CN102015685B - 作为hif-脯氨酰基-4-羟化酶抑制剂的取代的二氢吡唑啉酮类化合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及新的取代的二氢吡唑啉酮衍生物，它们的制备方法，它们用于治疗和/或预防疾病的用途和它们在制备用于治疗和/或预防疾病特别是心血管和血液学疾病、肾病，和用于促进伤口愈合的药物中的用途。

Description

作为HIF-脯氨酰基-4-羟化酶抑制剂的取代的二氢吡唑啉酮类化合物
技术领域
本申请涉及新的取代的二氢吡唑啉酮(pyrazolon)衍生物，它们的制备方法，它们用于治疗和/或预防疾病的用途以及它们在制备用于治疗和/或预防疾病特别是心血管和血液学疾病、肾病，以及用于促进伤口愈合的药物中的用途。
背景技术
人有机体或者其部件的供氧不足，或者由于其持续时间和/或其程度，其损害有机体或者其部件的正常功能或者导致其功能完全停顿，被称为缺氧。缺氧可以由吸入的空气中可获得的氧的减少(例如在高海拔期间)、通过外呼吸障碍(例如由于肺功能紊乱或者呼吸道阻塞)、通过心输出量的减少(例如在心功能不全、伴有肺栓塞的急性右心室超负荷的事件中)、通过血液的输氧能力过低(例如由于贫血(贫血)或者中毒，例如一氧化碳中毒)、由于血管闭塞引起供血不足导致的局部受限(通常例如心脏、下肢或者脑的局部缺血状态，糖尿病大血管病变和微血管病变)或者由于组织的需氧量增加(例如由于增加的肌肉活动或者局部炎症)引起[Eder，Gedigk(编)，Allgemeine Pathologie undpathologische Anatomie，第33版，Springer Verlag，Berlin，1990]。
人有机体能够在有限程度上适应急性和慢性供氧减少的情况。除了立即应答(其特别包括心输出量和呼吸输出量的增加的通过植物神经控制机制和血管局部扩张)外，缺氧会造成许多基因转录的改变。这里，基因产品的功能用于补偿缺氧。因此，多种糖酵解和葡萄糖载体1的酶的表达增强，由此厌氧ATP生成增加并且使得缺氧存活成为可能[Schmidt，Thews(编)，Physiologie des Menschen，第27版，SpringerVerlag，Berlin，1997；Petrides(编)，Biochemie undPathobiochemie，第7版，Springer Verlag，Berlin，2003]。
缺氧还会导致血管内皮细胞生长因子VEGF的表达增强，由此促进了缺氧组织中血管的再生(血管发生)。从而长期改善通过局部缺血组织的血流量。在各种心血管疾病和血管闭塞疾病情况中这种反调节显然是远远不够的[在：Simons和Ware，Therapeutic angiogenesis incardiovascular disease，Nat.Rev.Drug.Discov.2(11)，863-71(2003)中综述]。
此外，在全身性缺氧情况下，主要在肾间质成纤维细胞中形成的肽激素红细胞生成素的表达增强。从而刺激了骨髓中红细胞的形成，并且因此提高了血液的输氧能力。这种作用已经并且被高水平运动员在所谓的高海拔训练中应用。血液输氧能力的降低例如由于出血后的贫血通常会导致肾脏中红细胞生成素生成的增加。对于某些形式的贫血，这种调节机制可能被干扰或者其正常值可能被调低。因此例如在患有肾功能不全的患者中，虽然在肾实质中的确生成了红细胞生成素，但是相对于血液的输氧能力而言是以显著降低的量生成的，其导致所谓的肾性贫血。特别是肾性贫血，以及肿瘤和HIV感染引起的贫血通常通过胃肠外给予重组人红细胞生成素(rhEPO)进行治疗。目前对于这种昂贵的疗法还不存在使用可口服药物的替代疗法[在：Eckardt，The potential oferythropoietin and related strategies to stimulate erythropoiesis，Curr.Opin.Investig.Drugs 2(8)，1081-5(2001)；Berns，Should the targethemoglobin for patients with chronic kidney disease treated witherythropoietic replacement therapy be changed？，Semin.Dial.18(1)，22-9(2005)中综述]。最近的研究表明，除了其红细胞生成增强作用外，红细胞生成素对于缺氧组织，特别是心和脑还具有不依赖于此的保护(抗细胞凋亡)作用。此外，根据最近的研究，使用红细胞生成素的疗法降低了患有心功能不全的患者发病的平均严重程度[在：Caiola andCheng，Use of erythropoietin in heart failure management，Ann.Pharmacother.38(12)，2145-9(2004)；Katz，Mechanisms and treatmentof anemia in chronic heart failure，Congest.Heart.Fail.10(5)，243-7(2004)中综述]。
上述通过缺氧诱导的基因具有共同的特征，即在缺氧条件下其表达的增加由所谓的缺氧可诱导的转录因子(HIF)引起。HIF是杂二聚体转录因子，其包含α和β亚基。已经描述了三种HIFα同工型(Isoformen)，其中HIF-1α和HIF-2α是高度同源性的，并且对于缺氧-诱导基因表达是重要的。虽然β亚基(其中已经描述了两种(Isoformen))，也称为ARNT(芳香烃受体核转位分子)，是组成性表达的，但α亚基的表达取决于细胞中的氧含量。在含氧量正常条件下，HIFα蛋白是聚泛素化的并且随后被蛋白酶体降解。在缺氧条件下这种降解受到抑制，以致于HIFα与ARNT二聚化并且可以激活它的靶基因。这里，HIF二聚体与其靶基因调节序列中所谓的缺氧反应元件(HRE)结合。HRE通过共有序列进行定义。在许多缺氧-诱导基因的调控元件中已经检测到功能性HRE[在：Semenza，Hypoxia-inducible factor 1：oxygen homeostasis anddisease pathophysiology，Trends Mol.Med.7(8)，345-50(2001)；Wenger和Gassmann，Oxygen(es)and the hypoxia-inducible factor-1，Biol.Chem.378(7)，609-16(1997)中综述]。
HIFα的这种调节所依据的分子机制已经被多个彼此独立的研究小组的工作所阐明。该机制在物种间是保守的：HIFα通过称为PHD或者EGLN的氧依赖性脯氨酰基-4-羟化酶的亚类在两个特定的脯氨酰基残基(人HIF-1α亚基的P402和P564)上羟基化。HIF-脯氨酰基-4-羟化酶是铁依赖性的、2-氧代戊二酸转化双加氧酶[Epstein等，C.elegansEGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases thatregulate HIF by prolyl hydroxylation，Cell 107(1)，43-54(2001)；Bruick andMcKnight，A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF，Science 294(5545)，1337-40(2001)；Ivan等，Biochemical purificationand pharmacological inhibition of a mammalian prolyl hydroxylase actingon hypoxia-inducible factor，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(21)，13459-64(2002)]。该酶在2001年第一次被注释为脯氨酰基-羟化酶[Aravind和Koonin，The DNA-repair protein AlkB，EGL-9，and leprecandefine new families of 2-oxoglutarate-and iron-dependent dioxygenases，Genome Biol.2(3)，research0007.1-0007.8，Epub 2001年2月19日]。
pVHL肿瘤抑制蛋白，其与延伸蛋白B和C一起形成所谓的VBC复合物，其使HIFα亚基适应E3泛素连接酶，与脯氨酰羟基化HIFα亚基结合。由于HIFα亚基的脯氨酰基-4-羟基化及其随后的降解作为氧的细胞内浓度的函数发生，HIF-脯氨酰基-4-羟化酶还被称为细胞氧传感器。已经鉴定了这些酶的三种同工型：EGLN1/PHD2、EGLN2/PHD1和EGLN3/PHD3。这些酶的两种(EGLN2/PHD1和EGLN3/PHD3)本身甚至在缺氧条件下也被转录诱导，并且可能负责在长期缺氧条件下所观测到的HIFα水平的降低[在：Schofield和Ratcliffe，Oxygen sensing byHIF hydroxylases，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.5(5)，343-54(2004)中的综述]。
HIF-脯氨酰基-4-羟化酶的选择性药理学抑制导致HIF-依赖性靶基因的基因表达增加，并且因此对很多疾病综合征的治疗是有益的。特别是在心血管系统疾病的情况下，预期疾病期间的改善来自新血管的诱导和局部缺血器官中代谢条件从需氧到厌氧ATP生成的改变。慢性创伤血管化的改善促进愈合过程，特别是在难以愈合的小腿溃疡和其它慢性皮肤创伤的情况下。在某些疾病形式特别是在患有肾性贫血的患者中，内源性红细胞生成素的诱导同样是所寻求的治疗目标。
迄今在科学文献中描述的HIF-脯氨酰基-4-羟化酶抑制剂没有满足施加在药物上的需要。这些或者是竞争性的氧代戊二酸类似物(诸如例如N-草酰基甘氨酸)，特征在于它们非常低的作用效力，并且因此在体内模型中在HIF靶基因的诱导方面迄今显示没有作用。或者它们是铁络合剂(螯合剂)，例如去铁敏，其用作含铁双加氧酶的非特异性抑制剂，虽然它们导致靶基因，诸如例如红细胞生成素在体内的诱导，明显通过络合可利用的铁阻碍红细胞生成。
在EP 165 448和EP 212 281中公开了具有杀菌和/或杀真菌作用的2-杂芳基-4-芳基-1，2-二氢吡唑啉酮类化合物。在EP 183 159中请求保护2-杂芳基-4-芳基-1，2-二氢吡唑啉酮作为脂氧合酶抑制剂用于治疗呼吸道、心血管和炎性疾病的用途。在DE 2 651 008中描述了具有除草剂活性的2，4-二苯基-1，2-二氢吡唑啉酮类化合物。在Helv.Chim.Acta 49(1)，272-280(1966)中报道了某些2-吡啶基-1，2-二氢吡唑啉酮的制备和药理学性质。在WO 96/12706、WO 00/51989和WO 03/074550中请求保护用于治疗各种疾病的具有二氢吡唑啉酮部分结构的化合物，和在WO 2006/101903中公开了用于治疗神经精神病的羟基-或者烷氧基-取代的联吡唑。在WO 03/051833和WO 2004/089303中还描述了用于治疗疼痛和各种ZNS疾病的杂芳基-取代的吡唑衍生物。在WO 2006/114213中同时公开了作为HIF-脯氨酰基-4-羟化酶抑制剂的2，4-二吡啶基-1，2-二氢吡唑啉酮。
在Acta Crystallogr.，Section E：Structure Reports Online E57(11)，o1126-o1127(2001)[Chem.Abstr.2001：796190]中报道了化合物3-甲基-1-(吡啶-2-基)-4-(1-吡啶-2-基-3-甲基-1H-吡唑-5-基)-2H-3-吡唑啉-5(1H)-酮(其它名称：5，5′-二甲基-2，2′-二吡啶-2-基-1′，2′-二氢-2H，3′H-3，4′-联吡唑-3′-酮)的X-射线晶体结构。在Indian J.Heterocyclic Chem.3(1)，5-8(1993)[Chem.Abstr.1994：323362]中描述了某些3′，5-二甲基-2-苯基-1′-(1，3-噻唑-2-基)-1′H，2H-3，4′-联吡唑-5′-醇衍生物的合成。在J.Hetero-cyclic Chem.27(4)，865-870(1990)[Chem.Abstr.1991：428557]中报道了个别4-(吡唑-5-基)吡唑啉-5-酮衍生物的制备和互变异构现象。迄今还未描述这些出版物中提及的化合物的治疗应用。化合物2-叔-丁基-1′-[4-(4-氯苯基)-1，3-噻唑-2-基]-3’，5-二甲基-1′H，2H-3，4′-联吡唑-5′-醇在WO 2007/008541中被列为试验实施例。
发明内容
本发明的目的在于提供新的化合物，其可以用于治疗疾病，特别是心血管和血液学疾病。
在本发明上下文中，目前描述的化合物用作HIF-脯氨酰基-4-羟化酶的特异性抑制剂，并且在胃肠外或者口服给药后，基于这种特异性作用机制在体内导致HIF靶基因，诸如例如红细胞生成素的诱导，以及由此引起的生物学过程，诸如例如红细胞生成。
本发明的主题是式(I)化合物：
其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示通过氮原子连接的饱和的4-至7-元杂环基，
其中杂环基可以被取代基取代，其中所述取代基选自羟基、羟基羰基、C1-C3-烷基、C1-C3-烷基氨基和C3-C6-环烷基，
或者
其中杂环基可以被1-4个氟取代基取代，
或其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
根据本发明的化合物是式(I)化合物和它们的盐、溶剂化物和盐的溶剂化物，以及包括在式(I)中并且在下文中作为具体实施例提及的化合物和它们的盐、溶剂化物和盐的溶剂化物，只要其中包含在式(I)中并且在下文中提及的化合物本身在两种情况下还不是盐、溶剂化物和盐的溶剂化物。
根据本发明的化合物可以以立体异构形式(对映异构体，非对映异构体)存在，取决于它们的结构。因此本发明包括对映异构体或者非对映异构体以及它们各自的混合物。立体异构体相同的组分可以由对映异构体和/或非对映异构体的这种混合物以已知的方式分离。
如果根据本发明的化合物可以以互变异构形式存在，那么本发明包括所有的互变异构形式。
在本发明上下文中优选的盐是根据本发明的化合物的生理学上可接受的盐。还包括本身不适于药用但可以例如用于根据本发明的化合物的分离或者纯化的盐。
根据本发明的化合物的生理学上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的酸加成盐。
根据本发明的化合物的生理学上可接受的盐还包括常用碱的盐，诸如例如并优选碱金属盐(例如钠和钾盐)、碱土金属盐(例如钙和镁盐)和衍生自氨或者具有1-16个C原子的有机胺的铵盐，诸如例如并优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄基胺、N-甲基-吗啉、精氨酸、赖氨酸、乙二胺和N-甲基哌啶的铵盐。
在本发明上下文中溶剂化物被描述为根据本发明的化合物通过与溶剂分子配位形成固态或者液态配合物的形式。水合物是溶剂化物的一种特殊形式，其中与水发生配位。在本发明上下文中水合物是优选的溶剂化物。
此外，本发明还包括根据本发明的化合物的前药。术语“前药”包括其本身是生物学活性或者非活性的，但是在其体内停留期间转化(例如代谢或者水解)为根据本发明的化合物的化合物。
在本发明上下文中，取代基具有下列含义，除非另外说明：
烷基本身和烷基氨基中的“烷基”表示具有1-3个碳原子的直链或者支链烷基，例如并优选甲基、乙基、正丙基、异丙基。
烷基氨基表示具有一个或者两个(彼此独立选择)烷基取代基的烷基氨基，例如并优选甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、异丙基氨基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、N-乙基-N-甲基氨基、N-甲基-N-正丙基氨基和N-异丙基-N-正丙基氨基。例如，C1-C3-烷基氨基表示具有1-3个碳原子的单烷基氨基或者表示每个烷基取代基具有各自1-3个碳原子的二烷基氨基。
环烷基表示通常具有3-6个碳原子的单环的环烷基；可以提及的环烷基例如并优选为环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
