TWI374937B - Isolated cis-aconitic acid decarboxylase, nucleic acid, and method for producing itaconic acid - Google Patents

Description

1374937 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一種基因修飾之土麵菌说似) 品系，包括突變之順式烏頭酸脫羧酶(C/JD)，其在C端區 域上具有一或複數個突變，且相較於^生型之土麴菌，該 基因修飾之土麴菌具有較高的衣康酸(ΙΑ)產量。 % 【先前技術】 衣康酸(ΙΑ)為許多產物（如，聚丙烯纖維、橡膠、人工 鑽石及鏡片）之必需前驅物，其廣泛地使用於化學工業上。 • 某些微生物，如土麵菌ierrews)，可表現衣康 ' I ’且已發現順式烏頭酸脫缓酶(CAD)在衣康酸的生合成 上扮演重要的角色。 【發明内容】 在本發明之一範疇中，本發之特徵為一經分離之聚月 肽，包括突變的CAD胺基酸序列’其在野生型cad(序多 識別號：1)胺基酸序列的第441-490位置（例如，第461_49 位置或第481-490位置)上具有.一突變。此突變可位於序; 識別號：i的帛490位置。在一實施例中，此突變為序; 識別號：1第490位置的V被置換為—胜肽片段_，（ ^邮）。此突變的⑽可更包括在序列識別號：⑷ 9位置上有一突變（例如，序列識別號：1第彻位置的 1374937 被置換為F)。在另一實施例中’此突變為序列識別號：1 第441-490位置的片段被置換為另一片段’例如序列識別 號：9第441-492位置的片段。突變CAD可包括，但不限 於，例如序列識別號：3、5、7或9之胺基酸序列。 在本發明另一實施樣態中，本發明之特徵包括編碼上 述任何聚胜肽的核酸’以及含此核酸的寄主細胞，此枝酸 與在寄主細胞中具有功能的啟動子(promoter)操作性連接 (operative linkage)。啟動子序列為一核皆酸序列，其包括 使操作性連接之核酸序列開始轉錄的必要組< (elements)。啟動子至少包含一 RNA聚合酶結合位。啟動 子可更包括一或複數個可促進轉錄之增強子（enhaneej> element)，或包括一或複數個控制啟動子的開/關狀態之調 控子（regulatory element)。 在本發明之範疇中，更包括一種培養上述寄主細胞於 一適當培養基中以產生衣康酸(〗A)的方法。此產生的衣康 酸可由培養基中分離出來。 為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更 明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳 細說明如下： 【實施方式】 本發明所述之突變型順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，在與野 生型比較之下’其具有較高的酵素活性。 順式烏頭酸脫羧酶(CAD)，，可將順式烏頭酸轉變為 衣康酸，其為衣康酸生合成的重要酵素。本發明所述之 “CAD”係指任何天然的順式烏頭酸脫羧酶(例如，野生型 CAD)。例如，土麴菌 ierrews)之 CAD 描述於 Dwiarti et al.，J· Bioscience and Bioengineering, 94(1):29-33, 2002 以及 W02009/014437。下列提供土麴菌〇4· MrrewWCAD之胺基 酸序列（序列識別號：1)及編碼該胺基酸之核苷酸序列（序列 識別號：2)。 土麴菌之胺基酸序列（序列識別號： 及核苷酸序列（序列識別號：2): atgaccaaacaatctgcggacagcaacgcaaagtcaggagttacgtccgaaatatgtcat MTKQSADSNAKSGVTSEICH tgggcatccaacctggccactgacgacatcccttcggacgtattagaaagagcaaaatac WASNLATDDIPSDVLERAKY cttattctcgacggtattgcatgtgcctgggttggtgcaagagtgccttggtcagagaag LILDGIACAWVGARVPWSEK t a t g 11 caggcaacga t gage 11 tgagccgccgggggcctgcagggtgattggatatgga YVQATMSFEPPGACRVIGYG cagaaactggggcctgt tgcagcagccatgaccaat teegetttcatacaggctacggag QKLGPVAAAMTNSAFIQATE ct tgacgactaccacagcgaagcccccctacactctgcaagcat tgtcct tcctgcggtc LDDYHSEAPLHSASIVLPAV 11 tgcagcaagtgaggtct tagccgagcagggcaaaacaat t tccggtatagatgt tatt FAASEVLAEQGKTISGIDVI 'ctagccgccattgtggggtttgaatctggcccacggatcggcaaagcaatctacggatcg 1374937

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atgaccaaacaatctgcggacagcaacgcaaagtcaggagttacgtccgaaatatgtcat MTKQSADSNAKSGVTSEICH t gggc a t ccaacc t ggccac t gacgaca t ccc 11 cggacg t a 11 agaaagagcaaaa t ac WASNLATDDIPSDVLERAKY c 11 a 11 c t cgacgg t a t ΐ gca t g t gcc t ggg 11 gg t gcaagag t gcc 11 gg t cagagaag LILDGIACAWVGARVPWSEK t a t g 11 caggcaacga t gage 111 gagccgccgggggcc t gcaggg t ga 11 gga t a t gga YVQATMSFEPPGACRV IGYG cagaaac t ggggcc t g 11 gcagcagccatgaccaa 11 ccgc 111 ca t acaggct aeggag QKLGPVAAAMTNSAFIQATE ct tgacgactaccacagcgaagcccccctacactctgcaagcat tgtcct tcctgcggtc LDDYHSEAPLHSASIVLPAV tttgcagcaagtgaggtcttagccgagcagggcaaaacaatttccggtatagatgttatt FAASEVLAEQGKTI SGIDVI ctagccgccattgt gggg 111 gaa t c t ggcccacgga t cggcaaagcaa t c t aegga t eg LAAIVGFESGPRIGKAIYGS gacctct tgaacaacggctggcat tgtggagctgtgtatggcgctccagccggtgcgctg DLLNNGWHCGAVYGAPAGAL gccacaggaaagctcctcggtctaactccagactccatggaagatgctctcggaattgcg ATGKLLGLTPDSMEDALGIA tgcacgcaagcctgtggtttaatgtcggcgcaatacggaggcatggtaaagcgtgtgcaa CTQACGLMSAQYGGMVKRVQ cacgga 11 cgcagcgcg t aa t gg t c 11 c 11 gggggac t g ΐt ggccca t gg t ggg t aegag HGFAARNGLLGGLLAHGGYE 13 1374937

