TWI433846B

TWI433846B - 經取代之二氫吡唑酮及其用途

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Publication number: TWI433846B
Application number: TW098113265A
Authority: TW
Inventors: 馬力歐傑斯克; 英格福雷; 弗萊德克史托爾; 哈穆特貝克; 麥汀阿克巴巴
Original assignee: 拜耳智慧財產有限公司
Priority date: 2008-04-23
Filing date: 2009-04-22
Publication date: 2014-04-11
Also published as: ZA201006719B; HK1156306A1; IL208136A0; UA105487C2; WO2009129945A1; CA2722016A1; DE102008020113A1; MA32251B1; CN102015685A; KR20100135838A; SV2010003674A; CO6300844A2; TW201006825A; JP2011518794A; AU2009240311A1; US8067407B2; CA2722016C; US20120035151A1; AU2009240311B2; US20140038938A1

Description

經取代之二氫吡唑酮及其用途

本申請案係有關一種新穎之經取代之二氫吡唑酮衍生物，其製法，其於治療與/或預防疾病上之用途，及其於製備用於治療與/或預防疾病(特定言之心血管與血液疾病及腎臟疾病)及用於促進傷口癒合之醫藥上之用途。

人體或其組成供氧不足時，會因其過程時間長短及/或程度而損壞人體或其組成之正常功能或導致其功能完全破壞，此現象稱為缺氧。缺氧可能因所吸入空氣中可利用之氧氣減少(例如：在高山上)、體外呼吸失常(例如：因肺部功能異常或呼吸道阻塞所致)、心臟輸出量減少(例如：心臟功能不足、因肺栓塞所致之急性右心室負載過度)、血中氧運輸量太低(例如：因貧血或中毒，例如：一氧化碳中毒所致)、因血管阻塞以致血流減少造成之局部缺氧(例如：心臟、下肢或腦之典型絕血狀態、糖尿病性大血管-與微血管病變)或因組織需氧量增加(例如：因肌肉活動提高或局部發炎所致)而引起[Eder,Gedigk(編輯)，Allgemeine Pathologie und pathologische Anatomie，第33版，柏林Springer出版社，1990]。

人體在供氧量減少之狀態下急性及慢性適應之程度有限。除了立即反應外，還特別包括心臟輸出量與呼吸輸出量提高，並因靜止-緊張控制機轉而使血管局部舒張，缺氧導致許多基因之轉錄作用改變。此時之基因產物功能為補償氧不足。因此，糖原酵解與葡萄糖轉運子1之數種酵素之表現會加強，結果提高無氧ATP生產，並可在氧不足下存活[Schmidt,Thews(編輯)，Physiologie des Menschen，第27版，柏林Springer出版社，1997；Löffler,Petrides(編輯)，Biochemie und Pathobiochemie，第7版，柏林Springer出版社，2003]。

缺氧進一步加強血管內皮細胞生長因子VEGF之表現，因此缺氧組織中刺激血管再生(血管新生作用)。通過絕血組織之血流可因此而長期改善。此種逆勢調節作用對各種不同心血管疾病與血管阻塞疾病顯然極不適當[參見：Simons與Ware之Therapeutic angiogenesis in cardiovascullar disease,Nat.Rev.Drug.Discov.2(11),863-71(2003)]。

此外，在全身性缺氧上，則加強主要在腎臟之間質性纖維母細胞中形成之肽激素促紅血球生成素之表現。藉以刺激骨髓中紅血球形成，因而增加血液之輸送氧氣能力。這種效應已運用在高表現能力之運動員身上，稱為高山訓練法(high altitude training)。因例如：出血後貧血而致之血液輸送氧氣能力下降通常會使腎臟增加產生促紅血球生成素。某些型式之貧血可能干擾這種調節機轉或可能將其正常數值向下調降。因此例如：罹患腎功能不足之患者雖然仍在腎臟實質中生產促紅球生成素，但受到氧運送能力之影響而顯著減少，造成所謂腎貧血。特定言之，腎貧血及腫瘤與HIV感染引起之貧血之治療法通常經腹膜內投與重組人類促紅血球生成素(rhEPO)。目前仍無其他可經口服用之醫藥可以替代這種高成本之療法[參見：Eckardt之The potential of erythropoietin and related strategies to stimulate erythropoiesis,Curr.Opin. Investig.Drugs 2(8),1081-5(2001)；Berns之Should the target hemoglobin for patients with chronic kidney disease treated with erythropoietic replacement therapy be changed？,Semin.Dial.18(1),22-9(2005)]。近來之研究證實，除了其增加促紅血球生成之作用外，促紅血球生成素亦對缺氧組織(特定言之，心臟與腦)具有獨立之保護(抗細胞凋亡)作用。此外，依據最近之研究，採用促紅血球生成素之療法可降低心臟功能不足患者之平均嚴重罹病率[參見：Caiola與Cheng之Use of erythropoietin in heart failure management,Ann.Pharmacother.38(12),2145-9(2004)；Katz,Mechanisms and treatment of anemia in chronic heart failure,Congest.Heart.Fail.10(5),243-7(2004)]。

上述可因缺氧而誘發之基因之共同特色在於其在缺氧下所提高之表現係由所謂之”缺氧所誘發轉錄因子(HIF)”所引起。HIF為一種雜二聚體轉錄因子，係由α與β亞單位組成。已說明有三種HIF α同型，其中HIF-1 α與HIF-2 α具高度同質性，對缺氧所誘發基因表現具有重要性。雖然β亞單位(已說明其中2種同型)(亦稱為ARNT(芳基烴受體核移位子)持續表現，而α亞單位之表現則依細胞中氧含量而定。在正常含氧量下，HIF α蛋白質係普遍存在，然後被蛋白降解體降解。在缺氧下，此降解作用受到抑制，因此HIF α會與ARNT形成二聚體，進而活化其目標基因。該HIF二聚體與其目標基因之調節序列中所謂之缺氧負責元素(hypoxia-responsible elements(HRE))結合。HRE之定義為一種同義序列。已在許多缺氧所誘發基因之調節元素中檢測到功能性 HRE[參見：Semenza之Hypoxia-inducible factor 1：oxygen homeostasis and disease pathophysiology,Trends Mol.Med.7(8),345-50(2001)；Wenger與Gassmann,Oxygen(es)and the hypoxia-inducible factor-1,Biol.Chem.378(7),609-16(1997)]。

這種HIF α之調節作用之分子機轉基礎已由幾組獨立之研究者發現。該機轉隨物種而異：HIF α被兩個特定之脯胺醯基(人類HIF-1 α亞單位之P402與P564)上依賴氧之脯胺醯基4-羥化酶之子群(稱為PHD或EGLN)進行羥基化。HIF脯胺醯基4-羥化酶為依賴鐵之轉化2-側氧基戊二酸酯之二氧化酶[Epstein等人之C.elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation,Cell 107(1),43-54(2001)；Bruick與McKnight之A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF,Science 294(5545),1337-40(2001)；Ivan等人之Biochemical purification and pharmacological inhibition of a mammalian prolyl hydroxylase acting on hypoxia-inducible factor,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(21),13459-64(2002)]。該等酵素首次於2001年解讀為脯胺醯基羥化酶[Aravind與Koonin之The DNA-repair protein AlkB,EGL-9,and leprecan define new families of 2-oxo-glutarate-and iron-dependent dioxygenases,Genome Biol.2(3),research0007.1-0007.8,Epub 2001 Feb 19]。

pVHL腫瘤抑制子蛋白質，其與延伸蛋白(elongin)B與C共同形成所謂之VBC複合體，使HIF α亞單位得以配合 E3泛素黏接酶，與脯胺醯基經羥化之HIF α亞單位結合。由於HIF α亞單位之脯胺醯基4-羥化作用及其接續之降解作用係隨細胞內氧濃度變化，因此HIF脯胺醯基4-羥化酶亦稱為細胞氧感受器。已判別這類酵素之三種同型：EGLN1/PHD2、EGLN2/PHD1與EGLN3/PHD3。其中兩種酵素(EGLN2/PHD1與EGLN3/PHD3)即使在缺氧下仍經轉錄作用誘發，且可能與慢性缺氧下所觀察到之HIF α濃度下降有關[參見：Schofield與Ratcliffe之Oxygen sensing by HIF hydroxylases,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.5(5),343-54(2004)]。

以選擇性醫藥抑制HIF脯胺醯基4-羥化酶可以提高依賴HIF之目標基因之基因表現，因此有利於醫療許多種疾病症候群。特別針對心血管系統疾病，應可由誘發新血管及在絕血器官之代謝狀態下，由有氧ATP生產改變成無氧ATP生長，而改善疾病過程。尤其當潰瘍病灶處及其他慢性皮膚傷口很難癒合時，改善慢性傷口之血管化作用會促進癒合過程。在某些疾病型式，特定言之，罹患腎貧血患者中誘發內因性促紅血球生成素時，同樣可達到醫療目的。

迄今科學文獻所說明之HIF脯胺醯基4-羥化酶抑制劑尚無法符合醫藥上之要求。其係競爭性側氧基戊二酸酯類似物(如，例如：N-草醯基甘胺酸)，其特徵在於其作用效力極低，因此仍無法在活體內模式具有誘發HIF目標基因之作用。或其為鐵-複合劑(螯合劑)，如：去鐵胺(desferroxamine)，其係作為含鐵之二氧化酶之非專一性抑制劑，且雖然其於活體內誘發目標基因，如，例如：促紅血球生成素，但顯然因與可利用之鐵複合，所以與紅血球生成作用出現抗衡現象。

具有殺細菌與/或殺真菌作用之2-雜芳基-4-芳基-1,2-二氫吡唑酮類已揭示於EP 165 448與EP 212 281。作為治療呼吸道、心血管與炎症之脂氧化酶抑制劑之2-雜芳基-4-芳基-1,2-二氫吡唑酮類已於EP 183 159中申請專利權。具有除草活性之2,4-二苯基-1,2-二氫吡唑酮類說明於DE 2 651 008。某些2-吡啶基-1,2-二氫吡唑酮類之製法與醫藥性質已說明於Helv.Chim.Acta 49(1),272-280(1966)。WO 96/12706、WO 00/51989與WO 03/074550主張用於治療各種不同疾病之具有二氫吡唑酮部份結構之化合物之專利權，且用於治療神經精神疾病之經羥基-或烷氧基取代之聯吡唑類已揭示於WO 2006/101903。用於治療疼痛與各種不同CNS疾病之經雜芳基取代之吡唑衍生物已進一步說明於WO 03/051833與WO 2004/089303。WO 2006/114213同時揭示2,4-二吡啶基-1,2-二氫吡唑酮類作為HIF脯胺醯基4-羥化酶之抑制劑。

化合物3-甲基-1-(吡啶-2-基)-4-(1-吡啶-2-基-3-甲基-1H-吡唑-5-基)-2H-3-吡唑啉-5(1H)-酮(別名：5,5'-二甲基-2,2'-二吡啶-2-基-1',2'-二氫-2H,3'H-3,4'-聯吡唑-3'-酮)之X-射線結晶結構已說明於Acta Crystallogr.,Section E：Structure Reports Online E57(11),o1126-o1127(2001)[Chem.Abstr.2001：796190]。某些3',5-二甲基-2-苯基-1'-(1,3-噻唑-2-基)-1'H,2H-3,4'-聯吡唑-5'-醇衍生物之合成法已說明於Indian J.Heterocyclic Chem.3(1),5-8(1993)[Chem.Abstr.1994： 323362]。個別之4-(吡唑-5-基)吡唑啉-5-酮衍生物之製法與互變異構作用已說明於J.Heterocyclic Chem.27(4),865-870(1990)[Chem.Abstr.1991：428557]。此等文獻中所述及化合物之醫療用途則迄今尚無人說明。化合物2-第三丁基-1'-[4-(4-氯苯基)-1,3-噻唑-2-基]-3',5-二甲基-1'H,2H-3,4'-聯吡唑-5'-醇則列為WO 2007/008541之試驗實例。

本發明之主題在於提供一種供治療疾病，特定言之心血管與血液疾病之新穎化合物。

本發明內容中，現在說明之化合物可作為HIF脯胺醯基4-羥化酶之專一性抑制劑，且依據此專一性作用機轉，可於活體內，在非經腸式或經口投藥後誘發HIF目標基因，如，例如：促紅血球生成素，及其所引起之生物過程，如：促紅血球生成作用。

本發明提供如下式化合物其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表飽和之4-至7-員雜環基，其利用一個氮原子附接，其中雜環基可經一個取代基取代，其中該取代基係選自下列所組成群中：羥基、羥基羰基、C₁-C₃-烷基、C₁-C₃-烷基胺基與C₃-C₆-環烷基，或其中雜環基可經1至4個氟取代基取代，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

根據本發明化合物為式(I)化合物與其鹽、溶劑合物及其鹽之溶劑合物，及式(I)中所包括之化合物與下列具體實施例所述及之化合物，與其鹽、溶劑合物及其鹽之溶劑合物，其中式(I)中所包括之化合物與下列所述及之化合物不一定已形成鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

