TWI335432B - Oligo-nucleotide probes of aphids identification, biochip, and identifying method thereof - Google Patents

Description

1335432 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於一種鑑定蚜蟲類昆蟲的方法，且特別 是有關於一種鑑定蚜蟲類昆蟲的寡核酸探針、生物晶片及 其鑑定方法。 【先前技術】 蚜蟲為常見的昆蟲，通常成群棲息在植物的莖、葉、 炎部上，以刺吸式口器吸食植物體的汁液，被視為農業害 蟲。 蚜蟲一般群集於菜心部、花及種莢或葉背吸取營養 液，並分泌蜜露誘發煤煙病，造成植株外觀不良，影塑花 卉品質，危害嚴重的葉片常捲縮或萎凋。此外，除直接危 害外，蚜蟲更可傳佈植物性病毒。 目前蚜蟲類昆蟲的的鑑定一般以形態特徵鑑定為 主。然而，蚜蟲體長約(Μ〜〇_5公分，由於蟲體微小再加 上蚜蟲具有多態型，個體間外部形態變異程度大，因此造 成呀蟲種類較時的困難，需要由线驗的賴人員依賴 經驗及專Η能力加以判定’且傳統形態鑑定常因鑑定者主 觀的認知造成鐘定結果的不同，而難以客觀地判定。 【發明内容】 因此本發明就是在提供—種鏗定財蟲類昆蟲之寡核 普酸探針(P_e)及其使用方法，解決傳統_蟲態鐘定正 5 1335432 確性受人為判斷影響的問題。 本發明的另一目的是在提供一種鑑定蚜蟲類昆蟲之 生物晶片及其使用方法，用以快速鑑定不同屬之蚜蟲類昆 蟲。 根據本發明，提出一種鑑定蚜蟲類昆蟲之寡核苷酸探 針及其使用方法，鑑定蚜蟲類昆蟲之寡核苷酸探針包含 SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO : 6、SEQ ID NO : 7、 SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO : 12所示之核苷酸序列、其互補股之 核苷酸序列、簡併序列及其衍生序列。 應用上述寡核苷酸探針鑑定蚜蟲類昆蟲之方法包 含：以待測蟲體之粒線體細胞色素氧化酶I基因 (cytochrome I，COI)與上述寡核苷酸探針進行雜合反應，並 由雜合反應之結果鑑定財蟲類昆蟲之屬（genus)。 根據本發明，提出一種快速鑑定蚜蟲類昆蟲之生物晶 片及其使用方法，鑑定蚜蟲類昆蟲之生物晶片包含一基 材，基材上可固著選自於SEQ ID NO : 1 ' SEQ ID NO : 2、 SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 5 ' SEQ ID NO : 6、SEQ ID NO : 7、SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO : 9、 SEQ ID NO ·· 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO : 12 所示 之核苷酸序列、其互補股之核苷酸序列、簡併序列、其衍 生序列及上述序列之任意組合所組成之族群。 應用上述生物晶片鑑定蚜蟲類昆蟲之方法包含：以待 6 1335432 測蟲體之粒線體細胞色素氧化酶I基因（COI)與上述生物 晶片上的寡核苷酸探針進行雜合反應（hybridization)，並由 雜合反應之結果鑑定财蟲類昆蟲之屬（genus)。 【實施方式】 本發明係利用棉財gossypii) '馬鈐薯財 (Jw/acori/iMm so/iz/n·)、偽菜财小桔财 (Toxoptera aurantii)、s^i 3. ^ (Acythosiphon pisum)J^^i^ (M少zws perhcae)等不同屬的财蟲類昆蟲之細胞色素I基 因（COI)序列設計寡核苷酸探針，並進行探針之專一性測 試，除豌豆蚜及桃蚜外，均得到具有屬間特異性之寡核苷 酸探針，其序列分別編號為SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO : 6、SEQ ID NO : 7、SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO : 12。 所有使用之蟲體樣本均事先經鑑定確認種類。 