TWI480046B - 去殼薏苡子之醇萃取物以治療胃潰瘍及／或胃癌 - Google Patents

Description

去殼薏苡子之醇萃取物以治療胃潰瘍及/或胃癌

本發明係關於去殼薏苡子之醇萃取物之用途；具體言之，係用以治療胃潰瘍及/或胃癌。

胃酸分泌過多(Gastric hyperacidity)與胃十二指腸潰瘍(gastroduodenal ulcers)，均為現今相當常見的疾病，主要發生於胃部與十二指腸前端(Nneli,R. O.;Nwafia,W. C.;Oji,J. O. Niger. J. Physiol. Sci. 2007,22,1-13 )。胃潰瘍的主要病因為幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori )感染(Nneli et al.,2007 )，而飲食習慣不良、抽菸、飲酒過度、服用非類固醇抗發炎藥物(NSAID)，亦會提高罹患胃潰瘍的風險(de Barros,M. P.;Lemos,M.;Maistro,E. L.;Leite,M. F.;Sousa,J. P. B.;Bastos,J. K.;de Andrade,S. F. J. Ethnopharmacol. 2008,120,372-377 )。上述疾病的病理生理學著重於探討壓力過大與胃的防禦機制，如鹽酸製造、黏膜分泌、肝的非蛋白質巰基(NPSH)、血流等(Nneli et al.,2007 )。最近的研究顯示，服用NSAID將促進體內製造活性氧化物(ROS)，進而增加人體的氧化壓力(oxidative stress)(Das,D.;Bandyopadhyay,D.;Bhattacharjee,M.;Banerjee,R. K. Free Radical Biol. Med. 1997,23,8-18 )。活性氧化物對於壓力、酒精、NSAID所引發的急性胃部疾病影響至深(Das et al.,1997 )。此外，活性氧化物常引發細胞膜脂質過氧化，其產生的自由基，將造成DNA受損，甚至產生會致癌的基因突變(Halici,M.;Odabasoglu,F.;Sulayman,H.;Cakir,A.;Aslan,A.;Bayir,Y. Phytomedicine 2005,12,656-662 )。

薏苡(Coix lachryma-jobi L. var.ma-yuen Stapf)子又稱約伯的眼淚(Job's tears)，為中藥材(TCM)之一，長久以來做為抗發炎藥，用於治療疣(warts)、皮膚龜裂(chapped skin)、風溼病(rheumatism)及神經痛(neuralgia)(李時珍著，本草綱目，1596 )。最近一份研究報告顯示，去殼薏苡子(dehulled adlay，DA)可調節大鼠腸道的微生物叢(microbiota)(Chiang,W.;Cheng,C.;Chiang,M.;Chung,K. T. J. Agric. Food Chem. 2000,48,829-832 )，而體外試驗也證實薏苡子具有抗發炎與抗氧化的療效(Lee,M. Y.;Tsai,S. H.;Kuo,Y. H.;Chiang,W. Food Sci. Biotechnol. 2008,17,1265-1271 ;Kuo,C. C.;Shih,M. C.;Kuo,Y. H.;Chiang,W. J. Agric. Food Chem. 2001,49,1564-1570 )。許多不同來源薏苡子中，所含的多種強效成分皆已定量出(Wu,T. T.;Charles,A. L.;Huang,T. C. Food Chem. 2007,104,1509-1515 )。薏苡子可分離出數種酚類抗氧化劑，且萃取出的生物活性成分，在處理過程中皆相當穩定(Hsu,H. Y.;Lin,B. F.;Lin,J. Y.;Kuo,C. C.;Chiang,W. J. Agric. Food Chem. 2003,51,3763-3769 )。採用分析導向進行分離(assay-guided isolation)時，可自薏苡殼(adlay hull，AH)分離出木酚素(Lignan)與酚類化合物(Kuo,C. C.;Shih,M. C.;Kuo,Y. H.;Chiang,W. J. Agric. Food Chem. 2001,49, 1564-1570 )。分離薏苡子的抗發炎成分時，則可分離出黃酮類與數種酚酸化合物(Huang,D. W.;Kuo,Y. H.;Lin,F. Y.;Lin,Y. L.;Chiang,W. J. Agric. Food Chem. 2009,57,2259-2266;Huang,D. W;Chung,C. P.;Kuo,Y. H.;Lin,Y. L.;Chiang,W. J. Agric. Food Chem. 2009,57,10651-10657 ;Chen,H. J.;Chung,C. P.;Chiang,W.;Lin,Y. L. Food Chem. 2011,126,1741-1748 )。研究發現，薏苡種皮(adlay testa，AT)中的酚醇具有抗過敏活性(Chen,H. J.;Shih,C. K.;Hsu,H. Y.;Chiang,W. J. Agric. Food Chem. 2010,58,2596-2601 )，去殼薏苡子與薏苡子麩皮(adlay bran，AB)具有抗發炎活性，能延緩癌症形成(Shih,C. K.;Chiang,W.;Kuo,M. L. Food Chem. Toxicol. 2004,42,1339-1347 ;Li,S. C.;Chen,C. M.;Lin,S. H.;Chiang,W.;Shih,C. K. J. Sci. Food Agric. 2011,91,547-552 )，而阿魏酸(ferulic acid)經深入研究後發現為抗發炎的活性成分(Chung,C. P.;Hsu,H. Y.;Huang,D. W.;Hsu,H. H.;Lin,J. T.;Shih,C. K.;Chiang,W. J. Agric. Food Chem. 2010,58,7616-7623 )。

