TWI395587B - 葫蘆烷型三萜類化合物、醫藥組成物、用途及其萃取方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種分離自山苦瓜的活性成分，特別是關於一種葫蘆烷型三萜類化合物、醫藥組成物、用途及其萃取方法。
女性月經的周期與兩種主要的荷爾蒙：雌激素和黃體素的濃度變化有密切的關係。通常在45~55歲間，雌激素的分泌會明顯減少，同時導致黃體素的減少。這些女性荷爾蒙濃度的降低，可能會伴隨一些所謂的更年期症狀，如突然的熱潮紅、盜汗、心悸、容易失眠、情緒不穩、憂鬱、陰道乾燥變薄、骨質加速流失(容易骨折)、心血管疾病如中風、高血壓、心肌梗塞增加等。
自七十年代以來，「荷爾蒙替代療法」常被使用於緩和上述的更年期症狀。然而，不斷地有報告指出，使用荷爾蒙替代療法的婦女，罹患乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮內膜癌，及子宮頸癌的機率明顯增加，尤其是有家族性遺傳基因者，或已有此類癌細胞者。目前已知長期服用雌激素會危害身體健康並引起副作用，且其他替代方案亦會產生其他副作用。故開發出具有雌激素活性以控制更年期症狀、且無副作用之治療物或替代補充品，使更年期婦女可用以預防更年期症候群，則為當務之急。本發明使用的材料為中草藥常見食材之山苦瓜，從中發現具有雌激素活性之化合物，可有效活化雌激素受體ERα及ERβ，在未來可提供作為一種改善因缺乏雌激素所引發症狀之保健食品成份或醫藥組成物。
然而，先前關於山苦瓜的研究，多著重在其降血糖、降血脂、抗氧化、調節免疫反應等作用。本研究發現其不皂化物(non-saponifiable fraction)成份具有顯著活化雌激素受器(ER)之能力。
緣此，本發明之一目的即是提供一種葫蘆烷型三萜類化合物，該化合物係如式(I)所示：
其中C5和C10之間形成單鍵或雙鍵，C8和C9之間形成單鍵或雙鍵；其中C5和C10之間形成單鍵時，R1
係為氧；其中C8和C9之間形成單鍵時，R2
係為羰基、甲羥基、甲醛基或甲基二甲氧基；其中R1
為氧且R2
為羰基或甲羥基時，R1
之氧與R2
的C19形成單鍵，R1
+R2
=戊內酯或半縮醛環。
較佳地，上述化合物係為葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E
),24-trien-3β-ol-19.5β-olide)，如下式所示之化合物1
：
或5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E
),24-trien-3β,19-diol)，如下式所示之化合物2
：
或3β-羥葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-19-醛(3β-hydroxycucurbita-5(10),6,22(E
),24-tetraen-19-al)，如下式所示之化合物3
：
或19-二甲氧基葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-3β-醇(19-dimethoxycucurbita-5(10),6,22(E
),24-tetraen-3β-ol)，如下式所示之化合物4
：
或19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E
),24-五烯-3β-醇(19-nor
-cucurbita-5(10),6,8,22(E
),24-pentaen-3β-ol)，如下式所示之化合物5
：
本發明之又一目的係提供一種葫蘆烷型三萜類化合物用於調節雌激素受體活性的用途，其中該葫蘆烷型三萜類化合物係下列之群組(一)或(二)：群組(一)：係由葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E
),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)(化合物1
)、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E
),24-trien-3β,19-diol)(化合物2
)、19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E
),24-五烯-3β-醇(19-nor
-cucurbita-5(10),6,8,22(E
),24-pentaen-3β-ol)(化合物5
)及5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(化合物6
)所組成；群組(二)：係由葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E
),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)(化合物1
)、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E
),24-trien-3β,19-diol)(化合物2
)、3β-羥葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-19-醛(3β-hydroxycucurbita-5(10),6,22(E
),24-tetraen-19-al)(化合物3
)、19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E
),24-五烯-3β-醇(19-nor
-cucurbita-5(10),6,8,22(E
),24-pentaen-3β-ol)(化合物5
)及5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(化合物6
)所組成；其中將該群組(一)或群組(二)之葫蘆烷型三萜類化合物施加於一個體中，該群組(一)之葫蘆烷型三萜類化合物可單獨地活化該個體之雌激素受體活性，而該群組(二)之葫蘆烷型三萜類化合物係可部分地抑制該個體之內生性雌激素引起之雌激素受體活性；其中該5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇係為下列式所示之化合物6
：
本發明之另一目的即是提供一種用於調節雌激素受體活性之醫藥組成物，係包括下列之群組(一)或(二)：群組(一)：係由葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E
),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)(化合物1
)、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E
),24-trien-3β,19-diol)(化合物2
)、19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E
),24-五烯-3β-醇(19-nor
-cucurbita-5(10),6,8,22(E
),24-pentaen-3β-ol)(化合物5
)及5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(化合物6
)所組成；群組(二)：係由葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E
