TWI448295B - 抗人類泌尿上皮癌之香桂超臨界萃取物、製備方法及用途 - Google Patents

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Description

抗人類泌尿上皮癌之香桂超臨界萃取物、製備方法及用途
本案係關於一種香桂萃取物，尤其是一種香桂超臨界萃取物、製備方法及其用途，該香桂超臨界萃取物可有效對抗人類泌尿上皮癌。
香桂(Cinnamomum subavenium )為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum genus)，為生長於台灣海拔500至1000公尺森林之特有種，又稱為巒大桂(C. randaiense )、山肉桂、土肉桂等。由於其樹皮及葉部均有芳香味，故稱為香桂。由香桂樹皮提煉的精油可作為化妝品之香精原料，而從香桂葉部提煉的葉油則可作為食品、香菸之原料，或作為殺蟲劑。在中藥上，香桂也被用於治療多種病痛，例如胃痛、胸痛、反常疼痛、疝氣、腹瀉、風濕、噁心及嘔吐等。
中華民國專利公開案第200924788號揭示一種殺菌劑組合物，其包含已被用於食品工業及作為抑菌之用的土肉桂精油及其他精油。該篇專利申請案僅揭示將包含土肉桂精油之精油進行調配，但並未揭示土肉桂精油的萃取方式及內含成分。
中華民國專利公開案第200914036號揭示一種驅防鋏蠓之皮膚外用劑，包含土肉桂、檳榔子等主要成分。但並未揭示土肉桂之製備方法或其內含之化合物。
由於先前技術並未揭示香桂之成分及其製備方法，本領域技術人士並無法善用香桂成分於醫療、化妝品等領域。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
本案發明人為了由香桂中萃取各種化合物，且為避免有機溶劑的使用及殘留與減少萃取過程之能源消耗，使用超臨界二氧化碳流體萃取香桂，而獲得以subamolide A為主要成分之多種化合物，香桂超臨界二氧化碳萃取物能有效用於抑制泌尿上皮癌細胞之生長、用於治療癌症。此外，將烴化劑(例如順雙氨雙氯鉑(cisplatin))及核苷酸類似物(例如吉西他濱(gemcitabine))分別與香桂超臨界二氧化碳萃取物共同使用，或者將烴化劑及核苷酸類似物分別與subamolide A共同使用，則可協同性地抑制泌尿上皮癌細胞之生長。因此，烴化劑與香桂超臨界二氧化碳萃取物(或subamolide A)可單獨配製成一種藥物組合物，而核苷酸類似物與香桂超臨界二氧化碳萃取物(或subamolide A)則可配製成另一種藥物組合物，而用於治療人類泌尿上皮癌細胞或與泌尿系統有關之癌症。
因此，本發明提供一種製備香桂萃取物的方法，該方法包括下列步驟：(a)乾燥一香桂；(b)粉碎該香桂為顆粒；以及(c)以一超臨界二氧化碳萃取該顆粒，獲得該香桂萃取物，該香桂萃取物包括subamolide A。
其中，步驟(b)的操作條件包括萃取壓力介於150巴至350巴之間、萃取溫度介於45℃至55℃之間、超臨界二氧化碳之流速介於4公升/小時至6公升/小時之間以及原料填充密度介於250公克/公升至320公克/公升之間；而最佳的操作條件包括萃取壓力250巴、萃取溫度45℃、超臨界二氧化碳之流速4公升/小時以及原料填充密度320公克/公升。本發明可採用香桂莖部為原料來加以乾燥。
本發明另提供一種根據前述方法所製備的藥物萃取物，其用於治療或抑制癌細胞生長，該藥物萃取物包括：第一成分，其包括subamolide A；以及第二成分，係包含單萜類化合物、倍半萜類化合物、倍半萜類衍生物、飽和脂肪酸、丁內脂類化合物、植物固醇、三萜類化合物、植物甾酮及其組合。
本發明另提供一種藥物組合物，包括具有一有效量之subamolide A以及具有另一有效量之烴化劑。
本發明另提供一種藥物組合物，包括具有一有效量之subamolide A以及具有另一有效量之核苷酸類似物。