薏苡子之許多用途雖已經報導，但薏苡子之萃取物之不同應用仍待開發。

於本發明中，不同部位去殼薏苡之萃取物對胃癌細胞株之抗增殖活性係經闡述。同時亦提供去殼薏苡之抗潰瘍活性。本發明為薏苡子對胃保護活性之首次發現。

本發明係提供一種於一個體中治療胃潰瘍及/或胃癌之方法，其包含施予該個體有效量之去殼薏苡子之醇萃取物。

本發明係提供一種於一個體中治療胃潰瘍及/或胃癌之方法，其包含施予該個體有效量之去殼薏苡子之醇萃取物及視需要之醫藥上可接受之載劑或賦形劑。

參考以下對本發明之各態樣、實例、及伴隨相關描述之化學圖式及表格的詳細描述，可更容易地瞭解本發明。在揭示及描述本發明之化合物、組合物及/或方法之前，應瞭解，除非由申請專利範圍另外特別地指出，否則本發明不受限於特定製備方法、載劑或調配物、或將本發明化合物調配成用於局部、經口或非經腸投予之產物或組合物的特定模式，此係由於熟習相關技術之通常知識者非常清楚此等事情是可以加以變化的。亦應瞭解，本文所用之術語僅用於描述特定態樣之目的而不意欲用於限制性本發明之範疇。

除非另外指出，否則如本發明所用之以下術語應解釋為具有以下含義。

範圍在本文中通常表述為「約」一個特定值及/或至「約」另一個特定值。當表述此類範圍時，一態樣為包括一個特定值及/或至另一個特定值之範圍。類似地，當值藉由使用字「約」表述為近似值時，應瞭解特定值可形成另一態樣。另外應瞭解，每一範圍之各端點皆有顯著性，一端點與另一端點既有相關性，亦彼此獨立。

「視情況」或「視情況地」意謂隨後所述之事件或狀況可能發生或可能不發生，且該描述包括該事件或狀況發生之情況及其未發生之情況。舉例而言，「視情況包含藥劑」意謂該藥劑可能存在或可能不存在。

必須指出，除非上下文另外清楚規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一」及「該」包括複數個所指標的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

如本文所用之術語「個體」表示任何動物，較佳為哺乳動物，且更佳為人類。個體之實例包括人類、非人類靈長類動物、齧齒動物、天竺鼠、兔、綿羊、豬、山羊、母牛、馬、狗及貓。

術語如本文所提供之化合物的「有效量」意謂該化合物之量足以提供對所需功能(諸如基因表現、蛋白質功能或誘導特定類型之反應)之所需調節。如下文所指出，確實的需要量將在個體之間有變化，此視個體之疾病病況、身體狀況、年齡、性別、物種及體重、組合物之特性及配方等而定。給藥方案可經調整以誘導最佳治療反應。舉例而言，可每日投予若干分次劑量，或可依治療情形之緊急程度按比例減少劑量。因此，很難指定確實的「有效量」。然而，本發明領域中具有通常知識者使用常規實驗即可確定適當的有效量。