根據本發明化合物依其結構而定，可呈立體異構型(對映異構物、非對映異構物)。因此本發明包括對映異構物或非對映異構物與其特定混合物。立體化學性均一之組成物可依已知方式自對映異構物與/或非對映異構物之此等混合物中單離。

若根據本發明化合物出現互變異構型時，本發明包括所有此等互變異構型。

本發明內容中，較佳鹽類為根據本發明化合物之生理上可接受之鹽類。亦包括其本身不一定適用於醫藥，但可用於例如：單離或純化根據本發明化合物之鹽類。

根據本發明化合物之生理上可接受之鹽類包括礦物酸、羧酸與磺酸之酸加成鹽，例如：鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、馬來酸與苯甲酸之鹽類。

根據本發明化合物之生理上可接受之鹽類亦包括一般鹼類之鹽類，如，例如且較佳為鹼金屬鹽類(例如：鈉與鉀鹽)、鹼土金屬鹽類(例如：鈣與鎂鹽)與衍生自氨或具有1至16個碳原子之有機胺之銨鹽，如，例如且較佳為乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、乙基二異丙基胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環己胺、二甲基胺基乙醇、普魯卡因(procaine)、二苯甲基胺、N-甲基嗎啉、精胺酸、離胺酸、乙二胺與N-甲基哌啶。

本發明內容中之溶劑合物係指彼等根據本發明化合物與溶劑分子配位形成固態或液態之複合物。若與水發生配位時，水合物即為一種特定之溶劑合物型式。本發明內容中以水合物為較佳溶劑合物。

本發明亦包括根據本發明化合物之前藥。"前藥"包括本身有或沒有生物活性之化合物，但可以在體內停留期間轉化(例如：代謝或水解)成根據本發明化合物。

本發明內容中，取代基之定義如下，除非另有說明：烷基本身與烷基胺基中之"烷基"代表具有1至3個碳原子之直鏈或分支烷基，例如：較佳為甲基、乙基、正丙基、異丙基。

烷基胺基代表具有1或2個(分別獨立選出之)烷基取代基之烷基胺基，例如：較佳為甲基胺基、乙基胺基、正丙基胺基、異丙基胺基、N,N-二甲基胺基、N,N-二乙基胺基、N-乙基-N-甲基胺基、N-甲基-N-正丙基胺基與N-異丙基-N-正丙基胺基。例如：C₁-C₃-烷基胺基代表具有1至3個碳原子之單烷基胺基或代表每個烷基取代基具有1至3個碳原子之二烷基胺基。

環烷基代表一般具有3至6個碳原子之單環狀環烷基；可述及之環烷基實例較佳為環丙基、環丁基、環戊基與環己基。

可利用一個氮原子附接之飽和4-至7-員雜環基代表具有4至7個環原子之單環飽和雜環基，其中包括一個所附接之氮原子與另包含至多2個，較佳為至多一個雜原子與/或選自N、O、S、SO、SO₂所組成群中之雜基團，其中氮原子亦可形成N-氧化物。較佳為另具有至多一個選自由O、N與S所組成群中雜原子之4-至7-員單環狀飽和雜環基，例如：較佳為氮雜環丁烷-1-基、吡咯啉-1-基、哌啶-1-基、嗎啉-4-基、硫嗎啉-4-基、哌-1-基、1,2-氧氮雜環己烷-2-基、1,4-氧氮雜環庚烷-4-基、1,4-硫雜環庚烷-4-基。

較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表飽和之4-至7-員雜環基，其利用一個氮原子附接，其中雜環基經1至4個氟取代基取代，或R² 代表哌-1-基，其中哌-1-基經一個取代基取代，其中該取代基係選自C₃-C₆-環烷基所組成群中，或R² 代表氮雜環丁烷-1-基，其中氮雜環丁烷-1-基經一個取代基取代，其中該取代基係選自下列所組成群中：羥基羰基、C₁-C₃-烷基、C₁-C₃-烷基胺基與C₃-C₆-環烷基，或R² 代表1,2-氧氮雜環己烷-2-基或1,4-氧氮雜環庚烷-4-基，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表氮雜環丁烷-1-基、吡咯啉-1-基或哌啶-1-基，其中氮雜環丁烷-1-基、吡咯啉-1-基與哌啶-1-基經1至4個氟取代基取代，或R² 代表哌-1-基，其中哌-1-基之4-位置經一個取代基取代，其中該取代基係選自C₃-C₆-環烷基所組成群中，或R² 代表氮雜環丁烷-1-基，其中氮雜環丁烷-1-基之3-位置經一個取代基取代，其中該取代基係選自下列所組成群中：羥基羰基、甲基與二甲基胺基，或R² 代表1,2-氧氮雜環己烷-2-基或1,4-氧氮雜環庚烷-4-基，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

亦較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基， R² 代表飽和之4-至7-員雜環基，其利用一個氮原子附接，其中雜環基經1至4個氟取代基取代，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

亦較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表氮雜環丁烷-1-基、吡咯啉-1-基或哌啶-1-基，其中氮雜環丁烷-1-基、吡咯啉-1-基與哌啶-1-基經1至4個氟取代基取代，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

亦較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表氮雜環丁烷-1-基、吡咯啉-1-基或哌啶-1-基，其中氮雜環丁烷-1-基、吡咯啉-1-基與哌啶-1-基經2個氟取代基取代，其中此等取代基附接在同一個碳原子上。

及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

亦較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表哌-1-基，其中哌-1-基經一個取代基取代，其中該取代基係選自C₃-C₆-環烷基所組成群中，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

亦較佳為式(I)化合物，其中 X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表哌-1-基，其中哌-1-基之4-位置經一個取代基取代，其中該取代基係選自C₃-C₆-環烷基所組成群中，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

亦較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表氮雜環丁烷-1-基，其中氮雜環丁烷-1-基經一個取代基取代，其中該取代基係選自下列所組成群中：羥基羰基、C₁-C₃-烷基、C₁-C₃-烷基胺基與C₃-C₆-環烷基，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

亦較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表氮雜環丁烷-1-基，其中氮雜環丁烷-1-基經一個取代基取代，其中該取代基係選自下列所組成群中：羥基羰基、甲基與二甲基胺基，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

亦較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表氮雜環丁烷-1-基，其中氮雜環丁烷-1-基之3-位置經一個取代基取代，其中該取代基係選自下列所組成群中：羥基羰基、甲基與二甲基胺基，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

亦較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表1,2-氧氮雜環己烷-2-基或1,4-氧氮雜環庚烷-4-基。

亦較佳為式(I)化合物，其中X代表N。

亦較佳為式(I)化合物，其中R¹代表氫。

亦較佳為式(I)化合物，其中R¹代表氰基。

亦較佳為式(I)化合物，其中R²代表4-環丁基-哌-1-基。

亦較佳為式(I)化合物，其中X 代表N或CH，R¹ 代表氰基，R² 代表飽和之4-至7-員雜環基，其利用一個氮原子附接，其中雜環基經一個取代基取代，其中該取代基係選自下列所組成群中：羥基、羥基羰基、C₁-C₃-烷基、C₁-C₃-烷基胺基與C₃-C₆-環烷基，或其中雜環基經1至4個氟取代基取代，及其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物。

基團之特定組合或較佳組合中詳細說明之基團定義亦可依需要被其他組合之基團定義置換，不受所指定特定基團組合之影響。

以上述兩種或多種較佳範圍之組合極特別佳。

根據本發明式(I)1,2-二氫吡唑-3-酮衍生物亦可呈互變異構性1H-吡唑-5-醇型(I')(參見下列反應圖1)；這兩種互變異構型當然亦包括在本發明中。

本發明亦提供一種製備式(I)化合物或其鹽、溶劑合物與其鹽之溶劑合物之方法，其中根據下列製法[A]由如下式化合物其中R¹如上述定義，及Z¹ 代表甲基或乙基，於惰性溶劑中，若適當時，於酸之存在下，與如下式化合物反應其中R²如上述定義，產生如下式化合物其中Z¹、R¹與R²如上述定義，其在此等反應條件下或於接續反應步驟中，於鹼之影響下，環化產生式(I)化合物，且式(I)化合物若適當時，與適當之(i)溶劑與/或(ii)鹼或酸反應，轉化成其鹽、其溶劑合物或其鹽之溶劑合物，或[B]由如下式化合物其中Z¹與R¹如上述定義，與如下式化合物縮合其中Z² 代表甲基或乙基，產生如下式化合物其中Z¹與R¹如上述定義，然後於酸之存在下，與式(III)化合物反應，產生式(IV)化合物，其在此等反應條件下或於接續反應步驟中，於鹼之影響下，環化產生式(I)化合物

且式(I)化合物若適當時，與適當之(i)溶劑與/或(ii)鹼或酸反應，轉化成其鹽、其溶劑合物或其鹽之溶劑合物，或[C]由如下式化合物以水作為溶劑，於同爐反應中，先與如下式化合物反應其中R²如上述定義，然後與式(VII)化合物反應，產生式(I)化合物，該式(I)化合物若適當時，與適當之(i)溶劑與/或(ii)鹼或酸反應，轉化成其鹽、其溶劑合物或其鹽之溶劑合物。

該鹽類之游離鹼可由化合物之鹽類或該化合物之鹽之溶劑合物與鹼反應製得。

合適鹼類為鹼金屬氫氧化物，如，例如：氫氧化鈉或氫氧化鉀，鹼金屬或鹼土金屬碳酸鹽，如：碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣或碳酸銫，或氨水溶液。

另一種製法中，鹽類之游離鹼可由例如：逆相管柱層析法，使用添加鹼之乙腈/水梯度，特定言之使用RP18 Phenomenex Luna C18(2)管柱與作為鹼之二乙基胺製得。

本發明進一步提供一種製備式(I)化合物或其溶劑合物之方法，其中由化合物之鹽類或其鹽之溶劑合物與鹼反應或經添加鹼之層析法，轉化成該化合物。

其他根據本發明化合物亦可以上述製法得到之式(I)化合物為起始物，視需要由個別取代基(特定言之彼等列於R¹與R²之取代基)之官能基轉化得到。此等轉化法係依習此相關技藝之人士已知之傳統方式進行，且包括例如，如：親核性或親電子性取代反應、氧化反應、還原反應、氫化反應、過渡金屬催化之偶合反應、烷化反應、醯化反應、胺化反應、酯化反應、酯裂解反應、醚化反應、醚裂解反應、形成羧醯胺、磺醯胺、胺甲酸酯與脲類之反應，並引入及排除暫時性之保護基。

適合製法步驟(II)+(III)→(IV)、(VII)+(III)→(IV)與(IV)→(I)之惰性溶劑特定言之為醚類，如：乙醚、甲基第三丁基醚、1,2-二甲氧乙烷、四氫呋喃與二烷，或醇類，如：甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇與第三丁醇，或水或溶劑之混合物或溶劑與水之混合物。較佳為甲醇、乙醇、四氫呋喃或水。

製法步驟(V)+(VI)→(VII)較佳係在二甲基甲醯胺溶劑中或在過量(VI)之存在下，不使用其他溶劑下進行。若適當時，該反應亦可依有利方式，在微波照射下進行。該反應通常在+20℃至+150℃之溫度範圍進行，以+80℃至+120℃較佳[亦參見J.P.Bazureau等人之Synthesis 1998,967；如上述文獻，2001(4),581]。

若適當時，製法步驟(II)+(III)→(IV)與(VII)+(III)→(IV)可依有利方式，在添加酸下進行。適合此目的之酸為無機或有機酸類，如，例如：鹽酸、乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸或樟腦-10-磺酸。較佳為使用乙酸，特定言之三氟乙酸或對甲苯磺酸。

反應(II)+(III)→(IV)通常在0℃至+100℃之溫度範圍內進行，較佳為+10℃至+50℃。反應(VII)+(III)→(IV)通常在+20℃至+120℃之溫度範圍內進行，較佳為+50℃至+100℃。

製法順序(II)+(III)→(IV)→(I)與(VII)+(III)→(IV)→(I)可依兩步驟反應或在同爐反應中進行，不需單離出中間物(IV)。尤其適合後者係由反應成份於微波照射下反應；此時該反應通常在+50℃至+200℃之溫度範圍內進行，較佳為+100℃至+180℃。

即使在製備(IV)期間，仍可能有部份環封合形成(I)；此時，若需要時，可於原位以鹼處理反應混合物，使其完全封合。

適合此等分開之環化步驟(IV)→(I)之鹼為常見之無機或有機鹼。特定言之，其包括鹼金屬氫氧化物，如，例如：氫氧化鈉或氫氧化鉀，鹼金屬碳酸鹽或鹼土金屬碳酸鹽，如：碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣或碳酸銫，鹼金屬烷醇鹽，如：甲醇鈉或甲醇鉀、乙醇鈉或乙醇鉀或第三丁醇鈉或第三丁醇鉀，或鹼金屬氫化物，如：氫化鈉。較佳為使用甲醇鈉或乙醇鈉。

