TWI520743B - 構樹樹皮半固態發酵產物之水溶性萃取物及其製法 - Google Patents

Description

構樹樹皮半固態發酵產物之水溶性萃取物及其製法

本發明係關於一種構樹樹皮半固態發酵產物之水溶性萃取物。更特別地，係關於一種分離自構樹樹皮以白腐真菌進行半固態發酵所得產物之水溶性萃取物，其特徵在於具有強的Fe²⁺鐵離子螯合活性。

構樹(Broussonetia papyrifera)木材一般用於生產紙漿與木板，但是在進行刨削處理之前，由於樹皮含有高量的木質素/多酚類(會造成加工上的困難)，故必須將全部樹皮去除而當成廢棄物處理。樹皮通常佔樹木總重的約10-15%(Kofujita等人,1999,Wood Sci. Technol. 33,223-228)，是一種重要的生質能源。近年來因為意識到可供利用的資源有限，所以已逐漸嘗試研究及開發，對這些樹皮廢棄物做有效且具有附加價值的利用。

已知從某些樹皮分離到的化合物具有各種生理活性，例如抗氧化活性(Ku等人,2007,J. Wood Sci. 53,524-528；Wangthong等人,2010,J. Ethnapharmacol. 132,466-472)、抗微生物功效(Cowan,1999,Clin. Microbiol. Rev. 12,564-582)、抗-發炎特性(Wangthong等人,2010，如前述)、抗過敏活性(Bagchi等人,2000,Toxicology 148,187-197)及酪胺酸抑制活性(Momtaz等人,2008,J. Ethnopharmacol. 119,507-512)。構樹之根部、樹皮及果實已被用於中醫當做藥材(Lee等人,2001,J. Nat. Prod. 64,1286-1293)，而且已經鑑定出各種具有生物活性的化合物(Zheng等人,2008,Food Chem. 106,529-535；Mei等人，2009,J. Nat. Prod. 72,621-5)。

對於能產生有價值抗氧化化學品的再生資源之需求，也促使希望能研發出其他可生產該等抗氧化劑的替代系統。在過去數十年以來，研究人員已注意到，絲狀擔子菌能夠產生木質素分解酵素(包括漆化酵素、木質素過氧化酵素和錳過氧化酵素)，將木材中的木質素分解，而釋放出不同的酚類化合物(Rodriguez Couto與Toca-Herrera,2006,Biotechnol.Adv.24,500-513)。

本發明遂首先將構樹樹皮以白腐真菌進行半固態發酵，而獲得所得發酵產物之水溶性萃取物，並經由活性分析得知，該水溶性萃取物具有極佳的Fe²⁺鐵離子螯合能力，可應用做為優於EDTA之鐵離子螯合劑。

人體之鐵平衡取決於鐵吸收與鐵流失之差距，兩者相等即可維持平衡。組織鐵量若超過儲存機制所能負荷，游離鐵會與檸檬酸或ADP等小分子形成錯合物，並可催化自由基反應，導致組織發炎與纖維化等傷害，以肝臟傷害最為典型。身體中的鐵離子可以穿梭在ferric Fe(+3)和ferrous Fe(+2)的兩種能量狀態間來回移動，若失控時，則會快速且大量的產生自由基。過多的鐵離子將造成不正常的氧化作用與細胞傷害，它會造成細胞發炎反應、粒線體功能異常及細胞凋亡的發生。鐵離子會隨年齡而增加，可能與飲食和代謝因素有關。

遺傳性鐵代謝異常引發的疾病Friedreich ataxia是一種神經退化性運動失調症，導因於粒線體蛋白質frataxin之基因異常而含量降低，該蛋白質可能與粒線體之鐵釋出有關，患者粒線體有鐵堆積而造成傷害，對神經細胞傷害最為嚴重。鐵離子過多也是動脈粥樣硬化的危險因子。更年期前的婦女和定期捐血者，由於鐵離子會定期流失，證據顯示多少有遠離心臟病的保護效果。已知利用Desferoxamine螯合劑來降低體內的鐵，能降低自由基對心臟和動脈的損害。而本發明之水溶性萃取物經鑑定具有強的Fe²⁺鐵離子螯合活性及低的細胞毒性，故可應用於製備用以治療因體內鐵離子過多所造成之疾病的醫藥品。