本發明另提供一種藥物組合物，包括：香桂萃取物，其具有一有效量之subamolide A；以及具有另一有效量之烴化劑。
本發明另提供一種藥物組合物，包括：香桂萃取物，其具有一有效量之subamolide A；以及具有另一有效量之核苷酸類似物。
根據上述構想，香桂萃取物可為以超臨界二氧化碳流體萃取香桂而製備的香桂超臨界二氧化碳萃取物或是以甲醇萃取香桂而製備的香桂甲醇萃取物。
本案所提出之發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
實施例：
本發明的香桂萃取物(或稱為香桂甲醇萃取物)或香桂超臨界二氧化碳萃取物可用於抑制泌尿上皮癌細胞之生長、用於治療癌症。替代性地，香桂萃取物或香桂超臨界二氧化碳萃取物中的主要成分subamolide A可被製備成為用於抗癌之藥物萃取物。替代性地，具有有效量的subamolide A及具有有效量的其他成分亦可被製備成用於抗癌之藥物萃取物。
香桂萃取物或香桂超臨界二氧化碳萃取物可與烴化劑(alkylating analog，為抗癌藥物)協同性地抑制泌尿上皮癌細胞之生長。替代性地，香桂萃取物或香桂超臨界二氧化碳萃取物中的subamolide A可與烴化劑協同性地抑制泌尿上皮癌細胞之生長。
香桂萃取物或香桂超臨界二氧化碳萃取物可與核苷酸類似物(nucleoside analog，為抗癌藥物)協同性地抑制泌尿上皮癌細胞之生長。替代性地，香桂萃取物或香桂超臨界二氧化碳萃取物中的subamolide A可與核苷酸類似物協同性地抑制泌尿上皮癌細胞之生長可與核苷酸類似物協同性地抑制泌尿上皮癌細胞之生長。
本發明用語，例如萃取物、化合物、烴化劑、類似物、藥物組合物、萃取物之成分等，在使用上均具有一有效量，其是指對毒殺細胞具有最低有效量、一範圍區間內之有效量、或是最高有效量。
烴化劑包括但不限於順雙氨雙氯鉑(cisplatin)、順式-1,1-環丁烷二羧酸二氨鉑(卡鉑,carboplatin)、益樂鉑(oxaliplatin)等。核苷酸類似物包括但不限於去氧腺苷類似物(deoxyadenosine analog)、去氧胞苷類似物(deoxycytidine analog，例如吉西他濱(gemcitabine))、去氧鳥苷類似物(deoxyguanosine analog)、去氧胸苷類似物(deoxythymidine analog)、去氧尿苷類似物(deoxyuridine analog)、6-巰基嘌呤(6-thiohypoxanthine)及5-氟尿嘧啶(fluorouracil)等。
實驗與結果： 一、香桂超臨界二氧化碳萃取物之製備及分析：
本發明的香桂萃取物係以超臨界二氧化碳萃取香桂而製備。可採用的香桂莖部為原料來萃取。首先，將5公斤乾燥後的香桂莖部以機械或物理方式粉碎為平均約1～2 mm之顆粒。接著，利用田口品質實驗法的直交表(orthogonal array)排列組合進行實驗設計。本發明選用三水準直交表中的L9 (34 )進行實驗排列組合，並決定4種控制因子。控制因子A為萃取壓力，控制因子B為萃取溫度，控制因子C為超臨界二氧化碳之流體質量流率，控制因子D為原物料填充密度。而決定各控制因子之水準數如下：萃取壓力分別為150、250以及350巴；萃取溫度分別為45、50以及55℃；超臨界二氧化碳之流體質量流率分別為4、5以及6公升/小時；原物料填充密度分別為250、285以及320克/公升。