鹼誘發之反應(IV)→(I)通常在0℃至+60℃之溫度範圍內，較佳在0℃至+30℃下進行。

反應(VIII)+(IX)+(VII)→(I)通常每當量(VIII)使用1.1至2.0當量(IX)，若適當時，於1.1至2.0當量鹼之存在下進行。較佳為與1.1至1.5當量(IX)反應。

適合反應(VIII)+(IX)+(VII)→(I)之鹼為常見之無機或有機鹼。特定言之，其包括鹼金屬氫氧化物，如，例如：氫氧化鈉或氫氧化鉀，或胺鹼類，如，例如：N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺。較佳為N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺。

反應(VIII)+(IX)+(VII)→(I)通常在+20℃至+100℃之溫度範圍內，較佳在+70℃至+100℃下進行。

所有製法步驟均可在常壓、加壓或減壓(例如：0.5至5巴)下進行。通常，該反應係在常壓下進行。

式(II)化合物可由式(V)化合物依文獻中常用於羧酸之C-醯化反應之方法製備。式(III)、(V)、(VI)、(VIII)與(IX)化合物可自商品取得、自文獻中已知或可類似文獻中說明之方法製備。

根據本發明化合物製法說明於下列反應圖2：

[a)：DMF，16h，+100℃；b)：乙醇，三氟乙酸，+78℃；c)：NaOEt，乙醇，1h，RT]。

根據本發明化合物展現未預期之有價值之醫藥作用範圍。

其因此適用為治療與/或預防人類及哺乳動物疾病之醫藥。

根據本發明化合物之特徵在於其為HIF脯胺醯基4-羥化酶之專一性抑制劑。

依據其藥理性質，根據本發明化合物可用於治療與/或預防心血管疾病，特定言之心臟功能不足、冠狀動脈疾病、狹心症、心肌梗塞、中風、動脈粥樣硬化、本態性、肺部與惡性高血壓及周邊動脈阻塞疾病。

根據本發明化合物亦適用於治療與/或預防血液形成病變，如，例如：自發性貧血、腎貧血及伴隨腫瘤疾病(特定言之因化療引起之貧血)、感染(特定言之HIV感染)或另一種炎症，如，例如：類風濕關節炎出現之貧血。根據本發明化合物亦適合作為因失血、缺鐵性貧血、缺乏維生素性貧血(例如：因缺乏維生素B12或因缺乏葉酸所致)、發育不全性與成形不全性貧血或溶血性貧血所致貧血之支持療法，或作為因鐵利用性病變(鐵利用不能性貧血)所致貧血或因其他內分泌病變(例如：甲狀腺功能不足)所致貧血之支持療法。

該等化合物亦適合提高血球容積，以便在手術前得到可供自體輸血之血液。

根據本發明化合物亦可用於治療與/或預防與手術相關之絕血狀態及手術干預後之後遺症，特定言之採用心肺機之心臟干預手術(例如：繞道手術、心瓣膜植入)、頸動脈之干預手術、主動脈之干預手術及使用儀器打開或侵入頭蓋骨之干預手術。該等化合物亦適用在手術干預過程中之一般治療與/或預防，以加速傷口癒合及縮短康復時間。

該等化合物亦適用於治療與預防腦部之急性與延長時間絕血狀態(例如：中風、生產窒息)之後遺症。

該等化合物亦可用於治療與/或預防癌症，及治療與/或預防癌症治療過程中，特定言之在細胞抑制劑、抗生素與放射法治療之後所發生之健康受損狀態。

該等化合物亦適用於治療與/或預防風濕性疾病及與其他自體免疫疾病，特定言之治療與/或預防此等疾病之醫藥處理過程中所發生之健康受損狀態。

根據本發明化合物亦可用於治療與/或預防眼睛疾病(例如：青光眼)、腦部疾病(例如：巴金森氏症、阿茲海默氏症、癡呆症、慢性疼痛感知)、慢性腎臟疾病、腎臟功能不足與急性腎臟衰竭，及供促進傷口癒合。

該等化合物亦適用於治療與/或預防全身虛弱至惡性病，特定言之常發生在較大年紀之老年人。

該等化合物亦適用於治療與/或預防性功能障礙。

該等化合物亦適用於治療與/或預防糖尿病與其後遺症，如，例如：糖尿病性大血管病變與微血管病變、糖尿病性腎病變與神經病變。

根據本發明化合物亦適用於治療與/或預防例如：心臟、肺與肝臟之纖維變性疾病。

特定言之，根據本發明化合物亦適用於預防與治療早產兒之視網膜病變(早產兒視網膜病變)。

本發明亦提供一種以根據本發明化合物於治療與/或預防疾病，特定言之上述疾病上之用途。

本發明亦提供一種以根據本發明化合物於製備醫藥，供治療與/或預防疾病，特定言之上述疾病上之用途。

本發明亦提供一種使用活性量之至少一種根據本發明化合物治療與/或預防疾病，特定言之上述疾病之方法。

根據本發明化合物本身即可使用，或若需要時，可與其他活性化合物組合使用。本發明亦提供一種醫藥，其包含至少一種根據本發明化合物與一種或多種其他活性化合物，特定言之治療與/或預防上述疾病之活性化合物。用於組合之合適活性化合物較佳可述及例如：ACE抑制劑、血管收縮素II受體擷抗劑、β受體阻斷劑、鈣擷抗劑、PDE抑制劑、礦物皮質激素受體擷抗劑、利尿劑、阿斯匹靈、鐵補充劑、維生素B12與葉酸補充劑、斯塔汀抑制素(statins)、毛地黃(毛地黃毒苷)衍生物，腫瘤化療劑與抗生素。

本發明較佳具體實施例中，根據本發明化合物係與ACE抑制劑組合投藥，如，例如：較佳為依拉普利(enalapril)、卡托普利(captopril)、賴諾普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、地拉普利(delapril)、福辛普利(fosinopril)、奎諾普利(quinopril)、培吲普利拉(perindopril)或泉多普利(trandopril)。

本發明較佳具體實施例中，根據本發明化合物係與血管收縮素AII擷抗劑組合投藥，如，例如：較佳為樂斯坦(losartan)、甘斯坦(candesartan)、凡斯坦(valsartan)、特斯坦(telmisartan)或安斯坦(embusartan)。

本發明較佳具體實施例中，根據本發明化合物係與β受體阻斷劑組合投藥，如，例如：較佳為普萘洛爾(propranolol)、阿替洛爾(atenolol)、添慕寧(timolol)、頻脈樂(pindolol)、阿普洛爾(alprenolol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、戊丁特洛(penbutolol)、布拉洛爾(bupranolol)、美替洛爾(metipranolol)、奈丁樂(nadolol)、甲吲洛爾(mepindolol)、卡拉洛爾(carazalol)、索他洛爾(sotalol)、美托洛爾(metoprolol)、倍他洛爾(betaxolol)、噻利洛爾(celiprolol)、比索洛爾(bisoprolol)、卡替洛爾(carteolol)、艾司洛爾(esmolol)、拉貝洛爾(labetalol)、卡維地洛(carvedilol)、阿達洛爾(adaprolol)、蘭地洛爾(landiolol)、奈必洛爾(nebivolol)、益派洛爾(epanolol)或布新洛爾(bucindolol)。

本發明較佳具體實施例中，根據本發明化合物係與鈣擷抗劑組合投藥，如，例如：較佳為硝苯地平(nifedipine)、安莫地平(amlopidine)、維拉帕米(verapamil)或地爾硫卓(diltiazem)。

本發明較佳具體實施例中，根據本發明化合物係與磷酸二酯酶(PDE)抑制劑組合投藥，如，例如：較佳為米力農(milrinone)、氨利酮(amrinone)、匹莫苯丹(pimobendan)、西洛他唑(cilostazol)、昔多芬(sildenafil)、伐地那非(vardenafil)或他達那非(tadalafil)。

本發明較佳具體實施例中，根據本發明化合物係與礦物皮質激素受體擷抗劑組合投藥，如，例如：較佳為螺內酯(spironolactone)、依普利酮(eplerenone)、坎利酮(canrenone)或坎利酮鉀鹽。

本發明具體實施例中，根據本發明化合物係與利尿劑組合投藥，如，例如：較佳為樂泄錠(furosemide)、布美他尼(bumetanide)、托拉塞米(torsemide)、芐氟噻嗪(bendroflumethiazide)、氯磺噻(chlorthiazide)、氫氯噻嗪(hydrochlorthiazide)、氫氟噻嗪(hydroflumethiazide)、甲氯噻嗪(methyclothiazide)、泊利噻嗪(polythiazide)、三氯噻嗪(trichlormethiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、吲達帕胺(indapamide)、美托拉腙(metolazone)、喹乙松(quinethazone)、乙醯唑胺(acetazolamide)、二氯苯磺(dichlorphenamide)、甲醋唑胺(methazolamide)、甘油、異山梨醇(isosorbide)、甘露糖醇、阿米洛利(amiloride)或氨苯蝶啶(triamterene)。

本發明較佳具體實施例中，根據本發明化合物係與選自斯塔汀抑制素類之HMG-CoA還原酶抑制劑組合投藥，如，例如：較佳為洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、羅蘇伐他汀(rosuvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)或匹伐他汀(pitavastatin)。

本發明較佳具體實施例中，根據本發明化合物係與腫瘤化療劑組合投藥，例如：較佳為選自下列各物組成之群中：鉑錯合物如，例如：順鉑(cisplatin)與卡鉑(carboplatin)，烷化劑如，例如：環磷醯胺與氯氮芥(chlorambucil)、抗代謝物如，例如：5-氟尿嘧啶與胺甲蝶呤，拓樸異構酶抑制劑，如，例如：依托泊苷(etoposide)與喜樹鹼(camptothecin)，抗生素如，例如：阿黴素(oxorubicin)與柔紅霉素(daunorubicin)，或激酶抑制劑，如，例如：蕾莎瓦(sorafenib)與舒尼替尼(sunitinib)。

本發明較佳具體實施例中，根據本發明化合物係與抗生素組合投藥，例如：較佳為選自下列各物組成之群中：盤尼西靈、頭孢素或喹啉酮類，如，例如：環丙沙星(ciprofloxacin)與莫西沙星(moxifloxacin)。

本發明亦提供一種醫藥，其包含至少一種根據本發明化合物，通常共同使用一種或多種惰性無毒之醫藥上適合之輔劑物質，並提供其於上述目的上之用途。

根據本發明化合物具有全身性與/或局部性作用。其可依適合此等目的之方式投藥，如，例如：經口、非經腸式、經肺、鼻、舌下、舌、頰、直腸、皮膚、穿皮式、結膜、耳或作為植入物或人工支架。

根據本發明化合物可呈適合此等投藥途徑之投藥型式投藥。

具有根據先前技藝功能，可快速釋放及/或以經過修飾之方式釋放根據本發明化合物且包含根據本發明化合物之結晶與/或非晶型與/或溶解型之投藥型式適合經口投藥，如，例如：錠劑(未包衣或包衣錠劑，例如：抗拒胃液或以延緩方式溶解或不溶解且控制釋放根據本發明化合物之包衣)、可於口腔中快速崩解之錠劑或膜衣/扁圓錠(oblates)、膜衣/冷凍乾燥物或膠囊(例如：硬式或軟式明膠囊)、糖衣錠、粒劑、丸劑、粉劑、乳液、懸浮液、氣霧劑或溶液。

非經腸式投藥法可繞過吸收步驟進行(例如：經靜脈內、經動脈內、經心臟、經脊柱或經腰內)或包括吸收過程進行(例如：經肌內、皮下、皮內、經皮膚或腹膜內)，適合非經腸式投藥型式特別呈溶液、懸浮液、乳液、冷凍乾燥物或無菌粉末之注射與輸液調配物。

其他適合之投藥途徑為例如：吸入性醫藥型式(特別指吸入性粉劑、噴霧劑)、鼻滴液、溶液或噴灑液、供舌、舌下或頰內投藥用之錠劑、膜衣/扁圓錠或膠囊、栓劑、耳或眼用製劑、陰道用膠囊、水性懸浮液(洗液、搖溶混合物)、親脂性懸浮液、油膏、乳霜、穿皮式醫療系統(例如：貼布)、乳劑、糊劑、發泡劑、起泡性粉劑、植入物或人工支架。

以經口與非經腸式投藥法較佳。特定言之經口與經靜脈內投藥法。

根據本發明化合物可轉化成上述投藥型式。其可依本身已知方式，與惰性無毒之醫藥上合適之輔劑物質混合。此等輔劑物質特別包括載劑物質(例如：微晶纖維素、乳糖、甘露糖醇)、溶劑(例如：液態聚乙二醇)、乳化劑與勻散劑或濕化劑(例如：十二烷基硫酸鈉、聚氧山梨糖醇酐油酸酯)、結合劑(例如：聚乙烯吡咯烷酮)、合成性與天然聚合物(例如：白蛋白)、安定劑(例如：抗氧化劑，如，例如：抗壞血酸)、染料(例如：無機色素，如，例如：氧化鐵)與香料與/或矯味劑。

通常，已證明有利之非經腸式投藥劑量為約0.001至1mg/kg，較佳為約0.01至0.5mg/kg體重即可達到有效結果。若經口投藥時，其劑量為約0.01至100mg/kg，較佳為約0.01至20mg/kg與極特別佳為0.1至10mg/kg體重。