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G ¥ G G A TE L H 5 Q P R' _T ；T G. G Q. T gtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggctaa (；序列識別號：10) "W R C 5 x :Q ~~s l§ (该列識別號：9) 上述任何之突變型CAD可以傳統的重組技術製備。例 如，可導入一或複數個突變至編碼野生型CAD的核苷酸序 _ 列中，且此突變之編碼序列可於一適當的寄主細胞中表 現，以產生該突變型CAD聚胜肽。該編碼序列可視需要根 據寄主微生物中理想密碼子的使用進行密碼子理想化 " (codon optimization)。以下為 土麴菌（A 編碼序 - 列的例子，其中一些密碼子被理想化的大腸桿菌 密碼子置換： atgaccaagc agtctgctga ttccaacgcg aagtctggtg tgacctctga gatctgtcac

tgggcgtcta atctcgccac tgatgatatc ccgagcgacg ttctggagcg tgcaaaatac ctgatcctgg atggtatcgc gtgcgcgtgg gtaggtgctc gtgtcccatg gtctgaaaaa tacgttcaag cgaccatgtc tttcgaacct ccgggtgcgt gtcgtgtcat cggttacggc cagaaactgg gtccggtagc ggctgccatg acgaactctg catttattca ggcgaccgaa ctcgatgact atcactctga agcgccgctg cattccgcgt ctatcgttct cccggcagtt ttcgcggcga gcgaagtact ggccgaacag ggtaaaacca tctctggtat tgacgtgatt ctggctgcga tcgttggttt cgagagcggt cctcgcatcg gcaaagcgat ctacggttct gacctcctga acaacggctg gcactgcggt gcggtatatg gcgcaccggc tggtgcgctc gcaactggta agctcctggg cctcacgccg gacagcatgg aagatgcact gggtattgcc 17 1374937

tgcacgcaag catgcggcct catgtccgcg cagtatggtg gcatggttaa acgtgttcag cacggtttcg cagcgcgtaa tggtctcctc ggtggcctcc tggctcacgg cggctacgag gcgatgaaag gtgttctcga gcgttcttac ggtggcttcc tgaagatgtt caccaagggc aacggtcgtg aaccgccgta caaagaagaa gaggttgtgg ctggtctggg tagcttctgg cacaccttca ccattcgtat caaactgtac gcgtgctgcg gtctcgtaca cggtcctgtt gaagccattg aaaacctcca gggtcgttac ccggaactgc tcaatcgtgc taacctgtct aacatccgcc acgttcacgt acaactctct accgcgagca actcccactg tggttggatc ccagaagagc gcccaatctc ttctatcgcg ggtcaaatgt ctgtcgcata tatcctcgcc gttcagctcg ttgaccaaca gtgtctgctc agccagttct ccgagtttga cgataatctg gaacgcccgg aagtgtggga cctggcacgt aaggttacca gctctcaatc tgaggagttc gaccaggacg gtaactgtct ctctgccggt cgcgtccgta ttgagttcaa cgacggctcc tccatcaccg aatccgttga gaagccgctc ggtgtaaagg aaccaatgcc aaatgaacgc atcctgcaca aataccgtac cctggcgggt tctgtaacgg acgaaagccg tgttaaggag atcgaggatc tcgtgctcgg cctggaccgt ctgaccgata ttagcccgct cctcgagctg ctgaattgtc cggttaaatc cccactggtt taa (序列識別號：12) 蛋白質的表現程度可以傳統的方法來測量。在一實施 籲 例中’可由西方點潰分析法（Western analysis)破認野生型 CAD及突變型CAD的表現程度。該聚胜肽增加的酵素活 性可以傳統的方法來確認。在一實施例中，可藉由HPLC 來破認寄主細胞的衣康酸(IA)產量，以及相較於相同寄主 細胞型態表現的野生型CAD，衣康酸(IA)產量的增加表示 突變型CAD比野生型CAD具有較高的酵素活性。 在證實突變型CAD具有較高的酵素活性之後，此突變 18 1374937 型CAD可用來產生衣康酸。更具體地說，突變型cad編 -碼序列可被選殖（clone)至一適當的表現質體(plasmid)，並 導入一適當的寄主微生物。此微生物之後培養於一適當的 培養基中以生產衣康酸。此培養基較佳包括葡萄糖或；檬 •酸為製造衣康酸的前驅物。經過足夠的培養時間後，收集 此培養基並分離分泌出來的衣康酸。 無須進一步闡述，相信熟悉此技術領域人士可由上述 内容使用及完成本發明至最大程度。下列具體實施例僅用 • 於說明本發明，不可用來限制本發明之範疇。本發明中所 述之公開文獻皆屬於本發明之一部份。 【實施例】 - 實施例1 :以含有突變型CADs之土麴菌（乂 似) 株，產生衣康酸 製備含突變型CADs之土麴菌（A. terreus)突變株/融合 % 體(fusants)。 如下述之隨機突變製備土麴菌（儿ierreMS)突變株。將 108個細胞/ml之土麵菌〇4· ierrei^)(ATCC 10020)培養於衣 康酸產生培養基(IAproducingmedium)(pH2.8)中隔夜，該 衣康酸產生培養基包括：在每1 L的蒸餾水中含有100 g 的葡萄糖、6 g 的（NH4)2S〇4、〇_2 g 的 KH2P04、1 g 的 MgSO4.7H2O、0.4 g 的 CaSO4、0.5xl0_3 g 的 CuS〇4、〇.5xlO·3 g的ZnS04.4H20、及3xl(T3 g的FeCl3。將此細胞收集、清 19 1374937 洗’並與l〇_15 g/L的溶壁酶(Lysing Enzymes)(含有β-葡 聚糖酶(glucanase)、纖維素、蛋白質酶及幾丁酶（chitinase)) 及一致突變物(mutagen)共同培養，致突變物質為1-曱基_3- 硝基-硝基胍（l-methyl-3-nitro-nitrosoguanidine ; NTG，1-5 g/Ι)或曱烧石黃酸乙 g旨（ethylmethanesulfonate ; EMS，2-200 mg/l)以誘發突變。將此細胞再一次收集並重新懸浮於一培 養基中，並置於2-去氧葡萄糖(2-DG)-馬鈴薯的洋菜平板 (2-DG的濃度為0.25-5.0 g/Ι)上，於適當條件下允許菌落形 成（colony formation)。在任一致突變物質存在下，約有 φ 12.5-99·3%(3χ107-9χ108 CFU/ml)的細胞死亡。將每個存活 的菌落培養於25 ml的上述衣康酸產生培養基中，細胞濃 度為101G個細胞/ml ’接著將細胞置於含有pH指示劑(pH -3.0-5.4)的衣康酸-馬鈴薯葡萄糖(dextrose)洋菜平板上，該 pH指示劑擇自於溴曱紛綠（bromocresol green)、漠齡藍 (bromocresol blue)或剛果紅(congo red)(30-130 mg/L)。可由 平板上的顏色來選擇產生高衣康酸產量之菌落。 以上述之篩選方式，獲得高衣康酸產量之M1-M5突變籲 株。將此突變株培養於衣康酸產生培養基中3.5天，以孔 洞尺寸0.22 μιη的濾膜過濾出培養基中的衣康酸，以 LiChroCART管柱(粒徑為5-mm，長度為125-mm，直徑為 4-mm ’ Merk，Germany)進行HPLC，分析培養基中的衣康 酸含量。以含20 mM正磷酸之缓衝液在30°C下沖提出衣 康酸’沖提速率為1 ml/min。將沖提出的衣康酸以Shimadzu SD-20A 分光債檢器（Shimadzu ’ Japan)測定 OD230。如表一 20 1374937 所示，M1-M5突變株的衣康酸產量高於野生型土麴菌（左 terreus) ° 表一、以M1-M5突變株產生衣康酸 菌株 衣康酸濃度 衣康酸濃 度(倍數） 產量(％) 產量 (倍數） WT 10.87 1 23.38 1 Ml 17.43 1.60 28.30 1.21 M2 17.12 1.57 29.06 1.24 M3 21.68 1.99 33.55 1.44 M4 28.04 2.58 36.85 1,58 M5 23.51 2.16 39.32 1.68 WT :野生型 土麴菌(儿ierrews)突變株也可如下述利用與黑麴菌(j. φ 基因重組(genome shuffling)的方式形成。將土麵菌〇4· ㈣)(ATCC 10020)細胞（1〇8個細胞/ml)及黑麴菌（X 則·㈣(NRRRL 330)細胞(1 〇8個細胞/ml)分別在35。c下培養 於培養基(pH 3)過夜，該培養基包括於丨Ε的蒸餾水中，含 有 150 g 的葡萄糖、2.5 g 的（NH4)2S〇4、2 g 的 kH2P04、〇.5 g 的 MgS04、0.06χ1(Τ3 g 的 CaS04.5H20、O.lxlO·3 g 的