如本文所用之術語「治療」表示逆轉、減輕或改善此術語所適用之病症或病狀、或該病症或病狀之一或多種症狀，或抑制其進展。

如本文所用之術語「載劑」或「賦形劑」係指自身並不為治療劑，而是用作用於將治療劑傳遞至個體之載劑及/或稀釋劑及/或佐劑或媒劑，或添加至調配物中以改善調配物之處理或儲存性質或允許或有助於組合物之劑量單位形成適於經口投予之劑量單位(諸如膠囊或錠劑)的任何物質。適合之載劑或賦形劑為一般熟習製造醫藥調配物或食品之通常知識者所熟知。載劑或賦形劑可包括(舉例而言但不限於)緩衝劑、稀釋劑、崩解劑、黏合劑、黏著劑、濕潤劑、聚合物、潤滑劑、滑動劑、為遮蔽或抵消不良味道或氣味而添加之物質、調味劑、染料、芳香劑及為改善組合物之外觀而添加之物質。可接受之載劑或賦形劑包括檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、碳酸氫鹽緩衝劑、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、碳酸鎂、滑石、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、果膠、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、澱粉、明膠、纖維素物質(諸如烷酸之纖維素酯及纖維素烷基酯)、低熔點蠟、可可脂、胺基酸、尿素、醇類、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亞碸(DMSO)、氯化鈉或其他鹽、脂質體、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或粉末、聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)、及其他醫藥學上可接受之物質。載劑不應破壞治療劑之藥理學活性，且在以足以傳遞治療量之藥劑的劑量投予時應無毒性。

較佳地，該去殼薏苡子之醇萃取物係包含於一組合物中。根據本發明之組合物較佳為食品組合物或醫藥組合物。

該去殼薏苡子之醇萃取物可在食品製造過程中，添加於習用之食品組合物中(亦即可食用之食品或飲品或其前驅物)。幾乎所有之食品組合物皆可添加根據本發明之該去殼薏苡子之醇萃取物。可添加根據本發明之該去殼薏苡子之醇萃取物之食品組合物包含，但不限於糖果、烘焙食品、冰淇淋、乳製品、甜品及風味小點、小吃、肉類替代產品、快餐食品、湯類、麵食、麵條、罐頭食品、冷凍食品、乾製食品、冷藏食品、油脂、嬰兒食品、軟食物、或麵包塗醬或其混合物。

本發明之醫藥組合物可藉由本發明領域中已知之任何方法局部或全身投予，包括但不限於藉由肌肉內、皮內、靜脈內、皮下、腹膜內、鼻內、經口、黏膜或外部途徑投予。適當的投藥途徑、調配方法及投藥時程可由本發明領域中具有通常知識者來決定。在本發明中，醫藥組合物可根據相應投藥途徑以多種方式調配，諸如液體溶液、懸浮液、乳液、糖漿、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物、散劑、顆粒、安瓿、注射液、輸注液、套組、軟膏、洗劑、擦劑、乳膏或其組合。在必要時，其可經滅菌或與任何醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合，其中有許多醫藥學上可接受之載劑或賦形劑已為一般技術者所知，例如參見[實施方式]第10段。

於本發明之一較佳具體實施例中，該去殼薏苡子係進行氣相層析/質譜儀(Gas Chromatography/Mass Spectrometer，GS/MS)分析。此氣相層析係以arian450-GC進行；該質譜儀係為Varian240-MS；該管柱為VarianVF-5ms 30 m×0.25 mm(I.D. 0.25 μm)。溫度程式為150℃進行5分鐘；以10℃/分鐘之速率加熱至200℃，並進行20分鐘；以10℃/分鐘之速率加熱至280℃，並進行25分鐘。如圖1所示，該圖譜於下列滯留時間包含峰：約13.581分鐘、約19.237分鐘、約19.334分鐘、約19.435分鐘、約19.799分鐘、約37.75分鐘、約38.05分鐘、約48.504分鐘及約48.819分鐘(如表1所示)。

於本發明之一較佳具體實施例中，該去殼薏苡子係進行高效液體層析(high performance liquid chromatography，HPLC)分析。該管柱為反相C18管柱(250×4.6 mm i.d.;YMC Co.,INC)。管柱溫度為40℃。該層析係於280 nm及320 nm萃取。該流動相使用A溶液：5%醋酸於水中；B溶液：5%醋酸於水中/100%乙腈(1:1，v/v)。沖提梯度程式示於表2。如圖2所示，該圖譜於下列滯留時間包含峰：約7.5分鐘、約12.1分鐘、約14.4分鐘、約16.1分鐘、約19.799分鐘、約16.8分鐘、約18.9分鐘、約23.3分鐘及約29.1分鐘。