接著，請參閱第1圖的設備示意圖，將粉碎後之香桂顆粒置於超臨界萃取槽5內，以超臨界二氧化碳流體進行固態萃取。二氧化碳儲存槽1內的二氧化碳經過預冷器2預冷後，再經過高壓液態泵3及加熱器4，設定前述控制因子(操作壓力為150～350巴、溫度為45℃～55℃，流速為4公升/小時～6公升/小時)使二氧化碳進入超臨界萃取槽5。經固態萃取後的香桂超臨界二氧化碳萃取物與超臨界二氧化碳流體進入氣液分離槽6中，在氣液分離槽6下方出口收集香桂超臨界二氧化碳萃取物。藉由改變壓力與溫度，使超臨界二氧化碳流體改變其相態為氣態而降低香桂超臨界二氧化碳萃取物之溶解度，使香桂超臨界二氧化碳萃取物與超臨界二氧化碳流體分離，而達到氣液分離。氣態的二氧化碳再經壓縮後送回二氧化碳儲存槽1中回收使用。
以本領域技術人士所熟知的氣相層析串聯質譜(GC-MS)分析香桂超臨界二氧化碳萃取物可獲得34種組成物，如表1所示。其可分類為單萜類化合物(例如：丁香酚)、倍半萜類化合物(例如：α-蓽澄茄油烯、α-香柑油烯、反式-α-香柑油烯、γ-欖香烯、β-菖蒲二烯、α-姜烯、順式-α-紅没藥烯、β-紅沒藥烯、β-姜黃烯、δ-紫穗槐烯、反式-α-紅没藥烯)、倍半萜類衍生物(例如：柏木烷、α-姜黃烯、橙花叔醇、氧化石竹烯、律草烯-1,2-環氧化物、庫貝醇、τ-蓽橙茄醇、α-蓽橙茄醇、epi -β-蓽橙茄醇、epi -β-紅沒藥醇、epi -α-紅沒藥醇、α-沒藥醇、1,10-二氫諾卡酮)、飽和脂肪酸(例如：棕櫚酸乙酯)、丁內脂類化合物(isolinderanolide B、linderanolide B、secosubamolide、subamolide A)、植物固醇(例如：β-谷甾醇、γ-谷甾醇)、三萜類化合物(例如：白樺脂醇)、植物甾酮(例如：谷甾酮)。
由於香桂超臨界二氧化碳萃取物係由香桂萃取而得，前述化合物種類或其包含的成分的種類及含量受不同氣候、溫度、濕度、雨水量、種植環境、土壤、收成季節等因素所影響，因此，每一批次之香桂超臨界二氧化碳萃取物的成分、比例均有差異。本領域技術人員基於本發明均可以這些化合物的種類及成分任意地調製出包含subamolide A及/或其他成分的藥物萃取物。
由表1可得知subamolide A([(3Z ,4R ,5R )-3-tetradecylidene-4-hydroxy-5-methoxy-5-methylbutanolide],式I,含量35.1%)為香桂超臨界二氧化碳萃取物之主要成分。
本發明以田口直交法之L9 (34 )直交表進行實驗設計，建立最佳化之操作條件為萃取壓力150巴、萃取溫度45℃、超臨界二氧化碳之流體質量流率4公升/小時、原物料填充密度250克/公升。而由訊號雜音比(Signal to noise ratio;SN ratio)得知影響香桂超臨界二氧化碳萃取物之產率的主要因素依序為：超臨界二氧化碳之流體質量流率、萃取溫度、原物料填充密度、萃取壓力，其所預測之最佳操作條件為：萃取壓力250巴、萃取溫度45℃、超臨界二氧化碳之流體質量流率4公升/小時、原物料填充密度320克/公升。上述兩種操作條件，所得之產率分別為7.7%與7.8%，顯示兩種實驗方法所建立之操作條件相近，確認實驗結果與所預期的訊號雜音比相差範圍小於5，亦即所選擇之實驗條件成立，且超臨界萃取產率為5.39%，優於有機溶媒萃取率1.54%。
將依據前述製備方法所獲得的香桂超臨界二氧化碳萃取物進行細胞毒殺試驗。請參閱第2圖，發現香桂超臨界二氧化碳萃取物對人類泌尿上皮癌細胞株NTUB1具有最佳之細胞毒殺活性(IC50 =0.67±0.02 μg/mL)，而對正常泌尿上皮細胞株SV-HUC-1之細胞毒殺活性則為IC50 =14.1±1.15 μg/mL，香桂超臨界二氧化碳萃取物可選擇性地作用於NTUB1癌細胞，而非正常細胞。
二、香桂萃取物之製備：
此外，另可由香桂莖部萃取出subamolide A(純度高於90%)。簡言之，在室溫下以甲醇萃取風乾乾燥的莖部，將以減壓濃縮獲得的甲醇萃取物再懸浮於水中，再以三氯甲烷分餾以獲得溶於三氯甲烷之分餾物及溶於水之分餾物。三氯甲烷可溶性分餾物在矽膠上使用正己烷-乙酸乙酯-甲醇混合物作為沖提液而進行色層分析，且分成5個次分餾物。第二分餾物再進行矽膠管柱層析，並使用正己烷-乙酸乙酯以製備型薄層色層分析進行純化，獲得subamolide A。將subamolide A溶解於二甲基亞碸(DMSO)並儲存於-20℃。