ZnS04.7H20、及 G.lxlG·3 g 的 FeS〇4.24H2Q。收集所有的 細胞，並以含o.7MKC1之鱗酸緩衝液(pH6)清洗，且盘溶 壁酶輕微震盪培養2小時。將釋放出的原生f體㈣丈。咖叫 21 1374937 以1.4 Μ的山梨醇進行滲透作用，之後以1800 g離心收集。 接著’將該原生質體重新懸浮於蒸餾水中以形成粗原生質 體懸浮液。將土麴菌（乂 ierrews)及黑麴菌m'gerj的原生 質體懸浮液以相同體積混合，於4°C下以1000 g離心10 分鐘。使由此獲得的原生質體沉殿物(protoplast pellet)重新 懸浮於0.05 Μ的甘胺酸(glycin)-NaOH緩衝液(pH7.5)，該 緩衝液含有30%(w/v)的聚乙二醇(PEG)6000、100 mM的 CaCl2及0.7M的KC1。此懸浮液於30〇C下培養20分鐘後， 置於馬鈐薯葡萄糖洋菜平板的表面，於3(TC下培養5-7天 · 以形成菌落（colony)，此為融合體（fusant)Gl〜G6。融合率

(fusion frequency)約為 200 CFU/ml。將每個融合體在 35。C 下，於如上述之25 ml的衣康酸產生培養基中旋轉震動（15〇 - 轉/分鐘）培養5.5天。發現G1-G6融合體的衣康酸產量高於 -野生型土麴菌（乂化以^狀）。 表二、以G1-G6融合體產生衣廉醢 菌株 衣康酸濃度 衣康酸濃度 產量(％) 產量 (S/1) (倍數） (倍數） WT 21.83 1 27.20 1 G1 35.97 1.65 49.69 1.83 G2 35.63 1.63 50.26 1.85 G3 29.33 1.34 67.12 2.47 G4 31.90 1.46 50.46 ------* * 7 1.86 G5 31.62 1.45 55.29 2.03 22 1374937 G6 30.98 1.42 53.69 1.97 wt :野生型 確認編碼突變型CAD之核苷酸序列 以傳統的方式分析特定的突變株/融合體的CAD基因 體序列。簡單地說，分別以Wizard®基因體DNA純化套組 (Promega，USA)及 Epicentre®MasterPureTMRNA 純化套組 (Biotechnologies，USA)由關注的突變株/融合體分離出基因 體DNA及總RNA。以聚合酶連鎖反應(PCR)及tag聚合酶 (Invitrogen™，US)，使用以下引子，由基因體DNA擴增 含CAD基因的DNA片段，使用之引子如下所示： CAD1( 前 置引子 ） ： 5’-CAGCCATGACCAATTCCGCTTTC A-3,(序列識別號： 12)； CAD1( 反置 引子） ： 5’-AAGACCTCACTTGCTGCAAAGAC C-3’ （序列識別 號：13);

Cad-f-2(504-523)：5,-TTGTGGAGCTGTGTATGGCG-3, (序列識別號：14);

Cad-(700-716)-F: 5，-GTTGGCCCATGGTGGG-3,（序列 識別號：15);

Cad-(251-270)-R : 5，-CATGGCTGGETGCAACAGGCC-3’（序列識別號：16)。 PCR的條件為：94°C，5秒鐘；94X，20秒鐘，56°C， 1374937 30秒鐘，72°C，2分鐘，30個循環；最後延伸作用為72° C，10秒鐘。 CAD編碼序列也可以反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR) 進行擴增，以上述總RNA為模板，以上述引子及verso 1-步驟RT-PCR套組(AB gene，US)進行以下條件：47°C， 30 秒鐘；94°C，2 分鐘；94°C，20 秒鐘，55°C，30 秒鐘， 72 C，2分鐘，30個猶環；最後延伸作用（extension)為72 °C，5分鐘。 由實驗結果可知，Ml及M4突變株具有mCADl，G2 φ 及G4融合體具有mCAD2，G3融合體具有mCAD3。此突 變CAD之胺基酸序列及核苷酸序列如上所述。 確認突變型CAD的酵素活性 此突變型CAD的CAD活性測定可根據Dwiarti et al·, J.