通过氮原子连接的饱和的4-至7-元杂环基表示具有4-7个环原子的单环饱和的杂环基，所述环原子含有一个通过其连接的氮原子和至多两个，优选至多一个选自N、O、S、SO、SO2的其他杂原子和/或杂基团，其中氮原子还可以形成N-氧化物。优选是具有至多一个选自O、N和S的其他杂原子的4-至7-元单环饱和的杂环基，例如并优选氮杂环丁烷-1-基、吡咯啉-1-基，哌啶-1-基，吗啉-4-基，硫代吗啉-4-基，哌嗪-1-基，1，2-嗪烷(oxazinan)-2-基，1，4-氧氮杂环庚烷-4-基，1，4-硫氮杂环庚烷-4-基。
优选的是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示通过氮原子连接的饱和的4-至7-元杂环基，
其中杂环基被1-4个氟取代基取代，
或者
R2 表示哌嗪-1-基，
其中哌嗪-1-基被取代基取代，其中所述取代基选自C3-C6-环烷基，
或者
R2 表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基被取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、C1-C3-烷基、C1-C3-烷基氨基和C3-C6-环烷基，
或者
R2表示1，2-嗪烷-2-基或者1，4-氧氮杂环庚烷-4-基，及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
优选是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示氮杂环丁烷-1-基、吡咯啉-1-基或者哌啶-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基、吡咯啉-1-基和哌啶-1-基被1-4个氟取代基取代，
或者
R2 表示哌嗪-1-基，
其中哌嗪-1-基在4-位被取代基取代，其中所述取代基选自C3-C6-环烷基，
或者
R2 表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基在3-位被取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、甲基和二甲基氨基，
或者
R2 表1，2-嗪烷-2-基或者1，4-氧氮杂环庚烷-4-基，及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
还优选是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示通过氮原子连接的饱和的4-至7-元杂环基，
其中杂环基被1-4个氟取代基取代，
及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
还优选的是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示氮杂环丁烷-1-基、吡咯啉-1-基或者哌啶-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基、吡咯啉-1-基和哌啶-1-基被1-4个氟取代基取代，
及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
还优选的是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示氮杂环丁烷-1-基、吡咯啉-1-基或者哌啶-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基、吡咯啉-1-基和哌啶-1-基被2个氟取代基取代，其中这些取代基连接在相同的碳原子上，
及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
还优选的是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示哌嗪-1-基，
其中哌嗪-1-基被取代基取代，其中所述取代基选自C3-C6-环烷基，
及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
还优选的是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示哌嗪-1-基，
其中哌嗪-1-基在4-位被取代基取代，其中所述取代基选自C3-C6-环烷基，
及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
还优选的是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基被取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、C1-C3-烷基、C1-C3-烷基氨基和C3-C6-环烷基，
及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
还优选的是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基被取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、甲基和二甲基氨基，
及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
还优选的是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基在3-位被取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、甲基和二甲基氨基，
及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
还优选的是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氢或者氰基，
R2 表示1，2-嗪烷-2-基或者1，4-氧氮杂环庚烷-4-基。
还优选是式(I)化合物，其中X表示N。
还优选是式(I)化合物，其中R1表示氢。
还优选是式(I)化合物，其中R1表示氰基。
还优选是式(I)化合物，其中R2表示4-环丁基-哌嗪-1-基。
还优选是式(I)化合物，其中
X  表示N或者CH，
R1 表示氰基，
R2 表示通过氮原子连接的饱和的4-至7-元杂环基，
其中杂环基被取代基取代，其中所述取代基选自羟基、羟基羰基、C1-C3-烷基、C1-C3-烷基氨基和C3-C6-环烷基，
或者
其中杂环基被1-4个氟取代基取代，
及其盐、其溶剂化物和其盐的溶剂化物。
在基团的特定组合或者优选组合中详细给出的基团定义还可以根据需要被其它组合的基团定义替代，不依赖于各自所给出的基团的组合。
两种或者多种上述优选的范围的组合是非常特别优选的。
根据本发明的式(I)的1，2-二氢吡唑-3-酮衍生物还可以以互变异构的1H-吡唑-5-醇形式(I′)存在(参见下文方案1)；两种互变异构形式明确包括在本发明中。
方案1
本发明的主题还是制备式(I)化合物、或其盐、其溶剂化物或者其盐的溶剂化物的方法，其中，根据该方法
[A]式(II)化合物
其中R1具有上文给出的含义，和
Z1 表示甲基或者乙基，
在惰性溶剂中，任选在酸存在下，与式(III)化合物反应
其中R2具有上文给出的含义，
得到式(IV)化合物，
其中Z1、R1和R2具有上文给出的含义，
其已经在这些反应条件下或者在随后的反应步骤中在碱的影响下环化，以得到式(I)化合物，
和式(I)化合物任选用合适的(i)溶剂和/或(ii)碱或者酸，转化为它的盐、它的溶剂化物或者它的盐的溶剂化物，
或者
[B]式(V)化合物
其中Z1和R1具有上文给出的含义，
与式(VI)化合物缩合
其中
Z2 表示甲基或者乙基，
得到式(VII)化合物，
其中Z1和R1具有上文给出的含义，
然后在酸存在下与式(III)化合物反应，得到式(IV)化合物，其已经在这些反应条件下或者在随后的反应步骤中在碱的影响下环化，得到式(I)化合物，
和式(I)化合物任选用合适的(i)溶剂和/或(ii)碱或者酸，转化为它的盐、它的溶剂化物和它的盐的溶剂化物，
或者
[C]式(VIII)化合物
在作为溶剂的水中在一锅煮法中，首先与式(IX)化合物反应，
R2-H          (IX)，
其中R2具有上文给出的含义，
然后与式(VII)化合物反应得到式(I)化合物，
和式(I)化合物任选用合适的(i)溶剂和/或(ii)碱或者酸，转化为它的盐、它的溶剂化物和它的盐的溶剂化物。
盐的游离碱可以通过将化合物的盐或者化合物的盐的溶剂化物与碱反应获得。
合适的碱是碱金属氢氧化物，诸如，例如氢氧化钠或者氢氧化钾，碱金属或者碱土金属碳酸盐，诸如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙或者碳酸铯，或者氨水溶液。
在替代方法中，盐的游离碱可以，例如，通过色谱法在反相柱上使用添加了碱的乙腈/水梯度获得，特别是通过使用RP18 Phenomenex LunaC18(2)柱和二乙胺作为碱获得。
本发明的主题还是制备式(I)化合物或其溶剂化物的方法，其中化合物的盐或化合物的盐的溶剂化物通过与碱反应或者通过添加碱的色谱法转化为化合物。
此外，根据本发明的化合物还可以任选由上述方法得到的式(I)化合物起始，通过个别取代基特别是R1和R2下所列取代基的官能团的转化而制备。这些转化通过本领域技术人员已知的常规方法进行，包括例如反应诸如亲核或者亲电取代反应、氧化、还原、氢化、过渡金属-催化的偶联反应、烷基化、酰化、胺化、酯化、酯裂解、醚化、醚裂解、形成羧酰胺、磺胺、氨基甲酸酯和脲，以及引入和除去临时的保护基团。
对于方法步骤(II)+(III)→(IV)、(VII)+(III)→(IV)和(IV)→(I)而言，合适的惰性溶剂特别是醚，诸如乙醚、甲基叔-丁基醚、1，2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃和二烷，或者醇，诸如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇和叔丁醇，或者水，或者溶剂的混合物，或者溶剂与水的混合物。优选使用甲醇、乙醇、四氢呋喃或者水。
方法步骤(V)+(VI)→(VII)优选在作为溶剂的二甲基甲酰胺中或者没有其它溶剂在过量的(VI)存在下进行。任选反应还可以以有利的方式在微波照射下进行。该反应通常在+20℃～+150℃，优选在+80℃～+120℃的温度范围下进行[还参见J.P.Bazureau等，Synthesis 1998，967；同上.2001(4)，581]。
任选，方法步骤(II)+(III)→(IV)和(VII)+(III)→(IV)可以以有利的方式通过添加酸进行。适合该目的是常用的无机或有机酸，诸如，例如，氯化氢、乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸或者樟脑-10-磺酸。优选使用乙酸或者特别是三氟乙酸或者对甲苯磺酸。
反应(II)+(III)→(IV)通常在0℃～+100℃，优选在+10℃～+50℃的温度范围下进行。反应(VII)+(III)→(IV)通常在+20℃～+120℃，优选在+50℃～+100℃的温度范围下进行。
方法顺序(II)+(III)→(IV)→(I)和(VII)+(III)→(IV)→(I)可以作为两步反应或者作为一锅煮反应进行，而不分离中间体(IV)。特别适合后面的变体的是组分在微波照射下反应；这里，该反应通常在+50℃～+200℃，优选在+100℃～+180℃的温度范围下进行。
甚至在(IV)的制备期间(I)也已经发生部分闭环；在这种情况下，任选，环化可以通过使用碱原位处理反应混合物来完全进行。
对于这种单独的环化步骤(IV)→(I)而言，合适的碱是常用的无机或有机碱。这些包括特别是碱金属氢氧化物，诸如，例如，氢氧化钠或者氢氧化钾，碱金属碳酸盐或者碱土金属碳酸盐，诸如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙或者碳酸铯，碱金属醇化物，诸如甲醇钠或者甲醇钾、乙醇钠或者乙醇钾或者叔丁醇钠或者叔丁醇钾，或者碱金属氢化物，诸如氢化钠。优选使用甲醇钠或者乙醇钠。
碱诱导的反应(IV)→(I)通常在0℃～+60℃，优选在0℃～+30℃的温度范围下进行。
反应(VIII)+(IX)+(VII)→(I)通常基于1当量(VIII)使用1.1-2.0当量的(IX)，任选在1.1-2.0当量的碱存在下进行。使用1.1-1.5当量的(IX)进行反应是优选的。
对于反应(VIII)+(IX)+(VII)→(I)而言，合适的碱是常用的无机或者有机碱。这些包括特别是碱金属氢氧化物，诸如，例如，氢氧化钠或者氢氧化钾，或者胺碱，诸如，例如，N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺。优选是N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺。
反应(VIII)+(IX)+(VII)→(I)通常在+20℃～+100℃，优选在+70℃～+100℃的温度范围下进行。
所有方法步骤可以在大气压、升高或者降低的压力下(例如0.5-5巴)进行。通常，反应在大气压下进行。
式(II)化合物可以由式(V)化合物通过文献中通常用于羧酸酯的C-酰化的方法制备。式(III)、(V)、(VI)、(VIII)和(IX)的化合物是商业可获得的、文献中已知的或者可以通过类似于文献中描述的方法制备的。
根据本发明的化合物的制备可以通过下文的反应方案2说明：
方案2
[a)：DMF，16h，+100℃；b)：乙醇，三氟乙酸，+78℃；c)：NaOEt，乙醇，1h，RT]。
根据本发明的化合物显示不可预见的、有价值的药理学作用谱。
因此，它们适合用作治疗和/或预防人和动物疾病的药物。
根据本发明的化合物被称为HIF-脯氨酰基-4-羟化酶的特异性抑制剂。
根据它们的药理学性质，根据本发明的化合物可以用于治疗和/或预防心血管疾病，特别是心功能不全、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、中风、动脉硬化、原发性、肺和恶性高血压和周围动脉闭塞性疾病。
根据本发明的化合物还适用于治疗和/或预防造血障碍，诸如例如原发性贫血、肾性贫血和伴有肿瘤疾病的贫血(特别是化疗诱导的贫血)、感染(特别是HIV感染)或者其它炎性疾病，诸如例如类风湿性关节炎。根据本发明的化合物还适用于由于失血导致的贫血、缺铁性贫血、维生素缺乏性贫血(例如，由于维生素B12缺乏或由于叶酸缺乏)、发育不全和再生障碍性贫血或者溶血性贫血的支持治疗，或者用于由于铁利用障碍(铁失利用性贫血)或者由于其它内分泌紊乱(例如甲状腺功能减退)导致的贫血的支持治疗。
该化合物还适用于增加血细胞比容，以便获得血液，用于手术前自身供血。
根据本发明的化合物还可以用于治疗和/或预防在外科手术后与手术相关的局部缺血状态及其连续症状，特别是使用心肺机的心脏介入术(例如分流手术，心脏瓣膜移植)、颈动脉介入术、主动脉(Aorta)介入术和使用仪器开口或者穿透颅盖的介入术。该化合物还适用于在外科手术中以加速伤口愈合和缩短恢复时间为目的的一般性治疗和/或预防。
该化合物还适用于治疗和预防急性和延长性脑局部缺血状态的连续症状(例如中风、分娩窒息)。
该化合物还可以用于治疗和/或预防癌症以及用于治疗和/或预防在癌症治疗过程中发生的健康状态的损伤，特别是使用细胞抑制剂、抗生素和放射治疗后。
该化合物还适用于治疗和/或预防风湿性形式范围的疾病和其它被视为自身免疫疾病的疾病形式的疾病，特别是用于治疗和/或预防在这类疾病的药物治疗过程中发生的健康状态的损伤。
根据本发明的化合物还可以用于治疗和/或预防眼睛疾病(例如青光眼)、脑疾病(例如帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、痴呆、慢性痛觉)、慢性肾病、肾功能不全和急性肾衰竭以及用于促进伤口愈合。
该化合物还适用于治疗和/或预防特别是在较高年龄时频繁发生的一般性的体质虚弱直至恶病质。
该化合物还适用于治疗和/或预防性机能障碍。
