TWI487911B - 活體外檢測膀胱癌之方法 - Google Patents

Description

活體外檢測膀胱癌之方法

本發明係關於一種癌症檢測方法，詳言之，係關於一種用以活體外檢測膀胱癌之生物指標、方法及系統。

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，好發於男性中老年人，膀胱癌之五年平均存活率為60%左右，但因腫瘤之再發率高，導致膀胱癌病程延長，且生活品質不佳。

初期之膀胱癌難以診斷，病患通常遲至發生癌症病變的組織壞死或血管糜爛引起出血，造成無痛性血尿方才就醫，約80%的膀胱癌病人都因出現血尿症狀才接受檢查。

然而目前臨床上所採之膀胱癌檢測為使用膀胱鏡，此為一種侵入性檢測方式，對於病患而言是一項極為痛苦的檢查方式，且影響病患之檢查意願，而不利於診斷。因此，開發體外檢測膀胱癌之生物指標乃為目前臨床上重要之課題，van Rhijna等人(Bas W.G.van Rhijna,Henk G.van der Poelb,Theo H.van der wastc“Urine Markers for Bladder Cancer Surveillance：A Systematic Review”European Urology，2005，47，736)揭示多種檢測膀胱癌的生物指標或檢測系統，例如：BTAstat、BTAtrak、NMP22、FDP、ImmunoCyt^TM 、流式細胞儀、Quanticyt^TM 、血紅素試紙(Hb-dipstick)、LewisX、螢光原位雜交(FISH)、端粒酶(Telomerase)、微隨體(Microsatellite)、CYFRA21-1、UBC、細胞角質蛋白20(Cytokeratin 20)、BTA、TPS及細胞學檢查(Cytology)；其中CYFRA21-1(85%)、細胞角質蛋白20(85%)及微隨體分析(82%)之偵測靈敏度高；而細胞學檢查(94%)、BTA(92%)及微隨體分析(89%)之特異性高，然而前述生物指標或檢測系統皆不能完全取代膀胱鏡的診測，臨床上仍需開發其他生物指標，以期減少膀胱鏡的使用頻率，提高檢測之準確度並減輕病患之痛苦。

β2微球蛋白(β2-Microglobulin)係為一小分子球蛋白，其由99個胺基酸所組成，平均分子量約為11,731 Da，目前已知存在於所有有核細胞的細胞膜表面，並大量存在於淋巴增殖系統的細胞中。β2微球蛋白由於分子結構小，易通過正常腎絲球濾過膜，但99.8%以上在近端小管可被重吸收及分解代謝，僅一小部份的β2微球蛋白會被排到尿液中，因此現今臨床上β2微球蛋白常用來鑑別診斷腎絲球或腎小管病變，例如腎絲球過濾障礙之患者，其因血液中的β2微球蛋白無法排至尿液中，於血中濃度升高，尿液中β2微球蛋白濃度降低。另一方面，若是近端腎小管發生病變，例如重金屬中毒或是抗生素的副作用等，則無法將β2微球蛋白再吸收而大量排至尿中，使得尿液β2微球蛋白上升。再者，在多發性骨髓瘤、淋巴增殖相關的癌症、慢性淋巴球白血病發生時，可觀察到β2微球蛋白的合成增加，亦導致血液中濃度大量上升，使腎絲球濾過量超過腎小管重吸收能力，此時尿液中β2微球蛋白也會升高。

除上述檢測上之指標外，β2微球蛋白亦可作為自體免疫疾病及器官移植排斥反應之相關指標，利用對血液及尿液的β2微球蛋白分別測定，共同協助疾病的診斷。目前針對體液中β2微球蛋白的研究仍然不斷進行，已知β2微球蛋白的含量與幾種癌症相關，但目前為止仍未有研究指出尿液中的β2微球蛋白與膀胱癌的關連性。

發明概述

本發明之目的在於提供一種快速檢測膀胱癌之生物指標，可避免習知技術使用膀胱鏡檢測之痛苦，並提高診斷之正確性。

根據本發明之生物指標，其包含β2微球蛋白或其片段。

本發明之另一目的在於提供一種活體外檢測膀胱癌之方法，其包含檢測一檢體中是否包含前述之生物指標。

本發明之再一目的在於提供一種用以檢測膀胱癌之系統，其係檢測前述之生物指標，其包含一可抓取包含β2微球蛋白或其片段之單元，及一可檢測β2微球蛋白或其片段之單元。

發明詳細說明

本發明提供一種活體外檢測膀胱癌之生物指標，其包含β2微球蛋白或其片段。

現今β2微球蛋白雖已報導可作為腎絲球或腎小管病變及腎功能之相關生物指標，然而並未揭示β2微球蛋白與膀胱癌的關連性，本發明提供β2微球蛋白可作為檢測膀胱癌之指標，並提供一新穎且具進步性之檢測方法。由於此生物指標的特異性為87.5%，靈敏度為76.9%，可做為一有效的膀胱癌的生物指標。