三、統計分析：
以下實驗結果之數值以平均±標準差表示，在針對多組比較的ANOVA及針對兩組比較的學生t-試驗之後，以邦弗朗尼(Bonferroni)t-試驗進行統計分析，*P <0.05、**P <0.01及***P <0.001被認為具有統計上顯著性。
四、以MTT試驗法分析Subamolide A對不同癌細胞株之細胞毒殺作用：
化合物之細胞毒殺作用是使用二甲基噻唑烴基二苯四唑溴化物(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)試驗法進行。簡言之，將細胞以1×103 cells/well密度植入96孔盤並在藥物處理前隔夜培養於37℃。之後將細胞培養於37℃無或有不同濃度(0.3、1、3、6、9、12、15及20 μM)之subamolide A下72小時。之後，每個孔洞加入50 μL MTT(在PBS中2 mg/mL)並反應4小時。接著於1000×g離心10分鐘，移除培養液且每個孔洞加入150 μL DMSO。於540 nm波長的吸收光譜測定存活細胞比例。細胞存活率是以存活比例和未處理之對照組表示。每組之IC50 值以中位數抑制分析來計算並以平均±標準差(SD)來表示。而兩種化合物的組合效果則以中位數效應分析來分析。為了評估生長抑制的組合效果，採用相對應的組合指數(CI)，其小於1、等於1或大於1分別代表協同作用、加成效應或拮抗效應。
請參閱第3圖，其為subamolide A對人類泌尿上皮癌細胞株之細胞毒殺作用示意圖。當與前列腺癌細胞PC3(IC50 =10.10±0.67 μM)和人類泌尿上皮細胞SV-HUC-1(IC50 =18.10±1.03 μM)分別相較，subamolide A能顯著地降低泌尿上皮癌細胞NTUB1(IC50 =7.26±0.67 μM)及T24(IC50 =7.60±0.96 μM)之生長。因此，往後的實驗將研究subamolide A對NTUB1細胞的抗癌機制。如第3圖所示，在72小時處理後，NTUB1及T24細胞之生長隨subamolide A劑量增加而降低，而subamolide A對PC3及SV-HUC-1細胞之細胞毒殺作用較低。
五、Subamolide A誘導NTUB1細胞之細胞凋亡：
如第4圖(a)所示，以1、5及10 μM subamolide A分別處理NTUB1細胞(3×105 cells/well) 24小時並以流式細胞技術分析後，相較於未處理之對照組，sub-G1細胞凋亡之比例隨subamolide A劑量增加而增加(對應於1、5及10 μM subamolide A分別為5%、10.8%及21.9% sub-G1週期)。
六、細胞內活性氧之定量分析：
活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生以流式細胞儀加以分析。簡言之，將細胞植入6孔盤，在收集細胞前將10 μL二氯螢光雙醋酸鹽(dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)加至經處理的細胞30分鐘。以胰蛋白消化收集細胞，並以PBS清洗。以流式細胞儀結合525 nm帶通濾波器分析細胞內之二氯螢光(2’,7’-dichlorofluorescein)。活性氧生產效率(M1比例)以“(在M1之處理樣本計數-在M1之對照組計數)/在M1之對照組計數×100”表示。
活性氧已知可導致廣泛的適應性細胞反應，取決於活性氧之含量，範圍由暫時性之生長抑制到永久性之生長抑制、細胞凋亡、壞死(necrosis)等。在此，評估subamolide A對NTUB1細胞及SV-HUC-1細胞之細胞內活性氧含量。