其中編號 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:3 及SEQ ID NO:4之寡核苷酸探針係利用棉蚜之細胞色素I 基因（COI)序列設計，可用以鑑定棉蚜。棉蚜之細胞色素I 基因序列參見序列識別號碼SEQ ID NO: 13。 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6之寡核苷酸探針係利用 馬鈴薯蚜之細胞色素I基因（COI)序列設計，可用以鑑定 馬鈴薯蚜。馬鈴薯蚜之細胞色素I基因序列參見序列識別 號碼 SEQ ID NO: 14。 7 1335432 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8係利用偽菜蚜之細胞色 素I基因（COI)序列設計，可用以鑑定偽菜蚜，偽菜蚜之 細胞色素I基因序列參見序列識別號碼SEQIDN〇: 15。 SEQIDNO:9、SEQIDNO: 1〇、SEQIDNO:11 及 SEq ID NO: 12係利用小桔蚜之細胞色素j基因（c〇I)序列設 計，可用以鑑定小桔蚜，小桔蚜之細胞色素j基因序列參 見序列識別號碼SEQ ID NO: 16。 將上述之具有屬間特異性之寡核苷酸探針製成生物 晶片，可快速鑑定蚜蟲類昆蟲。用以鑑定蚜蟲之生物晶片 包含基材及固著於基材上之寡核苷酸探針， 質可包含尼龍膜、高分子材料、々片或玻璃。 生物晶片之製作方法包含將一空白晶片在45。〇下烘烤 約5分鐘，分別將40微莫耳濃度之_)合成的寡核普酸探 針加入探針溶液混合，再用點片機點在設定的位置，置於 45C烘烤1-2分鐘’最後再以紫外線交聯器⑴ 於〇·8焦_ ’ 6分鐘的條件下將寡核#酸探針固定在晶片上。 >清參照第1圖，為本發明之生物晶片的寡核普酸探針 細=不:圖。每—點上所標示之數字代表序列識別編號之 數字英文字母，C’，則代表控制組，用以確認雜合反應無 誤。其中’數字1〜4代表序列為SEQ ID NO : 1〜4之募核 苦酸探針，可與含有棉財之⑽基因序列的去氧核糖核酸 (财)樣產生專_性雜合，而在晶片相對應之位置呈 標丁數子5〜6之點代表序列為SEq ID Ν〇 : 5〜6之 核苷酸探針，可盥合古 J ” 3有馬鈴薯蚜之C()I基因序列的dNa樣 1335432 品產生專一性雜合。標示數字為7〜8之點代表序列為SEQ ID NO: 7〜8之寡核苷酸探針，可與含有偽菜蚜之COI基因 序列的DNA樣品產生專一性雜合。標示數字為9〜12之點 代表序列為SEQ ID NO: 9〜12之寡核苷酸探針，可與含有 小桔蚜之COI基因序列的DNA樣品產生專一性雜合。 請參照第2圖，為利用本發明之生物晶片鑑定蚜蟲類 昆蟲的方法流程圖，包含（a)萃取蟲體之基因體去氧核醣核 酸（DNA) ; (b)增幅待測蟲體之粒線體細胞色素氧化酶I基 因（COI)片段序列；（c)使用本發明之生物晶片與增幅之粒 線體細胞色素氧化酶I基因（COI)片段進行雜合反應；以及 (d)鑑定步驟（c)之雜合反應結果，並由雜合反應之結果鑑定 蚜蟲類昆蟲。 依照本發明之實施例，萃取蟲體之基因體DNA是使用 Wizard® Genomic DNA Purification Kit(Promega Corporation，Madison，USA)的方法，其步驟如下：將蟲體 置入内含缓衝液（0.5M EDTA， Nuclei Lysis Solution，20 mg/ml Proteinase K)之離心管中研磨均勻，將研磨液置於 恆溫培養箱中，於55°C加熱反應隔夜，加入適量之核醣核 酸酶（RNase)溶液，反轉離心管數次，並於37°C培養15〜30 分鐘。之後置於室溫5分鐘，再加入蛋白沈澱液（Protein Precipitation Solution)高速震盪20秒，置於冰上5分鐘。之 後以13,000xg之轉速離心4分鐘，取上清液至新的離心管内 並混入600微升（ul)異丙醇（Isopropanol)。輕輕翻轉直至白 色懸浮物產生。再離心去除上清液。加入70%之乙醇，輕 9 1335432 反轉離心管數次，離心去除上清液再進行烘乾。烘乾後的 DNA以無菌水於65°C下回溶，此即為供試蟲體之模板DNA 來源。 利用萃取之蟲體模板DNA，並以COI基因之專一性引 子對進行聚合酶連鎖反應（PCR)增幅COI基因片段。