TWI316960B - Substrates and assays for beta-secretase activity - Google Patents

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TWI316960B
TWI316960B TW090117695A TW90117695A TWI316960B TW I316960 B TWI316960 B TW I316960B TW 090117695 A TW090117695 A TW 090117695A TW 90117695 A TW90117695 A TW 90117695A TW I316960 B TWI316960 B TW I316960B
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E Gurney Mark
L Emmons Thomas
Jerome Bienkowski Michael
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Description

1316960
經濟部中央檫準局員工消费合作社印東 發明範疇 本發明係關於確認β-促泌酶活性之調節劑的方法和組合 物。更特定而言，本發明提供監視人類Asp2蛋白酶之卜促 泌酶活性的新穎受質，以及使用相同物的方法。這類方法 和...且S物’和可用來確忍έ周郎β _促泌酶活性的製劑，並因 此可用在其特徵爲出現澱粉樣斑之障礙的治療性干涉中。 發明背景 早老性癡呆徵候群（AD)引起進行性癡呆，結果形成澱粉 樣斑、神經元纖維纏結、神經膠樣變性和神經元的喪失。 該疾病以遣傳性和散發性兩種形式出現，其臨床過程和病 理學特徵是相當類似的。目前已經發現當三個基因發生突 變時，引起早老性癡呆的常染色體顯性形式。這些基因編 碼澱粉樣蛋白質前驅物（ΑΡΡ)和兩個蛋白質，早老素 (presenilin)-l (psi)和早老素_2 (PS2)，其在結構和功能上 是相關的。已經觀察到在三個蛋白質的任一個中發生突變 ，經由產生澱粉樣β肽（Αβ肽，有時稱爲Αβ)的細胞内路徑 ’增加ΑΡΡ的蛋白水解加工，該肽爲40-42個胺基酸的肽， 疋在AD中澱粉樣斑的主要組份（Y〇unkin, Brain Pathol. 1(4) ： 253-62, 199 1 ； Haass, J. Neurosci. 11(12) ： 3783-93, 1991) 〇 蛋白水解加工之細胞内路徑的調節障礙，可能是AD之病 理生理學的主因。在斑形成的案例中，APP、PS 1或PS2中 的突變一致地改變了 APP的蛋白水解加工，而得以增加Αβ 1 -42，一種形式之Αβ肽的形成，它似乎是特別能產生澱粉 -4- 本紙張尺度通用t國國家揉準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝-----訂------線
^ n^[ ^^1 111 HI m —I A7 1316960 ____B7 五、發明説明（2 ) 樣變性的’並因此在AD中是極重要的。APP局現在包括細 胞表面的分泌性膜結構上，並具有單一 C -終端的穿透膜功 能部位。APP之獨特同型物的實例，目前已知存在於人體 内的，包括由Kang等人（ 1 987)，Nature 325 : 733-736描述的 695個-胺基酸之多肽，將其命名爲，，正常的"八{>11;由1>〇加6 等人（ 1 988)，Nature 33 1 : 525-527( 1 988)和 Tanzi 等人（ 1988), Nature 33 1 : 528-530描述的751個胺基酸之多肽；以及由 Kitaguchi等人描述的7*70個胺基酸之多肽。 Αβ肽衍生自與APP相鄰的區域，並含有一部分的穿透膜 功能部位。通常’ ΑΡΡ的加工，在α_促泌酶位置切開與膜 相鄰之Αβ序列的中區，並從細胞表面釋放出可溶性的細胞 外功能邵位。該α-促泌酶ΑΡΡ加工，產生可溶性Αρρ_α，不 認爲其助成AD。然而ΑΡΡ的病理性加工，在位於α促泌 酶位置之Ν-終端和C-終端的β-和γ-促泌酶位置處切開，釋 放出Α β肽。在β -和γ-促泌酶位置的加工，可出現在内質網（ 在神經元中）中，以及在細胞表面ΑΡΡ之再度-内化作用之後 ，出現在内囊胞/溶酶體的路徑中（在所有細胞中）。β _促泌 酶切開位置位於得自漿膜管腔表面的2 8個殘基，而γ-促泌 酶切開位置則位於穿透膜區域中。認爲β _促泌酶位置在活 體内的加工’是Αβ產製中限制速率的步骤（sinha和 Lieberburg, Proc. Nat'l. Acad. Sci·， USA 96(4)， 1 1049-1 1053，1999)，且本身是佔優勢的標靶治療標靶e 最近，數組研究者已經報告了具有在(5_促泌酶切開位置 負貴APP加工之活性的人類天冬胺醯基蛋白酶（Hu_Asp2)。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公慶） ----- ---------^-----1T------線— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁j 經濟部中央樣準局員工消费合作社印製 1316960 Α7 Β7 五 明 説明發
Hu-Asp2是與膜-結合的天冬胺醯基蛋白酶（Yan等人，
Nature 402 533-5 36，1 999 : Lin等人，proc. Nat'l. Acad
Sci·，USA 97(4): 1456-1460, 2000; Vassar等人，Science 2 86 : 73 5-74 1，1 999)。諸如组織蛋白酶D、胃蛋白酶、腎浩 素之類的天冬胺醞基蛋白酶’和病毒的天冬胺醯基蛋白酶 ’均包括簽名催化三聯體...Asp-Thr-Gly…和 ...Asp-Ser-Gly…。在Hu-Asp2中，這些簽名催化三聯體彼此 相對地藏匿在Hu-Asp2的二葉結構中。其他哺乳動物天冬胺 醯基蛋白酶所缺乏之Hu-Asp2的重要特徵，是位在接近c_ 終端處的一股27個胺基酸，其將Hu-Asp2固定在膜上，且其 基本上在細胞中具有酵素功能。 迄今，利用重組的Hu-Asp2或從腦中純化之Hu-Asp2的在 活體外測定’依賴包括β -;殿粉樣前驅物序列的β ·促泌酶認 知序列（也就是ΑΡΡ序列）的肽受質，像是APP Swedish突變 序列…EVNL-DAEFR…(序列識別113號），其中連字號表示 該肽被β-促泌酶切開的地點。在表現Hu-Asp2之細胞株中， β -促泌酶測定亦使用相同的方法。 經濟部中央標準局員工消费合作·杜印製 f請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 現在需要確認可擔任Hu-Asp2之ΑΡΡ受質代用品的化合 物。確認這類受質，有助於確認在β -促泌酶位置處影響APP 加工之治療性製劑的新穎之在活體外和典型之在活體内測 定。最後，這類受質的確認和測定，將導致在確認有利地 干涉早#性癡呆徵候群之治療性化合物上的利益。 發明概要 本發明提供新穎的受質、測定’和進行天冬胺醯基蛋白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} 1316960 A7 B7 五、發明说明（4 ) 酶測定的方法。更特定而言，本發明一方面提供經過分離 的肽，其包括由式？2?1--?1〒2'定義的至少四個胺基酸之序 列，其中p 2爲帶電荷.的胺基酸、極性的胺基酸，或脂肪·族 的胺基酸，但不是芳香族的胺基酸：P I爲芳香族的胺基酸 或脂肪族的胺基酸’但不是極性的胺基酸或帶電荷的胺基 酸；P 11爲帶電何的胺基酸或脂肪族的胺基酸，或極性的胺 基酸，但不是芳香族的胺基酸；而P2'爲不帶電荷的脂肪族 極性之胺基酸，或芳香族的胺基酸，但不是帶電荷的胺基 酸；其中該肽在？！和Ρ!ι之間，被由序列識別1號或序列識別 3號编碼的人類天冬胺醯基蛋白酶切開’且該肽不包括在序 列識別19號；序列識別20號；’序列識別2 1號；序列識別26 號；序列識別27號；序列識別28號；序列識別3 1號；序列 識別3 2號；序列識別3 3號；序列識別3 4號；序列識別3 5號 :序列識別36號；序列識別37號；序列識別38號；序列識 別39號或序列識別40號中敘述之胺基酸序列的相對應之 ΡζΡγΡ/Ρζ'部分。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在某些具體實施例中，經過分離之肽包括由式 定義的胺基酸序列，其中Ρ3'爲任何的胺基酸 ，且其中該肽不包括在序列識別19號；序列識別20號；序 列識別2丨號；序列識別26號；序列識別27號；序列識別28 號：序列識別31號；序列識別32號；序列識別33號；序列 識別34號；序列識別35號；序列識別365虎’序列識別375虎 ;序列識別3 8號；序列識別3 9號或序列滅別4〇中迷敘心胺 基酸序列的相對應之P2Pi—P|’P2'p3部77 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公缓） 1316960 A7 B7__ 五、發明説明（5 ) 在更特定的具體實施例中，經過分離的肽包括由式 定義的胺基酸序列’其中P3爲不帶電荷的 極性胺基酸、不帶電荷的脂肪族胺基酸或芳香族胺基酸’ 且其中該肽不包括在序列識別19號；序列識別2 0號；序列 識別2 1號：序列識別2 6號..；序列識別2 7號’序列識別2 8號 :序列識別3 1號；序列識別3 2號；序列識別3 3號’序列識 別34號；序列識別35號；序列識別36號；序列識別37號； 序列識別38號；序列識別39號或序列識別40中述敛之胺基 酸序列的相對應之？3?2?1--匕，1>2，1>3，部分。在其他的具體實 施例中，經過分離的肽包括由式PePshPr-Pi'P2'?3'定義的 胺基酸序列，其中P4爲帶電荷的胺基酸 '極性的胺基酸或 脂肪族胺基酸，但不是芳香族胺基酸，且該肽不包括在序 列識別19號；序列識別20號；序列識別2丨號；序列識別26 號；序列識別27號；序列識別28號；序列識別3 1號；序列 識別32琴；序列識別33號；序列識別34號；序列識別35號 ;序列識別36號；序列識別37號；序列識別38號；序列識 別39號或序列識別40中述敘之胺基酸序列的相對應之 部分。在其他特殊的具體貫施例中，*亥 肽尚包括緊接P3,之羧基-終端位置的位置P4'處之胺基鉍’ 其中P4,爲任何的胺基酸，且其中該肽不包括在序列識別19 號；序列識別20號；序列識別2 1號；序列識別26號；序列 識別27號；序列識別28號；序列識別3 1號；序列識別32號 :序列識別33號：序列識別34號：序列識別35號；序列識 別36號；序列識別37號；序列識別38號；序列識別39说或 -8 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210 X 297公沒） 坤衣 -----IT------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部令央橾準局員工消费合作社印«. 1316960 Λ7 87 五、發明説明（6 序列識別40中述敘之胺其π , 盎杈序列 Νί^ί^Ργ-Ρ,'Ρ^Ρ^Ρ，部分。 在特佳的具體實施例中’ Ρ2爲選自包括 、Τ、D、A、Q和Ε的胺基酸。 在較佳的具體實施例中’ P,爲選 、F和Η的胺基酸。 在較佳的具體實施例中，將Ρ 、Μ、Q、S和G的胺基酸。 在較佳的具體實施例中，Ρ 、F和S的胺基酸。 在較佳的具體實施例中’ Ρ，爲谨 目包括E、G、F 基丙胺酸和S的胺基酸。 的相對應之
G 包括 Y、L、Μ、N1 e 定義爲選自包括E、A、D 爲選自包括V、A、n、T、L·
在較佳的具體實施例中，Ps爲選 Y、T和F的胺基酸。 在較佳的具體實施例中，P 績基丙胺酸和S的胺基酸。 在較佳的具體實施例中，P4 P Η、橫 包括 A、V、I、s、Η 爲選自包括ε、g、：