請參閱第4圖(b)，在10 μM subamolide A處理下，當與對照組比較時，NTUB1細胞之活性氧M1比例為-14.7±0.99%，而SV-HUC-1細胞之活性氧M1比例為-11.6±1.41%。Subamolide A導致細胞內活性氧含量(M1比例)顯著的降低，而隨著subamolide A濃度增加，在兩種細胞株均觀察到相似的變化；意即，Subamolide A在NTUB1及SV-HUC-1細胞株均降低活性氧之產生。此結果指出細胞內活性氧含量的改變在這些細胞中並未使細胞毒殺作用有差異。
七、以粒腺體膜電位(MMP,Δψm)測定粒腺體之細胞凋亡路徑：
粒腺體膜電位高低是以親脂性陽離子JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’,-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)螢光染劑來測定。簡言之，以前述的實驗條件將細胞植入培養盤並進行藥物處理。在收集細胞前，將JC-1螢光染劑(1 μM)加至細胞30分鐘。以胰蛋白消化收集細胞，並以PBS清洗。以流式細胞儀及軟體立刻分析紅色區域(細胞經JC1染色後呈聚集，R1區域)及綠色區域(細胞經JC1染色後呈單體，R2區域)。
為了驗證subamolide A是否藉由破壞粒腺體之凋亡路徑而引起細胞毒殺作用，在經subamolide A處理之NTUB1細胞測量其粒腺體膜電位(Δψm)的改變。結果發現，經JC-1染色後的NTUB1細胞由聚集形式(紅色螢光；R1)轉變為單體形式(綠色螢光；R2)(結果未示出)，其指出10 μM subamolide A的處理將導致粒腺體功能的破壞(3.52%相較於52.04%)。
此外，請參閱第5圖(a)及第5圖(b)，當粒腺體膜電位降低時，subamolide A正向調節Bax及反向調節Bcl-2蛋白表現，導致在10 μM subamolide A作用時Bax/Bcl-2比例增加兩倍。一致性地，細胞色素c由粒腺體釋出至細胞質中(在10 μM subamolide A作用時達到2.3倍)(第5圖(c))。此外，隨著subamolide A濃度增加，pro-caspase 3表現量降低且出現全長116 kDa之PARP蛋白，表示caspase 3被活化且PARP被切割，證實subamolide A所誘導的細胞凋亡是經由活化粒腺體凋亡訊息路徑。
八、Subamolide A在NTUB1細胞之細胞凋亡之影響：
請參閱第6圖(a)之西方墨點圖譜，10 μM subamolide A在NTUB1細胞活化了ERK1/2蛋白表現，但並無活化p38或JNK蛋白表現。而subamolide A可誘導NTUB1細胞之p53蛋白表現及p53在第15個胺基酸位置(serine 15)的磷酸化，表示p53在由subamolide A調節的細胞凋亡的誘導是具有關鍵性地位(第6圖(b))。
九、Subamolide A與順雙氨雙氯鉑或吉西他濱之組合對NTUB1細胞之細胞毒殺作用：
順雙氨雙氯鉑(cisplatin,CDDP)及吉西他濱(gemcitabine,Gem)為市售之化療藥物，其對NTUB1細胞(實驗開始種植細胞數：1×103 cells/well)作用72小時後的IC50 值分別為3 μM及8 nM(結果未示出)。請參閱第7圖(a)，將subamolide A(0、1、5及10 μM)與順雙氨雙氯鉑(1及3 μM)(或者與吉西他濱(2及8 nM)進行組合而共同作用於NTUB1細胞(實驗開始種植細胞數：1×103 cells/well)連續3天，並以MTT試驗法測定細胞存活率及計算組合指數，結果發現，subamolide A與順雙氨雙氯鉑(或者subamolide A與吉西他濱)均有效且顯著地抑制NTUB1細胞之生長(第7圖(a)、(b)、(c)及(d))，表示subamolide A與順雙氨雙氯鉑(或者subamolide A與吉西他濱)對泌尿上皮癌細胞(例如NTUB1細胞)有協同作用。