但可能有必要偏離上述劑量，特定言之需隨體重、投藥途徑、個體對活性化合物之反應、調配物之性質及投藥之時間點或間隔而定。有時候低於上述劑量可能即已足夠，而其他時候可能需要超過上述最高限值。若投與相當大量時，建議在一天內分成幾個小劑量投藥。

下列具體實施例說明本發明。本發明不受此等實例限制。

下列試驗與實例中之百分比係重量百分比，除非另有說明；份量數為重量份數。液體/液體溶液之溶劑比例、稀釋比例與濃度數據分別以體積計。

A. 實例 縮寫：

LC-MS、GC-MS與HPLC方法：

方法1(LC-MS)：儀器：附HPLC Agilent系列1100之Micromass Platform LCZ；管柱：Thermo Hypersil GOLD 3μ，20mm x 4mm；移動相A：1升水+0.5毫升濃度50%之甲酸，移動相B：1升乙腈+0.5毫升濃度50%之甲酸；梯度：0.0min 100% A→0.2min 100% A→2.9min 30% A→3.1min 10% A→5.5min 10% A；烘箱：50℃；流速：0.8ml/min；UV檢測：210nm。

方法2(LC-MS)：MS型儀器：Micromass ZQ；儀器機型HPLC：Waters Alliance 2795；管柱：Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20mm x 4mm；移動相A：1升水+0.5毫升濃度50%之甲酸，移動相B：1升乙腈+0.5毫升濃度50%之甲酸；梯度：0.0min 90% A→2.5min 30% A→3.0min 5% A→4.5min 5% A；流速：0.0min 1ml/min→2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；烘箱：50℃；UV檢測：210nm。

方法3(LC-MS)：儀器機型MS：Micromass ZQ；儀器機型HPLC：Waters Alliance 2795；管柱：Phenomenex Synergi 2.5μ MAX-RP 100A Mercury 20mm x 4mm；移動相A：1升水+0.5毫升濃度50%之甲酸，移動相B：1升乙腈+0.5毫升濃度50%之甲酸；梯度：0.0min 90% A→0.1min 90% A→3.0min 5% A→4.0min 5% A→4.01min 90% A；流速：2ml/min；烘箱：50℃；UV檢測：210nm。

方法4(LC-MS)：儀器：附HPLC Agilent系列1100之 Micromass Quattro Micro MS；管柱：Thermo Hypersil GOLD 3μ 20mm x 4mm；移動相A：1升水+0.5毫升濃度50%之甲酸，移動相B：1升乙腈+0.5毫升濃度50%之甲酸；梯度：0.0min 100% A→3.0min 10% A→4.0min 10% A→4.01min 100% A(流速2.5ml/min)→5.00min 100% A；烘箱：50℃；流速：2ml/min；UV檢測：210nm。

方法5(LC-MS)：儀器：附Waters UPLC Acquity之Micromass QuattroPremier；管柱：Thermo Hypersil GOLD 1.9μ 50mm x 1mm；移動相A：1升水+0.5毫升濃度50%之甲酸，移動相B：1升乙腈+0.5毫升濃度50%之甲酸；梯度：0.0min 90% A→0.1min 90% A→1.5min 10% A→2.2min 10% A；流速：0.33ml/min；烘箱：50℃；UV檢測：210nm。

方法6(HPLC)：儀器：附DAD檢測之HP 1100；管柱：Kromasil 100 RP-18，60mm x 2.1mm，3.5μm；移動相A：5毫升過氯酸(濃度70%)/升水，移動相B：乙腈；梯度：0min 2% B→0.5min 2% B→4.5min 90% B→6.5min 90% B→6.7min 2% B→7.5min 2% B；流速：0.75ml/min；管柱溫度：30℃；UV檢測：210nm。

方法7(GC-MS)：儀器：Micromass GCT，GC6890；管柱：Restek RTX-35，15m x 200μm x 0.33μm；恆定氦氣流：0.88ml/min；烘箱：70℃；入口：250℃；梯度：70℃，30℃/min→310℃(保持3min)。

方法8(製備性HPLC)：管柱：Kromasil 100 C18 5 μm，250mm x 20mm；移動相A：Milli-Q水，移動相B：濃度0.1%之三氟乙酸水溶液，移動相C：乙腈；梯度：0.0min 76% A，5% B，19% C→15min 4% A，95% B，1% C→15.1min 76% A，5% B，19% C→20min 76% A，5% B，19% C；烘箱：40℃；流速：25ml/min；UV檢測：210nm。

方法9(製備性HPLC)：管柱：Sunfire C18 5μm，19mm x 150mm；移動相A：濃度0.2%之三氟乙酸水溶液，移動相B：乙腈；梯度：0.0min 95% A→8min 50% A→8.01min 95% A→12min 95% A；RT；流速：25ml/min；UV檢測：210nm。

方法10(製備性HPLC)：管柱：Sunfire C18 5μm，19mm x 150mm；移動相A：濃度0.2%之三氟乙酸水溶液，移動相B：乙腈；0min 90% A→13min 90% A；烘箱：40℃；流速：25ml/min；UV檢測：210nm。

方法11(製備性HPLC)：管柱：XBridge C18 5μm，19mm x 150mm；移動相A：濃度0.2%之甲酸水溶液，移動相B：乙腈；0min 75% A→6min 75% A；RT；流速：25ml/min；UV檢測：210nm。

方法12(製備性HPLC)：管柱：XBridge C18 5μm，19mm x 150mm；移動相A：濃度0.2%之甲酸水溶液，移動相B：乙腈；0min 93% A→4min 93% A；RT；流速：25ml/min；UV檢測：210nm。

方法13(製備性HPLC)：管柱：XBridge C18 5μm，19mm x 150mm；移動相A：濃度0.2%之三氟乙酸水溶液，移動相B：乙腈；0min 90% A→12min 90% A；烘箱：40℃；流速：25ml/min；UV檢測：210nm。

起始物 實例1A

(4-氰基-1H-咪唑-1-基)乙酸乙酯

先添加3.3g(35.3mmol)1H-咪唑-4-甲腈[Matthews等人之J.Org.Chem. 1986,51,3228-3231]至13.2ml(11.5g,35.3mmol)濃度21%乙醇鈉之乙醇溶液中，添加4.3ml(6.5g,38.9mmol)溴乙酸乙酯。於室溫下攪拌反應混合物16小時。操作時，濾出沉澱固體，濾出之殘質經乙醇洗滌，濾液減壓濃縮。添加二異丙基醚至殘質中，再次過濾混合物，濾液再次於旋轉蒸發器中濃縮，殘質減壓乾燥。產量：3.8g(理論值之60%)

LC-MS(方法1)：R_t=1.17min；MS(ESIpos)：m/z=180[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.12(s,1H),7.88(s,1H),5.06(s,2H),4.18(q,2H),1.22(t,3H)。

實例2A

2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酸乙酯

慢慢添加129.2g(5.6mmol)鈉至4.0升乙醇中。添加 400.0g(5.6mol)1,2,3-1H-三唑，於內溫20-25℃下滴加623ml(938.2g,5.6mol)溴乙酸乙酯。於室溫下攪拌混合物48小時。濾出沉澱固體，減壓排除乙醇，再次過濾混合物。殘質溶於乙酸乙酯，過濾，再次減壓濃縮，經30cm管柱蒸餾純化。於槽溫140℃，塔頂溫度60-115℃與壓力1毫巴下得到產物。產量：440.0g(理論值之50%)

HPLC(方法6)：R_t=1.58min；LC-MS(方法1)：R_t=0.71min；MS(ESIpos)：m/z=156[M+H]⁺。

實例3A

1H-咪唑-1-基乙酸乙酯

慢慢添加118.2g(5.1mmol)鈉至2.5升乙醇中。於內溫20-25℃下滴加350.0g(5.1mol)咪唑與570ml(858.6g,5.1mol)溴乙酸乙酯。於室溫下攪拌混合物24小時。濾出沉澱固體，減壓排除乙醇，再次過濾混合物。殘質經矽膠管柱層析法純化(移動相：乙酸乙酯)。產量：639.0g(理論值之81%)

GC-MS(方法7)：R_t=4.55min；MS(ESIpos)：m/z=155[M+H]⁺.

實例4A

(4-氰基-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酸乙酯

取4.1g(31.9mmol)疊氮基乙酸乙酯與2.8g(31.9mmol)2-氯丙醯腈於32ml水中，於槽溫80℃下攪拌16小時。冷卻至室溫後，溶液經1N鹽酸酸化，以乙酸乙酯萃取。有機相經硫酸鈉脫水，過濾與減壓濃縮。添加50ml乙醇與10滴濃硫酸至殘質中，於回流下攪拌混合物16小時。操作時，反應混合物減壓濃縮，添加乙酸乙酯至殘質中，懸浮液經半濃縮之碳酸氫鈉溶液洗滌，有機相經硫酸鈉脫水。於旋轉蒸發器上完全排除溶劑，固體減壓乾燥。產量：1.5g(理論值之25%)

LC-MS(方法3)：R_t=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=181[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=9.06(s,1H),5.57(s,2H),4.19(q,2H),1.22(t,3H)。

實例5A

3-(N,N-二甲基胺基)-2-(1H-咪唑-1-基)丙烯酸乙酯

取38.0g(244.9mmol)來自實例3A之化合物於126ml(108.1g,734.7mmol)N,N-二甲基甲醯胺二乙基縮醛中，於槽溫90℃下攪拌16小時。冷卻後，混合物減壓濃縮，殘質與二異丙基醚攪拌，濾出固體，最後以二異丙基醚洗滌。產量：49.0g(理論值之95%)

LC-MS(方法2)：R_t=2.42min；MS(ESIpos)：m/z= 211[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=7.52(s,1H),7.49(s,1H),7.05(s,1H),6.91(s,1H),4.02(q,2H),2.63(br.s,6H),1.12(t,3H)。

實例6A

3-(N,N-二甲基胺基)-2-(4-氰基-1H-咪唑-1-基)丙烯酸乙酯

取3.8g(21.4mmol)來自實例1A之化合物與7.4ml(6.3g,42.8mmol)N,N-二甲基甲醯胺二乙基縮醛於槽溫100℃下攪拌16小時。操作時，冷卻之反應溶液於旋轉蒸發器中濃縮，殘質減壓乾燥。產量：5.0g(純度73%，理論值之73%)

LC-MS(方法1)：R_t=2.69min；MS(ESIpos)：m/z=235[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.13(s,1H),7.85(s,1H),7.58(s,1H),4.03(q,2H),2.69(br.s,6H),1.12(t,3H)。

實例7A

3-(二甲基胺基)-2-(4-氰基-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙烯酸乙酯

取1.3g(7.5mmol)來自實例4A之化合物與1.4ml(1.2g,8.2mmol)N,N-二甲基甲醯胺二乙基縮醛於槽溫100℃下攪拌16小時。操作時，冷卻之反應溶液於旋轉蒸發器中濃縮，殘質減壓乾燥。產量：1.5g(理論值之86%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.55min；MS(ESIpos)：m/z=236[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=9.14(s,1H),7.75(s,1H),4.04(q,2H),3.15(br.s,3H),2.18(br.s,3H),1.13(t,3H)。

實例8A

3-(二甲基胺基)-2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)丙烯酸乙酯

添加44.2ml(38.0g,257.8mmol)N,N-二甲基甲醯胺二乙基縮醛至20.0g(128.9mmol)來自實例2A之化合物中，混合物於100℃下攪拌16小時。冷卻至室溫後，反應混合物減壓濃縮。殘質與乙醚磨製，濾出，以乙醚洗滌。產量：18.0g(理論值之67%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.20min；MS(ESIpos)：m/z= 211[M+H]⁺。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.10(d,1H),7.78(d,1H),7.65(s,1H),4.03(q,2H),3.06(br.s,3H),2.10(br.s,3H),1.12(t,3H)。

實例9A

4-(4-環丁基哌-1-基)-6-肼基嘧啶

步驟a)：4-氯-6-(4-環丁基哌-1-基)嘧啶

先添加1.8g(8.4mmol)1-環丁基哌二鹽酸鹽(Zaragoza等人之J.Med.Chem. 2004,47,2833)至18ml水中，添加2.9ml(2.1g,16.9mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺。於室溫下攪拌混合物30min，添加1.3g(8.4mmol)4,6-二氯嘧啶。反應混合物於115℃下攪拌1小時，冷卻至室溫，添加25毫升乙酸乙酯，以25毫升飽和碳酸氫鈉水溶液萃取混合物。分離有機相，經硫酸鈉脫水，過濾與減壓濃縮。粗產物經矽膠管柱層析法純化(移動相：二氯甲烷/甲醇100/3)。產量：1.9g(理論值之89%)

HPLC(方法6)：R_t=2.79min；MS(DCI)：m/z=254[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.32(s,1H),6.95(s,1H),3.65-3.58(m,4H),2.70(quintet,1H),2.27(t,4H),2.00-1.93(m,2H),1.87-1.75(m,2H),1.67-1.55(m,2H)。