D、T (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 G、N、S和E的胺基酸。^詳έ I括F、W、G、A、Η 殘基將是明顯的。 “說明中，許多極佳的 在本發明較佳的具體實施例中 τ 經過分離的肽尚包括第 一個標記。在特定的具體實施例φ 甲’狀包括橫基丙胺酸， 其包括共價附接的標記。其他較佳的具體實施例企圖包括 尚包括弟一個標έ己的肤。在本發明的這一方面中，該標記 可以是任何經常用來檢測及/或定量肽的標記。在特定的具 -9- 本也浪尺度適用令國國家標準（CNS.) Α4規格（210Χ 297公釐） A7 B7 1316960 五、發明説明（ 體實施例中，本發明之肽可 ^ 4,¾ ^ 了梹測標3己和中止邵分， 田％ έ己與中止邵分非常接 ^ 1 邊中止邵分便中止標記的 了 fe測性質。更特定而言，選 D &擇中止邵分和標記，以便在 I和P 1 ’之間切開該肽時，將分龌φ 肘刀離中止邵分，而容許檢測該 ^ 〇&因此，在車父佳的具體實施例中，在Ρ,-Ρ,'切開位置的 兩側將中止部分和標記附接在肽上。 、在本發明較佳的具體實施例中，本發明提供一種肽，其 以比包括人類ΑΡΡ β-促泌酶切開序列：SE VKM-DAEFR(序 列減別2 0號）之多肽的切開速率更快的速率，被人類天冬胺 S盛基蛋白酶Hu-Asp2切開。再更佳的具體實施例，則提供一 種肽，其以比包括人類APP Swedish KM— NL突變，β-促泌 酶切開序列SEVNL-DAEFR(序列識別19號）之多肽的切開 速率更快的速率，被人類天冬胺醯基蛋白酶切開。 本發明之特佳的肽，包括但不限於包括在序列識別5號； 序列識別6號；序列識別7號；序列識別8號；序列識別9號 ;序列議別10號；序列識別11號；序列識別12號；序列識 別1 3號；序列識別14號；序列識別1 5號；序列識別1 6號； 序列識別1 7號；序列識別1 8號；序列識別120號；序列識別 1 3 3號；序列識別1 3 4號；序列識別1 3 5號；序列識別1 3 6號 ;序列識別137號；序列識別138號；序列識別14丨號；序列 識別143號；序列識別144號；序列識別145號；序列咸别147 號；序列識別148號；序列識別149號：序列滅別150號, 列識別151號；序列識別丨52號：序列識別153號；序列 154號；序列識別155號；序列識別15« :序列識別157说 本紙張尺度適财酬家鮮（CNS ) Α视格（21GX 297公楚） --------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中失櫟隼局員工消費合作社印裝 1316960 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) :序列識別1 5 8號：序列識別I 5 9號：序列識別1 60號：序 識別1 6 1號；序列識別1 62號：序列識別丨63號；序列識別1 64 號：序列識別1 6 5號；序列識別1 6 6號；序列識別1 6 7號：序 列識別1 6 8號；序列識別1 6 9號：序列識別1 9 0號；序列識別 1 9 1號：序列識別1 9 2號和序列識別1 9 3號中陳述之任一個序 列的那些。 本發明的其他方面，係關於包括藉著本發明的一個肽描 述之新穎的β -促泌酶切開位置之胺基酸序列，以及額外之 胺基酸序列的融合多肽。更特定而言，本發明期待包括本 發明之肽，且尚包括穿透膜功能部位之胺基酸序列的多月太 。在特定的具體實施例中，該肽含有在穿透膜功能部位之 Ν-終端的β-促泌酶切開位置，但亦期待在C-終端的。在某 些具體實施例中，可由交聯劑分開該肽與穿透膜功能部位 。更特定而言，該交聯劑可以是含有大約20到大約40個胺 基酸的肽交聯劑。在特佳的具體實施例中，穿透膜功能部 位將多Α固定在細胞内的膜上，選自包括高爾基氏體或内 質網。穿透膜功能部位本身包括蛋白質的穿透膜功能部位 胺基酸序列，其被固定在表現這類蛋白質之細胞的高爾基 氏體或ER膜上。在較佳的具體實施例中，融合多肽包括穿 透膜功能部位，選自包括半乳糖基轉移酶的的穿透膜功能 部位、唾液基（sialyly)轉移酶的穿透膜功能部位；人類天冬 胺醯基轉移酶1的穿透膜功能部位；人類天冬胺醯基轉移酶 2的牙透膜;功此部位，賽特辛（Syntaxin) 6的穿透膜功能部位 :乙酿胺基葡糖轉移酶的穿透膜功能部位；以及App的穿 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4現格(Τ^χ 297公楚） ----------^ f請先閱請背面之注意事項再填寫本 頁}
、1T 線 !316960 A7
心狀切晚邵位。 在本發明較佳的具體實施例 列之外，融合蛋白質尚可包括報告：蛋：：列和穿透膜序 。報告者序列最好提供可檢測了基酸序列 特徵），或是催化受質成爲產物的酵特中徵（例如，光學 提供可檢測和可定量的特徵 二：質或產物 者蛋白質之胺基酸序列和含有本發二=質包括報告 切開位置。在本發明的較佳方面，報告者蛋白 每 括蟲螢光素酶；鹼性磷酸酶；β. 匕 ^(g.uc〇H-dinase)： ： 。 求智元蛋白負，和氣黴素乙醯轉移酶
在某些方面，本發明期待突變或衍生的App分予並 已經修改野外型術的天終促泌酶切開位置，使其本有本 發明之-個受㈣b·促泌酶㈣位置。可藉著指定^之 ^變生成作用’或藉著肽合成，按照在本文中的描述來產 製這類突變或衍生的APP。 本發明的其他方面’期待包括編碼本發明之融合多肤之 核芬酸序列的多核芬酸。其他的具體實施例期待包㈣碼 本發明之肽受質之核苷酸序列的多核苷酸。在本文十，亦 期待包括任何本發明之多核-酸的載體。在較佳的具體實 施例中，載體包括編碼本發明之肽或融合多肽的多核荅酸 ，其中該多核苷酸以可操作之方式，與啓動基因連接，以 便在宿主細胞中增進由該多核-酸编碼之融合多肽的表現 。其他的具體實施例期待利用由本發明描述之多核芬酸或 -12- 本纸掁尺度適用尹國國家樣準（CNS 规格（2丨〇><297公趁） 1316960 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明（10 > 載Ha轉化或轉和感染的宿主細胞。在較佳的具體實施糾中 乂夕核知私/載體和編碼Hu-Asp2之多核与：酸/載體共同 轉移感染宿主細胞。 在本文中亦描述產製β -促泌酶測定之受質的方法，包括 '各》午泫夕肽表現的方式，使以本發明之載體轉化或轉移 感染的宿王細胞生長。本發明之該方面的其他具體實施例 ，尚可包括純化該多肽。在較佳的具體實施例中，宿主細 胞係選自包括哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞，和酵母 菌宿主細胞。 在本又中亦期待包括ΑΡΡ突變種的基因轉殖動物，具有 β-促泌酶，切開一個本發明之肽。 在另一万面，本發明提供測定卜促泌酶活性之調節劑的 方去I括使第一個組合物與第二個組合物，在假定之調 即劑化合物的存在和缺乏之下接觸的步驟，其中第一個組 口物包括哺礼動物β-促泌酶多肽或其具有生物活性的片段 且其+第一個組合物包括受質，其中該受質包括本發明 (肽或融合蛋白質。在較佳的具體實施例中，肖方法尚包 括在假定4調節劑的存在和缺之之下，測量受質肽的切開 ;並從在假定之調節劑组合物的存在對缺乏中，在切開上 的差異，來確認碉節劑的促泌酶活性，其中若調節劑爲卜 促泌酶拮抗劑，便降低這類切開，若調節劑爲卜促泌酶激 動劑，則增加這類切開。在特定的具體實施例中，第一個 組合物可包括經過純化的人類心…多肽。在其他的具體實 犯例中，第一個組合物可包括人類Asp2多肽的可溶性片段 -----IT------^ I®! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1316960 A 7 B7 五、發明説明（11 ) 經濟部中央標隼局W3K；工消費合作社印衷 _ ’其仍保留A s p 2 _β •促泌酶活性。更特定而言，可溶性片段 可以是缺乏Asρ2穿透膜功能部位的片段。在更佳的具體實 施例中，第一個組合物的促泌酶多肽，包括從以包括編 碼β -促泌酶多肽之核：y：酸序列的多核苷酸轉化或轉移感染 之細胞中純化和分離的多肽。 在其他特定的具體實施例中，第一個詛合物包括在以包 括編碼β-促泌酶多肽之核甞酸序列的多核：y：酸轉化或轉移 感染的細胞内，且測量步驟包括測量該細胞的App加工活 性。 另一方面’本發明企圖利用根據本發明方法確認其爲 Hu-Asp2之抑制劑的製劑，來治療早老性癡呆徵候群。較佳 方面更期待根據本發明之方法而確認出的β·促泌酶調節劑 。特別期待的是在活體内抑制β -促泌酶活性的方法，包括 對哺乳動物投與在哺乳動物細胞中，有效抑制卩_促泌酶之 含量的由本發明確認之調節劑的步驟，其中該調節劑爲β _ 促泌酶拮抗劑。 在本文中亦描述醫藥組合物，包括由本發明確認的β -促 泌酶調節劑和在藥學上可接受的載劑。另一方面，本發明 指j述治療其特徵在於異常之β _促泌酶活性之疾病或病況的 方法’包括對需要治療之個體投與如同上述的醫藥組合物 。其他的具體實施例則描述使用根據本發明確認的調節劑 ’來製造用來治療早老性癡呆徵候群的藥物。 在相關的方面’本發明提供含有包括根據本發明確認之 调郎劑之組合物的容器，含有說明用來治療早老性癡呆徵 -14- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,一51—^1 In - -- i - - - HI In 1 In HI In n 木紙張足度通用Φ SO IS1玄祕也 十 & ί J ι -
y 1N 格 Μ 公 7 9 2 1316960 A7 B7 五 、發明説明（12 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 矣群之即劑的指示之標記的容器。#交佳的是，該組合物 尚包括藥學載劑。該組合物最好是單位劑量的調配物。 拓1述用來確認抑制人類Asp2天冬胺醯基蛋白酶 p)之活性之製劑的額外方法，包括下列步驟：使本 發明足狀或融合多肽與包括Hu-Asp2活性之組合物，在受試 製势丨的存在和缺乏之下接觸：在受試製劑的存在和缺乏之 下’判足肽或多肽在匕和匕’之間被Hu_Asp2s開的程度； 並比較在受試製劑存在下之Hu-Asp2的切開活性與在缺乏 党試製劑之下的活性，確認該製劑是否抑制Hu_Asp2的切開 ’其中在受試製劑的存在下降低活性，則確認該製劑抑制 了 Hu-Asp2的活性。在較佳的具體實施例中，該Hu_Asp2是 從以包括編碼Hu-Asp2之核：y：酸序列的多核苷酸轉化或轉 移感染之細胞中純化和分離出的重組Hu-Asp2。在另外的具 體實施例中，在細胞中表現Hu-Asp2，其中該接觸作用包括 使該細胞在受試製劑的存在和缺乏之下生長，而該判定步 驟包括測量肽或融合蛋白質的切開。在特定的具體實施例 中，該細胞尚包括編碼多肽的多核：y：酸，且其中該接觸步 驟包括在使細胞表現該多肽的條件下，使該細胞生長。在 較佳的具體實施例中，該細胞爲人類胚胎腎臟細胞株293 細胞和老鼠Neuro-2a神經胚細胞瘤細胞株。在其他較佳的 具體實施例中，核苷酸序列係選自包括编碼在序列識別2 號中陳述之Hu-Asp2(a)胺基酸序列的核嘗酸序列；編碼在 序列識別4號中陳述之Hu-Asp2(b)胺基酸序列的核苷酸序 列；编碼Hu-Asp2(a)(序列識別2號）或Hu-Asp2(b)(序列識別 -15 - 本標举(CNS ) Α4規格（210χ 297公f ) C請先閱讀背而之注意事項真填"本寶) -装. --° 線 1316960 A7 經濟部中央樣準局員工消资合作社印製 Β7 五、發明説明（13 ) 4號）之片段的核苷酸序列，其中該片段顯示出 或Hu-Asp2(b)之特徵性的天冬胺醯基蛋白酶活性：以及在 嚴格的雜交條件下，與選自包括序列識別1號和序列識別3 號之編碼Hu-Asp2的多核苷酸雜交之多核甞酸的核苷酸序 列〇 其他方面則描述確認調節Asp2天冬胺醯基蛋白酶活性之 製劑的方法’包括下列步驟：在受試製劑的存在和缺乏之 下，使Asp2天冬胺醯基蛋白酶和本發明之肽或融合多肽接 觸’其中5亥Asp2天冬胺酿基蛋白酶係由在嚴格的雜交條件 下’與選自包括序列識別1號和序列識別3號之編碼Hu_Asp2 的多核苷酸雜交之核酸分子編碼；在受試製劑的存在和缺 之足下，判定肽或融合蛋白質在匕和匕，位置之間被Asp2s 開的程度；.並比較在受試製劑的存在下Asp2的切開活性， 與缺之Μ製劑之下的切開活性，確認該製劑是否調節多肽 的活性其中若該調節劑是Asp2抑制劑，便降低切開作用 ，而菽調節劑若是Asp2激動劑，則增加切開作用。在較佳 的具體實施例中，該方法尚包括以根據本發明確認爲