該去殼薏苡子包含麩皮(bran)及胚乳(endosperm)，因此，根據本發明之去殼薏苡子之醇萃取物較佳係包含薏苡麩皮之醇萃取物及薏苡胚乳之醇萃取物。自去殼薏苡子取得麩皮及胚乳之方式為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知。

於本發明之一較佳具體實施例中，該去殼薏苡子之醇萃取物係為去殼薏苡子之乙醇萃取物。

於本發明之一較佳具體實施例中，該方法包含施予該個體有效量之去殼薏苡子之醇萃取物之乙酸乙酯(ethyl acetate)分液(fraction)。

於本發明之一較佳具體實施例中，該方法包含施予該個體有效量之薏苡麩皮之醇萃取物之乙酸乙酯分液。

於本發明之一較佳具體實施例中，該方法包含施予該個體有效量之薏苡麩皮之醇萃取物之正丁醇(n-butanol)分液。

於本發明之一較佳具體實施例中，該方法包含施予該個體有效量之薏苡胚乳之醇萃取物之乙酸乙酯分液。

於本發明之一較佳具體實施例中，該去殼薏苡子之醇萃取物係由包含下列步驟之製備方法所製備：

(a)提供去殼薏苡子；

(b)將該去殼薏苡子切成小塊；及

(c)以醇萃取步驟(b)之小塊以提供該萃取物。

本文中所言之「去殼薏苡子」乙詞係指不具有殼、種皮(testas)、外皮(coverings)、外殼(shells)或荚(pods)之種子。自薏苡子中去除殼、外皮、外殼或荚之方式係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知。若需要，進一步自去殼薏苡子分離麩皮及/或胚乳。

本發明所言之薏苡子並無特殊限定，較佳地，該薏苡係屬於禾本科(Gramineae family)、黍亞科(Panicoideae sub-family)、薏苡屬(Coix species)，或薑目(Poales order)、早熟禾科(Poaceae family)、薏苡屬。更佳地，該薏苡為Coix lachryma-jobi 、Coix lachryma-jobi L.,Coix lachryma-jobi L. var.ma-yuen Stapf、Coix agrestis Lour. ,Coix arundinacea Lam. 、Coix exaltata Jacq. 或Coix lacryma L. 。

根據本發明之製備方法，於步驟(b)前該去殼薏苡子較佳係經乾燥。

於本發明之一較佳具體實施例中，步驟(b)進一步包含將該小塊攪碎為粉末。切塊及/或攪碎之方式為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知。

本文中所言之「去殼薏苡子之醇萃取物」乙詞係指以乙醇溶液萃取種子所得之去殼薏苡子萃取物。以一溶液萃取種子之方式為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知。於本發明之一較佳具體實施例中，該去殼薏苡子係浸於一醇溶液中以供萃取。

該去殼薏苡子及醇溶液之比例(w/v)並無特殊限制，可為約1:1至約1:10；較佳地，約1:3至約1:8；尤佳地；約1:5。

於本發明之一較佳具體實施例中，該醇係選自由甲醇、乙醇、正丙醇(n-propanol)、異丙醇(isopropanol)、正丁醇、異丁醇(iso-butanol)、仲丁醇(sec-butanol)、叔丁醇(tert-butanol)及乙酸乙酯所組成之群。尤佳地，該醇係為甲醇或乙醇；最佳地，該醇為乙醇。該醇溶液較佳為約90%至約99.9%乙醇。

較佳地，該製備方法進一步包含步驟(d)自該萃取物獲得一液體分液，並移除固體。移除固體部份已獲得該液體分液之方法係為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知。

於本發明之一較佳具體實施例中，該去殼薏苡子之醇萃取物之乙酸乙酯或正丁醇分液之製備係為進一步萃取去殼薏苡子之醇萃取物。於本發明之一較佳具體實施例中，該製備方法進一步包含步驟(e)以乙酸乙酯或正丁醇萃取該液體分液。

該去殼薏苡子之醇萃取物及較佳去殼薏苡子之醇萃取物之乙酸乙酯分液係可有效於一個體中治療胃潰瘍及/或胃癌。更佳地，該胃潰瘍係為非類固醇抗發炎藥物引發之胃潰瘍。另一方面，該去殼薏苡子之醇萃取物及較佳去殼薏苡子之醇萃取物之乙酸乙酯分液係可有效抑制胃癌之生長。

以下之非限制性之實例有助於本發明所屬技術領域中具通常知識者實施本發明。該等實例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