其中， 使用的引子對之序列請參照SEQ ID N0:17 (正向序列）與 SEQ ID NO: 18 (反向序列）。 聚合酶連鎖反應係以迴溫反應器（Perkin-Elmer; GeneAmp® PCR System 2700)進行增幅。取得生物體COI 序列之反應：以微量離心管盛裝欲增幅的反應物，每一反 應之總體積為25 μΐ，内含50 ng模板DNA、250 μΜ dNTPs、lXPCR 緩衝液、0·2μΜ 引子，以及0.5UTaqPluse 而t熱聚合酶（Bio Basic Inc., Canada)。COI之聚合酶連鎖 反應條件為94°C升溫2分鐘，之後以94°C 40秒、44°C 75 秒、72°C 40秒，進行30個循環，接著以72°C 10分鐘完成 反應，反應後之產物可進行產物片段之分離回收與純化。 將聚合酶連鎖反應增幅產物以洋菜瓊脂電泳分離，並 以溴化乙錠染色後，在紫外燈下將預定大小的DNA片段 自電泳膠片上切下，秤重後可以商用配方例如Micro-Elute DNA Clean/Extraction Kit ( Hopegen Biotechnology Development Enterprise, Taichung，Taiwan)進行回收，即 為COI基因片段。 取此COI基因片段利用商用配方例如pGEM®-T Easy Vector Systems(Promega Corporation，Madison，. USA)與 10 1335432

Fast-Trans™ Comptent E. coliXL-1 -Blue cells(Prothec Technology Enterprise Co.，Ltd, Taiwan)的系統進行基因選 殖_ (Cloning)，得到單一 COI基因序列的質體（plasmid)。 依照本發明之一實施例，利用含COI基因序列的質體 與具有生物素（Biotin)標定的引子進行聚合酶連鎖反應，其 每一個反應液總體積為25 jtil，内含2 ng模板DNA、250 μΜ dNTPs、lXPCR 緩衝液、〇.2μΜ 引子，以及 0.5UTaqPluse 耐熱聚合酶（Bio Basic Inc.，Canada)。反應條件為94°C升 溫2分鐘，之後以94°C 40秒、44°C 75秒、72°C 40秒， 進行20個循環，接著以72°C 10分鐘完成反應，而得到具 有生物素標定的COI基因片段，即為雜合反應之標的 (target) » 將生物素標定的target DNA片段與本發明之生物晶片 上之寡核苷酸探針進行雜合。依照本發明之實施例，進行 雜合反應之方法包含在晶片每一反應槽先加入雜合反應 液，再加入適量生物素標定的target DNA片段與之混合， 置於60°C環境下1小時，以進行雜合反應。之後洗去未雜合 的DNA片段，再加入顯色劑（4 μΐ NBT/BCIP + 196 μΐ Detection buffer)置於暗室中反應1〇分鐘，反應後以清水清 洗’並在45°C下烘乾，以出現色斑的有無判定蚜蟲種類。 請參照第3圖，為利用棉蚜之COI基因片段測試本 發明之生物晶片之探針的專一性結果。對照第1圖之寡核 苷酸探針施佈示意圖，以棉蚜之COI基因片段與本發明 之生物晶片上之寡核苷酸探針雜合的結果顯示，試驗組只 11 1335432 有第1〜4號的點有呈色，且控制組亦有呈色故可確認雜 合反應無誤。其中，1〜4點代表序列為SEQ m N〇 : i〜4 之寡核苷酸探針，因此SEQIDN〇:丨〜4之寡核苷酸探針 可與含有棉蚜之C0I基因序列的DNA樣品產生專—性雜 合，可用以準確鑑定棉蚜。 請參照第4圖，為利用馬鈐薯財之c〇I基因片段測 試本發明之生物晶片之探針的專—性結果。對照第！圖之 募核普酸探針施佈示意圖，以馬铃薯社c⑴基因片段 與本發明之生物晶片上之寡核苷酸探針雜合的結果顯 示’試驗組f 5、6號的點有呈色，且控制組亦有呈色故 可確認雜合反應無誤。其中，第5、6點代表序列&卿⑴ NO · 5、6之寡核苷酸探針，因此SEQ ID N〇 : 6之寡 核普酸探針可與含有騎_之⑽基因糊的舰樣 品產生專—性雜合，可Μ準確較馬鈴料。此外以婉 丑财之CQI基因序列設計之寡核㈣探針由於不具有專一 性’因此亦與馬鈴薯财之c〇I基因片段雜合，出現於第4 請參‘«5圖，為利用偽㈣之⑽基因片段測試 發月之生物BB片之探針的專_性結果。