TWI567063B - 用於促進癌細胞凋亡的化合物、其醫藥組成物及其用途 - Google Patents

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TWI567063B
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Description

用於促進癌細胞凋亡的化合物、其醫藥組成物及其用途
本發明係關於一種新穎化合物，尤其是，該化合物係用於抑制癌細胞生長並可促進癌細胞凋亡。
肺癌是現今高發病率與高致死率的癌症之一，而根據統計，肺癌是台灣最常見的癌症死因。肺癌主要可區分成小細胞肺癌(small cell lung carcinoma，簡稱SCLC)及非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，簡稱NSCLC)，其中NSCLC約占肺癌病例的80%，SCLC則占20%。絕大數的NSCLC的病患觀察到有上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，簡稱EGFR)的大量表現，突變且異常增升的EGFR為新興藥物標靶蛋白之一。
艾瑞莎(亦稱為Gefitinib或ZD1839)，現已應用於在治療非小細胞癌病人的臨床用藥，其會與ATP競爭EGFR的細胞內酪胺酸激酶(tyrosine kinase)區的受質結合位置，進而抑制酪胺酸激酶的自身磷酸化反應，進而抑制下游的訊息傳導途徑，是一種小分子的酪胺酸激酶抑制劑。
艾瑞莎的療效與EGFR本身的突變有關，如在表現子19基因缺失(exon19)和第858胺基酸位點由原本的白胺酸突變成精氨酸(L858R)時，會增加腫瘤對艾瑞莎的敏感性，治療效果較原始未突變的EGFR更佳。目前的研究發現，艾瑞莎的抗藥性與EGFR的第二個位點突變有關，臨床上的數據指出50%對艾瑞莎產生抗性的非小細胞肺癌病人在EGFR的第790胺基酸產生突變，由原本的蘇胺酸變異成蛋胺酸(T790M)，T790M突變點位於EGFR與ATP結合位置上，其阻擋EGFR與其抑制子結合，甚至提高EGFR與ATP的結合能力而增強EGFR的活性。
本發明提供一種式(I)化合物或其鹽，
其中，m為2至7之整數，以及R係獨立選自由氫及C1-C20烷基所組成群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，m為2，R係C1-C13烷基。
於本發明之一具體實施例中，m為2，R係C12烷基。
於本發明之一具體實施例中，本發明之化合物係用於促進癌細胞的細胞凋亡，用以抑制癌細胞的生長。較佳者，該癌細胞係選自由肺癌細胞、直腸癌細胞及膀胱癌細胞所組成群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，本發明之式(I)化合物係用以抑制表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，以下簡稱EGFR)蛋白激酶之活性，以促進癌細胞凋亡。
本發明進一步提供一種醫藥組成物，其係包含如上述式(I)之化合物或其鹽以及醫藥上可接受之載劑。
本發明再進一步提供一種包含本發明之醫藥組成物的用途，其係用於製造治療癌症之藥物，其中，該癌症係選自肺癌、直腸癌及膀胱癌所組成群組之至少一者。
第1圖係顯示不同濃度之艾瑞莎類似物(簡稱類似物)1、類似物2及艾瑞莎分別處理以不同癌症細胞株24小時後之細胞存活率結果，(A)為RKO人類直腸癌細胞株，(B)為BFTC905人類膀胱癌細胞株；第2圖係顯示類似物18相較於艾瑞莎對於促進不同人類肺癌細胞之細胞死亡更有效率；將不同人類肺癌細胞株以0至40μM的艾瑞莎或類似物18處理24小時，之後以MTT試驗進行細胞存活率分析。(A)為A549人類肺腺癌細胞株(以下簡稱A549)，(B)為H1299人類非小細胞肺癌細胞株(以下簡稱H1299)，(C)CL3人類肺癌細胞株((以下簡稱CL3)，其中(A)、(B)及(C)結果係得自3個實驗且該橫槓表示平均值±S.E.，##p<0.01表示以艾瑞莎處理樣品與以類似物18處理樣品間的顯著性差異；(D)為HFL1人類肺纖維母細胞株(以下簡稱HFL1)，該結果係得自6個實驗且該橫槓表示平均值±S.E.； 第3圖係顯示EGFR及磷酸化EGFR在不同人類肺癌細胞中之蛋白質表現；萃取自A549細胞株、H1299細胞株、CL3細胞株及A431人類表皮樣癌(係過分表現EGFR者，其做為正控制組)之總體蛋白質，利用抗EGFR、抗磷酸化EGFR及抗肌動蛋白之抗體進行西方墨點法分析，並以肌動蛋白作為蛋白質充填控制組，該結果係取自3個類似實驗結果其中之1； 第4圖係顯示類似物18及艾瑞莎均抑制EGFR蛋白激酶之活性，(A)ATP轉換至ADP的標準曲線，其與ADP的量具有正相關；(B)利用IVIS系統定量螢光強度的結果；(C)利用(A)之標準曲線計算蛋白激酶特定活性之結果；(D)以最大酵素活性之%表現EGFR蛋白激酶活性，其中，以類似物18或艾瑞莎不存在時之蛋白激酶特定活性作為100%；上述結果係得自3個實驗且該橫槓表示平均值±S.E.，*p<0.05、**p<0.01表示控制組(不含任何化合物者)與經類似物18或艾瑞莎處理樣品間的顯著性差異； 第5圖係顯示類似物18較艾瑞莎於人類肺癌細胞中引發細胞凋亡更具效率，A549細胞株以0至40μM之(A)類似物18或(B)艾瑞莎處理24小時後，利用膜聯蛋白V-碘化丙啶(Anncxin V-PI(propidium iodise，簡稱PI))染色及使用流式細胞儀分析測定被引發之細胞凋亡含量，該細胞群以Annexin V+/PI-(右下圖)及Annexin V+/PI+表示者(右上圖)，分別表示細胞凋亡之早期及晚期，該結果係取自3個類似實驗之其中之一； 第6圖係顯示以CellQuest軟體定量(A)早期細胞凋亡、(B)晚期細胞凋亡及(C)全部細胞凋亡之百分比，該橫槓表示平均值±S.E.，*p<0.05、**p<0.01表示以控制組(不含任何化合物者)與以類似物18處理樣品間的顯著性差異，#p<0.05及##p<0.01表示以艾瑞莎處理樣品與以類似物18處理樣品間的顯著性差異； 第7圖係顯示類似物18較艾瑞莎對於人類肺癌細胞之生長及細胞週期抑制更有效率，將A549細胞株以1×106細胞/p60培養皿的密度接種於60mm培養皿中培養18小時，再以30μM之類似物18或艾瑞莎處理24小時，待以藥物處理完後，該細胞繼續培養2天至6天，最後以血球計(hemocytometer)計算其細胞數，該結果係得自3個實驗且該橫槓表示平均值±S.E.，*p<0.05表示以控制組(不含任何化合物者)與以艾瑞莎處理樣品間的顯著性差異，##p<0.01表示以控制組(不含任何化合物者)與以類似物18處理樣品間的顯著性差異； 第8圖係顯示將A549細胞株以0至40μM之(B)類似物18或(A)艾瑞莎處理24小時後，以流式細胞儀進行分析，該結果係取自3個類似實驗其中之一； 第9圖係顯示利用ModFit LT軟體定量(A)G0/G1期、(B)S期、(C)G2/M期及(D)次-G1期之百分比，該結果係得自3個實驗且該橫槓表示平均值±S.E.，*p<0.05、**p<0.01表示以控制組(不含任何化合物者)與以類似物18或艾瑞莎處理樣品間的顯著性差異，##p<0.01表示以類似物18處理 樣品與以艾瑞莎處理樣品間的顯著性差異； 第10圖係顯示類似物18較艾瑞莎於人類肺癌細胞中誘發凋亡蛋白酶3(caspase 3)及多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase，以下簡稱PARP)之蛋白質表現更有效率，(A)將A549細胞株以0至40μM之類似物18或艾瑞莎處理24小時後，進行蛋白質萃取並使用抗凋亡蛋白3、抗PARP及抗肌動蛋白之特定抗體進行西方墨點法分析，將肌動蛋白用於作為蛋白質充填控制組，該結果係取自3個類似實驗結果之其中之一；(B)及(C)以半量化法(semi-quantification)得出活化態凋亡蛋白3及切割態PARP之相對蛋白質強度，該結果係得自3個實驗且該橫槓表示平均值±S.E.，*p<0.05表示以控制組(不含任何化合物者)與以類似物18處理樣品間的顯著性差異； 第11圖係顯示類似物18較艾瑞莎對於抑制人類肺癌細胞中的生存素(survivin)之基因及蛋白質表現更有效率，(A)將A549細胞株以0至40μM之類似物18或艾瑞莎處理24小時後，根據使用者手冊萃取出細胞之總RNA，以半定量反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction，以下簡稱RT-PCR)分析mRNA之表現，以GAPDH作為內部控制組，該結果係取自3個相似實驗結果之其中之一；(B)該橫槓表示平均值±S.E.