實例 材料與方法

藥品及試劑 ：薏苡子購自台灣台中縣農民，於2009年種植，為台中選育4號(Taichung Shuenyu no. 4，TCS4)薏苡(C. lachrymajobi L. var.ma-yuen Stapf)。人類胃腺癌細胞株(AGS cell line)取自台灣新竹市的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center)。3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2氫-溴化四氮(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT)、2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid，TBA)、丁基羥基甲苯(butylated hydroxytolune，BHT)、1,1,3,3-四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetraethoxypropane，TEP)、吲哚美辛(indomethacin)、三氯醋酸(trichloroacetic acid，TCA)、5,50-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(5,50-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB)、阿爾襄藍(alcian blue)、L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-cysteine hydrochloride)、氯化鈉(sodium chloride，NaCl)、鈉磷鎢三元水合物(sodium phosphotungstate tribasic hydrate)、碳酸鉀(potassium carbonate，K₂ CO₃ )、三苯甲基鹼(trizma base)、氯化鎂(magnesium chloride，MgCl₂ )、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)、標準品等分析中使用的試劑，均購自Sigma Chemicals公司(美國密蘇里州聖路易市)。抗生素、胎牛血清(FBS)、Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)培養基等，皆購自GIBCO公司(紐約州格蘭島)。純化過程採用分析級溶劑，包括甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、正己烷(Hex)、乙酸乙酯(EA)、1-丁醇(BuOH)、丙酮(ACE)、二氯甲烷(CH₂ Cl₂ )、二甲基亞碸(DMSO)等體外試驗的儲備溶液，且均購自默克集團(Merck)。

萃取及分餾 ：以研磨機去除薏苡子的殼與種皮，再將去殼薏苡子(DA)、薏苡麩皮(AB)與薏苡胚乳(AE)，研磨成粉，室溫下浸泡於5倍量的95%乙醇(w/v)中48小時。混合萃取液後，於50℃下減壓濃縮而得去殼薏苡子之乙醇萃取液(DAE，去殼薏苡子之2.35%)、薏苡麩皮乙醇萃取液(ABE，薏苡子麩皮之8.09%)與薏苡胚乳乙醇萃取液(AEE，薏苡子胚乳之2.65%)。遵照已發表的文獻，將薏苡子麩皮乙醇萃取液加水混合成懸浮液後，再依序以正己烷、乙酸乙酯與正丁醇分配萃取，取得溶於正己烷的成分(ABE-Hex，ABE之60.7%)、溶於乙酸乙酯的成分(ABE-EA，ABE之7.2%)、溶於正丁醇的成分(ABE-BuOH，ABE之4.4%)，與水溶性成分(ABE-H₂ O，ABE之27.2%)(Chung,C. P.;Hsu,H. Y.;Huang,D. W.;Hsu,H. H.;Lin,J. T.;Shih,C. K.;Chiang,W. J. Agric. Food Chem. 2010,58,7616-7623 )。另外，依上述方法取得薏苡子麩皮的甲醇分液(ABM，AB之16.5%)、乙酸乙酯分液(ABM-EA，ABM之14.3%)、正丁醇(ABM-BuOH，ABM之13.7%)(Lee,M. Y.;Tsai,S. H.;Kuo,Y. H.;Chiang,W. Food Sci. Biotechnol. 2008,17,1265-1271 )。

細胞培養與抗增殖分析 ：人類胃腺癌細胞株於DMEM培養基中培養，注入含5% CO₂ 的空氣，溫度保持37℃；DMEM培養基含有10%加熱去活性的胎牛血清、100單位/mL青黴素(penicillin)與100μg/mL的鏈黴素(streptomycin)(Ho,H. H.;Chang,C. S.;Ho,W. C.;Liao,S. Y.;Wu,C. H.;Wang,C. J. Food Chem. Toxicol. 2010,48,2508-2516 )。依前文所述，以細胞存活率分析(MTT assay)法，測定抑制人類胃腺癌細胞增殖的效果(Ho,H. H. et al.,2010 )。待分析檢品溶於DMSO中，而DMSO最終濃度為0.1%。人類胃腺癌細胞於96孔盤(96-well plate)中培養24小時，密度為每孔2×10³ 個細胞。之後將培養基更換為不含胎牛血清的DMEM培養基，再加入各種待分析檢品，將細胞再培養48小時。接著將不含胎牛血清的DMEM培養基中的MT溶液，注入96孔盤上各個孔泂(最終濃度為1 mg/mL)；MTT溶液已使用0.45 mm濾膜過濾。96孔盤於含5% CO₂ 的空氣，溫度保持37℃的環境中培養4小時。移除含未反應染料的培養基。96孔盤的各個孔泂，均加入DMSO(100μL)，以溶解MTT formazan結晶，並測量在570 nm波長的吸光度。細胞的存活率以下列方程式計算：細胞相對存活率(%)=(已處理孔洞的平均吸光度)×100/(未處理孔洞的平均吸光度)。0.1%的DMSO，做為空白媒液。