Bioscience and Bioengineering 94:29-33 (2002)之方法猶微 改良而進行。簡單地說’將含突變型CAD的土麴菌（乂. ierre㈣株在35°C下’旋轉震動（150轉/分鐘）培養於適當的 · 培養基中（101()個細胞/ml) 3天。收集經培養的細胞，並以 1 : 10的體積比例懸浮於磷酸鈉緩衝液(0.2 Μ，pH 6.2)中， 且以超音波震盪處理10分鐘使其胞溶，以獲得粗的溶胞產 物（lysates)。離心該溶胞產物並收集上清液 將4.5 ml的每 一上清液與終濃度為5.0mM的含順式烏頭酸溶液〇.5 ml， 於40°C下混合反應10分鐘’最後在該反應混合物中加入 〇.1 ml的12 M HC1停止反應。以HPLC(管柱： 24 1374937

LiChroCART，偵測器：SPD-20AD，20 mM 的正磷酸，30 °C，在波長230 nm)測定酵素反應產物-衣康酸的含量。

表三、含突變型CAD之土麴菌ierrewj)株的CAD 活性 菌株 CAD 活性（μιηοΐ/mg/min) CAD活性 (倍數） CAD WT 0.007 1 WT Ml 0.056 8 mCADl M4 0.064 9.1 mCADl G2 0.009 1.3 mCAD2 G3 0.008 1.1 mCAD3 G4 0.018 2.6 mCAD2 WT :野生型 如上述表三所示，相較於野生型土麴菌（i ierrew)品 系，所有含突變型CADs的土麴菌(A /errews)株皆顯示較 高的CAD活性。 實施例2 :大腸桿菌（五· c〇/f)中突變型CAD的製備 mCAD 1、mCAD2及mCAD3使用下列引子經PCR擴增： CAD( 前置引 子 ） ： actcatatgATGACCAAACAATCTGCGGA (序列識別號：17); mCADl( 反 置引子 ） ： 25 1374937 tacggatccTATACCCAGGGGCGATT TCAC(序列識別號： 18)； mCAD2( 反置 引 子 ） ： tacggatccTTTTATACCCAGGGGCGAT TTC(序列識別號： 19) ； mCAD3( 反置 引子） ： tacggatccTATACCAAAGGGCGATTTC ACG(序列識別號： 20) 。 PCR的條件為：94eC，5秒鐘；94eC，20秒鐘，56。 · C，30秒鐘，72°C，2分鐘，25個循環；最後延伸作用為 72°C，10 秒鐘。 該PCR產物經由限切酵素位BamHI以及Ndel選殖 (cloned)進入帶有 His-tag 的 pET-24a DNA -69749-3(Novagen)，所得質體導入 DH5a(Cat.no.DH01-10， GeneMark)。使用引子 5’ -ctcagcttcctttcgggctt-3’（序列識別 號：21)及5’- cgcacctgtggcgcc-3’（序列識別號：22)以菌落 PCR(colony PCR)確認陽性菌落（positive colony)，更進 鲁 一步以DNA定序確認。帶有mCADl、mCAD2、mCAD3的 編碼序列的質體DNA，使用質體微製造純化套組（Plasmid Miniprep Purification Kit)(GeneMark, cat.

No. :DP01-300)純化。 mCADl、mCAD2 及 mCAD3 以及野生型（wt)CAD 在 DH5 a 中過度表現，利用 His*Bind®套組（Cat. No. 70239-3，Novagen)純化。經過西方點潰分析，這些突變型 26 1374937 的表現程度與野生型CAD相似，表示該突變型在蛋白質表 現上沒有影響（如第2圖所示）。 上述經過純化的突變型CAD的CAD活性如實施例χ 之方法檢測。如下列表四及第1圖所示，與野生型CAD相 比，上述之突變型CAD皆呈現較高的CAD活性。 突變型CAD之大腸椁菌（五.^/〇的CAD活性 菌株 CAD活性(％) v^· /w Ί. CAD活性（倍數） WT 100 1 mCADl 118.24 1.2 mCAD2 153.88 1.5 mCAD3 104.16 1.04 WT :野生型 而且酵素動力（enzyme kinetics)根據 Dwiarti et al.，J. Bioscience and Bioengineering 94:29-33 (2002)所述方法鞘 微改良而檢測。簡單地說，將含有一個上述突變型CAD的 大腸桿菌CE.⑺/〇於35°C旋轉震動（250轉/分鐘）下培養於 LB培養基中一段適當時間。當該培養基的光學密度達到 0.4時，將其中的細菌細胞培養於30°C旋轉震動（250轉/ 分鐘）下、添加異丙基-D-硫代半乳糖（isopropyl-P-D-1-thiogalactopyranoside;IPTG)之 M9 培養基（lg/1 的酵母菌 萃取物及20g/l的葡萄糖）5-6小時，使前述之突變型CAD 表現。收集上述細胞，以1 : 10的體積比例懸浮於填酸鈉 27 1374937 緩衝液（0· 2M，ρΗ6· 5)中，經攪拌式微珠研磨器（bead beater)胞》谷（lyze).l分鐘，形成粗的溶胞產物（iySate)。 離心該溶胞產物，並收集上清液。將該上清液〇. 5ml培養 於37°C不同時間的含有順烏頭酸終濃度為i2mM的溶液 0. 5ml ’然後與1 μ 1的12M HC1混合，終止酵素反應，以 確認前述突變型CAD的酵素活性。由前述突變型CAD將順 烏頭酸轉換為衣康酸的量’經HPLC(管柱：LiChroCART， 偵測器：SPD-20AD，20mM的正磷酸，在3(TC，在波長230nm) 檢測。 表五、突變型CAD的酵素動力 分離係數 Km(mM) 最大反應速率 Vm(mM/min) 催化速率 kcat(l/s) 催化效率 kcat/Km WT 5 0.0024 60.61 12.12 mCAD3 3.7 0.002 81.82 22.11 mCAD2 5 0.0027 72.73 14.55 mCADl 5.55 0.0025 75.76 13.65 WT :野生型 總結來說，此結果表示mCADl、mCAD2及mCAD3 顯示較野生型CAD具有較高的酵素活性。 實施例3 :以大腸桿菌（E. coli)表現mCAD4，產生衣康 28 1374937

mCAD4如下述之任意突變而產生。使用序列識別號：11 為模板，及GeneMorph® II任意突變套組（Stratagene， Catalog #200550)進行 Error-Prone PCR。確認編碼 mCAD4 的突變序列。與野生型CAD相比，mCAD4包括在野生型CAD 第441-490位置（序列識別號·· 1)上具有一取代片段(52個胺 基酸）。 如實施例1所述之方法確認以大腸桿菌（五.株表現 mCAD4或野生型CAD的衣康酸產量，結果如表六及第3圖 所示。 表六、以大腸桿菌（五· co/z_)株表現mCAD4及野生型 CAD，產生衣康酸 菌株 衣康酸濃度(g/1) 衣康酸濃度(倍數） WT 0.020121 1 mCAD4 0.024648 1.22 WT:野生型 上述結果顯示相較於大腸桿菌（五C0/z·)株表現野生型 CAD所產生的衣康酸濃度，大腸桿菌co/〇株表現mCAD4 產生較咼濃度的衣康酸。此表示mCAD4較野生型CAD具有 較高的酵素活性。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限疋本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神 1374937 和範圍内，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