),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)(化合物1
)、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E
),24-trien-3β,19-diol)(化合物2
)、3β-羥葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-19-醛(3β-hydroxycucurbita-5(10),6,22(E
),24-tetraen-19-al)(化合物3
)、19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E
),24-五烯-3β-醇(19-nor
-cucurbita-5(10),6,8,22(E
),24-pentaen-3β-ol)(化合物5
)及5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(化合物6
)所組成；以及其組合或其藥學上可接受鹽類，以及一稀釋劑、賦形劑或載劑。
本發明之另一目的即是提供一種自山苦瓜中萃取上述化合物之方法，其步驟包括：
(a)提供一預定重量之山苦瓜凍乾粉末，以乙酸乙酯於室溫下萃取，經減壓濃縮除去溶劑後得到一乙酸乙酯萃取物；
(b)將該經乙酸乙酯萃取過之山苦瓜粉末再以乙醇於室溫下萃取，經減壓濃縮除去溶劑後得到一乙醇萃取物；
(c)將該乙醇萃取物進行粗顆粒之逆相管柱層析，取其中一區分進行酸水解反應，再以乙酸乙酯於室溫下萃取，經減壓濃縮除去溶劑後得到一酸水解產物；
(d)將該酸水解產物再次進行逆相管柱層析；
(e)將步驟(d)所得之一區分以逆相與正相製備級高效率液相層析進行進一步純化分離，得到該具有雌激素活性之化合物。
經由本發明所採用之技術手段，將山苦瓜冷凍乾燥後經乙酸乙酯(EA)及酒精(EtOH)萃取之萃取物，或分別再進行鹼水解及酸水解處理之濃縮產物，其中含有新穎的植物雌激素成份，可有效活化雌激素受器(ER)之轉錄活性，且部份成分亦有拮抗雌激素所誘發的雌激素受體活化之效果。未來可應用於婦女更年期症狀或雌激素缺乏症患者身上，除了可以有效活化雌激素受器用以治療或改善此些症狀外，亦可配合某些雌激素藥物同時施用，可選擇性地活化雌激素受器，具有開發為治療、減緩婦女更年期症狀或雌激素缺乏症之保健食品的潛力。另外，本發明之葫蘆烷型三萜類化合物可部分地抑制該個體之內生性雌激素引起之雌激素受體活性，例如對於某些雌激素依賴型乳癌之患者而言，可抑制其內生性雌激素的活化作用，具有減緩癌細胞增生的功效性。
本發明主要是將山苦瓜凍乾粉末以乙酸乙酯萃取後，其萃取物經鹼水解反應以製備排除脂肪酸干擾之不皂化物。將不皂化物以氣相層析質譜儀(GC-MS)開放式管柱層析及製備式HPLC進行純化分離，並利用雌激素轉錄活性檢測(ER transactivation assay)追蹤活性成份，而分離得到已知結構的葉黃素(lutein)、黑麥草內酯(loliolide)及5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(化合物6
)。繼續將萃取過之山苦瓜粉末以酒精萃取，為避免受測細胞對高極性之帶醣分子吸收效果不佳，又推測可與雌激素受體(ER)作用者應為結構較小之配基分子，故將酒精萃物分別以酸水解處理，再進行純化分離。則再分得五個葫蘆烷型三萜類化合物之新穎化合物，經結構鑑定得其分別為葫蘆烷型三萜類化合物(化合物1-5
)：葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(化合物1
)、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β,19-二醇(化合物2
)、3β-羥葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-19-醛(化合物3
)、19-二甲氧基葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-3β-醇(化合物4
)及19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E
),24-五烯-3β-醇(化合物5
)。本發明證實化合物1、2、5、6、
葉黃素及黑麥草內酯皆可活化雌激素受體(ERα及ERβ)。而該些化合物與雌激素活性物17β-雌二醇(E2)同時施加後，證實化合物1、2、3、5、6
可抑制由E2所誘發的ERα及ERβ活化，而葉黃素及黑麥草內酯則與E2具有協同活化雌激素受體(ERα及ERβ)之效果。
本文中所使用的「雌激素活性物」之用語，包括天然的或人工合成具有雌激素活性之化合物，例如雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)和17α-乙炔基雌二醇(EE2)，而在本發明實施例中主要使用的是17β-雌二醇(E2)。
本文中所使用的「雌激素受體」之用語，主要是指人類的雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)，且以ERα與ERβ為主，兩者在人體組織中的分佈有相當之不同。雌激素受體可作為人類雌激素作用的專一性核受器並供其結合，啟動雌激素所調控基因之表現而呈現其作用活性。
將含有GAL4-hERα(或β) LBD嵌合體受體(Chimeric receptors)之pBKCMV質體與含(UAS)4
-鹼性磷酸酶報導基因(Alkaline phosphatase Reporter gene)之質體共同轉染至CHO-K1細胞中。當待測樣品與ER作用，則誘發GAL4與報導基因前的(UAS)4
專一性結合，進而啟動基因表現。故可利用測量鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性來判定其雌激素活性。
取CHO-K1細胞株(菌種編號CCRC 60006，取自食品工業發展研究所)，以含10%胎牛血清(FBS)及Ham’s F12培養基(GIBCOBRL)的培養液培養。於進行轉染前一日，將細胞植入96孔培養盤中，將含血清之培養基洗除。接著，將前述兩種質體DNA等比例加入Lipofectamine2000轉染劑(GIBCOBRL)及轉染專用培養基，使其形成DNA-微脂體(liposome)複合體，再加入上述洗淨的細胞中，轉染5小時後，再換成配製了樣品的培養液。經培養2天後，吸取定量培養基以測定其中ALP的活性。ALP活性係以4-硝苯基磷酸二鈉鹽六水合物(4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate,pNPP)為受質，於96孔培養盤中測定波長405nm的吸光值。另以已知之ER活化劑(1nM 17β-雌二醇)作為正對照組。
每次取山苦瓜之凍乾粉末200公克，浸泡於20倍體積之乙酸乙酯中。於室溫下以磁石進行攪拌，持續16~24小時後，以抽氣過濾裝置收集萃取液，過濾之粉末再加入乙酸乙酯攪拌，重複萃取一次。萃取液合併後經減壓濃縮去除溶劑後，可得到乙酸乙酯萃取物，萃取率約4%。
每次取山苦瓜乙酸乙酯萃取物約30克，溶於五倍體積之四氫呋喃(THF)中，再加入相同體積之40%氫氧化鈉水溶液，以60℃加熱攪拌16~20小時。反應液先經減壓濃縮去除其中有機溶劑THF後，改加入等量之正己烷，與水層進行萃取，共進行3~5次。收集上層之正己烷層，以水洗至中性後，經減壓濃縮可收得不皂化物(NS)，收集量約為所取乙酸乙酯萃取物之2.5%。而水層部分則加入鹽酸，使其酸化至pH=2後，加入等量之乙酸乙酯進行萃取，共萃取兩次。收集得上層之乙酸乙酯層同樣以水洗至中性，減壓濃縮後即可收得皂化物(saponifiable fraction,S)。
