TWI398513B - Crystallization purification of zeaxanthin palmitate with biological activity - Google Patents

Description

具有生物活性的玉米黃素棕櫚酸酯的結晶純化方法

本發明主要是從除醣的枸杞乾糙果粒中提取玉米黃素棕櫚酸酯，用以產製保護眼睛的健康產品技術上。

枸杞為具有悠久歷史的慢性疾病治療用藥及用作改善視力的健康食品用以維持身體健康，因為人體無法合成此營養物「類蘿蔔素」。直至今日有超過400種的類蘿蔔素被發現，其中部分類蘿蔔素被認為具有預防新血管疾病及其他慢性疾病。枸杞中許多種類的類蘿蔔素已被分離鑑定出來，其中玉米黃素可從玉米黃素棕櫚酸酯化物經皂化而得，和其它類蘿蔔素相比具有特殊的高共軛雙鍵。因此，玉米黃素已被證實是光靈敏化合物對視覺的處理很重要，可預防如眼睛老化所引發的白內障及老年黃斑部病變。玉米黃素更被進一步從視網膜組織中分離而得，其研究證實在眼球保護方面扮演重要的角色。然而在枸杞中玉米黃素棕櫚酸酯(ZDP)已被報導其含量高達0.219%，這可被採用做是玉米黃素的替代來源，用以產製保護眼睛的健康產品。

本發明人目前從事相關產品的製造、設計，累積多年的實務經驗與心得，積極地投入創新與改良的精神，所完成具有生物活性的玉米黃素棕櫚酸酯的結晶純化方法。

本發明提供一種具有生物活性的玉米黃素棕櫚酸酯的結晶純化方法。主要是從除醣後的枸杞經超音波丙酮溶劑萃取，經管柱層析後，再以液－液抗溶鹽析結晶獲得。管柱層析純化方法，分別測試以正相的SG-60及逆相的PS-100為吸附材質，實際結果顯示，均可得到酯化物的高回收率，其值超過95%。在經鹽析沉澱之後，玉米黃素棕櫚酸酯的純度可達983 mg/g(98.3%)，此穩定的玉米黃素棕櫚酸酯對經雙氧水處理過後之視網膜色素上皮細胞，具有些許增生效果。

為使專精熟悉此項技藝之人仕業者易於深入瞭解本發明的裝置內容以及所能達成的功能效益，茲列舉一具體實施例，詳細介紹說明如下：一種具有生物活性的玉米黃素棕櫚酸酯的結晶純化方法。其中：枸杞果實是在超音波萃取前先經過除醣的前處理，其步驟為：

一、取1克磨碎後之枸杞浸入20毫升的去離子水，在303K下以超音波震盪萃取30分鐘，超音波萃取的頻率為40KHz，功率為300W。

二、萃取之後，溶液經4號濾紙過濾，收集濾紙上的枸杞萃餘物，之後進行冷凍乾燥，待乾燥48小時後，得除醣枸杞粉末0.354克，並保存於-10 ℃的冰箱。

超音波萃取步驟為：

一、取上述除醣枸杞粉末0.354克加入28mL的丙酮，之後以超音波攪拌萃取裝置在溫度303K下，萃取30分鐘。

二、過濾後去除溶劑，經秤重後得萃出物0.0454克。

此萃出物會先保存在-10℃直到HPLC分析及管柱層析。

管柱層析分劃及純化玉米黃素棕櫚酸酯

以SG-60矽膠用做吸附材質

取枸杞10克經去醣後以280mL的丙酮進行萃取，經濃縮後得萃出物0.454克，之後取0.1克的萃出物溶在乙酸乙酯和正己烷(V/V=1/15)的混合溶劑，之後將此溶液以管柱層析法進行純化分離，管柱之內徑為3cm，長度為30cm，吸附材質為矽膠(silica-gel,60-240 mesh)，沖提液為乙酸乙酯和正己烷(V/V=1/15)的混合溶劑，之後得三個分劃層，並各別濃縮至乾，純化後的樣品儲存在-80℃直至HPLC分析。

以PS100樹酯用做吸附材質

取枸杞10克經去醣後以280mL的丙酮進行萃取，經濃縮後得萃出物0.454克，之後取0.1克的萃出物溶在乙酸乙酯和正己烷(V/V=1/15)的混合溶劑，之後將此溶液以管柱層析法進行純化分離，管柱之內徑為3cm，長度為30cm，吸附材質為樹酯(PS100)，沖提液為丙酮，之後得二個分劃層，並各別濃縮至乾，純化後的樣品儲存在-80℃直至HPLC分析及ARPE-19。