，#p<0.05表示以類似物18處理樣品與以艾瑞莎處理樣品間的顯著性差異；(C)將A549細胞株以0至40μM之類似物18或艾瑞莎處理24小時後，使用抗生存素及抗肌動蛋白 之特定抗體進行西方墨點法以分析總蛋白萃取物，該結果係取自3個相似實驗結果之其中之一；(D)以半定量化法自西方墨點法得出生存素之相對蛋白質強度，該結果係得自3個實驗且該橫槓表示平均值±S.E.，*p<0.05表示以控制組(不含任何化合物者)與以類似物18或艾瑞莎處理樣品間的顯著性差異，#p<0.05表示以類似物18處理樣品與以艾瑞莎處理樣品間的顯著性差異； 第12圖係顯示在肺癌細胞中以GFP-生存素表現載體轉染之生存素過度表現，可抑制類似物18所引發的細胞死亡，(A)將總蛋白萃取物進行西方墨點法分析；(B)在轉染及以類似物18處理後，以MTT試驗進行細胞存活率分析，該結果係得自3個實驗且該橫槓表示平均值±S.E.，**p<0.01表示控制組之轉染與生存素組之轉染或以類似物18處理之生存素組轉染樣品間的顯著性差異，##p<0.01表示以類似物18處理之樣品及控制組間的顯著性差異； 第13圖係顯示類似物18可在異體移植人類肺癌細胞的裸鼠中抑制腫瘤大小及生存素蛋白質的表現，(A)每4天測量一次腫瘤之體積，該結果係得自8隻裸鼠且該橫槓表示平均值±S.E.，***p<0.001表示控制組(不含任何化合物者)與以類似物18處理樣品間的顯著性差異；(B)在以藥物處理後之第16天犧牲裸鼠並取出腫瘤；(C)將得自各組的異體腫瘤組織均質化並使用抗生存素及抗肌動蛋白之特定抗體進行西方墨點法以分析總裂解物，該結果係得自3個相似實驗結果之其中之一，以半定量化法自西方墨點法得出 生存素之相對蛋白質強度，該結果係得自3個實驗。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此專業之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之優點及功效。本發明亦可藉由其它不同之實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。
本發明提供一種式(I)化合物或其鹽，
其中，m為2至7之整數，以及R係獨立選自由氫及C1-C20烷基所組成群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，較佳者，m為2，R係C1-C20烷基。最佳者，m為2，R係C12烷基。
於本發明之一具體實施例中，本發明之化合物係4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧喹唑啉-6-氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十二酯(類似物18)。
於本發明之一具體實施例中，本發明之化合物係用於促進癌細胞的細胞凋亡，用以抑制癌細胞的生長。較佳者，該癌細胞係選自由肺癌細胞、直腸癌細胞及膀胱癌細胞所組成群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，本發明之式(I)化合物係用以抑制EGFR(epidermal growth factor receptor)蛋白激酶之活性，以促進癌細胞凋亡。
於本發明之一具體實施例中，本發明之化合物係用以促進癌細胞中凋亡蛋白酶3(caspase 3)之活化及多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase)之切割，並抑制生存素(survivin)的蛋白質及基因表現，以促進癌細胞凋亡。
本發明進一步提供一種醫藥組成物，其包含本發明之式(I)之化合物或其鹽以及醫藥上可接受之載劑。
本發明化合物具有低毒性及可藉由與藥理上可接受的載劑等混合而呈醫藥組合物用於哺乳動物(例如：人類、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬、豬、猴)。
作為藥藥上可接受的載劑，可使用傳統上用作為配方材料的各種有機或無機載劑物質。該等被合併作為用於固體配方的賦形劑、潤滑劑、結合劑及崩解劑，用於液體配方的溶劑、溶解劑、懸浮劑、等滲劑、緩衝液、舒緩劑，及其類似者，以及如需要時可添加的配方添加劑(例如：防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑、及其類似物)。
該醫藥組合物的劑型之實例包括口服製劑(例如：錠劑(包括糖衣錠、膜衣錠、舌下含錠、口服崩解錠)、膠囊(包括軟膠囊、微膠囊)、顆粒、粉末、片劑、糖漿、乳液、懸浮液、薄膜(例如：口服可崩解薄膜)及其類似物；以及腸外試劑(例如：注射液(例如：皮下注射液、靜脈注射液、肌肉注射液、腹腔注射液、點滴注射液)、丸劑、鼻製劑、 肺製劑(吸入劑)及其類似物。
本發明再進一步提供一種包含如上述式(I)之化合物或其鹽的用途，係用於製造治療癌症之藥物，其中，該癌症係選自由肺癌、直腸癌及膀胱癌所組成群組至少之一者。
用於本發明之說明書中，術語「艾瑞莎(Iresa)」係指治療肺癌藥物之商品名，其學名為吉非替尼(Gefitinib)，其係為表皮細胞生長因子受體之抑制劑。
用於本發明之說明書中，術語「艾瑞莎類似物(analogues)」係指一系列吉非替尼之哌嗪類似物，其中，在吉非替尼之嗎啉基經多種的哌嗪基所取代。
實施例 細胞株與細胞培養
RKO係人類直腸癌細胞株；BFTC905係人類膀胱癌細胞株；A549細胞株(ATCC編號：CCL-185)係衍生自58歲的男性白種人(Caucasian)之肺腺癌細胞(含有野生型p53者)；H1299細胞株係人類非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma)細胞株(無法表現p53蛋白質者)；CL3係由國立台灣大學楊泮池博士所提供；HFL-1(ACTT編號CCL-153)係衍生自白種胎兒之正常肺纖維母細胞；A431細胞株係衍生自85歲女性之表皮樣癌(epidermoid carcinoma)(過分表現EGFR者)細胞株。BFTC905、A549、H1299及CL3細胞株均以RPMI-1640培養基培養(Gibco,Life Technologies,Grand Island,NY,USA)；RKI、HFL1及A431細胞株均以 DMEM培養基培養(Gibco,Life Technologies,Grand Island,NY,USA)。完全培養基含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，以下簡稱FBS)、100單位/毫升(U/mL)青黴素、100微克/毫升(μg/mL)鏈黴素以及碳酸氫鈉。所有細胞株均培養於37℃之5% CO2之潮濕培養箱(310/Thermo,Forma Scientific,Inc.,Marietta,OH)。
統計分析
各實驗至少重複3次，數據係以學生t檢定(Student’s t test)分析；與多組比較上，以變異數分析(analysis of variance)測試分析數據。以p值<0.05認定為統計上顯著差異。
實施例1 艾瑞莎類似物之合成 1.艾瑞莎類似物(簡稱類似物)1及類似物2之合成：
(1).化合物1：4-甲氧基-4-氧代丁酸(步驟1)
將丁二酸酐(1公克(g)，10毫莫耳(mmol))與乾甲醇(20毫升(mL)，500mmol)混合後，以迴流方式(reflux)加熱並劇烈地攪拌2.5小時。在減壓下移除多餘的甲醇後，以水將剩餘物溶解。接著將該溶液以二氯甲烷萃取後，再以MgSO4進行乾燥，蒸發後獲得產率為68%之化合物1(0.9g，6.81mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：10.89(b,1H),3.70(s,3H),2.71-2.61(m,4H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：178.1,172.6,51.9,28.8,28.6；IR(KBr)：3028,2957,1736,1690,1175,1003cm-1；MS m/z：132.0(M+,0.1),114.1(11.2),101.0(100.0),73.1(20.9),59.1(17.2),55.0(41.8)；HRMS-EI(m/z)：[M]+ calcd for C5H8O4,132.0423；found,132.0424.
