KR101501576B1 - Ｈｉｆ-1 활성을 저해하는 아릴옥시페녹시아세틸계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 - Google Patents

Ｈｉｆ-1 활성을 저해하는 아릴옥시페녹시아세틸계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HIF-1 활성을 저해하는 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 비선택적인 세포독성에 의해 항암 활성을 나타내는 것이 아니라, 암세포의 성장 및 전이에 중요한 역할을 하는 전사인자인 HIF-1의 활성을 저해하여 항암 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 HIF-1 활성을 저해하여 대장암, 간암, 위암 및 유방암 등의 다양한 고형암 질환의 치료제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 저산소 상태에서 HIF-1에 의한 VEGFA의 발현이 증가되어 악화되는 당뇨병성 망막증이나 관절염 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

Description

ＨＩＦ-1 활성을 저해하는 아릴옥시페녹시아세틸계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물{Aryloxyphenoxyacetyl-based compound having HIF-1 inhibition activity, preparation method thereof and pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient}
본 발명은 HIF-1의 활성을 저해하는 아릴옥시페녹시아세틸계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 인류의 지난 수십 년간의 부단한 노력에도 불구하고 난치병 중의 하나로 여전히 남아 있다. 최근에 암세포생물학, 의약 화학 등의 제반 학문의 눈부신 발전과 더불어 글리벡(Gleevec)과 같은 새로운 작용 기전을 가진 항암제가 개발되고 있으며, 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project) 이후 새로운 표적분자들이 대두되고 있다.
HIF-1(Hypoxia Inducible Factor-1)는 저산소증(hypoxia)에서 유도되는 전사인자로서 산소 의존적으로 분해되는 HIF-1α 서브유니트(subunit)와 항시 발현되는 HIF-1β 서브유니트로 구성된 헤테로 다이머(dimer)로서[Cancer Metastasis Rev., 17, 187-195, 1998; Trends Mol. Med., 7, 345-350, 2001], 보통의 산소 농도 조건하에서 HIF-1α 단백질은 산소 의존적으로 402번 및 564번의 프롤린 잔기가 히드록시화되어 암 억제 유전자인 pVHL(Von Hippel-Lindau)단백질과 결합하여 유비퀴틴(ubiquitin)화되고 프로테아좀에 의해 분해되나, 저산소상태에서는 이러한 일련의 반응이 저해되어 HIF-1α 단백질이 축적되어 이미 존재하고 있는 HIF-1β 단백질과 결합하여 핵으로 이동하게 된다[Science 292, 468-472, 2001; Science 292, 468-472, 2001]. HIF-1α의 안정성은 산소분압 외에도 산소감지경로(oxygen sensing pathway)에 관여하는 인자들에 의해 영향을 받게 되며, 이러한 인자들로는 전이금속 이온(transition metal ion), 철 킬레이트제(iron chelator) 또는 항산화제(antioxidant) 등을 들 수 있다. 또한, HIF-1α 단백질은 산소 농도에 상관없이 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 헤레굴린(heregulin), 인슐린 유사 성장인자-I(insulin-like growth factors-I)과 인슐린 유사 성장인자-II 등과 같은 성장인자(growth factor)나 ErβB2 등과 같은 온코진(oncogene)의 활성화에 의해 축적되기도 한다. 이러한 성장인자들이 각자의 수용체에 결합하게 되면 PI3K-AKT, MAPK 신호전달경로가 활성화되고 HIF-1α 단백질의 합성이 증가되어 HIF-1α 단백질이 축적된다.
핵으로 이동한 HIF는 표적 유전자의 프로모터(promoter)상의 HRE(Hypoxia Responsive Element, 5'-ACGTG-3')에 결합하여 유전자의 발현을 유도하게 되는데 HIF에 의해 조절되는 유전자로는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)를 포함하여 현재까지 약 60종 이상이 알려져 있다(Nat . Rev. Cancer 2, 38-47, 2002; J. Biol . Chem . 278, 19575-19578, 2003; Nat , Med . 9, 677-684, 2003; Biochem . Pharmacol . 64, 993-998, 2002).
암, 특히 고형암에서의 저산소증은 일반적으로 나타나는 현상으로서, 고형암세포들은 다양한 유전적인 변화를 거쳐 이러한 저산소 조건에 적응되어 있어 암세포가 더욱 악성화되고 항암제에 대한 내성을 갖게 되는데, 실제로 저산소증은 인간의 모든 암종의 70%이상의 암을 악성화시키는 주요 유발인자로서 알려져 있다 (Nature 386, 403, 1997; Hockel M and Vaupel P, Semin. Oncol. 28, 36-41, 2001, Nature Med. 6, 1335, 2000; Bos et al. Cancer 2003, 97, 1573-1581). HIF-1은 이러한 저산소 상태에 대한 암세포의 적응을 조절하는 가장 중요한 분자로서 알려져 있고, HIF-1α 단백질의 양과 암 환자의 예후는 밀접한 상관 관계를 갖는 것으로 알려져 있다. 암세포가 저산소 조건에 의해 또는 상기에서 언급한 성장 인자의 자극이나 온코진(oncogene)의 활성화, 또는 pVHL과 같은 암 억제유전자의 불활성화에 의해 활성화된 HIF-1은 헥소키나아제 2(hexokinase 2), 글루코스 전달체 1(glucose transporter 1), 에리쓰로포이에틴(erythropoietin), IGF-2, 엔도글린(endoglin), VEGFA, MMP-2, uPAR, MDR1 등과 같은 유전자의 발현을 유도하여 세포사(apoptosis)에 대한 내성, 혈관신생능의 증가, 세포증식능의 증가, 침윤(invasion)능의 증가 등의 형질을 획득하게 되어 결국 암 세포는 악성화되게 된다. 따라서, 이와 같이 HIF는 암, 특히 고형암의 성장, 증식 및 악성화에 중요한 역할을 하기 때문에 이를 표적으로 하여 항암제를 개발하려는 연구가 매우 활발히 진행되고 있다(Cancer Res. 62, 4316, 2002; Nat Rev Drug Discovery 2, 1, 2003; Semenza et al. Nature Reviews Cancer 2003, 3, 721-732). 최근, 탁솔(taxol), 라파마이신(rafamycin) 및 17-AAG(17-allylaminogeldanamycin)와 같은 상당수의 기존에 알려진 항암제들이나, 구아닐레일 사이클라제 활성화제(guanylaly cyclase activator)인 저분자 화합물YC-1(3-(5'-히드록시메틸-2'-퓨릴)-1-벤질인다졸, 3-(5'-hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazole)이 HIF-1 저해제로서 이들은 여러 단계의 임상실험 중에 있으며[Johnson et al Nature Reviews Drug Discovery 2003, 2, 1-9; Semenza et al. Nature Reviews Cancer 2003, 3, 721-732; JNCI 95, 516, 2003], HRE를 활용한 세포 단계에서의 리포터 분석(cell based reporter assay)을 통한 새로운 구조의 HIF-1 저해제 개발도 활발하게 진행되고 있으나(Cancer Res 65, 4918, 2005; Cancer Cell 6, 33, 2004; Cancer Res. 62, 4316, 2002), 아직 초기 단계이다.
한편, HIF-1은 암 뿐만 아니라 혈관 신생작용의 활성화가 질환의 악화와 관련되는 질환의 치료제 개발의 표적으로 활용될 수 있다. 저산소 상태에서 활성화되는 HIF-1에 의해 유래되는 VEGFA와 같은 혈관 신생 인자들은 암은 물론 당뇨병성 망막증과 관절염의 진전과 관련되어 있다. 따라서, 질환 조직의 저산소 상태로부터 활성화되는 HIF-1을 저해하는 화합물은 당뇨병성 망막증이나 류마티스성 관절염과 같은 질환의 새로운 치료제로 활용될 수 있을 것이다(Eiji Ikeda, Pathology International, 2005, Vol 55, 603-610). 그러나 이 분야 역시 아직은 초기 단계이다.
이에 본 발명자들은 HIF-1 활성을 저해하는 화합물을 연구하던 중, HIF-1의 활성 억제, 암 전이 억제 및 신생혈관 형성 저해 효과가 현저히 우수할 뿐만 아니라 인체 내에서 안정성이 향상된 화합물을 합성하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 HIF-1 활성을 저해하는 신규 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 망막증 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 3-[2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)-아세틸아미노]-4-히드록시-벤조산 이소프로필 에스테르 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112010067902515-pat00001
.