30 1374937 【圖式簡單說明】 第1圖顯示含突變CAD片段之大腸桿菌（五· α")的 CAD活性。 第2圖顯示含突變CAD之大腸桿菌（五· 的CAD蛋 白檢測結果。 第3圖顯示含突變CAD44-490區域之大腸桿菌〇Ε· α/ζ·) 的衣康酸產量。 【主要元件符號說明】 益〇 - 4 »*\ 31 1374937 【序列編號】 <110〉財團法人工業技術研究院 <120〉經分離之聚胜肽、核酸、以及生產衣康酸的方法 <160> 12 <150> U.S. Application No.: 12/494,487; 12/624,658 <151> 2009-6-30; 2009-11-24 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 490

<212> PRT <213> Escherichia coli <220> <400> 1 MTKQSADSNA KSGVTSEICH WASNLATDDI PSDVLERAKY LILDGIACAW VGARVPWSEK 60 YVQATMSFEP PGACRVIGYG QKLGPVAAAM TNSAFIQATE LDDYHSEAPL HSASIVLPAV 120 FAASEVLAEQ GKTISGIDVI LAAIVGFESG PRIGKftlYGS DLLNNGWHCG AVYGAPAGAL 180 ATGKLLGLTP DSMEDALGIA CTQACGLMSA QYGGMVKRVQ HGEAARNGLL GGLLAHGGYE 240 AMKGVLERSY GGFLKMFTKG NGREPPYKEE EWAGLGSFW HTFTIRIKLY ACCGLVHGPV 300 EAIENLQGRY PELLNRANLS NIRHVHVQLS TASNSHCGWI PEERPISSIA GQMSVAYILA 360 VQLVDQQCLL SQFSEFDDNL ERPEVWDLAR KVTSSQSEEF DQDGNCLSAG RVRIEFNDGS 420 SITESVEKPL GVKEPMPNER ILHKYRTLAG SVTDESRVKE IEDLVLGLDR LTDISPLLEL 480 LNCPVKSPLV 490 <210> 2 1374937

<211> 1473 <212> DNA <213> Escherichia coli <400〉 2

atgaccaaac aatctgcgga cagcaacgca aagtcaggag ttacgtccga aatatgtcat 60 tgggcatcca acctggccac tgacgacatc ccttcggacg tattagaaag agcaaaatac 120 cttattctcg acggtattgc atgtgcctgg gttggtgcaa gagtgccttg gtcagagaag 180 tatgttcagg caacgatgag ctttgagccg ccgggggcct gcagggtgat tggatatgga 240 cagaaactgg ggcctgttgc agcagccatg accaattccg ctttcataca ggctacggag 300 cttgacgact accacagcga agccccccta cactctgcaa gcattgtcct tcctgcggtc 360 tttgcagcaa gtgaggtctt agccgagcag ggcaaaacaa tttccggtat agatgttatt 420 ctagccgcca ttgtggggtt tgaatctggc ccacggatcg gcaaagcaat ctacggatcg 480 gacctcttga acaacggctg gcattgtgga gctgtgtatg gcgctccagc cggtgcgctg 540 gccacaggaa agctcctcgg tctaactcca gactccatgg aagatgctct cggaattgcg 600 tgcacgcaag cctgtggttt aatgtcggcg caatacggag gcatggtaaa gcgtgtgcaa 660 cacggattcg cagcgcgtaa tggtcttctt gggggactgt tggcccatgg tgggtacgag 720 gcaatgaaag gtgtcctgga gagatcttac ggcggtttcc tcaagatgtt caccaagggc 780 aacggcagag agcctcccta caaagaggag gaagtggtgg ctggtctcgg ttcattctgg 840 cataccttta ctattcgcat caagctctat gcctgctgcg gacttgtcca tggtccagtc 900 gaggctatcg aaaaccttca ggggagatac cccgagctct tgaatagagc caacctcagc 960 aacattcgcc atgttcatgt acagctttca acggcctcga acagtcactg tggatggata 1020 ccagaggaga gacccatcag ttcaatcgca gggcagatga gtgtcgcata cattctcgcc 1080 gtccagctgg tcgaccagca atgtcttttg tcccagtttt ctgagtttga tgacaacctg 1140 gagaggccag aagtttggga tctggccagg aaggttactt catctcaaag cgaagagttt 1200 gatcaagacg gcaactgtct cagtgcgggt cgcgtgagga ttgagttcaa cgatggttct 1260 tctattacgg aaagtgtcga gaagcctctt ggtgtcaaag agcccatgcc aaacgaacgg 1320 attctccaca aataccgaac ccttgctggt agcgtgacgg acgaatcccg ggtgaaagag 1380 attgaggatc ttgtcctcgg cctggacagg ctcaccgaca ttagcccatt gctggagctg 1440 ctgaattgcc ccgtgaaatc gccactggta taa 1473

<210> 3 <211〉 491 <212> PRT <213> Escherichia coli <220〉 <400〉 3 MTKQSADSNA KSGVTSEICH WASNLATDDI PSDVLERAKY LILDGIACAW VGARVPWSEK 60 YVQATMSFEP PGACRVIGYG QKLGPVAMM TNSAFIQATE LDDYHSEAPL HSASIVLPAV 120 FAASEVLAEQ GKTISGIDVI LAAIVGFESG PRIGKAIYGS DLLNNGWHCG AVYGAPAGAL 180 ATGKLLGLTP DSMEDALGIA CTQACGLMSA QYGGMVKRVQ HGFAARNGLL GGLLAHGGYE 240 AMKGVLERSY GGFLKMFTKG NGREPPYKEE EWAGLGSFW HTFTIRIKLY ACCGLVHGPV 300 EAIENLQGRY PELLNRANLS NIRHVHVQLS TASNSHCGWI PEERPISSIA GQMSVAYILA 360 VQLVDQQCLL SQFSEFDDNL ERPEVWDLAR KVTSSQSEEF DQDGNCLSAG RVRIEFNDGS 420 SITESVEKPL GVKEPMPNER ILHKYRTLAG SVTDESRVKE IEDLVLGLDR LTDISPLLEL 480 LNCPVKSPLGI <210> 4 <211> 1476 491 1374937