由於subamolide A為香桂超臨界二氧化碳萃取物的主要成分，本領域技術人士將含有subamolide A的香桂超臨界二氧化碳萃取物與順雙氨雙氯鉑，或者將含有subamolide A的香桂超臨界二氧化碳萃取物與吉西他濱共同處理泌尿上皮癌細胞，將比個別藥物處理泌尿上皮癌細胞獲得更佳的抑制效果。
前述實驗係分別選擇數個Subamolide A及順雙氨雙氯鉑(或吉西他濱)的濃度進行組合，以分析其協同作用。但本領域的技術人士均可任意地根據前述實驗條件，調整Subamolide A及順雙氨雙氯鉑(或吉西他濱)的濃度，而施用於NTUB1細胞或其他細胞株，或者依照實驗動物技術而施用於適當生理條件(如體重、年齡、性別、疾病狀態等)及實驗條件的動物上。例如，於針對密度1×103 cells/well之NTUB1細胞數的細胞實驗中，調整subamolide A的濃度為低於1 μM、介於1至10 μM或高於10 μM；調整順雙氨雙氯鉑的濃度為低於1 μM、介於1至3 μM或高於3 μM；以及調整吉西他濱的濃度為低於2 μM、介於2至8 μM或高於8 μM。於動物實驗上，則依據動物之體重、年齡、性別、疾病狀態等條件施用：(1)適當量的Subamolide A及順雙氨雙氯鉑(或吉西他濱)；(2)適當量的香桂甲醇萃取物(含適當量之Subamolide A)及順雙氨雙氯鉑(或吉西他濱)；或(3)適當量的香桂超臨界二氧化碳萃取物(含適當量之Subamolide A)及順雙氨雙氯鉑(或吉西他濱)。更甚者，本領域的技術人士亦可換算得到施用於人體的適當量的Subamolide A(香桂甲醇萃取物或香桂超臨界二氧化碳萃取物)及順雙氨雙氯鉑(或吉西他濱)。含有適當量之Subamolide A及適當量之順雙氨雙氯鉑(或吉西他濱)的藥物組合物可施用於動物細胞及動物身上，動物包括人、齧齒類動物、或其他哺乳類動物等。
此外，請參閱第8圖(a)及第8圖(b)，可發現香桂超臨界二氧化碳萃取物在濃度1及2 μg/mL以下亦可協同性地增加順雙氨雙氯鉑(1 μM)與吉西他濱(2 nM)於NTUB1細胞中之細胞毒殺活性，其協同性地影響優於subamolide A。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。
1．．．二氧化碳儲存槽
2．．．預冷器
3．．．高壓液態泵
4．．．加熱器
5．．．超臨界萃取槽
6．．．氣液分離槽
第1圖為本發明的香桂超臨界二氧化碳萃取物之設備示意圖。
第2圖為香桂超臨界二氧化碳萃取物對人類泌尿上皮癌細胞株NTUB1及正常泌尿上皮細胞株SV-HUC-1之細胞毒殺活性。
第3圖為subamolide A抑制人類泌尿上皮癌細胞株NTUB1及T24、人類前列腺癌細胞株PC3及正常泌尿上皮細胞株SV-HUC-1之細胞存活率。
第4圖(a)為以subamolide A處理NTUB1細胞後之各個細胞週期之比例。
第4圖(b)為以subamolide A處理NTUB1及SV-HUC-1細胞後之細胞內活性氧M1比例之變化示意圖。
第5圖(a)為以subamolide A處理NTUB1細胞後之細胞蛋白表現變化之西方點漬圖譜。
第5圖(b)及第5圖(c)分別為以subamolide A處理NTUB1細胞後之(b) Bax/Bcl-2比例之變化倍數以及(c)細胞色素c之變化倍數示意圖。
第6圖(a)及第6圖(b)為以subamolide A處理NTUB1細胞後之西方點漬圖譜。
第7圖(a)及第7圖(b)分別為以subamolide A及順雙氨雙氯鉑對NTUB1細胞作用24、48及72小時之組合式細胞毒殺作用之(a)細胞存活率以及(b)組合指數。組合指數以Calcusyn軟體執行中位數效應分析(median-effect analysis)而得。