该化合物还适用于治疗和/或预防糖尿病及其连续症状，诸如例如糖尿病性大血管病和微血管病、糖尿病性肾病和神经病。
根据本发明的化合物还适用于治疗和/或预防例如心、肺和肝的纤维变性疾病。
特别地，根据本发明的化合物还适用于预防和治疗早产儿视网膜病(Retinopathia praematurorum)。
本发明的主题还是根据本发明的化合物用于治疗和/或预防疾病，特别是上述疾病的用途。
本发明的主题还是根据本发明的化合物在制备用于治疗和/或预防疾病，特别是上述疾病的药物中的用途。
本发明的主题还是使用活性量的至少一种根据本发明的化合物来用于治疗和/或预防疾病，特别是上述疾病的方法。
根据本发明的化合物可以单独或者，如果需要，与其它活性化合物结合使用。本发明的主题还是药物，其包含至少一种根据本发明的化合物和一种或多种其它活性化合物，特别是用于治疗和/或预防上述疾病。可以提及的合适的结合的活性化合物例如并优选为：ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、β受体阻断剂、钙拮抗剂、PDE抑制剂、盐皮质激素(Mineralocorticoid)受体拮抗剂、利尿剂、阿斯匹林、铁补充剂、维生素B12和叶酸补充剂、他汀类药物(Statine)、洋地黄(地高辛)衍生物、肿瘤化疗药物和抗生素。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与ACE抑制剂，诸如，例如并优选、依那普利、卡托普利、赖诺普利、雷米普利、地拉普利、福辛普利、喹那普利、培哚普利或者川多普利结合给药。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与血管紧张素AII拮抗剂，诸如，例如并优选，氯沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、替米沙坦或者恩布沙坦结合给药。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与β受体阻断剂，诸如，例如并优选，普萘洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、阿普洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、布拉洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、甲吲洛尔、卡拉洛尔、索他洛尔、美托洛尔、贝他洛尔、塞利洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、艾司洛尔、拉贝洛尔、卡维地洛、阿达洛尔、兰地洛尔、奈必洛尔、依泮洛尔或者布新洛尔结合给药。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与钙拮抗剂，诸如，例如并优选，硝苯地平、氨氯地平、维拉帕米或者地尔硫卓结合给药。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，诸如，例如并优选，米力农、氨力农、匹莫苯、西洛他唑、西地那非、伐地那非或者他达拉非结合给药。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与盐皮质激素受体拮抗剂，诸如，例如并优选，螺内酯、依普利酮、坎利酮或者烯睾丙酸钾结合给药。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与利尿剂，诸如，例如并优选，呋塞米、布美他尼、托塞米、苄氟噻嗪、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、泊利噻嗪、三氯噻嗪、氯噻酮、吲达帕胺、美托拉宗、喹乙宗、乙酰唑胺、二氯磺胺、醋甲唑胺、甘油、异山梨醇、甘露醇、阿米洛利或者氨苯喋啶结合给药。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与他汀类的HMG-CoA还原酶抑制剂，诸如，例如并优选、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀、西立伐他汀或者匹伐他汀结合给药。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与肿瘤化疗药物，例如并优选铂络合物，诸如例如顺铂和卡铂，烷化剂，诸如例如环磷酰胺和苯丁酸氮芥，抗代谢物，诸如例如5-氟脲嘧啶和甲氨蝶呤，拓扑异构酶抑制剂，诸如例如依托泊苷和喜树碱，抗生素，诸如例如多柔比星和柔红霉素，或者激酶抑制剂，诸如例如索拉非尼和舒尼替尼结合给药。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的化合物与抗生素，例如并优选青霉素类，头孢菌素类或者喹诺酮类，诸如例如环丙沙星和莫西沙星结合给药。
本发明的主题还是药物，其包含至少一种根据本发明的化合物，通常与一种或多种惰性的、无毒的、药学合适的辅助物质一起，及其用于上述目的的用途。
根据本发明的化合物可以全身和/或局部起效。为此目的，它们可以以适合的方式施用，诸如例如通过口服、胃肠外、肺、鼻、舌下、舌、颊、直肠、皮肤、经皮、结膜、耳或者作为植入剂或者支架施用。
对于这些施用途径，根据本发明的化合物可以以适合的施用形式给药。
根据现有技术起作用的、以快速和/或改进方式释放根据本发明的化合物并且包含结晶和/或无定形的和/或溶解形式的根据本发明的化合物的施用形式是适合口服给药的，诸如例如片剂(非包衣或者包衣片剂，例如抗胃液或者以延迟方式溶解或者不溶的以及控制根据本发明的化合物释放的包衣)，在口腔中快速崩解的片剂或者薄膜/扁球体、薄膜/冻干物、胶囊(例如硬或者软明胶胶囊)、糖衣片(Dragees)、颗粒、丸剂、粉剂、乳剂、混悬剂、气雾剂或者溶液。
胃肠外给药可以绕开吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心内、脊柱内或者腰内)或者包括吸收(例如肌内、皮下、皮内、经皮或者腹膜内)实施。适合胃肠外给药的施用形式尤其是以溶液、混悬剂、乳剂、冻干物或者无菌粉末形式的注射-和输注-制剂。
对于其它施用途径适合的是，例如吸入药物形式(特别是粉末吸入剂、雾化剂)、滴鼻剂、-溶液或者-喷雾剂、用于舌、舌下或者颊给药的片剂、薄膜/扁球体或者胶囊、栓剂、耳或者眼制剂、阴道胶囊、含水混悬剂(洗剂、震荡合剂)、亲脂性混悬剂、软膏、乳膏、经皮治疗体系(例如贴剂)、乳状物、糊剂、泡沫、喷洒粉剂、植入物或者支架。
口服或胃肠外给药是优选的，特别是口服和静脉内给药。
根据本发明的化合物可以转化为所述施用形式。这可以以本身已知的方式通过与惰性的、无毒的、药学合适的辅助物质混合而实施。这些辅助物质特别地包括载体物质(例如微晶纤维素、乳糖、甘露醇)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂和分散-或者湿润剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧去水山梨糖醇油酸酯)、粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然聚合物(例如白蛋白)、稳定剂(例如抗氧化剂，诸如，例如，抗坏血酸)、染料(例如无机颜料，诸如，例如，氧化铁)以及香味和/或气味矫正剂。
通常，已经证实在胃肠外给药的情况下给药约0.001-1mg/kg，优选约0.01-0.5mg/kg体重的量以达到有效结果是有利的。在口服给药的情况下剂量为约0.01-100mg/kg，优选约0.01-20mg/kg以及非常特别优选0.1-10mg/kg体重。
然而任选需要偏离上述量，并特别是取决于体重、施用途径、个体对活性化合物的行为、制剂的性质和给药的时间点或者间隔。因此在某些情况下，服用低于上述最小量可能是足够的，而在其它情况下必须超过上述上限。在施用较大量的情况下，在一天内将这些分成多个单独剂量可能是适当的。
具体实施方式
下列具体实施例用于说明本发明。本发明不局限于这些实施例。
下列试验和实施例中的百分比数据是重量百分比，除非另外说明。份数是重量份数。在各种情况下液体/液体溶液的溶剂比、稀释比和浓度数据涉及体积。
A.实施例
缩写：
aq.     水溶液
cat.    催化的
d       天(诸天)
DCI     直接化学电离(在MS中)
DMF     二甲基甲酰胺
DMSO    二甲亚砜
d.Th.   理论值的(在产率方面)
EI      电子碰撞电离(在MS中)
ESI     电喷射离子化(在MS中)
Et      乙基
GC-MS   与气相色谱-联合的质谱
h       小时(诸小时)
HPLC    高压-、高效液相色谱
konz.   浓缩的
LC-MS   与液相色谱-联合的质谱
Meth.   方法
min.    分钟(诸分钟)
MS      质谱
NMR     核磁共振谱
Rt      保留时间(在HPLC中)
RT      室温
TFA     三氟乙酸
THF     四氢呋喃
LC-MS-、GC-MS-和HPLC-方法：
方法1(LC-MS)：仪器：具有HPLC Agilent Serie 1100的MicromassPlatform LCZ；柱：Thermo Hypersil GOLD 3μ，20mmx4mm；流动相A：1l水+0.5ml 50％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.5ml 50％浓度的甲酸；梯度：0.0min 100％A →0.2min 100％A→2.9min 30％A→3.1min 10％ A→5.5min 10％A；恒温箱：50℃；流速：0.8ml/min；UV检测：210nm。
方法2(LC-MS)：仪器类型MS：Micromass ZQ；仪器类型HPLC：Waters Alliance 2795；柱：Phenomenex Synergi 2μHydro-RP Mercury 20mmx4mm；流动相A：1l水+0.5ml 50％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.5ml 50％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；流速：0.0min 1ml/min→2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；恒温箱：50℃；UV检测：210nm。
方法3(LC-MS)：仪器类型MS：Micromass ZQ；仪器类型HPLC：Waters Alliance 2795；柱：Phenomenex Synergi 2.5μMAX-RP 100AMercury 20mmx4mm；流动相A：1l水+0.5ml 50％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.5ml 50％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→0.1min 90％ A→3.0min 5％ A→4.0min 5％ A→4.01min 90％A；流速：2ml/min；恒温箱：50℃；UV检测：210nm。
方法4(LC-MS)：仪器：具有HPLC Agilent Serie 1100的MicromassQuattro Micro MS；柱：Thermo Hypersil GOLD 3μ20mmx4mm；流动相A：1l水+0.5ml 50％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.5ml50％浓度的甲酸；梯度：0.0min 100％A→3.0min 10％A→4.0min10％A→4.01min 100％A(流速2.5ml/min)→5.00min 100％A；恒温箱：50℃；流速：2ml/min；UV检测：210nm。
方法5(LC-MS)：仪器：具有Waters UPLC Acquity的MicromassQuattroPremier；柱：Thermo Hypersil GOLD 1.9μ50mmx1mm；流动相A：1l水+0.5ml 50％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.5ml50％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→0.1min 90％A→1.5min10％A→2.2min 10％A；流速：0.33ml/min；恒温箱：50℃；UV检测：210nm。
方法6(HPLC)：仪器：具有DAD检测的HP 1100；柱：Kromasil100RP-18，60mmx2.1mm，3.5μm；流动相A：5ml高氯酸(70％浓度)/l水，流动相B：乙腈；梯度：0min 2％B→0.5min 2％B→4.5min 90％B→6.5min 90％B →6.7min 2％B→7.5min 2％B；流速：0.75ml/min；柱温：30℃；UV检测：210nm。
方法7(GC-MS)：仪器：Micromass GCT，GC6890；柱：RestekRTX-35，15mx200μmx0.33μm；氦恒定流速：0.88ml/min；恒温箱：70℃；进口：250℃；梯度：70℃，30℃/min→310℃(保持3min)。
方法8(制备型HPLC)：柱：Kromasil 100C185μm，250mmx20mm；流动相A：Milli-Q-水，流动相B：0.1％浓度的三氟乙酸水溶液，流动相C：乙腈；梯度：0.0min 76％A，5％B，19％C→15min4％A，95％B，1％C →15.1min 76％A，5％B，19％C→20min 76％A，5％B，19％C；恒温箱：40℃；流速：25ml/min；UV检测：210nm。
方法9(制备型HPLC)：柱：Sunfire C18 5μm，19mmx150mm；流动相A：0.2％浓度的三氟乙酸水溶液，流动相B：乙腈；梯度：0.0min 95％A→8min 50％A→8.01min 95％A→12min 95％A；RT；流速：25ml/min；UV检测：210nm。
方法10(制备型HPLC)：柱：Sunfire C18 5μm，19mmx150mm；流动相A：0.2％浓度的三氟乙酸水溶液，流动相B：乙腈；0min 90％A→13min 90％A；恒温箱：40℃；流速：25ml/min；UV检测：210nm。
方法11(制备型HPLC)：柱：XBridge C18 5μm，19mmx150mm；流动相A：0.2％浓度的甲酸水溶液，流动相B：乙腈；0min 75％A→6min 75％A；RT；流速：25ml/min；UV检测：210nm。
方法12(制备型HPLC)：柱：XBridge C185μm，19mmx150mm；流动相A：0.2％浓度的甲酸水溶液，流动相B：乙腈；0min 93％A→4min 93％A；RT；流速：25ml/min；UV检测：210nm。
方法13(制备型HPLC)：柱：XBridge C18 5μm，19mmx150mm；流动相A：0.2％浓度的三氟乙酸水溶液，流动相B：乙腈；0min90％A →12min 90％A；恒温箱：40℃；流速：25ml/min；UV检测：210nm。
起始物质
实施例1A
(4-氰基-1H-咪唑-1-基)乙酸乙酯
开始将3.3g(35.3mmol)1H-咪唑-4-腈[Matthews等，J.Org.Chem.1986，51，3228-3231]加入到13.2ml(11.5g，35.3mmol)21％浓度的乙醇钠在乙醇中的溶液中，加入4.3ml(6.5g，38.9mmol)溴乙酸乙酯。反应混合物在RT下搅拌16h。为了进行后处理，滤出沉淀的固体，使用乙醇洗涤滤渣，减压浓缩滤液。向残留物中加入二异丙醚，再次过滤混合物，在旋转蒸发仪上再次浓缩滤液，减压干燥残留物。产率：3.8g(理论值的60％)
LC-MS(方法1)：Rt＝1.17min；MS(ESIpos)：m/z＝180[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.12(s，1H)，7.88(s，1H)，5.06(s，2H)，4.18(q，2H)，1.22(t，3H).
