1330086 A7 _____B7 五、發明説明（1 ) 本技藝之領域 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明關於一種用來抑制細菌經由腸道屏障入侵的細 菌移位抑制劑，及用來抑制細菌移位之方法。 背景技藝 大部分與動物（包括人類）接觸的微生物爲那些存在 於動物腸道中者。例如，在人類方面，小腸較下方的部分 中每1克腸道內容物中有至多1 〇5 - 1 〇7個這類衍生物 ，而在大腸中至多有1 〇g— 1 011個。微生物種類亦說 有約1 0 0種。這些微生物包括那些可入侵其它有機物， 然後增殖、起動稱爲隨機感染或嚴重疾病（如：多重器官 衰竭和敗血症）的有害細菌。 一種用來抑制這些疾病的方法爲抑制這些有害細菌通 過腸黏膜滲入和侵入腹腔及器官。 可抑制這類入侵的機制稱爲腸道屏障。此腸道屏障包 括：腸免疫系統和解剖學上的構造。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 腸免疫系統係一種特異於腸道鄰近的免疫系統，此系 統牽涉到與腸相關之淋巴組織、分泌型I g A和吞噬細胞 。腸道屏障之解剖構造爲生理上可抑制細菌滲入腸黏膜的 構造，如：黏膜層和上皮細胞。 具體的說，這類構造之實例爲碳水化合物複合物，包 含：存在細胞表面，形成部分細胞膜之蛋白質、糖脂質和 聚葡萄糖胺。這些複合物稱爲甘卡因。甘卡因之形成可預 防細菌的接觸和侵襲，並改良黏膜細胞的腸道屏障功能， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4- 1330086 A7 B7 五、發明説明（2 ) 因此，可降低上皮細胞之壞死和脫屑的頻率並減低宿主有 機體的負擔。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經由腸道屏障入侵宿主有機體的細菌侵入稱爲細菌移 位（BTL) 。BTL有二種可能的BTL途徑：淋巴系 統和血管。根據許多動物試驗和臨床硏究，淋巴系統被認 爲係主要途徑。硏究顯示出··在由細菌進行生長所引起並 帶有小量黏膜損傷之B T L的情況中，細菌係從淋巴途徑 進入，然而，在具嚴重侵入之BTL案例（如：出血性休 克）中，細菌亦可直接進入血流中。其中細菌之侵入係侷 限在腸繫膜淋巴結（以下簡寫爲M L N )的淋巴性B T L 中，其本身並不會造成嚴重的狀況。然而，當在MLN中 的細菌量超過可治療的量時，該細菌還會侵入血管系統和 器官中，而這會造成嚴重的疾病。因此，抑制_btl進入 ML N可預防由B T L所引起的疾病。 在動物之肉類部分所發生的B T L不僅會導致可食部 分的污染，而可能引起食物中毒，也會抑制理想的動物生 長而使生產量減少。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在先前技藝中，用來治療具BTL之人類或動物的方 法包括投遞抗生物、疫苗和干擾素。然而，投遞抗生素可 能會引起產生具抗生素抗性之菌種和副作用的問題。由於 疫苗之效果係以對抗各傳染病媒介的特殊作用爲基礎，因 此，藉由疫苗抑制BTL時，必須投遞用於所有傳染病媒 介的疫苗。由於干擾素很昂貴，因此，基於費用的考量， 干擾素之使用係侷限於人類而不適用在肉類。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — -5- 1330086 A7 B7___ 五、發明説明（3 ) 本發明之揭示內容 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的目的係提供一種可以簡單、有效地抑制 BTL的藥品，和簡單、有效之抑制BTL的方法。 本發明係提供一種含有枯草桿菌細胞做爲活性成分的 B T L抑制劑。 本發明亦提供其中該枯草桿菌爲枯草桿菌 C ~ 3 1 0 2 (儲存於生物科學和人類-技術之國家協會 中，儲存號碼爲FERM BP — 1096)的BTL抑 制劑。 本發明還提供一種BTL抑制劑，其中該枯草桿菌 C — 3 102具有一種染色體DNA，當萃取、純化該染 色體D NA並利用序列1和2之引物來進行P C R處理時 ，其可產生一約爲700bps的DNA片段。 本發明還提供一種用來抑制BTL的方法，其包含口 服投遞B T L抑制劑的步驟。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖形的簡單說明 第1圖示爲實施例3，健康對照組之迴腸切片的顯微 鏡照片。 