對照第1圖之 針^示意圖’以偽菜財之⑽基因片段與本 明之生物日日日月上之寡核㈣探針雜合的結果顯示，試驗 第Η號的點有呈色，且控制組亦有呈色故可確 Γ雜合反應無誤。其卜第7、8點代表序料SEQIDN0: 、8之綱酸探針，因此SEQidn〇:7 8之寡㈣ 12 1335432 酸探針可與含有偽菜蚜之C0I基因序列的DNA樣品產生 專一性雜合’可用以準確鑑定偽菜蚜。 明參照第6圖，為利用小桔蚜之c〇I基因片段測試 本發明之生物晶片之探針的專一性結果。對照第丨圖之寡 核苷酸探針施佈示意圖，以小桔蚜之c〇I基因片段與本 發明之生物晶片上之寡核苷酸探針雜合的結果顯示，試驗 組第9〜12號的點有呈色，且控制組亦有呈色故可確認雜 合反應無誤。其中，第9〜12點代表序列為SEQ ID N〇 : 9〜12之寡核苷酸探針，因此SEQIDN〇 : 7、8之寡核苷 酸探針可與含有小结財之COI基因序列的DNA樣品產生 專一性雜合，可用以準痛鑑定小桔蚜。此外，專一性差的 豌旦蚜募核苷酸探針亦與小桔蚜之c〇I基因片段雜合，於 第6圖中產生一微弱訊號。 依照本發明之實施例，本發明之生物晶片可包含上述 SEQ m NO:卜12所示之核苦酸序列、其互補股之核芽 酸序列、簡併序列及其衍生序列。此處所指之衍生序列係 於序列SEQ ID NO]〜12之3，端3戈5·端修娜核芽酸序列， 使其仍和原序列具有70%以上相似性之寡核苷酸序列。 雖然本發明已以數實施例揭露如上，然其並非用以限 定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和 範圍内’當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範 圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 ° 【圖式簡單說明】 13 1335432 為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例 能更明顯易懂’所附圖式之詳細說明如下： 第1圖為本發明之生物晶片的寡核苷酸探針施佈示意 圖。 第2圖係繪示依照本發明實施例的一種以生物晶片鑑 定蚜蟲類昆蟲的方法流程圖。 第3圖為利用棉蚜之c〇I基因片段測試本發明之生 物晶片之探針的專一性結果。 第4圖為利用馬鈴薯財之⑽基因片段測試本發明 之生物晶片之探針的專—性結果。 第5圖為㈣偽菜敎CQI基因片段測試本發明之 生物晶片之探針的專一性結果。 第6圖為利用小柏·姑^m 括財之COI基因片段測試本發明之 生物晶片之探針的專—性結果。 【主要元件符號說明】 無

Claims (1)

1335432 十、申請專利範圍： 99年11月19日修正替才 奏頁 才年;、月'"'日{聲替額 1_ 一種鑑別棉坊、馬鈐薯財 (Aulacorthum solani)、偽菜场（Lipaphis erysimi)、4、结蜗 (Toxoptera aurantii)之方法，包含： (a) 萃取待測蟲體之去氧核醣核酸（DNA); (b) 以 SEQ ID NO : 17 及 SEQ ID NO : 18 增幅待測蟲 體之粒線體細胞色素氧化酶I基因（COI)片段序列，增幅出 之序列為 SEQ ID NO : 13-16 ; (c) 使用寡核苷酸探針與步驟（b)之產物進行雜合反 應，其中該寡核苷酸探針為SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO : 6、SEQ ID NO : 7、SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO : 12 所 示之核苷酸序列；以及 (d) 鑑定步驟（c)之雜合反應結果。 2. 如申請專利範圍第1項所述鑑別棉蚜 gossypii)、馬铃 I 场（Aulacorthum solanf)、偽 I 辑（Lipaphis er少·5ζ_α?ϊζ_)、小桔讶（7b;co/>iera awrawiii)之方法，其中該步驟 (b)為使用聚合酶連鎖反應進行增幅。 3. 如申請專利範圍第1項所述鑑別棉蚜 、馬鈐薯財（dw/acori/iMm ·?ο/ίζπζ·)、偽菜财 eryhwz·)、小桔財（7bxo/>iera 之方法，更包含使用 1 1335432 _ - 99年11月19日修正替換頁 J 標記分子標記該步驟（b)之產物。 