取先前經由乙酸乙酯萃取過之山苦瓜粉末，以與乙酸乙酯萃取時相同之萃取比例及步驟，繼續浸泡於20倍體積之藥用酒精中。於室溫下以磁石進行攪拌萃取，每次持續16~24小時，共進行兩次。萃取液合併後經減壓濃縮去除溶劑後，即得到去除乙酸乙酯萃取成分之酒精萃取物，萃取回收率約18~20%。
因山苦瓜酒精萃取物之組成包含乙酸乙酯萃取殘留之脂肪酸(屬低極性)，以及高極性之純糖分子(例如葡萄糖)，故將酒精萃取物經過一粗顆粒之逆相管柱層析(Diaion open column)，所收得之其中一區分(如後段介紹)進行酸水解反應。取前述排除脂肪酸與純醣分子之區分(MeOH區分) 20.4克，溶於六倍體積(120 mL)之去離子水中，再加入四倍體積(80 mL)之12 N鹽酸，使鹽酸溶液之最終反應濃度約15%。以水浴加熱迴流一小時，待降溫後以乙酸乙酯萃取酸水解產物。收集該乙酸乙酯層以水洗至中性後，經減壓濃縮抽除溶劑後可得「酸水解產物」(acid-hydrolyzed product) 11克，回收率為54%。
秤取山苦瓜之不皂化物(NS)，以最少量之正己烷溶解之，注入以約10~15倍重量之矽膠(Silica gel,70~230 mesh)填充所製備成之矽膠管柱(矽膠部分約佔玻璃管柱之六至七成高，內徑3 cm×矽膠高度25 cm，以正己烷平衡之)，以進行管柱層析。沖提液以不同比例之正己烷(hexane)與乙酸乙酯(EA)配製，依據沖提液極性由低至高之原則，依序以100% hexane、1% EA/hexane、2% EA、5% EA、10% EA、20% EA、30% EA、50% EA與100% EA為沖提液進行流洗，每250 mL為單位加以收集。各收集結果經薄層色層分析(TLC)點片比較，將相似結果之收集進行合併成同一區分(fraction,fr.)。取各區分進行ER轉錄活性分析，作為追蹤其中活性成分以及後續純化分離之指標依據。
不皂化物(NS)之開放式管柱層析共進行兩次。第一次以7克之不皂化物(NS)進行管柱層析，取各區分追蹤ER活性成分之分佈，並針對有活性之區分再進一步以製備式高效率液相管柱層析(HPLC)繼續純化分離以期收得單一活性成分。同時間繼續進行乙酸乙酯萃取物以及不皂化物的製備。因第一次純化分離的結果雖有追蹤到活性成分，然不斷的HPLC分離亦使回收量減少而不足以再純化並鑑定結構。故待再收集到約18克之不皂化物，即再進行第二次管柱層析，並參考第一次層析結果，針對沖洗出活性成分之沖提液極性區，繼續以ER轉錄活性分析確認活性成分的分佈，及以HPLC進行後續單一活性成分之純化分離。
將Diaion gel泡於水中，使其吸水並沈降之後，藉攪拌懸浮時將其倒入玻璃管柱內，待其沈降緊密後完成管柱製備(內徑7 cm×diaion gel高度15 cm)。將管柱內之溶劑以甲醇置換之，使管柱內溶劑約為80% MeOH/H2
O，即可開始進行管柱層析。將山苦瓜之酒精萃取物(EtOH ext.)120 g分成兩批進行diaion管柱層析。每批樣品先溶解於少量之水中，緩慢將其注入至管柱中，待其均沒入diaion gel後，依序以水2L、50%甲醇/水1.5L、甲醇1L、丙酮2L進行沖提。將四種沖提液流洗出來之區分加以收集，經減壓濃縮後，即收得水區分、甲醇/水區分、甲醇區分、丙酮區分等四個區分。
將RP-18 gel泡入甲醇中，使其平衡後，藉攪拌懸浮時將其倒入玻璃管柱內，待其沈降緊密後完成管柱製備(內徑5 cm×RP-18 gel高度20 cm)。將管柱內之溶劑以80% MeOH/H2
O置換平衡，即可開始進行管柱層析。本研究中有兩種樣品以此逆相管柱進行層析，一為酒精萃取物經diaion層析所得之fr.MeOH/H2
O，一為fr.MeOH經酸水解反應後所得到之酸水解產物。將樣品溶於少量水中(需酌量添加少量甲醇幫助溶解)，即可將樣品注入至管柱中。待樣品均沒入RP-18 gel後，先以80% MeOH/H2
O 200 mL流洗後，即改以甲醇進行沖提，每250 mL為單位加以收集。各收集結果經TLC點片比較，將相似結果之收集進行合併成同一次區分。
經過開放式管柱層析後，藉由活性追蹤篩選出具活性成分、藉由NMR分析出含有特定結構之各區分，即以製備級HPLC進行更精確之純化分離。根據各樣品之TLC點片結果選擇分離效果最好之溶劑配方，配製層析所用之移動相，再將欲分離的樣品溶於該移動相並經0.22 um過濾膜去除不溶顆粒後，分次注入儀器中，觀察積分儀並收集分離出的樣品。分離出的樣品再經由TLC點片與NMR光譜分析結果，確認所收集樣品是否為單一化合物。若非單一化合物則繼續以其他溶劑配方進行HPLC純化，若可判斷為單一成分，則進一步利用更多核磁共振光譜、紅外線光譜、質譜等所提供之資訊，鑑定其結構特徵、官能基與分子量，進而推測為何種化合物。
將山苦瓜酒精萃物(120 g)經diaion層析所得之fr. MeOH(20.4 g)以酸水解收得酸水解產物(11 g)，以RP-18管柱層析，沖提液為甲醇，總共收得13個區分(RP-1~13)。將RP-7區分(258 mg)以RP-18 HPLC進行分離，移動相為100% MeOH，流速為2 mL/min，收集9.7~11.3 min得到RP-7-3區分(153 mg)。再經由正相HPLC純化，移動相為EA/hexane=3/7，流速為3 mL/min，則收集在9.3 min出現之積分峰，即為RP-7-3-4區分(27 mg)。由TLC點片結果與下述NMR數據判定其為單一化合物，將其訂為「化合物1
」。
又分離酸水解產物之另一區分RP-9(584 mg)，以RP-18 HPLC進行層析，移動相為100% MeOH，流速為3 mL/min，收集6.7~7.5 min之區分得到RP-9-2(47 mg)。再經由正相HPLC純化，移動相為EA/hexane=3/7，流速為4 mL/min，則收集在6.4 min出現之積分峰，即為RP-9-2-4(11 mg)。由NMR分析發現其圖譜與RP-7-3-4相符，即為「化合物1
」。
請同時參閱第2、9A~9E圖以及後文的表1a，其分別為化合物1
之二維異核化學位移相關光譜(Heteronuclear Multiple-Bond Correlation,HMBC)及核間奧氏效應光譜(Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy,NOESY)、氫核磁共振光譜(1
H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,1
H NMR)、無畸變極化轉移增益實驗(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer,DEPT)、電子轟擊電離(Electron Impact Ionization,EIMS)、高解析度質譜儀(High Resolution Mass Spectrometry,HRMS)及傅立葉轉換紅外線光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)之結果。
化合物1
之紅外線光譜在3501及1759 cm-1
有吸收，顯示具有羥基(hydroxyl)及γ-內酯(γ-lactone)之官能基；根據高解析質譜m/z
452.3279及13
C核磁共振吸收(表1a)，可推測出化合物1
之分子式為C30
H44
O3