Hu-Asp2之抑制劑的製劑，來治療早老性癡呆徵候群的步驟 〇 亦描述確認抑制人類Asp2天冬胺醯基蛋白酶（Hu_Asp2) 活性之製劑的方法，包括下列步驟：使細胞在受試製劑的 存在和缺乏之下生長，其中該細胞表現Hu-AsP2或老鼠的 Asp2，並表現包括本發明之肽或融合多肽的蛋白質；在受 試製劑的存在和缺乏之下，判定蛋白質在細胞中，在^和 16- --装 -----訂------線--------^--------- (請先閲讀背面之注意事項再填离本頁) Λ>< 1316960 A7 經濟部中央樣率局員工消費合作社印聚 B7 五、發明説明（14) p I '之間的位置處被切開的程度；並比較在受試製/劑存在下 的切開活性，與缺乏該製劑之下的切開活性，確認該製劑 是否抑制Hu-Asp2的活性，其中若在受試製劑的存在下降低 切開活性，則確認該製劑抑制Hu-Asp2之活性。在較佳的具 體實施例中，該宿主細胞表現内源的Asp2，或已經利用包 括編碼Hu-Asp2之核甞酸序列的多核甞酸轉化或轉移感染 ’其中該核苷酸序列係選自包括编碼在序列識別2號中陳述 之Hu-Asp2(a)胺基酸序列的核苷酸序列；編碼在序列識別4 號中陳述之Hu-Asp2(b)胺基酸序列的核荅酸序列；編碼 Hu-Asp2(a)(序列識別2號）或Hu-Asp2(b)(序列識別4號）之 片段的核：y：酸序列，其中該片段顯示出Hu_Asp2(a)或 Hu-AsP2(b)之特徵性的天冬胺醯基蛋白酶活性：以及在嚴 格的雜交條件下，與選自包括序列識別丨號和序列識別3號 之編碼Hu-AsP2的多核甞酸雜交之多核苷酸的核站酸序列 。本發明亦企圖使用根據本發明確認爲Hu-Asp2之抑制劑的 製劑，‘製造用來治療早老性癡呆徵候群的藥物。 前段描述了使用本發明之肽受質，或使用包括該妝之多 月太，來確認天冬胺醯基蛋白酶活性之調節劑的方法。關於 這些方法t的每-個，較佳的具體實施例包括合成一種以 上已經確認爲天冬胺醯基蛋白酶抑制劑之調節劑的額外步 驟。在較佳的變化中，該方法尚包括在藥學上 之稀 釋劑、佐劑或載劑中合成含有該調節劑的組合物^方法 尚可視需要包括將該組合物投與哺乳動物二 該哺乳動物中抑制天冬胺醯基蛋白酶的活性：’.水，以 ___ _____ - 17- 尺度賴巾㈣家縣(CNS M4規格（270^297^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1T • i -1 -I « . 、16 、 20 75 、 80 、 180 、 190 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 1316960 Α7 Β7 五、發明説明（15) 此外’本發明亦期待進行β -促泌酶測定的套組，包括與β _ 促泌酶酵素包裝在一起的本發明之β_促泌酶受質肽。在特 定的具體實施例中，該β -促泌酶受質可以是本發明之融合 多肽。更多的具體實施例期待該套組可包括檢測該肽或融 合蛋白質之切開作用的試劑。本發明亦描述其他較佳的肽 ’其包括具有序列SEISY-EVEFR(序列識別152號）的至少10 個胺基酸。亦期待包括緊接在SEISY-EVEFR(序列識別152 號）之羧基-終端，及/或緊接在SEISY-EVEFR(序列識別152 號）之胺基-終端的3、4、5、1〇、12、15、20、25、30、35 ' 40 、 45 、 50 ' 55 、 60 、 65 、 7〇 、 75 、 80 、 85 、 90 ' 95或 I 0 0個胺基酸的肽。較佳的肽可以是丨〇、1 3、1 、25 、 30 、 35 、 40 、 45 、 50 、 55 、 60 、 65 、 70 85、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170 、200個胺基酸或更長。 從本申請案的全部中，包括附圖和詳細説明，本發明的 其他特徵和變卩，對熟諳此藝纟而言將是明顯的，並希望 使所有的這類特徵成爲本發明的觀點。同樣的，可將在本 文中描述的本發明之特徽，五_说χ h _ _ 级再度併入頚外的具體實施例中 ，亦希望使其成馬本發明的飽I处，么、 丨的覜點，揲論所併入之特徵，在 上文t是否以本發明之觀點或具體實袍例特別提及。再者 ’僅應回頋在本文中由於對木發明具有決定性而加以描述 的這類限制；並希望使由於並重要，峰T p 叫7…、！要性不足以在本文中加以 描述’且缺乏限制的本發明之樂化占Λ 货乃乙文化成馬本發明的觀點。 除了前述的之外，另—士品 ,.. 另万面，本發明亦包括在任何方面 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂------線----Γ
j316960 ，比在上文中特別提及之變化範圍更窄的所有本發明之具 體實施例。雖然申請者（們）創造了附錄之申請專利範圍的 疋整把圍，但附綠之申請專利範圍不希望將其他人的先前 技藝之工作包括在其範圍内。因A，條若在申請專利範圍 内的法定之先前技藝，引起專利辦公室之申請者，或其他 貫體或個人的注意，本申請者（們）保留在適用的專利法律 下行使修正權利的權禾j，以便再定義這類申請專利範圍的 主題，明確地從這類申請專利範圍的範圍中，排除這類法 足之先則技蝥或法定之先前技藝的明顯變化。希望由這類 經過修正之"專利範圍定義的本發明之變化，成爲二 明的觀點。在下文中提出的詳細說明，提供本發明較佳4 具體實施例，《企圖作爲解釋之用，因爲在本發明範圍内 的變化和修改，總而言之q乃可能提供在本發明精神内的 具體實施例。 圖式簡單説明 下列Θ圖片形成本說明書的一部分，並包括於其中，以 便進一步證實本發明之觀點。可藉著參考圖片，連同在本 又中提供之特定具體實施例的詳細說明，更徹底地瞭解本 發明。 圖1A至圖1D，敘述本發明之代表性融合多肽（序列識別 128號）相鄰的、完整的序列，以及編碼該多肽的核苷酸序 列（序列識別127號）。以正常的字體顯示從MLLL(序列識別 44號）_ · •至D A AHPG(序列識別4 5號）之分泌性鹼性磷酸:二 冗整搶碼序列。以斜體罕茚刷衍生自胰島素鏈，帶有經 -19- 本紙張尺度通财㈣家標準（CNS ) A4規格（2H^X 297公楚)~ __ ---------i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --訂-- 線 —— 經濟部中央搮隼扃員工消资合作社印製 A7 B7 1316960 五、發明説明（J ) 過修改之β-促泌酶切開位置的序列。將得自Asp2 454-477 的穿透膜功能部位加下標線。DYKDDDK(序列識別1 14號） 則是flag標籤序列。 圖2敘述在以細胞爲基礎的測定中，提出爲Asp2之受質的 嵌合體。以"ecto”標示的部分意指外功能部位，以"endo” 標示的部分意指内功能部位，而以”memb”標示的部分則意 指嵌合型蛋白質的膜功能部位。 圖3含有敘述藉著β-促泌酶加工APP之西方墨點分析的 影像。以wt-APP或不同的突變種APP DNA構築體轉移感染 表現高程度Asp2的穩定HEK-293細胞株。在轉移感染48小 時之後，藉著西方分析分析細胞萃取物。使用認得人類APP 之C-終端的抗體C8來檢測全長的APP及其加工產物。藉著 CTF99的產生，或CTF99超過CTF83之比例來判斷β-促泌酶 活性。 較佳具體實施例的詳細説明 早老性癡呆徵候群是最主要的與年齡有關之障礙，常與 進行性癡呆一起，且其病理學特徵爲皮質萎縮和衰老斑的 沉積，以及神經元纖維纏結。該斑的主要組份爲40-42個胺 基酸長的肽，衍生自與ΑΡΡ相鄰之區域的Αβ，並含有全長 ΑΡΡ的一部份穿透膜功能部位。由於起因於β-和γ-促泌酶活 性之後續加工的結果，而產生該病理性肽。雖然已經廣泛 地追蹤這些酵素的身分，但蛋白質的精確身分仍是捉摸不 定的。然而，最近已累積了明顯的證據，暗示Hu-Asp2可能 是β-促泌酶活性的可能候選者。本發明提供可被Hu-Asp2 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210X297公釐） … 經濟部中央樣準局1貝i消費合作社印褽 1316960 7 A7 B7 五、發明説明（18 ) 切開的化合物、分子.或受質，並擔任Λ P P受質的代用品。 在下文中更詳細地提供製造和使用這些化合物的方法和組 合物。 I.新穎的Hu-Asp2之肽受質 本發明提供Hu-Asp2的受質。一開始，就Hu-Asp2的可能 受質來測試許多肽。藉著連字號分開在兩個胺基酸之間被 切開的肽： WKKGAIIGL-MVGGVVKK(序列識別 1 16 號）， ANL-STFAQPRR(序歹]識別 1 17號）， ΥίΙΥ(^5Η0ΥΑΡ-83νΕΚ：ίΙ^Η]^00(：(序歹 4 ΐ 我別 1 18號）， YRYQSHDY-AFSSVEKLLHLGGC(序列 ΐ我別 119號）。 在序列...KTITL-EVEPS.·.·(序列識別120號）中，Leu殘基 的C-終端側，亦切開（His)6泛素和融合蛋白質（His)6泛素 -CTAPIII。 然而，所有的這些受質，均以比相當於APP之Swedish突 變形式的肽：SEVNL-DAEFR(序列識別19號）更低的效率被 切開。有趣的是，氧化的騰島素B鏈是Asp2之受質，並以 可與SEVNL-DAEFR(序列識別19號）相比擬的速率切開。胰 島素B鏈的切開位置是在序列VEALY-LVC(SO)3GER(序列 識別1 2 1號）中的Tyr和Leu之間。亦測試其他以Glu代替磺基 丙胺酸的肽（VEALY-LVEGER(序列識別122號）），並發現其 被Hu-Asp2切開。使用這些觀察，發明者進行上文之 Hu-Asp2受質與其他已知之Hu-Asp2受質的進一步比較，説 -21 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝-----訂 A7 1316960 ______ B7 ___ 五、發明説明（19) 明有關於佔據和圍繞切開位置之特定胺基酸的資訊。 在本文中使用胺基酸的傳統縮寫，如下：丙胺酸’ Ala ，A :精胺酸，Arg ’ R :天冬醯胺，Asn，n :天冬胺酸，AsP ，D :半胱胺酸，Cys，C :縠胺醯胺，Gin，Q :穀胺酸， Glu，E ;甘胺酸，Gly，G :組胺酸，His，Η ;異亮胺酸， lie ’ I ;亮胺酸，Leu ’ L :離胺酸，Lys，Κ ;甲硫胺酸’ Met ’ Μ ;苯丙胺酸’ Phe，F ;脯胺酸，pro，p ;絲胺酸，Ser ，S ;蘇胺酸，Thr，T ;色胺酸，Trp，w ;酪胺酸，Tyr， Y ;纈胺酸，Val，V ;天冬胺酸或天冬醯胺，Asx，B ;穀 胺酸或縠胺醯胺，Glx ’ Z ;去甲亮胺酸，Nle ;乙醯基-甘 胺酸（Ac)G ;任何胺基酸’ xaa，X。按照在本文中的描述 ，亦可使用其他經過修改的胺基酸。例如C(S03)，意指磺 基丙胺酸。 在表1中敘述的肽，包括連字號，表示Hu-Asp2的估計切 開位置。 in . I I - - - - - -----! - I— . I : (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線 經濟部中央樣準局員工消費合作社印装 22 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210x 297公楚） 1316960 A7 B7五、發明説明（20 ) 肽序列 起源/身份 序列鑑定 SEVNL-DAEFR 促泌酶，A/? Swedish突變種序列 序列識別19號 SEVKM-DAEFR /3-促泌酶，A/5 正常的序列 序列識別20號 SEVN(Nle)-DAEFR β ·從泌酶，Αβ Swedish突變種 L—Nle 序列識別21號 (Ac)GSESMDSGISL-DNKW Casp-3前斷片 序列識別22號 WKKGAIIGL-MVGGVVKK 在A/?上切開 序列識別23號 ANL-STFAQPRR 新穎的序列 序列識別24號 ....EFRHDSGY-EVHHQKLVFF AE.... 在Ab上切開 序列識別25號 (請先閱讀背面之注意事項再填寫 寫本 •LTGKTITL-E VEPSDTI. (His)6 泛素-CTAPIII 序列 序列識別26號
FVNQHLC〇xGSHLVEALY-LVC〇x GERGFFYTPKA
GIVEQC〇XC〇XASVC〇XSLY-QLENYC〇XN
YRYQSHDY-AFSSVEKLLHALGGC
YRYQSHDYAF-SSVEKLLHALGGC
LVNM-AEGD
RGSM-AGVL
GTQH-GIRL
SSNF-AVGA 氧化的胰島素B鏈序列 氧化的騰島素A鏈序列 本發明的新穎序列 PS1 M2-Pro M2-Pro M2 序列識別27號 序列識別28號 序列識別29號 序列識別30號 序列識別31號 序列識別32號 序列識別33號 經濟部中央樣隼局員工消費合作杜印装
GLAY-AEIA HLCG-SHLV CGER-GFFY GVLL-SRK VGS-GVLL M2 氧化的騰島素B-鍵 的胰 V字型刻痕 V字型刻痕 序列識別34號