於是，本發明之一方面係關於，一種分離自構樹樹皮以白腐真菌進行半固態發酵所得產物之水溶性萃取物，其特徵在於該水溶性萃取物含有酚類化合物總量為61.6-89.3 mg g^-1(五倍子酸當量)及類黃酮素含量為2.75-5.26 mg g^-1(槲皮素酸當量)；且具有ABST自由基與DPPH自由基清除能力、Fe³⁺還原能力(0.024-0.233)、酪胺酸酶抑制能力(EC₅₀=706-2768 μg ml^-1)，以及強的Fe²⁺鐵離子螯合活性(EC₅₀<2 μg ml^-1)。

另一方面，本發明關於一種製備構樹樹皮半固態發酵產物之水溶性萃取物的方法，該方法包含：將經過乾燥、粉碎之構樹樹皮10~12.5%(w v^-1)與50~60 mM緩衝溶液(pH 4.0~6.5)、10~40 μM的CuSO₄‧5H₂O溶液、0.01~1.0%(w/v) Tween 80、以及10~30 g/L葡萄糖製成半固態培養基；將白腐真菌Perenniporia tephropora TFRI707接種於該半固態培養基；將培養基物靜置於30~35℃之恆溫室中，不照光培養13~30天；收集上層培養液，並將樹皮殘餘物以60 mM磷酸鈉緩衝液(pH 4.0)萃洗；將該上層培養液與洗液匯集，並過濾、離心而得澄清溶液；以及將該澄清溶液以離子交換管柱進行純化而得水溶性萃取物。

又另一方面，本發明提供一種Fe²⁺鐵離子螯合劑組合物，其包含根據本發明方法所製得之水溶性萃取物。於本發明之一項具體實施例，本發明之Fe²⁺鐵離子螯合劑組合物可用於製備用以治療因體內鐵離子過多所造成之疾病的醫藥品。

於另一項具體實施例，本發明之Fe²⁺鐵離子螯合劑組合物可用於製備用以預防體內鐵離子過多所造成不正常的氧化作用與細胞傷害之食品。於一項具體實施例，該體內鐵離子過多所造成不正常的氧化作用與細胞傷害包括細胞發炎反應、粒線體功能異常及引發細胞凋亡。

根據本發明所呈現的各種實施例，下述各種儀器、裝置、方法和其相關結果者，實施例中為了方便讀者閱讀所使用的標題或副標題，並不被限制在本發明的範圍之內。此外，在此所提出和披露的某些理論，但無論他們是對還是錯，只要該創作是根據本發明所實施的，而不需考慮任何特定的理論或行動的計畫，都應被限制在本發明的範圍之內。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

實施例 實施例一：構樹樹皮半固態發酵產物之水溶性萃取物的製備

將構樹的外層樹皮以手剝下，並置於60℃之對流烘箱中乾燥48小時。然後使用磨碎機將乾燥樹皮碾碎備用。於培養基，以內徑7 mm的打孔器取下含有生長於4℃馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基(potato dextrose agar,PDA)平板上，生長狀態良好之白腐真菌Perenniporia tephropora TFRI707(得自台灣生物寄存中心，寄存編號BCRC930104)菌落外緣處的菌絲的洋菜塊做為接種原。

取八個三角錐瓶，每個瓶中含有70 ml培養基質(每升含有：12.5%(w v^-1)磨碎的乾燥構樹樹皮、0.5克Tween 80、10克葡萄糖、7 ml之320 μM CuSO₄‧5H₂O、1 ml微量元素溶液與60 mM磷酸鈉緩衝液(pH 4.0)，以1M HCl溶液將pH值調整及保持在4.0；微量元素溶液每升含有0.1克Na₂B₄O₇‧10 H₂O、0.01克MnSO₄‧7 H₂O、0.01克CuSO₄‧5H₂O、0.05克FeSO₄‧7 H₂O、0.07克ZnSO₄‧7 H₂O、0.01克MnSO₄‧7 H₂O、0.01克(NH₄)₆Mo₇O₂₄‧4H₂O)。此含構樹樹皮的培養基先以高溫高壓滅菌30分，放冷後於每個瓶中接種20個含菌絲的洋菜塊(直徑7 mm)，平均放置於構樹樹皮削上；並於30℃下進行半固態培養30天)。