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
화학식 2의 화합물을 에스테르화 반응을 수행하여 화학식 3의 화합물을 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 제조된 화학식 3의 화합물을 벤질브로마이드와 함께 알킬화(alkylation) 반응을 수행하여 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 제조된 화학식 4의 화합물을 가수분해시켜 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계(단계 3);
상기 단계 3에서 제조된 화학식 5의 화합물을 후니그(Hunig) 염기 존재하에 알킬 할라이드와 반응시켜 화학식 6의 화합물을 제조하는 단계(단계 4);
상기 단계 4에서 제조된 화학식 6의 화합물을 촉매 및 수소기체 하에서 환원시켜 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계(단계 5); 및
상기 단계 5에서 제조된 화학식 7의 화합물을 화학식 8의 화합물과 후니그 염기 존재하에 에스테르화 반응을 수행하여 최종 생성물(1)을 제조하는 단계(단계 6)를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 1]
.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 망막증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은, 비선택적인 세포독성에 의해 항암 활성을 나타내는 것이 아니라, HIF-1의 활성을 저해함으로써 HRE 전사활성화를 억제하고, VEGFA, EPO, NADH 및 CA Ⅸ의 발현을 선택적으로 억제하여 암의 성장 및 전이 등을 억제하므로, 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, VEGFA의 발현이 증가되어 악화되는 당뇨병성 망막증이나 관절염 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 화합물이 HRE 전사 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 화합물이 HIF-1α 축적을 저해하는 정도를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 화합물이 VEGFA 및 EPO의 발현에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 화합물이 LDHA의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 화합물이 CA Ⅸ의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 화합물에 의해 HIF-1α의 발현이 감소하는 것을 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 7은 본 발명의 화합물을 정맥투여하고 기존 항암제를 경구투여할 경우 종양 크기 변화를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 화합물 및 기존 항암제를 병용하여 경구투여할 경우 종양 크기 변화를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 화합물이 관 형성(tube formation)에 미치는 영향을 측정한 광학현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 화합물이 신생혈관 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 화합물이 신생혈관 생성에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 12는 본 발명의 화합물 처리에 따른 폐의 암 전이 군집 수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 화합물 처리에 따른 폐의 암 전이 군집을 찍은 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3-[2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)-아세틸아미노]-4-히드록시-벤조산 이소프로필 에스테르 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 구체적으로는, 상기 화합물은 종양세포의 성장 및 전이를 억제함으로써 강한 항암 활성을 나타내고 부작용을 최소화한다. 또한, 상기 화합물은 HIF-1 활성의 저해를 통하여 당뇨병성 망막증이나 관절염을 치료한다.
Figure 112010067902515-pat00003
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 분자량 463.6, 녹는점 203.4~204.5 ℃인 화합물로서 다음과 같은 1H-NMR 스펙트럼 값을 나타내는 신규한 화합물이다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 9.72 (1H, s, OH), 8.62 (1H, s, NH), 7.82-7.86 (1H, m, aromatic-H), 7.73 (1H, m, aromatic-H), 7.36 (2H, d, J = 9.0 Hz, aromatic-H), 7.05 (1H, d, J = 8.1 Hz, aromatic-H), 6.96 (2H, d, J = 8.7 Hz, aromatic-H), 5.23 (1H, m, CH), 4.68 (2H, s, CH2), 2.10 (3H, m, adamantly-H), 1.90 (6H, m, adamantly-H), 1.77 (6H, m, adamantly-H), 1.37 (3H, s, CH3), 1.35 (3H, s, CH3)
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
화학식 2의 화합물을 에스테르화 반응을 수행하여 화학식 3의 화합물을 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 제조된 화학식 3의 화합물을 벤질브로마이드와 함께 알킬화(alkylation) 반응을 수행하여 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 제조된 화학식 4의 화합물을 가수분해시켜 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계(단계 3);
상기 단계 3에서 제조된 화학식 5의 화합물을 후니그(Hunig) 염기 존재하에 알킬 할라이드와 반응시켜 화학식 6의 화합물을 제조하는 단계(단계 4);
상기 단계 4에서 제조된 화학식 6의 화합물을 촉매 및 수소기체 하에서 환원시켜 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계(단계 5); 및
상기 단계 5에서 제조된 화학식 7의 화합물을 화학식 8의 화합물과 후니그 염기 존재하에 에스테르화 반응을 수행하여 최종 생성물(1)을 제조하는 단계(단계 6)를 포함하는 상기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure 112010067902515-pat00004

이하, 본 발명을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 화학식 2의 화합물을 출발 물질로 하여 클로라이드 제조 시약을 사용해 클로라이드 중간체 화합물을 거쳐 화학식 3의 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 화학식 2의 4-히드록시-3-니트로-벤조산을 메탄올 등과 같은 유기용매에 녹인 후, -10~10 ℃에서 옥살릴 클로라이드(oxalyl chloride), 티오닐 클로라이드(thionyl chloride) 등과 같은 클로라이드 제조 시약을 첨가하여 클로라이드 중간체 화합물을 거쳐 화학식 3의 4-히드록시-3-니트로-벤조산 메틸 에스테르를 제조한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 화학식 3의 화합물을 염기 조건하에서 알킬화 반응을 수행하여 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 화학식 3의 4-히드록시-3-니트로-벤조산 메틸 에스테르와 벤질브로마이드(BnBr)를 DMF 등과 같은 유기용매에 녹인 후, 탄산칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등과 같은 무기염기를 첨가하여 염기 조건으로 만들고 알킬화 반응을 수행하여 화학식 4의 4-벤질옥시-3-니트로-벤조산 메틸 에스테르를 제조한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 화학식 4의 화합물을 가수분해의 과정을 거쳐 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 화학식 4의 4-벤질옥시-3-니트로-벤조산 메틸 에스테르를 THF 등과 같은 유기용매와 물을 혼합한 용매에 녹인 후, 리튬 하이드록사이드 모노하이드레이트(lithium hydroxide monohydrate)를 첨가하고 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등과 같은 무기염기 또는 염산, 황산 등과 같은 무기산으로 처리하여 가수분해시켜 화학식 5의 4-벤질옥시-3-니트로-벤조산을 제조한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 4는 화학식 5의 화합물을 후니그 염기 및 알킬 할라이드와 함께 용매에서 반응시켜 화학식 6의 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 화학식 5의 4-벤질옥시-3-니트로-벤조산을 (트리헥시)테트라데실-포스포늄 비스-트리플라미드((trihexy)tetradecyl-phosphonium bis-triflamide) 용매에 녹인 후, 2-브로모프로판과 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 트리에틸아민(TEA) 등과 같은 후니그 염기를 첨가하여 알킬화 반응을 수행함으로써 화학식 6의 4-벤질옥시-3-니트로-벤조산 이소프로필 에스테르를 제조한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 5는 화학식 6의 화합물을 촉매 및 수소기체 존재하에 환원시켜 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 4-벤질옥시-3-니트로-벤조산 이소프로필 에스테르(화학식 6의 화합물)를 메탄올, 에탄올 등과 같은 유기용매에 녹인 후 팔라듐 촉매와 수소기체를 첨가하여 환원시킴으로써 화학식 7의 3-아미노-4-히드록시-벤조산 이소프로필 에스테르를 제조한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 6은 화학식 7의 화합물을 화학식 8의 화합물과 함께 축합반응을 수행하여 화합물 1을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 화학식 7의 3-아미노-4-히드록시-벤조산 이소프로필 에스테르를 (4-아다만탄-1-일-페녹시)-아세트산(화학식 8의 화합물); DIPEA, TEA 등과 같은 후니그 염기; 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 염산염(1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC), 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBt), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate, PyBOP) 등과 같은 축합시약과 함께 DMF 등과 같은 유기용매에서 반응시켜 최종 생성물인 화학식 1의 3-[2-(4-아다만탄-1-일-페녹시)-아세틸아미노]-4-히드록시-벤조산 이소프로필 에스테르를 제조한다.
상기와 같이 본 발명에 따라 제조된 신규 아릴옥시페녹시아세틸계 화합물은 제조 후, 고속 액체크로마토그래피로 분리 정제한 후 핵자기 공명에 의해 분자구조를 확인할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 비선택적인 세포독성에 의해 항암 활성을 나타내는 것이 아니라, 암세포의 성장 및 전이에 중요한 역할을 수행하는 전사인자인 HIF-1의 활성을 저해하여 항암 활성을 나타낸다.