V-GSGV V字型刻痕 序列識別35號 _——-一 序列識別36^ 序列識別3 7號 — 序列識別38號 序列識別39號 序列識別40號 -23- 1316960 經濟部中央標準局員工消费合作杜印裂 A7 B7 五、發明説明（21) 當在本文中使用時’除非在本文中另行指磺基丙胺酸， cox和c(so3)意指氧化的半胱胺酸，這些名詞在本文和此項 技藝中可交替使用。應注意的是，在本發明之肽受質中任 何地方的特定殘基處使用磺基丙胺酸，則亦期待在該殘基 處包括半胱胺酸的其他受質。在較佳的具體實施例中，將 在序列識別3 6號和序列識別3 7號中的半胱胺酸氧化成磺基 丙胺酸。 使用 Schechter和 Berger (Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 : 157(1967)和 Biochem. Biophys. Res_ Commun· 32 : 898 (1968))的命名法來說明本發明之肽，其中以Pi __Pn定義在 肽受質中經歷切開的胺基酸殘基，從剪開的鍵結向N-終端 移動，以及P!'...Pn' ’其從剪開的鍵結向C-終端移動。因此 ，剪開的鍵結在肽亞單元的P,和P,'殘基之間，並在本文中 以在P丨和P丨'之間的連字號表示。 在是f效的Hu-Asp2受質之本發明肽中，Tyr/Phe* Leu 是在Pi位置處最豐富的胺基酸；Asn則在？2位置處出現數次 ;Glu、Asp和入13在P,1中是顯著的；而Val在P2,中經常出現. ;序列Glu-Val-Glu出現在泛素、其他Asp受質的Pi'P/P〆處 ;其他位置則未顯示有任何明顯的偏好。使用這些觀察， 在軋化的胰島素B -鏈之切開位置周圍進行胺基酸取代，尤 其是在P2-P3’處。 在表2中列舉的肽，是爲了 Hu-Asp2之受質活性而設計、 合成並進行測試的。在3 7°C，pH 4.5下，將每種受試受質 各200 μΜ與210 nM的Hu-Asp2酵素—起培養3小時。當然暸 -24- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）—~' 一~ " I — ：------------1T------^1# {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 A7 B7 五、發明説明（22 ) 解這僅是代表性的測定條件，熟諳此藝者將可改變這些條 件，而仍提供適切的Hu-Asp2活性。例如，想像在從大約4.0 到大約7.0之p Η値範圍中進行該測定。亦可改變加至特定反 應混合物中之酵素的含量，且熟諳此藝者將能夠進行測定 ，限定特定測定所需之最佳酵素濃度，像是加入1 50 nm ; 200 nm ; 2 50 nm ; 3 00 nm，或更多或更少的酵素。亦可改 變受質濃度，而使得該測定可使用1 〇〇 μΜ，1 50 μΜ，200 μΜ ，250 μΜ，300 μΜ，3 50 μΜ，或更多或更少的任何特定之 受質。有可能某一個受質在一種濃度下產生最佳的活性， 而另一個受質則需要提供不同的濃度，才能產生最佳的切 開速率。然而，這類酵素測定條件的最優化作用，完全在 熟諳此藝者的領域中，且將不需要過度的實驗。 在下文的表2中，以” + ”號表示產生活性的受質，其中活 性越高，就提供越多的+號。藉著號表示未被Hu-Asp2切 開的那些受質。 表2 肽序列 活性 序列鑑定 KVEALY-LV(S〇3-)GER - 序列識別4 1號 WRRVEALY-LVEGERK + + 序列識別42號 KVEANY-LVEGERKK + 序列識別43號 KVEANY-EVEGERKK + + + + 序列識別5號 KVEANY-AVEGERKK + + + + 序列識別7號 KVEANY-DVEGERKK + 序列識別46號 KVEANY-AVEGERKK + 序列識別47號 KVEANY-AVEGERKK + 序列識別48號 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS> A4規格（210X297公釐） A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 1316960 ______ Β7__ 五、發明説明（23) 從上文列舉的假定受質中，選出KVEANY-EVEGERKK( 序列識別5 ?虎）進行進一步的研究。特別將Cys插入R和KK之 間，產生肽KVEANY-EVEGERCKK(序列識別6號）。該肽爲
Hu-Asp2的良好受質。在額外的步驟中，將該肽的Ν_終端 生物素基化，並藉著在Cys殘基處共價附接俄勒岡綠製造螢 光。在下列的條件中測試所得的化合物，生物素 -KVEANY-EVEGERC(俄勒岡綠）KK(序列識別 49號）：10 μΜ 受質’ 50 ηΜ酵素，在3 7°C下。容許該反應進行2小時，並 取回試樣數次。分別以在1 5、3 0、6 0和1 2 0分鐘之後發生2 0 % 、3 7%、57%和82%切開來顯示結果。質譜分析顯示切開作 用僅發生在Tyr和Glu之間。顯示新的生物素基化之螢光肽 所具有的Vmax和Km値，爲對先前的衍生自Swedish突變種 肽之生物素基螢光受質觀察到之値的至少兩倍。 爲了額外的修改，分別選擇出現在序列識別5號和序列識 別7號之位置Ρ^-Ρ^處的EVE和AVE序列（表2)。因爲在發展 螢光受f生物素-KVEANY-EVEGERC(俄勒岡綠）KK(序列 識別49號）的案例中，選擇EVE序列作爲修改的起點。在十 肽KTITL-i-EVEPS(序列識別120號）的情況中，特別選擇 EVE序列，因爲在該十肽中的胺基酸序列，是包含在泛素 中找到之切開位置L-丄-E的一股十個胺基酸之精確模仿物 (參見在表1中的序列識別26號）。 -26- 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΙΟΧ2Ή公埯） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1316960 五、發明説明（24) 表3.以在泛素中之切開位置爲基礎，Asp2的受質最優化作 用 肽 肽序列 (序列識別號） 切開+的相對速率 APP-Sw SEVNL- | -DAEFR (序列識別19號） 100 APP-野外型 SEVKM- i -DAEFR (序列識別20號） 2.Γ 泛素(肽1) KTITL-1-EVEPS (序列識別120號） 13.1 肽2 KTINL- i -EVEPS (序列識別133號） 92.0 肽3 KTINnle- i -EVEPS (序列識別134號） 92.6 肽4 KTINnle- i -EVDPS (序列識別135號） 93.6 肽5 KTINnle-1 -DVDPS (序列識別136號） 12.2 肽6 KTISL-1 -DVEPS (序列識別137號） 69.0 肽7 KTISL- i -DVDPS (序列識別13 8號） 20.5 nle =去甲亮胺酸 +測定條件爲200 nM酵素和200 μΜ受質，300 mM乙酸鈉， 4% DMSO，在 pH 4.5，37°C 下 4 小時。 (請先閱請背面之注意事項再填寫本頁 -裝 頁) 訂---- 線 24小時反應 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 除了在PT-PJEVE)位置的修改之外，亦可在P2-Pi位置進 行修改。建構KTITL-丄-EVEPS(序列識別120號）的六個變 體，並將其作爲Asp2受質之活性，與Swedish突變肽，序列 識別1 9號，和野外型肽，序列識別20號所示之活性相比較（ 表3)。具有序列識別120號之序列的泛素-衍生之肽，比野 外型肽，序列識別20號更好六倍，但僅爲Swe-dish突變種 -27 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公缝） A7 1316960 _ B7 五、發明説明（25) ，序列識別丨9號所示之活性的大約1 3 %(表3)。然而’以As η 取代Ρ2的Thr，產生具有序列識別I 3 3號之序列的肽，其具 有類似Swedish突變種，序列識別1 9號之活性。以非天然的 胺基酸去甲亮胺酸’取代在肽#2序列識別1 3 3號之位置P ! 處的L e u (肽# 3 ;序列識別1 3 4號），得到類似S w e d i s h突變種 的活性。亦極完全地容忍以Asp取代在肽#3序列識別1314號 之P3'處的Glu(肽#4 ;序列識別135號）。然而，以兩個Asp 殘基取代在肽序列識別134號）中位置Ρ,’和p3'處的兩個 Glu殘基的突變，得到肽#5(序列識別136號），降低活性大 約10倍。藉著將絲胺酸殘基放在P2，並將Asp放在位置P,， ，修改肽#1，序列識別120號，得到KTISL- -DVEPS(肽#6 :序列識別1 3 7號）。完全容忍該雙取代作用，得到比野外 型肽更高大約35倍的活性，以及Swedish突變種序列識別19 號之活性的69%。然而’當將Asp放在肽#6(序列識別137號 )之P3'位置處’代替G1 u時’得到肽# 7 (序列識別1 3 8號），實 質上使性滑落。如同對肽#5(序列識別1 36號）所觀察到的 ，在位置Ρ〆和Ρ3'處的Glu殘基，更優於在相同位置的ASp殘 基0 上述的Asp2受質之最優化作用，將Asn留在p2(表2和3) 。這對於在活體外的測定而言是可接受的，因爲是在騰島 素B -鏈和泛素的情況下進行最優化作用。然而，在一也情 況下’將希望利用APP序列的最少瓦解，發展以細胞爲基 礎的測定。爲了這個目的，涉及改變胰島素B_鏈和泛素序 列的研究，關於位在和接近AsP2之β-促泌酶切開位置之胺 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝IAW-----訂------線-▲ 輕濟部中央樣準局員工消費合作社印聚 -28- 1316960 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（26 ) 基酸的影響，以及其對由該酵素加工APP之作用的影響， 已經產生大量的資訊。可使用該資訊修改在序列SEVKM_ i -DAEFR(序列識別2〇號）/SEVNL_丄_daefr(序列識別19 號）（野外型/Swedish突變）中的ρ2_ρ2ι殘基，並產生改變最少 的APP形式，其極易受到卜促泌酶切開的影響。這類受質在 以細胞爲基礎之APP加工、Αβ產製和促泌酶調節作用的 測定中，以及任何其他可能使用野外型或突變種Αρρ的測 定中將是有用的。 使用上文的原理’發明者更進—步探討在Appi ρ2位置 處的殘基，發現在本發明之Asp2受質中，絲胺酸是Lys/Asn 的良好代替品。因此，在特佳的具體實施例中，在本發明 之受貪中位置P2處的胺基酸是絲胺酸。因此，以…S γ_丄 -ΕV...(序列識別140號）代替在Αρρ中β_促泌酶切開位置周 圍的四個胺基酸’也就是....KM-丨-DA··..(序列識別139號） ’產生肽SEVSY-丄-EVEFR(序列識別141號），其以比在野 外型中^到的速率更高70倍的速率，被Asp2水解。 因此，發明者已經藉著將四個胺基酸…NL_丄_DA ·(序列 識別142號），其包括在ΑΡΡ Swedish突變中的β-促泌酶切開 位置，改變成…SY- i -EV.…(序列識別141號），而產生優於 Swedish突變肽的受質（對於β_促泌酶切開作用）。該發現提 供了產製改變最少之ΑΡΡ的方法，其極易受到β-促泌酶切開 的影響，並因此成爲用來改良測試Asp2之抑制劑、以細胞 爲基礎之測定的基礎。 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝' 訂 經濟邡中夹槔準局員工消费合作社印装 1316960 a7 1 B7 ' -1.1 立、發明説明（27 ) 表4. Asp2之受質最優化作用，合併所有可利用的資訊 肽序列（序列之列號） SEVNL-丄-DAEFR(序列識別I9號） 100.0 ^~~~— SEVKM- j -DAEFR(序列識別 2〇號） 2.Γ ~~~~~- SEVSY- j -DAEFR(序列識別 I43 號） --- 18.3 SEVSY- i -EAEFR(序列 t我別 144號） ，--^------ 77.1 SEVSY-卜EVEFR(序列識別141號） ----—. 141.8 +測定條件爲200 nM酵素和200 μΜ受質，在pH 4 5，37ΐ; 1小時。 >24小時反應 在表4中，比較利用三個新近合成之化合物、野外型和 Sewdish突變種的Asp2活性。SEVS Y- i -DAEFR(序列識別 143號）活性具有勝過野外塑大約9倍的增加，但仍比 Swedish突變種序列識別19號低大約5倍。以SY-丄-E取代三 聯體KM-丄-D，得到SEVSY-丄-EAEFR(序列識別144號）， 產生勝過野外型40-倍等級的活性改良，並具有可與 Swedish突變種可相比擬之活性。當以SY-丄-EV(序列識別 1 40號）取代在野外型肽之活性位置處的四個胺基酸KM-丄 -DA(序列識別139號），得到序列SEVSY- j-EVEFR(序列識 別14 I號）時，獲得勝過野外型接近70-倍的活性增加，以及 勝過S e w d i s h突變種1.4 -倍的增加。 · 此外，發明者產製額外的受質，更進一步改良受質 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 線 1316960 A7 B7 五、發明説明（28 ) SEVSY- | -EVEFR(序歹il識別14 I號）對Asp2切開作用的潛力 。在表6中概述結果。在一種策略中，特別藉著5 -、1 0 -和 15-個殘基延伸SEVSY- | -EVEFR(序列識別141號）的N-終 端。在這些延伸作用中所包含的所有胺基酸序列，均得自 APP的天然序列。 表6. A s p 2的受質最優化作用 肽序列(序列之列號） 切開的 相對速率 切開活性 微莫耳/分鐘/毫克 TRPGSGLTNIKTEEISEVSY-EVEFR (序列識別145號） 840 1.35 GLTNIKTEEISEVSY-EVEFR (序列識別146號） ND ND KTEEISEVSY-EVEFR(序列識別 147 號） 360 0.58 SEVS Y-EVEFR(序列識別 141 號） 100 0.16 TEVSY-EVEFR(序列識別 148 號） 160 0.27 SEVDY-EVEFR(序列識別 149 號） 240 0.38 TEVDY-EVEFR(序列識別 150 號） 230 0.37 TEID Y-EVEFR(序列識別 151 號） 390 0.62 SEISY-EVEFR(序列識別 152 號） 500 0.80 SEID Y-EVEFR(序列識別 153 號） 430 0.69 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 測定條件爲2 η Μ酵素和5 0 μ Μ受質，2 5 m Μ乙酸鈉，在p Η 4.4，37°C 下 2小時。 