於培養期間，每天以長的拋棄式pipet收集0.5 ml沉積於瓶底之培養液(extracellular fluid)(其中包含真菌細胞分泌到胞外的液體)，並取樣檢驗其中的漆化酵素(laccase)活性。當所測之漆化酵素活性分別達到約50U ml^-1、100U ml^-1、150U ml^-1及200U ml^-1時，各收取兩瓶全部的細胞外液體。

先收集瓶底的培養液，然後將樹皮殘餘物以70ml之60mM磷酸鈉緩衝液(pH 4.0)洗兩次。將收集到的細胞外液體與洗液匯集，然後將其過濾，再於8000g下離心15分鐘使其澄清。將所得之澄清濾液以離子交換管柱(DEAE Sepharose Fast,GE Healthcare,USA)，及分子量截斷點為5kDa之Amicon過濾膜(Millipore,USA)進行純化與濃縮。將經過濃縮之澄清濾液於室溫下乾燥並稱重。經30天培養期，可溶性萃取物(此水溶性化合物可包含真菌萃取物)之產量為約0.8-2.2%(乾重，克/克)。

實施例二：水溶性萃取物之酚類化合物與類黃酮素含量測定

以Folin-Ciocalteu法測定每一水溶性萃取物樣本中所含之酚類化合物總量(Spanos與Wrolstad,1990,J.Agric.Food Chem.38,1565-1571)。將酚類化合物總量對五倍子酸標準化，而以mg/克五倍子酸當量(GAE)表示。所有測試皆進行三重複組。圖1列示酚類化合物總量對五倍子酸之標準曲線。

每一水溶性萃取物樣本之類黃酮素含量，係藉由比色法測定得。將類黃酮素含量對槲皮素標準化，而以mg/克槲皮素當量表示。圖2列示類黃酮素總量對槲皮素之標準曲線。

參照表1得知，於30天培養期間，水溶性萃取物中的酚類化合物總量從89.3mg g^-1減少至61.6mg g^-1(五倍子酸當量)，而類黃酮素含量亦從5.26mg g^-1減至2.75mg g^-1(槲皮素當量)。

表1. 水溶性萃取物之酚類化合物及類黃酮素含量分析

實施例三：水溶性萃取物之生物活性分析 ABTS自由基清除能力

於20℃下，使用Boeriu等人所述之方法(Boeriu等人,2004,Ind. Crops Prod. 20,205-218)進行ABST自由基清除活性分析。ABTS自由基係在有H₂O₂存在之條件下，於不含氧之溶液中經由過氧化酶作用產生。反應的開始是，將44 U過氧化酶溶液(體積為75 μl)加入3.0 ml含有1 mM ABTS與0.5 mM H₂O₂之反應混合物中，並將其靜置反應1小時。於734 nm之波長下，以分光光度法及時檢測ABTS自由基因為與抗氧化劑作用而消失的量。自由基清除活性係以，每分鐘ABTS自由基被1 mg抗氧化劑清除之量(μmol)表示。