步驟b)：4-(4-環丁基哌-1-基)-6-肼基嘧啶

於室溫下，攪拌滴加4.4ml(4.5g,89.7mmol)肼水合物至含1.9g(7.5mmol)4-氯-6-(4-環丁基哌-1-基)嘧啶之28ml乙醇溶液中。反應溶液於80℃下攪拌16小時，操作時，混合物減壓濃縮。殘質與乙醚重覆磨製，濾出沉澱固體，減壓乾燥。殘質再經矽膠管柱層析法純化(移動相二氯甲烷/甲醇10/2)。產量：1.5g(理論值之80%)

LC-MS(方法6)：R_t=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=249[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=7.92(s,1H),7.63(s, 1H),5.90(NH),4.09(s,NH2),3.45(t,4H),2.69(quintet,1H),2.26(t,4H),2.00-1.93(m,2H),1.82-1.75(m,2H),1.67-1.60(m,2H)。

實例10A

1-(6-肼基嘧啶-4-基)氮雜環丁烷-3-醇

步驟a)：1-(6-氯嘧啶-4-基)氮雜環丁烷-3-醇

取7.3g(48.7mmol)4,6-二氯嘧啶懸浮於140ml水中，添加47ml 1N氫氧化鈉水溶液。添加5.3g(48.7mmol)3-羥基氮雜環丁烷，反應混合物於90℃下攪拌3天。冷卻至室溫後，反應混合物減壓濃縮，其未再純化即繼續反應。

LC-MS(方法5)：R_t=0.36min；MS(ESIpos)：m/z=1.87[M+H]⁺。

步驟b)：1-(6-肼基嘧啶-4-基)氮雜環丁烷-3-醇

於室溫下，攪拌滴加27.2ml(27.9g,279.1mmol)肼水合物至含10.4g(55.8mmol)1-(6-氯嘧啶-4-基)氮雜環丁烷-3-醇之100ml乙醇溶液中。反應溶液於80℃下攪拌16小時，操作時，混合物減壓濃縮，濾出沉澱，以各10ml乙醇洗滌2次。產量：2.0g(理論值之19%)

LC-MS(方法1)：R_t=2.06min；MS(ESIpos)：m/z=194[M+H]⁺。

實例11A

4-氯-6-肼基嘧啶

於室溫下，攪拌滴加11.8ml(12.1g,241.6mmol)肼水合物至含20.0g(134.3mmol)4,6-二氯嘧啶之300ml乙醇溶液中。若在定量添加肼水合物期間溶液轉呈渾濁時，則再添加乙醇(約400ml)。於室溫下攪拌反應溶液12小時，操作時，濾出沉澱固體，濾出之殘質經各150ml水洗滌2次，經各100毫升乙醚洗滌2次，產物減壓乾燥。由濃縮之母液進一步得到結晶產物。產量：16.8g(理論值之87%)

LC-MS(方法1)：R_t=1.17min；MS(ESIpos)：m/z=145[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.81(s,1H),8.17(br.s,1H),6.75(s,1H),4.48(br.s,2H)。

實例12A

2-(6-氯嘧啶-4-基)-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮鹽酸鹽

先添加10.0g(47.7mmol)來自實例8A之化合物與8.3g(57.1mmol)來自實例11A之化合物至100ml乙醇中，添加1.5ml(2.2g,19.0mmol)三氟乙酸。於回流下攪拌混合物12小時。然後添加過量4M鹽酸之二烷溶液至冷卻之反應混合物中，攪拌混合物約1小時，濾出沉澱固體，濾出之殘質經二烷與乙醇洗滌。取依此方式得到之中間物溶於150ml乙醇中，添加50ml濃度25%之甲醇鈉之甲醇溶液，於室溫下攪拌混合物2小時。使用1N鹽酸調整反應混合物至pH=5，再於室溫下攪拌2小時，濾出固體，濾出之殘質經乙醇洗滌，產物減壓乾燥。產量：7.0g(理論值之49%)

LC-MS(方法5)：R_t=1.20min；MS(ESIpos)：m/z=264[M+H]⁺。

實例13A

2-(6-氯嘧啶-4-基)-4-(1H-咪唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑- 3-酮鹽酸鹽

先添加10.0g(47.8mmol)來自實例5A之化合物與8.3g(57.3mmol)來自實例11A之化合物至100ml乙醇中，添加1.5ml(2.2g,19.0mmol)三氟乙酸。於回流下攪拌混合物12小時。濾出沉澱之結晶，濾出之殘質經乙醇洗滌，取中間物減壓乾燥一夜。取中間物懸浮於20ml甲醇中，添加100ml 4M鹽酸之二烷溶液，於室溫下攪拌混合物反應1小時。濾出固體，濾出之殘質經二烷、乙酸乙酯與二異丙醚洗滌，產物減壓乾燥。產量：4.6g(理論值之32%)

HPLC(方法6)：R_t=2.81min；MS(ESIpos)：m/z=263[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=9.46(s,1H),8.96(s,1H),8.56(s,1H),8.51(d,1H),8.07-8.04(m,1H),7.85-7.82(m,1H)。

實例14A

4-(6-肼基嘧啶-4-基)-1,4-氧氮雜環庚烷

步驟a)：4-(6-氯嘧啶-4-基)-1,4-氧氮雜環庚烷

取含3.0g(20.1mmol)4,6-二氯嘧啶、2.8g(20.1mmol)l,4-氧氮雜環庚烷鹽酸鹽與6.4g(60.4mmol)碳酸鈉之45ml水之混合物於回流下攪拌16小時。冷卻至室溫後，以乙酸乙酯萃取反應混合物。有機相經飽和氯化鈉溶液洗滌，經硫酸鈉脫水與過濾。濾液於減壓下濃縮至乾。得到油狀產物。產量：3.9g(理論值之86%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.32min；MS(ESIpos)：m/z=214[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.33(s,1H),6.86(s,1H),3.99-3.52(m,8H),1.84(m,2H)。

步驟b)：4-(6-肼基嘧啶-4-基)-1,4-氧氮雜環庚烷

於室溫下，攪拌滴加8.8ml(9.0g,180.2mmol)肼水合物至含3.9g(18.0mmol)4-(6-氯嘧啶-4-基)-1,4-氧氮雜環庚烷之25ml乙醇溶液中。於80℃下攪拌16小時後，反應溶液減壓濃縮。殘質與冷乙醇磨製，濾出沉澱固體，濾出之殘質經 25ml乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：1.4g(理論值之36%)

HPLC(方法11)：R_t=2.48min；MS(ESIpos)：m/z=210[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=7.91(s,1H),7.56(br.s,1H),5.81(s,1H),4.12(br.s,2H),3.75-3.55(m,8H),1.85(quintet,2H)。

操作實例 實例1

2-[6-(4-環丁基哌-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-咪唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

添加16μl(23mg,0.2mmol)三氟乙酸至含211mg(1.0mmol)來自實例5A之化合物與250mg(1.0mmol)來自實例9A之化合物之4ml乙酸乙酯之混合物中，於100℃下攪拌混合物20小時。反應混合物減壓濃縮，再加乙酸乙酯與三氟乙酸(與上述同量)，於100℃下攪拌混合物20小時。反應混合物冷卻至室溫，濾出沉澱固體，以乙醚洗滌。殘質先經矽膠管柱層析法預純化(移動相二氯甲烷/甲醇/氨10/2/0.2)，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：137mg(理論值之36%)

HPLC(方法6)：R_t=2.73min；MS(ESIpos)：m/z=367[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.40(s,1H),8.12(s,1H),7.90(s,1H),7.74(s,1H),7.50(s,1H),7.07(s,1H),3.65-3.58(m,4H),2.77(quintet,1H),2.38-2.35(m,4H),2.01-1.96(m,2H),1.89-1.79(m,2H),1.67-1.62(m,2H)。

實例2

2-[6-(4-環丁基哌-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

添加16μl(23mg,0.2mmol)三氟乙酸至含211mg(1.0mmol)來自實例8A之化合物與250mg(1.0mmol)來自實例9A之化合物之4ml乙酸乙酯之混合物中，於100℃下攪拌混合物20小時。反應混合物減壓濃縮，再加乙酸乙酯與三氟乙酸(與上述同量)，於100℃下攪拌混合物3天。反應混合物冷卻至室溫，濾出沉澱固體，以乙醚洗滌。殘質懸浮於2ml水中，添加1N氫氧化鈉水溶液(pH=9-10)使其溶解，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：195mg(理論值之51%)

HPLC(方法6)：R_t=2.90min；MS(ESIpos)：m/z=368[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.41(s,1H),8.40(s,1H),7.88(s,1H),7.82(s,1H),7.75(s,1H),3.70-3.65(m,4H),3.03-2.97(m,1H),2.60-2.57(m,4H),2.06-2.02(m,2H),1.98-1.90(m,2H),1.70-1.64(m,2H)。

實例3

1-{2-[6-(4-環丁基哌-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-甲腈

添加16μl(23mg,0.2mmol)三氟乙酸至含236mg(1.0mmol)來自實例6A之化合物與250mg(1.0mmol)來自實例9A之化合物之4毫升乙酸乙酯混合物中，混合物於100℃下攪拌20小時。反應混合物減壓濃縮，再加乙酸乙酯與三氟乙酸(與上述同量)。於100℃下攪拌混合物3天。反應混合物冷卻至室溫，濾出沉澱固體，以乙醚洗滌。殘質懸浮於2ml水中，添加1N氫氧化鈉水溶液(pH=9-10)使其溶解，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：219mg(理論值之56%)

HPLC(方法6)：R_t=3.10min；MS(ESIpos)：m/z=392[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.38(d,1H),8.37(d,1H),8.17(d,1H),7.82(s,1H),7.80(s,1H),3.68-3.62(m,4H),3.38-3.30(m,4H),2.96-2.91(m,1H),2.06-2.00(m,2H),1.95-1.85(m,2H),1.70-1.63(m,2H)。

實例4

1-{2-[6-(3-羥基氮雜環丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-甲腈

添加46μl(68mg,0.6mmol)三氟乙酸至含700mg(3.0mmol)來自實例6A之化合物與541mg(3.0mmol)來自實例10A之化合物之10毫升乙酸乙酯之混合物中，於100℃下攪拌混合物10小時。反應混合物減壓濃縮，溶於5ml乙醇中，濾出沉澱。取固體懸浮於10ml水中，添加1N氫氧化鈉水溶液(pH=9)至固體溶解。然後使用1N鹽酸調整pH至7，混合物濃縮至體積約5ml，濾出所形成之沉澱。殘質經水與二異丙基醚洗滌，經製備性HPLC層析(方法8)。取固體懸浮於10ml水中，添加1N氫氧化鈉水溶液(pH=9)至固體溶解。然後使用1N鹽酸調整pH至7，濃縮混合物至體積約2.5ml，濾出所形成之沉澱。濃縮濾液至約2ml，再次過濾。合併兩份殘質，以水與乙酸乙酯洗滌，減壓乾燥。產量：78mg(理論值之8%)

HPLC(方法6)：R_t=2.90min；MS(ESIpos)：m/z=325[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.35(s,1H),8.29(s,1H),8.17(s,1H),7.66(s,1H),7.34(s,1H),5.80-5.75(m,1H),4.63-4.58(m,1H),4.24-4.20(m,2H),3.75-3.73(m,2H)。

實例5

1-{6-[4-(1H-咪唑-1-基)-5-側氧基-2,5-二氫-1H-吡唑-1-基]嘧啶-4-基}氮雜環丁烷-3-羧酸

先添加46mg(0.3mmol)氮雜環丁烷-3-羧酸鹽酸鹽至含1ml水與0.3ml乙醇之混合物中。添加100mg(0.3mmol)來自實例13A之化合物，於100℃下攪拌混合物1小時。反應混合物再使用1N氫氧化鈉水溶液調整至pH=7，於100℃下攪拌16小時。再此使用1N氫氧化鈉水溶液調整混合物至pH=7，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於150℃下反應1小時。反應混合物減壓濃縮，經製備性 HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：23mg(理論值之21%)

LC-MS(方法8)：R_t=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=328[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.41(s,1H),7.79(s,1H),7.47(s,1H),7.36(s,1H),7.31(s,1H),6.89(s,1H),4.09(t,2H),3.99(t,2H)。

實例6

1-{6-[5-側氧基-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-2,5-二氫-1H-吡唑-1-基]嘧啶-4-基}氮雜環丁烷-3-羧酸

先添加55mg(0.4mmol)氮雜環丁烷-3-羧酸鹽酸鹽至2ml水中。添加100mg(0.3mmol)來自實例12A之化合物，使用1N氫氧化鈉水溶液調整pH至7。混合物於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於150℃下反應1小時。反應混合物減壓濃縮，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：15mg(理論值之13%)

HPLC(方法6)：R_t=2.81min；MS(ESIpos)：m/z=329[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.42(s,1H),8.26(s, 1H),7.70(s,1H),7.67(s,1H),7.34(s,1H),4.05-3.96(m,2H與2H),3.13-3.07(m,1H)。