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 A7 A7 B7 五、發明説明（29) 有趣的是 ’ TRPGSGLTNIKTEEISEVSY-EVEFR(序列識別 145號）以比SEVSY-丄-EVEFR(序列識別Ml號）快8.4倍的 速率被切開’表6。而肽{<：丁已£18巳乂8丫-£乂£?{1(序列識別147 號）僅比SEVSY-丄-EVEFR(序列識別14 1號）長5個殘基，卻 以比後者更快3 _ 6倍的速率切開（表6)。在第二個策略中，發 明者在P位置修改SEVSY- i -EVEFR(序列識別141號），特別 是在P3-、P3和P i位置，以便增加對Asp2的活性。發明者使 用該策略，產生達到比在SEVSY- | -EVEFR(序列識別141 號）中觀察到之活性更高之活性程度的受質（表6)。本發明的 特佳受質爲SEISY-丄-EVEFR(序列識別152號），其中在 SEVSY-丄-EVEFR(序列識別141號）中，以lie代替在P3處的 Val。以lie取代Val的作用，導致活性增加5-倍。 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在位置P3中的胺基酸He，相當於泛素切開位置（參見表3) 。以表6的結果爲基礎，發明者預期SEISY-EVEFR(序列識 別1 52號）的N-終端延伸例如5至1 5個殘基，將導致活性實質 上的增加。這類延伸肽之的實例，包括但不限於 SEISY-EVEFRXKK(序列-識別 1541虎）;KTEEISEISY-EVEFRXKK( ή·歹ij i我別 155 號）;GLTNIKTEEISEISY-EVEFRXKK(序列識別 156號）；TRPGSGLTNIKTEEISEISY-EVEFRXFCK(序歹ij 識別 157號）；生物素-SEISY-EVEFRXKK( 序列識別158號）；生物素-KTEEISEISY-EVEFRXKKC序列識 另|J 159號）；生物素-GLTNIKTEEISEISY-EVEFRXKK(序歹'J ΐ我 別 160號）；生物素-TRPGSGLTNIKTEEISEISY-EVEFRXKK( 序列識別161號），其中X爲色胺酸，以及SEISY-EVEFRXICK( -32 - 本紙張尺度適用t國國家樣準（CNS ) A4規格（2IOX 297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（3〇 ) ；ffili^^l62^):fCTEE[SE[SY-EVEFRXKK(；f9ji^Ml63 號）：GLTNIKETTISEISY-EVEFRXKK(序歹ij 一識別 164 號）； TRPGSGLTNIKTEEISEiSY-EVEFRXKK(序歹>j 1我別 165?虎）： 生物素-SEISY-EVEFRXKK(序列識別166號）：生物素 -KTEEISEISY-EVEFRXKK(序歹4 識別 167 號）；生物素 -GLTNIKTEEISEISY-EVEFRXKK(序歹j 識別 168號）：生物素 -TRPGSGLTNIKTEEISEISY-EVEFRXKK(序列 i线別 169 號） ，其中X爲俄勒岡綠或其他螢光部分。提供該揭示内容， 期待熟諳此藝者可修改並延伸任何在本文中揭示之肽受質 ，以便提供其他有用的A s p 2受質。 本發明其他較佳的肽，包括SEISY-EVEFRWKK(序列識 別190號）、GLTNIKTEEISEISY-EVEFRWKK(序列ΐ我別191 號）、生物素-KEISEISY-EVEFR(Cys-俄勒岡綠）KK(序列識 另192 號），和生物素-GLTNIKTEEISEISY-EVEFR(Cys-俄勒 岡綠）KK(序列識別193號）。在後兩個肽中，生物素有助於 利用鏈彳Ϊ;菌抗生物素蛋白捕捉，而俄勒岡綠提供螢光的發 出，超越從序列識別190號和序列識別1 9 1號之肽中色胺酸 發出的勞光。 在受質SEISY-EVEFRWKK(序列識別190號）和 GLTNIKTEEISEISY-EVEFRWKK(序歹ij 識別 191 號）中，月太 SEISY-EVEFRWKK(序歹ij識別190號）之10個M-終端的胺基 酸，與肽SEISY-EVEFR(序列識別152號）的那些相同。兩個 肽之間的差異爲在序列識別1 90號之肽中，出現色胺酸和兩 個離胺酸。SEISY-EVEFRWKK(序列識別190號）和SEISY- -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. « m ml «ικ · 訂 丨線 經濟部中央標隼局貝工消费合作社印製 1316960 at B7 五、發明説明（31) EVEFR(序列識別152號）對Hu-Asp具有可相比擬的活性，但 是螢光色胺酸的加入，增加了對HPLC測定的敏感性。此外 ，加入兩個離胺酸增加了溶解性。對SEISY-EVEFRWiCK( 序列識別 190 號）和 gltnikteeiseisy-evefrwkk(序列 識別1 9 1號）進行H u - A s p活性的測試。如同預期的，序列識 別191號之肽的活性比序列識別190號之肽的高很多。在這 兩個肽之間的活性差異，在4.0-4.6之pH値範圍内是特別戲 劇化的。尤其是，序列識別191號之肽高6.3-4.8倍。伴隨著 離子強度的增加，序列識別1 90號之肽的活性，比序列識別 1 9 1號之肽的活性更快地降低。藉著增加DMSΟ之濃度，來 抑制這兩個肽。在利用100 mM NaOAc/HOAc，pH 4_5進行 的研究中，序列識別190號之肽顯示185毫微莫耳/毫 克/分鐘，和Km = 86.7 μΜ，而序列識別191號之肽顯示 Vmax=1260毫微莫耳/毫克/分鐘，和Km = 43_l μΜ。如同預期 的’ Ν -終瑞的延長增加了活性。此外，從内部中止的肽受 質（MCA)Ac-SEVNL-DAEFRK(Dnp)RR-NH2(序列識別 195 .號）’在Swedish突變種APP之後製造的’包括β-促泌酶切開 位置’顯示Vmax=18毫微莫耳/毫克/分鐘，*Km = 7 μΜ。明 顯地’從序列識別19 5號之S w e d i s h突變肽至序列識別19 1號 ’在V m a X處達到7 0 -倍的改良。在H U - A S p抑制研究中，以及 在與從大腸桿菌包涵體中再折疊之重組Hi^Asp有關的研究 中’發展出序列識別190號和序列識別191號之受質是極有 價値的。 本發明之肽受質可以是任何長度的胺基酸，只要該胺基 -34 - 本紙張尺度適用中國國家棣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 .J— 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印袋 1316960 at B7 五、發明説明（32) 酸包括β-促泌酶切開位置即可，在序列識別19號：序列識 別20號：序列識別21號：序列識別26號；序列識別27號； 序列識別2 8號：序列識別3 1號：序列識別3 2號：序列識別 3 3號；序列識別3 4號·，序列識別3 5號：序列識別3 6號；序 列識別37號；序列識別38號·，序列識別39號和序列識別40 號的任何序列中，並未敘述該斤-促泌酶切開位置。該新穎 的Hu-Asp2之肽受質，長度最好是至少大約5個胺基酸，在 某些具體實施例中，本發明之新穎的肽可包括大約5、6、7 、8、 9' 10、 11' 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 、21 、 22 ' 23 、 24 、 25 、 26 ' 27 ' 28 、 29 、 30 ' 31 、 32 ' 33、34、35、36、37、38、39、40、45、50或更多個胺基 酸的相鄰胺基酸序列。 一般而言，可藉著基本主旨定義本發明之肽，其符合 Schechter 和 Berger 命名法，並包括 ; Ρ2Ρι-Ρ.'Ρ2'Ρ3'Ρ4' ； Ρ3Ρ2Ρ,-Ρι，Ρ2,Ρ3, ； P3P2Pi-P,,P2'P3,P4，； ，其中卩2爲帶電荷 的胺基酸、極性的胺基酸，或脂肪族的胺基酸，但並非芳 香族的；P i爲芳香族的胺基酸或脂肪族的胺基酸，但不是 極性的胺基Ss_或帶電荷的胺基酸；P,1是帶電荷的胺基酸、 脂肪族的胺基酸或極性的胺基酸，但不是芳香族的胺基酸 ;P21是脂肪族的極性胺基酸或芳香族的胺基酸，但不是帶 電荷的胺基酸：P3'最好是帶電荷的胺基酸，但可以是任何 .其他的胺基酸：P3是極性的胺基酸、脂肪·族的胺基酸或芳 香族的胺基酸’但不是帶電荷的胺基酸；p4是帶電荷的胺 -35 - i紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2_10X 297公緣) · ---- —U-------裝-ml—^—訂-----丨線一φ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印袈 1316960 A7 B7 五、發明説明（33 ) 基酸、極性的胺基酸或脂昉族的胺基酸’但不是芳香族的 胺基酸：而P4’最好是芳香族的胺基酸，但可以是任何其他 的胺基酸。 最後，期待新穎的受質可包括Ρη...Ρ|_Ρ|，· pn,之序列。肽 的長度可以是任何長度，只要該受質包括可被Hu_Asp2切開 的β-促泌酶切開位置即可。由n定義之整數可以是任何整數 ’只要該受質包括可被Hu-Asp2切開的β-促泌酶切開位置即 可。同樣地’由η，定義之整數可以是任何整數，只要該受 質包括可被Hu-Asp2切開的β-促泌酶切開位置即可。期待ή 和η1可以是相同或不同的。該β -促泌酶切開位置最好能夠被 由序列識別1號或序列識別3號之核酸序列（包括其成熟形 式和具有生物活性之片段）編碼的人類天冬胺酿基蛋白酶 切開。 芳香族的胺基酸、帶電荷的胺基酸、脂肪族的胺基和極 性的胺基酸等名詞，均爲熟諳此藝者已熟知的，且其在本 發明中Θ用法與該項技藝之名詞一致。例如，芳香族的胺 基酸爲笨丙胺酸、酪胺酸和色胺酸，帶電荷的胺基酸（在生 理學之pH値下）爲離胺酸、精胺酸、天冬胺酸、穀胺酸，有 時還有組胺酸，而極性的胺基酸爲天冬胺酸、穀胺酸、天 冬醯胺和穀胺醯胺，表現出脂肪族例鏈的胺基酸爲甘胺酸 、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、絲胺酸和蘇胺酸 〇 當考量位在P4、P3、P2 ' Pi、IV、P2,、P3,或iV之任何位 置處的特定胺基酸時，考慮在按照在本文中之描述’已知 -36 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公瘦) ---------批衣.^-----II——-----^-—0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本莧) 1316960 A7 B7 五、發明説明（34 ) 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印袈 爲有效Hu-AsP2受質的肽中，每個位置之胺基酸的疏水指數 ，並以一個具有類似疏水指數的胺基酸取代特定的胺基酸 ，可能是有用的。已接受胺基酸之相對疏水特徵貢獻了所 得之蛋白質或肽的二級結構，其轉而定義該蛋白質與其他 分子，例如酵素、受質、受體、DNA、抗體 '抗原及其類 似物的交互作用。已經以胺基酸的忌水性和電荷特徵爲基 礎，指派每個胺基的疏水指數（Kyte & Doolhtle，J. Mol. Biol.，1 57(1): 105- 1 32，1 982,以引用的方式併入本文中） 。通常，胺基酸可被另一個具有類似疏水指數或分數的胺 基酸取代，而仍產生具有類似生物活性的蛋白質，也就仍 獲得具有相等之生物功能的蛋白質或肽。在本發明之肽的 情況下’具有相等之生物功能的蛋白質或肽，將是仍可以 超過包括序列識別20號之天然APP肽的切開速率之速率， 被/5 -促泌酶切開的蛋白質或肽。 此外，亦可以親水性爲基礎，有效地進行類似胺基酸的 取代作爾。美國專利第4,554,101號，以引用的方式併入本 文中’陳述蛋白質的最大局部平均親水性，係由其相鄰胺 基酸的親水性支配，與該蛋白質之生物特性有關連。胺基 酸本身可被具有類似親水性値的其他胺基酸取代，並仍獲 得在生物學上相等，且在免疫學上相等的蛋白質。 -37- 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 訂 1316960 A7 B7 五、發明説明（35
表7敘述在每個位置P4、P3、P2、P!、Pi，、P，，、 處將有用的代表性胺基酸 P 卩.;'和 P4
Pi
Pi' P2' P3'
B
E
A
Y
E
V
E
F B2B4
G
D
V
L
L
A
A
G
W
K
M
D
N
F
G s
Nle
M
T
B
T
H
G
F
Q
L H C*
Λ H (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) B6
C
Y
T
H
S
F b7
S
T
D
G
S
P G B.