將本發明萃取物之ABTS自由基清除能力與水溶性維生素E類似物trolox(託弱斯)的清除能力進行比較，而抑制百分比以下列算式計算：

ABTS自由基清除活性

(%)=[(Abs_對照組-Abs_樣本)/Abs_對照組] x 100%

其中Abs_對照組為ABTS自由基乙醇溶液的吸光值；Abs_樣本為ABTS自由基溶液與萃取物/標準物樣本混合的吸光值。所有測定接以三重複進行(n=3)。

DPPH自由基清除能力

原則上以Yen與Hsieh所述之方法(Yen與Hsieh,1997,Biosci. Biotechnol. Biochem. 61,1646-1649)，藉由分光光度計測量DPPH甲醇因抗氧化劑活性而造成之減少量，但有些許改變。簡述之，於96-孔微量平盤中，將100 μl各種濃度之樣本或100%甲醇(為陰性對照組)；0.23、0.18、0.14、0.09與0.05 mM trolox(為陽性對照組)或空白試樣(為背景扣除值)，於室溫下和100 μl之0.1 mM DPPH溶液置於暗室中反應20分鐘。使用UV-VIS微量平盤讀數器(BioTek,USA)，於517 nm波長下測量吸光值。結果以自由基被清除50%時之萃取物濃度(EC₅₀)表示。所有測試皆進行三重複組。

抑制百分比以下列算式計算：%清除活性=(1-(樣本-樣本背景)/(對照組-空白試樣))×100，其中對照組與樣本分別係指對照組(不含樣本之DPPH溶液)，及測試樣本(DPPH溶液加測試樣本或陽性對照組)之吸光值。

參見表1，本發明可溶性萃取物對ABTS清除能力之EC₅₀為603 mg g^-1至4477 mg g^-1；而對DPPH清除能力之EC₅₀為142 mg g^-1至2568 mg g^-1。此等自由基清除能力與類黃酮素含量有良好關連性(r²=0.958,r²=0.858)。

還原能力

本發明水溶性萃取物之還原能力，係根據Oyaizu所述之方法(Oyaizu,1986,Japan. J. Nutri. 44,307-315)進行測定。將不同劑量(50、100及250 μg)溶於200 μl蒸餾水之可溶性萃取物，和200μl磷酸鹽緩衝液(0.2 M,pH 6.6)與200 μl鐵氰化鉀(1%)混合。將混合物於50℃下培育20分鐘後，再置於冰水中冷卻3分鐘。接著將200 μl TCA(10%)加入該混合物中，然後於1000×g下離心10分鐘。將溶液上層(100 μl)與蒸餾水(100 μl)及FeCl₃(20 μl,0.1%)混合，並經過反應10分鐘後，於700 nm波長下以分光光度計測量吸光值。使用Trolox做為標準化合物。所測得反應混合物之吸光值越高，表示其還原能力越大。

水溶性萃取物之生物活性分析結果，統整於表2。

表2.　水溶性萃取物之生物活性分析

由表2之結果顯示，隨著真菌分泌到細胞外之液體中之漆化酵素活性增加，所得可溶性萃取物的還原能力逐漸減低(0.233-0.024)。吾等之結果亦顯示，還原能力與類黃酮素含量(r²=0.986)，及與酚類化合物總含量(r²=0.834)皆有良好關連性。基於前述結果，類黃酮素含量可能直接和本發明水溶性萃取物之抗氧化作用有關。

酪胺酸酶抑制活性

酪胺酸酶抑制分析主要是依Karioti等人所述之方法(Karioti等人,2007,Bioorg. Medic. Chem. 15,2708-2714)完成。使用1-酪胺酸做為測定酪胺酸酶抑制活性的受質。將100微升200單位ml^-1之菇類酪胺酸酶溶液(溶於20 mM磷酸鹽緩衝液,pH 6.8)，與1 ml適當不同濃度的樣本混合於微量平盤中。將分析混合物於室溫下進行預-培養10分鐘，然後將1 ml溶於20 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.8)之2 mM 1-酪胺酸溶液加入，接著再於室溫下靜置培育30分鐘。

以微量平盤讀數器，於波長475 nm下測量所形成的多巴色素量。使用最終濃度為0.35、0.28、0.21、0.14、0.11及0.07 mM之麴酸做為標準酪胺酸酶抑制劑。所有測試皆進行三重複組，且數據以酪胺酸酶活性之抑制百分比(±1平均值標準偏差；SEM)表示，其計算公式如下：