實例7

4-(1H-咪唑-1-基)-2-[6-(3-甲基氮雜環丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

取43mg(0.4mmol)3-甲基氮雜環丁烷鹽酸鹽、100mg(0.3mmol)來自實例13A之化合物與174μl(130mg,1.0mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺懸浮於2ml四氫呋喃中，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於120℃下反應4.5小時。反應混合物減壓濃縮，溶於添加1N氫氧化鈉水溶液之水(pH=9-10)中，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：30mg(理論值之30%)

HPLC(方法6)：R_t=3.07min；MS(ESIpos)：m/z=298[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.25(s,1H),7.81(s,1H),7.46(s,1H),7.39(s,1H),7.31(s,1H),6.88(s,1H),4.10(t,2H),3.54(dd,2H),2.86-2.75(m,1H),1.25(d,3H)。

實例8

2-[6-(3-甲基氮雜環丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

取43mg(0.4mmol)3-甲基氮雜環丁烷鹽酸鹽、100mg(0.3mmol)來自實例12A之化合物與174μl(130mg,1.0mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺懸浮於2ml四氫呋喃中，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於120℃下反應1.5小時。反應混合物減壓濃縮，溶於添加1N氫氧化鈉水溶液之水(pH=9-10)中，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：25mg(理論值之25%)

HPLC(方法6)：R_t=3.00min；MS(ESIpos)：m/z=299[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.41(s,1H),8.27(s,1H),7.70(s,1H),7.67(s,1H),7.41(s,1H),4.11(t,2H),3.56(dd,2H),2.86-2.78(m,1H),1.25(d,3H)。

實例9

2-{6-[3-(二甲基胺基)氮雜環丁烷-1-基]嘧啶-4-基}-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮二鹽酸鹽

取271mg(1.5mmol)N,N-二甲基氮雜環丁烷-3-胺二鹽酸鹽、400mg(1.5mmol)來自實例12A之化合物與847mg(6.1mmol)碳酸鉀懸浮於8毫升N,N-二甲基甲醯胺中，於100℃下攪拌16小時。反應混合物減壓濃縮，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：添加濃度0.1%三氟乙酸之乙腈/水梯度)。進一步利用製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：添加濃度0.1%甲酸之乙腈/水梯度)。添加2毫升1N鹽酸至含產物之溶離份，於室溫下攪拌混合物1小時。濾出固體，於高度真空下乾燥。產量：62mg(理論值之17%)

LC-MS(方法5)：R_t=0.19min；MS(ESIpos)：m/z=328[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.42(s,1H),8.28(s,1H),7.69(s,1H),7.66(s,1H),7.52(s,1H),4.02(t,2H),3.76(dd,2H),3.24-3.18(m,1H),2.12(s,6H)。

實例10

2-[6-(4,4-二氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-咪唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

先添加100mg(0.3mmol)來自實例13A之化合物、63mg(0.4mmol)4,4-二氟哌啶鹽酸鹽與116μl(86mg,0.7mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺至2ml四氫呋喃中，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於120℃下反應2.5小時。減壓濃縮後，殘質溶於乙腈/水，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：82mg(理論值之71%)

HPLC(方法6)：R_t=3.37min；MS(ESIpos)：m/z=348[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.49(s,1H),8.38(s,1H),8.15(s,1H),7.76(s,1H),7.64(s,1H),7.22(s,1H),3.80(t,4H),2.06(heptet,4H)。

實例11

2-[6-(4,4-二氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

先添加250mg(0.8mmol)來自實例12A之化合物、158mg(1.0mmol)4,4-二氟哌啶鹽酸鹽與435μl(323mg,2.5mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺至5ml四氫呋喃中，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於120℃下反應30min。經製備性HPLC預純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)後，產物再經矽膠管柱層析法純化(移動相二氯甲烷/甲醇，10/1)。產量：29mg(理論值之10%)

HPLC(方法6)：R_t=3.49min；MS(ESIpos)：m/z=349[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.56(s,1H),8.39(s,1H),8.30(s,1H),7.87(s,1H),7.57(s,1H),3.91-3.81(m,4H),2.09(heptet,4H)。

實例12

1-{2-[6-(4,4-二氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-甲腈

取含200mg(1.4mmol)來自實例11A之化合物、262mg(1.7mmol)4,4-二氟哌啶鹽酸鹽與289μl(215mg,1.7mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之3ml水混合物於100℃下攪拌16小時。添加53μl(79mg,0.7mmol)三氟乙酸與324mg(1.4mmol)來自實例6A之化合物後，於100℃下攪拌反應混合物16小時。濾出沉澱固體，依序以水及乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：111mg(理論值之21%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.69min；MS(ESIpos)：m/z=373[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.55(s,1H),8.44(d,1H),8.33(s,1H),8.22(d,1H),7.60(br.s,1H),3.84(br.s,4H),2.09(heptet,4H)。

實例13

1-{2-[6-(4,4-二氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-1,2,3-三唑-4-甲腈

取含200mg(1.4mmol)來自實例11A之化合物、262mg(1.7mmol)4,4-二氟哌啶鹽酸鹽與289μl(215mg,1.7mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之3ml水混合物於100℃下攪拌16小時。添加53μl(79mg,0.7mmol)三氟乙酸與325mg(1.4mmol)來自實例7A之化合物後，於100℃下攪拌反應混合物16小時。濾出沉澱固體，依序以水及乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：34mg(理論值之7%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.77min；MS(ESIpos)：m/z=374[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=9.24(s,1H),8.59(s,1H),8.27(s,1H),7.54(s,1H),3.90(br.s,4H),2.12(heptet,4H)。

實例14

2-[6-(3,3-二氟吡咯啶-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-咪唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

先添加100mg(0.3mmol)來自實例13A之化合物、58mg(0.4mmol)3,3-二氟吡咯啶鹽酸鹽與175μl(130mg,1.0mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺至2ml四氫呋喃中，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於120℃下反應1小時。減壓濃縮後，殘質溶於乙腈/水，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：111mg(理論值之99%)

HPLC(方法6)：R_t=3.18min；MS(ESIpos)：m/z=334[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz，甲醇-d₄)：δ=8.41(s,1H),7.85(s,1H),7.62(s,1H),7.56(s,1H),7.29(s,1H),7.03(s,1H),3.91(t,2H),3.76(t,2H),2.55(heptet,2H)。

實例15

2-[6-(3,3-二氟吡咯啶-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

先添加100mg(0.8mmol)來自實例12A之化合物、57mg(0.4mmol)3,3-二氟吡咯啶鹽酸鹽與174μl(129mg,1.0mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺至2ml四氫呋喃中，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於120℃下反應30min。減壓濃縮後，殘質溶於乙腈/水，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：13mg(理論值之12%)

HPLC(方法6)：R_t=3.33min；MS(ESIpos)：m/z=335[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.42(s,1H),8.35(s,1H),7.72-7.66(m,3H),3.87(t,2H),3.65(t,2H),2.64-2.50(m，部份低於DMSO訊號，2H)。

實例16

1-{2-[6-(3,3-二氟吡咯啶-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-甲腈

取含200mg(1.4mmol)來自實例11A之化合物、238mg(1.7mmol)3,3-二氟吡咯啶鹽酸鹽與289μl(215mg,1.7mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之3ml水混合物於100℃下攪拌16小時。添加53μl(79mg,0.7mmol)三氟乙酸與324mg(1.4mmol)來自實例6A之化合物後，於100℃下攪拌反應混合物16小時。添加1毫升1N鹽酸至反應混合物中。濾出所得鹽酸鹽粗產物之沉澱，以乙醚洗滌及乾燥。粗產物仍含有未反應之起始物(實例11A之化合物)。因此，由粗產物與108μl(80mg,0.6mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺、10mg(0.1mmol)3,3-二氟吡咯啶鹽酸鹽與2ml水，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於170℃下反應15min。反應溶液經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：30mg(理論值之6%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.58min；MS(ESIpos)：m/z=359[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.55(s,1H),8.44(d,1H),8.33(s,1H),8.21(d,1H),7.26(br.s,1H),3.99(t,2H),3.75(br.s,2H),2.66-2.54(m，部份低於DMSO訊號，2H)。

實例17

1-{2-[6-(3,3-二氟吡咯啶-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-1,2,3-三唑-4-甲腈

取含200mg(1.4mmol)來自實例11A之化合物、238mg(1.7mmol)3,3-二氟吡咯啶鹽酸鹽與289μl(215mg,1.7mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之3ml水混合物於100℃下攪拌16小時。添加53μl(79mg,0.7mmol)三氟乙酸與325mg(1.4mmol)來自實例7A之化合物後，於100℃下攪拌反應混合物16小時。濾出沉澱固體，依序以水及乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：137mg(理論值之27%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.66min；MS(ESIpos)：m/z=360[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=9.25(s,1H),8.61(s,1H),8.29(s,1H),7.21(br.s,1H),4.06(t,2H),3.82(br.s,2H),2.69-2.55(m，部份低於DMSO訊號，2H)。

實例18

2-[6-(3,3-二氟氮雜環丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-咪唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

先添加100mg(0.3mmol)來自實例13A之化合物、52mg(0.4mmol)3,3-二氟氮雜環丁烷鹽酸鹽與175μl(130mg,1.0mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺至2ml四氫呋喃中，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於120℃下反應3小時。濾出沉澱固體，濾液減壓濃縮。殘質溶於乙腈/水，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：36mg(理論值之32%)

HPLC(方法6)：R_t=3.00min；MS(ESIpos)：m/z=320[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.42(s,1H),8.16(s,1H),7.79(s,1H),7.56(s,1H),7.50(s,1H),7.07(s,1H),4.49(t,4H)。

實例19

2-[6-(3,3-二氟氮雜環丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

先添加100mg(0.3mmol)來自實例12A之化合物、52mg(0.4mmol)3,3-二氟氮雜環丁烷鹽酸鹽與174μl(130mg,1.0mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺至2ml四氫呋喃中，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於120℃下反應30min。減壓濃縮後，殘質溶於乙腈/水，經製備性HPLC純化(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)。產量：36mg(理論值之34%)

HPLC(方法6)：R_t=3.20min；MS(ESIpos)：m/z=321[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.42(s,1H),8.39(s,1H),7.71(s,2H),7.62(s,1H),4.46(t,4H)。

實例20

1-{2-[6-(3,3-二氟氮雜環丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-甲腈

取含120mg(0.8mmol)來自實例11A之化合物、129mg(1.0mmol)3,3-二氟氮雜環丁烷鹽酸鹽與174μl(129mg,1.0mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之3ml水混合物於100℃下攪拌16小時。添加32μl(47mg,0.4mmol)三氟乙酸與194mg(0.8mmol)來自實例6A之化合物後，於100℃下攪拌反應混合物16小時。濾出沉澱固體，依序以水及乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：32mg(理論值之11%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=345[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.80-8.08(m,4H),7.25(s,1H),4.61(br.s,4H)。

實例21

1-{2-[6-(3,3-二氟氮雜環丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-1,2,3-三唑-4-甲腈

取含120mg(0.8mmol)來自實例11A之化合物、129mg(1.0mmol)3,3-二氟氮雜環丁烷鹽酸鹽與174μl(129mg,1.0mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之3ml水混合物於100℃下攪拌16小時。添加32μl(47mg,0.4mmol)三氟乙酸與194mg(0.8mmol)來自實例7A之化合物後，於100℃ 下攪拌反應混合物16小時。濾出沉澱固體，依序以水及乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：51mg(理論值之18%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.56min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=9.26(s,1H),8.60(s,1H),8.36(s,1H),7.18(s,1H),4.69(t,4H)。

實例22

4-(1H-咪唑-1-基)-2-[6-(1,4-氧氮雜環庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮鹽酸鹽

取含200mg(1.0mmol)來自實例5A之化合物、200mg(1.0mmol)來自實例14A之化合物與37μl(54mg,0.5mmol)三氟乙酸之3ml水混合物於100℃下攪拌16小時。經製備性HPLC(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)預純化後，粗產物與1毫升1N鹽酸攪拌，濾出，以乙醚洗滌產物，減壓乾燥。產量：21mg(理論值之6%)

LC-MS(方法4)：R_t=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=364[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=9.46(s,1H),8.56(s,1H),8.30(s,1H),8.06(t,1H),7.83(t,1H),7.50-7.33(m,1H),4.05(br.s,2H),3.91-3.70(m,4H),3.68(t,2H),2.04-1.73(m, 2H)。

實例23

2-[6-(1,4-氧氮雜環庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮鹽酸鹽

取含400mg(1.3mmol)來自實例12A之化合物與220mg(1.6mmol)1,4-氧氮雜環庚烷鹽酸鹽之4毫升丙烷-2-醇混合物，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於115℃下反應30min。添加232μl(172mg,1.3mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺，反應混合物於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於115℃下反應20min。減壓濃縮後，殘質溶於乙腈/水/三氟乙酸，經製備性HPLC層析(方法9)。取得自HPLC分離法之三氟乙酸鹽冷凍乾燥，使用2毫升1N鹽酸轉化成鹽酸鹽。產量：7mg(理論值之1%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.20min；MS(ESIpos)：m/z=329[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.54(s,1H),8.38(s,1H),8.25(s,1H),7.86(d,1H),7.35(br.s,1H),4.14-3.69(m,6H),3.67(t,2H),2.03-1.77(m,2H)。