。再由氫譜與碳譜之數據(表1a)，顯示化合物1
之化學結構中帶有六支單峰甲基[δH
0.84,0.92,0.93,1.25,1.71,1.73(3H each,s)]、一個雙峰甲基[δH
1.02(3H,d,J
=6.5 Hz)]、以及一組含氧三級碳之氫吸收[δH
3.45(1H,br s)]。此外，由NMR數據發現一組環已烯(cyclohexene)上的ABX型態吸收[δH
5.17(1H,dd,J
=9.9,2.2 Hz,H-6),5.69(1H,dd,J
=9.9,3.3 Hz,H-7),2.51(1H,dd,J
=3.3,2.2 Hz,H-8);δC
133.4(d),131.1(d),44.5(d)]。綜合以上數據結果，發現與已知化合物karavilagenin D相似，可推測化合物1
是cucurbitane-type之三萜類化合物。
化合物1
與已知化合物karavilagenin D在A至D環之結構均相似，惟一不同處在於D環上之支鏈結構。化合物1
之支鏈結構推測為E
-form之1,1-dimethy-4-alkyl-1,3-butadiene，NMR數據為[δH
5.37(1H,dd,J
=15.0,8.7Hz,H-22),6.14(1H,dd,J
=15.0,10.8 Hz,H-23),5.72(1H,d,J
=10.8 Hz,H-24),1.71及1.73(3H each,s);δC
138.1(C-22),124.4(C-23),125.1(C-24),133.1(C-25),18.2(C-26),25.9(C-27)]。經由分析化合物1之UV光譜，發現在波長238 nm處有顯現出支鏈上雙鍵之吸收。EIMS分析中亦發現有一在m/z
109(100%)之碎裂峰，推測為C8
H13
化合式，符合推測之支鏈結構。另外在HMBC光譜上(第2圖)亦可觀察到H-27(δH
1.73)與C-25(δC
133.1),C-24(δC
125.1)之關聯性、H-24(δH
5.72)與C-22(δC
138.1),C-23(δC
124.4)之關聯性、以及H-21(δH
1.02)與C-17(δC
50.4),C-20(δC
40.3),C-22(δC
138.1)之關聯性，由此均可證明推導之支鏈結構無誤。
化合物1
之立體結構可由NOESY光譜證明(第2圖)，包含了H3
-18與H-8 & H3
-20、H-3 & H3
-29與H-10 & H3
-30之NOE關聯性。綜合與已知化合物karavilagenin D之光譜數據比對結果，並配合二維核磁共振光譜、質譜、紅外線光譜及紫外線光譜等數據，可推導出新穎化合物1
為葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E
),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)。
RP-9區分以RP-18 HPLC進行層析(移動相為100% MeOH，流速為3 mL/min)，收集7.5~8.8 min得到RP-9-3區分(267 mg)。再經由正相HPLC純化，移動相為EA/hexane=3/7，流速為3 mL/min，則收集在11.3 min出現之積分峰，即為RP-9-3-7區分(24 mg)。由TLC點片結果與下述NMR數據判定其為單一化合物，將其訂為「化合物2
」。
請同時參閱第2、10A~10E圖以及表1a，其分別為化合物2
之HMBC、NOESY、1
H NMR、DEPT、EIMS、HRMS及FTIR之結果。根據化合物2
之高解析質譜m/z
454.3471，可推導出其分子式為C30
H46
O3
；根據紅外線光譜，則顯示出羥基(hydroxyl,3421 cm-1
)及雙鍵(1647 cm-1
)官能基之吸收。氫譜與碳譜之數據(表1a)顯示出結構中帶有六支四級甲基，其中兩支為雙鍵上之甲基、一支為二級甲基，還有一個含氧三級碳及一組環已烯上之ABX型態吸收。EI質譜碎裂峰109m/z
及UV 238 nm之吸收結果，可確認支鏈結構為C8
H13
。比較化合物2
及1
之氫譜與碳譜數據，可發現兩者許多相似之處，惟一不同處為化合物1
所具有「與C-5連結之γ-內酯(γ-lactone)基之C-19吸收(δC
181.5)」特徵，在化合物2
之光譜數據中並未出現，並取代為另一吸收δH
5.12(s)(δC
105.2)。由其低磁場之氫譜吸收，推測為半縮醛之氫的特徵，亦即形成了一5,19-半縮醛環。該半縮醛環上氫氧基之立體位向，依H-19及Hβ
-1.(Mulhollandet al.
,1997;Liet al.
,2007)之nOe效應(第2圖)可證明為endo-form。配合二維核磁共振光譜、質譜、紅外線光譜及紫外線光譜等數據，可推導出新穎化合物2
為5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E
),24-trien-3β,19-diol)。
將酸水解產物之RP-8區分(2.4 g)，以RP-18 HPLC進行層析，移動相為100% MeOH+0.1% Acetic acid，流速為3 mL/min，收集6.5~7.5 min得到RP-8-2區分(488 mg)，以及7.8~8.7 min得到RP-8-4區分(542 mg)。兩區分分別再經由正相HPLC純化，移動相同為THF/hexane=2/8，流速為4 mL/min，則收集在6.8 min出現之積分峰，分別得RP-8-2-4區分(45 mg)及RP-8-4-4區分(73 mg)。由NMR分析發現兩者圖譜結果相同，將其訂為「化合物3
」。
化合物3
結構易變，後續仍有以相似條件再度純化，以排除壞掉之成份。之後保存該樣品時故加入少許NaHCO3
，並於室溫水浴(不加熱)的狀況下進行減壓濃縮，以避免其變壞。
請同時參閱第2、11A~11E圖以及表1a，其分別為化合物3之HMBC、1
H NMR、DEPT、EIMS、HRMS及FTIR之結果。
根據化合物3
之高解析質譜436.2970m
/z
，可推測分子式為C30
H44
O2
。紅外線光譜分析化合物3
在3438 cm-1
處有吸收，顯示有羥基(hydroxy)。又2723、1712 cm-1
處有吸收，則顯示有醛(aldehyde)之官能基特徵。氫譜與碳譜之數據(表1a)顯示化合物3
有六支單峰甲基吸收[δH
0.80,0.90,1.03,1.05,1.71,1.72(3H each,s)]、一支雙重分裂峰甲基[δH
0.98(3H,d,J
=6.5 Hz)]、一含共軛雙鍵之E
-form 1,1,4-trialkylsubstituted buta-1,3-diene支鏈[δH
5.35 dd(1H,dd,J
=15.0,8.7 Hz),6.12(1H,dd,J
=15.0,10.8 Hz),5.72(1H,d,J
=10.8 Hz);δC
138.3(d),124.3(d),125.1(d),132.9(s)][UVλmax
239 nm]，還有一組環已烯吸收[δH
5.62(1H,dd,J
=10.0,6.0 Hz),6.04(1H,d,J
=10.0 Hz);δC
126.2(d),126.8(d)]，及一個位於軸向之含氧三級碳的氫吸收[δH
3.50(1H,dd,J
=8.8,2.9 Hz,H-3)]。
比較化合物3
及1
之氫譜與碳譜數據，顯示化合物3
之D環上支鏈特徵和化合物1
之數據極相似，可知其支鏈結構應相同。另外發現化合物3
在B環上有一組1,3-環已二烯(cyclohexa-1,3-diene)的結構，可由UV光譜在273 nm吸收，以及13
