白質；以及在該複數個孔之各孔中共同培養第二細胞，該第二細胞表現在細胞表面的受體及報導基因，從而製備基因體規模的T細胞活性陣列，其中，該受體與該抗CD3抗體、或其抗原結合片段之間的相互作用，提供初級訊息而刺激該第二細胞株之活性；以及其中，該報導基因的表現量增高表示由該複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現之蛋白質係作用為刺激性共同訊息分子而刺激該第二細胞株之活性；且其中，該報導基因的表現量減低表示由該複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現之蛋白質係作用為抑制性共同訊息分子而抑制該第二細胞株之活性。
如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該固體支持構造為多孔盤。
如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該多孔盤係選自由96孔盤、384孔盤、及1536孔盤所組成之群組。
如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該第一細胞為人類293T細胞。
如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該第一細胞為人類293T.2A細胞，其表現免疫相關銜接蛋白。
如申請專利範圍第27項所述之方法，其中該免疫相關銜接蛋白係選自由DAP10、DAP12、FcR γ、及CD3E所組成之群組。
如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該第二細胞為免疫細胞。
如申請專利範圍第29項所述之方法，其中該免疫細胞為骨髓衍生抑制細胞(MDSC)。
如申請專利範圍第29項所述之方法，其中該免疫細胞為T細胞。
如申請專利範圍第31項所述之方法，其中該T細胞係選自由Jurkat細胞、初始T細胞、效應T細胞、衰竭T細胞、失活型T細胞及調控性T細胞所組成之群組。
如申請專利範圍第23項所述之方法，其中該報導基因係包含於選自由與細胞毒性相關之報導建構體、與細胞凋亡相關之報導建構體、及與增生相關之報導建構體所組成之群組的DNA建構體中。
如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該與細胞毒性相關之報導建構體為基於螢光之報導建構體。
如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該與細胞凋亡相關之報導建構體基於螢光之報導建構體。
如申請專利範圍第34項或第35項所述之陣列，其中該基於螢光之報導建構體包含與T細胞相關之轉錄反應單元，其後有最小CMV啟動子及GFP報導基因。
如申請專利範圍第36項所述之方法，其中該與T細胞相關之轉錄反應單元係選自由NF-κ B、NF-AT、AP-1、EGR2、MAPK、及PI3K所組成之群組。
如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該與增生相關之報導建構體中之報導基因為細胞介素基因。
如申請專利範圍第38項所述之方法，其中該細胞介素係選自由IFN-γ、TNF-α及IL-10所組成之群組。
一種辨識免疫調節因子的方法，該方法包含：提供如申請專利範圍第1項所述之基因體規模的T細胞活性陣列(GS-TCAA)；使該第一細胞表現該複數個人類膜基因之一者；共同培養該第一細胞與該第二細胞；偵測該第二細胞中之報導基因的表現量；以及比較該報導基因的表現量與控制組第二細胞的報導基因表現量，其中該控制組第二細胞係與未轉染該複數個人類膜基因之一者的控制組第一細胞共同培養；其中，該報導基因的表現量增高表示由該複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現之蛋白質係作用為刺激性共同訊息分子而刺激該第二細胞株之活性；且其中，該報導基因的表現量減低表示由該複數個人類膜基因之一者所編碼的經呈現之蛋白質係作用為抑制性共同訊息分子而抑制該第二細胞株之活性，從而辨識該免疫調節因子。
如申請專利範圍第40項所述之方法，其中該免疫調節因子係選自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2所組成之群組。
如申請專利範圍第40項所述之方法，其中該免疫調節因子係選自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6及GP1BA所組成之群組。
如申請專利範圍第40項所述之方法，其中該免疫調節因子係選自由FLT1、SEMA6a、SEC22b及GP1BA所組成之群組。
如申請專利範圍第40項所述之方法，其中該方法為自動化者。
如申請專利範圍第40項所述之方法，其中該方法係使用機器人進行。
如申請專利範圍第45項所述之方法，其中該方法係使用機器人之液體作業技術進行。
如申請專利範圍第45項所述之方法，其中該方法係使用自動化孔盤作業系統進行。
如申請專利範圍第40項所述之方法，進一步包含進行選自由下列所組成之群組的分析：體外功能分析、體內分析、受體陣列分析、生物資訊分析、或其組合。
如申請專利範圍第48項所述之方法，其中該體外功能分析包含：以表現該複數個人類膜基因之一者及膜結合性抗-CD3抗體、或其抗原結合片段的第二細胞與初級T細胞培養；以及進行選自由細胞增生分析、細胞凋亡分析及細胞介素釋放分析所組成之群組的體外功能分析。
如申請專利範圍第49項所述之方法，其中該初級T細胞為人類初級CD8細胞及/或人類初級CD4細胞。
如申請專利範圍第48項所述之方法，其中進行該受體陣列分析以辨識該免疫調節因子之相互作用蛋白質。
如申請專利範圍第51項所述之方法，其中該受體陣列包含：含有複數個孔之固體支持構造，其中該複數個孔之各孔含有：經編碼複數個受體基因之cDNA基因庫轉染之細胞，該細胞係以使該細胞呈現由該複數個受體基因之一者所編碼的受體之方式轉染；含有免疫調節因子融合標記之重組蛋白；對該標記有專一性之經螢光標示之抗體；其中，可偵測之螢光訊號為該免疫調節因子與該受體相互作用之指標。
如申請專利範圍第52項所述之方法，其中該標記係選自由IgG2a Fc標記、人類IgG1 Fc標記、FLAG標記及6×His標記。
如申請專利範圍第52項所述之方法，其中該免疫調節因子為免疫調節因子的全長蛋白質。
如申請專利範圍第52項所述之方法，其中該免疫調節因子為該免疫調節因子之胞外結構域。
如申請專利範圍第48項所述之方法，其中該體內分析包含對用於自體免疫疾病或癌症之動物模式投予該免疫調節因子。
如申請專利範圍第56項所述之方法，其中該動物模式為注射人類黑色素腫瘤細胞及腫瘤反應T細胞的NOD-scid IL2R γ^null小鼠模式。
如申請專利範圍第56項所述之方法，其中該動物模式為人類化小鼠模式。
如申請專利範圍第58項所述之方法，其中該人類化小鼠模式為免疫患者衍生的異種移植(免疫PDX)模式。
一種如申請專利範圍第40項所述之方法所辨識的免疫調節因子的有效量用於製備於有其需要之個體中治療自體免疫疾病或癌症的藥劑的用途。
一種如申請專利範圍第40項所述之方法所辨識的免疫調節因子之調控因子的有效量用於製備於有其需要之個體中治療自體免疫疾病或癌症的藥劑的用途。
如申請專利範圍第60項或第61項所述之用途，其中該免疫調節因子係選自由FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4-1BBL及B7.2所組成之群組。
如申請專利範圍第60項或第61項所述之用途，其中該免疫調節因子係選自由FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1、LY6 及GP1BA所組成之群組。
如申請專利範圍第61項所述之用途，其中該免疫調節因子之調控因子增高該免疫調節因子之表現量及/或活性量。
如申請專利範圍第61項所述之用途，其中該免疫調節因子之調控因子減低該免疫調節因子之表現量及/或活性量。