第2圖係說明在第1圖中所觀察到之黏膜上皮闽胞的 壞死、脫離、脫屑及嗜中性白血球和淋巴球浸潤入固有層 〇 第3圖示爲實施例3中健康攝取組之迴腸切片的顯微 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6- 1330086 A7 B7 五、發明説明（4 ) 鏡照片。 第4圖係說明在第3圖中所觀察到之黏膜上皮細胞的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 壞死、脫離、脫屑及嗜中性白血球和淋巴球浸潤入固有層 〇 第5圖示爲實施例3中健康對照組之迴腸切片的顯微 鏡照片。 第6圖係說明在第5圖中所觀察到之黏膜上皮細胞的 壞死、脫離、脫屑及嗜中性白血球和淋巴球浸潤入固有層 〇 第7圖示爲實施例3中健康攝取組之迴腸切片的顯微 鏡照片。 第8圖係說明在第7圖中所觀察到之黏膜上皮細胞的 壞死、脫離、脫屑及嗜中性白血球和淋巴球浸潤入固有層 0 第9圖示係實驗1中，藉PCR增數所取得之產物的 電泳結果照片。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之具體例 本發明之B T L抑制劑含有活枯草桿菌細胞做爲其活 性成分。本文所使用之”活枯草桿菌細胞”意指枯草桿菌 之活孢子及/或營養細胞》 枯草桿菌之細菌學特徵係說明於，如：伯基氏細菌學 說明書，11冊（1986)。在活菌方面，可使用具下 列特徵者： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1330086 A7 ___B7 五、發明説明（5 ) (1 )革蘭氏陽性 (2 )形成卵圓形孢子 (3 )桿狀菌 (4)移動性：陽性 (5 )需氧的 (6) 觸酶：陽性 (7) 在50°C下生長：+ (8) 在PH57下生長：+ (9 )利用檸檬酸鹽：+ (1 0)從下列群體產生酸：阿拉伯糖、葡萄糖、木 糖和甘露糖：+ (1 1 ) V P 試驗：+ (12)水解澱粉：+ (1 3 )還原硝酸鹽：+ (1 4 )形成吲哚：一 (1 5 )水解明膠：+ (1 6 )水解酪蛋白：+ (1 7 )在液態介質中形成膜：+ (1 8 )凝集牛奶：— (19)腺化牛奶：一 枯草桿菌之B T L抑制效果係根據菌種型式而有程度 上的不同。能提供本B T L抑制劑之活性成分的較佳枯草 胃菌包栝：枯草桿菌C—3102，枯草桿菌係儲存於國 家工業科學和技術協會之生物科學和人類-技術組織，儲 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. *1Τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -8- 1330086 A7 B7_ 五、發明説明（6 ) 存號碼爲FERM BP—1096，儲存日期爲 1 985， 12月25日。國家生物科學和人類-技術組 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 織已改名爲國家高級工業科學和技術組織之專利有機體保 管處。現在，枯草桿菌C-3102可從國際專利有機體 保管處公開取得。 枯草桿菌C 一 3 1 0 2的特徵爲當利用下列序列1和 2之P C R引物來進行其染色體D NA之P C R反應時， 可擴大約含7 0 0個鹼基對之片段。用於序列1和2之引 物最初係以該編碼解澱粉桿菌之D NA的增數引物型式來 產生的。以其它枯草桿菌種進行時，則不會發生經由此 PCR引物進行之增數作用。在枯草桿菌C — 3 1 02中 生長之約含7 0 0個鹼基對的片段，其特徵爲與澱粉酶序 列不同源，且可淸楚地從其它枯草桿菌種中分辨出來。 經濟部智慧財度局員工消費合作社印製 序歹!J 1 : S'-GCCCCGCACATACGAAAAGACTGGCTGAAAJ1 序歹U2 : 5，-GGATCCCACGTTGTGATTAAAAGCAGCGAT-3' 前述之枯草桿菌可利用那些在常態下做爲微生物培養 時之培養介質的，含有碳源、氮源和無機物質之液體或固 體介質來培養。碳源可爲那些枯草桿菌可利用者，如：葡 萄糖、果糖、蔗糖、澱粉、和糖蜜。氮源之實例可包括： 腺、酪蛋白水解產物、肉類萃取物、和硫酸銨。介質中還 可含有如下群體之鹽類：磷酸、鉀、鎂、鈣、鈉、鐵、和 錳、維他命、胺基酸、和淸潔劑等。培養情況宜爲有氧環 境。