4. 如申請專利範圍第3項所述鑑別棉財（^4/7/π··? gossypii)、馬龄集场（Aulacorthum solani)、偽菜场（Lipaphis er少57·»π·)、小桔財（7bxc77iera awra/ζίζ·，·）、之方法，其中該標 記分子標記為生物素（Biotin)。 5. —種用於鑑別棉財gowyp/O、馬鈐薯財 (Aulacorthum solani) ' 偽菜场（Lipaphis 、小桔財 (Toxoptera aurantii)之 t 物晶片，包含 一基材； 複數寡核苷酸探針，固著於該基材上，該些寡核苷酸 探針為 SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO : 3、 SEQ ID NO : 4、SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO : 6、SEQ ID NO : 7、SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10、 SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO : 12所示之核苷酸序列。 6. 如申請專利範圍第5項所述用於鑑別棉蚜 gossypii)、馬铃 Μ·辑[Aulacorthum solani)、偽菜场（Lipaphis 、小桔財aMrfl/ziz'i)之生物晶片，其中該 基材之材質包含尼龍膜、高分子材料、矽片或玻璃。 _ 7.—種利用申請專利範圍第5項所述之生物晶片鑑別 棉財馬龄薯財（/iw/acoriAMm 偽 2 99年11月19日修正替換頁 策辑（Lipaphis erysimi)、小桂财（Toxoptera aurantif)之方 法，包含： (a) 萃取待測蟲體之去氧核醣核酸（DNA); (b) 以 SEQ ID NO : 17 及 SEQ ID NO : 18 增幅待測蟲 體之粒線體細胞色素氧化酶I基因（COI)片段序列，增幅出 之序列為 SEQ ID NO : 13-16 ; (c) 使用申請專利範圍第5項所述之生物晶片進行雜合 反應；以及 (d) 鑑定步驟（c)之雜合反應結果。 8. 如申請專利範圍第7項所述利用申請專利範圍第5 項所述之生物晶片鑑別棉財、馬鈴薯财 (Aulacorthum solani)、偽菜场（Lipaphis erjhmz·)、巧、桔财 (Tbxopiera 之方法，其中該步驟（b)為使用聚合酶 連鎖反應進行增幅。 9. 如申請專利範圍第7項所述利用申請專利範圍第5 項所述之生物晶片鑑別棉財⑴、馬鈴薯財 (Aulacorthum solani)、偽 I 场（Lipaphis erjyhmz·)、小桔財 (Γ〇Λ：ο/7βΓ(2 之方法，更包含使用標記分子標記該步 驟（b)之產物。 10. 如申請專利範圍第9項所述利用申請專利範圍第5 項所述之生物晶片鑑別棉财、馬鈴薯財 rI335432 99年11月19日修正替換頁 (y4M/acoriAwm so/awz·)、偽菜財（Upap/n's er^yhmz·)、小桔財 (7bxo/7iera <3wra«h〇之方法，其中該標記分子為生物素 (Biotin) 〇 11. 一種鑑別棉財«ρ/π··?、馬鈴薯財 (v4M/iic〇A*i/iMW «ϊο/β/π·)、偽菜財（Ζ/Ζ·/?ίζ/?/π··5 er少以·/^)、小桔財 (7bxo/>ieraiZwriZ«"i·)之套組，包含： 五種寡核苷酸探針，該五種寡核苷酸探針包含SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO : 4 之至少其中之一、SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO : 6之至少 其中之一、SEQ ID NO : 7、SEQ ID NO : 8之至少其中之 一、SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、 SEQ ID NO: 12之至少其中之一所示之核苷酸序列；以及 一 COI基因專一性引子對，具有SEQ ID NO : 17及 SEQ ID NO : 18所示之序列。 4