(2).化合物2：4-(4-芐基哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸甲酯(步驟2)
將丁二酸單甲酯(0.35g,2.65mmol)及亞硫醯氯(0.22mL,2.9mmol)的5mL苯溶液迴流1.5小時，再以蒸餾法(distillation)將大部分的亞硫醯氯及苯去除。將該混合物冷卻至室溫並於真空下乾燥得到粗3-氯羰基-丙酸甲酯。藉由套管將3-氯羰基-丙酸甲酯(0.5g，2mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液加入含有1-芐基哌嗪(0.5g,2.84mmol)之二氯甲烷圓形燒瓶中，隨後添加吡啶(0.65mL，8mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌過夜，最後加水使其淬滅(quench)。加入2M的NaOH溶液使該pH成鹼性(pH 9)，接著以二氯甲烷萃取且以MgSO4乾燥及蒸發，獲得粗的殘留物。再將該殘留物以管柱層析法純化，並以乙酸乙酯/己烷(1：2.3，1：1，3：1)沖提(elute)後獲得產率為34%之化合物2(0.26g，0.90 mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：7.32-7.29(m,4H),7.28-7.27(m,1H),3.69(s,3H),3.63-3.60(t,J=5.1Hz,2H),3.51(s,2H),3.49-3.47(t,J=5.1Hz,2H),2.68-2.59(m,4H),2.45-2.39(m,4H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：173.7,169.5,137.6,129.1,128.3,127.3,62.9,52.9,52.7,51.8,45.3,41.8,29.1,27.9；IR(KBr)：2949,1736,1646,1438,1226,1165,998,744cm-1；MS m/z：290.1(M+,14.0),259.1(16.4),146.1(48.7),134.1(21.5),91.1(100.0)；HRMS-EI(m/z)：[M]+針對C16H22N2O3之計算值，290.1630；實測值，290.1634.
(3).化合物3：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸甲酯(步驟3)
將化合物2(0.21g，0.72mmol)及含有10%鈀碳催化劑(palladium on carbon)(22mg，10重量%(wt%))的20mL甲醇之混合物置入巴氏容器(Parr glass vessel)中，並小心地以氫氣換氣三次。最後將該巴氏容器以60psi氫氣充填後，機械式搖動12小時。反應完成後，將該反應混合物以矽藻土墊過濾並以過量的甲醇沖洗。減壓下濃縮該過濾物後，得到產率為66%之4-側氧基-4-哌嗪-1-基-丁酸甲酯(0.095g，0.48mmol)。將4-側氧基-4-哌嗪-1-基-丁酸甲酯溶於10mL之四氫呋喃中，再加入三乙胺(0.08mL，0.57mmol)及1- 溴-3-氯丙烷(0.057mL，0.57mmol)，接著將該溶液攪拌過夜，最後加水使其淬滅。將所得溶液以乙酸乙酯萃取，再以MgSO4乾燥，蒸發以獲得粗殘留物。接著將此殘留物以管柱層析法(Al2O3)純化，並以乙酸乙酯沖提(elute)後獲得產率為18%之化合物3(0.024g，0.087mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：3.67(s,3H),3.60-3.57(t,J=6.3Hz,4H),3.48-3.45(t,J=5.1Hz,2H),2.66-2.58(m,4H),2.49-2.46(t,J=7.1Hz,2H),2.43-2.41(t,J=5.0Hz,2H),2.39-2.36(t,J=5.1Hz,2H),1.95-1.88(m,2H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：173.6,169.5,55.1,53.3,52.8,51.8,45.2,43.0,41.7,29.7,29.0,27.9；IR(KBr)：2950,2814,1736,1647,1438,1369,1227,1168cm-1；MS m/z：276.1(M+,8.6),245.1(28.2),213.1(100.0),132.1(15.4)；HRMS-EI(m/z)：[M]+C12H21ClN2O3計算值，276.1241；實測值276.1242.
(4).化合物4：4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇(步驟4)
將6-(芐氧基)-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺(0.15g，0.37mmol)及含有10%鈀碳催化劑(palladium on carbon)(25mg，10wt%)的20mL甲醇混合物置入巴氏容器中，並小心地以氫氣沖洗三次。最後將該巴氏容器以60psi氫氣充填後，機械式搖動24小時。反應完 成後，將該反應混合物以矽藻土墊過濾並以過量的甲醇沖洗。減壓下濃縮該過濾物以得到產率為82%之化合物4(0.096g，0.3mmol)。
(5).類似物1：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧喹唑啉-6-基氧基)基丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸甲酯(步驟5)
先將化合物4(20mg，0.063mmol)溶解於0.4mL的N,N-二甲基甲醯胺(以下簡稱DMF)中，再加入碳酸鉀(17mg，0.125mmol)及化合物3(17mg，0.063mmol)，並在90℃下加熱過夜。再將該反應混合混合物冷卻至室溫並加水使其淬滅。將所得溶液以乙酸乙酯萃取，再以MgSO4乾燥，接著濃縮後獲得粗殘留物。最後將該殘留物以管柱層析法純化且以乙酸乙酯沖提後獲得產率為57%之類似物1(0.023g，0.041mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：8.65(s,1H),7.89-7.86(dd,J=6.4,2.5Hz,1H),7.74(b,1H),7.56-7.53(m,1H),7.24-7.23(m,2H),7.20-7.06(m,1H),4.18-4.15(t,J=6.5Hz,2H),3.97(s,3H),3.68(s,3H),3.63(b,2H),3.51(b,2H),3.66-2.59(m,6H),2.51(b,2H),2.46(b,2H),2.12-2.07(m,4H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：173.8,169.6,160.8,158.4,156.7,155.1,153.6,148.9,147.3,134.6,127.3,124.2,115.8,115.6,109.0,107.7,101.2,67.4,56.2,54.7,53.2,52.7, 51.9,45.1,41.6,29.7,29.0,27.9,26.3；IR(KBr)：3322,2949,2893,2838,1747,1644,1633,1579,1502,1472,1433,1220,1172,1005,839cm-1；MS m/z：559.2(M+,2.9),525.2(20.1),494.2(23.1),381.1(21.0),297.1(28.2),285.1(32.3),241.1(28.5),213.1(100.0),99.1(33.2),70.1(29.7)；HRMS-EI(m/z)：[M]+C27H31ClFN5O5計算值559.1998；實測值559.2007.
(6).類似物2：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸甲酯酸(步驟6)
將含有類似物1(0.08g，0.143mmol)及氫氧化鋰(9mg，0.214mmol)的8mL甲醇溶液於60℃下加熱過夜。接著，將該反應混合物冷卻至室溫，再進行蒸發後，得到粗產物。該粗產物再以水溶解後，利用乙酸乙酯進行萃取，以MgSO4進行乾燥，最後蒸發，得到產率為68%之類似物2(53mg,0.097mmol)。
1H NMR(400MHz,MeOD,δ)：8.46(s,1H),8.02-7.99(dd,J=6.7,2.4Hz,1H),7.74(s,1H),7.71-7.66(m,1H),7.30-7.25(t,J=8.9Hz,2H),7.19-7.15(m,1H),4.30-4.27(t,J=5.9Hz,2H),4.01(s,3H),3.66-3.63(t,J=4.9Hz,4H),3.33-3.31(m,2H),2.75-2.72(t,J=7.2Hz,2H),2.69-2.66(m,4H),2.61-2.58(m,4H),2.19-2.14(m,2H)；13C NMR (100.6MHz,CDCl3,δ)：174.4,169.9,156.5,155.0,154.8,153.1,152.4,148.8,147.5,137.3,124.0,122.9,122.8,119.3,119.1,117.1,116.9,109.2,107.8,102.3,67.6,56.4,54.9,53.5,53.1,45.1,41.6,40.6,29.5,27.9,26.6；IR(KBr)：3387,2963,2812,1723,1646,1625,1584,1533,1499,1476,1427,1238,854cm-1；MS m/z：546.0(M+,50.9),512.0(16.1),389.0(13.7),320.0(26.8),307.0(30.1),227.0(36.1),199.0(28.3),154.0(99.9),136.0(100.0),90.0(80.5),78.0(76.5)；HRMS-FAB(m/z)：[M+1]+ C26H30ClFN5O5計算值，546.1920；實測值546.1930.