較佳之培養裝置的實例可包括帶有充氣振盪之液體培 養裝置，如：瓶罐醱酵器、架一型固體培養裝置，和麴一 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -9 - 1330086 A7 ______B7_ 五、發明説明（7 ) 製造裝置。較佳之培養溫度爲20-5 0 t，尤其是30 —4 5 °C。培養時間可爲1 2小時至7天。培養之起始 PH可爲pH 5 — 9,尤以pH 6 — 8更佳。 經由前述方法取得之培養本身可做爲本發明之B T L 抑制劑。培養之濃縮物、從培養分離出之細胞體，及另外 含有添加劑（如：賦形劑）之配方：如：乾燥粉末、顆粒 、和錠劑也可做爲本發明之B T L抑制劑。該賦形劑包括 :碳酸鈣、玉米磨光粉、玉米粉、去脂米糠、麥糠、和乾 燥的脫脂奶，但不限於此。 本發明之BTL抑制劑宜含有1 〇6 - 1 ο11細胞/ 克之活枯草桿菌細胞，也就是孢子及/或營養細胞。 可投遞本發明之BTL抑制劑的個體包括：動物（如 :飼養以做爲肉食者，如：乳牛、豬和雞），以及人類， 但不限於此。在這些投遞之對象中，較佳者爲BTL高危 險群，如：有不正常之腸道菌增殖的個體，宿主免疫功能 減低者，或腸黏膜解剖構造失調者，如：絨毛萎縮。 本發明之B T L抑制劑可供投遞的型式包括：液體、 粉末、顆粒及錠劑，但不限於此。尤其是，當投遞對象爲 人類時，可即時投遞之錠劑或顆粒爲較佳者。投遞途徑可 爲口服投遞，但不限於此。在投遞至家畜類的情況中，本 β T L抑制劑宜爲粉末型式並與供口服投遞之飼料混合， 以易於處理。 本發明之B T L抑制劑的劑量就活枯草桿菌細胞而言 ，宜爲ΙΟ6— 1011細胞/天，尤其是1〇8 - 1010 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格.（2丨OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝. *?τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -10- 1330086 A7 B7 五、發明説明（8 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 細胞/天。當該個體爲肉食用之動物時，宜將粉末型式之 BTL抑制劑，以1〇3 - 1〇9細胞/克之速率，而以 1 0 4 — 1 0 7細胞/克之速率較佳（就活菌細胞而言）加 入飼料中來投遞該B T L抑制劑。藉由1 〇 6細胞/天或更 多之劑量可得到足夠之作用。藉由1 0 11細胞/天或更少 之劑量可得到足夠之B T L抑制作用》 本發明之B T L抑制劑可加強個體之腸道屏障功能並 可抑制有害細菌入侵腸道淋巴結而進入腸道。因此，可預 防所謂之機會性感染、多重器官衰竭、和敗血症。將本 B T L抑制劑投遞給人類時有助於人體健康。投遞給供肉 食用之動物時可藉由預防動物之污染而提供安全的肉類。 本發明之實例 本發明參考下列實施例和比較實施例來做更詳細的說 明。然而，本發明並不限於此。 實施例1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將1 8隻6週大之具有相同腸道菌叢的小鼠（物種： I c R ,公鼠）分成對照組（1 〇隻小鼠）和攝取組（8 隻小鼠），此1 8隻小鼠係經由在其5週大後之1週的預 備性飼養來取得相同的腸道菌叢。讓對照組進食由克利爾 日本（Clea Japan )公司製造的” CE — 2” 。讓攝取組進 食含3x 1 07CFU/克之枯草桿菌C — 3 1 〇 2 (儲存 於國家生物科學和人類技術組織中，儲存號碼爲 本k張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 -11 - 1330086 A7 _B7 五、發明説明（9 ) FERM BP-1096)的” CE — 2” 。從投遞的 第1 4天起，經由餵食二組小鼠做爲飮水之含0 . 8毫克 /毫升青黴素和2毫克/毫升鏈黴素的水來投遞抗生素。 在開始投遞抗生素後的三天，對糞便進行顯微鏡檢查。在 確認腸道菌已被排除後，將1 0 8 C F U /動物之具鏈黴素 抗性的大腸桿菌（大腸桿菌C 2 5 ;從美國代表型之培養 收集處購得；儲存號碼P T A — 1 8 9 6 ;儲存日期 2 0 0 0年5月1 9日，且現在可公開取得）投遞給小鼠 。然後，將僅含鏈黴素之水做爲飮水給予小鼠。在投遞具 鏈黴素抗性之大腸桿菌後4天，殺死老鼠並根據下列操作 來解剖之，以計算在MLN和盲腸中之菌數。 