상기 HIF-1 활성 저해는 HRE(Hypoxia Responsive Element, 5'-ACGTG-3') 전사 활성 저해, HIF-1α 단백질 축적 저해 또는 HIF-1 표적 유전자 단백질의 발현을 저해하는 일련의 현상을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은, 저산소 조건에서 HIF-1의 HRE 전사활성화에 본 발명의 화학식 1의 화합물이 미치는 영향을 측정한 결과, 본 발명의 화학식 1의 화합물과 유사한 구조를 갖는 종래의 화합물(비교예 1)보다 HIF-1 활성 저해효과가 현저히 향상되었다(도 1 참조). 따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 저산소 조건에서 HIF-1의 HRE 전사 활성을 저해하므로 암의 악성화와 관련된 유전자들의 발현을 저해하여 암의 성장 및 전이를 억제할 수 있기 때문에 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은, 저산소 조건에서 토포이소머라제-1(TOPO-1)의 생성에는 영향을 주지 않으면서, HIF-1α 단백질의 생성을 농도 의존적으로 저해하는 것으로 나타났다(도 2 참조). 따라서, 본 발명의 화합물은 비선택적인 세포 독성에 의해 항암 활성을 나타내는 것이 아니라, HIF-1α 단백질의 축적을 선택적으로 저해하여 암의 성장 및 전이를 억제할 수 있으므로, 항암 활성을 나타내면서 부작용을 최소화할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은, HIF-1의 표적 유전자들 중 암의 증식과 전이에 기여하는 것으로 알려져 있는, 암의 성장 및 암이 다른 조직으로 전이하는데 있어서 중요한 혈관 신생 인자인 VEGFA(Vascular endothelial growth factor A), 적혈구의 생성을 촉진시키는 EPO(erythropoietin), 당 신생 및 글루코오스의 암세포 내 투입량을 증가시키는 인자인 LDHA(lactate dehydrogenase A) 및 이산화탄소를 탄산으로 전환하여 암세포의 산성화를 유도하는 인자인 CA IX(carbonic anhydrase 9)의 발현을 농도 의존적으로 저해하는 것으로 나타났다(도 3, 도 4 및 도 5 참조). 따라서, 본 발명의 화합물은 암의 증식과 전이에 기여하는 HIF-1의 표적 유전자인 VEGFA, EPO, LDHA 및 CA IX의 발현 저해 작용이 있으므로 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 HIF-1의 활성을 효과적으로 저해하므로 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양 등의 다양한 암의 치료제로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 HIF-1 활성의 저해를 통하여 당뇨병성 망막증이나 관절염의 치료 효과를 나타내는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 HIF-1 활성 저해는 HRE 전사 활성 저해, HIF-1α 단백질 축적 저해 또는 HIF-1 표적 유전자 단백질의 발현을 저해하는 일련의 현상을 모두 포함한다.
HIF-1은 혈관 신생작용의 활성화가 질환의 악화와 관련되는 질환의 치료제 개발에 표적으로 이용될 수 있다. 특히, 저산소 상태에서 활성화되는 HIF-1에 의해 유발되는 VEGFA와 같은 혈관 신생 인자들은 당뇨병성 망막증 또는 류마티스성 관절염과 같은 관절염의 진전과 관련되어 있다. 당뇨병성 망막증 또는 관절염은 저산소 상태에서 HIF-1에 의해 VEGFA의 발현이 증가되어 악화될 수 있다. 따라서, 질환 조직의 저산소 상태로부터 활성화되는 HIF-1을 저해하는 화합물은 당뇨병성 망막증 또는 관절염의 치료제로 활용되는 것이다(Eiji Ikeda, Pathology International, 2005, Vol 55, 603-610).
상기에서 언급한 바와 같이 본 발명의 화학식 1의 화합물은 저산소 조건에서 대조 유전자인 GAPDH의 발현에는 전혀 영향을 주지 않으면서, 혈관 신생 인자인 VEGFA(Vascular endothelial growth factor A)의 발현을 선택적으로 저해할 수 있으므로, 저산소 상태에서 HIF-1에 의한 VEGFA의 발현이 증가되어 악화되는 당뇨병성 망막증 또는 관절염 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경구 또는 비경구투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구투여할 수 있으며, 비경구투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다. 유효성분으로서 화학식 1의 화합물은 사람을 포함하는 포유동물에 대해서 하루 0.1 내지 500mg/kg(체중), 바람직하게는 0.5 내지 100mg/kg(체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구 경로를 통해 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 3-[2-(4- 아다만탄 -1-일- 페녹시 )- 아세틸아미노 ]-4-히드록시-벤조산 이소프로필 에스테르 (3-[2-(4- Adamantan -1- yl - phenoxy )- acetylamino ]-4- hydroxy -benzoic acid isopropyl ester )의 제조
단계 1: 4-히드록시-3-니트로-벤조산 메틸 에스테르 (4- Hydroxy -3- nitro - benzoic acid methyl ester )의 제조
Figure 112010067902515-pat00005
4-히드록시-3-니트로-벤조산(1.0 g, 5.46 mmol)을 메탄올(10 ml)에 녹인 후, 0 ℃에서 티오닐 클로라이드(SOCl2, 1.30 g, 0.8 ml, 10.92 mmol)를 천천히 첨가하고 4 시간 동안 환류시켜 반응용액을 제조하였다. 상기 반응용액을 농축하고, 에틸아세테이트(EtOAc)와 염화나트륨 수용액으로 분리하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고 농축하여 목적 화합물(992.3 mg, 수득율: 92.2%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 10.89 (1H, s, OH), 8.82 (1H, d, J = 1.5 Hz, aromatic-H), 8.23 (1H, dd, J = 2.1 , 8.9 Hz, aromatic-H), 7.22 (1H, d, J = 8.7 Hz, aromatic-H), 3.95 (3H, s, OCH3)
단계 2: 4- 벤질옥시 -3-니트로-벤조산 메틸 에스테르 (4- Benzyloxy -3- nitro - benzoic acid methyl ester )의 제조
Figure 112010067902515-pat00006
4-히드록시-3-니트로-벤조산 메틸 에스테르(992 mg, 5.03 mmol)와 벤질브로마이드(BnBr, 1.033 g, 6.04 mmol)를 디메틸포름아미드(DMF, 8 ml)에 녹인 후, 탄산칼륨(K2CO3, 1.74 g, 12.6 mmol)을 추가하고 상온에서 하루 밤 동안 교반하여 반응용액을 제조하였다. 상기 반응용액을 에틸 아세테이트와 염화나트륨 수용액으로 분리하고 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조하여 농축하였다. 잔여 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-Hexane:EtOAc = 3:1)로 분리하여 목적 화합물(1.3 g, 수득율: 90.0%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 10.89 (1H, s, OH), 8.82 (1H, d, J = 1.5 Hz, aromatic-H), 8.23 (1H, dd, J = 2.1 , 8.9 Hz, aromatic-H), 7.22 (1H, d, J = 8.7 Hz, aromatic-H), 3.95 (3H, s, OCH3)
단계 3: 4- 벤질옥시 -3-니트로-벤조산 (4- Benzyloxy -3- nitro - benzoic acid )의 제조
Figure 112010067902515-pat00007
4-벤질옥시-3-니트로-벤조산 메틸 에스테르(5.41 g, 18.83 mmol)를 THF/H2O (3:1, 280 ml)에 녹인 다음, 리튬 하이드록사이드 모노하이드레이트(153 mg, 3.65 mmol)를 첨가한 후 하루 밤 동안 교반하여 반응용액을 제조하였다. 상기 반응용액을 10% HCl 수용액으로 처리하고, 에틸 아세테이트와 염화나트륨 수용액으로 분리한 후 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하여 목적 화합물(4.55 g, 수득율: 88.4%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 8.58 (1H, d, J = 2.4 Hz, aromatic-H), 8.23 (1H, dd, J = 2.4, 8.7 Hz, aromatic-H), 7.36-7.48 (5H, m, aromatic-H), 7.20 (1H, d, J = 9.0 Hz, aromatic-H), 5.34 (2H, s, CH2)
단계 4: 4- 벤질옥시 -3-니트로-벤조산 이소프로필 에스테르 (4- Benzyloxy -3- nitro -benzoic acid isopropyl ester )의 제조
Figure 112010067902515-pat00008