2.類似物3至7之合成：
(1).化合物5：1-(3-氯丙基)-哌嗪‧鹽酸鹽(步驟7)
將1-(3-氯丙基)-4-(第三丁氧羰基)-哌嗪(4.0g,15.2mmol)以溶於乙酸乙酯的鹽酸處理後得到1-(3-氯丙基)-哌嗪‧鹽酸鹽(3.17g,13.5mmol)，產率89%。
1H NMR(400MHz,D2O,δ)：3.63-3.54(m,9H),3.39(s,1H),3.40-3.35(m,2H),2.21-2.14(m,2H).13C NMR(100.6MHz,D2O,δ)：54.8,48.6,41.1,40.7,26.2.IR(KBr)：3356,3001,1443,1301,1160,1084cm-1.MS m/z：162.1(M+,13.6),120.1(100.0),99.1(79.5),70.1(29.2),56.1(49.6).HRMS-EI (m/z)：[M]+計算值，C7H15ClN2,162.0924；實測值，162.0930.
(2).化合物6至10：(步驟8)
將含有單烷基酸(碳數分別為3至7)(1.2eq)及亞硫醯氯(1.4eq)於5mL苯的溶液迴流(reflux)3小時。接著，將大部分的亞硫醯氯及苯以蒸餾方式去除，將該混合物冷卻至室溫後，真空下乾燥以獲得粗氯羰基-烷酸甲酯(烷酸的碳數分別為3至7)。將化合物5置入圓形燒瓶，再以套管(cannula)將含有該氯羰基-烷酸甲酯(烷酸的碳數分別為3至7)的5mL二氯甲烷溶液加入其中，接著加入吡啶(3.5eq)。將所得的溶液在室溫下攪拌過夜，再加入水使其淬滅。將該溶液以乙酸乙酯萃取，再以MgSO4乾燥，接著蒸發以獲得粗殘留物，將該殘留物以管柱層析法(Al2O3)純化，並以乙酸乙酯/己烷(1：15)沖提後分別獲得化合物6至10。
化合物6：5-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸甲酯
產率：35%,1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：3.65(s,3H),3.60-3.57(t,J=6.5Hz,4H),3.46-3.43(t,J=4.9Hz,2H),2.49-2.46(t,J=7.0Hz,2H),2.46-2.33(m,8H),1.96-1.92(m,4H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：173.8,170.6,55.1,53.4,52.8,51.5,45.4,43.0,41.5,33.2,32.1,30.0,20.4；IR(KBr)：2923,2853,1735,1647,1457,1373,1105cm-1；MS m/z：290.2(M+,6.8),259.2(27.3),227.2(100.0),132.1(75.2), 99.1(79.6),70.1(39.8),55.1(50.5)；HRMS-EI(m/z)：[M]+ C13H23ClN2O3計算值，290.1397；實測值290.1391.
化合物7：6-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-6-氧代己酸甲酯
產率：56%,1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：3.64(s,3H),3.60-3.58(t,J=6.4Hz,4H),3.45-3.42(t,J=4.9Hz,2H),2.50-2.46(t,J=7.0Hz,2H),2.46-2.36(m,4H),2.34-2.29(m,4H),1.96-1.89(m,2H),1.67-1.63(m,4H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：173.9,171.0,55.1,53.5,52.8,51.5,45.5,42.9,41.5,33.8,32.8,29.7,24.7.IR(KBr)：2949,1735,1645,1436,1249,1004cm-1；MS m/z：304.2(M+,6.2),273.1(25.1),241.1(100.0),132.1(96.0),99.1(41.7),70.1(27.8),55.1(55.6)；HRMS-EI(m/z)：[M]+ C14H25ClN2O3計算值，304.1554；實測值304.1558.
化合物8：7-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酸甲酯
產率：60%,1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：3.64(s,3H),3.60-3.57(t,J=6.3Hz,4H),3.44-3.42(t,J=4.6Hz,2H),2.50-2.46(t,J=6.9Hz,2H),2.38-2.36(m,4H),2.31-2.27(m,4H),1.95-1.89(m,2H),1.67-1.61(m,4H),1.38-1.30(m,2H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：174.1,171.3,55.1,53.5,52.8,51.5,45.5,43.0,41.5,33.9,33.0,29.7,28.9,24.9,24.7； IR(KBr)：2947,1736,1644,1435,1174,1004cm-1.MS m/z：318.2(M+,4.5),287.2(22.4),255.2(100.0),132.1(90.2),99.1(70.5),70.1(23.7),55.1(27.9；HRMS-EI(m/z)：[M]+ C15H27ClN2O3計算值，318.1710；實測值318.1718.
化合物9：8-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-8-氧代辛酸甲酯
產率：67%,1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：3.61(s,3H),3.61-3.57(m,4H),3.42-3.40(t,J=4.9Hz,2H),2.47-2.43(m,2H),2.39-2.33(m,4H),2.27-2.23(t,J=7.5Hz,4H),1.93-1.87(m,4H),1.59-1.54(m,4H),1.30-1.29(b,4H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：174.1,171.4,55.1,53.5,52.8,51.4,45.5,43.0,41.4,33.9,33.0,29.7,29.0,28.9,25.0,24.7；IR(KBr)：2934,2858,1737,1645,1462,1435,1370,1173,1004cm-1；MS m/z：332.2(M+,7.5),301.2(20.4),269.2(100.0),132.1(99.5),120.1(34.8),99.1(32.2),70.1(11.4),55.1(14.1)；HRMS-EI(m/z)：[M]+ C16H29ClN2O3計算值，332.1867；實測值332.1880.
化合物10：9-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-9-氧代壬酸甲酯
產率：63%,1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：3.64(s,3H),3.60-3.57(m,4H),3.45-3.42(t,J=4.8Hz,2H),2.50-2.46(t,J=7.0Hz,2H),2.42-2.36(m,4H),2.29-2.26(m,4H), 1.96-89(m,2H),1.61-1.57(m,4H),1.30(b,6H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：174.2,171.5,55.2,53.5,52.9,51.4,45.6,42.9,41.5,34.0,33.2,29.7,29.2,29.0,28.9,25.2,24.9；IR(KBr)：2932,2856,1737,1645,1435,1004cm-1；MS m/z：346.2(M+,0.5),313.2(53.4),284.1(54.3),269.1(26.9),191.2(100.0),132.1(99.5),120.1(10.2),99.1(12.3),55.1(90.6)；HRMS-EI(m/z)：[M]+ C17H31ClN2O3計算值，346.2023；實測值346.2031.