實例24

2-[6-(1,4-氧氮雜環庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

取含500mg(1.7mmol)來自實例12A之化合物、688mg(5.0mmol)1,4-氧氮雜環庚烷鹽酸鹽與1.4ml(1077mg,8.3mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之混合物於10ml四氫呋喃/乙醇(1/1)中，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於140℃下反應30min。經製備性HPLC(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)預純化後，粗產物溶於乙腈/三氟乙酸，經製備性HPLC層析(方法10)。取得自HPLC分離法之三氟乙酸鹽冷凍乾燥，使用1N氫氧化鈉水溶液調整至pH=7-8。經製備性HPLC(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)單離產物。產量：176mg(理論值之31%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.19min；MS(ESIpos)：m/z=329[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.41(d,1H),8.33(d,1H),7.78(br.s,1H),7.72-7.70(m,2H),3.91-3.65(m,6H),3.62(t,2H),1.95-1.83(m,2H)。

實例25

1-{2-[6-(1,4-氧氮雜環庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-甲腈

取含200mg(0.9mmol)來自實例6A之化合物、178mg(0.9mmol)來自實例14A之化合物與33μl(49mg,0.4mmol)三氟乙酸之3ml水混合物於100℃下攪拌16小時。濾出沉澱固體，依序以水及乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：120mg(理論值之40%)

HPLC(方法6)：R_t=3.27min；MS(ESIpos)：m/z=353[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.52(s,1H),8.42(d,1H),8.25(s,1H),8.19(d,1H),7.39(br.s,1H),4.14-3.70(m,6H),3.66(t,2H),2.05-1.68(m,2H)。

實例26

1-{2-[6-(1,4-氧氮雜環庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-1,2,3-三唑-4-甲腈

取含200mg(0.9mmol)來自實例7A之化合物、178mg(0.9mmol)來自實例14A之化合物與33μl(49mg,0.4 mmol)三氟乙酸之3ml水混合物於100℃下攪拌16小時。濾出沉澱固體，依序以水及乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：80mg(理論值之27%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.40min；MS(ESIpos)：m/z=354[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=9.22(s,1H),8.56(s,1H),8.21(s,1H),7.45-7.26(m,1H),4.06(br.s,2H),3.92-3.71(m,4H),3.68(t,2H),2.06-1.74(m,2H)。

實例27

2-[6-(1,2-氧氮雜環己烷-2-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮

取含200mg(0.7mmol)來自實例12A之化合物、99mg(0.8mmol)1,2-氧氮雜環己烷鹽酸鹽[Bhat等人之J.Chem.Soc.Perkin Trans.2 2000,7,1435-1446]與348μl(258mg,2.0mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之4ml四氫呋喃混合物，於單一模式微波爐(Emrys Optimizer)中，於140℃下反應30min。經製備性HPLC(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)預純化後，粗產物溶於乙腈/水/甲醇，經製備性HPLC層析(方法11)。取得自HPLC分離法之甲酸鹽冷凍乾燥，使用1N氫氧化鈉水溶液調整至pH=7-8。經製備性 HPLC(RP18管柱；移動相：乙腈/水梯度)單離產物。產量：23mg(理論值之11%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.38min；MS(ESIpos)：m/z=315[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.58(d,1H),8.42(d,1H),8.40(br.s,1H),7.88(d,1H),7.66(br.s,1H),4.09(t,2H),3.98(t,2H),1.86-1.68(m,4H)。

實例28

1-{2-[6-(1,2-氧氮雜環己烷-2-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-甲腈

取含200mg(1.4mmol)來自實例11A之化合物、205mg(1.7mmol)1,2-氧氮雜環己烷鹽酸鹽[Bhat等人之J.Chem.Soc.Perkin Trans.2 2000,7,1435-1446]與289μl(215mg,1.7mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之3ml水混合物於100℃下攪拌1.5小時。添加59μl(49mg,0.4mmol)三氟乙酸與324mg(1.4mmol)來自實例6A之化合物後，於100℃下攪拌反應混合物16小時。濾出沉澱固體，依序以水及乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：199mg(理論值之39%)

LC-MS(方法5)：R_t=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=339[M+H]⁺； ¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=8.57(d,1H),8.45(d,1H),8.40(br.s,1H),8.23(d,1H),7.70(br.s,1H),4.07(t,2H),3.96(t,2H),1.85-1.65(m,4H)。

實例29

1-{2-[6-(1,2-氧氮雜環己烷-2-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-1,2,3-三唑-4-甲腈

取含200mg(1.4mmol)來自實例11A之化合物、205mg(1.7mmol)1,2-氧氮雜環己烷鹽酸鹽[Bhat等人之J.Chem.Soc.Perkin Trans.2 2000,7,1435-1446]與289μl(215mg,1.7mmol)N-乙基-N-(丙烷-2-基)丙烷-2-胺之3ml水混合物於100℃下攪拌1.5小時。添加59μl(49mg,0.4mmol)三氟乙酸與325mg(1.4mmol)來自實例7A之化合物後，於100℃下攪拌反應混合物16小時。濾出沉澱固體，依序以水及乙醚洗滌。產物減壓乾燥。產量：122mg(理論值之24%)

LC-MS(方法4)：R_t=1.66min；MS(ESIpos)：m/z=340[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ=9.28(s,1H),8.58(s,1H),8.36(s,1H),7.60(br.s,1H),4.12(t,2H),4.03(t,2H),1.88-1.70(m,4H)。

B. 藥理活性分析法

根據本發明化合物之藥理性質可依下列分析法證實：縮寫：DMEM 杜氏改良伊格氏培養基(Dulbecco's modified Eagle medium)

FCS 胎牛血清

TMB 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺

Tris 參(羥基甲基)胺基甲烷

1. 測定HIF脯胺醯基4-羥化酶抑制劑活性與選擇性之活體外試驗 1.a)對HIF脯胺醯基羥化酶之抑制活性：

羥化之HIF會專一性結合馮希伯-林道(von Hippel-Lindau)蛋白質-延伸蛋白B-延伸蛋白C複合物(VBC複合物)。這種交互作用僅發生在保留之脯胺醯基上之HIF被羥化時。其係HIF脯胺醯基羥化酶活性之生化測定基礎。該試驗係依文獻說明進行[Oehme F.,Jonghaus W.,Narouz-Ott L.,Huetter J.,Flamme I.,Anal.Biochem. 330(1),74-80(2004)]：取已塗佈NeutrAvidin HBC之透明96孔微滴定板(Pierce)，使用阻斷劑酪蛋白培養30分鐘。培養板再經每孔各200μl洗滌緩衝液(50mM Tris，pH 7.5、100mM NaCl，10%(v/v)阻斷劑酪蛋白、0.05%(v/v)Tween 20)洗滌3次。添加肽生物素-DLDLEMLAPYIPMDDDFQL(比利時4102 Seraing，Eurogentec公司)，濃度400nM/100μl洗滌緩衝液。以此肽作為脯胺醯基羥化受質，並與微滴定板結合。培養60分鐘後，以洗滌緩衝液洗滌微滴定板3次，與含1mM生物素之阻斷劑酪蛋白培養30分鐘後，再次以洗滌緩衝液洗滌3次。

進行脯胺醯基羥化酶反應時，取已與微滴定板結合之肽受質與含脯胺醯基羥化酶之溶胞液培養1至60分鐘。於室溫下，在100μl反應緩衝液(20mM Tris，pH 7.5、5mM KCl，1.5mM MgCl₂，1μM-1mM 2-側氧基戊二酸酯，10μM FeSO₄，2mM抗壞血酸)中反應。反應混合物亦含有各種不同試驗濃度之脯胺醯基羥化酶抑制劑。該試驗物質之濃度最好(但不一定)在1nM與100μM之間。以洗滌緩衝液洗滌微滴定板3次以中止反應。

定量脯胺醯基羥化反應時，添加同時包含來自大腸桿菌(E.coli)之硫氧化還原蛋白與VBC複合物之融合蛋白質之80μl結合緩衝液(50mM Tris，pH 7.5、120mM NaCl)。15分鐘後，添加10μl含來自兔子之多株抗硫氧化還原蛋白抗體之結合緩衝液溶液。再過30分鐘後，取10μl含已與辣根過氧化酶偶合之抗兔子免疫球蛋白偶合之結合緩衝液溶液。於室溫下培養30分鐘後，以洗滌緩衝液洗滌微滴定板3次，以排除未結合之VB複合物與抗體。為了測定VBC複合物之結合量，由微滴定板與TMB培養15分鐘。添加100μl 1M硫酸中止呈色反應。於450nm下測定光密度，決定VBC複合物結合量。其與肽受質中羥化脯胺酸量呈正相關性。

或者，可利用與銪(Perkin Elmer)偶合之VBC複合物來檢測脯胺醯基羥化程度。此時，VBC複合物之結合量係以隨時間變化之螢光度測定。亦可使用標記[³⁵S]-甲硫胺酸之VBC複合物。此時，於網織球溶胞液中，利用活體外轉錄-轉譯作用製備標記放射性之VBC複合物。

該具體實施例在此試驗中抑制HIF脯胺醯基羥化酶活性之IC₅₀值30μM。具體實施例之代表性IC₅₀值示於下表1中：

1.b)活體外之細胞功能試驗：

根據本發明化合物活性係採用重組體細胞株定量。細胞源自於人類肺癌瘤細胞株(A549，ATCC：美國菌種培養收集處，Manassas,VA 20108,USA)。該試驗細胞株依穩定方式，經包含螢火蟲Photinus pyralis螢光酶(下文中稱為螢光酶)報導子基因，於人工最小促進子之控制下進行轉染。該最小促進子包括TATA盒上游之兩個缺氧負責元素[Oehme F.,Ellinghaus P.,Kolkhof P., Smith T.J.,Ramakrishnan S.,Hütter J.,Schramm M.,Flamme I.,Biochem.Biophys.Res.Commun. 296(2),343-9(2002)]。在缺氧效應下(例如：於1%氧之存在下培養24小時)或於非選擇性二氧化酶抑制劑(例如：濃度100μM之去鐵胺(desferroxamine)，濃度100μM之氯化鈷或濃度1mM之N-草醯基甘胺酸二乙酯)之作用下，試驗細胞株會產生螢光酶，可藉由合適之生物發光試劑(例如：Steady-Glo® Luciferase Assay System螢光酶分析系統，美國Promega Corporation,Madison,WI 53711,USA)與合適光度計檢測及定量。

試驗法：試驗前一天，將經過精確計算之細胞量塗覆在384-或1,536-孔微滴定板之培養基(DMEM，10% FCS，2mM麩醯胺)中，並保持在細胞培養箱中(大氣濕度96%，5% v/v CO₂，37℃)。試驗當天，添加試驗物質至有標度濃度之培養基中。未添加試驗物質之細胞係作為陰性對照組。以測定細胞對抑制劑敏感性之試驗作為陽性對照組，例如：添加去鐵胺至終濃度100μM。添加試驗物質至微滴定板孔中6至24小時後，以光度計測定所得光訊號。藉由測定值畫出劑量/效應曲線，作為決定最大活性濃度一半值(稱為EC₅₀值)之基礎。

1.c)修飾基因表現之活體外細胞功能試驗

為了探討經過試驗物質處理之人類細胞株對專一性mRNA表現之修飾作用，取下列細胞株於6-或24-孔培養板上培養：人類肝腫瘤細胞(HUH，日本JCRB細胞銀行)、人類胚胎腎臟纖維母細胞(HEK/293，美國 ATCC,Manassas,VA 20108)、人類子宮頸癌瘤細胞(HeLa，美國ATCC,Manassas,VA 20108)、人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC，美國Cambrex,East Rutherford,New Jersey 07073)。添加試驗物質後24小時，以磷酸鹽緩衝之生理食鹽水洗滌細胞，使用合適方法取得總RNA(例如：Trizol^®試劑，德國Invitrogen GmbH,76131 Karlsruhe)。

典型之分析實驗中，各取1μg依此方式取得之總RNA，使用DNase I分解，使用合適之逆轉錄酶反應(ImProm-II逆轉錄酶系統，美國Promega公司，Madison,WI 53711)轉譯成互補DNA(cDNA)。各取2.5%依此方式取得之cDNA進行聚合酶鏈反應。利用實時定量性聚合酶鏈反應[TaqMan-PCR；Heid C.A.,Stevens J.,Livak K.J.,Williams P.M.,Genome Res. 6(10),986-94(1996)]，使用ABI Prism 7700序列檢測儀器(Applied Biosystems,Inc.)探討所試驗基因之mRNA表現程度。此時所採用引子-探針組合係利用Primer Express 1.5軟體產生(Applied Biosystems,Inc.)。明確言之，探討促紅血球生成素、碳酸酐酶IX、乳酸脫氫酶A與血管內皮細胞生長因子之mRNA。