4-벤질옥시-3-니트로-벤조산(400.0 mg, 1.46 mmol)을 (트리헥시)테트라데실-포스포늄 비스-트리플라미드((trihexy)tetradecyl-phosphonium bis-triflamide) (2.0 ml)에 녹인 후, 2-브로모프로판(630.0 mg, 0.48 ml, 5.12 mmol)과 디이소프로필에틸아민(DIPEA, 661.8 mg, 0.89 ml, 5.12 mmol)을 첨가하여 반응용액을 제조하였다. 상기 반응용액을 40 ℃에서 12 시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트와 염화나트륨 수용액으로 분리한 후 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 농축하였다. 잔여 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-Hexane:EtOAc = 20:1)로 분리하여 목적 화합물(200.2 mg, 수득율: 43.5%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 8.49 (1H, m, aromatic-H), 8.17 (1H, d, J = 9.0 Hz, aromatic-H), 7.32-7.46 (5H, m, aromatic-H), 7.15 (1H, d, J = 8.7 Hz, aromatic-H), 5.30 (2H, s, CH2), 5.24 (1H, m, CH), 1.38 (3H, s, CH3), 1.36 (3H, s, CH3)
단계 5: 3-아미노-4-히드록시-벤조산 이소프로필 에스테르 (3- Amino -4- hydroxy -benzoic acid isopropyl ester )의 제조
Figure 112010067902515-pat00009
4-벤질옥시-3-니트로-벤조산 이소프로필 에스테르(370 mg)를 넣은 용기를 아르곤으로 치환하고 메탄올 25 ml 추가한 후, 반응 용액에 팔라듐-탄소 5 중량%를 천천히 첨가하였다. 계속하여 수소 기체 속 및 상온에서 하루 밤 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 셀라이트 베드(Celite bed)를 이용하여 팔라듐을 제거하였다. 여과용액을 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-Hexane:EtOAc = 3:1)로 분리하여 목적 화합물(211.7 mg, 수득율: 92.4%)을 노란색 고체로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7.43 (1H, s, aromatic-H), 7.38 (1H, d, J = 8.7 Hz, aromatic-H), 6.74 (1H, d, J = 8.1 Hz, aromatic-H), 5.19 (1H, m, CH), 1.34 (3H, s, CH3), 1.32 (3H, s, CH3)
단계 6: 3-[2-(4- 아다만탄 -1-일- 페녹시 )- 아세틸아미노 ]-4-히드록시-벤조산 이소프로필 에스테르 (3-[2-(4- Adamantan -1- yl - phenoxy )- acetylamino ]-4- hydroxy - benzoic acid isopropyl ester )의 제조
Figure 112010067902515-pat00010
DMF(14 ml)에 (4-아다만탄-1-일-페녹시)-아세트산(143.2 mg, 0.5 mmol), 3-아미노-4-히드록시-벤조산 이소프로필 에스테르(211.7 mg, 1.08 mmol), EDC(207.8 mg, 1.08 mmol), HOBt(146.5 mg, 1.08 mmol) 및 DIPEA(0.19 ml, 1.08 mmol)를 첨가하여 반응용액을 제조하였다. 상기 반응용액을 교반시킨 후 에틸 아세테이트와 10% HCl로 분리한 다음 유기층을 염화나트륨 수용액으로 세척하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (n-Hexane:EtOAc = 3:1)로 정제하여 최종 생성물인 화학식 1의 화합물(195.6 mg, 수득율:81.92%)을 흰색 고체로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 9.72 (1H, s, OH), 8.62 (1H, s, NH), 7.82-7.86 (1H, m, aromatic-H), 7.73 (1H, m, aromatic-H), 7.36 (2H, d, J = 9.0 Hz, aromatic-H), 7.05 (1H, d, J = 8.1 Hz, aromatic-H), 6.96 (2H, d, J = 8.7 Hz, aromatic-H), 5.23 (1H, m, CH), 4.68 (2H, s, CH2), 2.10 (3H, m, adamantly-H), 1.90 (6H, m, adamantly-H), 1.77 (6H, m, adamantly-H), 1.37 (3H, s, CH3), 1.35 (3H, s, CH3)
< 비교예 1> 3-[2-(4- 아다만탄 -1-일- 페녹시 )- 아세틸아미노 ]-4-히드록시-벤조산 메틸 에스테르 (3-[2-(4- Adamantan -1- yl - phenoxy )- acetylamino ]-4- hydroxy - benzoic acid methyl ester )의 제조
Figure 112010067902515-pat00011
4-아다만탄-1-일-페녹시 아세트산(143.2 mg, 0.5 mmol)을 THF 5 ml 및 옥살릴 클로라이드(oxalyl chloride, 178.5 mg, 0.11 ml, 1.5 mmol)에 용해시키고, DMF를 적가하였다. 한 시간 동안 상온에서 반응시킨 후에, 3-아미노-4-히드록시-벤조산 메틸 에스테르(125.4 mg, 0.75 mmol) 및 피리딘 0.05 ml를 첨가하고, 혼합물을 상온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 에틸 아세테이트와 염화나트륨 수용액으로 분리하고, 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고, 농축시켰다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(N-Hexane: EtOAc:MeOH=6:3:1)로 분리하여 목적 화합물(183.2 mg, 수득율:84.1%)을 흰색 고체로 얻었다.
1H-NMR (DMSO-d6, 300 Hz) 11.10(1H, s, OH), 9.24(1H, s, NH), 8.69(1H, m, aromatic-H), 7.60-7.64 (1H, m, aromatic-H), 7.30(2H, d, J=8.4 Hz, aromatic-H), 6.94-6.99 (3H, m, aromatic-H), 4.74(2H, s, CH2), 3.79(3H, s, CH3), 2.04(3H, m, adamantly-H), 1.83(6H, m, adamantly-H), 1.72(6H, m, adamantly-H)
< 실험예 1> HIF -1에 의해 매개된 HRE 전사활성화 저해도 측정
상기 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물의 HIF-1 전사활성 저해도를 측정하기 위해 전달체(reporter)로서 루시퍼라아제(luciferase)를 이용하는 pGL3-basic 벡터(Promega사)에 인간 VEGFA 유전자에 존재하는 HRE(Hypoxia Responsive Element, 5'-ACGTG-3')가 여섯 번 반복되도록 멀티클로닝사이트(multi-cloning site)에 복제시켜 pGL3-HRE-루시퍼라아제(pGL3-HRE-luciferase) 벡터를 제조하여 사용하였다.
48-웰 세포 배양 용기에서 인간 직장암 세포주인 HCT116 세포(제조사)를 파종하고, 하루가 지난 다음, 폴리펙트 시약(Polyfect reagent, 제조사)을 이용하여 25 ng의 pGL3-HRE-루시퍼라아제 벡터와 2.5 ng의 레닐라(Renilla) 대조군 벡터를 함께 형질전환(transfection)시켰다. 24시간 동안 배양한 후 배지를 교체하고, 4시간 동안 추가 배양한 다음, 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물 및 비교예 1의 화합물을 각각 0, 1, 3, 5, 10, 20 μM 농도로 처리하고, 저산소 조건(산소 1%, 질소 94%, 이산화탄소 5%)에서 12시간 배양하였다. 수동 핵막분해 완충용액(Passive lysis buffer)을 이용하여 용해물(lysate)을 얻어 이중-루시퍼라아제 리포터 분석 시스템(Dual-luciferase assay system, Promega사)을 사용하여 저산소 조건에서 유도된 루시퍼라아제의 활성을 측정함으로써 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 각 화합물의 HIF-1 저해 활성을 측정한 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.
HRE 전사활성도(%) 비교
실시예 1의 화합물 비교예 1의 화합물
0 uM 100 100
1 uM 128.7 119.4
3 uM 103.7 121.5
5 uM 52.3 98.8
10 uM 18.9 75.6
20 uM 12 43.1
도 1은 본 발명의 화합물이 HRE 전사 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 저산소 조건에서 유도되는 HIF-1에 의해 매개된 HRE 전사활성화에 본 발명의 화학식 1의 화합물이 미치는 영향을 측정한 결과, 본 발명의 화학식 1의 화합물이 비교예 1의 화합물에 비하여 암 세포주에서 최대 4배 이상 우수한 HRE 전사활성 저해도를 가지고 있음을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 HIF-1에 의해 활성화되는 HRE 전사활성을 저해하여 암의 성장 및 전이 등을 억제할 수 있으므로, 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 2> 저산소 상태에서의 HIF -1α 축적 저해도 측정
HIF-1α 단백질은 HIF-1을 구성하는 단백질의 하나로서 HIF-1 표적 유전자들의 발현에 중요한 역할을 한다.
상기 실험예 1을 통해 강한 HIF-1 전사활성 저해도를 나타낸 화합물 1에 대하여 직장암 세포주인 HCT116 세포에서 HIF-1α 축적(accumulation) 저해도를 측정하였다. 구체적으로는, 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물이 저산소(hypoxia) 조건에 의해 유도되는 HIF-1α 단백질의 생성을 저해하는 효과를 웨스턴 블롯(Western blot) 분석법을 이용하여 측정하였다.
