JP6916535B2 - ゲノムスケールのt細胞活性アレイおよびその使用の方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年10月14日に出願された米国仮特許出願第62/241,466への優先権の利益を主張し、当該出願の内容全体は、本明細書において参考として援用される。
I.定義
II.ゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)
III.ゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)を作製する方法
IV.ゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)を用いたスクリーニングアッセイ
V.治療の方法
医薬製剤
、TORISEL(テムシロリムス;Temsirolimus)、トシツモマブ(Tositumomab)およびI131ヨードトシツモマブ、TOTECT(塩酸デキスラゾキサン(Dexrazoxane))、トラメチニブ(Trametinib)、トラスツズマブ(Trastuzumab)、TREANDA(塩酸ベンダムスチン(Bendamustine))、TRISENOX(三酸化ヒ素)、TYKERB(ラパチニブ(Lapatinib)ジトシレート)、バンデタニブ(Vandetanib)、VECTIBIX(パニツムマブ;Panitumumab)、VelP、VELBAN(硫酸ビンブラスチン(Vinblastine))、VELCADE(ボルテゾミブ;Bortezomib)、VELSAR(硫酸ビンブラスチン)、ベムラフェニブ(Vemurafenib)、VEPESID(エトポシド;Etoposide)、VIADUR(酢酸ロイプロリド(Leuprolide))、VIDAZA(アザシチジン)、ビンブラスチン(Vinblastine)硫酸塩、ビンクリスチン(Vincristine)硫酸塩、ビノレルビン(Vinorelbine)酒石酸塩、ビスモデジブ(Vismodegib)、VORAXAZE(グルカピダーゼ;Glucarpidase)、ボリノスタット(Vorinostat)、VOTRIENT(塩酸パゾパニブ(Pazopanib))、WELLCOVORIN(ロイコボリン(Leucovorin)カルシウム)、XALKORI(クリゾチニブ(Crizotinib))、XELODA(カペシタビン;Capecitabine)、XGEVA(デノスマブ;Denosumab)、XOFIGO(ラジウム223二塩化物)、XTANDI(エンザルタミド;Enzalutamide)、YERVOY(イピリムマブ;Ipilimumab)、ZALTRAP(Ziv−アフリベルセプト;Ziv-Aflibercept)、ZELBORAF(ベムラフェニブ;Vemurafenib)、ゼバリン(イブリツモマブ・チウキセタン;Ibritumomab Tiuxetan)、ZINECARD(塩酸デキスラゾキサン(Dexrazoxane))、Ziv−アフリベルセプト、ゾレドロン酸(Zoledronic Acid)、ZOLINZA(ボリノスタット;Vorinostat)、ZOMETA(ゾレドロン酸)、ZYTIGA(酢酸アビラテロン(Abiraterone))のようながんを治療することが公知の薬剤と組み合わせてもよい。
ゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)の構築
将来の免疫療法の標的のヒトゲノム全域検索を行うために、ゲノムスケールのT細胞活性アレイを開発した。ヒト膜ゲノムの90%をカバーする6402ヒト膜cDNAを、Qiagen miniprepキットを使用して調製し、GS−TCAA構築のために定量し、希釈した。
(実施例2)
ゲノムスケールのT細胞活性アレイの検出およびスクリーニング
(実施例3)
がん/自己免疫疾患を治療する可能性を有する新規な免疫調節遺伝子の検証
in vitro T細胞機能アッセイ
受容体アレイ技術(RAT)
ヒトがんのin vivoマウスモデル
患者由来異種移植(PDX)
バイオインフォマティクスのアプローチ
均等物
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
複数のウェルを含む固体支持構造体を含むゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)であって、
前記複数のウェルのそれぞれが:
膜結合抗CD3抗体またはその抗原結合性断片を発現する第1の細胞であって、複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされるタンパク質の前記第1の細胞上への提示が可能になるように、前記複数のヒト膜遺伝子をコードするcDNAライブラリーでトランスフェクトされている、第1の細胞;
細胞表面上の受容体およびレポーター遺伝子を発現する第2の細胞;
を含み、
前記受容体と前記抗CD3抗体またはその抗原結合性断片との間の相互作用が一次シグナルを提供し、前記第2の細胞株の活性を刺激し、
前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を刺激することを示し、前記レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を阻害することを示す、アレイ。
(項目2)