根據本發明物質在源於人類之細胞中，會隨劑量變化而顯著提高缺氧所誘發基因之mRNA。

2. 檢測心血管系統中作用之活體內試驗 2.a)修飾基因表現之活體內試驗：

取溶於合適溶劑中之試驗化合物，對小鼠或大鼠使用胃管經口投藥、經腹膜內投藥或經靜脈內投藥。典型劑量為每公斤體重投與0.1、0.5、1、5、10、20、50、100與300mg物質。對照組動物僅接受投與溶劑。投與試驗物質後4、8或24小時，以過量異氟烷(isoflurane)殺死動物，隨後切下頸部及取出待試驗之器官。取一部份器官於液態氮中急速冷凍。依B.1.a)之說明，自部份器官中得到總RNA，並轉譯成cDNA。採用實時定量性聚合酶鏈反應，使用ABI Prism 7700序列檢測儀器(Applied Biosystems,Inc.)探討待試驗基因之mRNA之表現程度[TaqMan-PCR；Heid C.A.,Stevens J.,Livak K.J.,Williams P.M.,Genome Res. 6(10),986-94(1996)]。

相較於安慰劑對照組，在經口或非經腸式投與根據本發明物質後，使腎臟中促紅血球生成素之mRNA隨劑量變化而顯著提高。

2.b)血清中促紅血球生成素含量測定法：

取含於合適溶劑中之試驗物質經腹膜內或經口投與小鼠或大鼠，一天一次或兩次。典型劑量為每公斤體重投與0.1、0.5、1、5、10、20、50、100與300mg物質。安慰劑對照組動物僅接受投與溶劑。投藥前及最後一次投與試驗物質後4小時，在短暫麻醉下，自動物眼後靜脈叢或尾靜脈抽出50μl血液。添加肝素鋰防止血液凝結。離心得到血漿。利用促紅血球生成素-ELISA(Quantikine^®小鼠Epo免疫分析法，美國Minneapolis市R&D Systems公司)，依據製造商之指示，測定血漿中促紅血球生成素含量。利用小鼠所測定之促紅血球生成素參考值，將測定值換算成pg/ml。

相較於起始值及安慰劑對照組，在經口或非經腸式投與根據本發明物質後，使血漿中促紅血球生成素隨劑量變化而顯著提高。

2.c)周邊血液之細胞組成測定法：

取含於合適溶劑中之試驗物質經腹膜內或經口投與小鼠或大鼠，一天一次或兩次，共進行數天。典型劑量為每公斤體重投與0.1、0.5、1、5、10、20、50、100與300mg物質。對照組動物僅接受投與溶劑。試驗結束時，在短暫麻醉下，自動物眼角靜脈叢或尾靜脈抽出血液。添加檸檬酸鈉防止血液凝結。以適當電子測定儀器測定血樣中紅血球、白血球及血小板濃度。利用血液抹片，使用適合此目的之染色溶液(KABE Labortechnik,Nümbrecht)，經由顯微鏡，分別在1000個紅血球中篩選測定網織球濃度。利用血球容積毛細管自眼後靜脈叢抽出血液，毛細管在適合此目的之離心機中離心後，手動讀取血球容積值。

相較於起始值及安慰劑對照組，在經口或非經腸式投與根據本發明物質後，使血球容積、紅血球數量與網織球隨劑量變化而顯著提高。

3. 溶解度測定法 起始溶液(初始溶液)製法：

準確稱取至少1.5mg試驗物質加至附有螺旋蓋及瓶塞之寬口10mm螺旋蓋V形瓶(來自Glastechnik Gräfenroda GmbH公司，產品編號8004-WM-H/V15μ)中，添加DMSO至濃度50mg/ml，混合物渦轉30分鐘。

校準溶液製法：

所需之定量吸取步驟係於1.2ml之96孔深孔分析板(DWP)上，使用自動化液體操作機器進行。所使用溶劑為乙腈/水8：2之混合物。

校準溶液之起始溶液製法(儲備母液)：添加833μl溶劑混合物至10μl初始溶液(濃度=600μg/ml)，混合物均質化。各試驗物質分別在DWP中，製備1：100稀釋液，並使稀釋液均質化。

校準溶液5(600ng/ml)：添加270μl溶劑混合物至30μl母液中，混合物均質化。

校準溶液4(60ng/ml)：添加270μl溶劑混合物至30μl校準溶液5中，混合物均質化。

校準溶液3(12ng/ml)：添加400μl溶劑混合物至100μl校準溶液4中，混合物均質化。

校準溶液2(1.2ng/ml)：添加270μl溶劑混合物至30μl校準溶液3中，混合物均質化。

校準溶液1(0.6ng/ml)：添加150μl溶劑混合物至150μl校準溶液2中，混合物均質化。

樣本溶液製法：

所需之定量吸取步驟係於1.2ml之96孔深孔分析板(DWP)上，使用自動化液體操作機器進行。添加1000μl PBS緩衝液pH 6.5至10.1μl母液中(PBS緩衝液pH 6.5：稱取61.86g氯化鈉、39.54g磷酸二氫鈉與83.35g 1N氫氧化鈉水溶液加至1升定量燒瓶中，在燒瓶中添加水，攪拌混合物約1小時。由此溶液取500ml加至5升定量燒瓶中，加水至燒瓶中。使用1N氫氧化鈉水溶液調整pH至6.5)。

操作法：

所需之定量吸取步驟係於1.2ml之96孔DWP上，使用自動化液體操作機器進行。使用調節溫度之振盪器，使依此方式製備之樣本溶液於20℃與1400rpm下振盪24小時。由此等溶液中分別取出180μl，移至Beckman polyallomer離心管中。此等溶液於約223 000 x g下離心1小時。自各樣本溶液中取出100μl上清液，使用PBS緩衝液6.5稀釋1：10與1：1000。

分析法：

以HPLC/MS-MS分析樣本。使用試驗化合物之5點校準曲線定量。溶解度以mg/l表示。分析順序：1)空白組(溶劑混合物)；2)校準溶液0.6ng/ml；3)校準溶液1.2ng/ml；4)校準溶液12ng/ml；5)校準溶液60ng/ml；6)校準溶液600ng/ml；7)空白組(溶劑混合物)；8)樣本溶液1：1000；7)樣本溶液1：10。

HPLC/MS-MS法

HPLC：Agilent 1100，定量幫浦(G1311A)、自動取樣器CTC HTS PAL，脫氣機(G1322A)與管柱恆溫器(G1316A)；管柱：Oasis HLB 20mm x 2.1mm，25μ；溫度：40℃；移動相A：水+0.5毫升甲酸/升；移動相B：乙腈+0.5毫升甲酸/升；流速：2.5ml/min；停止時間1.5min；梯度：0min 95% A，5% B；跳升：0-0.5min 5% A，95% B；0.5-0.84 min 5% A，95% B；跳升：0.84-0.85min 95% A，5% B；0.85-1.5min 95% A，5% B。

MS/MS：Waters Quattro Micro Tandem MS/MS；Z-Spray API介面；HPLC-MS初始分流器1：20；以ESI模式測定。

C. 醫藥組合物之具體實施例

根據本發明化合物可依下列方式轉化成醫藥調配物：

錠劑：組成：

100mg根據本發明化合物、50mg乳糖(單水合物)、50mg玉米澱粉(天然)、10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(德國Ludwigshafen市BASF公司)與2mg硬脂酸鎂。

錠劑重量212mg。直徑8mm，彎曲半徑12mm。

製法：

取含根據本發明化合物、乳糖與澱粉之混合物與濃度5%(w/w)之PVP水溶液製成顆粒。乾燥後，顆粒與硬脂酸鎂混合5分鐘。使用一般壓錠機壓縮混合物(錠劑格式參見上文)。建議使用之壓縮力為15kN。

經口投藥用之懸浮液：組成：

1000mg根據本發明化合物、1000mg乙醇(96%)、400mg Rhodigel^®(來自美國賓州FMC公司之黃原膠)與99g水。

10毫升口服懸浮液相當於單獨劑量100mg根據本發明化合物。

製法：

取Rhodigel懸浮於乙醇，添加根據本發明化合物至懸浮液中。攪拌加水。攪拌混合物約6小時，直到Rhodigel結束膨脹為止。

口服用溶液：組成：

500mg根據本發明化合物、2.5g聚山梨酸酯與97g聚乙二醇400。20g口服溶液相當於個別劑量100mg根據本發明化合物。

製法：

取根據本發明化合物攪拌懸浮於聚乙二醇與聚山梨酸酯之混合物中。持續攪拌操作，直到根據本發明化合物完全溶解為止。

經靜脈內溶液：

取根據本發明化合物以低於飽和溶解度之濃度溶於生理上可接受之溶劑(例如：等張性生理食鹽水溶液、5%葡萄糖溶液與/或30%PEG 400溶液)中。溶液經過無菌過濾，移入無菌且無熱原注射容器中。

Claims

一種如下式化合物，其中X代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表哌-1-基，其中哌-1-基經一個取代基取代，其中該取代基係選自C₃-C₆-環烷基所組成群，或其一種鹽。
根據申請專利範圍第1項之化合物，其特徵在於X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表哌-1-基，其中哌-1-基之4-位置經一個取代基取代，其中該取代基係選自C₃-C₆-環烷基所組成群，或其一種鹽。
根據申請專利範圍第1項之化合物，其特徵在於X 代表N或CH，R¹ 代表氫，R² 代表哌-1-基，其中哌-1-基之4-位置經一個取代基取代，其中該取代基係選自C₃-C₆-環烷基所組成群，或其一種鹽。
根據申請專利範圍第1項之化合物，其特徵在於X 代表N或CH，R¹ 代表氫或氰基，R² 代表4-環丁基哌-1-基，或其一種鹽。
根據申請專利範圍第1項之化合物，其為2-[6-(4-環丁基哌-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮，具有下式或其一種鹽。
根據申請專利範圍第1項之化合物，其為2-[6-(4-環丁基哌-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮，具有下式
根據申請專利範圍第1項之化合物，其為1-{2-[6-(4-環丁基哌-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-甲腈，具有下式或其一種鹽。
根據申請專利範圍第1項之化合物，其為1-{2-[6-(4-環丁基哌-1-基)嘧啶-4-基]-3-側氧基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-甲腈，具有下式
一種製備根據申請專利範圍第1項之式(I)化合物或其鹽之方法，其特徵在於[A]由如下式化合物其中R¹如申請專利範圍第1項之定義，及Z¹ 代表甲基或乙基，於惰性溶劑中，若適當時，於酸之存在下，與如下式化合物反應其中R²如申請專利範圍第1項之定義，產生如下式化合物其中Z¹、R¹與R²如申請專利範圍第1項之定義，其在此等反應條件下或於接續反應步驟中，於鹼之影響下，環化產生式(I)化合物，且式(I)化合物若適當時，與適當之(i)溶劑與/或(ii)鹼或酸反應，轉化成其一種鹽，或[B]由如下式化合物其中Z¹與R¹如申請專利範圍第1項之定義，與如下式化合物縮合其中Z² 代表甲基或乙基，產生如下式化合物其中Z¹與R¹如申請專利範圍第1項之定義，然後於酸之存在下，與式(III)化合物反應，產生式(IV)化合物，其在此等反應條件下或於接續反應步驟中，於鹼之影響下，環化產生式(I)化合物，式(I)化合物若適當時，與適當之(i)溶劑與/或(ii)鹼或酸反應，轉化成其一種鹽、其溶劑合物或其鹽之溶劑合物，或[C]由如下式化合物於作為溶劑之水中，於同爐反應中，先與如下式化合物反應其中R²如申請專利範圍第1項之定義，然後與式(VII)化合物反應，產生式(I)化合物，式(I)化合物若適當時，與適當之(i)溶劑與/或(ii)鹼或酸反應，轉化成其一種鹽。
根據申請專利範圍第1至8項中任一項之化合物，其係供治療與/或預防疾病。
一種以根據申請專利範圍第1至8項中任一項之化合物於製備醫藥供治療心血管疾病、心臟功能不足、貧血、慢性腎臟疾病與腎功能不足上之用途。
一種醫藥品，其包含根據申請專利範圍第1至8項中任一項之化合物與惰性無毒之醫藥上合適之輔劑組合。
根據申請專利範圍第12項之醫藥品，其係與另一種或多種選自下列所組成群中之化合物組合：ACE抑制劑、血管收縮素II受體擷抗劑、β受體阻斷劑、鈣擷抗劑、PDE抑制劑、礦物皮質激素受體擷抗劑、利尿劑、阿斯匹靈、鐵補充劑、維生素B12與葉酸補充劑、斯塔汀抑制素(statins)、毛地黃(毛地黃毒苷)衍生物、腫瘤化療劑與抗生素。
根據申請專利範圍第13項之醫藥品，其係供治療心血管疾病、心臟功能不足、貧血、慢性腎臟疾病與腎功能不足。
根據申請專利範圍第1至8項中任一項所定義之化合物，其係用於治療心血管疾病、心臟功能不足、貧血、慢性腎臟疾病與腎功能不足之方法。