C核磁共振[δC
126.8(s) 137.7(s),126.2(d),126.8(d)]之數據加以佐證。同時依二維HMBC分析(第2圖)，顯示包含了H-1(δH
2.14~2.26)與C-5(δC
137.7) & C-10(δC
126.8)、H-6(δH
6.04)與C-5(δC
137.7) & C-7(δC
126.8) & C-8(δC
39.9) & C-10(δC
126.8)之關聯性，可推導出共軛雙鏈位於C-5,C-6,C-7及C-10之間。化合物3
之A至D環之核磁共振數據和已知化合物cucurbita-5(10),6,23(E
)-triene-3β,25-diol相符，除了C-19例外。核磁共振吸收[δH
9.23(1H,s),δC
202.3(s)]顯示C-19應為醛基。另外二維HMBC光譜數據亦顯示出δH
9.23與C-8(δC
39.9)、C-10(δC
126.8)、C-11(δC
202.3)間之關聯性，證明醛基之位置應該在C-19上。因此推導出新穎化合物3為3β-羥葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-19-醛(3β-hydroxycucurbita-5(10),6,22(E
),24-tetraen-19-al)。
與化合物3
同一純化步驟，亦即將RP-8-2區分(488 mg)與RP-8-4區分(542 mg)以RP-18 HPLC進行層析，經由正相HPLC純化，移動相同為THF/hexane=2/8，流速為4 mL/min，則收集在5.7 min出現之積分峰，分別得RP-8-2-3區分(78 mg)及RP-8-4-3區分(120 mg)。由NMR分析發現兩者圖譜相似，將其訂為「化合物4
」。
又將RP-9區分(584 mg)以RP-18 HPLC進行層析時(移動相為100% MeOH，流速為3 mL/min)，收集8.8~10.4 min得到RP-9-4區分(204 mg)。再經由正相HPLC純化，移動相為EA/hexane=1/3，流速為3 mL/min，則收集在7.9 min出現之積分峰，即為RP-9-4-4區分(44 mg)。由NMR分析發現其圖譜與RP-8-4-3區分相符，即為「化合物4
」。
請同時參閱第2、12A~12E圖以及表1b，其分別為化合物4
之HMBC、1
H NMR、DEPT、EIMS、HRMS及FTIR之結果。
化合物4
之高解析質譜m/z
482.3767顯示分子式為C32
H50
O3
，推算其不飽合度為8。紅外線光譜分析出3421 cm-1
有吸收，表示結構中帶有羥基。氫譜與碳譜之數據(表1b)顯示有六支四級甲基、一支二級甲基、一組環已共軛雙烯(cyclohexa-1,3-diene)、一組1,3-丁二烯(1,3-butadiene)、一個含氧三級碳及一個含二甲氧基之縮醛。UV光譜分析出在239及269 nm處有吸收，顯示出共軛雙烯之特徵。比較1
H及13
C核磁共振數據可發現化合物4
和3
相似，惟一不同處為化合物3之C-19上的醛基轉變成含二甲氧基之縮醛，如所繪圖之結構。核磁共振吸收[δH
3.34,3.44(3H each,s),3.99(1H,s);δC
58.1,58.8,112.3]顯示為兩組甲氧基及一個三級碳組成之縮醛結構(第2圖)。藉由2D核磁共振光譜詳細分析結果，可推導出新穎化合物4
為19-二甲氧基葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-3β-醇(19-dimethoxycucurbita-5(10),6,22(E
),24-tetraen-3β-ol)。
與化合物3
同一純化步驟，亦即將RP-9-4區分(204 mg)再經由正相HPLC純化，移動相為EA/hexane=1/3，流速為3 mL/min，則收集在7.2 min出現之積分峰，即為RP-9-4-3區分(15 mg)。由TLC點片結果與NMR數據判定其為單一化合物，將其訂為「化合物5
」。
又與化合物2
同一純化步驟，將RP-9-3區分(267 mg)經由正相HPLC層析，移動相為EA/hexane=3/7，流速為3 mL/min，並收集在7.3~8.0 min得到RP-9-3-5區分(76 mg)。再次以正相HPLC純化，移動相為EA/hexane=3/7，流速為4 mL/min，並收集在4.9 min出現之積分峰，即為RP-9-3-5-1區分(29 mg)。由NMR分析發現其圖譜與RP-9-4-3區分相符，故亦為「化合物5
」。
請同時參閱第2、13A~13E圖以及表1b，其分別為化合物5
之HMBC、NOESY、1
H NMR、DEPT、EIMS、HRMS及FTIR之結果。根據化合物5
之紅外線光譜分析，發現在3012,1606,1479 cm-1
有吸收，顯示含苯環(aromatic)。IR在3415 cm-1
有吸收顯示為羥基(hydroxy)。由高解析質譜m/z
406.3241推導出分子式C29
H42
O，可計算出9個不飽合度。UV光譜分析出239 nm吸收，為支鏈1,1,4-trialkylsubstituted buta-1,3-diene之共軛雙烯吸收。1
H核磁共振光譜(表1b)顯示四支四級甲基共振峰[δH
0.65,1.01,1.26,1.30(3H each,s)]、一支二級甲基共振峰[δH
1.07(3H,d,J
=6.6 Hz)]、二支烯基上甲基共振峰[δH
1.73,1.74(3H each,s)]、一組含氧三級碳共振峰[δH
3.72(1 H,dd,J
=8.8,2.9 Hz,H-3)]、及三支共軛雙鍵共振峰[δH
5.44(1H,dd,J
=15.0,8.4 Hz),6.16(1H,dd,J
=15.0,11.0 Hz)及5.76(1H,d,J
=11.0 Hz)]。13
C核磁共振顯示共有29個碳訊號，可分類為7個甲基、6個二級碳、2個三級碳、3個四級碳、6個苯環碳、4個雙鍵碳及1個含氧碳。比較化合物5
及3
之氫譜與碳譜之數據(表1a、1b)發現兩者支鏈之數據幾乎相同，可知支鏈結構相同。化合物5
在B環上具有苯環結構，可由兩組鄰位苯環氫吸收在δH
7.11(1H,d,J
=8.1 Hz)及6.86(1H,d,J
=8.1 Hz)、及六支13
C核磁共振吸收在δC
122.8(d),123.8(d),140.6(s),132.0(s),132.6(s)及144.5(s)證明。另外，二維HMBC(第2圖)分析出H-6(δH
7.11)與C-4(δC
39.0)、H-7(δH
6.86)與C-14(δC
50.2)之關聯性，以及H-6與H-28之NOESY關聯性，則可推導出苯環特徵係位於四環骨架之B環。新穎化合物5
因此建構為19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E
),24-五烯-3β-醇(19-nor
-cucurbita-5(10),6,8,22(E
),24-pentaen-3β-ol)。
在山苦瓜不皂化物NS(18 g)之矽膠管柱層析中，以50%EA/hexane沖提之流洗液的前1升收為11區分(149 mg)。將11區分經由正相HPLC分離，移動相為MeOH/CH2
Cl2
=2/98，流速為4 mL/min，收集6.4~8.3 min之區分為11-1區分(41 mg)。將11-1區分再經由RP-18 HPLC純化，移動相為H2
O/THF/ACN=1/1/8，流速為4 mL/min，則收集在6.5分鐘出現之積分峰，即為11-1-2區分(9 mg)。由TLC點片結果與下述NMR數據判定其為單一化合物，將其訂為「化合物6