F
A
N B9
Q
S
B
E
E c代表績基丙胺酸 •裝-----訂-----—線 經濟部中央標準局員工消费合作社印装 想像可從上表中建構的肽，例如，其在位置P t處具有在 PI欄中之胺基酸B |至B7的任一個。因此在本發明的前後文 中，可能有用的特定受質包括 • ANY-EVEF(序列識別49號）；EV NY-EVEF(序列識別50 號）；EA—Y-EVEF(序列識別51號）；EAN.-EVEFC序列識 別 52號）；EANY-〇 VEF(序列識別 53 號）；ΕΑΝΥ-ΕΛ EF(序 列識別54號）：EANY-EV—F(序列識別55號）；EANY-EVE △(序列識別56號）：_ VLL-AAGW(序列識別57號）：〇▼ -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（2丨〇X 297公釐） 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 1316960 a? B7 五、發明説明（36) LL-GW(序列識別58號）：GV— L-AAGW(序列識別59號）： GVL命-AAGW(序列識別60號）：GVL L-〇 AGW(序列識別 61 號）：GVL L-ΑΛ GW(序列識別 62號）：GVL L-AA— W(序 列識別 63號）；GVL L-AAG△(序列識別 64號）；.IKM-DNFG( 序列識別65號）；I ▼ ΚΜ-DNFG(序列識別66號）；II — M-DNFG(序列識別67號）：IIK^ -DNFG(序列識別68號）； IIKM-ONFG(序列識別69號）；IIKM-DAFG(序列識別70號） ;IIKM-DN—G(序列識別71號）；IIKM-DNF△(序列識別72 號）；.SSN1E-MTHA(序列識別 73號）；DT SN1E-MTHA( 序列識別74號）；DS —N1E-MTHA(序列識別75號）；DSS. -MTHA(序列識別76號）；DSSNIE-O THA(序列識別77號） ;DSSNIE-ΜΔΗΑ(序列識別 78號）；DSN1E0MT—A(序列 識別 79號）；DSN1E-MTHA (序列識別 80號）；.HGF-QLC^H( 序列識別81號）；TV GF-QLC^H(序列識別82號）；ΤΗ — F-QLC‘H(序列識別83號）；ΤΗΟ.-ΟΙΧ4!!(序列識別84號） ;THGF:〇LC’H(序列識別85號）；THGF-QAfH(序列識別 86號）；THGF-QL—Η(序列識別 87號）：THGF-QLC*A(序列 識別 88號）；.YTH-SFSP(序列識別 89號）；C<'TTH-SFSP( 序列識別90號）；C*Y — H-SFSP(序列識別91號）；C4YT> -SFSP(序列識別92號）；C^YTH-O FSP(序列識別93號）； C*YTH-A FSP(序列識別 94號）；C*YTH-SF—P(序列識別 95 號）；C*YTH-SFS△(序列識別96號）：.TDX-GSXG(序列識 別 97號）：SVDX-GSXG(序列識別 98號）；ST—X-GSXG(序 列識別99號）；STD^-GSXG(序列識別100號）；STDX-〇 -39- 本紙悵尺度適用中國國家捸準（CNS> A4規格（2i〇x297公釐） —i-------裝-m— · (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 1316960 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（37) SXG(序列識別1 〇 1號）·· STDX-G Λ XG(序列識別| 〇2號）： STDX-GS— G(序歹q識別1 〇3號）：STDX-GSX△(序歹_】識別1 04 號）：.FAX-XXXN(序列識別 1 05 號）：XV AX-XXXN(序列 識別106號）；XF — χ_χχχΝ(序列識別107號）；XFA ♦ -XXXN(序列識別1〇8號）；XFAX-OXXN(序列識別109號） ;XFAX-ΧΔΧΝ(序列識別1 10號）：XFAX-XX—N(序列識別 1 11號）；XFAX-XXX△(序列識別1 12號）；其中，'χ"爲任何的 胺基酸；””代表例如E、G、I、D、T、C*、S ; " 代表 例如 A、V、I、S、Η、Y、T、F ;"—"代表例如 N、L、K 、S、G、Τ、D、A、Q、Ε ;11代表例如 Υ ' L、Μ、Nle 、F、Η ; " ◊”代表例如 Ε、A、D、Μ、Q、S、G ;，，△，，代表 例如 V、A ' N、T、L、F、S ; I，—"代表例如 E、G、F、H 、C、S ;且代表例如 F、W、G、A、Η、P、G、N、S 、E。 本發明特佳的肽包括KVEANY-EVEFERKK(序列識別5 號);—KVEANY-EVEGERCKK(序列 i线別 6 號）； KVEANY-AVEGERKK(序列識別 7 號）；KVEANY-AVEGERCKK(序列識別8號）；EANY-EVEF(序列i线別9號） :GVLL-AAGW(序列識別10號）；IIKM-DNFG(序列識別1 1 號）；DSSNle-MTHA(序列識別 12號）：THGF-QLC*H(序列識 別 13號）：CYTH-SFSP(序列識別 14號）；STFX-GSXG(序列 識別 15 號）；XFAX-XXXN(序列識別 16號）；XXQX-XXXS( 序列識別17號）；以及XXEX-XXXE(序列識別18號）。 以上的敎導得以證實在確認Hu-Asp2之調節劑及/或Αβ -40 - (請先閲讀背面之注意事項真填寫本萸) -裝. 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210Χ 297公釐) 1316960 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 A 7 B7 五 '發明説明（38) 斑形成之調節劑的作用中，Hu_Asp2之肽受質將是有用的。 在下文中更詳細地說明上文_確認之受質及其變體的製造 和使用方法。 Π_新穎Hu-Asp2肽受質的衍生物 在本又中提供的Hu-Asp2受質肽，是建構衍生物有用的核 心結構。這類衍生物可以是融合蛋白質或肽，其包括作爲 其序到部彳刀的上文讨論之受質，或可將其加以標示，或 另行修改Hu-Asp2受質，其中可使用標示或修改，而有助於 該肽的純化、？亥肽本身的檢測，或在H u _ a s p作用時檢測該 肽文質之切開產物。在下文中更詳細地説明代表性的修改 〇 A.融合多肽 除了上述的新穎肽受體之外，本發明尚企圖產生上述的 或根據本發明確認之Hu-APs2受質的終端添加，亦稱爲融合 蛋白％[或融合多肽。該融合多肽通常具有全部或實質上部 份的天戎分子（也就是上文討論的Hu_Asp2肽受質），在N-及/或C-終端，與全邵或一部分第二或第三個多肽連接。企 圖藉著重組蛋白質產製，或眞的藉著在本説明書中另行討 論之自動肽合成，來產製融合多肽。 設計和製造融合蛋白質的共同原則，爲熟諳此藝者已熟 知的。例如，融合通常使用得自其他物種的前導序列，容 許蛋白質或肽在異種宿主中的重組表現。其他有用的融合 包括加入具有免疫活性的功能部位，像是抗體之抗原決定 位’而有助於融合多肽的純化。在融合接合處或其附近包 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公餐 --；--^-----装 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 A7 B7 經濟部中央標準扃貝工消费合作社印装 五、發明説明（39) 括切開位置，將有助於在純化之後移除外來的多肽。在木 說明書中另行詳細描述這些融合的重組產製。其他有用的 融合包括與有功能的功能部位連接，像是得自酵素之活性 位置、糖基化作用功能部位、細胞標靶信號或穿透膜區域 〇 更特定而言，本發明期待融合多肽，其中第—個組份包 括含有本發明之Hu-AsP2肽受質的Hu_Asp2切開位置，與包 括穿透膜功能部位的第二個组份附接。在額外的具體實施 例中，融合多肽尚可包括第三個組份，其包括報告者基因 產物。在更進一步的具體實施例中，融合多肽尚可包括附 加標蕺的序列組份。特佳的融合多肽是在細胞内之穿透膜 功能邵位序列的一邊，包括報告者基因產物，一股含有. Hu-Asp2切開位置的短序列，則利用ER/高爾基氏標乾信號 與穿透膜功能部位附接，而附加標籤之序列則位在穿透膜 功能部位的另一邊。 期待i切開位置與穿透膜功能部位之起點之間的距離約 爲20-40個胺基酸，以便模仿ΑΡΡ β促泌酶切開功能部位的 立體特性。該距離可從賦與穿透膜區域之蛋白質中產生， 或可藉著異種的肽交聯劑來創造它。該區域最好是得自穿 透膜蛋白質。融合多肽的穿透膜功能部位組份，基本上可 以疋任何的穿透膜功能部位·组份，其將是特定細胞的標乾 ’並位在該特定細胞的高爾基氏體或内質網。特佳的膜標 乾序列包括但不限於半乳糖基轉移酶的的穿透膜功能部位 (參見例如Genbank登錄編號AF 1 55582)、唾液基轉移酶的穿 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） --^-------¾.^-----ir------線·1· {請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 7 Α7 Β7 五、發明説明（4〇〉 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 % 透膜功能部位（參見例如G e η - b a n k登綠編號N M_0 0 3 0 3 2): 人類天冬胺醯基轉移酶1的穿透膜功能部位（Asp 1 :參見例 如Genbank登綠編號AF200342):人類天冬胺醯基轉移酶2 的穿透膜功能部位（Asp2 ;參見例如Genbank登錄编號 NM—012104);赛特辛6的穿透膜功能部位（參見例如 Genbank登錄編號NM_0058 19);乙醯胺基葡糖轉移酶的穿 透膜功能部位（參見例如Gen bank登錄编號ΝΜ_0 02406);以 及APP的穿透膜功能部位（參見例如Genbank登錄編號 A33292)。上文提供的Genbank登綠編號詳述了完整的蛋白 質序列。爲了本發明之目的，可使用這些蛋白質的全部或 部份穿透膜功能部位。在特定的具體實施例中，Asp2的殘 基454-477，APP(例如APP 695)的殘基598-66 1、半乳糖基 轉移酶的殘基4-27、Asp 1的殘基470-492、唾液基轉移酶的 殘基10-33、乙醯胺基葡糖轉移酶的殘基7-29，和赛特辛6 的殘基2 6 1 - 2 9 8，對此將是特別有用的。 在本番明之融合多肽中使用的報告者基因產物，可以是 熟諳此藝者常用的任何報告者蛋白質。代表性的報告者蛋 白質包括但不限於蟲螢光素酶；分泌性鹼性磷酸酶（SEAP) 經濟部中夬標準局貝工消费合作社印裝 ;β -半乳糖站酶；β -葡糖雷速酶；綠螢光蛋白質和氣黴素 乙酿基轉移酶。 其他特定的具體實施例更企圖使瞄準序列成爲本發明之 融合多肽的第四個組份。在本發明的情況下，有各種市售 的融合蛋白質表現系統’可用來提供瞄準序列。特別有用 的系統包括但不限於穀胱甘肽S-轉移酶（GST)系統 43- 本纸張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4规格（210X 297公釐） A7 1316960 ___B7_ 五、發明説明（41 )
(Pharmacia, Piscataway，NJ)，麥芽糖結合蛋白質系統（NEB (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Beverley, ΜΑ)，FLAG 系統（IBI，New Haven，CT)，以及 6x