前記固体支持構造体がマルチウェルプレートである、項目1に記載のアレイ。
(項目3)
前記マルチウェルプレートが、96ウェルプレート、384ウェルプレートおよび1536ウェルプレートからなる群から選択される、項目2に記載のアレイ。
(項目4)
前記第1の細胞がヒト293T細胞である、項目1に記載のアレイ。
(項目5)
前記第1の細胞が、免疫関連アダプターを発現するヒト293T.2A細胞である、項目1に記載のアレイ。
(項目6)
前記免疫関連アダプターが、DAP10、DAP12、FcRγおよびCD3Eからなる群から選択される、項目5に記載のアレイ。
(項目7)
前記第2の細胞が免疫細胞である、項目1に記載のアレイ。
(項目8)
前記免疫細胞が、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)である、項目7に記載のアレイ。
(項目9)
前記免疫細胞がT細胞である、項目7に記載のアレイ。
(項目10)
前記T細胞が、Jurkat細胞、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、消耗T細胞、アネルギー性T細胞および制御性T細胞からなる群から選択される、項目9に記載のアレイ。
(項目11)
前記レポーター遺伝子が、細胞毒性関連レポーター構築物、アポトーシス関連レポーター構築物および増殖関連レポーター構築物からなる群から選択されるDNA構築物に含まれる、項目1に記載のアレイ。
(項目12)
前記細胞毒性関連レポーター構築物が蛍光ベースのレポーター構築物である、項目11に記載のアレイ。
(項目13)
前記アポトーシス関連レポーター構築物が、蛍光ベースのレポーター構築物である、項目11に記載のアレイ。
(項目14)
前記蛍光ベースのレポーター構築物が、T細胞関連転写応答エレメントと、それに続く最小CMVプロモーターおよびGFPレポーター遺伝子を含む、項目12または13に記載のアレイ。
(項目15)
前記T細胞関連転写応答エレメントが、NF−kb、NF−AT、AP−1、EGR2、MAPKおよびPI3Kからなる群から選択される、項目14に記載のアレイ。
(項目16)
前記増殖関連レポーター構築物中のレポーター遺伝子がサイトカイン遺伝子である、項目11に記載のアレイ。
(項目17)
前記サイトカインが、IFN−ガンマ、TNF−アルファおよびIL−10からなる群から選択される、項目16に記載のアレイ。
(項目18)
前記複数のヒト膜遺伝子が、受容体遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、トランスポーター遺伝子およびシグナル伝達遺伝子から選択される遺伝子を含む、項目1に記載のアレイ。
(項目19)
前記複数のヒト膜遺伝子が約1,000〜7,000の遺伝子を含む、項目1に記載のアレイ。
(項目20)
前記複数のヒト膜遺伝子が約2,000〜5,000個の遺伝子を含む、項目1に記載のアレイ。
(項目21)
前記複数のヒト膜遺伝子が約4,000〜7,000個の遺伝子を含む、項目1に記載のアレイ。
(項目22)
前記第2の細胞の前記活性が、細胞増殖、細胞抑制、細胞消耗、細胞アポトーシス、および細胞からのサイトカイン放出からなる群から選択される、項目1に記載のアレイ。
(項目23)
ゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)を作製する方法であって、
複数のウェルを含む固体支持構造体を提供するステップ;
膜結合抗CD3抗体またはその抗原結合性断片を発現する第1の細胞を、前記複数のウェルのそれぞれに培養するステップ;
複数のヒト膜遺伝子の1つによってコードされたタンパク質の前記第1の細胞上への提示が可能となるように、前記複数のヒト膜遺伝子をコードするcDNAライブラリーで前記第1の細胞をトランスフェクトするステップ;および
細胞表面上の受容体およびレポーター遺伝子を発現する第2の細胞を、前記複数のウェルのそれぞれに共培養し、それによってゲノムスケールのT細胞活性アレイを調製するステップ
を含み、
前記受容体と前記抗CD3抗体またはその抗原結合性断片との間の相互作用が、一次シグナルを提供し、前記第2の細胞株の活性を刺激し、
前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を刺激することを示し、前記レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を阻害することを示す、方法。
(項目24)
前記固体支持構造体がマルチウェルプレートである、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記マルチウェルプレートが、96ウェルプレート、384ウェルプレートおよび1536ウェルプレートからなる群から選択される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記第1の細胞がヒト293T細胞である、項目23に記載の方法。
(項目27)
前記第1の細胞が、免疫関連アダプターを発現するヒト293T.2A細胞である、項目23に記載の方法。
(項目28)
前記免疫関連アダプターが、DAP10、DAP12、FcRγおよびCD3Eからなる群から選択される、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記第2の細胞が免疫細胞である、項目23に記載の方法。