먼저, 세포배양용기에서 인간의 직장암 세포주인 HCT116 세포(제조사)를 2×105 cell/ml로 파종하고, 24시간 동안 배양한 다음, 저산소 조건(산소 1%, 질소 94%, 이산화탄소 5%, 도 1에서 1% O2로 표시)에서 4시간 동안 전처리하여 HIF-1α의 축적을 유도한 후, 화학식 1의 화합물을 DMSO 용매에 녹여 0, 2, 5, 10 μM의 농도로 HCT116 세포에 처리한 다음, 상기 저산소 조건에서 12시간 동안 배양한 다음 RIPA 완충용액을 이용하여 핵 추출물을 조제하였다. 이때, 저산소 조건에 따른 HIF-1 표적 유전자의 발현을 비교하기 위하여 산소 20%를 포함하는 대조군과 함께 실험을 수행하였다. 상기 핵 추출물 각 시료당 약 30 ㎍을 SDS PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membrane)에 옮긴 후 HIF-1α 항체(R,D System사) 및 HRP(horseradish peroxidase)로 표식된 2차 항체(Amersham-Pharmacia사)를 사용하여 HIF-1α 단백질의 양을 검출하였다. 또한, 각 폴리비닐리덴 플루오라이드 막에 동일한 양의 핵 추출물이 함유되어 있는 것을 다시 확인하기 위해, HIF-1α를 검출에 사용한 막에서 HIF-1α 항체를 2-메르캅토에탄올을 함유한 완충 용액을 사용하여 떼어내고, 다시 토포이소머라제-1(topoisomerase-1, 도 2 에서 'TOPO-1'으로 표시) 항체(Santa Cruz사제품)를 이용하여 토포이소머라제-1의 양을 검출하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 본 발명의 화합물이 HIF-1α 축적을 저해하는 정도를 나타내는 도면이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물은 저산소 조건에서 토포이소머라제-1(TOPO-1)의 생성에는 영향을 주지 않으면서 HIF-1α 단백질의 생성을 농도 의존적으로 저해하고 있음을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 암을 악성화시키는 HIF-1α의 축적을 억제하므로, 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 3> HIF -1의 표적 유전자인 VEGFA , EPO , LDHA 및 CA IX 발현에 화학식 1의 화합물이 미치는 영향 측정(RT-PCR, reverse transcriptase polymerase chain reaction 분석)
HIF-1의 표적 유전자들 중, VEGFA(Vascular endothelial growth factor A)는 암의 성장 및 암이 다른 조직으로 전이하는데 있어서 중요한 혈관 신생 인자이고, EPO(erythropoietin)는 적혈구의 생성을 촉진시키는 역할을 하며, LDHA(lactate dehydrogenase A)는 당 신생 및 글루코오스의 암세포 내 투입량을 증가시키는 인자이고, CA IX(carbonic anhydrase 9)은 이산화탄소를 탄산으로 전환하여 암세포의 산성화를 유도하는 인자이다. 이들 표적 유전자들은 암의 증식과 전이에 기여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 화합물의 HIF-1 저해 활성을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물이 HIF-1의 대표적인 표적 유전자인 VEGFA, EPO, LDHA 및 CA IX의 발현을 저해하는 정도를 측정하였다. 구체적으로는, 직장암 세포주인 HCT116 세포를 사용하여 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
세포배양용기에서 HCT116 세포를 2×105 cell/ml로 파종하고, 24시간 동안 배양한 다음, 저산소 조건(산소 1%, 질소 94%, 이산화탄소 5%) 상태로 4시간 동안 처리하여 HIF-1α의 축적을 유도한 후, 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물을 0, 5, 10, 15, 20 μM의 농도로 처리한 다음, 상기 저산소 조건에서 12시간 동안 배양하고, 트리졸(trizol)을 이용하여 mRNA를 정제하였다. 이때, 저산소 조건에 따른 HIF-1 표적 유전자의 발현을 비교하기 위하여 산소 20%를 포함하는 대조군과 함께 실험을 수행하였다. 다음으로, 정제한 mRNA를 RT-PCR 키트(Invitrogen사)를 이용하여 cDNA를 합성하고 RT-PCR과 실시간 RT-PCR을 이용하여 HIF-1α의 표적 유전자인 VEGFA(Vascular endothelial growth factor A), EPO(erythropoietin), LDHA(Lactate dehydrogenase A) 및 CA Ⅸ(carbonic anhydrase 9)의 mRNA 양을 측정하였다. 이때, 내부 대조 유전자로 GAPDH를 동시에 증폭하여 화학식 1의 화합물의 VEGFA, EPO, LDHA, CA Ⅸ에 대한 선택적 발현 저해 활성을 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 2, 표 3, 도 3, 도 4 및 도 5에 나타내었다.
저산소 조건에서 화학식 1의 화합물에 의한 LDHA 단백질 발현 억제 측정
산소 조건 20% O2 1% O2
화학식 1의 화합물(μM) 0 0 10 20
LDHA의 mRNA 발현양 1 1.7 0.6 0.7
저산소 조건에서 화학식 1의 화합물에 의한 CA Ⅸ 단백질 발현 억제 측정
산소 조건 20% O2 1% O2
화학식 1의 화합물(μM) 0 0 10 20
CA Ⅸ의 mRNA 발현양 1 48 5 4
도 3은 본 발명의 화합물이 VEGFA 및 EPO의 발현에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 화합물이 LDHA의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 화합물이 CA Ⅸ의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
표 2, 표 3, 도 3, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물은 저산소 조건에서 내부 대조 유전자인 GAPDH의 발현에는 전혀 영향을 주지 않았다. 그러나 HIF-1의 표적 유전자인 VEGFA, EPO, LDHA 및 CA Ⅸ의 발현은 화학식 1의 화합물의 농도에 의존적으로 저해됨을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 암의 성장 및 암이 다른 조직으로 전이하는데 중요한 인자인 VEGFA, EPO, LDHA 및 CA Ⅸ의 발현을 선택적으로 저해할 수 있기 때문에 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 저산소 상태에서 VEGFA의 발현이 증가되어 악화되는 당뇨병성 망막증이나 관절염 치료제의 유효성분으로도 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 4> 화학식 1의 화합물의 경구투여에 의한 생체 내 항암 활성 측정
실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물을 경구로 투여하였을 때의 종양 성장 억제 활성을 평가하기 위해 마우스에서의 생체 내(in vivo ) 항암 활성을 측정하였다. 구체적으로는, 군마다 5 마리의 누드 마우스로 실험군 및 대조군을 구성하여 마우스의 체중변화, 종양크기 및 종양무게를 측정하여 항암 활성을 측정하였다.
6주령의 암컷 누드 마우스(출처:BALB/c nu/nu, Charles River사)는 실험기간 동안 항온, 항습이 유지되는 무균 상태로 사육하였다. 누드 마우스를 마취시킨 후 4×107 cells/mouse의 이식농도로 인체유래 직장암 세포주인 HCT116 세포를 직장 조직에 이식하고, 수술용 클립으로 봉하였다. 직장암 세포주를 이식한 후 칼리퍼스로 암의 크기를 측정하여 암의 크기가 54.5 mm3으로 자랐을 때, 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물을 투여하였다. 구체적으로는, 실험군에 대해서는 화학식 1의 화합물을 살린(saline) 80%, DMAC 10% 및 트윈 80(Tween 80) 10%로 구성되는 용매(이하, '용매 A'라고 함)에 용해시켜 화합물의 농도가 30 mg/kg가 되도록 하여, 각각 15 ml/kg 용량으로 매일 1회씩 경구투여하였다. 대조군은 화합물을 첨가하지 않은 용매 A만 15 ml/kg씩 매일 1회 경구투여하였다. 이후 암 세포주의 크기 및 체중은 0, 2, 4, 6, 8, 11, 13, 14일째에 1회씩 측정하였다.
종양의 크기(tumor volume)는 하기의 수학식 1로 계산하였고, 화학식 1의 화합물을 반복하여 경구투여 시의 독성 정도를 알아보기 위한 마우스의 체중변화를 표 4에 나타내었고, 종양 무게 및 크기의 변화를 표 5에 나타내었다. 이때, 표 5의 저해도(%)는 하기 수학식 2로 계산하였는데, 화합물에 의한 종양 생성의 저해도를 백분율로 나타낸 것이다.
Figure 112010067902515-pat00012
Figure 112010067902515-pat00013
화학식 1의 화합물의 반복 경구투여 시 마우스의 체중 변화(%)
군
(n=5)		 투여량
(mg/kg)		 투여 경과 일 수
0 2 4 6 8 11 13 14
대조군 0 100.0
±0.0		 104.2
±1.6		 104.6
±2.6		 103.9
±2.7		 103.2
±3.8		 101.7
±2.2		 101.6
±2.5		 99.9
±3.0
실험군 30 100.0
±0.0		 104.0
±2.0		 102.8
±3.5		 102.2
±5.3		 102.4
±4.8		 102.7
±8.1		 101.6
±8.4		 99.9
±8.5
표 4에 나타난 바와 같이, 화학식 1의 화합물을 30 mg/kg의 용량으로 누드 마우스에 반복 경구투여한 기간 동안 특이한 일반 증상은 관찰되지 않았으며, 마우스 체중 변화의 최종일(14일째) 결과를 보면 대조군과 비교하여 실험군에서 통계적으로 유의한 체중 감소는 없는 것을 알 수 있다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
화학식 1의 화합물의 반복 경구투여 시 종양크기 변화 및 최종일의 종양 무게
군
(n=5)
 투여량
(mg/kg)
 종양크기(mm3) 종양무게
(mg)
투여 경과 일 수
0 2 4 6 8 11 13 14 14
대조군 0 0.0
±0.0		 29.8
±4.8		 85.4
±16.6		 171.3
±29.9		 246.0
±51.9		 455.0
±88.8		 604.8
±108.9		 745.3
±132.5		 1799.3
±308.9
실험군 30 0.0
±0.0		 23.8
±6.1		 65.1
±7.3		 129.6
±19.9		 184.0
±16.4		 329.3
±49.8		 435.6
±68.6		 505.6
±77.2		 1207.3
±140.9
저해도(%) - 19.9 23.8 24.3 25.2 27.6 28 32.2 32.9
표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물을 30 mg/kg을 투여한 실험군에서는 대조군에 비하여 32.9%로 암세포의 성장을 저해하였음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물을 경구투여할 경우 생체 내 항암 활성을 가지며, 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 5> 화학식 1의 화합물의 정맥투여에 의한 생체 내 항암 활성 측정
실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물을 정맥투여하였을 때의 종양 성장 억제 활성을 평가하기 위해 마우스에서의 생체 내(in vivo ) 항암 활성을 측정하였다. 구체적으로, 화학식 1의 화합물을 10, 20, 30 mg/kg의 용량으로 정맥투여한 것을 제외하고는 실험예 4와 같이 수행하여, 마우스의 체중변화, 종양크기 및 종양무게를 측정하여 항암 활성을 측정하였다.