動物飼料與NSAID誘發的胃潰瘍模型 ：本試驗計畫經台灣大學實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)核准後執行，並自國立台灣大學醫學院的動物中心(台灣台北市)，購入32隻雄性威斯達大鼠(5週大)。本試驗的老鼠均個別於塑膠籠子內飼養，試驗期開始前，餵食AIN-93 M標準配方的飼料(Reeves,P. G. J. Nutr. 1997,127,838S-841S )，並無限量供應水，而飼養室不具致病原，室溫維持在23±2℃，相對溼度維持在50±10%，亮、暗週期均為12小時。試驗飼料的配方替換為前文所述的去殼薏苡子(Hsu,H. Y. et al.,. 2003 ;Shih,C. K. et al.,2004 )。本試驗秤量大鼠的體重，一週記錄2次飼料攝取量。本試驗將大鼠隨機分成4組：一組為空白組(BL)，一組為負調控組(NC)，兩組皆含有8隻大鼠，並餵食AIN-93 M標準配方的飼料；一組為低劑量去殼薏苡子組(LDA)，含有8隻大鼠，餵食以去殼薏苡子替換10% AIN-93 M標準配方的飼料；一組為高劑量去殼薏苡子組(HDA)，含有8隻大鼠，餵食以去殼薏苡子替換30% AIN-93 M標準配方的飼料(表3A)。大鼠均以試驗飼料餵食4週，再禁食36小時。採用修正後的前述方法誘發胃潰瘍(de Barros ,M. P. et al.,2008 )。將30 mg/每公斤體重的吲哚美辛，溶於0.5%之CMC水溶液，用於誘發胃潰瘍，空白組則餵食0.5%之CMC媒液。大鼠餵食吲哚美辛或媒液7小時後，將老鼠犧牲。取出大鼠的胃、肝與血清，儲存於-20℃的環境下，以供進一步研究。

表3：含DA實驗之飲食(A)、體重、飼料轉化效率、肝臟重量(B)於Wistar大鼠之影響

(A)

(B)

測定胃潰瘍指標(UI)、TBA反應物質(TBARS)、NPSH及胃的病理觀察結果 ：執行腹壁切開術取出胃囊前，所有血液皆抽取完畢。以含磷酸緩衝液的生理食鹽水(PBS)沖洗胃囊後，切開並展開胃囊，以便拍照。利用美國國家衛生院(NIH，馬里蘭州Bethesda)開發的影像軟體，測定酸蝕範圍，做為胃潰瘍指標(UI，mm² )(Yoshizawa,M.;Yokoyama,K.;Nakano,Y.;Nakamura,H. Pharm. Soc. Jpn. 2004,124,571-575 )。拍照後，立即以載玻片刮除黏液，之後以10%甲醛固定胃組織，並於4℃的環境中儲存。使用不同濃度的乙醇，去除固定檢體的水分與脂肪，再以石蠟包埋檢體，切為3-4 μm的切片。去除切片中的石蠟，以蘇木紫與伊紅(H&E)將該部位染色，利用光學顯微鏡觀察組織病理變化。將黏液或肝臟組織(0.2g)，加入2 mL含0.002% BHT的0.15 M NaCl溶液，或2 mL的0.02 M乙烯二胺四醋酸二鈉(disodium ethylenediaminetetra acetic acid，EDTA-Na₂ )溶液，以攪拌器混合均勻後，將此均質液置於-20℃的環境中儲存，以待進一步分析。