<212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4

atgaccaaac aatctgcgga cagcaacgca aagtcaggag ttacgtccga aatatgtcat 60 tgggcatcca acctggccac tgacgacatc ccttcggacg tattagaaag agcaaaatac 120 cttattctcg acggtattgc atgtgcctgg gttggtgcaa gagtgccttg gtcagagaag 180 tatgttcagg caacgatgag ctttgagccg ccgggggcct gcagggtgat tggatatgga 240 cagaaactgg ggcctgttgc agcagccatg accaattccg ctttcataca ggctacggag 300 cttgacgact accacagcga agccccccta cactctgcaa gcattgtcct tcctgcggtc 360 tttgcagcaa gtgaggtctt agccgagcag ggcaaaacaa tttccggtat agatgttatt 420 ctagccgcca ttgtggggtt tgaatctggc ccacggatcg gcaaagcaat ctacggatcg 480 gacctcttga acaacggctg gcattgtgga gctgtgtatg gcgctccagc cggtgcgctg 540 gccacaggaa agctcctcgg tctaactcca gactccatgg aagatgctct cggaattgcg 600 tgcacgcaag cctgtggttt aatgtcggcg caatacggag gcatggtaaa gcgtgtgcaa 660 cacggattcg cagcgcgtaa tggtcttctt gggggactgt tggcccatgg tgggtacgag 720 gcaatgaaag gtgtcctgga gagatcttac ggcggtttcc tcaagatgtt caccaagggc 780 aacggcagag agcctcccta caaagaggag gaagtggtgg ctggtctcgg ttcattctgg 840 cataccttta ctattcgcat caagctctat gcctgctgcg gacttgtcca tggtccagtc 900 gaggctatcg aaaaccttca ggggagatac cccgagctct tgaatagagc caacctcagc 960 aacattcgcc atgttcatgt acagctttca acggcctcga acagtcactg tggatggata 1020 ccagaggaga gacccatcag ttcaatcgca gggcagatga gtgtcgcata cattctcgcc 1080 gtccagctgg tcgaccagca atgtcttttg tcccagtttt ctgagtttga tgacaacctg 1140 gagaggccag aagtttggga tctggccagg aaggttactt catctcaaag cgaagagttt 1200 gatcaagacg gcaactgtct cagtgcgggt cgcgtgagga ttgagttcaa cgatggttct 1260 4 tctattacgg aaagtgtcga gaagcctctt ggtgtcaaag agcccatgcc aaacgaacgg 1320 attctccaca aataccgaac ccttgctggt agcgtgacgg acgaatcccg ggtgaaagag 1380 attgaggatc ttgtcctcgg cctggacagg ctcaccgaca ttagcccatt gctggagctg 1440 ctgaattgcc ccgtgaaatc gccactgggt atataa 1476

<210> 5 <211> 492 <212〉 PRT <213> Escherichia coli <400> 5 MTKQSADSNA KSGVTSEICH WASNLATDDI PSDVLERAKY LILDGIACAW VGARVPWSEK 60 YVQATMSFEP PGACRVIGYG QKLGPVAAAM TNSAFIQATE LDDYHSEAPL HSASIVLPAV 120 FAASEVLAEQ GKTISGIDVI LAAIVGFESG PRIGKAIYGS DLLNNGWHCG AVYGAPAGAL 180 ATGKLLGLTP DSMEDALGIA CTQACGLMSA QYGGMVKRVQ HGFAARNGLL GGLLAHGGYE 240 AMKGVLERSY GGFLKMFTKG NGREPPYKEE EWAGLGSFW HTFTIRIKLY ACCGLVHGPV 300 EAIENLQGRY PELLNRANLS NIRHVHVQLS TASNSHCGWI PEERPISSIA GQMSVAYILA 360 VQLVDQQCLL SQFSEFDDNL ERPEVWDLAR KVTSSQSEEF DQDGNCLSAG RVRIEFNDGS 420 SITESVEKPL GVKEPMPNER ILHKYRTLAG SVTDESRVKE IEDLVLGLDR LTDISPLLEL 480 LNCPVKSPLG IK 492

<210> 6 <211> 1479 <212> DNA <213> Escherichia coli 1374937 <400> 6

atgaccaaac aatctgcgga cagcaacgca aagtcaggag ttacgtccga aatatgtcat 60 tgggcatcca acctggccac tgacgacatc ccttcggacg tattagaaag agcaaaatac 120 cttattctcg acggtattgc atgtgcctgg gttggtgcaa gagtgccttg gtcagagaag 180 tatgttcagg caacgatgag ctttgagccg ccgggggcct gcagggtgat tggatatgga 240 cagaaactgg ggcctgttgc agcagccatg accaattccg ctttcataca ggctacggag 300 cttgacgact accacagcga agccccccta cactctgcaa gcattgtcct tcctgcggtc 360 tttgcagcaa gtgaggtctt agccgagcag ggcaaaacaa tttccggtat agatgttatt 420 ctagccgcca ttgtggggtt tgaatctggc ccacggatcg gcaaagcaat ctacggatcg 480 gacctcttga acaacggctg gcattgtgga gctgtgtatg gcgctccagc cggtgcgctg 540 gccacaggaa agctcctcgg tctaactcca gactccatgg aagatgctct cggaattgcg 600 tgcacgcaag cctgtggttt aatgtcggcg caatacggag gcatggtaaa gcgtgtgcaa 660 cacggattcg cagcgcgtaa tggtcttctt gggggactgt tggcccatgg tgggtacgag 720 gcaatgaaag gtgtcctgga gagatcttac ggcggtttcc tcaagatgtt caccaagggc 780 aacggcagag agcctcccta caaagaggag gaagtggtgg ctggtctcgg ttcattctgg 840 cataccttta ctattcgcat caagctctat gcctgctgcg gacttgtcca tggtccagtc 900 gaggctatcg aaaaccttca ggggagatac cccgagctct tgaatagagc caacctcagc 960 aacattcgcc atgttcatgt acagctttca acggcctcga acagtcactg tggatggata 1020 ccagaggaga gacccatcag ttcaatcgca gggcagatga gtgtcgcata cattctcgcc 1080 gtccagctgg tcgaccagca atgtcttttg tcccagtttt ctgagtttga tgacaacctg 1140 gagaggccag aagtttggga tctggccagg aaggttactt catctcaaag cgaagagttt 1200 gatcaagacg gcaactgtct cagtgcgggt cgcgtgagga ttgagttcaa cgatggttct 1260 tctattacgg aaagtgtcga gaagcctctt ggtgtcaaag agcccatgcc aaacgaacgg 1320 attctccaca aataccgaac ccttgctggt agcgtgacgg acgaatcccg ggtgaaagag 1380 6 attgaggatc ttgtcctcgg cctggacagg ctcaccgaca ttagcccatt gctggagctg 1440 ctgaattgcc ccgtgaaatc gccactgggt ataaaataa 1479