종양의 크기는 실험예 4의 상기 수학식 1로 계산하였고, 저해도(%)는 실험예 4의 상기 수학식 2로 계산하였으며, 화학식 1의 화합물을 반복하여 정맥투여 시의 독성 정도를 알아보기 위한 마우스의 체중변화를 표 6에 나타내었고, 종양 무게 및 크기의 변화를 표 7에 나타내었다.
화학식 1의 화합물의 반복 정맥투여 시 마우스의 체중 변화(%)
군
(n=5)		 투여량
(mg/kg)		 투여 경과 일 수
0 2 4 6 8 11 13 14
대조군 0 100.0
±0.0		 102.8
±1.1		 104.5
±4.5		 102.9
±5.5		 102.2
±4.3		 99.5
±4.8		 100.4
±2.9		 98.6
±2.7
실험군 1 10 100.0
±0.0		 102.9
±3.0		 102.3
±3.6		 102.1
±5.6		 101.3
±4.5		 98.5
±3.8		 99.8
±2.1		 98.7
±2.8
실험군 2 20 100.0
±0.0		 102.3±2.1 102.1±3.8 102.0±1.7 101.3±2.2 99.6
±2.6		 99.5
±2.3		 99.4
±2.8
실험군 3 30 100.0
±0.0		 101.6
±5.6		 101.8±4.0 101.4±3.2 101.2±3.4 100.7±7.6 100.3±7.1 99.6
±6.8
표 6에 나타난 바와 같이, 화학식 1의 화합물을 10, 20, 30 mg/kg의 용량으로 누드 마우스에 반복 정맥투여한 기간 동안 특이한 일반 증상은 관찰되지 않았으며, 마우스 체중 변화의 최종일(14일째) 결과를 보면 대조군과 비교하여 실험군에서 통계적으로 유의한 체중 감소는 없는 것을 알 수 있다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
화학식 1의 화합물의 반복 정맥투여 시 종양크기 변화 및 최종일의 종양 무게
군
(n=5)
 투여량
(mg/kg)
 종양크기(mm3) 종양무게
(mg)
투여 경과 일 수
0 2 4 6 8 11 13 14 14
대조군 0 0.0
±0.0		 28.4
±3.6		 86.6
±20.0		 156.5
±40.8		 261.7
±58.5		 457.9
±129.5		 634.2
±121.1		 825.1
±116.2		 2037.4
±249.2
실험군 1 10 0.0
±0.0		 22.7
±3.5		 69.6
±13.3		 127.2
±18.0		 223.9
±34.4		 412.7
±66.6		 595.8
±87.4		 765.0
±192.8		 1855.9
±343.6
저해도(%) - 20.2 19.6 18.7 14.4 9.9 6.0 7.3 8.9
실험군 2 20 0.0
±0.0		 21.1±2.1 63.3±7.9 113.0±9.3 184.1±9.1 315.8±32.4 461.7±79.0 586.4±80.3 1450.7±258.0
저해도(%) - 25.7 26.9 27.8 29.6 31.0 27.2 28.9 28.8
실험군 3 30 0.0
±0.0		 19.5±2.2 58.5±4.4 100.3±11.8 166.5±24.7 266.3±32.7 367.8±91.1 453.7±91.2 1136.3±202.7
저해도(%) - 31.3 32.4 36.0 36.4 41.8 42.0 45.0 44.2
표 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 화학식 1의 화합물을 10, 20, 30 mg/kg을 투여한 실험군에서는 각각 7.3%, 28.9%, 45.0%의 종양성장 억제 효과가 관찰되었다. 이러한 결과는 화학식 1의 화합물의 용량을 증가시킬수록 종양 성장 억제 활성이 증가함을 나타낸다.
추가적으로, 본 실험예 5에서 나타난 항암 활성 결과가 HIF-1α의 발현 감소에 의한 것인지 알아보기 위하여 종양조직의 면역반응실험을 실시하였다. 구체적으로, 비교군으로 토포테칸(topotecan)을 처리하고, 실험군으로 화학식 1의 화합물을 처리하여 종양조직의 면역반응 실험을 실시하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 본 발명의 화합물에 의해 HIF-1α의 발현이 감소하는 것을 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우에는 HIF-1α의 발현이 뚜렷히 관찰되지만, 화학식 1의 화합물을 투여한 경우에는 쥐의 종양조직에서 HIF-1α 발현이 확연히 감소함을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물을 정맥투여할 경우 종양조직에서 HIF-1α 발현을 감소시켜 항암 활성을 가지며, 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 6> 화학식 1의 화합물을 정맥투여하고 기존 항암제를 경구투여할 경우 마우스에서의 생체 내 항암 활성 측정
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 기존의 다른 항암제와 병용하여 꼬리정맥에 투여한 마우스에서 생체 내(in vivo ) 항암 활성을 측정하였다. 구체적으로는, 실험군은 화학식 1의 화합물 30 mg/kg을 꼬리 정맥으로 투여한 실험군 1, 기존 항암제(sunitinib) 30 mg/kg을 경구투여한 실험군 2, 화학식 1의 화합물 30 mg/kg을 꼬리 정맥으로 투여하고 기존 항암제(sunitinib) 30 mg/kg을 경구투여한 실험군 3으로 나눈 것; 대조군은 카보네이트 버퍼 80%, 디메틸아세트아미드 10% 및 크레모포아 EL 10%로 구성되는 용매 B를 꼬리정맥으로 투여한 대조군 1, 증류수를 경구투여한 대조군 2, 용매 B를 꼬리정맥으로 투여하고 증류수를 경구투여한 대조군 3으로 나눈 것; 암 세포주의 크기 및 체중을 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14일째에 1회씩 측정한 것, 실험 시작 시 종양의 크기가 54.0 mm3인 것을 제외하고는 실험예 4와 동일한 방법으로 수행하여 마우스의 체중변화, 종양크기 및 종양무게를 측정하여 항암 활성을 측정하였다.
종양의 크기(tumor volume)는 실험예 4의 상기 수학식 1로 계산하였고, 저해도(%)는 실험예 4의 상기 수학식 2로 계산하였으며, 실험군 1 내지 실험군 3에서 반복 투여 시의 독성 정도를 알아보기 위한 마우스의 체중변화를 표 8에 나타내었고, 종양 무게 및 크기의 변화를 표 9 및 도 7에 나타내었다.