实施例2A
2-(1H-1，2，3-三唑-1-基)乙酸乙酯
向4.0升乙醇中缓慢加入129.2g(5.6mol)钠。然后加入400.0g(5.6mol)1，2，3-1H-三唑，在20-25℃的内部温度下逐滴加入623ml(938.2g，5.6mol)溴乙酸乙酯。混合物在RT下搅拌48h。滤出沉淀的固体，减压除去乙醇，再次过滤混合物。将残留物溶于乙酸乙酯中，过滤，再次减压浓缩，通过30cm柱蒸馏纯化。在浴温140℃、顶部温度60-115℃以及1mbar的压力下得到产物。产率：440.0g(理论值的50％)。
HPLC(方法6)：Rt＝1.58min；
LC-MS(方法1)：Rt＝0.71min；MS(ESIpos)：m/z＝156[M+H]+.
实施例3A
1H-咪唑-1-基乙酸乙酯
向2.5升乙醇中缓慢加入118.2g(5.1mol)钠。然后加入350.0g(5.1mol)咪唑和在20-25℃的内部温度下逐滴加入570ml(858.6g，5.1mol)溴乙酸乙酯。混合物在RT下搅拌24h。滤出沉淀的固体，减压除去乙醇，再次过滤混合物。通过柱色谱法在硅胶上纯化残留物(流动相：乙酸乙酯)。产率：639.0g(理论值的81％)
GC-MS(方法7)：Rt＝4.55min；MS(ESIpos)：m/z＝155[M+H]+。
实施例4A
(4-氰基-1H-1，2，3-三唑-1-基)乙酸乙酯
在80℃的浴温下将4.1g(31.9mmol)叠氮乙酸乙酯和2.8g(31.9mmol)2-氯丙烯腈在32ml水中搅拌16h。在冷却至RT后，使用1N盐酸酸化溶液并使用乙酸乙酯萃取。通过硫酸钠干燥有机相，过滤并减压浓缩。向残留物中加入50ml乙醇和10滴浓硫酸，混合物回流搅拌16h。为了进行后处理，减压浓缩反应混合物，向残留物中加入乙酸乙酯，使用半浓缩的碳酸氢钠溶液洗涤悬浮液，通过硫酸钠干燥有机相。在旋转蒸发仪上完全除去溶剂，减压干燥固体。产率：1.5g(理论值的25％)
LC-MS(方法3)：Rt＝0.96min；MS(ESIpos)：m/z＝181[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.06(s，1H)，5.57(s，2H)，4.19(q，2H)，1.22(t，3H).
实施例5A
3-(N，N-二甲基氨基)-2-(1H-咪唑-1-基)丙烯酸乙酯
在90℃的浴温下将38.0g(244.9mmol)实施例3A的化合物在126ml(108.1g，734.7mmol)N，N-二甲基甲酰胺-二乙基缩醛中搅拌16h。冷却后，减压浓缩混合物，使用二异丙醚搅拌残留物，滤出固体，最后使用二异丙醚洗涤。产率：49.0g(理论值的95％)。
LC-MS(方法2)：Rt＝2.42min；MS(ESIpos)：m/z＝211[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.52(s，1H)，7.49(s，1H)，7.05(s，1H)，6.91(s，1H)，4.02(q，2H)，2.63(br.s，6H)，1.12(t，3H).
实施例6A
3-(N，N-二甲基氨基)-2-(4-氰基-1H-咪唑-1-基)丙烯酸乙酯
在100℃的浴温下将3.8g(21.4mmol)实施例1A的化合物和7.4ml(6.3g，42.8mmol)N，N-二甲基甲酰胺-二乙基缩醛搅拌16h。为了进行后处理，在旋转蒸发仪上浓缩冷却的反应溶液，减压干燥残留物。产率：5.0g(纯度73％，理论值的73％)。
LC-MS(方法1)：Rt＝2.69min；MS(ESIpos)：m/z＝235[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.13(s，1H)，7.85(s，1H)，7.58(s，1H)，4.03(q，2H)，2.69(br.s，6H)，1.12(t，3H).
实施例7A
3-(二甲基氨基)-2-(4-氰基-1H-1，2，3-三唑-1-基)丙烯酸乙酯
在100℃浴温下将1.3g(7.5mmol)实施例4A的化合物和1.4ml(1.2g，8.2mmol)N，N-二甲基甲酰胺-二乙基缩醛搅拌16h。为了进行后处理，在旋转蒸发仪上浓缩冷却的反应溶液，减压干燥残留物。产率：1.5g(理论值的86％)
LC-MS(方法4)：Rt＝1.55min；MS(ESIpos)：m/z＝236[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.14(s，1H)，7.75(s，1H)，4.04(q，2H)，3.15(br.s，3H)，2.18(br.s，3H)，1.13(t，3h).
实施例8A
3-(二甲基氨基)-2-(1H-1，2，3-三唑-1-基)丙烯酸乙酯
向20.0g(128.9mmol)实施例2A的化合物中加入44.2ml(38.0g，257.8mmol)N，N-二甲基甲酰胺-二乙基缩醛，混合物在100℃下搅拌16h。在冷却至RT后，减压浓缩反应混合物。使用乙醚研制残留物，滤出并使用乙醚洗涤。产率：18.0g(理论值的67％)
LC-MS(方法4)：Rt＝1.20min；MS(ESIpos)：m/z＝211[M+H]+.
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.10(d，1H)，7.78(d，1H)，7.65(s，1H)，4.03(q，2H)，3.06(br.s，3H)，2.10(br.s，3H)，1.12(t，3H).
实施例9A
4-(4-环丁基哌嗪-1-基)-6-肼基嘧啶
步骤a)：4-氯-6-(4-环丁基哌嗪-1-基)嘧啶
开始向18ml水中加入1.8g(8.4mmol)1-环丁基哌嗪二盐酸盐(Zaragoza等，J.Med.Chem.2004，47，2833)，加入2.9ml(2.1g，16.9mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺。混合物在RT下搅拌30min，加入1.3g(8.4mmol)4，6-二氯嘧啶。反应混合物在115℃下搅拌1h，冷却至RT，加入25ml乙酸乙酯，使用25ml饱和的碳酸氢钠水溶液萃取混合物。分离出有机相，通过硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱在硅胶上纯化粗产物(流动相：二氯甲烷/甲醇100/3)。产率：1.9g(理论值的89％)。
HPLC(方法6)：Rt＝2.79min；MS(DCI)：m/z＝254[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.32(s，1H)，6.95(s，1H)，3.65-3.58(m，4H)，2.70(五重峰，1H)，2.27(t，4H)，2.00-1.93(m，2H)，1.87-1.75(m，2H)，1.67-1.55(m，2H).
步骤b)：4-(4-环丁基哌嗪-1-基)-6-肼基(hydrazino)嘧啶
在RT下，在搅拌下向1.9g(7.5mmol)4-氯-6-(4-环丁基哌嗪-1-基)嘧啶在28ml乙醇中的溶液中逐滴加入4.4ml(4.5g，89.7mmol)水合肼。反应溶液在80℃下搅拌16h。为了进行后处理，减压浓缩混合物，使用乙醚多次研制残留物，滤出沉淀的固体，减压干燥。然后通过柱色谱在硅胶上纯化残留物(流动相：二氯甲烷/甲醇10/2)。产率：1.5g(理论值的80％)。
LC-MS(方法6)：Rt＝1.36min；MS(ESIpos)：m/z＝249[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.92(s，1H)，7.63(s，1H)，5.90(NH)，4.09(s，NH2)，3.45(t，4H)，2.69(五重峰，1H)，2.26(t，4H)，2.00-1.93(m，2H)，1.82-1.75(m，2H)，1.67-1.60(m，2H).
实施例10A
1-(6-肼基(Hydrazinyl)嘧啶-4-基)氮杂环丁烷-3-醇
步骤a)：1-(6-氯嘧啶-4-基)氮杂环丁烷-3-醇
将7.3g(48.7mmol)4，6-二氯嘧啶悬浮于140ml水中，加入47ml 1N氢氧化钠水溶液。加入5.3g(48.7mmol)3-羟基氮杂环丁烷，反应混合物在90℃下搅拌3d。在冷却至RT后，减压浓缩反应混合物，进一步反应而未进一步纯化。
LC-MS(方法5)：Rt＝0.36min；MS(ESIpos)：m/z＝1.87[M+H]+。
步骤b)：1-(6-肼基嘧啶-4-基)氮杂环丁烷-3-醇
在RT下，在搅拌下向10.4g(55.8mmol)1-(6-氯嘧啶-4-基)氮杂环丁烷-3-醇在100ml乙醇中的溶液中逐滴加入27.2ml(27.9g，279.1mmol)水合肼。反应溶液在80℃下搅拌16h。为了进行后处理，减压浓缩混合物，滤出沉淀物，使用乙醇洗涤两次，每次10ml。产率：2.0g(理论值的19％)。
LC-MS(方法1)：Rt＝2.06min；MS(ESIpos)：m/z＝194[M+H]+。
实施例11A
4-氯-6-肼基嘧啶
在RT下，在搅拌下向20.0g(134.3mmol)4，6-二氯嘧啶在300ml乙醇中的溶液中逐滴加入11.8ml(12.1g，241.6mmol)水合肼。如果在计量加入水合肼期间溶液变混浊，则加入进一步的乙醇(约400ml)。反应溶液在RT下搅拌12h。为了进行后处理，滤出沉淀的固体，使用水洗涤滤渣两次，每次150ml，使用乙醚洗涤两次，每次100ml，减压干燥产物。浓缩的母液生成进一步的结晶产物级分。产率：16.8g(理论值的87％)。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.17min；MS(ESIpos)：m/z＝145[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.81(s，1H)，8.17(br.s，1H)，6.75(s，1H)，4.48(br.s，2H).