雖然在盲腸中所觀察到之細菌數並無太多差異，但在 攝取組之M L N中的細菌數則爲對照組所具者之4 9 %， 也就是，其降低程度値得注意》 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表1 在MLN中之菌種 在盲腸中之菌數 (CFU/MLN) (Log CFU/克） 對照組 105.3± 77.3 9.28± 0.19 (η=10) 攝取組 51.9± 31.5 9.45± 0.15 (η = 8) (用於計算菌數的方法） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -12- 1330086 A7 B7 五、發明説明（10 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 藉由將頸椎移位，並噴灑70%之乙醇來殺死老鼠。 切開腹部外皮，並再次以7 0 %之乙醇來消毒腹膜。然後 ，切開腹膜，並取出ML N和盲腸。在此步驟中，每次更 換切開部分時，需藉由浸入10 0%之乙醇再燃燒之，來 消毒所使用之手術儀器，以使之成爲無菌。 將取出之MLN在1毫升BHI液體介質中均化。將 均質物平皿接種在三個含鏈黴素的D H L介質上。每一介 質中所平皿接種之均質物的量爲0·2毫升。然後，將在 介質上之均質物於3 7 °C下培養2 0小時。從出現之菌落 數來決定每一M L N之菌數。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將取出之盲腸以剪刀切開，並置於含玻璃珠和10毫 升ΒΗ I液體介質的5 0毫升試管中。測量盲腸（含其內 容物）的重量，然後劇烈攪拌之，以懸浮該內容物。以 P B S (-)(商標名；由 ROMAN KOGYO Κ.Κ.製造，9 .5 7 m Μ )將懸浮液稀釋1 0 0倍。重覆此稀釋步驟三 次以使最終之稀釋倍數爲一百萬倍。將該最終之稀釋液體 平皿接種在三個含鏈黴素的D H L介質上。平皿接種之液 體量爲每一介質中0 . 1毫升。然後，將介質在3 7 °C下 培養2 0小時》從出現之菌落數計算出每單位重量之肓腸 含量中的細菌數。 實施例2 將3 0隻6週大之具有相同腸道菌叢的小鼠（物種： I C R，公鼠）分成對照組（1 5隻小鼠）和攝取組（ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） -13- 1330086 A7 ______B7___ 五、發明説明（11 ) 1 5隻小鼠），此3 0隻小鼠係經由在其5週大後之1週 的預備性飼養來取得相同的腸道菌叢。讓對照組進食由克 利爾日本（CleaJapan)公司製造的” CE — 2” 。讓攝取 組進食含3χ 1 07CFU/克之枯草桿菌C — 3 1 02 ( 儲存於國家生物科學和人類技術組織中，儲存號碼爲 FERM BP-1096)的” CE—2” 。從投遞的 第1 4天起，經由餵食二組小鼠做爲飮水之含0 · 8毫克 /毫升青黴素和2毫克/毫升鏈黴素的水來投遞抗生素。 在開始投遞抗生素後的三天，對糞便進行顯微鏡檢查。在 確認腸道菌已被排除後，將1 0 8 C F U /動物之相同於實 例1中所使用的具鏈黴素抗性的大腸桿菌投遞給小鼠。然 後，將僅含鏈黴素之水做爲飮水給予小鼠。在投遞具鏈黴 素抗性之大腸桿菌後4天，殺死老鼠並根據如實施例1中 之操作來解剖之，以計算在M L N和盲腸中之菌數。 雖然在盲腸中所觀察到之細菌數並無太多差異，但在 攝取組之M L Ν中的細菌數則爲對照組所具者之6 2 %， 也就是，其降低程度値得注意。該差異之顯著程度爲5 % ，具統計學上之顯著性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝- 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -14- 1330086 A7 B7 五、發明説明（12) 表2 MLN中之菌種 肓腸中之菌數 (CFU/MLN) (Log CFU/克） 對照組 112.6± 64.8 10.1± 0.21 (n=15) 攝取組 69.4± 42.2* 9.8± 0.24 (n=15) *P<0.05 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例3 將3 9隻6週大之具有相同腸道菌叢的小鼠（物種： I C R，公鼠）分成四組：B T L對照組（1 8隻小鼠） ，B T L攝取組（1 7隻小鼠），健康對照組（2隻小鼠 ),和健康攝取組（2隻小鼠），此3 9隻小鼠係經由在 其5週大後之1週的預備性飼養來取得相同的腸道菌叢。 