(項目30)
前記免疫細胞が骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)である、項目29に記載のアレイ。
(項目31)
前記免疫細胞がT細胞である、項目29に記載の方法。
(項目32)
前記T細胞が、Jurkat細胞、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、消耗T細胞、アネルギーT細胞および制御性T細胞からなる群から選択される、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記レポーター遺伝子が、細胞毒性関連レポーター構築物、アポトーシス関連レポーター構築物および増殖関連レポーター構築物からなる群から選択されるDNA構築物に含まれる、項目23に記載の方法。
(項目34)
前記細胞毒性関連レポーター構築物が蛍光ベースのレポーター構築物である、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記アポトーシス関連レポーター構築物が蛍光ベースのレポーター構築物である、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記蛍光ベースのレポーター構築物が、T細胞関連転写応答エレメントと、それに続く最小CMVプロモーターおよびGFPレポーター遺伝子を含む、項目34または35に記載のアレイ。
(項目37)
前記T細胞関連転写応答エレメントが、NF−kB、NF−AT、AP−1、EGR2、MAPKおよびPI3Kからなる群から選択される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記増殖関連レポーター構築物中のレポーター遺伝子がサイトカイン遺伝子である、項目33に記載の方法。
(項目39)
前記サイトカインが、IFN−ガンマ、TNF−アルファおよびIL−10からなる群から選択される、項目38に記載の方法。
(項目40)
免疫モジュレーターを同定する方法であって、
項目1に記載のゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)を提供するステップ;
第1の細胞中の前記複数のヒト膜遺伝子の1つを発現させるステップ、
前記第1の細胞と前記第2の細胞とを共培養するステップ;
前記第2の細胞における前記レポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ;および
前記レポーター遺伝子の発現レベルを、前記複数のヒト膜遺伝子の1つでトランスフェクトされていない対照の第1の細胞と共培養された対照の第2の細胞中の前記レポーター遺伝子の発現レベルと比較するステップ
を含み、
前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を刺激することを示し、前記レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を阻害することを示し、それによって免疫モジュレーターが同定される、方法。
(項目41)
前記免疫モジュレーターが、FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4−1BBLおよびB7.2からなる群から選択される、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記免疫モジュレーターが、FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6およびGP1BAからなる群から選択される、項目40に記載の方法。
(項目43)
前記免疫モジュレーターが、FLT1、SEMA6a、SEC22bおよびGP1BAからなる群から選択される、項目40に記載の方法。
(項目44)
自動化されている、項目40に記載の方法。
(項目45)
ロボット工学を使用して実行される、項目40に記載の方法。
(項目46)
ロボット液体ハンドリング技術を使用して実行される、項目45に記載の方法。
(項目47)
自動プレートハンドリングシステムを使用して実行される、項目45に記載の方法。
(項目48)
in vitro機能アッセイ、in vivoアッセイ、受容体アレイアッセイ、バイオインフォマティクスアッセイ、またはそれらの組合せからなる群から選択されるアッセイを実行することをさらに含む、項目40に記載の方法。
(項目49)
前記in vitro機能アッセイが、
前記複数のヒト膜遺伝子の1つおよび膜結合抗CD3抗体またはその抗原結合性断片を発現する前記第2の細胞を初代T細胞と共に培養すること;および
増殖アッセイ、アポトーシスアッセイおよびサイトカイン放出アッセイからなる群から選択されるin vitro機能アッセイを実行すること
を含む、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記初代T細胞が、ヒト初代CD8細胞および/またはヒト初代CD4細胞である、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記受容体アレイアッセイが、前記免疫モジュレーターの相互作用タンパク質を同定するために実行される、項目48に記載の方法。
(項目52)
前記受容体アレイが:
複数のウェルを含む固体支持構造体
を含み、前記複数のウェルのそれぞれが:
複数の受容体遺伝子の1つによってコードされる受容体の前記細胞上での提示が可能になるように、前記複数の受容体遺伝子をコードするcDNAライブラリーでトランスフェクトされた細胞;
タグと融合した免疫モジュレーターを含む組換えタンパク質;
前記タグに特異的な蛍光標識された抗体
を含み;
検出可能な蛍光シグナルが、前記免疫モジュレーターが前記受容体と相互作用することの指標である、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記タグが、マウスIgG2a Fcタグ、ヒトIgG1 Fcタグ、FLAGタグおよび6xHisタグからなる群から選択される、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記免疫モジュレーターが前記免疫モジュレーターの全長タンパク質である、項目52に記載の方法。
(項目55)
前記免疫モジュレーターが、前記免疫モジュレーターの細胞外ドメインである、項目52に記載の方法。
(項目56)
前記in vivoアッセイが、前記免疫モジュレーターを自己免疫疾患またはがんの動物モデルに投与することを含む、項目48に記載の方法。
(項目57)
前記動物モデルが、ヒトメラノーマ細胞および腫瘍反応性T細胞を注射されたNOD−scid IL2Rガンマ null マウスモデルである、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記動物モデルがヒト化マウスモデルである、項目56に記載の方法。
(項目59)
前記ヒト化マウスモデルが、免疫患者由来の異種移植(免疫PDX)モデルである、項目58に記載の方法。
(項目60)
それを必要とする対象における自己免疫疾患またはがんを治療する方法であって、項目40に記載の方法によって同定された免疫モジュレーターの有効量を前記対象に投与し、それにより前記対象における自己免疫疾患またはがんを治療することを含む、方法。
(項目61)
それを必要とする対象における自己免疫疾患またはがんを治療する方法であって、項目40に記載の方法によって同定された免疫モジュレーターの調節物質の有効量を前記対象に投与し、それにより前記対象における自己免疫疾患またはがんを治療することを含む、方法。
(項目62)
前記免疫モジュレーターが、FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4−1BBLおよびB7.2からなる群から選択される、項目60または61に記載の方法。
(項目63)
前記免疫モジュレーターが、FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6およびGP1BAからなる群から選択される、項目60または61に記載の方法。
(項目64)
前記免疫モジュレーターの調節物質が、前記免疫調節物質の発現レベルおよび/または活性レベルを上昇させる、項目61に記載の方法。
(項目65)
前記免疫モジュレーターの調節物質が、前記免疫調節物質の発現レベルおよび/または活性レベルを低下させる、項目61に記載の方法。
Claims (53)
- 複数のウェルを含む固体支持構造体を含むゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)であって、
前記複数のウェルのそれぞれが:
膜結合抗CD3抗体またはその抗原結合性断片を発現する第1の細胞であって、複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされるタンパク質の前記第1の細胞上への提示が可能になるように、前記複数のヒト膜遺伝子をコードするcDNAライブラリーでトランスフェクトされている、第1の細胞;
細胞表面上の受容体およびレポーター遺伝子を発現する第2の細胞;
を含み、
前記第2の細胞がT細胞であり、前記レポーター遺伝子がT細胞関連転写応答エレメントを含む構築物に含まれ、
前記受容体と前記抗CD3抗体またはその抗原結合性断片との間の相互作用が一次シグナルを提供し、前記第2の細胞株の活性を刺激し、
前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を刺激することを示し、前記レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を阻害することを示す、アレイ。 - 前記固体支持構造体がマルチウェルプレートである、請求項1に記載のアレイ。
- 前記マルチウェルプレートが、96ウェルプレート、384ウェルプレートおよび1536ウェルプレートからなる群から選択される、請求項2に記載のアレイ。
- 前記第1の細胞がヒト293T細胞である、請求項1に記載のアレイ。
- 前記第1の細胞が、免疫関連アダプターを発現するヒト293T.2A細胞である、請求項1に記載のアレイ。
- 前記免疫関連アダプターが、DAP10、DAP12、FcRγおよびCD3Eからなる群から選択される、請求項5に記載のアレイ。
- 前記T細胞が、Jurkat細胞、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、消耗T細胞、アネルギー性T細胞および制御性T細胞からなる群から選択される、請求項1に記載のアレイ。
- 前記レポーター遺伝子が、細胞毒性関連レポーター構築物、アポトーシス関連レポーター構築物および増殖関連レポーター構築物からなる群から選択されるDNA構築物に含まれる、請求項1に記載のアレイ。