His系統（Qiagen，Chats worth，C A)。這些系統能夠產生僅帶 有少量額外胺基酸的重組多肽，其不可能影響重組之融合 蛋白質的生物相關活性。例如，F L A G系統和6 X H i s系統僅 加入短的序列，已知兩者皆具有不佳的抗原性，且對於多 肽折疊成其天然構形並無不利的影響。企圖使用其他的N_ 終如！融合，在蛋白負或肤的N -終端區域融合Met-Lys二肽。 這類融合可在蛋白質的表現及/或活性上，產生有利的增加 。在本發明中企圖使用的特定瞄準序列’包括FLAG標籤序 列DYKDDDDK(序列識別186號）和APP的殘基662-695。 經濟部中央橾準局員工消費合作杜印製 本發明之較佳融合蛋白質的代表性實例，是其中將SEAp 與部份或全長的胰島素B-鏈融合者，其包括含有一個在本 文中描述之新穎Hu-Asp2受質的Asp2切開位置，以及 Hu-Asp2之穿透膜功能部位（殘基454-477)，連同短的、在 C-終端七加Flag-標籤的尾巴一起。在圖敘述代表性融 合多肽的序列（序列識別128號）。爲了監視嵌合型構築體被 Hu-AsP2切開的作用，該嵌合型構築體使用鹼性磷酸酶作爲 報告者蛋白質。因爲可在活體外之測定中被切開的肽，在 細胞條件中可能未與蛋白酶排成一直線，所以在SEAp和穿 透膜功能部位之間插入可經歷改變的序列，以便獲最佳的 條件。這類最優化作用可使用肽交聯劑，其將在報告者蛋 白質和切開位置之間提供最佳的距離。Hu_Asp2穿透膜功能 部位將確保有效地將以胰島素或泛素爲基礎的受質遞送至 -44 - 本紙浪尺度用中關家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐)" ；-- 1316960 Λ7 Β7 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 五、發明説明（42) 細胞的環境，在那裏其可結合有活性的H u - A s p 2，並被它切 開。 另一種設計使用得自APP的C -終端97個胺基酸，模仿其 天然的間隔和膜功能部位。基本上，該構築體將具有APP 穿透膜功能部位，和大部份的Αβ肽序列，除了切開位置從 KM-DAE(序列識別129號）突變成如同上述的pji-Pj'p/p， 序列之外。 當融合蛋白質在細胞株中與Hu-Asp2共同-表現，或在產 生較高H u - A s p 2活性之細胞株中表現時，H u - A s p 2將切開融 合多肽，將SEAP釋放至細胞培養基中。因此，可在培養基 中，以SEAP活性爲基礎來監視蛋白酶的活性。 如同在上文第I段中討論的，SEVSY-丄-EAEFR(序列識別 144號）和SEVSY- 1 -EVEFR(序列識別141號），是以APP之天 然結構突變爲基礎的本發明代表性Asp2肽受質。前者具有 可與Swedish突變相比擬的活性，而後者具有超越Swedish 突變的¥性》在SEVSY-丄-EVEFR(序列識別141號）的案例 中，在APP之β-促泌酶切開位置周圍的胺基酸，已經從 ...KM/NL- 1 -DA...(在野夕卜型序歹ij識別139號/Swedish突變 序列識別142號中），改變成...SY-丨.-EV....(序列識別14〇號） 〇 在本文中的實驗數據，指出上文-指示之在APP序列中僅 四個胺基酸的改變，將產生優異的APP-修改之Asp2受質’ 其在以細胞爲基礎的測定中，將產生可輕易測量的Αβ値（ 或其他可檢測的切開產物）。因此，想像序列SY- i _ΕΑ(序 -45- ——^— r,----裝 (請先K1讀背面之注意事項再填寫本 頁) 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（2丨OX297公釐） 經濟部中央樣準局員工消費合作.杜印» 1316960 at B7 五、發明説明（43) 列識別187號），或SY- ! -EV(序列識別丨40號）’或SY-丨-AV( 序列識別丨8 8號），或其類似物’與具有將融合蛋白質固定 在想要的細胞内膜，像是E R或高爾基氏體隔間上之能力的 序列融合。根據圖2之計劃，在以”1 ”標示的襴位之下，使 用序列SY-丄-EA(序列識別187號）、SY-丄-EV(序列識別14〇 號），或S Y-丄-AV(序列識別1 8 8號）來代替在圩外型APP中 的序列KM-丄-DA(序列識別139號）。在本文中的肽數據指 出，相對於天然A P P的切開速率，這#構築體將被β -促泌酶 迅速地切開。 圖2亦以共同的名詞，描述本發明以細胞爲基礎之測定的 Asp2嵌合型受質，其中在細胞内穿透膜斷片的外功能部位 上，使用諸如SE AP之類的報告者基因產物。在較佳的具體 實施例中，這類嵌合型蛋白質包括一股含有本發明之肽的 Asp2切開位置的短序列，在中央利用ER/高爾基氏體標乾信 號與穿透膜功能部位附接，並在膜的對側上有附加標蕺的 序列。 可藉著將SEAP與APP-CT99融合，獲得代表性的構築體 。按照在圖2中，在"2"之下來修改在SEAP和APP-CT99之間 的接合點，以便增加被A s ρ 2切開的作用。其他的構築體則 可以在X素中的切開位置爲基礎（圖2，" 3 "欄）。特別將s E A P 與利用Asp2之穿透膜功能部位（殘基454_477)和短c_終端 之Flag-尾延伸其C_終端的泛素融合。在該構築體中，修改 泛素的可切開序列KTITL- ! -EVEPS(序列識別120號），以 便增加切開作用。例如，藉著s取代在處的τ，並藉 -46 - 本今民張尺度適用f國國家標準（CNS )八4規格（21()χ297公餐） --------裝«I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 A7 B7 經濟部中央樣準局貝工消費合作.社印製 五、發明説明（44) 著Y取代在P,處的L。在圖2中每個欄位的隔壁，指出其他 可能的取代作用’並在本文中説明實驗的纟田節。 當使用泛素作爲融合蛋白質時，最好是將泛素C-終端的 殘基Gly-Gly改變成一些其他的胺基酸，以避免在泛素的c_ 終端之後，被泛素水解酶切開。Asp2穿透膜功能部位將確 保將感興趣的構築體有效地遞送至細胞的環境，在那裏它 將由具有活性的Asp2認出，並被其切開。當後者的融合蛋 白質在細胞株中與Asp2共同-表現，或在產生較高Asp2活性 的細胞株中表現時，Asp2將認出並切開該受質。該事件將 多肽（位在切開位置的N-終端）釋放至細胞培養基中，因此 容許蛋白酶活性的直接測定。 B ·其他的修改作用 除了提供業已描述的融合多肽之外，本發明亦提供進一 步修改’併入例如標記或其他可檢測部份的融合蛋白質或 肽受質。 較佳的肽受質，内部將包括中止標記，其在切開肽受質 之後’產生增加的可檢測性。可修改肽受質，使其附接成 對的螢光團和中止劑（quencher)，分別包括但不限於7_胺基 -4-甲基香豆素和2,4-二硝基g分，使得該肽被Hu_ASp切開時 ’因爲附接在剪開之鍵結兩侧的螢光團與中止劑的物理性 分離’而產生增加的螢光。其他成對的螢光團和中止劑， 包括波帝派（bodipy)-四甲基若丹明（rhodamine)和QSY-5 (Mo-lecular Probes，Inc.)。在該測定的變體中，可將生物素 或其他適當的標籤放在肽的一端，將肽固定在受質測定板 , -47- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X 297.公釐） --.--·-----裝·-----訂------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 a _ B7 立、發明説明（45 ) 上，並可將螢光團放在該肽的另一端。有用的螢光團包括 上文列舉的那些，和諸如W8044 (EG&g Wa丨丨ac’ inc)之類 的銪標記。較佳的標記是俄勒岡綠，可將其附接在Cys殘基 上。耠著Asp2切開肽，將從板中釋放出螢光團或其他標籤 ，谷坪藉著剩餘螢光的增加，顯示抑制Asp2蛋白水解切開 作用之待測定的化合物。Hu-Asp蛋白水解活性的較佳色原 測定，利用包括P2和基酸的其他適當受質，其包括經 由醯胺鍵結與鄰-硝基朌連接的切開認知位置，使得其被 Hu-Asp切開時，在將測定緩衝溶液改變爲鹼性？]9値之後， 導致光密度的增_力口。 此外，可使用熟諳此藝者已熟知的標記來標示肽，例如 ’特別期待生物素標記。這類標記的使用爲熟諳此藝者已 熟知的，並描述在例如，美國專利第3，8丨7,837號；美國專 經濟部中失樣準局貝工消费合作杜印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 利第3,850,752號；美國專利第3,996,345號和美國專利第 4,277,43_7號中。其他有用的標記，包括但不限於放射性標 .記、勞光_標記和化.學發光標記。關於這類標記之使用的美 國專利案，包括例如，美國專利第3,8 1 7,837號；美國專利 第3,850,752號；美國專利第3,939,350號和美國專利第 3,996,345號。任何本發明的狀，可包括一、二或更多個任 何的這些肽》 本發明特別期待的其他衍生物，包括不可水解的衍生物 ’像是本發明之β-促泌酶受質的抑胃酶胺酸（statine)衍生物 。含有抑胃酶胺酸的肽’因爲對天冬胺醯基蛋白酶具有抑 制作用而被認出（Shewale，J.G. : Takahashi，R. ; Tang，J.， -48 - 本紙·張尺度適用中國國家櫟準（CNS ) A4規格.（210x 297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（你 )
Aspartic Proteinases and Their Inhibitors, Kostka，V.编輯 ，Walter de. Gruy ter : Berlin (1986)第 101-116頁）。亦已經 描述組織蛋白酶D (Lin, T.-Y. ; Willi-ams, J. Biol· Chem. (1979)，254，1 1875-1 1883 ; Rich和 Agarwal，N.S·，J. Med. Chem. (1986) 29 (25 19-2524))和普拉斯普辛（plas-mepsin) (Silva, A.M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93，10034-10039)之抑胃酶胺酸抑制劑的實例。 抑胃酶胺酸是一種非-標準胺基酸殘基，出現在胃蛋白酶 抑制素中，並以化學名（3S，4S)-4-胺基-3-羥基-6-甲基庚酸 而爲人所知，並在Merck索引（第11版）專論8759中進一步確 認。抑胃酶胺酸是可輕易購得的，例如從Sigma-Aldrich (St Louis. M0)。在肽技藝中，抑胃酶胺酸的三字縮寫爲Sta。 可藉著在美國專利第4,3 97,786號中揭示的方法來製備抑胃 酶胺酸衍生物。在丁!^ Peptides，第 5册：Analysis，Biology ;(Academic Press, NY ; 1983); Kessler和 Schudok，Synthesis (6) 457-8 (1990) ; Nishi和 Morisawa，Heterocycles 29 (9)， 183 5-42 (1989)中描述了其他方法，分別以引用的方式併入 本文中。因此’熟諳此藝者將能夠使用這類技術，產生本 發明的抑胃酶胺酸衍生物。WO 00/77030描述了 β-促泌酶酵 素的抑胃酶胺酸-衍生之肽抑制劑，並特別以引用的方式併 入本文中，作爲敎導產製肽之抑胃酶胺酸衍生物的方法。 除了抑胃酶胺酸衍生物之外，許多其他的不可水解之肽 鍵結亦爲此項技藝中已知的，連同含有這類鍵結之肽的合 成程序。不可水解的鍵結包括“[ch2nh]--還原的'醯胺肽鍵 -49- 1 本紙張尺度適财S ®家鮮(CNS) A4规格(21GX 297公釐)' ' 1316960 經濟部中央榡準局員工消費合作钍印製
X 297公釐） A7 B7 五、發明説明（47) 結、”[COCH2]--酮亞甲基肽鍵結、—[CI_i(CN)NH]--(氰基亞 甲基）胺基肽鍵結、--[C Η2 C Η (〇 Η)]--超基伸乙基肽鍵結、 --[(：士0]--肽鍵結，以及--[(：^128] —硫代亞甲基肽鍵結（參見 美國專利第6,172,043號）。 111.天冬胺醯基蛋白酶 除了新穎的肽受質之外’本發明還針對在各種Hu_Asp2 測定中使用這類受質的方法。本段提供這些具有促泌酶 活性之蛋白質的討論。 PCT公告第WO 00/17369號，特別以引用的方式全部併入 本文中’描述關於確認和定出β促泌酶酵素之特徵的方法和 組合物，在本文中將其稱爲Asp2。此外，在1999年10月3 日建樓之美國專利申請案第09/416,901號，亦全部以引用的 方式併入本文中，其提供關於Asp2之性質、功能和特徵， 以及這些蛋白酶在AD中所扮演之角色的額外揭示内容。 這些孚利申請案描述了人類AsP2的兩個同功型，稱爲 Hu-Asp2(a)和Hu-Asp2(b)，可在本發明的情況下使用，以 及其片段、類似物、正類似物（orth〇l〇g)和變體。所有的這 邊开/式均可在本發明之情況下使用，而較佳的是最類似早 老性癡呆徵候群患者中之天然形式的形式。 在特足的具體實施例中，在本發明中有用的天冬胺醯基 蛋白酶是由序列識別1號或序列識別3號編碼的。預測序列 减引1號之核酸編碼序列識別2號的序列，其馬人類Asp-2(a) 的預測胺基酸序列。Asp2(a)胺基酸序列包括假定的信號肽 ’其包括殘基N2 1 ;以及在信號肽之後假定的前肽·原 50- ___ ^ L__ΙΓ1-I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 A7 B7_ 五、發明説明（48 ) (pre-propepride) ’其延伸至殘基45(藉著觀察在CHO細胞中 重組Asp2(a)的加工來評估），以及假定的前肽，以觀察grr i G S序列具有蛋白酶認知序列之特徵的觀察爲基礎，其可 延伸至至少大約殘基5 7。Asp2(a)尚包含穿透膜功能部位， 包括殘基455-477，細胞質功能部位，包括殘基478-501， 並在蛋白酶催化功能部位與穿透膜功能部位之間，包含假 定的α -螺旋間隔區，包括殘基420-454，咸相信其爲Asp2 之適當折疊所需的》預測序列識別3號之核酸序列編碼序列 識別4號之序列，其爲人類Asp-2(b)，預測的胺基酸序列。 Asp2(b)胺基酸序列包含假定的信號肽、前肽原和前肽，如 同關於Asp2(a)之描述。Asp2(b)尚包含穿透膜功能部位，包 括殘基430-452 ’細胞質功能部位，包括殘基453-476，並 在蛋白酶催化功能部位與穿透膜功能部位之間，包含假定 的α -螺旋間隔區，包括殘基395_429，咸相信其爲八5?2之 適當折疊所需的。