讓B T L對照組和健康對照組進食由克利爾日本公司所製 造之” CE-2” 。讓BTL攝取組和健康攝取組進食含 3x 1 07CFU/克之枯草桿菌C — 3 1 02 (儲存於國 家生物科學和人類技術組織中，儲存號碼爲F E RM BP — 1096)的” CE — 2” 。從投遞的第14天起 ，藉由餵食B T L對照組和B T L攝取組做爲飮水之含 0·8毫克/毫升青黴素和2毫克/毫升鏈黴素的水來投 遞抗生素。在開始投遞抗生素後的三天，對糞便進行顯微 鏡檢查。在確認腸道菌已被排除後，將0 . 6 3x 108 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15- 1330086 A7 _____B7 五、發明説明（13) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) c f u/動物之相同的具鏈黴素抗性的大腸桿菌投遞給小 鼠。然後，將僅含鏈黴素之水做爲飮水來給予小鼠。在投 遞具鏈黴素抗性之大腸桿菌後4天，殺死小鼠並解剖之。 在B T L對照組和B T L攝取組中之小鼠被殺和解剖的同 ~天，將未經投遞抗生素和具鏈黴素抗性之大腸桿菌的健 康對照組和健康攝取組的小鼠殺死並解剖之。取出迴腸和 盲腸，並在含1 0 %福馬林（以體積計）的緩衝溶液（ Ρ Η 7 . 2 )中固定之。然後，依例行方法將樣本包埋 在石蠟中，再製備厚度爲5微米的切片。然後，進行蘇木 精-伊紅染色，再於光學顯微鏡下觀察樣本。 在各組中之盲腸和迴腸中的黏膜上皮細胞之壞死和脫 離/脫屑，以及固有層中之細胞浸潤的計分爲：沒有者0 分，輕微者1分，中等程度者2分，嚴重者3分，然後， 決定該平均値。還有，決定在BTL攝取組和BTL對照 組中之誤差。結果顯示於表3中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -16- 1330086 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五 •發明説明（14 ) 表3 迴腸 組別 動物數 黏膜上皮細胞 固有層 壞死 脫離/脫屑 嗜中性血球 嗜伊紅血球 巨噬細胞 淋巴球 BTL 18 0.78± 0.55 0.94± 0.54 0.39± 0.5 0.22± 0.43 〇.11± 0.32 〇.28± 0.46 對照組 〇.41± 0.51* 0_59± 0.62 0.18± 0.39 〇.24± 0.44 0.06± 0.24 0.12± 0.33 BTL 17 攝取組 健康對 2 2 2.5 2 1 1 2.5 照組 健康攝 2 1.5 2 1.5 1 0.5 1.5 取組 盲腸 組別 動物數 黏膜上皮細胞 固有層 壞死 脫離/脫屑 嗜中性血球 嗜伊紅血球 巨噬細胞 淋巴球 BTL 18 0.67± 0.59 1.06± 0.64 0.39± 0.5 0.22± 0.43 〇.11± 0.32 0.33± 0.49 對照組 〇.41± 0.51 0.65± 0.49* 0.18+ 0.39 0.29± 0.47 0.12± 0.33 0.12± 0.33 BTL 17 攝取組 健康對 2 2.5 3 2 0.5 1 2.5 照組 健康攝 2 1 2 1 0 0.5 1.5 取組 * :顯著性5 %之顯著程度 ---„------9 裝— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（_ ⑺OX騰楚）—17 _ 訂 1330086 A7 B7 五、發明説明（15 ) 在B T L攝取組和B T L對照組中均明顯引出B T L 。本B T L抑制劑係投遞給B T L攝取組，但未投遞給 B T L對照組。比較這些組別可知在B T L攝取組中之黏 膜上皮細胞的壞死和脫離/脫屑情形，以及在固有層中之 細胞浸潤情形比在B T L對照組中所產生的這些情況來得 少，尤其是，在迴腸之壞死方面和在盲腸之脫離/脫屑方 面，其具有5%之顯著程度的差異顯著性。在健康攝取組 之黏膜上皮細胞的壞死和脫離/脫屑情形，以及在固有層 中之細胞浸潤情形也較在健康對照組中所產生的這些情形 來得少。 在健康攝取組和健康對照組中之黏膜上皮細胞的壞死 和脫離/脫屑情形，以及在固有層中之嗜中性血球和淋巴 球浸潤情形比在B T L攝取組和B T L對照組中所具有者