- 前記細胞毒性関連レポーター構築物が蛍光ベースのレポーター構築物である、請求項8に記載のアレイ。
- 前記アポトーシス関連レポーター構築物が、蛍光ベースのレポーター構築物である、請求項8に記載のアレイ。
- 前記蛍光ベースのレポーター構築物が、T細胞関連転写応答エレメントと、それに続く最小CMVプロモーターおよびGFPレポーター遺伝子を含む、請求項9または10に記載のアレイ。
- 前記T細胞関連転写応答エレメントが、NF−kb、NF−AT、AP−1、EGR2、MAPKおよびPI3Kからなる群から選択される、請求項1に記載のアレイ。
- 前記増殖関連レポーター構築物中のレポーター遺伝子がサイトカイン遺伝子である、請求項8に記載のアレイ。
- 前記サイトカインが、IFN−ガンマ、TNF−アルファおよびIL−10からなる群から選択される、請求項13に記載のアレイ。
- 前記複数のヒト膜遺伝子が、受容体遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、トランスポーター遺伝子およびシグナル伝達遺伝子から選択される遺伝子を含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記複数のヒト膜遺伝子が約1,000〜7,000の遺伝子を含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記複数のヒト膜遺伝子が約2,000〜5,000個の遺伝子を含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記複数のヒト膜遺伝子が約4,000〜7,000個の遺伝子を含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記第2の細胞の前記活性が、細胞増殖、細胞抑制、細胞消耗、細胞アポトーシス、および細胞からのサイトカイン放出からなる群から選択される、請求項1に記載のアレイ。
- ゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)を作製する方法であって、
複数のウェルを含む固体支持構造体を提供するステップ;
膜結合抗CD3抗体またはその抗原結合性断片を発現する第1の細胞を、前記複数のウェルのそれぞれに培養するステップ;
複数のヒト膜遺伝子の1つによってコードされたタンパク質の前記第1の細胞上への提示が可能となるように、前記複数のヒト膜遺伝子をコードするcDNAライブラリーで前記第1の細胞をトランスフェクトするステップ;および
細胞表面上の受容体およびレポーター遺伝子を発現する第2の細胞を、前記複数のウェルのそれぞれに共培養するステップであって、前記第2の細胞がT細胞であり、前記レポーター遺伝子がT細胞関連転写応答エレメントを含む構築物に含まれ、それによってゲノムスケールのT細胞活性アレイを調製する、共培養するステップ
を含み、
前記受容体と前記抗CD3抗体またはその抗原結合性断片との間の相互作用が、一次シグナルを提供し、前記第2の細胞株の活性を刺激し、
前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を刺激することを示し、前記レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を阻害することを示す、方法。 - 前記固体支持構造体がマルチウェルプレートである、請求項20に記載の方法。
- 前記マルチウェルプレートが、96ウェルプレート、384ウェルプレートおよび1536ウェルプレートからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記第1の細胞がヒト293T細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記第1の細胞が、免疫関連アダプターを発現するヒト293T.2A細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記免疫関連アダプターが、DAP10、DAP12、FcRγおよびCD3Eからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記T細胞が、Jurkat細胞、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、消耗T細胞、アネルギーT細胞および制御性T細胞からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、細胞毒性関連レポーター構築物、アポトーシス関連レポーター構築物および増殖関連レポーター構築物からなる群から選択されるDNA構築物に含まれる、請求項20に記載の方法。
- 前記細胞毒性関連レポーター構築物が蛍光ベースのレポーター構築物である、請求項27に記載の方法。
- 前記アポトーシス関連レポーター構築物が蛍光ベースのレポーター構築物である、請求項27に記載の方法。
- 前記蛍光ベースのレポーター構築物が、T細胞関連転写応答エレメントと、それに続く最小CMVプロモーターおよびGFPレポーター遺伝子を含む、請求項28または29に記載の方法。