(3).類似物3至7：(步驟9)
先以1mL的N,N-二甲基甲醯胺溶解化合物4(1eq)後，再加入碳酸鉀(2eq)及自化合物6至10選一者加入，並在80℃下加熱過夜。再將該反應混合物冷卻至室溫並加水使其淬滅。將所得的溶液以乙酸乙酯萃取，接著將所合併之萃取物以水及鹽水(brine)清洗，再以MgSO4乾燥，接著蒸發後以獲得殘留物。最後將該殘留物以管柱層析法純化後獲得類似物3至7。
類似物3：5-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊酸甲酯
產率：40%；1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：9.50(s,1H),8.43(s,1H),7.83(s,1H),7.79-7.75(m,2H),7.25-7.20(t,J=8.3Hz,2H),4.20-4.17(t,J=6.1Hz,2H),3.94(s,3H),3.59 (s,3H),3.45-3.42(m,4H),2.41(b,2H),2.36-2.30(m,6H),2.02-1.99(m,2H),1.76-1.69(m,2H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：173.6,170.4,160.0,157.6,156.9,154.8,153.3,148.7,147.3,136.2,124.9,124.8,115.6,115.4,109.2,107.8,103.2,67.6,56.3,54.9,53.6,53.1,51.7,45.2,41.4,33.1,31.8,26.5,20.7；IR(KBr)：3374,2949,1729,1624,1508,1428,1214,854cm-1；MS m/z：573.2(M+,6.3),539.2(19.6),508.2(23.2),381.2(35.6),297.1(55.8),285.1(87.3),227.1(100.0),213.1(57.0),99.1(95.7),70.1(85.8),55.0(47.0)；HRMS-EI(m/z)：[M]+ C28H33ClFN5O5計算值，573.2154；實測值，573.2940.
類似物4：6-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-6-氧代己酸甲酯
產率：30%；1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：8.62(s,1H),7.62-7.58(m,2H),7.37(b,1H),7.24(s,1H),7.12-7.07(m,2H),4.18-4.15(t,J=6.6Hz,2H),3.98(s,3H),3.65(s,3H),3.62-3.60(t,J=4.7Hz,2H),3.46-3.44(t,J=4.9Hz,2H),2.59-2.56(t,J=7.0Hz,2H),2.47-2.40(m,4H),2.35-2.29(m,4H),2.13-2.06(m,2H),1.66(b,4H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：173.9,171.0,160.8,158.4,156.5,155.1,153.7,148.9,147.5,134.5,124.2,124.1,115.9,115.7,108.9, 108.0,100.8,67.5,56.2,54.8,53.5,52.9,51.5,45.5,41.5,33.8,32.8,26.4,24.7,24.6；IR(KBr)：3379,2949,1733,1623,1508,1430,1214cm-1；MS m/z：587.2(M+,0.9),551.2(14.3),522.2(23.4),381.1(33.5),355.1(19.5),297.1(53.2),285.0(100.0),269.1(56.4),241.1(80.4),99.0(73.4),70.0(56.2),55.0(44.9)；HRMS-EI(m/z)：[M]+ C29H35ClFN5O5計算值，587.2311；實測值，587.2314.
類似物5：7-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-7-氧代庚酸甲酯
產率：33%；1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：8.63(s,1H),7.63-7.59(m,2H),7.24(s,1H),7.12-7.08(m,3H),4.19-4.16(t,J=6.3Hz,2H),3.99(s,3H),3.66(s,3H),3.62(b,3H),3.46(b,3H),2.61-2.57(t,J=6.9Hz,2H),2.46-2.44(m,4H),2.33-2.28(m,4H),2.14-2.09(m,2H),1.68-1.60(m,4H),1.40-1.32(m,2H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：174.1,171.3,160.9,158.4,156.5,155.2,153.7,148.9,147.6,134.5,124.2,124.1,115.9,115.7,108.8,108.1,100.7,67.6,56.2,54.8,53.5,52.9,51.5,45.5,41.5,33.9,32.9,28.9,26.4,24.9,24.7；IR(KBr)：2927,1735,1624,1582,1508,1429,1214,732cm-1.
類似物6：8-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉 -6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-8-氧代辛酸甲酯
產率：35%；1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：8.63(s,1H),7.63-7.59(m,2H),7.25(s,1H),7.13-7.08(m,3H),4.21-4.18(t,J=6.5Hz,2H),4.00(s,3H),3.66(s,3H),3.64-3.61(t,J=5.1Hz,2H),3.48-3.45(t,J=4.7Hz,2H),2.61-2.58(t,J=6.9Hz,2H),2.48-2.43(m,4H),2.31-2.28(t,J=7.4Hz,4H),2.15-2.08(m,2H),1.66-1.60(m,4H),1.36-1.32(m,4H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：174.2,171.5,160.9,158.4,156.5,155.2,153.7,148.9,147.6,134.5,124.2,124.1,115.9,115.7,108.8,108.1,100.7,67.6,56.2,54.8,53.5,52.9,51.5,45.6,41.5,33.9,33.1,29.1,28.9,26.4,25.1,24.8；IR(KBr)：2931,1734,1623,1583,1508,1429,1244,1214,1141,1005,833cm-1.
類似物7：9-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-9-氧代壬酸甲酯
產率：31%；1H NMR(400MHz,CDCl3,δ)：8.62(s,1H),7.63-7.59(m,2H),7.29(s,1H),7.24(s,1H),7.11-7.07(m,2H),4.19-4.16(t,J=6.3Hz,2H),3.99(s,3H),3.66(s,3H), 3.63-3.61(t,J=4.7Hz,2H),3.47-3.45(t,J=4.7Hz,2H),2.60-2.57(t,J=6.9Hz,2H),2.48-2.42(m,4H),2.31-2.27(t,J=7.4Hz,4H),2.13-2.06(m,2H),1.62-1.59(m,4H),1.31(b,6H)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3,δ)：174.2,171.6,160.8,158.4,156.5,155.2,153.7,148.9,147.6,134.5,124.2,124.1,115.9,115.7,108.9,108.1,100.9,67.6,56.2,54.8,53.5,52.9,51.4,45.6,41.5,34.0,33.2,29.2,29.0,28.9,26.5,25.2,24.9；IR(KBr)：2927,1732,1628,1508,1265,739,704cm-1；MS m/z：629.4(M+,0.9),593.4(20.8),564.4(27.7),381.2(54.3),355.2(32.6),312.2(40.8),297.2(80.6),285.1(100.0),269.1(25.8),125.1(31.2),99.1(99.6),70.1(77.6),55.1(64.7)；HRMS-EI(m/z)：[M]+ C32H41ClFN5O5計算值，629.2780；實測值，629.2789.