更常發生。這看來是因爲抗生素在B T L對照組和B T L 攝取組在腸道造成損傷，需待其恢復後才進行觀察的緣故 〇 在健康對照組和健康攝取組中之迴腸的顯微鏡照片各 顯示於第1圖和第3圖中。在健康對照組和健康攝取組中 之盲腸的顯微鏡照片各顯示於第5圖和第7圖中。在第1 ,3, 5和7圖中所觀察到之在黏膜上皮細胞的壞死和脫 離/脫屑位置以及在固有層中之嗜中性血球和淋巴球浸潤 係各說明於第2, 4， 6和8圖中。 在第1至8圖中之數字係表示下列意義： 11:有細胞核消失、壞死和脫屑情形且藉嗜伊紅染色之 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -18- 1330086 A7 B7 五、發明説明（16 ) 部分 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 12:有細胞核消失、壞死和脫屑情形之部分 1 3 :有嗜中性白血球和淋巴球浸潤之部分 3 1 :細菌 3 2 :有脫屑情形之部分 5 1 :細菌 5 2 :有壞死情形之部分 7 1 :細菌 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在健康對照組之迴腸和盲腸中，黏膜上皮細胞之壞死 和脫離/脫屑情形很顯著。還有，在健康對照組中可經常 觀察到嗜中性白血球和淋巴球浸潤入固有層（見第1和第 2圖，以及第5和6圖）。相反的，在健康攝取組之迴腸 和盲腸中顯現出較少的黏膜上皮細胞壞死和脫離/脫屑情 況，且固有層之嗜中性白血球和淋巴球浸潤情形較健康對 照組中者較不常見。在健康攝取組的黏膜上皮細胞表面上 可淸楚觀察到一層厚甘卡因的輪廓（見第3和4，以及第 7和8圖）。從這些結果中，可淸楚知道投遞本BTL抑 制劑可減少在腸道黏膜中之壞死和脫離/脫屑，減少細菌 入侵腸道組織，並減少嗜中性白血球和淋巴球浸潤入固有 層。 實驗1
在各爲10毫升之TS介質中培養下列8種菌種一整 夜：枯草桿菌C-3102菌株，解澱粉桿菌ATCC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19- 1330086 A7 B7 五、發明説明（17 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 23350菌株（代表株），解澱粉桿菌ifo 14141菌株，解澱粉桿菌I f〇 3022菌株，枯 草桿菌I FO 3009菌株，枯草桿菌I f〇 12112菌株，枯草桿菌ATCC 9372菌株和枯 草桿菌ATCC 6051菌株（代表株）。 解澱粉桿菌ATCC 23350菌株，枯草桿菌 ATCC 9372菌株和枯草桿菌ATCC 6051 菌株可從美國分類培養收集處公開取得，而解澱粉桿菌 IFO 14141菌株，解澱粉桿菌IFO 3 0 2 2 菌株，枯草桿菌I FO 3009菌株和枯草桿菌I F〇 1 2 1 1 2可從日本大阪醱酵組織公開取得。 以用於酵母和革蘭氏陽性細菌之D NA製備套組” G e η T L E ” （由TAKARA SHUZO有限公司製造）來萃 取並純化各培養菌株之染色體DNA，以取得染色體 D N A溶液。該萃取和純化方法可根據D NA製備套組之 指示來進行，但需將經真空乾燥之D N A小九溶於2 0微 升T E緩衝液中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將所產生之染色體D NA溶液與表4中所說明之其它 試劑混合，以製備用於PCR處理之樣本。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） -20- 1330086 A7 _ B7 五、發明説明（18 ) 表4 1微升 5微升 8微升（各2_5mM) 0.2β Μ (在最終樣本中的濃度） 0.2 ν Μ (在最終樣本中的濃度） 0.5微升（5單位/微升） 34.5微升 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 染色體DNA溶液 10X PCR緩衝液 dNTP混合溶液 引物1 引物2 Taq聚合酶 無菌水_ 全部 5 0微升 在表4中，” l〇X PCR緩衝液”爲附在由 TAKARA SHUZO有限公司所製造之” TaKaRa LA-PCR套組 V e r 2 ”者。引物1和2各爲藉序列1和2所鑑定者。 