- 前記T細胞関連転写応答エレメントが、NF−kB、NF−AT、AP−1、EGR2、MAPKおよびPI3Kからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 前記増殖関連レポーター構築物中のレポーター遺伝子がサイトカイン遺伝子である、請求項27に記載の方法。
- 前記サイトカインが、IFN−ガンマ、TNF−アルファおよびIL−10からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
- 免疫モジュレーターを同定する方法であって、
請求項1に記載のゲノムスケールのT細胞活性アレイ(GS−TCAA)を提供するステップ;
第1の細胞中の前記複数のヒト膜遺伝子の1つを発現させるステップ、
前記第1の細胞と前記第2の細胞とを共培養するステップ;
前記第2の細胞における前記レポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ;および
前記レポーター遺伝子の発現レベルを、前記複数のヒト膜遺伝子の1つでトランスフェクトされていない対照の第1の細胞と共培養された対照の第2の細胞中の前記レポーター遺伝子の発現レベルと比較するステップ
を含み、
前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が刺激性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を刺激することを示し、前記レポーター遺伝子の発現レベルの低下が、前記複数のヒト膜遺伝子のうちの1つによってコードされる前記提示されたタンパク質が阻害性共シグナル伝達分子として作用し、前記第2の細胞株の活性を阻害することを示し、それによって免疫モジュレーターが同定される、方法。 - 前記免疫モジュレーターが、FOLH1、FAS、IL3RA、CD248、THBD、B7.1、GJB1、OX40L、4−1BBLおよびB7.2からなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記免疫モジュレーターが、FLT1、CXCR6、SEMA6a、RHCE、FCRLA、TNFRSF19、SEC22b、B3GNT1、NFAM1.LY6およびGP1BAからなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記免疫モジュレーターが、FLT1、SEMA6a、SEC22bおよびGP1BAからなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 自動化されている、請求項34に記載の方法。
- ロボット工学を使用して実行される、請求項34に記載の方法。
- ロボット液体ハンドリング技術を使用して実行される、請求項39に記載の方法。
- 自動プレートハンドリングシステムを使用して実行される、請求項39に記載の方法。
- in vitro機能アッセイ、非ヒト動物において行われるin vivoアッセイ、受容体アレイアッセイ、バイオインフォマティクスアッセイ、またはそれらの組合せからなる群から選択されるアッセイを実行することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記in vitro機能アッセイが、
前記複数のヒト膜遺伝子の1つおよび膜結合抗CD3抗体またはその抗原結合性断片を発現する前記第2の細胞を初代T細胞と共に培養すること;および
増殖アッセイ、アポトーシスアッセイおよびサイトカイン放出アッセイからなる群から選択されるin vitro機能アッセイを実行すること
を含む、請求項42に記載の方法。 - 前記初代T細胞が、ヒト初代CD8細胞および/またはヒト初代CD4細胞である、請求項43に記載の方法。
- 前記受容体アレイアッセイが、前記免疫モジュレーターの相互作用タンパク質を同定するために実行される、請求項42に記載の方法。
- 前記受容体アレイが:
複数のウェルを含む固体支持構造体
を含み、前記複数のウェルのそれぞれが:
複数の受容体遺伝子の1つによってコードされる受容体の前記細胞上での提示が可能になるように、前記複数の受容体遺伝子をコードするcDNAライブラリーでトランスフェクトされた細胞;
タグと融合した免疫モジュレーターを含む組換えタンパク質;
前記タグに特異的な蛍光標識された抗体
を含み;
検出可能な蛍光シグナルが、前記免疫モジュレーターが前記受容体と相互作用することの指標である、請求項45に記載の方法。 - 前記タグが、マウスIgG2a Fcタグ、ヒトIgG1 Fcタグ、FLAGタグおよび6xHisタグからなる群から選択される、請求項46に記載の方法。
- 前記免疫モジュレーターが前記免疫モジュレーターの全長タンパク質である、請求項46に記載の方法。
- 前記免疫モジュレーターが、前記免疫モジュレーターの細胞外ドメインである、請求項46に記載の方法。
- 前記in vivoアッセイが、前記免疫モジュレーターを自己免疫疾患またはがんの非ヒト動物モデルに投与することを含む、請求項42に記載の方法。
- 前記非ヒト動物モデルが、ヒトメラノーマ細胞および腫瘍反応性T細胞を注射されたNOD−scid IL2Rガンマnullマウスモデルである、請求項50に記載の方法。
- 前記非ヒト動物モデルがヒト化マウスモデルである、請求項50に記載の方法。
- 前記ヒト化マウスモデルが、免疫患者由来の異種移植(免疫PDX)モデルである、請求項52に記載の方法。
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