酪胺酸酶活性之抑制%=(A-B)-(C-D)/(A-B)×100%

其中A為不含測試化合物之反應混合物(酪胺酸酶+酪胺酸)的吸光值，B為空白對照組(只含有酪胺酸)之吸光值，C為含有測試化合物之反應混合物(酪胺酸酶+酪胺酸+測試化合物)的吸光值，而D為空白樣本(酪胺酸+測試化合物)之吸光值。至於對照組之空白試樣，係將酪胺酸酶溶液與1-酪胺酸溶液置換成20 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.8)。

結果顯示(參見上表2)，在半固態發酵期間或是隨著細胞外液體中之漆化酵素活性增加，可溶性萃取物的酪胺酸酶抑制能力亦增加，EC₅₀值從2.678 mg ml^-1變為0.706 mg ml^-1。

施例四：水溶性萃取物之金屬螯合活性及細胞毒性分析 金屬螯合活性評估

將100 μl不同濃度(0.2、0.4、0.8、1.6及3.2 mg/ml)之可溶性萃取物樣本，與5 μl 2m M FeCl₂加至微量平盤的孔中。藉由添加15 μl 5 mM ferrozine而開始反應，將混合物劇烈搖晃，之後令其於室溫、黑暗下靜置10分鐘。待混合物達到平衡後，於562 nm波長下以分光光度計測量吸光值。以下列公式計算出ferrozine-Fe2⁺複合物形成之抑制百分比：%抑制=(A₀-A₁)/A₀×100，其中為對照組之吸光值，而為有本發明萃取物/標準物(Glcin等人,2003,Ach. J. Ethnopharmacol. 79,325-329)存在下所測得之吸光值。使用Na₄EDTA為陽性對照組。

於半固態發酵期間所得之可溶性萃取物，都具有顯著高的Fe²⁺鐵離子螯合活性(EC₅₀<2 μg ml^-1)。此數值相較於一般認為優良的鐵離子螯合劑EDTA-Na₄(其於之濃度下螯合能力可達99.8%)，本發明之水溶性萃取物的EC₅₀值僅為EDTA溶液之11.1%以下，表示其Fe²⁺鐵離子螯合活性顯著優於EDTA。

以MTT分析測定細胞毒性

大鼠神經膠質瘤細胞株(rat glioma cell line) C6於含有10%胎牛血清、10 μg ml^-1青黴素、10 μg ml^-1鏈黴素與10 μg ml^-1新黴素之完整基礎培養基中，於37℃含有5% CO₂之濕潤大氣下進行培養。用於活體外實驗，係將細胞再懸浮於於含有10%胎牛血清、10 μg ml^-1青黴素、10 μg ml^-1鏈黴素與10 μg ml^-1新黴素之完整DMEM培養基中。

細胞毒性評估之原理係基於，活細胞之線粒體中的乳酸脫氫酶(LDH)能夠代謝還原MTT，同時在細胞色素C的作用下，生成藍色(或藍紫色)不溶於水的甲醇，其可以在570 nm波長下以分光光度計測定(Mosmann,1983,J. Immunol. Methods 65,55-63)。

將100微升神經膠質瘤細胞株C6細胞(濃度為2×10⁴細胞/孔)接種於96-孔微量平盤，然後於37℃下培養4-6小時，以使細胞恢復並附著於平盤表面。然後將150 μl濃度不同之樣本(溶解於含有2%胎牛血清之DMEM培養基)混合入各孔中，將細胞於37℃下培養48小時，並於培養之最後4小時將100 μl溶於PBS之12 mM MTT試劑添加至細胞。接著攪動平盤使甲醇結晶溶解。以微量平盤讀數器，於波長570 nm下測量已溶解之甲醇的吸光值。

由實驗結果(圖3)得知，本發明水溶性萃取物之有效細胞毒性濃度為56.0-200 μg ml^-1，且其毒性依酚類化合物總含量降低其毒性亦降低。於是，從適當半發酵時期收集的胞外液萃取之水溶性萃取物有有效Fe²⁺鐵離子螯合濃度外亦具有很低的細胞毒性，故可應用於製備有效且低毒性的鐵螯合劑組合物，及/或應用在製備具有效降低體內鐵離子含量，以治療或預防因鐵離子過高所造成之疾病的醫藥組合物。