這些係用來擴大編碼解澱粉桿菌之α -澱粉酶的D NA片 段，此片段長度爲約2kb，且具如下序列： 序列1 : 5'-GCCCCGCACATACGAAAAGACTGGCTGAAA-3' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 序列2 : 5I-GGATCCCACGTTGTGATTAAAAGCAGCGAT-31 然後，將欲進行P C R處理之樣本以由 TAKARA SHUZO有限公司製造之” TaKaRa LA-PCR套組V e r 2，， 和” TaKaRa PCT Thermal Cycler PERSONAL” 來進行 PCR處理，以取得經PCR增數之產物。PCT處理之 熱條件說明於表5中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -21 - 1330086 A7 _____ B7 五、發明説明（19) 表5 9 4 °c，1分鐘 9 8 〇c，2 0 秒一 X 2 5個循環 7 1 °C，3分鐘—— 7 2 °c , 1 0 分鐘 4 °C ,以終止反應 取5微升所產生之P C R增數產物來進行電泳，此係 在〜水平電泳單位Mupid2 (由ADVANCE有限公司製造） 中，以1 . 2%瓊脂糖凝膠進行。使用；I 一 DNA之 H i n d Π分解產物做爲分子量標記。電泳結果顯示於第 9圖中。 在第9圖中，照片頂端處之數字（1至9 )爲電泳道 的數目。在各電泳道中，將下列樣本進行電泳： 第1道：分子量標記（λ—DNA之Hi ndn分解 產物）。在第1道中有六條可辨識出之帶。位在短移行距 離處之三個亮帶爲2 3 1 3 0 b p標記（最短的移行距離 )，9416bp標記（第二短的移行距離）和6557 bP標記（第三短的移行距離）。位在較長之移行距離處 之鄰接的暗帶爲4 3 6 1 b p標記。位在較長之移行距離 處且較暗帶稍亮的二個帶爲2 3 2 2 b p標記（第二長之 移行距離）和2 0 2 7標記（最長之移行距離）。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -22 - 1330086 A7 ____ B7 五、發明説明（2〇 ) 第2道：從枯草桿菌C—3102衍生之DNA增數 產物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第3道：從解澱粉桿菌ATCC 2350 (代表株 )衍生之DNA增數產物。 第4道：從解澱粉桿菌IFO 14141衍生之 D Ν A增數產物。 第5道：從解澱粉桿菌IFO 3022衍生之 D N A增數產物。
第6道：從枯草桿菌IFO 3009衍生之DNA 增數產物。 第7道：從枯草桿菌IFO 12112衍生之 D N A增數產物。 第8道：從枯草桿菌ATCC 9372衍生之 D N A增數產物。 第9道：從枯草桿菌ATCC 6051(代表株） 衍生之D N A增數產物。 在來自解澱粉桿菌菌株之樣本（第3， 4和5道）的 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 電泳結果中可觀察到長約2 k b的片段增數產物。在來自 枯草桿菌IFO 3009菌株，枯草桿菌IFO 12112菌株，枯草桿菌ATCC 9372菌株和枯 草桿菌ATCC 6051菌株之樣本（第6，7，8和 9道）的電泳結果中，無法偵測到片段之增數產物。然而 ，在來自枯草桿菌C—3102(第2道）之樣本的電泳 結果中，可辨識出一約70〇kb的特定淸楚帶。 ---* 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23- 1330086 A7 B7 五、發明説明（21 ) 序列表 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 申請者：卡畢斯（Calpis)有限公司 標題：細菌移行抑制劑及用於抑制細菌移行的方法 序列數：2 序列編號1 長度：3 0個核苷酸 類型：D N A 來源：解澱粉桿菌 序列= gcccc gcaca tacga aaaga ctggc tgaaa 30 序列編號2 長度：30個核苷酸 類型：D N A 來源：解澱粉桿菌 序列： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ggatc ccacg ttgtg attaa aagca gcgat 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -24-