」。
經比較核磁共振光譜數據(表1b)，發現化合物6
與已知化合物：karavilagenin E相符，其結構可由下列數據印證：高解析質譜分析m/z
456.3592顯示分子式為C30
H48
O3
，推算其不飽合度為6。紅外線光譜分析在3423 cm-1
有吸收，代表為羥基之吸收。氫譜與碳譜之數據顯示有六支單峰甲基吸收[δH
0.84,0.87,0.87,1.18,1.67,1.69(3H each,s)]、一支雙重分裂峰甲基[δH
0.95(3H,d,J
=6.5 Hz)]、一組環已烯吸收[δH
5.61(1H,dd,J
=9.8,3.6 Hz),6.02(1H,dd,J
=9.8,2.0 Hz);δC
131.5(d),131.7(d)]、一組三取代烯基吸收[δH
5.17(1H,br d,J
=8.4 Hz);δC
129.0(d),133.9(s)]、一個位於軸向之含氧三級碳的氫吸收[δH
3.38(1H,br s,H-3)]、一組含氧二級碳之氫吸收[δH
3.49(1H,d,J
=8.4 Hz)、3.65(1H,d,J
=8.5 Hz);δC
79.9(t)]、及另一個含氧三級碳之氫吸收[δH
4.44(1H,td,J
=9.6,3.1 Hz);δC
65.9(d)]。由三取代烯基之氫δH
5.17與二支單峰甲基δC
18.1(s)、25.7(s)及含氧三級碳δC
65.9(d)之二維HMBC關聯性可推導出1,1-dimethyl-3-hydroxyl-4-alkylsubstituted butane之支鏈結構。C-19上含氧二級碳之氫吸收δH
3.49,3.65與含氧四級碳C-5[δC
87.5(s)]之二維HMBC關聯性,則可推導出C-5與C-19之醚基相連結構。依據上述光譜數據並配合二維核磁共振光譜、質譜、紅外線光譜及紫外線光譜等分析結果,可推導出化合物6
為5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,24-diene-3β,23ξ-diol)。
以前述六個純化所得之葫蘆烷型三萜類化合物(化合物1-6
)分別進行雌激素受體轉錄活性檢測，結果發現化合物1、2、5、6
隨著樣品濃度增加，報導基因鹼性磷酸酶(ALP)的活性會有劑量效應之逐漸增加的趨勢(參閱第3A及3B圖)。在這四個樣品中，化合物6
之活化能力較高，在濃度為22 μM時，可活化ERα(E2之30%)及ERβ(E2之23%)至最大效果。化合物1、2、5
之活化效果約為化合物6
之一半，三樣品活化ERα之最大效果分別為E2之12%、15%、15%，活化ERβ之最大效果則為E2之10%、8%、9%。而化合物3
與4
則受限於具有細胞毒性，其最高細胞耐受濃度僅2 μM，在各處理濃度下，均沒有顯著活化ERα及ERβ之效果。
第3A及3B圖之誤差條(error bar)代表至少三次獨立實驗的活化倍數(fold)之平均值±標準差(means±SD)。以1 nM的雌二醇(E2)作為正對照組(positive control)，其分別對ERα具有6.2±1.3倍、對ERβ具有6.5±1.1倍之活化效果。*表示以學生t檢定分析，與空白載體相較具有p
<0.01之顯著差異。
另將化合物1-6
分別與1 nM E2共同處理，分析其影響E2活化ER轉錄活性之效果(參閱第4A及4B圖)。結果發現化合物1、2、3、6
對ER具有拮抗性，隨著樣品濃度增加，會逐漸降低因E2所引起之ERα及ERβ活化現象。化合物1
與2
在11 μM時，可抑制E2活化ERα及ERβ之能力至其60~70%；化合物3
在2 μM樣品處理下，可降低ALP之活性至E2之48%(ERα)與73%(ERβ)；化合物6
在22 μM樣品處理下，降低ALP之活性至E2之10%(ERα)與24%(ERβ)，在四樣品中最顯著降低因E2所誘發ER之活化現象。化合物5
僅在樣品濃度為1 μM，有輕微抑制E2所誘發ERβ活化之效果(E2之83%，p<0.05)；化合物4
則不具有影響E2所誘發ERα或ERβ轉錄活性之效果。
第4A及4B圖之數值係以E2的活化倍數當作100%，而以空白載體的活化倍數當作0%。誤差條代表至少三次獨立實驗的活化倍數(fold)之平均值±標準差(means±SD)。#及##表示以學生t檢定分析，與E2組相較具有p
<0.05(#)或p
<0.01(##)之顯著差異。
第一批7 g的山苦瓜不皂化物(NS)經矽膠管柱層析，收集以30% EA/hexane沖提之提洗液，以每0.5升之體積為一單位，分別收得13區分、14區分與15區分，其中14區分(74 mg)以NMR與MS分析後，鑑定其為葉黃素(lutein)。
在第二批18 g的山苦瓜不皂化物(NS)之矽膠管柱層析中，以50% EA/hexane沖提之流洗液的前1.5升收為11區分(149 mg)與12區分(124 mg)，再0.5升所收為13區分(156 mg)，最後1升收為14區分(161 mg)。其中13區分經NMR鑑定亦為葉黃素。
將第二批不皂化物(NS)管柱層析之12區分經由製備級RP-18 HPLC分離所分得之12-4區分(3mg，移動相為H2
O/THF/ACN=5/10/85，流速為5 mL/min，在10.1 min出現)，以及將14區分以正相HPLC分離所得之14-3區分(4 mg，移動相為MeOH/EA/CH2
Cl2
=2/3/95，流速為3 mL/min，在8.1 min出現)，亦均鑑定為葉黃素。
將純化所得之葉黃素進行雌激素受體轉錄活性檢測，結果顯示隨著樣品濃度增加，報導基因鹼性磷酸酶(ALP)的活性有逐漸增加之趨勢；當濃度達35 μM時，可活化ERα(E2之29%)及ERβ(E2之26%)至最大效果(第5A、5B圖
)。計算其EC50
分別為17.5 μM(ERα)與11.8 μM(ERβ)。改以市售之葉黃素進行活性分析，亦得相似之活性表現。
第5A、5B圖之結果以平均值±標準差表示，該些數值係分別得自在三重複孔洞進行之至少三次獨立實驗。*及**表示以學生t檢定分析，與空白載體相較具有p
<0.05(*)或p
<0.01(**)之顯著差異。
另將純化所得之葉黃素與1 nM E2共同處理，則發現其對E2所促進ERα及ERβ的活化具有增效效果。在18 μM之樣品濃度處理下，其與E2協同活化效果可達E2之141%(ERα)與166%(ERβ)，參閱第6A、6B圖。
第6A、6B圖之結果以平均值±標準差表示，該些數值係為得自至少三次獨立實驗之結果。#及##表示以學生t檢定分析，與正對照組(E2)相較具有p
<0.05(#)或p
<0.01(##)之顯著差異。
將第二批山苦瓜不皂化物(NS)管柱層析之14區分(161 mg)，以正相HPLC分離所得14-4區分(4 mg，移動相為MeOH/EA/CH2
Cl2
=2/3/95，流速為3 mL/min，在8.5 min出現)，以NMR分析，並搭配GC-MS比對資料庫之結果，鑑定其為黑麥草內酯(Loliolide)。
Loliolide: C11
H16
O3
,1
H NMR(400 MHz,CDCl3
):δ5.67(1H,s,H-7),4.31(1H,m,H-3),2.43(1H,ddd,J
=14.1,2.6,2.6 Hz,H-4β),1.95(1H,ddd,J
=14.5,2.7,2.7 Hz,H-2β),1.76(3H,s,5-CH3
),1.76(1H,dd,J
=14.1,4.0 Hz,H-4α),1.51(1H,dd,J
=14.5,3.7 Hz,H-2α),1.45(3H,s,1α-CH3
),1.27(3H,s,1β-CH3