3.類似物8至26之合成：
(1).化合物11至29：(步驟10)
將含有丁二酸酐(1eq)及乾燥醇類(碳數分別為2至20)(1eq)的4mL甲苯溶液洄流下加熱2.5小時。減壓下移除甲苯後，以水將殘留物溶解。接著將此溶液以二氯甲烷萃取，再以MgSO4進行乾燥，蒸發後得到單烷基丁二酸(烷基的碳數分別為2至20)。
將含有單烷基丁二酸(烷基的碳數分別為2至20)(1.2eq)及亞硫醯氯(1.4eq)的5mL苯溶液迴流3小時，再以蒸餾方式除去大部分的亞硫醯氯及苯。將該混合物冷卻至室溫，真空乾燥以獲得粗氯羰基-烷基酯(烷基的碳數為2至 20)。將化合物5(1eq)置於圓形燒瓶中，再以套管(cannula)將該氯羰基-烷基酯(烷基的碳數為2至20)的5mL二氯甲烷溶液加入其中，接著加入吡啶(1.4eq)。將該所得溶液在室溫下攪拌過夜，再加入水使其淬滅。以乙酸乙酯萃取，再以MgSO4乾燥，蒸發以獲得殘留物。將該殘留物以管柱層析法(Al2O3)純化，以乙酸乙酯/己烷(1：15)沖提後得到化合物11至29(其物化數據詳見於表1)。
化合物11：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸乙酯
化合物12：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸丙酯
化合物13：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸丁酯
化合物14：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸戊酯
化合物15：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸己酯
化合物16：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸庚酯
化合物17：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸辛酯
化合物18：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸壬酯
化合物19：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸癸酯
化合物20：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十一酯
化合物21：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十二酯
化合物22：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十三酯
化合物23：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十四酯
化合物24：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十五酯
化合物25：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十六酯
化合物26：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十七酯
化合物27：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十八酯
化合物28：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十九酯
化合物29：4-(4-(3-氯丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸二十酯
(2).類似物8至26之合成：(步驟11)
將化合物4(1eq)溶於1mL二甲基甲醯胺中，分別加入化合物11至29(1eq)及碳酸鉀(2eq)，並在80℃下加熱過夜，將該反應混合物冷卻至室溫後再加水使其淬滅，以乙烯乙酯萃取該所得溶液。將所合併之萃取物以水及鹽水(brine)清洗後，以MgSO4乾燥，蒸發以獲得粗殘留物，將該殘留物以管柱層析法純化後得到類似物8至26(其物化數據詳見於表2)。
類似物8：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸乙酯
類似物9：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸丙酯
類似物10：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸丁酯
類似物11：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸戊酯
類似物12：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸己酯
類似物13：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸庚酯
類似物14：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸辛酯
類似物15：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸壬酯
類似物16：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸癸酯
類似物17：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十一酯
類似物18：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十二酯
類似物19：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十三酯
類似物20：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十四酯
類似物21：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十五酯
類似物22：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十六酯
類似物23：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十七酯
類似物24：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十八酯
類似物25：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十九酯
類似物26：4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸二十酯
實施例2 艾瑞莎類似物對於癌細胞之毒殺效果
首先，以本發明實施例1所合成之艾瑞莎類似物(簡稱類似物)處理RKO人類腸癌細胞株(以下簡稱RKO細胞株)、BFTC905人類膀胱癌細胞株(以下簡稱BFTC905細胞株)及之A549人類肺腺癌細胞株(以下簡稱A549細胞株)，以評估本發明所合成之艾瑞莎類似物的癌細胞毒殺作用。
將上述細胞株以1×104細胞/孔的密度接種於96-孔盤中培養16至20小時。接著，於RPMI-1640培養基中，以分別含有或不含有艾瑞莎或艾瑞莎類似物(包括本發明之類似物1至26)處理該細胞24小時。於藥物處理後，以磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，以下簡稱PBS)洗滌細胞，並以新鮮之完全培養基RPMI-1640培養2天。之後，更換培養基且將該細胞與0.5mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，以下簡稱MTT)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)於完全培養基中培養4小時。存活的細胞將MTT轉化為甲簪(formazan)，其溶解於二甲基亞碸(以下簡稱DMSO)時產生藍紫色。使用讀盤儀(plate reader)(VERSAmax,Molecular Dynamics Sunnyvale,CA)於565nm下測定甲簪強度。細胞 存活率之相對百分比係藉由將各實驗中該經處理細胞之吸收值除以控制組之吸收值而得出。
如第1圖(A)及(B)所示，在細胞存活率的結果中顯示類似物1較艾瑞莎對於RKO細胞株及BFTC905細胞株具有顯著的毒殺效果；然而，相較於艾瑞莎及類似物1，類似物2對於RKO細胞株則無毒殺效果，而對於BFTC905細胞株則僅有小量毒殺作用。因此，由上述之結果確認類似物之哌嗪基之末端應該連接酯基，以下以類似物1之結構為基礎進一步設計合成類似物3至7及26至44。
如表3所示，類似物3至7的細胞存活率分析結果顯示，增加類似物1中二個羧酸基間的碳鏈後(類似物3至7分別為增加1至5個碳鏈)，相較於艾瑞莎，對於A549細胞株並不具有顯著的毒殺效果。
如表3所示，類似物8至26的細胞存活率分析結果顯示，增加類似物1之哌嗪基之末端碳鏈後(類似物8至26分別為增加1至19個碳鏈)，相較於艾瑞莎，對於A549細胞株具有相似或顯著的毒殺效果；其中又以類似物18之毒殺效果最佳，當以濃度為40μM之類似物18處理A549細胞株時，其毒殺效果增加15至20倍。因此確認艾瑞莎類似物18，4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸十二酯，為一種新穎的抗肺癌化合物，以下稱為類似物18，下述實施例並針對類似物18的抑制癌細胞機制做進一步之測試。
實施例3 類似物18對於不同肺癌細胞株均具有毒殺效果