实施例12A
2-(6-氯嘧啶-4-基)-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮盐酸盐
开始向100ml乙醇中加入10.0g(47.7mmol)实施例8A的化合物和8.3g(57.1mmol)实施例11A的化合物，加入1.5ml(2.2g，19.0mmol)三氟乙酸。混合物在回流下搅拌12h。然后向冷却的反应混合物中加入过量的4M氯化氢在二烷中的溶液，混合物搅拌约1h，滤出沉淀的结晶，使用二烷和乙醇洗涤滤渣。将以这种方式得到的中间体溶解于150ml乙醇中，加入50ml  25％浓度的甲醇钠的甲醇溶液，混合物在RT下搅拌2h。然后使用1N盐酸将反应混合物调节至pH＝5，并在RT下再搅拌2h，滤出固体，使用乙醇洗涤滤渣，减压干燥产物。产率：7.0g(理论值的49％)。
LC-MS(方法5)：Rt＝1.20min；MS(ESIpos)：m/z＝264[M+H]+。
实施例13A
2-(6-氯嘧啶-4-基)-4-(1H-咪唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮盐酸盐
开始向100ml乙醇中加入10.0g(47.8mmol)实施例5A的化合物和8.3g(57.3mmol)实施例11A的化合物，加入1.5ml(2.2g，19.0mmol)三氟乙酸。混合物在回流下搅拌12h。滤出沉淀的结晶，使用乙醇洗涤滤渣，将中间体减压干燥过夜。然后将中间体悬浮于20ml甲醇中，加入100ml 4M氯化氢在二烷中的溶液，混合物在RT下搅拌1h。滤出固体，使用二烷、乙酸乙酯和二异丙醚洗涤滤渣，减压干燥产物。产率：4.6g(理论值的32％)。
HPLC(方法6)：Rt＝2.81min；MS(ESIpos)：m/z＝263[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.46(s，1H)，8.96(s，1H)，8.56(s，1H)，8.51(d，1H)，8.07-8.04(m，1H)，7.85-7.82(m，1H).
实施例14A
4-(6-肼基嘧啶-4-基)-1，4-氧氮杂环庚烷
步骤a)：4-(6-氯嘧啶-4-基)-1，4-氧氮杂环庚烷
将3.0g(20.1mmol)4，6-二氯嘧啶、2.8g(20.1mmol)1，4-氧氮杂环庚烷盐酸盐和6.4g(60.4mmol)碳酸钠在45ml水中的混合物在回流下搅拌16h。在冷却至RT后，使用乙酸乙酯萃取反应混合物。使用饱和的氯化钠溶液洗涤有机相，通过硫酸钠干燥并过滤。在减压条件下，将滤液浓缩至干。得到产物，为油状物。产率：3.9g(理论值的86％)。
LC-MS(方法4)：Rt＝1.32min；MS(ESIpos)：m/z＝214[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.33(s，1H)，6.86(s，1H)，3.99-3.52(m，8H)，1.84(m，2H).
步骤b)：4-(6-肼基嘧啶-4-基)-1，4-氧氮杂环庚烷
在RT下，在搅拌下向3.9g(18.0mmol)4-(6-氯嘧啶-4-基)-1，4-氧氮杂环庚烷在25ml乙醇中的溶液中逐滴加入8.8ml(9.0g，180.2mmol)水合肼。在80℃下搅拌16h后，减压浓缩反应溶液。使用冷的乙醇研制残留物，滤出沉淀的固体，使用25ml乙醚洗涤滤渣。减压干燥产物。产率：1.4g(理论值的36％)。
HPLC(方法11)：Rt＝2.48min；MS(ESIpos)：m/z＝210[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.91(s，1H)，7.56(br.s，1H)，5.81(s，1H)，4.12(br.s，2H)，3.75-3.55(m，8H)，1.85(五重峰，2H).
实施例
实施例1
2-[6-(4-环丁基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-咪唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
向211mg(1.0mmol)实施例5A的化合物和250mg(1.0mmol)实施例9A的化合物在4ml乙酸乙酯中的混合物中加入16μl(23mg，0.2mmol)三氟乙酸，混合物在100℃下搅拌20h。减压浓缩反应混合物，加入相同用量的乙酸乙酯和三氟乙酸，混合物在100℃下搅拌20h。反应混合物冷却至RT，滤出沉淀的固体，使用乙醚洗涤。残留物通过柱色谱在硅胶上(流动相：二氯甲烷/甲醇/氨10/2/0.2)进行预纯化，通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)进行纯化。产率：137mg(理论值的36％)
HPLC(方法6)：Rt＝2.73min；MS(ESIpos)：m/z＝367[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.40(s，1H)，8.12(s，1H)，7.90(s，1H)，7.74(s，1H)，7.50(s，1H)，7.07(s，1H)，3.65-3.58(m，4H)，2.77(五重峰，1H)，2.38-2.35(m，4H)，2.01-1.96(m，2H)，1.89-1.79(m，2H)，1.67-1.62(m，2H).
实施例2
2-[6-(4-环丁基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
向211mg(1.0mmol)实施例8A的化合物和250mg(1.0mmol)实施例9A的化合物在4ml乙酸乙酯的混合物中加入16μl(23mg，0.2mmol)三氟乙酸，混合物在100℃下搅拌20h。减压浓缩反应混合物，加入相同用量的乙酸乙酯和三氟乙酸，混合物在100℃下搅拌3d。反应混合物冷却至RT，滤出沉淀的固体，使用乙醚洗涤。将残留物悬浮于2ml水中，通过加入1N氢氧化钠水溶液(pH＝9-10)使其溶解，通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)进行纯化。产率：195mg(理论值的51％)
HPLC(方法6)：Rt＝2.90min；MS(ESIpos)：m/z＝368[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.41(s，1H)，8.40(s，1H)，7.88(s，1H)，7.82(s，1H)，7.75(s，1H)，3.70-3.65(m，4H)，3.03-2.97(m，1H)，2.60-2.57(m，4H)，2.06-2.02(m，2H)，1.98-1.90(m，2H)，1.70-1.64(m，2H).
实施例3
1-{2-[6-(4-环丁基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-腈
向236mg(1.0mmol)实施例6A的化合物和250mg (10mmol)实施例9A的化合物在4ml乙酸乙酯中的混合物中加入16μl(23mg，0.2mmol)三氟乙酸，混合物在100℃下搅拌20h。减压浓缩反应混合物，加入相同用量的乙酸乙酯和三氟乙酸，混合物在100℃下搅拌3d。反应混合物冷却至RT，滤出沉淀的固体，使用乙醚洗涤。将残留物悬浮于2ml水中，通过加入1N氢氧化钠水溶液(pH＝9-10)使其溶解，通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)进行纯化。产率：219mg(理论值的56％)
HPLC(方法6)：Rt＝3.10min；MS(ESIpos)：m/z＝392[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.38(d，1H)，8.37(d，1H)，8.17(d，1H)，7.82(s，1H)，7.80(s，1H)，3.68-3.62(m，4H)，3.38-3.30(m，4H)，2.96-2.91(m，1H)，2.06-2.00(m，2H)，1.95-1.85(m，2H)，1.70-1.63(m，2H).
实施例4
1-{2-[6-(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-腈
向700mg(3.0mmol)实施例6A的化合物和541mg(3.0mmol)实施例10A的化合物在10ml乙酸乙酯中的混合物中加入46μl(68mg，0.6mmol)三氟乙酸，混合物在100℃下搅拌10h。减压浓缩反应混合物并将其溶于5ml乙醇中，滤出沉淀物。将固体悬浮于10ml水中，加入1N氢氧化钠水溶液(pH＝9)，直至固体溶解。然后使用1N盐酸将pH调节至7，将混合物浓缩至体积约5ml，滤出形成的沉淀。使用水和二异丙醚洗涤残留物，通过制备型HPLC(方法8)进行色谱分离。然后将固体悬浮于10ml水中，加入1N氢氧化钠水溶液(pH＝9)，直至固体溶解。然后使用1N盐酸将pH调节至7，将混合物浓缩至体积约2.5ml，滤出形成的沉淀。将滤液浓缩至约2ml，再次过滤。合并两份残留物，使用水和乙酸乙酯洗涤并减压干燥。产率：78mg(理论值的8％)
HPLC(方法6)：Rt＝2.90min；MS(ESIpos)：m/z＝325[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.35(s，1H)，8.29(s，1H)，8.17(s，1H)，7.66(s，1H)，7.34(s，1H)，5.80-5.75(m，1H)，4.63-4.58(m，1H)，4.24-4.20(m，2H)，3.75-3.73(m，2H).
实施例5
1-{6-[4-(1H-咪唑-1-基)-5-氧代-2，5-二氢-1H-吡唑-1-基]嘧啶-4-基}氮杂环丁烷-3-甲酸
开始向1ml水和0.3ml乙醇的混合物中加入46mg(0.3mmol)氮杂环丁烷-3-甲酸盐酸盐。加入100mg(0.3mmol)实施例13A的化合物，混合物在100℃下搅拌1h。然后使用1N氢氧化钠水溶液将反应混合物调节至pH＝7，在100℃下搅拌16h。再一次，使用1N氢氧化钠水溶液将混合物调节至pH＝7，在150℃下在单模(single mode)微波(EmrysOptimizer)中反应1h。减压浓缩反应混合物，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)。产率：23mg(理论值的21％)
LC-MS(方法8)：Rt＝0.86min；MS(ESIpos)：m/z＝328[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.41(s，1H)，7.79(s，1H)，7.47(s，1H)，7.36(s，1H)，7.31(s，1H)，6.89(s，1H)，4.09(t，2H)，3.99(t，2H).
实施例6
1-{6-[5-氧代-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-2，5-二氢-1H-吡唑-1-基]嘧啶-4-基}氮杂环丁烷-3-甲酸
开始向2ml水中加入55mg(0.4mmol)氮杂环丁烷-3-甲酸盐酸盐。加入100mg(0.3mmol)实施例12A的化合物，使用1N氢氧化钠水溶液将pH调节至7。混合物在150℃下在单模微波(Emrys Optimizer)中反应1h。减压浓缩反应混合物，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)。产率：15mg(理论值的13％)
HPLC(方法6)：Rt＝2.81min；MS(ESIpos)：m/z＝329[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.42(s，1H)，8.26(s，1H)，7.70(s，1H)，7.67(s，1H)，7.34(s，1H)，4.05-3.96(m，2H和2H)，3.13-3.07(m，1H).
实施例7
4-(1H-咪唑-1-基)-2-[6-(3-甲基氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
将43mg(0.4mmol)3-甲基氮杂环丁烷盐酸盐、100mg(0.3mmol)实施例13A的化合物和174μl(130mg，1.0mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺悬浮于2ml四氢呋喃中，在120℃下在单模微波(EmrysOptimizer)中反应4.5h。减压浓缩反应混合物，使其溶解于水中，加入1N氢氧化钠水溶液(pH＝9-10)，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)。产率：30mg(理论值的30％)
HPLC(方法6)：Rt＝3.07min；MS(ESIpos)：m/z＝298[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.25(s，1H)，7.81(s，1H)，7.46(s，1H)，7.39(s，1H)，7.31(s，1H)，6.88(s，1H)，4.10(t，2H)，3.54(dd，2H)，2.86-2.75(m，1H)，1.25(d，3H).
实施例8
2-[6-(3-甲基氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
将43mg(0.4mmol)3-甲基氮杂环丁烷盐酸盐、100mg(0.3mmol)实施例12A的化合物和174μl(130mg，1.0mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺悬浮于2ml四氢呋喃中，在120℃下在单模微波(EmrysOptimizer)中反应1.5h。减压浓缩反应混合物，使其溶解于水中，加入1N氢氧化钠水溶液(pH＝9-10)，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)。产率：25mg(理论值的25％)
HPLC(方法6)：Rt＝3.00min；MS(ESIpos)：m/z＝299[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.41(s，1H)，8.27(s，1H)，7.70(s，1H)，7.67(s，1H)，7.41(s，1H)，4.11(t，2H)，3.56(dd，2H)，2.86-2.78(m，1H)，1.25(d，3H).
实施例9
2-{6-[3-(二甲基氨基)氮杂环丁烷-1-基]嘧啶-4-基}-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮二盐酸盐
将271mg(1.5mmol)N，N-二甲基氮杂环丁烷-3-胺二盐酸盐、400mg(1.5mmol)实施例12A的化合物和847mg(6.1mmol)碳酸钾悬浮于8mlN，N-二甲基甲酰胺中，在100℃下搅拌16h。减压浓缩反应混合物，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度，添加有0.1％浓度的三氟乙酸)。通过制备型HPLC进行进一步的纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度，添加有0.1％浓度的甲酸)。向含有产物的级分中加入2ml 1N盐酸，混合物在RT下搅拌1h。滤出固体并在高真空下干燥。产率：62mg(理论值的17％)
LC-MS(方法5)：Rt＝0.19min；MS(ESIpos)：m/z＝328[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.42(s，1H)，8.28(s，1H)，7.69(s，1H)，7.66(s，1H)，7.52(s，1H)，4.02(t，2H)，3.76(dd，2H)，3.24-3.18(m，1H)，2.12(s，6H).