根據本發明，完整之β2微球蛋白可作為檢測膀胱癌之生物指標，但於臨床應用上，本發明之一具體較佳實施態樣為以β2微球蛋白片段作為生物指標，其係考慮完整之蛋白之檢測操作較為繁複，或考慮檢測之正確性，而以較易操作之片段作為生物指標，並可提高檢測之正確性。於本發明之一較佳具體實施例中，β2微球蛋白之片段係選自由以蛋白酶消化分解β2微球蛋白所得之片段、化學消化劑分解β2微球蛋白所得之片段及包含抗原決定部位(epitope)之片段所組成之群。

最常用於將蛋白質消化成胜肽片段為使用蛋白酶，例如具特異性切點之胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)、Lys-C蛋白酶、Lys-N蛋白酶、Asp-N蛋白酶或Arg-C蛋白酶；另有具非特異性切點之枯草溶菌素(Subtilysin)、胃蛋白酶(pepsin)、蛋白分解酶K(proteinase K)及鍊黴蛋白酶(pronas)。

另一方面，蛋白質亦可以化學消化劑分解，例如使用溴化氰(cyanogen bromide)分解，再者，酸及鹼亦可以消化分解蛋白質，並產生片段。

較佳地，根據本發明之β2微球蛋白片段係為包含抗原決定部位之片段，該片段係為抗體辨識之部位，可便於利用各式免疫檢測技術以檢測該生物指標。

本發明另提供一種活體外檢測膀胱癌之方法，其包含檢測一檢體中是否包含前述之生物指標。

根據本發明之檢體係為取自人體但已與人體分離之組織，較佳地，該檢體係選自由膀胱組織、血液及尿液所組成之群。為方便檢測，更佳地，該檢體係為尿液。

較佳地，根據本發明之檢體係經酸化處理。於本發明之一較佳具體實施例中，係將尿液與同體積的飽和α-CHC(4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid)溶液混合，再進行後續檢測。

根據本發明，本發明所屬技術領域中具通常知識者可應用蛋白質檢測技術以檢測該檢體中是否包含該生物指標之方法。於本發明之一較佳具體實施例中，該檢測方法係選自由質譜儀檢測、抗體檢測、層析檢測、電泳檢測、親和性濃縮檢測所組成之群。

於本發明之一具體實施例中，其係使用質譜儀檢測，其除可檢測具特定分子量之根據本發明之生物指標，並可應用於定量，例如以質譜儀為基礎的相對定量(ICAT、iTRAQ、SILAC等)或絕對定量(穩定同位素稀釋(stable isotope dilution)、AQUA、PSAQ、QconCAT、label-free等)方法，可以分析出檢體中β2微球蛋白含量是否有升高的現象。較佳地，該質譜儀係為介質輔助雷射脫附游離飛行式質譜儀(matrix-assisted laser desorption inoization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF)，其可準確檢測蛋白質類大分子。

於本發明之一較佳具體實施例中，其係利用免疫學之抗體檢測該生物指標，例如讀取光譜吸收值之酵素連結免疫吸附法(Enzyme-linked Immuno-Sorbent Assay，ELISA)、結合螢光光譜之螢光免疫檢測法及放射免疫分析法檢測。

另一方面，利用層析及電泳等各式分離法、各式親和濃縮法，結合質譜儀及生物資訊資料庫，亦可進行β2微球蛋白之檢測。再者，利用二維凝膠電泳(2-D PAGE)及螢光染劑標示二維凝膠電泳(2-D DIGE)等方法亦可直接檢測檢體中β2微球蛋白之含量。

根據本發明之方法，其另包含自該檢體濃縮蛋白質之步驟，本發明所屬技術領域中具通常知識者可應用蛋白質濃縮技術於本發明中。

根據本發明之方法，其另包含利用疏水基親和性初步抓取蛋白質之步驟。由於β2微球蛋白係屬疏水性蛋白質，可利用該特性初步抓取。

根據本發明之方法，其另包含利用電泳初步篩選蛋白質之步驟，本發明所屬技術領域中具通常知識者可應用電泳技術於本發明中。

於本發明之一較佳具體實施例中，該檢測膀胱癌之方法包含下列步驟：

(a)提供一載體及連結於該載體之疏水基；

(b)將該疏水基與該檢體接觸，以使該檢體中具疏水基親和性之蛋白質與該疏水基結合；

(c)移除該檢體中未與該疏水基結合之蛋白質；及

(d)以質譜儀分析與該疏水基結合之蛋白質。

根據本發明之方法，其中該載體係選自由載玻片，及層析管柱所組成之群，該載體係作為一固體承載，用以連結疏水基，並利於後續之操作，於本發明之一較佳具體實施例中，該載體係為載玻片，並據以作為一生物晶片，方便操作，並可用以後續之質譜儀分析。

根據本發明之方法，其中連結於該載體之疏水基可為本發明所屬技術領域中具通常知識者可決定者，較佳係為C₁₈ H₃₇ Cl₃ Si。

本發明亦提供一種用以檢測膀胱癌之系統，其係檢測前述之生物指標，其包含一可抓取包含β2微球蛋白或其片段之單元，及一可檢測β2微球蛋白或其片段之單元。

根據本發明之系統，其中該可抓取包含β2微球蛋白或其片段之單元較佳係為可實施前述利用疏水基親和性初步抓取蛋白質之步驟或利用電泳初步篩選蛋白質之步驟之裝置及/或試劑。