將A549人類肺腺癌細胞株(以下稱為A549細胞株)、H1299人類非小細胞肺癌細胞株(以下稱為H1299細胞株)、CL3人類肺癌細胞株(以下稱為CL3細胞株)及HFL1人類肺纖維母細胞株HFL1(做為控制組)以1×104細胞/孔的密度接種於96-孔盤維持16至20小時。接著分別以0至40μM之類似物18或艾瑞莎在37℃下於RPMI-1640培養基處理細胞24小時。於藥物處理後，以PBS洗滌細胞，並以完全培養基RPMI-1640培養2天。之後，更換培養基且將細胞與0.5mg/mL的MTT(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)於完全培養基中培養4小時。使用讀盤儀(VERSAmax,Molecular Dynamics Sunnyvale,CA)於565nm下測定甲簪強度。細胞存活率之相對百分比係藉由將各實驗中該經處理者之吸收值除以控制組之吸收值而得出。
如第2圖(A)、(B)及(C)所示，其結果顯示類似物18較艾瑞莎對於降低A549、H1299及CL3細胞株的存活率上效果更佳。然而，根據第2圖(D)所示，類似物18對於HFL1 人類正常肺纖維母細胞株的存活率效果與艾瑞莎相似。在類似物18之濃度為40μM時，其對於三種肺癌細胞株(包括A549、H1299及CL3)的毒殺效果大於99%，而對於正常肺組織細胞的存活率，類似物18及艾瑞莎均維持大於30%的細胞存活率。此結果表示，類似物18對肺癌細胞之毒殺效果較佳，對於正常肺組織細胞不會造成嚴重的毒殺效果。
實施例4 類似物18可抑制肺癌細胞中EGFR蛋白激酶的活性
本發明測試類似物18是否係藉由抑制肺癌細胞的上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，以下簡稱EGFR)蛋白激酶(protein kinase)活性而造成其細胞存活率降低。
1.步驟1：檢驗不同人類肺癌細胞中EGFR的表現情形：
分別將A549細胞株、H1299細胞株、CL3細胞株及A431人類表皮樣癌(以下稱為A431細胞株，其過分表現EGFR者，做為正控制組)以pH 7.6的冰冷卻細胞萃取緩衝液(含有0.5mM DTT、0.2mM EDTA、20mM HEPES、2.5mM MgCl2、75mM NaCl、0.1mM Na3VO4、50mM NaF及0.1% Triton X-100)將細胞裂解，將蛋白酶抑制劑(含有1μg/ml抑肽酶(aprotinin)、0.5μg/ml亮肽素(leupeptin)及100μg/ml 4-(2-胺基乙基)苯磺醯氟(4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride))添加於該細胞懸浮液中，於4℃下震盪30分鐘後，再以10,000rpm離心10分鐘。藉由BCA 蛋白質試驗套組(Pierce,Rockford,IL)測定蛋白質濃度。製備該總細胞蛋白質萃取物，於8至12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide，以下簡稱SDS)膠體上分離，且將蛋白質電泳轉移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride)膜上，於4℃下，使用封閉緩衝液(其係將5%脫脂奶粉溶於含有50mM Tris/HCl(pH 8.0),2mM CaCl2,80mM氯化鈉，0.05% Tween 20及0.02%疊氮化鈉的溶液中)封閉該聚偏氟乙烯膜過夜，然後，以初級抗體(primary antibody)及隨後之辣根過氧化物酶共軛(horseradish peroxidase-conjugated)之二級抗體依序雜交該膜，使用增強化學發光檢測系統(enhanced chemiluminescence detection system，PerkinElmer Life and Analytical Sciences,Boston,MA)於X光膠片上觀察到該蛋白質條帶，使用特定抗體進行EGFR及磷酸化(tyr 1068)EGFR之西方墨點法分析，為了確認蛋白質的均等充填及轉移，將肌動蛋白(actin)作為蛋白質充填控制組。最後利用膠體數位化軟體Un-Scan-It gel(V5.1,Silk Scientific,Inc.,Orem,UT)分析X光膠片上的蛋白質條帶強度。
如第3圖所示，A549細胞株、H1299細胞株及CL3細胞株均會表現EGFR及磷酸化(Tyr 1068)EGFR，其表示各肺癌細胞株中均具有活化態之EGFR蛋白激酶。
2.步驟2：測試類似物18抑制EGFR蛋白激酶之活性：
利用ADP-GloTM蛋白激酶試驗(ADP-GloTM Kinase Assay)及EGFR蛋白激酶酵素系統(EGFR Kinase Enyzme System； Promega,Madison,WI)，依照使用者手冊進行操作。該蛋白激酶反應係在pH 7.5之反應緩衝液A、2mM MnCl2及2mM DTT中進行。步驟簡述如下：(1).在50μM之ATP/ADP範圍中，製備ATP轉換至ADP的標準曲線，如第4圖(A)所示，其與ADP的含量呈正相關；(2).將下述反應組成物加入96-孔盤中：5納克(ng)活化態EGFR、0.25μg/μl的(Glu4，Tyr1)多肽物基質、反應緩衝液A(含有40mM的Tris-HCl(pH7.5)，20mM的MgCl2及0.1mg/mL的BSA)以及濃度為20至100納莫耳(nM)的類似物18或艾瑞莎；(3).在30℃下加入50μM的ATP反應15分鐘，以啟動EGFR蛋白激酶反應；(4).在室溫下加入ADP-GloTM試劑反應40分鐘，以中止EGFR蛋白激酶反應並移除剩餘的ATP；(5).在室溫下加入蛋白激酶偵測試劑(Kinase Detection Reagent)作用30分鐘，以進行ADP至ATP的轉換作用；(6).以IVIS系統(Xenogen IVIS Spectrum,Caliper Life Sciences)及光度計(Modulus Single Tube,Turner Biosystems,Inc.,Sunnyvale,CA)觀察及分析ADP轉換至ATP時所發出之螢光；使用上述標準曲線測定在該多肽物基質有無中所產生之ADP含量，蛋白激酶特定活性之計算係依照下列公式： (ADP-空白組之ADP)(nmol)/反應時間(分鐘)×蛋白激酶之重量(mg)。
如第4圖(B)、(C)及(D)所示，其結果顯示以20至100nM之類似物18或艾瑞莎處理後，其螢光強度均下降，且經計算後的EGFR蛋白激酶特定活性(以nmol/分鐘/mg表示者)及EGFR蛋白激酶活性(以%表示者，以0nM之類似物18或艾瑞莎處理時之蛋白激酶特定活性作為100%)均呈現依藥物處理濃度之上升而呈下降的趨勢。另外，以IVIS系統量測類似物18或艾瑞莎的IC50分別為130.1nM及56.3nM；以光度計量測類似物18或艾瑞莎的IC50分別為125.9nM及55.4nM。
(3).測試類似物18抑制EGFR蛋白激酶之專一性
以KinaseProfilerTM服務試驗(Merck Millipore,Billerica,MA)進行類似物18對蛋白激酶專一性之測試，蛋白激酶活性剩餘值(kinase activity remaining values，簡稱KAR值)之數值係與該蛋白激酶之活性呈負相關，KAR值為50時表示抑制50%蛋白激酶活性時之濃度為10μM。
如表4所示，表4類似物18及艾瑞莎均為EGFR蛋白激酶之潛在抑制劑。
實施例5 類似物18引發肺癌細胞進行細胞凋亡的效果較艾瑞莎更佳
本實施例測試類似物18是否係藉由引發肺癌細胞的細胞凋亡而造成細胞存活率降低，且類似物18較艾瑞莎對於引起肺癌細胞凋亡是否具有較佳的效果。
藉由膜聯蛋白V-碘化丙啶(Annexin-propidium iodise(以下簡稱PI))分析來測定經類似物18或艾瑞莎所引發之細胞凋亡含量，根據製造商之手冊，Annexin V-PI染色套組(BioVision,Mountain View,CA)係用於檢測藉由與螢光素異氰酸酯(fluorescein isocyanate，簡稱FITC)共軛之Annexin V及PI培養之細胞。該細胞顯示Annexin V+/PI-及Annexin V+/PI+者，係分別表示在細胞凋亡之早期及晚期。將A549細胞株以7×105細胞密度培養於60mm培養皿中16至20小時。分別以0至40μM之類似物18或艾瑞莎處理4小時後，以PBS洗滌該細胞。該細胞係經胰蛋白酶消化且於1500rpm離心5分鐘收集。此後，於室溫及避光下， 以500μl之Annexin V-PI標記溶液(含有5μl之Annexin V-FITC及5μl之PI於PBS中)培養該細胞5分鐘。為了避免細胞凝集，將該細胞溶液經尼龍篩網膜(Becton-Dickinson,San Jose,CA)過濾。最後，藉由流式細胞儀(FACS Calibur,BD Biosciences,Heidelberg,Germany)立即分析該樣品，藉由CellQuest軟體(BD Biosciences)自最小10,000個細胞定量Annexin V-PI染色細胞之百分比。
如第5圖(A)所示，在以10至40μM之類似物18或艾瑞莎處理後，A549細胞株之Annexin V+/PI-及V+/PI+細胞數量均增加，表示正在進行細胞凋亡的細胞數增加；且如第6圖(A)、(B)及(C)所示，類似物18引發67.9%的細胞凋亡，而艾瑞莎僅引發19.6%的細胞凋亡。此結果表示，類似物18是藉由更有效率地引發肺癌細胞的細胞凋亡而造成其細胞存活率降低。
實施例6 類似物18抑制癌症細胞生長並增加肺癌細胞的次-G1期
本發明測試類似物18是否係藉由引發肺癌細胞進行細胞凋亡而抑制該細胞之生長，並進一步探討類似物18對於肺癌細胞之細胞周期的影響。
(1).步驟1：測試類似物18對肺癌細胞生長的抑制：將A549細胞株以1×106細胞密度接種於含有完全培養基之60mm培養皿中維持18小時，再以30μM之類似物18或艾瑞莎處理24小時。藥物處理完後，以PBS洗滌該 細胞，並置換新鮮的RPMI-1640完全培養基且培養2天至6天，最後以血球計(hemocytometer)計算細胞數。