).氫譜結果與文獻比對相符。
以黑麥草內酯進行雌激素受體轉錄活性檢測，結果顯示隨著樣品濃度增加，鹼性磷酸酶(ALP)活性亦隨之增加，具有劑量效應。當濃度為102 μM，可達ERα活化倍數之最大值(E2之24%)；當濃度為51 μM，可達ERβ活化倍數之最大值(E2之20%)，參閱第7A、7B圖。計算其EC50
分別為14.2 μM(ERα)與16.7 μM(ERβ)。
第7A、7B圖之結果以平均值±標準差表示，該些數值係為得自至少三次獨立實驗之結果。*及**表示以學生t檢定分析，與正對照組(E2)相較具有p
<0.05(*)或p
<0.01(**)之顯著差異。
純化所得之黑麥草內酯與1 nM E2共同處理，則發現其對E2所促進ERα及ERβ的活化具有增效效果。在102 μM之樣品濃度處理下，其與E2協同活化ERα之效果可達E2之146%；在51 μM之樣品濃度處理下，其與E2協同活化ERβ之效果可達E2之145%(參閱第8A、8B圖)。
第8A、8B圖之結果以平均值±標準差表示，該些數值係為得自至少三次獨立實驗之結果。*及**表示以學生t檢定分析，與正對照組(E2)相較具有p
<0.05(*)或p
<0.01(**)之顯著差異。
經由上述實施例的說明，證實化合物1、2、5、6、
葉黃素及黑麥草內酯皆可活化雌激素受體(ERα及ERβ)。而該些化合物與雌激素活性物17β-雌二醇(E2)同時施加後，證實化合物1、2、3、5、6
對E2具有拮抗性，可抑制由E2所誘發的ERα及ERβ活化，而葉黃素及黑麥草內酯則與E2具有協同活化雌激素受體(ERα及ERβ)之效果。
特別是，本發明之化合物1
~5
，可以如式(I)之通式所示：
其中C5和C10之間形成單鍵或雙鍵，C8和C9之間形成單鍵或雙鍵；其中C5和C10之間形成單鍵時，R1
係為氧；其中C8和C9之間形成單鍵時，R2
係為羰基、甲羥基、甲醛基或甲基二甲氧基；其中R1
為氧且R2
為羰基或甲羥基時，R1
之氧與R2
的C19形成單鍵，R1
+R2
=戊內酯或半縮醛環。
本發明所分離之新穎葫蘆烷型三萜類化合物1
~5
分別為葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(化合物1
)、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E
),24-三烯-3β,19-二醇(化合物2
)、3β-羥葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-19-醛(化合物3
)、19-二甲氧基葫蘆素-5(10),6,22(E
),24-四烯-3β-醇(化合物4
)及19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E
),24-五烯-3β-醇(化合物5
)。
更進一步地，化合物1
~6
可依其功能性分為兩個群組，群組(一)係由化合物1、2、5及6所組成，而群組(二)係由化合物1、2、3、5及6所組成；群組(一)具有可單獨地活化一個體內的雌激素受體之功能，包括可單獨地用於活化人類的雌激素受體α或雌激素受體β，或與一雌激素活性物(例如E2)同時施加於一個體；以及群組(二)可部分地抑制該個體之內生性雌激素引起之雌激素受體活性，此些功能從未被揭露，皆可作為一種調節雌激素受體活性的新穎用途。
更進一步地，上述葫蘆烷型三萜類化合物更可作為一種用於調節雌激素受體活性之醫藥組成物，係包括前述之群組(一)或(二)；以及其組合或其藥學上可接受鹽類，以及一稀釋劑、賦形劑或載劑。
上述活性成分無論是以單一化合物或醫藥組成物之形式，未來皆可應用於婦女更年期症狀或雌激素缺乏症患者身上，例如群組(一)之葫蘆烷型三萜類化合物除了可以有效活化雌激素受器用以治療或改善此些症狀外，亦可配合某些雌激素藥物同時施用，可選擇性地活化雌激素受器，具有開發為治療、減緩婦女更年期症狀或雌激素缺乏症之保健食品的潛力。而群組(二)之葫蘆烷型三萜類化合物係可部分地抑制該個體之內生性雌激素引起之雌激素受體活性，例如對於某些雌激素依賴型乳癌之患者而言，可抑制其內生性雌激素的活化作用，具有減緩癌細胞增生的功效性。
本發明所提供之可活化雌激素受體之化合物、醫藥組成物、用途及其萃取方法確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。
第1圖顯示山苦瓜各單一活性成份純化分離之總流程；
第2圖顯示由山苦瓜中所純化出之化合物1
~5
之HMBC與NOESY關聯性分析；
第3A~3B圖分別顯示化合物1-6
活化ERα與ERβ轉錄活性之效果；
第4A~4B圖分別顯示化合物1-6
與1 nM E2共同處理細胞時對ERα與ERβ轉錄活性之影響；
第5A~5B圖分別圖顯示葉黃素(lutein)活化ERα與ERβ轉錄活性之劑量反應；
第6A~6B圖分別顯示葉黃素(lutein)與1 nM E2共同處理細胞時對ERα與ERβ轉錄活性之影響；
第7A~7B圖分別顯示黑麥草內酯(loliolide)活化ERα與ERβ轉錄活性之劑量反應；
第8A~8B圖分別顯示黑麥草內酯(loliolide)與1 nM E2共同處理細胞時對ERα與ERβ轉錄活性之影響；
第9A~9D圖分別顯示化合物1
的1
H NMR、DEPT、EIMS、HRMS及FTIR圖譜；
第10A~10D圖分別顯示化合物2
的1
H NMR、DEPT、EIMS、HRMS及FTIR圖譜；
第11A~11D圖分別顯示化合物3
的1
H NMR、DEPT、EIMS、HRMS及FTIR圖譜；
第12A~12D圖分別顯示化合物4
的1
H NMR、DEPT、EIMS及HRMS及FTIR圖譜；
第13A~13D圖分別顯示化合物5
的1
H NMR、DEPT、EIMS、HRMS及FTIR圖譜。
Claims (15)
- 一種葫蘆烷型三萜類化合物，該化合物係如式(I)所示：
- 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該化合物係為葫蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E ),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)(化合物1 )、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E ),24-trien-3β,19-diol)(化合物2 )、3β-羥葫蘆素-5(10),6,22(E ),24-四烯-19-醛(3β-hydroxycucurbita-5(10),6,22(E ),24-tetraen-19-al)(化合物3 )、19-二甲氧基葫蘆素-5(10),6,22(E ),24-四烯-3β-醇(19-dimethoxycucurbita-5(10),6,22(E ),24-tetraen-3β-ol)(化合物4 )或19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E ),24-五烯-3β-醇(19-nor -cucurbita-5(10),6,8,22(E ),24-pentaen-3β-ol)(化合物5 )。