<210> 7 <211> 491 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 7 MTKQSADSNA KSGVTSEICH WASNIATDDI PSDVLERAKY LILDGIACAW VGARVPWSEK 60 YVQATMSFEP PGACRVIGYG QKLGPVAAAM TNSAFIQATE LDDYHSEAPL HSASIVLPAV 120 FAASEVLAEQ GKTISGIDVI LAAIVGFESG PRIGKAIYGS DLLNNGWHCG AVYGAPAGAL 180 ATGKLLGLTP DSMEDALGIA CTQACGLMSA QYGGMVKRVQ HGFAARNGLL GGLLAHGGYE 240 AMKGVLERSY GGFLKMFTKG NGREPPYKEE EWAGLGSFW HTFTIRIKLY ACCGLVHGPV 300 EAIENLQGRY PELLNRANLS NIRHVHVQLS TASNSHCGWI PEERPISSIA GQMSVAYILA 360 VQLVDQQCLL SQFSEFDDNL ERPEVWDLAR KVTSSQSEEF DQDGNCLSAG RVRIEFNDGS 420 SITESVEKPL GVKEPMPNER ILHKYRTLAG SVTDESRVKE IEDLVLGLDR LTDISPLLEL 480 LNCPVKSPFG I 491

<210> 8 <211> 1476 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 atgaccaaac aatctgcgga cagcaacgca aagtcaggag ttacgtccga aatatgtcat 60 1374937

tgggcatcca acctggccac tgacgacatc ccttcggacg tattagaaag agcaaaatac 120 cttattctcg acggtattgc atgtgcctgg gttggtgcaa gagtgccttg gtcagagaag 180 tatgttcagg caacgatgag ctttgagccg ccgggggcct gcagggtgat tggatatgga 240 cagaaactgg ggcctgttgc agcagccatg accaattccg ctttcataca ggctacggag 300 cttgacgact accacagcga agccccccta cactctgcaa gcattgtcct tcctgcggtc 360 tttgcagcaa gtgaggtctt agccgagcag ggcaaaacaa tttccggtat agatgttatt 420 ctagccgcca ttgtggggtt tgaatctggc ccacggatcg gcaaagcaat ctacggatcg 480 gacctcttga acaacggctg gcattgtgga gctgtgtatg gcgctccagc cggtgcgctg 540 gccacaggaa agctcctcgg tctaactcca gactccatgg aagatgctct cggaattgcg 600 tgcacgcaag cctgtggttt aatgtcggcg caatacggag gcatggtaaa gcgtgtgcaa 660 cacggattcg cagcgcgtaa tggtcttctt gggggactgt tggcccatgg tgggtacgag 720 gcaatgaaag gtgtcctgga gagatcttac ggcggtttcc tcaagatgtt caccaagggc 780 aacggcagag agcctcccta caaagaggag gaagtggtgg ctggtctcgg ttcattctgg 840 cataccttta ctattcgcat caagctctat gcctgctgcg gacttgtcca tggtccagtc 900 gaggctatcg aaaaccttca ggggagatac cccgagctct tgaatagagc caacctcagc 960 aacattcgcc atgttcatgt acagctttca acggcctcga acagtcactg tggatggata 1020 ccagaggaga gacccatcag ttcaatcgca gggcagatga gtgtcgcata cattctcgcc 1080 gtccagctgg tcgaccagca atgtcttttg tcccagtttt ctgagtttga tgacaacctg 1140 gagaggccag aagtttggga tctggccagg aaggttactt catctcaaag cgaagagttt 1200 gatcaagacg gcaactgtct cagtgcgggt cgcgtgagga ttgagttcaa cgatggttct 1260 tctattacgg aaagtgtcga gaagcctctt ggtgtcaaag agcccatgcc aaacgaacgg 1320 attctccaca aataccgaac ccttgctggt agcgtgacgg acgaatcccg ggtgaaagag 1380 attgaggatc ttgtcctcgg cctggacagg ctcaccgaca ttagcccatt gctggagctg 1440 ctgaattgcc ccgtgaaatc gccatttggt atataa 1476 8 <210> 9

<211> 492 <212〉 PRT <213> Escherichia coli <400> 9

MTKQSADSNA KSGVTSEICH WASNLATDDI PSDVLERAKY LILDGIACAW VGARVPWSEK YVQATMSFEP PGACRVIGYG QKLGPVAAAM TNSAFIQATE LDDYHSEAPL HSASIVLPAV FAASEVLAEQ GKTISGIDVI LAAIVGFESG PRIGKAIYGS DLLNNGWHCG AVYGAPAGAL ATGKLLGLTP DSMEDALGIA CTQACGLMSA QYGGMVKRVQ HGFAARNGLL GGLLAHGGYE AMKGVLERSY GGFLKMFTKG NGREPPYKEE EWAGLGSFW HTFTIRIKLY ACCGLVHGPV EAIENLQGRY PELLNRANLS NIRHVHVQLS TASNSHCGWI PEERPISSIA GQMSVAYILA VQLVDQQCLL SQFSEFDDNL ERPEVWDLAR KVTSSQSEEF DQDGNCLSAG RVRIEFNDGS SITESVEKPL GVKEPMPNER FPRGEPGQPR FCENAGKSGS GDGGAELHSQ PRGTTTGGQT WADWRCHLQ SG

<210> 10 <211> 1479 <212> DNA <213> Escherichia coli <400〉 10 atgaccaagc agtctgctga ttccaacgcg aagtctggtg tgacctctga gatctgtcac tgggcgtcta atctcgccac tgatgatatc ccgagcgacg ttctggagcg tgcaaaatac ctgatcctgg atggtatcgc gtgcgcgtgg gtaggtgctc gtgtcccatg gtctgaaaaa tacgttcaag cgaccatgtc tttcgaacct ccgggtgcgt gtcgtgtcat cggttacggc 60 120 180 240 300 360 420 480 492 60 120 180 240 1374937