화학식 1의 화합물을 정맥투여하고 기존 항암제를 경구투여 시 마우스의 체중 변화(%)
군(n=5)
 투여량
(mg/kg)		 투여 경과 일 수
0 3 5 7 10 12 14
대조군 1 0 100.0
±0.0		 101.2
±3.0		 101.2
±2.1		 101.7
±2.8		 99.8
±2.1		 98.7
±3.6		 96.4
±4.5
실험군 1 30 100.0
±0.0		 99.6
±2.3		 99.9
±2.2		 99.5
±1.9		 98.9
±1.7		 98.5
±4.0		 97.2
±3.7
대조군 2 0 100.0
±0.0		 101.7
±2.8		 101.5
±2.4		 101.8
±2.4		 100.7
±4.1		 98.5
±3.9		 96.1
±3.8
실험군 2 30 100.0
±0.0		 101.6
±2.6		 101.3
±3.0		 100.2
±2.6		 101.0
±4.5		 100.1
±4.0		 99.2
±5.1
대조군 3 0 100.0
±0.0		 100.3
±2.0		 100.4
±2.8		 102.0
±3.2		 99.6
±3.5		 98.0
±3.3		 95.4
±3.6
실험군 3 30+30 100.0
±0.0		 99.9
±1.6		 100.1
±2.1		 99.3
±0.9		 98.1
±2.6		 97.1
±2.9		 96.8
±4.0
표 8에 나타난 바와 같이, 각 실험군 및 각 대조군에서 화학식 1의 화합물 및 기존 항암제를 반복 정맥투여한 기간 동안 특이한 일반 증상은 관찰되지 않았으며, 마우스 체중 변화의 최종일(14일째) 결과를 보면 각 대조군과 비교하여 각 실험군에서 통계적으로 유의한 체중 감소는 없는 것을 알 수 있다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
화학식 1의 화합물을 정맥투여하고 기존 항암제를 경구투여 시 종양크기 변화( mm 3 )
군(n=5)
 투여량
(mg/kg)		 투여 경과 일 수
0 3 5 7 10 12 14
대조군 1 0 0.0
±0.0		 26.7
±4.7		 59.8
±8.0		 120.2
±12.9		 238.0
±19.1		 410.2
±67.6		 558.9
±108.1
실험군 1 30 0.0
±0.0		 17.8
±3.1		 39.1
±4.9		 78.6
±10.7		 153.6
±18.7		 260.4
±25.5		 356.8
±49.9
저해도(%) 33.1 34.5 34.6 35.4 36.5 36.2
대조군 2 0 0.0
±0.0		 28.8
±3.6		 72.3
±14.8		 142.3
±31.8		 269.7
±51.0		 432.6
±96.7		 588.9
±56.4
실험군 2 30 0.0
±0.0		 20.5
±3.8		 50.0
±6.4		 96.1
±13.8		 174.7
±28.9		 280.5
±54.8		 380.5
±67.8
저해도(%) 29.0 30.8 32.4 35.2 35.1 35.4
대조군 3 0 0.0
±0.0		 37.9
±7.9		 92.4
±11.9		 172.5
±27.7		 317.1
±64.8		 502.0
±99.3		 672.9
±152.5
실험군 3 30+30 0.0
±0.0		 16.6
±3.5		 36.7
±5.6		 61.2
±12.7		 104.9
±25.7		 152.0
±35.7		 177.4
±47.1
저해도(%) 56.3 60.2 64.5 66.9 69.7 73.6
도 7은 본 발명의 화합물을 정맥투여하고 기존 항암제를 경구투여할 경우 종양 크기 변화를 나타내는 도면이다.
표 9 및 도 7에 나타난 바와 같이, 화학식 1의 화합물을 단독으로 정맥투여할 경우(실험군 1)에는 36.2%의 암세포 성장 저해도를 보였고, 기존 항암제를 단독으로 정맥투여할 경우(실험군 2)에는 35.4%의 암세포 성장 저해도를 나타내었다. 또한. 화학식 1의 화합물을 정맥투여하고 기존 항암제를 경구투여할 경우(실험군 3)에는 암세포 성장 저해도가 73.6%로 나타나 단독으로 투여하는 경우에 비하여 2배 이상의 암세포 성장 저해 효과가 나타난 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 기존의 항암제와 병용하여 투여할 경우에도 마우스 생체 내 항암 활성이 향상되며, 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 기존의 항암제와 함께 사용될 수 있다.
< 실험예 7> 화학식 1의 화합물과 기존 항암제를 병용하여 경구투여 시 마우스에서의 생체 내 항암 활성 측정
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 기존의 다른 항암제와 병용하여 경구투여한 마우스에서 생체 내(in vivo) 항암 활성을 측정하였다. 구체적으로는, 화학식 1의 화합물을 30 mg/kg의 용량으로 경구투여한 실험군 1; 기존 항암제(sunitinib)을 30 mg/kg의 용량으로 경구투여한 실험군 2; 화학식 1의 화합물 30 mg/kg과 기존 항암제(sunitinib) 30 mg/kg을 병용하여 경구투여한 실험군 3; 및 카보네이트 버퍼 80%, 디메틸아세트아미드 10% 및 크레모포아 EL 10%로 구성되는 용매를 투여한 대조군으로 나눈 것을 제외하고는 실험예 6과 동일한 방법으로 수행하여 마우스의 체중변화, 종양크기 및 종양무게를 측정하여 항암 활성을 측정하였다.
종양의 크기(tumor volume)는 실험예 4의 상기 수학식 1로 계산하였고, 저해도(%)는 실험예 4의 상기 수학식 2로 계산하였으며, 실험군 1 내지 실험군 3에서 반복 투여 시의 독성 정도를 알아보기 위한 마우스의 체중변화를 표 10에 나타내었고, 종양 무게 및 크기의 변화를 표 11 및 도 8에 나타내었다.
화학식 1의 화합물 및 기존 항암제를 병용하여 경구투여 시 마우스의 체중 변화(%)
군
(n=5)		 투여량
(mg/kg)		 투여 경과 일 수
0 2 4 6 8 10 13 14
대조군 0 100.0
±0.0		 104.0±1.3 103.4±2.1 103.9±2.5 104.1±4.0 103.5±3.4 103.2±2.3 103.3±2.0
실험군 1 30 100.0
±0.0		 105.2±1.5 104.3±1.3 102.8±1.9 104.8±1.7 102.5±2.5 102.9±2.8 103.1±3.9
실험군 2 30 100.0
±0.0		 103.9±1.5 103.0±0.8 105.3±1.4 107.4±3.2 106.0±2.9 104.2±3.2 103.4±4.0
실험군 3 30+30 100.0
±0.0		 106.3±1.5 103.6±2.7 105.5±4.4 110.1±1.3 107.9±1.6 107.0±4.0 106.5±4.0
표 10에 나타난 바와 같이, 각 실험군 및 각 대조군에서 화학식 1의 화합물 및 기존 항암제를 반복하여 경구투여한 기간 동안 특이한 일반 증상은 관찰되지 않았으며, 마우스 체중 변화의 최종일(14일째) 결과를 보면 각 대조군과 비교하여 각 실험군에서 통계적으로 유의한 체중 감소는 없는 것을 알 수 있다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
화학식 1의 화합물 및 기존 항암제를 병용하여 경구투여 시 종양크기 변화
군
(n=5)
 투여량
(mg/kg)
 종양크기(mm3) 종양무게
(mg)
투여 경과 일 수
0 2 4 6 8 10 13 14 14
대조군 0 0.0
±0.0		 27.2±2.7 59.9±2.7 116.0±8.5 177.5±21.7 243.9±35.9 386.2±53.8 559.3±95.2 1659.5±251.0
실험군 1 30 0.0
±0.0		 20.8±6.5 46.2±9.4 88.7±12.4 133.9±15.5 182.3±18.3 273.1±24.8 388.5±47.9 1140.0±92.6
저해도(%) - 23.5 22.8 23.5 24.6 25.3 29.3 30.5 31.3
실험군 2 30 0.0
±0.0		 20.5±3.2 45.1±6.5 86.0±10.5 125.8±17.5 169.0±21.3 244.7±20.0 346.9±41.6 1028.2±126.1
저해도(%) - 24.7 24.7 25.9 29.1 30.7 36.6 38.0 38.0
실험군 3 30+30 0.0
±0.0		 13.2±2.0 27.7±4.4 49.8±6.8 71.3±11.0 97.3±14.6 137.6±32.1 171.3±39.0 510.5±50.6
저해도(%) - 51.7 53.7 57.1 59.8 60.1 64.4 69.4 69.2
도 8은 본 발명의 화합물 및 기존 항암제를 병용하여 경구투여할 경우 종양 크기 변화를 나타내는 도면이다.
표 11 및 도 8에 나타난 바와 같이, 화학식 1의 화합물을 단독으로 경구투여할 경우(실험군 1)에는 30.5 %의 암세포 성장 저해 효과를 나타냈고, 기존 항암제를 단독 경구투여할 경우(실험군 2)에는 38.0 %의 암세포 성장 저해 효과를 나타냈다. 또한, 화학식 1의 화합물 및 기존의 항암제를 병용하여 경구투여할 경우(실험군 3)에는 암세포 성장 저해도가 69.4%로 나타나 단독으로 투여하는 경우에 비하여 2배 이상의 암세포 성장 저해 효과가 나타난 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 기존의 항암제와 병용하여 경구투여할 경우에도 마우스 생체 내 항암 활성이 향상되며, 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 기존의 항암제와 함께 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 8> 화학식 1의 화합물의 관 형성( tube formation ) 억제활성 평가
화학식 1의 화합물이 관 형성(tube formation)에 미치는 영향을 관찰함으로써 혈관신생에 대한 효과를 예측하기 위한 목적으로 본 실험을 실시하였다.