第7圖(c)及第7圖(d)分別為以subamolide A及吉西他濱對NTUB1細胞作用24、48及72小時之組合式細胞毒殺作用之(a)細胞存活率以及(b)組合指數。組合指數以Calcusyn軟體執行中位數效應分析(median-effect analysis)而得。
第8圖(a)及第8圖(b)分別為以香桂超臨界二氧化碳萃取物(內含主成分subamolide A)及順雙氨雙氯鉑(或吉西他濱)對NTUB1細胞作用24小時之組合式細胞毒殺作用之(a)細胞存活率以及(b)組合指數。組合指數以Calcusyn軟體執行中位數效應分析(median-effect analysis)而得。
1．．．二氧化碳儲存槽
2．．．預冷器
3．．．高壓液態泵
4．．．加熱器
5．．．超臨界萃取槽
6．．．氣液分離槽

Claims (11)

  1. 一種製備一香桂萃取物的方法，該方法包括下列步驟：(a)乾燥一香桂；(b)粉碎該香桂為複數個顆粒；以及(c)以一超臨界二氧化碳萃取該複數個顆粒，獲得該香桂萃取物，該香桂萃取物包含subamolide A，其中，該超臨界二氧化碳的操作條件包括流速介於4公升/小時至6公升/小時之間以及原料填充密度介於250公克/公升至320公克/公升之間。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該步驟(b)的操作條件包括萃取壓力介於150巴至350巴之間以及萃取溫度介於45℃至55℃之間。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中該步驟(b)的操作條件還包括萃取壓力250巴、萃取溫度45℃、該超臨界二氧化碳之流速4公升/小時以及原料填充密度320公克/公升。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該步驟(a)更包括步驟(a1)乾燥該香桂的莖部。
  5. 一種根據申請專利範圍第1項所述的方法所製備用於抑制一人類泌尿上皮癌細胞生長的一藥物萃取物之用途，該藥物萃取物包括：一第一成分，包括subamolide A；以及一第二成分，係選自由一單萜類化合物、一倍半萜類化合物、一倍半萜類衍生物、一飽和脂肪酸、一丁內脂類化合物、一植物固醇、一三萜類化合物、一植物甾酮及其組合所組成的群組其中之一。
  6. 一種以subamolide A及一烴化劑用於製備抑制一人類泌尿上皮癌細胞生長的藥物組合物之用途，其中該subamolide A具有一第一有效量及該烴化劑具有一第二有效量。
  7. 一種以subamolide A及一核苷酸類似物用於製備抑制一人類泌尿上皮癌細胞生長的藥物組合物之用途，其中該subamolide A具有一第一有效量及該核苷酸類似物具有一第二有效量。
  8. 如申請專利範圍第6及7項中任一項所述之用途，其中該subamolide A係以一超臨界二氧化碳流體萃取一香桂而製備。
  9. 一種以一香桂萃取物及一烴化劑用於製備抑制一人類泌尿上皮癌細胞生長的藥物組合物之用途，其中該香桂萃取物包含具有一第一有效量之subamolide A及該烴化劑具有一第二有效量。
  10. 一種以一香桂萃取物及一核苷酸類似物用於製備抑制一人類泌尿上皮癌細胞生長的藥物組合物之用途，其中該香桂萃取物包含具有一第一有效量之subamolide A及該核苷酸類似物具有一第二有效量。
  11. 如申請專利範圍第9及10項中任一項所述之用途，其中該香桂萃取物還為一香桂超臨界二氧化碳萃取物或一香桂甲醇萃取物，該香桂超臨界二氧化碳萃取物係以一超臨界二氧化碳流體萃取一香桂而製備，該香桂甲醇萃取物是以一甲醇萃取該香桂而製備。
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