其他具體態樣

本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。

從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。

圖1為酚類化合物總量對五倍子酸之標準曲線。圖中所示吸光值(ABS)為三重複實驗的平均值。

圖2為類黃酮素總量對槲皮素之標準曲線。圖中所示吸光值(ABS)為三重複實驗的平均值。

圖3列示以MTT分析測定本發明水溶性萃取物之細胞毒性的結果。

Claims (10)

1. 一種製備分離自構樹樹皮以白腐真菌進行半固態發酵之產物之水溶性萃取物的方法，該方法包含下列步驟：將經過乾燥、磨碎之構樹樹皮(10~12.5%(w v^-1))與50~60mM緩衝溶液(pH 4.0~6.5)、0.1~0.4mM的CuSO₄˙5H₂O溶液、0.01~1.0%(w/v)Tween 80、1ml/L微量元素溶液、以及10~30g/L葡萄糖製成半固態培養基；將白腐真菌Perenniporia tephropora TFRI707接種於該半固態培養基；將該已接種白腐真菌Perenniporia tephropora TFRI707之培養物靜置於30~35℃之恆溫室中，不照光培養13~30天；收集胞外液(extracellular fluid)，並將樹皮殘餘物以60mM磷酸鈉緩衝液(pH 4.0)萃洗；將該胞外液(extracellular fluid)與洗液匯集，並過濾、離心而得澄清溶液；以及將該澄清溶液以離子交換管柱進行純化，而得到水溶性萃取物。
2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝溶液係為磷酸緩衝溶液、草酸鹽緩衝溶液、丙二酸鹽緩衝溶液及酒石酸鈉緩衝溶液其中之一。
3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該半固態培養基(每升)含有：12.5%(w v^-1)磨碎的乾燥構樹樹皮、0.5克Tween 80、10克葡萄糖、10ml之32μM CuSO₄˙5H₂O、1ml/L微量元素溶液與60mM磷酸鈉緩衝液(pH 4.0)。
4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該微量元素溶液每升含有0.1克Na₂B₄O₇˙10 H₂O、0.01克MnSO₄˙7 H₂O、0.01克CuSO₄˙5H₂O、0.05克FeSO₄˙7 H₂O、0.07克ZnSO₄˙7 H₂O、0.01克MnSO₄˙7 H₂O、0.01克(NH₄)₆Mo₇O₂₄˙4H₂O)。
5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該白腐真菌Perenniporia tephropora菌株之接種比例為每70mL培養基加入20塊直徑7mm菌絲塊。
6. 一種根據申請專利範圍第1項之製備分離自構樹樹皮以白腐真菌進行半固態發酵之產物之水溶性萃取物的方法所製得之水溶性萃取物，其含有酚類化合物總量為61.6-89.3mg g^-1(五倍子酸當量)及類黃酮素含量為2.75-5.26mg g^-1(槲皮素酸當量)；且具有ABST自由基與DPPH自由基清除能力、Fe³⁺還原能力(0.024-0.233)、酪胺酸酶抑制能力(EC₅₀=706-2768μg ml^-1)，以及強的Fe²⁺鐵離子螯合活性(EC₅₀<0.2μg ml^-1)與低的細胞毒性(EC₅₀=260μg ml^-1)。
7. 一種Fe²⁺鐵離子螯合劑組合物，其包含根據申請專利範圍第6項之水溶性萃取物。
8. 根據申請專利範圍第7項之Fe²⁺鐵離子螯合劑組合物，其係用於製備用以治療因體內鐵離子過多所造成之疾病的醫藥品。
9. 根據申請專利範圍第7項之Fe²⁺鐵離子螯合劑組合物，其係用於製備用以預防體內鐵離子過多所造成不正常的氧化作用與細胞傷害之食品。
10. 根據申請專利範圍第9項之Fe²⁺鐵離子螯合劑組合物，其中該體內鐵離子過多所造成不正常的氧化作用與細胞傷害包括細胞發炎反應、粒線體功能異常及引發細胞凋亡。