实施例10
2-[6-(4，4-二氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-咪唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
开始向2ml四氢呋喃中加入100mg(0.3mmol)实施例13A的化合物、63mg(0.4mmol)4，4-二氟哌啶盐酸盐和116μl(86mg，0.7mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺，在120℃下在单模微波(Emrys Optimizer)中反应2.5h。在减压浓缩后，将残留物溶解于乙腈/水中，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)。产率：82mg(理论值的71％)
HPLC(方法6)：Rt＝3.37min；MS(ESIpos)：m/z＝348[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.49(s，1H)，8.38(s，1H)，8.15(s，1H)，7.76(s，1H)，7.64(s，1H)，7.22(s，1H)，3.80(t，4H)，2.06(七重峰，4H).
实施例11
2-[6-(4，4-二氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
开始向5ml四氢呋喃中加入250mg(0.8mmol)实施例12A的化合物、158mg(1.0mmol)4，4-二氟哌啶盐酸盐和435μl(323mg，2.5mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺，在120℃下在单模微波(EmrysOptimizer)中反应30min。在通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)预纯化后，再将产物通过柱色谱在硅胶上(流动相：二氯甲烷/甲醇，10/1)纯化。产率：29mg(理论值的10％)
HPLC(方法6)：Rt＝3.49min；MS(ESIpos)：m/z＝349[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.56(s，1H)，8.39(s，1H)，8.30(s，1H)，7.87(s，1H)，7.57(s，1H)，3.91-3.81(m，4H)，2.09(七重峰，4H).
实施例12
1-{2-[6-(4，4-二氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-腈
将200mg(1.4mmol)实施例11A的化合物、262mg(1.7mmol)4，4-二氟哌啶盐酸盐和289μl(215mg，1.7mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺在3ml水中的混合物在100℃下搅拌16h。在加入53μl(79mg，0.7mmol)三氟乙酸和324mg(1.4mmol)实施例6A的化合物后，反应混合物在100℃下搅拌16h。滤出沉淀的固体，首先使用水洗涤，然后使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：111mg(理论值的21％)
LC-MS(方法4)：Rt＝1.69min；MS(ESIpos)：m/z＝373[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.55(s，1H)，8.44(d，1H)，8.33(s，1H)，8.22(d，1H)，7.60(br.s，1H)，3.84(br.s，4H)，2.09(七重峰，4H).
实施例13
1-{2-[6-(4，4-二氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-1，2，3-三唑-4-腈
将200mg(1.4mmol)实施例11A的化合物、262mg(1.7mmol)4，4-二氟哌啶盐酸盐和289μl(215mg，1.7mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺在3ml水中的混合物在100℃下搅拌16h。在加入53μl(79mg，0.7mmol)三氟乙酸和325mg(1.4mmol)实施例7A的化合物后，反应混合物在100℃下搅拌16h。滤出沉淀的固体，首先使用水洗涤，然后使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：34mg(理论值的7％)
LC-MS(方法4)：Rt＝1.77min；MS(ESIpos)：m/z＝374[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.24(s，1H)，8.59(s，1H)，8.27(s，1H)，7.54(s，1H)，3.90(br.s，4H)，2.12(七重峰，4H)
实施例14
2-[6-(3，3-二氟吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-咪唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
开始向2ml四氢呋喃中加入100mg(0.3mmol)实施例13A的化合物、58mg(0.4mmol)3，3-二氟吡咯烷盐酸盐和175μl(130mg，1.0mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺，在120℃下在单模微波(EmrysOptimizer)中反应1h。在减压浓缩后，将残留物溶解于乙腈/水中，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)。产率：111mg(理论值的99％)
HPLC(方法6)：Rt＝3.18min；MS(ESIpos)：m/z＝334[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，甲醇-d4)：δ＝8.41(s，1H)，7.85(s，1H)，7.62(s，1H)，7.56(s，1H)，7.29(s，1H)，7.03(s，1H)，3.91(t，2H)，3.76(t，2H)，2.55(七重峰，2H).
实施例15
2-[6-(3，3-二氟吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
开始向2ml四氢呋喃中加入100mg(0.8mmol)实施例12A的化合物、57mg(0.4mmol)3，3-二氟吡咯烷盐酸盐和174μl(129mg，1.0mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺，在120℃下在单模微波(EmrysOptimizer)中反应30min，在减压浓缩后，将残留物溶解于乙腈/水中，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)。产率：13mg(理论值的12％)
HPLC(方法6)：Rt＝3.33min；MS(ESIpos)：m/z＝335[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.42(s，1H)，8.35(s，1H)，7.72-7.66(m，3H)，3.87(t，2H)，3.65(t，2H)，2.64-2.50(m，部分在DMSO信号下，2H).
实施例16
1-{2-[6-(3，3-二氟吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-腈
将200mg(1.4mmol)实施例11A的化合物、238mg(1.7mmol)3，3-二氟吡咯烷盐酸盐和289μl(215mg，1.7mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺在3ml水中的混合物在100℃下搅拌16h。在加入53μl(79mg，0.7mmol)三氟乙酸和324mg(1.4mmol)实施例6A的化合物后，反应混合物在100℃下搅拌16h。向反应混合物中加入1ml 1N盐酸。滤出沉淀得到的粗产物的盐酸盐，使用乙醚洗涤并干燥。粗产物还含有未反应的起始化合物(实施例11A的化合物)。因此，粗产物与108μl(80mg，0.6mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺、10mg(0.1mmol)3，3-二氟吡咯烷盐酸盐和2ml水在170℃下在单模微波(Emrys Optimizer)中反应15min。反应溶液通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)进行纯化。产率：30mg(理论值的6％)
LC-MS(方法4)：Rt＝1.58min；MS(ESIpos)：m/z＝359[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.55(s，1H)，8.44(d，1H)，8.33(s，1H)，8.21(d，1H)，7.26(br.s，1H)，3.99(t，2H)，3.75(br.s，2.66，2.66-2.54(m，部分在DMSO信号下，2H).
实施例17
1-{2-[6-(3，3-二氟吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-1，2，3-三唑-4-腈
将200mg(1.4mmol)实施例11A的化合物、238mg(1.7mmol)3，3-二氟吡咯烷盐酸盐和289μl(215mg，1.7mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺在3ml水中的混合物在100℃下搅拌16h。在加入53μl(79mg，0.7mmol)三氟乙酸和325mg(1.4mmol)实施例7A的化合物后，反应混合物在100℃下搅拌16h。滤出沉淀的固体，首先使用水洗涤，然后使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：137mg(理论值的27％)。
LC-MS(方法4)：Rt＝1.66min；MS(ESIpos)：m/z＝360[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.25(s，1H)，8.61(s，1H)，8.29(s，1H)，7.21(br.s，1H)，4.06(t，2H)，3.82(br.s，2.69，2.69-2.55(m，部分在DMSO信号下，2H).
实施例18
2-[6-(3，3-二氟氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-咪唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
开始向2ml四氢呋喃中加入100mg(0.3mmol)实施例13A的化合物、52mg(0.4mmol)3，3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐和175μl(130mg，1.0mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺，在120℃下在单模微波(EmrysOptimizer)中反应3h。滤出沉淀的固体，减压浓缩滤液。将残留物溶解于乙腈/水中，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)。产率：36mg(理论值的32％)
HPLC(方法6)：Rt＝3.00min；MS(ESIpos)：m/z＝320[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.42(s，1H)，8.16(s，1H)，7.79(s，1H)，7.56(s，1H)，7.50(s，1H)，7.07(s，1H)，4.49(t，4H).
实施例19
2-[6-(3，3-二氟氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
开始向2ml四氢呋喃中加入100mg(0.3mmol)实施例12A的化合物、52mg(0.4mmol)3，3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐和174μl(130mg，1.0mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺，在120℃下在单模微波(EmrysOptimizer)中反应30min，在减压浓缩后，将残留物溶解于乙腈/水中，通过制备型HPLC进行纯化(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)。产率：36mg(理论值的34％)。
HPLC(方法6)：Rt＝3.20min；MS(ESIpos)：m/z＝321[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.42(s，1H)，8.39(s，1H)，7.71(s，2H)，7.62(s，1H)，4.46(t，4H).
实施例20
1-{2-[6-(3，3-二氟氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-腈
将120mg(0.8mmol)实施例11A的化合物、129mg(1.0mmol)3，3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐和174μl(129mg，1.0mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺在3ml水中的混合物在100℃下搅拌16h。在加入32μl(47mg，0.4mmol)三氟乙酸和194mg(0.8mmol)实施例6A的化合物后，反应混合物在100℃下搅拌16h。滤出沉淀的固体，首先使用水洗涤，然后使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：32mg(理论值的11％)
LC-MS(方法4)：Rt＝1.48min；MS(ESIpos)：m/z＝345[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.80-8.08(m，4H)，7.25(s，1H)，4.61(br.s，4H).
实施例21
1-{2-[6-(3，3-二氟氮杂环丁烷-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-1，2，3-三唑-4-腈
将120mg(0.8mmol)实施例11A的化合物、129mg(1.0mmol)3，3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐和174μl(129mg，1.0mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺在3ml水中的混合物在100℃下搅拌16h。在加入32μl(47mg，0.4mmol)三氟乙酸和194mg(0.8mmol)实施例7A的化合物后，反应混合物在100℃下搅拌16h。滤出沉淀的固体，首先使用水洗涤，然后使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：51mg(理论值的18％)。
LC-MS(方法4)：Rt＝1.56min；MS(ESIpos)：m/z＝346[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.26(s，1H)，8.60(s，1H)，8.36(s，1H)，7.18(s，1H)，4.69(t，4H).
实施例22
4-(1H-咪唑-1-基)-2-[6-(1，4-氧氮杂环庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮盐酸盐
将200mg(1.0mmol)实施例5A的化合物、200mg(1.0mmol)实施例14A的化合物和37μl(54mg，0.5mmol)三氟乙酸在3ml水中的混合物在100℃下搅拌16h。在通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)预纯化后，将粗产物与1ml 1N盐酸搅拌，过滤并使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：21mg(理论值的6％)。
LC-MS(方法4)：Rt＝0.95min；MS(ESIpos)：m/z＝364[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.46(s，1H)，8.56(s，1H)，8.30(s，1H)，8.06(t，1H)，7.83(t，1H)，7.50-7.33(m，1H)，4.05(br.s，2H)，3.91-3.70(m，4H)，3.68(t，2H)，2.04-1.73(m，2H).
实施例23
2-[6-(1，4-氧氮杂环庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮盐酸盐
将400mg(1.3mmol)实施例12A的化合物和220mg(1.6mmol)1，4-氧氮杂环庚烷盐酸盐在4ml丙-2-醇中的混合物在115℃下在单模微波(Emrys Optimizer)中反应30min。加入232μl(172mg，1.3mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺，反应混合物在115℃下在单模微波(Emrys Optimizer)中反应20min。在减压浓缩后，将残留物溶解于乙腈/水/三氟乙酸中，通过制备型HPLC(方法9)进行色谱分离。通过HPLC分离得到的冻干的三氟乙酸盐，使用2ml 1N盐酸将其转化为盐酸盐。产率：7mg(理论值的1％)
LC-MS(方法4)：Rt＝1.20min；MS(ESIpos)：m/z＝329[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.54(s，1H)，8.38(s，1H)，8.25(s，1H)，7.86(d，1H)，7.35(br.s，1H)，4.14-3.69(m，6H)，3.67(t，2H)，2.03-1.77(m，2H).
实施例24
2-[6-(1，4-氧氮杂环庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
将500mg(1.7mmol)实施例12A的化合物、688mg(5.0mmol)1，4-氧氮杂环庚烷盐酸盐和1.4ml(1077mg，8.3mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺的混合物在10ml四氢呋喃/乙醇(1/1)中在140℃下在单模微波(Emrys Optimizer)中反应30min。在通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)预纯化后，将粗产物溶解于乙腈/三氟乙酸中，通过制备型HPLC(方法10)进行色谱分离。通过HPLC分离得到的冻干的三氟乙酸盐，使用1N氢氧化钠水溶液调节至pH＝7-8。通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)分离产物。产率：176mg(理论值的31％)。
LC-MS(方法4)：Rt＝1.19min；MS(ESIpos)：m/z＝329[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.41(d，1H)，8.33(d，1H)，7.78(br.s，1H)，7.72-7.70(m，2H)，3.91-3.65(m，6H)，3.62(t，2H)，1.95-1.83(m，2H).
实施例25
1-{2-[6-(1，4-氧氮杂环庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-腈
将200mg(0.9mmol)实施例6A的化合物、178mg(0.9mmol)实施例14A的化合物和33μl(49mg，0.4mmol)三氟乙酸在3ml水中的混合物在100℃下搅拌16h。滤出沉淀的固体，首先使用水洗涤，然后使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：120mg(理论值的40％)。
HPLC(方法6)：Rt＝3.27min；MS(ESIpos)：m/z＝353[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.52(s，1H)，8.42(d，1H)，8.25(s，1H)，8.19(d，1H)，7.39(br.s，1H)，4.14-3.70(m，6H)，3.66(t，2H)，2.05-1.68(m，2H).