- 一種葫蘆烷型三萜類化合物用於調節雌激素受體活性的用途，其中該葫蘆烷型三萜類化合物係下列之群組(一)或(二)：群組(一)：係由葫蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯 (cucurbita-6,22(E ),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)(化合物1 )、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E ),24-trien-3β,19-diol)(化合物2 )、19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E ),24-五烯-3β-醇(19-nor -cucurbita-5(10),6,8,22(E ),24-pentaen-3β-ol)(化合物5 )及5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(化合物6 )所組成；群組(二)：係由葫蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E ),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)(化合物1 )、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E ),24-trien-3β,19-diol)(化合物2 )、3β-羥葫蘆素-5(10),6,22(E ),24-四烯-19-醛(3β-hydroxycucurbita-5(10),6,22(E ),24-tetraen-19-al)(化合物3 )、19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E ),24-五烯-3β-醇(19-nor -cucurbita-5(10),6,8,22(E ),24-pentaen-3β-ol)(化合物5 )及5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(化合物6 )所組成；其中將該群組(一)或群組(二)之葫蘆烷型三萜類化合物施加於一個體中，該群組(一)之葫蘆烷型三萜類化合物可單獨地活化該個體之雌激素受體活性，而該群組(二)之葫蘆烷型三萜類化合物係可部分地抑制該個體之內生性雌激素引起之雌激素受體活性。
- 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該雌激素受體係為人類的雌激素受體α或雌激素受體β。
- 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該化合物係與一雌激素活性物同時施加於一個體，其中該雌激素活性物係選自於由雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)及17α-乙炔基雌二醇(EE2)所組成之群組。
- 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該化合物係分離自一山苦瓜。
- 一種用於調節雌激素受體活性之醫藥組成物，係包括下列之群組(一)或(二)：群組(一)：係由葫蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E ),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)(化合物1 )、5β,19-環氧葫 蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E ),24-trien-3β,19-diol)(化合物2 )、19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E ),24-五烯-3β-醇(19-nor -cucurbita-5(10),6,8,22(E ),24-pentaen-3β-ol)(化合物5 )及5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(化合物6 )所組成；群組(二)：係由葫蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β-羥基-19,5β-內酯(cucurbita-6,22(E ),24-trien-3β-ol-19,5β-olide)(化合物1 )、5β,19-環氧葫蘆素-6,22(E ),24-三烯-3β,19-二醇(5β,19-epoxycucurbita-6,22(E ),24-trien-3β,19-diol)(化合物2 )、3β-羥葫蘆素-5(10),6,22(E ),24-四烯-19-醛(3β-hydroxycucurbita-5(10),6,22(E ),24-tetraen-19-al)(化合物3 )、19-去碳-葫蘆素-5(10),6,8,22(E ),24-五烯-3β-醇(19-nor -cucurbita-5(10),6,8,22(E ),24-pentaen-3β-ol)(化合物5 )及5β,19-環氧葫蘆素-6,24-二烯-3β,23ξ-二醇(化合物6 )所組成；以及其組合或其藥學上可接受鹽類，以及一稀釋劑、賦形劑或載劑。
- 一種自山苦瓜中萃取如申請專利範圍第1項所述之式(I)化合物之方法，其步驟包括：(a)提供一預定重量之山苦瓜凍乾粉末，以乙酸乙酯於室溫下萃取，經減壓濃縮除去溶劑後得到一乙酸乙酯萃取物；(b)將該經乙酸乙酯萃取過之山苦瓜粉末再以乙醇於室溫下萃取，經減壓濃縮除去溶劑後得到一乙醇萃取物；(c)將該乙醇萃取物進行粗顆粒之逆相管柱層析，取其中一區分進行酸水解反應，再以乙酸乙酯於室溫下萃取，經減壓濃縮除去溶劑後得到一酸水解產物；(d)將該酸水解產物再次進行逆相管柱層析；(e)將步驟(d)所得之一區分以逆相與正相製備級高效率液相層析進行進一步純化分離，得到該具有雌激素活性之化合物。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中步驟(a)係以相對於該山苦瓜凍乾粉末20倍體積之乙酸乙酯進行萃取。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中步驟(b)係以相對於該山苦瓜粉末20倍體積之乙醇進行萃取。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中步驟(c)之逆相管柱層析係依序以水、50%甲醇/水溶液、100%甲醇及丙酮作為流動相進行沖提流洗。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中步驟(c)先以80%甲醇/水流洗，再依序以水、50%甲醇/水、甲醇及丙酮進行沖提，將所收得之甲醇區分進行酸水解反應。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中步驟(c)係以鹽酸進行酸水解反應。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中步驟(d)之逆相管柱層析係依序以80%甲醇/水溶液與100%甲醇為流動相進行沖提流洗。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中步驟(e)之逆相製備級高效率液相層析的流動相為100%甲醇或100%甲醇+0.1%乙酸，正相製備級高效率液相層析的流動相為乙酸乙酯/正己烷(比例=3：7)或四氫呋喃/正己烷(比例=2：8)。
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