如第7圖所示，類似物18及艾瑞莎均有抑制A549細胞株生長的功效，且類似物18之效果較艾瑞莎更為顯著。
(2).步驟2：測試類似物18對肺癌細胞之細胞週期之影響：將A549細胞株以7×105細胞密度接種於含有完全培養基之60mm培養皿中培養16至20小時，再分別以0至40μM之類似物18或艾瑞莎在37℃下處理24小時。藥物處理完後，將收集細胞並以70%冰冷卻乙醇在-20℃下固定過夜。接著，以1500rpm離心5分鐘後，將沉澱物在37℃下以4μg/mL之PI溶液(含有1% Triton X-100及50μg/mL之RNase)避光處理30分鐘。為了避免細胞凝集，將該細胞溶液經尼龍篩網膜(Becton-Dickinson,San Jose,CA)過濾。最後，藉由流式細胞儀分析該樣品，並藉由ModFit LT軟體(Ver.2.0,Becton-Dickinson)自10,000個細胞分析其位於不同細胞週期之百分比。
如第8圖(A)及(B)以及第9圖(A)至(D)所示，類似物18並未顯著改變A549細胞株的G1、S及G2/M期的部分，但卻顯著地增加A549細胞株的次-G1期部分(sub-G1)，且在以40μM之類似物18處理後，A549細胞株之次-G1部分被提升至66.7%；然而以40μM之艾瑞莎處理者，僅造成A549細胞株之G1部分從60.5%提升至76.1%。此結果表示，類似物18並未改變A549肺腺癌細胞株的細胞週 期，次-G1期部分增加係表示正在進行細胞凋亡的細胞數增加，亦即類似物18會促使A549細胞株進行細胞凋亡而抑制其生長，且效果較艾瑞莎顯著。
實施例7 類似物18促進肺癌細胞中凋亡蛋白酶3之活化及PARP的切割
本發明進一步測試類似物18可藉由活化肺癌細胞中之凋亡蛋白酶3(caspase 3)及促進多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase，簡稱PARP)之切割，而造成其細胞凋亡。
將A549細胞株以1×106細胞密度接種於60mm含有完全培養基之培養皿培養16至20小時。接著分別以0至40μM之類似物18或艾瑞莎在37℃下處理細胞24小時。於藥物處理後，以實施例4所提供之方法進行蛋白質萃取並使用特定抗體進行西方墨點法分析，為了確認蛋白質的均等充填及轉移，將肌動蛋白用於作為蛋白質充填控制組。
如第10圖(A)所示，以10至40μM之類似物18處理可顯著地引發A549細胞株之凋亡蛋白酶3轉化成活化態，此外，類似物18並引發PARP蛋白之切割態；然而，艾瑞莎並未造成凋亡蛋白酶3及PARP的顯著改變。如第10圖(B)及(C)所示，類似物18可顯著地增加活化態凋亡蛋白酶3並促使PARP蛋白質之切割，而造成A549細胞株凋亡，相較於在A549細胞株中以艾瑞莎處理者，並無顯著改變活化態凋亡蛋白酶3及PARP蛋白質之切割。
實施例8 類似物18抑制肺癌細胞中生存素的蛋白質及基因表現
本發明測試類似物18藉由抑制肺癌細胞中之生存素的基因及蛋白質表現而引發細胞凋亡。
將A549細胞株以1×106細胞密度接種於60mm含有完全培養基之培養皿培養16至20小時。接著分別以0至40μM之類似物18或艾瑞莎在37℃下處理細胞24小時。於藥物處理後，以實施例4所提供之方法進行蛋白質萃取並使用特定抗體進行西方墨點法分析，為了確認蛋白質的均等充填及轉移，將肌動蛋白作為蛋白質充填控制組。
另外，將A549細胞株以2×106細胞密度接種於60mm含有完全培養基之培養皿培養16至20小時。接著分別以0至40μM之類似物18或艾瑞莎處理細胞24小時。於藥物處理後，利用ZR RNA MiniPrepTM(Zymo Research,Irvine,CA)，依照使用者手冊，將細胞之RNA純化，並以分光光度計(spectrophotometry)測量RNA之濃度。接著，藉由含oligo(dT)12-18引子(Invitrogen)之SuperScriptTM III反轉錄酶合成cDNA，以GAPDH作為內控制品而擴增各反轉錄樣品，DNA熱循環機(Mastercycler gradient,Hamburg,Germany)進行反轉錄聚合酶連鎖反應RT-PCR係使用DNA熱循環機(Mastercycler gradient,Hamburg,Germany)進行，該反應試劑如表5所示，其所使用之引子對如表6所示，其反應條件如下：以94℃反應2分鐘進行初期變性，隨後在94℃反 應30秒、56℃反應30秒、72℃反應40秒，進行共30個循環，最後以72℃反應5分鐘以進行擴增。之後，將RT-PCR產物以1.2%瓊脂糖凝膠(agarose gel)電泳分離，並進行溴化乙錠染色後，以UV透照法(transillumination)觀察，最後以DH27-S3相機(Medclub,Taoyuan,Taiwan)拍照保存。
為了更進一步確認類似物18抑制生存素而造成細胞凋亡的影響，依照使用者手冊，使用LipofectamineTM 2000(Invitrogen)將pCT-GFP2及pCT-GFP-sur8用於轉染，該pCT-GFP-sur8構築載體(會過度表現生存素)，並以pCT-GFP2做為控制組(僅過度表現綠色螢光蛋白(green fluorescent protein，簡稱GFP))。將A549細胞株以2×106細胞密度接種於60mm培養皿培養16至20小時。接著，以20μg的pCT-GFP-sur8或pCT-GFP2做為控制組或生存素表現載體在無血清的培養基中，並置於37℃的CO2培養基中進行細胞轉染(transfection)8小時。之後，再加入等量含有20% FBS之培養基作用24小時。於轉染後，分別依照實施例2及實施例4之方法進行細胞存活率測試及西方墨點法分析。
如第11圖(A)至(D)所示，以類似物18處理A549細胞株，其生存素之基因表現明顯地被抑制，且係依類似物18處理濃度之增加而呈下降之趨勢，而艾瑞莎並未顯著地改變生存素之基因表現；此外，類似物18及艾瑞莎均顯著抑制生存素之蛋白質表現。此結果表示，類似物18可顯著地抑制生存素之基因表現，並造成A549細胞凋亡，且效果較艾瑞莎更佳。
如第12圖(A)所示，經pCT-GFP-sur8載體轉染的A549細胞確實可利用針對GFP及生存素之特定抗體偵測到生存素-GFP融合蛋白質(43.5kDa)，而控制組(pCT-GFP2載體)則僅表現GFP(27kDa)，另外，A549細胞本身含有的生存素係16.5kDa。如第12圖(B)所示，利用pCT-GFP-sur8載體在A549細胞中過度表現生存素會增加該細胞之存活率，且轉染pCT-GFP-sur8載體可抑制類似物18所引發的細胞凋亡，且其效率較轉染pCT-GFP2者更佳。此結果表示，類似物18確實係藉由抑制生存素而引發肺癌細胞進行細胞凋亡。
實施例9 類似物18抑制肺癌腫瘤的形成
本發明測試類似物18在體內實驗可抑制小鼠中異體移植人類肺癌細胞的腫瘤的擴大。自BioLASCO(BioLASCO.,Ltd.,Taipei,Taiwan)獲得BALB/cAnN.Cg-Foxnlnu/CrlNarl小鼠(三週齡大之公鼠)，先進行2週的環境適應後，將2×106之A549細胞以皮下注射注入各小鼠之腹腔中。堅實之A549側腹腫瘤於10天後形成，然後藉由每間隔4天以皮下注射100μl玉米油(控制組小鼠)或30mg/kg之類似物18(實驗組小鼠)三次。利用數字卡尺(digital caliper)，每4天測量該腫瘤大小，並以下列公式計算之：(長度)×(寬度)2×0.5。將小鼠犧牲後取出腫瘤，將該腫瘤均質化後且將總裂解物依照實施例4之方法進行西方墨點法分析。
如第13圖(A)及(B)所示，經注射類似物18之裸鼠之腫瘤大小顯著地較控制組為小，詳言之，開始每4天注射玉米油至第16天的裸鼠之腫瘤平均大小為406.52mm3，而注射類似物18的裸鼠之腫瘤平均大小為118.19mm3。此外，依第13圖(C)所示，經注射類似物18之小鼠，其腫瘤中之生存素的蛋白表現量較控制組減少約一半。此結果表示，類似物18可藉由抑制生存素之表現而在異體移植人類肺癌細胞的小鼠中抑制腫瘤的擴大。

Claims (10)

  1. 一種式(I)化合物或其鹽， 其中，m為2至7之整數，以及R係獨立選自由氫及C1-C20烷基所組成群組之至少一者。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物或其鹽，其中，m為2以及R係C1-C13烷基。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之化合物或其鹽，係用以促進癌細胞的細胞凋亡，以抑制癌細胞的生長。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之化合物或其鹽，該癌細胞係選自由肺癌細胞、直腸癌細胞及膀胱癌細胞所組成群組之至少一者。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之化合物或其鹽，係用以抑制表皮生長因子蛋白激酶之活性。
  6. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項所述之化合物或其鹽及醫藥上可接受之載劑。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之醫藥組成物，係用以促進癌細胞的細胞凋亡，以抑制癌細胞的生長。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之醫藥組成物，其中，該癌細胞係選自由肺癌細胞、直腸癌細胞及膀胱癌細胞所組成群組之至少一者。
  9. 一種包含如申請專利範圍第6項所述之醫藥組成物的用途，其係用於製造治療癌症之藥物。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中，該癌症係選自由肺癌、直腸癌及膀胱癌所組成群組之至少一者。
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