实施例26
1-{2-[6-(1，4-氧氮杂环庚烷-4-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-1，2，3-三唑-4-腈
将200mg(0.9mmol)实施例7A的化合物、178mg(0.9mmol)实施例14A的化合物和33μl(49mg，0.4mmol)三氟乙酸在3ml水中的混合物在100℃下搅拌16h。滤出沉淀的固体，首先使用水洗涤，然后使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：80mg(理论值的27％)。
LC-MS(方法4)：Rt＝1.40min；MS(ESIpos)：m/z＝354[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.22(s，1H)，8.56(s，1H)，8.21(s，1H)，7.45-7.26(m，1H)，4.06(br.s，2H)，3.92-3.71(m，4H)，3.68(t，2H)，2.06-1.74(m，2H).
实施例27
2-[6-(1，2-嗪烷-2-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮
将200mg(0.7mmol)实施例12A的化合物、99mg(0.8mmol)1，2-嗪烷盐酸盐[Bhat等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.22000，7，1435-1446]和348μl(258mg，2.0mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺在4ml四氢呋喃中的混合物在140℃下在单模微波(Emrys Optimizer)中反应30min。在通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)预纯化后，将粗产物溶解于乙腈/水/甲醇中，通过制备型HPLC(方法11)进行色谱分离。通过HPLC分离得到的冻干的甲酸盐，使用1N氢氧化钠水溶液调节至pH＝7-8。通过制备型HPLC(RP18柱；流动相：乙腈/水梯度)分离产物。产率：23mg(理论值的11％)。
LC-MS(方法4)：Rt＝1.38min；MS(ESIpos)：m/z＝315[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.58(d，1H)，8.42(d，1H)，8.40(br.s，1H)，7.88(d，1H)，7.66(br.s，1H)，4.09(t，2H)，3.98(t，2H)，1.86-1.68(m，4H).
实施例28
1-{2-[6-(1，2-嗪烷-2-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-腈
将200mg(1.4mmol)实施例11A的化合物、205mg(1.7mmol)1，2-嗪烷盐酸盐[Bhat等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.22000，7，1435-1446]和289μl(215mg，1.7mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺在3ml水中的混合物在100℃下搅拌1.5h。在加入59μl(49mg，0.4mmol)三氟乙酸和324mg(1.4mmol)实施例6A的化合物后，反应混合物在100℃下搅拌16h。滤出沉淀的固体，首先使用水洗涤，然后使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：199mg(理论值的39％)。
LC-MS(方法5)：Rt＝0.87min；MS(ESIpos)：m/z＝339[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.57(d，1H)，8.45(d，1H)，8.40(br.s，1H)，8.23(d，1H)，7.70(br.s，1H)，4.07(t，2H)，3.96(t，2H)，1.85-1.65(m，4H).
实施例29
1-{2-[6-(1，2-嗪烷-2-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-1，2，3-三唑-4-腈
将200mg(1.4mmol)实施例11A的化合物、205mg(1.7mmol)1，2-嗪烷盐酸盐[Bhat等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.22000，7，1435-1446]和289μl(215mg，1.7mmol)N-乙基-N-(丙-2-基)丙烷-2-胺在3ml水中的混合物在100℃下搅拌1.5h。在加入59μl(49mg，0.4mmol)三氟乙酸和325mg(1.4mmol)实施例7A的化合物后，反应混合物在100℃下搅拌16h。滤出沉淀的固体，首先使用水洗涤，然后使用乙醚洗涤。减压干燥产物。产率：122mg(理论值的24％)。
LC-MS(方法4)：Rt＝1.66min；MS(ESIpos)：m/z＝340[M+H]+；
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.28(s，1H)，8.58(s，1H)，8.36(s，1H)，7.60(br.s，1H)，4.12(t，2H)，4.03(t，2H)，1.88-1.70(m，4H).
B.药理学活性的评价
根据本发明的化合物的药理学性质可以在下列试验中证实：
缩写：
DMEM                Dulbecco′s 改进的Eagle培养基
FCS                 胎牛血清
TMB                 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(benzidin)
Tris                三(羟基甲基)氨基甲烷
1.用于测定HIF脯氨酰基-4-羟化酶抑制剂的活性和选择性的体外 试验
1.a)HIF脯氨酰基羟化酶活性的抑制：
羟基化的HIF特异性地与von Hippel-Lindau蛋白-延伸蛋白B-延伸蛋白C复合物(VBC复合物)结合。这种相互作用仅在HIF在保存的脯氨酰基上羟基化时才发生。它是生化测定HIF脯氨酰基羟化酶活性的基础。该试验如[Oehme F.，Jonghaus W.，Narouz-Ott L.，Huetter J.，Flamme I.，Anal.Biochem.330(1)，74-80(2004)]所描述的进行：
将涂覆有NeutrAvidin HBC的洁净的96-孔微量滴定板(Fa.Pierce)用阻断剂酪蛋白培养30分钟。然后每孔每次用200μl洗涤缓冲液(50mMTris，pH 7.5，100mM NaCl，10％(v/v)阻断剂酪蛋白，0.05％(v/v)吐温20)将滴定板洗涤三次。在100μl洗涤缓冲液中以400nM的浓度加入肽生物素-DLDLEMLAPYIPMDDDFQL(Fa.Eurogentec，4102Seraing，比利时)。该肽用作脯氨酰基羟基化的底物并且与微量滴定板结合。在培养60分钟后，滴定板用洗涤缓冲液洗涤三次，使用1mM在阻断剂酪蛋白中的生物素培养30分钟，然后再次使用洗涤缓冲液洗涤三次。
为了进行脯氨酰基羟化酶反应，使用含有脯氨酰基羟化酶的细胞溶解产物将与滴定板结合的肽底物培养1-60分钟。反应在室温下在100μl反应缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，5mM KCl，1.5mM MgCl2，1μM-1mM 2-氧代戊二酸盐，10μM FeSO4，2mM抗坏血酸盐)中发生。反应混合物还含有不同浓度的待测试的脯氨酰基羟化酶抑制剂。试验物质优选，但并非仅仅以1nM-100μM的浓度使用。通过使用洗涤缓冲液将滴定板洗涤三次来停止反应。
为了定量测定脯氨酰基羟基化，加入含有来自E.coli的硫氧还蛋白和在80μl结合缓冲液(50mM Tris，pH 7.5，120mM NaCl)中的VBC复合物的融合蛋白。15分钟后，加入10μl来自兔子的多克隆抗-硫氧还蛋白抗体在结合缓冲液中的溶液。再过30分钟后，加入10μl与辣根过氧化物酶结合的抗-兔免疫球蛋白在结合缓冲液中的溶液。在室温下培养30分钟后，为了除去未结合的VBC复合物和抗体，滴定板用洗涤缓冲液洗涤三次。为了测定结合的VBC复合物的量，滴定板用TMB培养15分钟。通过加入100μl 1M硫酸结束显色反应。通过在450nm下测定吸光度来测定结合的VBC复合物的量。它与在肽底物中的羟基化脯氨酸的量成正比(proportional)。
或者，与铕(Fa.Perkin Elmer)偶合的VBC复合物可以用于检测脯氨酰基羟基化。在这种情况下，通过相对于时间的荧光测定结合的VBC复合物的量。使用[35S]-甲硫氨酸标记的VBC复合物也是可能的。为此，可以通过在网织红细胞裂解物中体外转录-转译来制备放射性标记的VBC复合物。
在该试验中，具体实施例以≤30μM的IC50值抑制HIF脯氨酰基羟化酶的活性。具体实施例的代表性IC50值再现于下文表1中：
表1
  实施例编号   IC50[nM]
  2   880
  5   540
  9   760
  17   130
  20   90
  实施例编号   IC50[nM]
  21   70
  25   180
  26   380
  29   170
1.b)细胞学、功能性体外试验：
根据本发明的化合物的活性借助重组细胞系进行定量。该细胞最初来源于人肺癌细胞系(A549，ATCC：American Type CultureCollection，Manassas，VA 20108，美国)。将该测试细胞系以稳定的方式在人工最小启动子的控制下使用媒介物转染，所述媒介物含有Photinus pyralis荧光素酶(以下称为荧光素酶)的报道基因。该最小启动子的组成为两种TATA区上游的缺氧反应元件[Oehme F.，EllinghausP.，Kolkhof P.，Smith T.J.，Ramakrishnan S.，Hütter J.，SchrammM.，Flamme I.，Biochem.Biophys.Res.Commun.296(2)，343-9(2002)]。在缺氧作用下(例如在1％氧存在下培养24小时)或者在非选择性双加氧酶抑制剂作用下(例如浓度为100μM的去铁敏，浓度为100μM的氯化钴或者浓度为1mM的N-草酰基甘氨酸二乙酯)，该测试细胞系产生荧光素酶，其可以借助合适的生物发光试剂(例如Steady-Luciferase Assay System，Promega Corporation，Madison，WI 53711，美国)和合适的照度计检测和定量。
试验操作：试验前一天，在准确计算量的培养基(DMEM，10％FCS，2mM谷氨酰胺)中将细胞涂覆到384-或者1536-well微量滴定板中，并保存在细胞培养器(96％大气湿度，5％v/v CO237℃)中。试验当天，以分等级的浓度向培养基中加入试验物质。在用作阴性对照的细胞中没有分批加入试验物质。作为测定细胞对抑制剂敏感性的阳性对照，例如以100μM的最终浓度加入去铁敏。在将试验物质转移至微量滴定板的孔中6-24小时后，在照度计中测定所得的光信号。借助测定值绘制剂量/效果关系，其作为测定半数最大活性浓度(称为EC50值)的基础。
1.c)用于基因表达修饰的细胞学、功能性体外试验：
为了研究在使用试验物质处理后人细胞系中特异性mRNAs的表达修饰，在6-或者24-孔板上培养下列细胞系：人肝癌细胞(HUH，JCRBCell Bank，日本)，人胚胎肾成纤维细胞(HEK/293，ATCC，Manassas，VA 20108，美国)，人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC，Manassas，VA 20108，美国)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC，Cambrex，East Rutherford，New Jersey 07073，美国)。在加入试验物质后24小时，使用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，并使用合适的方法(例如试剂，Invitrogen GmbH，76131Karlsruhe，德国)由它们得到总RNA。
对于典型的分析实验，使用DNase I消化每种情况下1μg以该方式的得到的总RNA，并使用合适的逆转录酶反应(ImProm-II ReverseTranscription System，Promega Corporation，Madison，WI 53711，美国)将其转译成互补DNA(cDNA)。在每种情况中2.5％的以该方式得到的cDNA批料用于聚合酶链反应。待研究的基因mRNA的表达水平通过实时定量聚合酶链反应[TaqMan-PCR；Heid C.A.，Stevens J.，LivakK.J.，Williams P.M.，Genome Res.6(10)，986-94(1996)]使用ABIPrism 7700序列检测仪(Fa.Applied Biosystems，Inc.)进行研究。这里使用的引物-探针-组合通过Primer Express 1.5软件(Fa.AppliedBiosystems，Inc.)产生。特别地，研究红细胞生成素、碳酸酐酶(Carboanhydrase)IX、乳酸脱氢酶A和血管内皮细胞生长因子的mRNAs。
根据本发明的物质导致在人来源的细胞中缺氧诱导的基因的mRNA显著的剂量依赖性增加。
2.用于检测在心血管系统中的作用的体内试验
2.a)用于基因表达修饰的体内试验：
通过胃管施用、腹膜内或者静脉内将溶解于合适的溶剂中的试验化合物给予小鼠或者大鼠。典型的剂量为0.1、0.5、1、5、10、20、50、100和300mg物质每kg体重并给药。对照动物仅接受溶剂。在试验物质给药后4、8或者24小时，使用过量的异氟烷并随后扭断颈部处死动物，取出待研究的器官。将部分器官在液氮中急冻。由器官部分得到如B.1.a)下描述的总RNA，并将其转译为cDNA。待研究的基因的mRNA的表达水平通过实时定量聚合酶链反应[TaqMan-PCR；Heid C.A.，Stevens J.，Livak K.J.，Williams P.M.，Genome Res.6(10)，986-94(1996)]使用ABI Prism 7700序列检测仪(Fa.Applied Biosystems，Inc.)进行研究。
与安慰剂-对照相比，在口服或者胃肠外给药后，根据本发明的物质导致肾脏中红细胞生成素的mRNA的显著的剂量依赖性增加。
2.b)血清中红细胞生成素水平的测定：