根據本發明之系統，其中該可檢測β2微球蛋白或其片段之單元較佳係選自由質譜儀、抗體、層析管柱檢測、電泳、親和性濃縮試劑所組成之群，其係應用於檢測該生物指標，詳如前述方法所言。

根據本發明之系統，其另包含可自該檢體濃縮蛋白質之單元，係為可實施前述自該檢體濃縮蛋白質之步驟之裝置及/或試劑。

本發明主要是開發活體外檢測膀胱癌的生物指標，於本發明之一較佳具體實施例中，以簡易的晶片抓取方法，結合質譜儀的快速偵測，提供一個診斷膀胱癌的新策略。有別於侵入性極大的傳統診斷方法，本發明選擇毫無侵入性的活體外檢體，大大減低病患受檢時所承受的痛苦，加上靈敏度及精確度極高的質譜法，更可以增加診斷的正確性，應用至臨床醫學檢驗為病患之一大福音。

茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯並不意味本發明僅侷限於此等實例所揭示之內容。

製作生物晶片的流程

以乙醇清洗市售的載玻片表面，並以10 mL的食人魚溶液(Piranha solution)氧化載玻片表面，使其形成表面帶有－OH官能基的玻片。接著配製1%的C₁₈ H₃₇ Cl₃ Si於異丙醇中，取3 mL置於前述處理過的玻片上，並於室溫下反應3小時。反應完成之後，大部分溶劑揮發，大量的白色粉末會沉積在蓋玻片上，用異丙醇清洗表面3次(每次搖晃5分鐘)，以去除未作用的C₁₈ H₃₇ Cl₃ Si固體，清洗步驟完畢後將蓋玻片風乾，待異丙醇揮發後可觀察到生物晶片的表面覆蓋了一層薄薄的白色粉末，即可製得生物晶片。

抓取生物指標的流程

將尿液與同體積的飽和α-CHC溶液混合，取500 μL置於晶片上放置45分鐘進行生物指標的抓取，再以二次去離子水進行清洗作用時間約45分鐘，與晶片表面的化學官能基親和性高的蛋白質會被抓取。接著再以約兩毫升的去離子水清洗3次(5分鐘/次)，去除親和性較弱的蛋白質及雜質，靜置乾燥之後用導電膠帶固定於基質輔助雷射脫附游離質譜儀之樣品盤上，進行質譜分析。

質譜偵測

以MALDI-TOF質譜儀的線性模式(linear mode)進行偵測，檢視質譜圖中有無m/z 11.7 kDa之訊號，若有此訊號即代表晶片自尿液檢體中抓取到β2微球蛋白，即本發明之生物指標，其結果示於圖1。

病人與正常人之比較結果示於下表1：

由結果可知，此生物指標的特異性為87.5%，靈敏度為76.9%。

生物指標之鑑定

將體積為600 μL的尿液利用上述實驗步驟萃取後，利用ACN/H₂ O=1/1溶液將留在生物晶片上的之分析物萃取至離心瓶中，經過離心的步驟後取出上清液，最後以真空濃縮機將此溶液濃縮至粉末狀。

接著進行酵素水解，其將上述粉末以體積為20 μL、濃度為50 mM的NH₄ CO₂ 溶液回溶，基於萃取下來的溶液含有基質(CHC)其pH值偏酸性，在酸性環境下不適合酵素反應的因素，再加入2%的NH₄ OH，目的為將pH質調整至約8.0。接著加入體積為1μL、濃度為1mg/mL的酵素，在溫度為57度的水浴鍋中硝化三十分鐘後，送入質譜儀(MALDI-MS)進行胜肽片段的分析，其結果示於圖2，並且與標準品得到的片段進行序列比較，其結果可知，該生物指標確實為β2微球蛋白。

上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

圖1為膀胱癌與正常人之尿液質譜分析比較圖。

圖2為膀胱癌病人(包含新取病人及病人)經酵素水解之尿液及酵素本身之質譜分析比較圖；星號代表經酵素水解之β2微球蛋白片段。

(無元件符號說明)

Claims (3)

1. 一種於活體外檢測膀胱癌之方法，其包含檢測一檢體中是否包含β2微球蛋白(β-2-microglobulin)，其中該檢體係為尿液，其包含下列步驟：(a)提供一載體及連結於該載體之疏水基；(b)將該疏水基與該檢體接觸，以使該檢體中具疏水基親和性之蛋白質與該疏水基結合；(c)移除該檢體中未與該疏水基結合之蛋白質；及(d)以質譜儀分析與該疏水基結合之蛋白質；其中該質譜儀係為介質輔助雷射脫附游離飛行式質譜儀(matrix-assisted laser desorption inoization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF)；及連結於該載體之疏水基係為C₁₈ H₃₇ Cl₃ Si。
2. 根據請求項1之方法，其另包含利用電泳初步篩選蛋白質之步驟。
3. 根據請求項1之方法，其中該載體係選自由載玻片，及層析管柱所組成之群。