依前述方式，測定血清與胃黏膜的TBARS(Ohkawa,H.;Ohichi,N.;Yagi,K. Anal. Biochem. 1979,95,351-358 )。簡言之，20 μL的血清與4 mL的1/12 N硫酸水溶液混合後，加入0.5 mL的10%磷鎢酸鈉(sodium phosphotungstate)水溶液，再於室溫下靜置5分鐘，之後以1570 g的轉速離心15分鐘，完成後移除上層液，將4 mL的二次蒸餾(dd)水及1 mL的0.67% TBA溶液，倒入下層的塊狀物混合。檢體置於95℃的水浴中60分鐘。待冷卻後，將5 mL的丁醇加至試驗檢體中，以1570 g的轉速離心15分鐘。以螢光光譜儀(F-4500，日本日立股份有限公司生產)(於515 nm波長激發，於553 nm發出放射線)測定上層液，記錄其吸光度(AU)。同樣地，將0.2 mL的1.15% KCl/3 mM EDTA-Na₂ 、3mL的1% H₃ PO₄ 、0.3 mL的0.3% BHT/乙醇，及1 mL的0.6% TBA溶液，與0.2 mL的胃黏液均質液混合，並旋轉振盪，再將試驗檢體置於100℃的水浴中60分鐘。待檢體冷卻後，加入2 mL丁醇，測量溶於丁醇的成分，在532 nm波長的吸光度。校正曲線由代入TEP溶液的各種濃度後繪出。試驗結果以每公克組織的奈米莫耳數(nanomole)表示。

胃黏液與肝臟中的非蛋白質巰基，以前述方法(Sedlek,J.;Lindsay,R. H. Anal. Biochem. 1968,25,192-205 )測定。簡言之，將1 mL的胃黏液或肝臟均質液，混入0.8 mL的二次蒸餾水及0.5 mL的50% TCA溶液，並旋轉振盪2分鐘，再以1570 g的轉速離心20分鐘。之後將0.5 mL的上層液，混入1.0 mL的0.4M Tris緩衝液(pH 8.9)，並以25 μL的0.01 M DTNB溶液染色。記錄在412 nm波長的吸光度，試驗結果以每公克組織的微莫耳數micromole)表示。

統計分析：所有數值均以平均±標準差(SD)表示。採用變異數分析(ANOVA)與Duncan氏多重範圍檢定(Duncan's multiple-range test)法，分析各組的結果；p值<0.05視為達到統計顯著。

結果與討論

DAE、ABE，及ABE與AEE分液的抗增殖活性 ：評估DA、DAE、ABE、AEE抑制人類胃腺癌細胞增殖的效果。200 μg/mL的DAE可抑制38.5%的人類胃腺癌細胞存活率；以200 μg/mL的ABE治療後，可抑制71.0%的細胞生長，而AEE則可降低細胞活性(圖3)。試驗結果顯示，DA的抗增殖療效主要來自AB分液的抑制活性，也能抑制人類胃腺癌細胞生長。ABE-EA的50%抑制濃度(IC₅₀ )<100 μg/mL，而ABE-BuOH的濃度為200 μg/mL時，可抑制37.9%的細胞生長(圖3)，可見ABE-EA與ABE-BuOH之抑制活性高於其他萃取液。

大鼠以吲哚美辛誘發胃潰瘍後，以DA治療的療效：餵食去殼薏苡子(DA)的大鼠，依前文所述方式，以吲哚美辛誘發胃潰瘍(de Barros,M. P. et al.,2008 )。本試驗修改AIN-93M標準配方(Reeves,P. G. 1997 )，將10%與30%的ANI-93 M標準配方，替換為去殼薏苡子，並加入粗脂肪、粗蛋白質，與不含氮的萃取物(NFE)，確保各試驗組別攝取相同的熱量(Hsu ,H. Y. et al.,2003 ;Shih,C. K. et al.,2004 )(表3A)。經過4週試驗期後，各組的最終體重、攝食量平均值、飼料利用率、肝重量等，並無顯著差異(表3B)。本試驗結果顯示，去殼薏苡子不會延緩大鼠的成長速度。胃潰瘍指標隨餵食去殼薏苡子後降低，抑制程度顯著較NC組大(圖4)。LDA與HAD組的胃表面出血塊，少於NC組，而BL組則無出血塊(圖5)。BL、NC與HAD組的胃囊，以組織病理學的觀察結果評估，結果顯示，NC組的酸蝕情形嚴重，但在餵食去殼薏苡子後，酸蝕情形受到抑制(圖6)。

本試驗分析數項指標，以研究抗潰瘍療效的作用機轉。NC組的血清TBARS濃度，高於BL組，也高於HAD組，但與LDA組的差異並不顯著(圖4)。BL、NC與LDA組的黏膜TBARS差異並不顯著，但HDA組則較低(圖4)。NC組的胃NPSH低於BL組，而對照NC組後，可見去殼薏苡子能將NPSH升高至正常範圍(圖4)。投予吲哚美辛後，肝NPSH並未改變，但HDA組的肝NPSH高於NC組與BL組(圖4)。本試驗的結果顯示，去殼薏苡子可抑制血清與黏膜中的TBARS，也會增加胃與肝的NPSH，意味著去殼薏苡子的抗氧化活性，主要源自於其抗潰瘍活性。