cagaaactgg gtccggtagc ggctgccatg acgaactctg catttattca ggcgaccgaa 300 ctcgatgact atcactctga agcgccgctg cattccgcgt ctatcgttct cccggcagtt 360 ttcgcggcga gcgaagtact ggccgaacag ggtaaaacca tctctggtat tgacgtgatt 420 ctggctgcga tcgttggttt cgagagcggt cctcgcatcg gcaaagcgat ctacggttct 480 gacctcctga acaacggctg gcactgcggt gcggtatatg gcgcaccggc tggtgcgctc 540 gcaactggta agctcctggg cctcacgccg gacagcatgg aagatgcact gggtattgcc 600 tgcacgcaag catgcggcct catgtccgcg cagtatggtg gcatggttaa acgtgttcag 660 cacggtttcg cagcgcgtaa tggtctcctc ggtggcctcc tggctcacgg cggctacgag 720 gcgatgaaag gtgttctcga gcgttcttac ggtggcttcc tgaagatgtt caccaagggc 780 aacggtcgtg aaccgccgta caaagaagaa gaggttgtgg ctggtctggg tagcttctgg 840 cacaccttca ccattcgtat caaactgtac gcgtgctgcg gtctcgtaca cggtcctgtt 900 gaagccattg aaaacctcca gggtcgttac ccggaactgc tcaatcgtgc taacctgtct 960 aacatccgcc acgttcacgt acaactctct accgcgagca actcccactg tggttggatc 1020 ccagaagagc gcccaatctc ttctatcgcg ggtcaaatgt ctgtcgcata tatcctcgcc 1080 gttcagctcg ttgaccaaca gtgtctgctc agccagttct ccgagtttga cgataatctg 1140 gaacgcccgg aagtgtggga cctggcacgt aaggttacca gctctcaatc tgaggagttc 1200 gaccaggacg gtaactgtct ctctgccggt cgcgtccgta ttgagttcaa cgacggctcc 1260 tccatcaccg aatccgttga gaagccgctc ggtgtaaagg aaccaatgcc aaatgaacgc 1320 ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa acgcgggaaa aagtggaagc 1380 ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg cgggcaaaca 1440 gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggctaa 1479 <210> 11 <211> 490. 10 1374937

<212> PRT <213> Escherichia coli <400> 11

MTKQSADSNA KSGVTSEICH WASNLATDDI PSDVLERAKY LILDGIACAW VGARVPWSEK 60 YVQATMSFEP PGACRVIGYG QKLGPVAAAM TNSAFIQATE LDDYHSEAPL HSASIVLPAV 120 FAASEVLAEQ GKTISGIDVI LAAIVGFESG PRIGKAIYGS DLLNNGWHCG AVYGAPAGAL 180 ATGKLLGLTP DSMEDALGIA CTQACGLMSA QYGGMVKRVQ HGFAARNGLL GGLLAHGGYE 240 AMKGVLERSY GGFLKMFTKG NGREPPYKEE EWAGLGSFW HTFTIRIKLY ACCGLVHGPV 300 EAIENLQGRY PELLNRANLS NIRHVHVQLS TASNSHCGWI PEERPISSIA GQMSVAYILA 360 VQLVDQQCLL SQFSEFDDNL ERPEVWDLAR KVTSSQSEEF DQDGNCLSAG RVRIEFNDGS 420 SITESVEKPL GVKEPMPNER ILHKYRTLAG SVTDESRVKE IEDLVLGLDR LTDISPLLEL 480 LNCPVKSPLV 490

<210> 12 <211> 1473 <212> DNA

<213> Escherichia coli <400> 12 atgaccaagc agtctgctga ttccaacgcg aagtctggtg tgacctctga gatctgtcac 60 tgggcgtcta atctcgccac tgatgatatc ccgagcgacg ttctggagcg tgcaaaatac 120 ctgatcctgg atggtatcgc gtgcgcgtgg gtaggtgctc gtgtcccatg gtctgaaaaa 180 tacgttcaag cgaccatgtc tttcgaacct ccgggtgcgt gtcgtgtcat cggttacggc 240 cagaaactgg gtccggtagc ggctgccatg acgaactctg catttattca ggcgaccgaa 300 ctcgatgact atcactctga agcgccgctg cattccgcgt ctatcgttct cccggcagtt 360 11

Claims (1)

1374937 修正日期:101.8.15

修正本 第 98M5755 號 七、申請專利範圍- 1. 一種經分離的聚胜肽，包括· 一突變之順式烏頭酸脫羧酶（CAD)胺基酸序列，其 中，相較於野生型之順式烏頭酸脫羧酶，該突變之順式烏 頭酸脫羧酶在序列識別號：1的第441-490的位置上具有二 個或複數個突變，且至少在序列識別號：i的第49〇的位 置上具有突變。 2. 如申凊專利範圍第1項所述之經分離的聚胜肽，其 中’於序列識別號：i的帛461_49〇位置具有一個或複數個 突變。 3. 如申明專利範圍第2項所述之經分離的聚胜狀，其 中’於序列識別號：1的第481.·柳位置具有一個或複數個 突變。 ^ .如申明專釗範圍第1至3項任一項所述之經分離的 聚胜狀，其中該突變為序列識別號：】第490位置的V被 一胜肽片段置換。 5’如^專利乾圍第4項所述之經分離的聚胜狀，其 _該胜肽片段為GI。 ^如申請專利範圍第5項所述之經分離的聚胜狀，其 中4胜肽包括序列識別號：3之胺基酸序列。 二=圍第4項所述之經分離的聚胜肽，其 中項所述之經分離的聚胜肽，其 已括序列識別唬·· 5之胺基酸序列。 9·如申請專利範圍第4項所述之經分離的聚胜肽，其 第 98145755 號 ·· 修正本 修正日期:1〇1815 1，在序列識別號：^89位置上具有突變。 中，利範圍第5項所述之經分離的聚胜肽，其 識別號.1第489位置上具有突變。 1中^利隨第1G項所述之經⑽的聚胜肽， /"為序列識別號：1第·位置的L被取代為卜 …圍第U項所述之經分離的聚胜肽， ^胜肽包妨_職：7之絲酸序列。 1二如申請專利範㈣丨項所述之經分離的聚胜狀，立 中胺基酸序列為序列識別號.：9。 ’、 14.—種經分離的核酸，包括編碼如申言奮專利範圍第} 項之聚胜肽的核苷酸序列。 15·如申„月專利耗圍第14項所述之經分離的核酸，其 中該核倾序顺碼擇自於序列朗號：3、5、7及9 ^ 胺基酸序列。 16.如申請專利範圍第14項所述之經分離的核酸，其 中該核n纟現載體，該肖普酸序列操作連接至—啟動 子序列。 17·—種生產衣康酸的方法，包括： 提供包括一基因表現組合（expression cassette)的寄 主細胞，該基因表現組合中包含一編碼如申請專利範圍第 1項之5、胜敗的核苷酸序列操作連接至一啟動子； 培養該寄主細胞於培養基中，以表現該聚胜肽，因此 使該寄主細胞產生衣康酸。 18.如申請專利範圍第17項所述之生產衣康酸的方 法，其中該聚胜肽具有擇自於序列識別號：3、5、7及9 1374937 修正本 第 98145755 號 之胺基酸序列。 19.如申％專利範園第π 法’更包括在該培養步驟之後 康酸，因此生產衣康酸。 項所述之生產衣康酸的方 由該培養基中分離出該衣 1374937 四、指定代表圖 (一) 本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 無0 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 無0