抗溶再結晶純化玉米黃素棕櫚酸酯

收集經矽膠管柱層析的第二個富含玉米黃素棕櫚酸酯的分劃層，並且濃縮至乾，得7.9mg，並將其加入1.0mL的二氯甲烷溶解，之後加入等量的99%乙醇在-10℃下進行再結晶。經24小時冷凍後，紅色固體會在瓶底沉澱析出，並以滴管移除上層液，再加入1mL的99%的乙醇，在20℃下進行離心，離心轉速為8000 rpm，時間是5分鍾。上層液用滴管小心移除，而析出固體則濃縮至乾，得2.3mg的紅色固體，而產率是29.1%，此棗紅色固體即為玉米黃素棕櫚酸酯，之後再經HPLC，LC-MS及NMR定性。

HPLC定量分析玉米黃素棕櫚酸酯

HPLC是使用Hitachi 2130泵，配有2400 UV系統。HPLC之分析管柱為YMC C-30(5μm,250mm×4.6mm i.d.)，每次樣品注入體積為20μL，波長為450nm，分析條件為動相A：甲醇，動相B：甲基第三丁基醚，流速控制在1mL/min，梯度沖提條件為：

0 min 70% A，30% B，

5 min 70% A，30% B，

20 min 40% A，60% B，

26 min 20% A，80% B，

30 min 20% A，80% B。

玉米黃素棕櫚酸酯的定量是比對其滯留時間跟面積比。

本發明從除醣後的枸杞經超音波丙酮溶劑萃取，經管柱層析後，再以液－液抗溶鹽析結晶獲得。管柱層析純化方法，分別測試以正相的SG-60及逆相的PS-100為吸附材質，實際結果顯示，均可得到酯化物的高回收率，其值超過95%。在經鹽析沉澱之後，玉米黃素棕櫚酸酯的純度可達983 mg/g(98.3%)，此穩定的玉米黃素棕櫚酸酯對經雙氧水處理過後之視網膜色素上皮細胞，具有些許增生效果。

綜合上述所陳，本發明係在提供一種具有生物活性的玉米黃素棕櫚酸酯的結晶純化方法，經過本發明人實際製作完成以及反覆操作測試之後，證實的確可以達到本發明所預期的功能效益；同時，又為目前坊間尚無見聞之「首先創作」，具有「產業上的利用價值」，誠然已經符合發明專利之成立要義，爰依專利法之規定，向　鈞局提出發明專利之申請。

Claims (4)

1. 一種具有生物活性的玉米黃素棕櫚酸酯的結晶純化方法，管柱層析分劃及結晶純化玉米黃素棕櫚酸酯的程序如下：一、取枸杞經去醣後以丙酮進行萃取，經濃縮後得萃出物；二、取萃出物溶在乙酸乙酯和正己烷(V/V=1/15)的混合溶劑，之後將此溶液以管柱層析法進行純化分離，之後得數個分劃層，並各別濃縮至乾；三、收集經管柱層析的第二個富含玉米黃素棕櫚酸酯的分劃層，並且濃縮至乾，並將其加入二氯甲烷溶解，之後加入等量的99%乙醇在-10℃下進行再結晶；四、經冷凍後，玉米黃素棕櫊酸酯會在瓶底沉澱析出，以滴管移除上層液，再加入1mL的99%的乙醇，在20℃下進行離心，離心轉速為8000 rpm，時間是5分鍾；五、上層液用滴管小心移除，而析出玉米黃素棕櫊酸酯固體則濃縮至乾。
2. 如申請專利範圍第1項所述之具有生物活性的玉米黃素棕櫚酸酯的結晶純化方法，其中：步驟一係使用超音波攪拌萃取裝置，在溫度303K下，以丙酮萃取除醣枸杞粉末30分鐘。
3. 如申請專利範圍第1項所述之具有生物活性的玉米黃素棕櫚酸酯的結晶純化方法，其中：步驟二之管柱吸附材質係使用正相的矽膠吸附劑，沖提液為乙酸乙酯和正己烷(V/V=1/15)的混合溶劑。
4. 如申請專利範圍第1項所述之具有生物活性的玉米黃素棕櫚酸酯的結晶純化方法，其中：步驟二之管柱吸附材質係使用反相的樹脂吸附劑，沖提液為丙酮。