總而言之，本試驗證實去殼薏苡子確實有保護胃部的療效，而去殼薏苡子麩皮抑制人類胃腺癌細胞增殖的活性，高於薏苡子胚乳。此外，去殼薏苡子是透過抗氧化的方式，抑制吲哚美辛誘發的胃潰瘍。

上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

圖1顯示根據本發明之去殼薏苡子之醇萃取物之GS/MS圖譜。

圖1顯示根據本發明之去殼薏苡子之醇萃取物之HPLC圖譜。

圖3顯示DAE、ABE、AEE及ABE之分液在AGS細胞株中之增殖影響。細胞係於具有或不具有測試樣品中培養48 h，並進行MTT分析。結果係表示相對於不接受任何治療之平行培養物，具有測試樣品中存活之細胞比例。每一短線表示平均值+SD(n=3)，且不同標示之短線係顯著不同。(*)與控制組相比，p<0.05。

圖4顯示於吲哚美辛處理之Wistar大鼠中施予DA，對UI、血清及黏膜TBARS與黏膜及肝NPSH之影響。每一短線表示平均值+SD(n=8)，且不同標示之短線係顯著不同。(*)與控制組相比，p<0.05。BL：空白組；NC：負向控制組；LDA：低劑量DA組；HAD：高劑量DA組。

圖5顯示公Wistar大鼠中，以吲哚美辛誘發胃潰瘍之病理改變結果。(A)：空白組；(B)：負向控制組；(C)：LDA組；(D)：HAD組。

圖6顯示Wistar大鼠胃部以H&E染色切片之組織病理觀察結果。(A)：空白組；(B)：負向控制組；(D)：HAD組(左，60×；右，100×)。黑色箭頭係指因潰瘍而產生之侵蝕。

(無元件符號說明)

Claims (15)

1. 一種去殼薏苡子之醇萃取物之用途，其係用以製造治療胃潰瘍及/或抑制胃癌細胞增殖以治療胃癌之藥物。
2. 如請求項1之用途，其中該去殼薏苡子之醇萃取物包含薏苡麩皮(bran)之乙醇萃取物及薏苡胚乳(endosperm)之醇萃取物。
3. 如請求項1之用途，其中該去殼薏苡子之醇萃取物為薏苡麩皮之醇萃取物及薏苡胚乳之醇萃取物。
4. 如請求項1之用途，其中該去殼薏苡子之醇萃取物包含去殼薏苡子之醇萃取物之乙酸乙酯(ethyl acetate)分液(fraction)。
5. 如請求項1之用途，其中該去殼薏苡子之醇萃取物包含薏苡麩皮之醇萃取物之乙酸乙酯(ethyl acetate)分液(fraction)或薏苡麩皮之醇萃取物之正丁醇(n-butanol)分液。
6. 如請求項1之用途，其中該去殼薏苡子之醇萃取物包含薏苡胚乳之醇萃取物之乙酸乙酯分液。
7. 如請求項1之用途，其中該去殼薏苡子之醇萃取物係由包含下列步驟之製備方法所製備：(a)提供去殼薏苡子；(b)將該去殼薏苡子切成小塊；及(c)以醇萃取步驟(b)之小塊以提供該萃取物。
8. 如請求項1之用途，其中該薏苡係為Coix lachryma-jobi L.var.ma-yuen Stapf。
9. 如請求項1之用途，其中該醇係選自由甲醇、乙醇、正丙醇(n-propanol)、異丙醇(isopropanol)、正丁醇、異丁醇(iso-butanol)、仲丁醇(sec-butanol)、叔丁醇(tert-butanol)及乙酸乙酯所組成之群。
10. 如請求項1之用途，其中該醇係為乙醇。
11. 如請求項7之用途，其中步驟(b)進一步包含將該小塊攪碎為粉末。
12. 如請求項7之用途，其中該製備方法進一步包含步驟(d)自該萃取物獲得一液體分液。
13. 如請求項12之用途，其中該製備方法進一步包含步驟(e)以乙酸乙酯或正丁醇萃取該液體分液。
14. 如請求項1之用途，其中該胃潰瘍係為非類固醇抗發炎藥物引發之胃潰瘍。
15. 如請求項1之用途，其係用以抑制胃癌之生長。