通过腹膜内或者口服将在合适的溶剂中的试验物质给予小鼠或者大鼠，每天一次或者两次。典型剂量为0.1、0.5、1、5、10、20、50、100和300mg物质每kg体重并给药。安慰剂对照动物仅接受溶剂。在施用前以及在最后一次给予物质后4小时，由动物眶后静脉丛或者尾静脉在短期麻醉下取50μl血。通过加入肝素锂使血不凝固。通过离心得到血浆。借助红细胞生成素-ELISA(mouse EpoImmunoassay，R & D Systems，Inc.，Minneapolis，美国)根据制造商的说明测定血浆中红细胞生成素的含量。测定值借助于记录的小鼠红细胞生成素对照测定值转换为pg/ml。
与起始值和安慰剂-对照相比，在口服和胃肠外给药后，根据本发明的物质导致血浆中红细胞生成素的显著的剂量依赖性增加。
2.c)外周血液的细胞组成的测定：
在数天内通过腹膜内或者口服，将在合适的溶剂中的试验物质给予小鼠或者大鼠，每天一次或者两次。典型剂量例如为0.1、0.5、1、5、10、20、50、100和300mg物质每kg体重并给药。对照动物仅接受溶剂。在研究结束时，由动物眼角静脉丛或者尾静脉在短期麻醉下取血，并且通过加入柠檬酸钠使血不凝固。在合适的电子测量仪器中测定血样中红细胞、白细胞和血小板的浓度。通过在每种情况下1000红细胞的显微镜筛选借助使用适合于该目的的染色溶液(Fa.KABELabortechnik，Nümbrecht)染色的血涂片测定网织红细胞的浓度。为了测定血细胞比容，由眶后静脉丛通过血细胞比容毛细管取血，并且在适合该目的的离心机中在毛细管离心后人工读出血细胞比容值。
与起始值和安慰剂-对照相比，在口服和胃肠外给药后根据本发明的物质导致血细胞比容、红细胞数和网织红细胞的显著的剂量依赖性增加。
3.溶解度的测定
起始溶液(初始溶液)的制备：
在具有装配螺旋帽和隔膜的Wide Mouth 10mm Screw V-Vial(来自Fa.GlastechnikGmbH，Art.-Nr.8004-WM-H/V15μ)中准确称取至少1.5mg试验物质，加入DMSO以产生50mg/ml的浓度，并将混合物借助于涡流机(vortexers)涡旋30分钟。
校准溶液的制备：
在1.2ml具有96孔的深孔板(DWP)中使用液体操作机器人进行需要的移液步骤。使用的溶剂是乙腈/水8∶2的混合物。
用于校准溶液(母液)的起始溶液的制备：向10μl初始溶液(浓度＝600μg/ml)中加入833μl溶剂混合物，将混合物匀质化。对于每种试验物质，在分开的DWP’s中制备1∶100稀释液，将稀释液各自重复匀质化。
校准溶液5(600ng/ml)：向30μl母液中加入270μl溶剂混合物，并且将混合物匀质化。
校准溶液4(60ng/ml)：向30μl校准溶液5中加入270μl溶剂混合物，并且将混合物匀质化。
校准溶液3(12ng/ml)：向100μl校准溶液4中加入400μl溶剂混合物，并且将混合物匀质化。
校准溶液2(1.2ng/ml)：向30μl校准溶液3中加入270μl溶剂混合物，并且将混合物匀质化。
校准溶液1(0.6ng/ml)：向150μl校准溶液2中加入150μl溶剂混合物，并且将混合物匀质化。
样品溶液的制备：
在1.2ml具有96孔的DWP中使用液体操作机器人进行需要的移液步骤。向10.1μl母液中加入1000μl PBS缓冲液pH 6.5。(在1升容量瓶中称取PBS缓冲液pH 6.5：61.86g氯化钠，39.54g磷酸二氢钠和83.35g 1N氢氧化钠水溶液，将该瓶中充满水，将混合物搅拌约1小时。由该溶液中，向5-升容量瓶中加入500ml，并且将该瓶中充满水。使用1N氢氧化钠水溶液，将pH调节至6.5。)
实施：
在1.2ml具有96孔的DWP中使用液体操作机器人进行需要的移液步骤。使用温度可调的振荡器，以该方式制备的样品溶液在20℃和1400rpm下振摇24小时。由这些溶液中，在每种情况下移除180μl并转移至Beckman Polyallomer离心管中。将这些溶液在约223.000xg下离心1小时。由每种样品溶液中，移除100μl上清液，使用PBS缓冲液6.5稀释1∶10和1∶1000。
分析：
样品通过HPLC/MS-MS分析。使用该试验化合物的五点校准曲线进行定量。溶解度用mg/l表示。分析顺序：1)空白(溶剂混合物)；2)校准溶液0.6ng/ml；3)校准溶液1.2ng/ml；4)校准溶液12ng/ml；5)校准溶液60ng/ml；6)校准溶液600ng/ml；7)空白(溶剂混合物)；8)样品溶液1∶1000；7)样品溶液1∶10。
HPLC/MS-MS方法
HPLC：Agilent 1100，定量泵(G1311A)，自动采样器CTC HTSPAL，脱气器(G1322A)和柱恒温箱(G1316A)；柱：Oasis HLB 20mm x2.1mm，25μ；温度：40℃；流动相A：水+0.5ml甲酸/l；流动相B：乙腈+0.5ml甲酸/l；流速：2.5ml/min；停止时间1.5min；梯度：0min 95％A，5％B；坡度(Rampe)：0-0.5min 5％A，95％B；0.5-0.84min 5％A，95％B；坡度：0.84-0.85min 95％A，5％B；0.85-1.5min 95％A，5％B。
MS/MS：WATERS Quattro Micro Tandem MS/MS；Z-Spray API界面；HPLC-MS初始分离器1∶20；以ESI模式测定。
C.药物组合物的具体实施例
根据本发明的化合物可以如下转化为药物制剂：
片剂：
组成：
100mg根据本发明的化合物，50mg乳糖(一水合物)，50mg玉米淀粉(天然)，10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(Fa.BASF，Ludwigshafen，德国)和2mg硬脂酸镁。
片剂重量212mg。直径8mm，曲率半径12mm。
制备：
根据本发明的化合物、乳糖和淀粉的混合物用5％浓度PVPs在水中的溶液(m/m)制粒。干燥后，将颗粒与硬脂酸镁混合5分钟。用常规的压片机压制该混合物(片剂形式参见上文)。15kN的压力用作压制的推荐值。
可口服给药的悬浮液：
组成：
1000mg根据本发明的化合物，1000mg乙醇(96％)，400mg(来自Fa.FMC，Pennsylvania，美国的黄原胶)和99g水。
10ml口服悬浮液相当于100mg根据本发明的化合物的单独剂量。
制备：
将Rhodigel悬浮于乙醇中，向悬浮液中加入根据本发明的化合物。在搅拌下加入水。混合物搅拌大约6h，直至Rhodigels停止溶胀。
可口服给药的溶液：
组成：
500mg根据本发明的化合物，2.5g聚山梨酯(Polysorbat)和97g聚乙二醇400。20g口服溶液相当于100mg根据本发明的化合物的单独剂量。
制备：
在搅拌条件下将根据本发明的化合物悬浮于聚乙二醇和聚山梨酯的混合物中。继续搅拌操作，直至根据本发明的化合物完全溶解。
静脉内(i.v.)溶液：
将根据本发明的化合物以低于饱和溶解度的浓度溶解于生理学上可接受的溶剂(例如等渗盐水溶液、5％葡萄糖溶液和/或30％PEG 400溶液)中。该溶液进行灭菌过滤，并灌入无菌和无热原的注射容器中。

Claims (21)

1.式(I)化合物
其中
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示通过氮原子连接的饱和的4-至7-元杂环基，其中所述4-至7-元杂环基含有1或2个N原子、和0或1个氧原子，
其中杂环基可以被取代基取代，其中所述取代基选自羟基、羟基羰基、C1-C3-烷基、C1-C3-烷基氨基和C3-C6-环烷基，
或者
其中杂环基可以被1-4个氟取代基取代，
或者其盐。
2.权利要求1的化合物，其特征在于，
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示通过氮原子连接的饱和的4-至7-元杂环基，其中所述4-至7-元杂环基含有1或2个N原子、和0或1个氧原子，和
其中杂环基被1-4个氟取代基取代，
或者其盐。
3.权利要求1的化合物，其特征在于，
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示哌嗪-1-基，
其中哌嗪-1-基被一个取代基取代，其中所述取代基选自C3-C6-环烷基，
或者
R2表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基被一个取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、C1-C3-烷基、C1-C3-烷基氨基和C3-C6-环烷基，
或者
R2表示1,2-嗪烷-2-基或者1,4-氧氮杂环庚烷-4-基，
或者其盐。
4.权利要求1至3中任一项的化合物，其特征在于，
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示氮杂环丁烷-1-基、吡咯啉-1-基或者哌啶-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基、吡咯啉-1-基和哌啶-1-基被1-4个氟取代基取代，
或者
R2表示哌嗪-1-基，
其中哌嗪-1-基在4-位被一个取代基取代，其中所述取代基选自C-3-C6-环烷基，
或者
R2表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基在3-位被取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、甲基和二甲基氨基，
或者
R2表示1,2-嗪烷-2-基或者1,4-氧氮杂环庚烷-4-基，
或者其盐。
5.制备根据权利要求1的式(I)化合物或其盐的方法，其特征在于，
[A]式(II)化合物
其中R1具有权利要求1中给出的定义，和
Z1表示甲基或者乙基，
在惰性溶剂中，任选在酸存在下，与式(III)化合物反应
其中R2具有权利要求1中给出的定义，
以得到式(IV)化合物，
其中Z1、R1和R2具有权利要求1中给出的定义，
其已经在这些反应条件下或者在随后的反应步骤中在碱的影响下，环化得到式(I)化合物，
和式(I)化合物任选用合适的(i)溶剂和／或(ii)碱或者酸，转化为其盐，
或者
[B]式(V)化合物
其中Z1和R1具有权利要求1中给出的定义，
与式(VI)化合物缩合
其中
Z2表示甲基或者乙基，
得到式(VII)化合物，
其中Z1和R1具有权利要求1中给出的定义，
然后在酸存在下与式(III)化合物反应得到式(IV)化合物，其已经在这些反应条件下或者在随后的反应步骤中在碱的影响下，环化得到式(I)化合物，
和式(I)化合物任选用合适的(i)溶剂和／或(ii)碱或者酸，转化为其盐，
或者
[C]式(VIII)化合物
在作为溶剂的水中在一锅煮法中，首先与式(IX)化合物反应，
R2-H      (IX)，
其中R2具有权利要求1中给出的定义，
然后与式(VII)化合物反应得到式(I)化合物，
和式(I)化合物任选用合适的(i)溶剂和／或(ii)碱或者酸，转化为其盐。
6.一种药物，其包含根据权利要求1-4任一项的化合物，以及与其结合的惰性的、无毒的、药学适合的助剂。
7.根据权利要求1-3中任一项的化合物，其特征在于，
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示哌嗪-1-基，
其中哌嗪-1-基被一个取代基取代，其中所述取代基选自C3-C6-环烷基，
或其盐。
8.根据权利要求7的化合物，其特征在于，
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示哌嗪-1-基，
其中哌嗪-1-基在4-位被一个取代基取代，其中所述取代基选自C3-C6-环烷基，
或其盐。
9.根据权利要求1-3中任一项的化合物，其特征在于，
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基被一个取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、C1-C3-烷基、C1-C3-烷基氨基和C3-C6-环烷基，
或其盐。
10.根据权利要求9的化合物，其特征在于，
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基被一个取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、甲基和二甲基氨基，
或其盐。
11.根据权利要求10的化合物，其特征在于，
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示氮杂环丁烷-1-基，
其中氮杂环丁烷-1-基在3-位被一个取代基取代，其中所述取代基选自羟基羰基、甲基和二甲基氨基，
或其盐。
12.根据权利要求1-3中任一项的化合物，其特征在于，
X表示N或者CH，
R1表示氢或者氰基，
R2表示1，2-嗪烷-2-基或者1，4-氧氮杂环庚烷-4-基，
或其盐。
13.根据权利要求1-3中任一项的化合物，其特征在于，
R2表示4-环丁基-哌嗪-1-基。
14.根据权利要求1的化合物，其为1-{2-[6-(4-环丁基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-腈，其具有下式：
及其盐。
15.根据权利要求1的化合物，其为1-{2-[6-(4-环丁基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-咪唑-4-腈，其具有下式：
16.根据权利要求1的化合物，其为1-{6-[5-氧代-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-2，5-二氢-1H-吡唑-1-基]嘧啶-4-基}氮杂环丁烷-3-甲酸，其具有下式：
及其盐。
17.根据权利要求1的化合物，其为1-{6-[5-氧代-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-2，5-二氢-1H-吡唑-1-基]嘧啶-4-基}氮杂环丁烷-3-甲酸，其具有下式：
18.根据权利要求1的化合物，其为2-[6-(1，2-嗪烷-2-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮，其具有下式：
及其盐。
19.根据权利要求1的化合物，其为2-[6-(1，2-嗪烷-2-基)嘧啶-4-基]-4-(1H-1，2，3-三唑-1-基)-1，2-二氢-3H-吡唑-3-酮，其具有下式：
20.根据权利要求1的化合物，其为1-{2-[6-(1，2-嗪烷-2-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-1，2，3-三唑-4-腈，其具有下式：
及其盐。
21.根据权利要求1的化合物，其为1-{2-[6-(1，2-嗪烷-2-基)嘧啶-4-基]-3-氧代-2，3-二氢-1H-吡唑-4-基}-1H-1，2，3-三唑-4-腈，其具有下式：
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