사람의 제대혈관 내피세포(HUVEC; Human Umbilical Vein Endothelial Cell)를 기저막 기질(sement membrane matrix)인 마트리겔(matrigel)위에 놓으면 모세혈관과 같은 관 구조를 형성(capillary-like tube formation)하는데, 이것은 마치 신혈관생성(angiogenesis)이 일어날 때 내피세포가 이동하고 분화하는 과정과 흡사하다. 사람 제대혈관 내피세포 관 형성 평가(HUVEC tube formation assay)는 화학식 1의 화합물이 관 형성에 미치는 영향을 관찰함으로서 혈관신생에 대한 효과를 간접적으로 알 수 있는 생체 외 평가이며, 생체 내 동물실험과 가장 연관성이 높은 평가이다.
HUVEC 세포주는 한국 생명공학연구원에서 보존중인 것을 사용하였고 배양액은 EBM-2(제조사: Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)에 보충물을 추가하여 배지로 사용하였고, 화학식 1의 화합물을 1, 3, 10 μM 농도로 처리하였다. 대조군은 DMSO 용액으로 처리하였고, 비교군은 수마린(suramin) 10 μM을 처리하고 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9는 본 발명의 화합물이 관 형성(tube formation)에 미치는 영향을 측정한 광학현미경 사진이다.
도 9에 나타난 바와 같이, 화학식 1의 화합물을 1, 3, 10 μM 농도로 처리한 경우 모두에서 관 형성을 억제하였으므로, 화학식 1의 화합물이 신생혈관생성 억제 활성이 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 신생혈관생성 억제 활성이 있으므로, 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 9> 화학식 1의 화합물의 신생혈관생성 억제 활성 평가
화학식 1의 화합물이 신생혈관생성을 억제하는 정도를 확인하고자 다음과 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 6주령 암컷 쥐(C57BL) 5마리를 1군으로 하여 B16F10 melanoma 세포주를 이식하고 암세포 배양 후 화학식 1의 화합물 20 mg/kg 농도로 5일간 매일 복강 투여하여 종양이 감소되는 정도와 신생혈관 형성 억제 정도를 관찰하였다. 대조군에는 10% DMAC, 10% 크레모포아 및 80% 버퍼(pH 10)의 혼합용액을 매일마다 투여하였고, 비교군에는 토포테칸(Topotecan) 2 mg/kg을 2일마다 1회 투여하여, 마우스의 체중변화 및 생성된 신생혈관 수를 측정하였고, 그 결과를 표 12, 도 10 및 도 11에 나타내었다.
화학식 1의 화합물 복강 투여 시 마우스의 체중 변화(%)
군
(n=5)		 투여량
(mg/kg)		 투여 경과 일 수
0 2 5
대조군 0/day 100.0
±0.0		 102.9
±0.7		 107.5
±1.7
비교군 2/2day 100.0
±0.0		 101.2
±0.6		 103.7
±1.4
실험군 20/day 100.0
±0.0		 101.6
±2.1		 106.7
±3.7
표 12에 나타난 바와 같이, 각 실험군 및 각 대조군에서 화학식 1의 화합물 및 기존 항암제를 반복하여 복강 투여한 기간 동안 특이한 일반 증상은 관찰되지 않았으며, 마우스 체중 변화의 최종일(5일째) 결과를 보면 각 대조군과 비교하여 각 실험군에서 통계적으로 유의한 체중 감소는 없는 것을 알 수 있다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
도 10은 본 발명의 화합물이 신생혈관 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 화합물이 신생혈관 생성에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이, 화학식 1의 화합물을 종양 조직에 처리하였을 경우에는 아무런 처리를 하지않은 경우에 비하여 신생혈관 생성 수가 약 50% 감소되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 신생혈관생성 억제 활성이 있으므로, 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
< 실험예 10> 암 전이 활성 억제 평가
화학식 1의 화합물이 암 전이를 억제하는 정도를 확인하고자 다음과 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 6주령 암컷 쥐(C57BL) 6마리를 1군으로 하여 B16F10 melanoma 세포주를 이식하고 암세포 배양 후 화학식 1의 화합물 20 mg/kg 농도로 12일간 매일 복강 투여하여 종양이 감소되는 정도와 신생혈관 형성 억제 정도를 관찰하였다. 대조군에는 정제수를 처리하였고, 비교군에는 토포테칸(Topotecan) 2 mg/kg을 2일마다 1회 투여하여, 마우스의 체중변화 및 암 전이 정도를 측정하였고, 그 결과를 표 13, 표 14, 도 12 및 도 13에 나타내었다.
화학식 1의 화합물 복강 투여 시 마우스의 체중 변화(%)
군
(n=6)		 투여량
(mg/kg)		 투여 경과 일 수
0 2 5 7 9 12
대조군 0/day 100.0
±0.0		 101.4±2.5 105.5±2.9 105.0±2.5 106.8±2.6 107.1±2.7
비교군 2/2day 100.0
±0.0		 101.0±2.9 103.5±6.1 104.0±4.6 104.3±6.2 103.7±5.5
실험군 20/day 100.0
±0.0		 100.9±1.9 102.6±4.0 103.5±1.1 107.5±1.6 108.7±3.8
표 13에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 화합물을 20 mg/kg의 용량으로 누드 마우스에 반복 복강투여한 기간 동안 특이한 일반 증상은 관찰되지 않았으며, 마우스 체중 변화의 최종일(12일째) 결과를 보면 대조군과 비교하여 실험군에서 통계적으로 유의한 체중 감소는 없는 것을 알 수 있다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 독성이 거의 없어 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
화학식 1의 화합물 복강 투여 시 암 전이 군집 수의 변화 개수
군(n=6) 투여량(mg/kg) 전이된 종양 군집 수
대조군 0 306.8±23.1
비교군 2 148.3±49.4
전이 저해도(%) - 51.7
실험군 20 179.2±54.0
전이 저해도(%) - 41.6
도 12는 화학식 1의 화합물 처리에 따른 폐의 암 전이 군집 수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 화학식 1의 화합물 처리에 따른 폐의 암 전이 군집 수 변화를 찍은 사진이다.
표 14, 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 실험 최종일(day 12)에 마우스를 희생시켜 폐의 종양 군집 수를 육안으로 계수한 결과 대조군은 평균 306.8개의 전이 군집을 형성한 반면에, 화학식 1의 화합물 20 mg/kg 투여한 실험군은 평균 179.2개의 전이 군집만을 형성하여, 41.6%로 통계적으로 유의한 전이 억제 활성을 나타냈다.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 암 전이 억제 활성이 있으므로, 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 조성물을 이용한 제제예를 예시한다.
< 제제예 1> 산제의 제조
화학식 1의 화합물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
< 제제예 2> 정제의 제조
화학식 1의 화합물 100 mg
옥수수 전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
< 제제예 3> 캡슐제의 제조
화학식 1의 화합물 100 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
< 제제예 4> 주사액제의 제조
화학식 1의 화합물 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure 112010067902515-pat00014
    .
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항의 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암은 HIF-1α 단백질의 축적이 많이 일어나는 고형암인 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 HIF-1의 활성을 저해하여 항암 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 HIF-1α 단백질의 축적을 저해하여 항암 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 HIF-1α 단백질의 축적을 저해하여 암의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제1항의 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 망막증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 HIF-1의 활성을 저해하여 신생혈관의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 HIF-1α 단백질의 축적을 저해하여 신생혈관의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 VEGFA 단백질 발현을 저해하여 신생혈관의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제1항의 화합물을 유효성분으로 함유하는 류마티스성 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 HIF-1의 활성을 저해하여 신생혈관의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 HIF-1α 단백질의 축적을 저해하여 신생혈관의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.




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KR101599259B1 (ko) * 2013-12-04 2016-03-03 일동제약주식회사 혈관 신생작용 관련 질환 치료를 위한 HIF-1α 저해 화합물
US10074375B2 (en) * 2014-01-15 2018-09-11 Samsung Electronics Co., Ltd. Weight function determination device and method for quantizing linear prediction coding coefficient
WO2015111967A1 (ko) * 2014-01-23 2015-07-30 동국대학교 산학협력단 페녹시아크릴 유도체 및 이의 용도
CN105085287A (zh) * 2014-05-12 2015-11-25 上海医药工业研究院 3`-氨基-2`-羟基-[1,1`-联苯]-3-羧酸的制备方法
CN105085276A (zh) * 2014-05-12 2015-11-25 上海医药工业研究院 艾曲波帕中间体及其制备方法和应用
CN107226785B (zh) * 2017-06-11 2019-08-30 长春工业大学 金刚烷苯乙烯类衍生物及其制备方法和应用
KR102274238B1 (ko) 2020-01-23 2021-07-09 동국대학교 산학협력단 이치환 아다만틸 유도체, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 성장 억제용 약학적 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008004798A1 (en) * 2006-07-04 2008-01-10 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Compounds that inhibit hif-1 activity, the method for preparation thereof and the pharmaceutical composition containing them as an effective component

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008004798A1 (en) * 2006-07-04 2008-01-10 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Compounds that inhibit hif-1 activity, the method for preparation thereof and the pharmaceutical composition containing them as an effective component

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