當在本文中使用時，請瞭解所有提及之 ”Hu_Asp2”，意指Hu-Asp2(a)和Hu-Asp2(b)兩者。本發明亦 企圖使用經過分離或突變種Hu-Aspl、Hu-Asp2(a)和 Hu-Asp2(b)多肽’以及其顯示出天冬胺醯基蛋白酶活性的 片段。 在判定本發明受質之切開作用的代表性測定中，從High FiveT't蟲細胞來製備Asp2。一般而言，在酸性pH値（4.0 至5.0)之落液中，在25-37°C下’在以nM計或低於-毫微莫 耳農度之酵素的存在下進行測定。在適當的培養期間之後 ’在想要的時候藉著加入4%三氟乙酸（TF A)中止該反應。 __*51 * 本紙張尺度適用中81國家樣準（CNS ) A4規格（210X 297公廣) ~ — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 訂 線 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 經濟部中夬樣_局員工消费合作社印裝 1316960 A7 B7 五、發明説明（49 ) 使用逆相Η P L C分離受質和產物。藉著連續測量流出物在 2 2 Ο π Μ處的吸光度’ Si視受資的消失和產物的出現。此外 ，如果肽包括色胺酸殘基，可額外地或另外藉著連續監視 流出物之色胺酸螢光的螢光（在280 nM處激發，在248 nM 處放出）來監視之。單獨或除了生物素標記之外，包含俄勒 岡綠標記的本發明之肽，特別適用於高輸貫量的筛選。爲 了該目的，肽生物素-1<：£18日18丫-£乂£?11(€乂3-俄勒岡綠）1^( 序列識別192號）和生物素-GLTNIKTEEISEISY-(Cys-俄勒 岡綠）KK(序列識別193號），特別適合高輸貫量的篩選測定 〇 在代表性的測定中，在37°C下，在pH 4·5下，在〇·2乙酸 鈉中，以100微升之體積培養210 ηΜ酵素和220 μΜ受質1至 3小時。藉著加入50微升5% TFA，降低pH値至酵素的活性 範圍之下，使該測定中止。接著’將1 〇〇微升的該混合物注 射到裝設有預先以9 5。/。A (0 · 1 5 %在水中之T F A)、5 % B (0_15°/〇j乙腈中之TFA)平衡之Vydac管柱（4.6毫米直徑 X 1 50毫米 ’ 5微米）的 Hewlett Package型號 1090 HPLC 内。然 後利用下列的直線梯度· 0-1 5分鐘：5 - 5 0% B ; 1 5 -1 7分鐘
:50- 100% B ; 17-20分鐘：100-5% B ; 20-22分鐘：5% B ，從管柱中洗脱出成分。然後使用增強積分儀，定量切開 產物。 在上述關於序列識別1 9 0號之受質，或在序列識別1 9 1號 中敘述之其N-終端延伸版本之測定的變化中，以2〇〇微_升之 終反應溶液體積（雖然亦使用50-100微升的反應混合物），將 -52 - ^^^^度適财賴家標準（〔叫/\4規格（2丨(^ 297公慶) _ --i I.----------,1T------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本f > 1316960 Λ 7 _____ Β7 五 '發明説明（50 ) 受質與酵素一起培養，該終反應溶液由5_5〇 μΜ狀受質、 1-10 ηΜ酵素、〇·ΐ Μ乙酸鈉緩衝溶液，在ρΗ 4.5下所組成 。容許該反應在3 7X下進行1至3小時，並藉著加入1 〇〇微升 4% TFA使其中止。接著，將一等分5〇微升至1〇〇微升之混 合物注射到裝设有Alltech Cis 3 μΜ Rocket管柱（53毫米長 ，7毫米直徑，零件編號50605)的HPLC裝置（Agilent 1100 系列）内。從該管柱中洗脱受質的HPLC溶劑A爲0.1%在水中 之TFA ;溶劑B爲0.1%在乙腈中之TFA。然後以下列的直線 梯度從管柱中洗脱受質：時間〇 : 12%溶劑b ;時間4 30%溶 劑B ;時間6 50%溶劑B ;時間6.5 90%溶劑B ;時間7 12%溶 劑B :時間8 12%溶劑B。 除了 Hu-Asp之外，亦企圖證明本發明之受質可用於使用 其他天冬胺醯基蛋白酶的測定中，例如Asp 1、胃蛋白酶、 胃亞蛋白酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E和腎浩素。 IV.蛋白質或肽的產製和純化 本發明提供可用來確認Hu-Asp2之調節劑的蛋白質和肽 。可藉著傳統的自動肽合成法，或藉著重組表現，來產製 這類蛋白質或肽。 A.合成的肽產製 可根據傳統的技術，在溶液中或在固體支撑物上，合成 本發明之肽或甚至全長的融合多肽。各種自動合成器·是可 購得的，並可根據已知的草案使用。參見，例如Stewart和
Young, Solid Phase Peptide Synthesis，第 2 版，Pierce Chemical Co.，（1984) ; Tam等人，J. Am. Chem. Soc , 105 __-53- _ 本纸張尺度適用中aa家搮準(CNS) A4規格(21QX297公着) 一 - 1316960 A7 __B7 五、發明説明（51 ) ：6442, ( 1983) ; Merrifield, Science, 232 ： 34 1-347, ( 1986) ;以及 Barany 和 Marrifield, The Peptides, Gross 和 Mei.enhofer編輯，Academic Press, New York, 1-284，（1979) ’分別以引用的方式併入本文中。可迅速地合成本發明之 新穎的Asp2受質，其包括β_促泌酶切開位置，然後在 Hu-Asp2篩選測定中筛選之。 在特佳的方法中’可藉著使用得自Applied Biosystems Inc.之433A型的固-相技術’來合成本發明的肽。可使用逆 相HPLC分析’判定任何經由自動肽合成或經由重組方法產 生之特定肽受質的純度。可藉著任何熟諳此藝者已熟知的 方法’建立每個肽的化學眞實性。在較佳的具體實施例中 ’藉著如同在實例中描述之質譜分析來建立眞實性。 此外，亦可使用其中進行微波水解的胺基酸分析，來定 量肽°這類分析可使用微波爐，像是CEM Corporation的 MDS 20D0微波爐。使該肽（大約2微克蛋白質）與帶有大約 0.5%(體積對體積）之酚（Mallinckr〇dt)的 6 n HC1 (Pierce Constant Boiling，例如大約4毫升）接觸。在水解之前，先 另行抽2試樣，並以N2沖洗。使用兩個階段的方法進行蛋 白質水解。在第一個階段期間，使肽經歷大約1004C的反應 溫度’並保持在該溫度下1分鐘。在該步驟之後，立刻將溫 度升高到1 50°C，並保持在該溫度下大約25分鐘。在冷卻之 後’將試樣脱水’並利用6-胺基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞胺 基胺基甲酸酯衍生得自水解肽試樣的胺基酸，產生穩定的 月尿’其在395毫微米處發出螢光（Waters AccQ . Tag -54- 本紙張（度適财g圏家科(CNS)城格(勝297公董) - A7 1316960 ___ B7 五、發明説明（52 )
Chemistry Package)。可藉著逆相HPLC分析試樣，並可使 用增強積分儀完成定量。 B.重組的蛋白質產製 自動肽合成以外的另一種選擇，可使用重組的DNA技術 ’其中將編碼本發明之肽的核苷酸序列插入表現載體内， 轉化或轉移感染適當的宿主細胞，並按照在下文中的描述 ’在適合表現的條件下培養。重組方法對於產製包括本發 明之肽序列的較長多肽而言是特佳的。 從新穎之Hu-Asp2受質肽序列的揭示内容中，有可能藉著 重組技述來產製該肽和融合多肽。可利用各種表現載體/宿 主系統，來容納並表現該肤或融合多肢的密碼序列。這些 包括但不限於微生物，像是以重組P藍菌體、質體或枯接質 體DNA表現載體轉化的細菌；以酵母菌表現載體轉化的酵 母菌；以病毒表現載體（例如桿狀病毒）感染的昆蟲細胞系 統；以病毒表現載體（例如花椰菜花葉病毒，CaMV ;煙草 花葉病毒’ TMV)轉移感染，或以細菌表現載體（例如丁丨或 p B R 3 2 2質體）轉化的植物細胞系統，或動物纟田胞系統。可用 於重組蛋白質產製的哺乳動物細胞，包括但不限於V£R〇 細胞、HeLa細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞株、C0S細胞（ 像.疋 COS-7) ' WI38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCBC、 A549、PC12、K5 62和2 93細胞。在下文中說明在細菌、酵 母菌和其他無脊椎動物中’重組表現肽受質或融合多肽的 代表性草案。 在原核生物宿主中使用的表現載體，通常包括一或多個 — _ — -55- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） —·—•丨----裝n-----訂------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局員工消費合作.社印裝 --- 1316960 A 7 B7 五、發明説明（53 ) 表現型可選擇標記基因。這類基因通常編碼，例如賦與抗 生素抗藥性，或支持營養缺陷需求的蛋白質。各式各樣的 這類載體，可輕易獲自商業來源。實例包括pSPORT載體、 pGEM 載體（Promega)、pPROEX 載體（LTI，Bethesda, MD)、 Bluescript 載體（Stratagene)、ρΕΤ 載體（Novagen)和 pQE 載體 (Qiagen)。藉著PCR擴大編碼特定肽受質或融合多肽的DNA 序列，並選殖到這類載體内，例如pGEX-3X (Pharmacia, Pis cata way, NJ)，將其設計成可產生包括由該載體編碼之穀 胱甘肽-S-轉移酶（GST)，以及由插入該載體之選殖位置的 DNA片段編碼之蛋白質的融合蛋白質。可產製包括，例如 適當之切開位置的PCR引子。預期利用凝血酶或因子Xa (Pharmacia, Piscataway，NJ)處理重組的融合蛋白質，以便 切開該融合蛋白質，從GST部份中釋放出受質或含有受質 的多肽。將pGEX-3X/HuAsp2肽構築體轉化至大腸桿菌 XL-1 Blue細胞（Stratagene, La Jolla CA)内，分離個別的轉 化物，並使其生長。從個別的轉化物中純化質體DNA，並 使用自動定序器部份定序，證實以適當方位插入之核酸编 碼的想要肽或多肽的存在。 然而，本發明的某些具體實施例，企圖使用合成的肽合 成器和後續的FPLC分析來產製肽或多肽，並適當地再折疊 半胱胺酸雙鍵，期待亦可使用重組的蛋白質產製，來產生 肽組合物。例如，藉著使經過轉化的XL-1 B lue培養物，在 37Ό下，在LB培養基（補充有羧苄青黴素）中，在波長600 毫微米下生長至0.4之光密度，接著在0.5 mM異丙基β-D- -56- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（54 ) 硫代 p比喃半乳糖"^(Sigma Chemical Co.，St. Louis MO)的 存在下，進一步培養4小時，來完成GST/受質融合蛋白質的 誘導作用。 GST融合蛋白質，預期在細菌中以不溶包涵體之形式產 生，可如下來純化。藉著離心收獲細胞；以0.1 5 M NaCl，1 0 mM Tris，pH .8，1 mM EDTA沖洗；並在室溫下以0.1毫克/ 毫升溶菌酶（Sigma Chemical Co.)處理1 5分鐘。藉著超音波 振盪使該溶胞產物澄清，並藉著以12,000 Xg離心10分鐘使 細胞碎屑形成小球。將含有融合蛋白質之小球再懸浮於50 mM Tris，pH 8和10 mM EDTA中，在50%甘油上分出層次 ，並以6000 Xg離心30分鐘。將小球再懸浮於不含Mg++和 Ca++的標準磷酸緩衝之生理鹽水溶液（PBS)中。藉著在變性 的SDS聚丙烯酿胺凝膠（Sambrook等人，在前）中，分級分離 已經懸浮的小球，進一步純化該融合蛋白質。將凝膠浸泡 在0.4 M-KC1中，使蛋白質呈現，將其切除，並在缺乏SDS 之跑凝膠的緩衝溶液中進行電洗脱。如果在細菌中，以可 溶蛋白質的形式產生GST/HuAsp2融合蛋白質，則可使用 GST純化組件（Pharmacia Biotech)純化之。 可使融合蛋白質接受凝血酶消化，從成熟的HuAsp2受質 肽或含有HuAsp受質的多肽中切開GST。在室溫下培養該消 化反應（20-40微克融合蛋白質，20-30單位人類凝血酶（4000 單位/毫克（Sigma)，在0.5毫升PBS中）16-48小時，並裝在變 性的SDS-PAGE凝膠上，以便分級分離該反應產物。將該凝 膠浸泡在0.4 M KC1中，使蛋白質譜帶呈現。可藉著使用自 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 1316960 經濟部中央樣隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（55) 動定序器（Applied Biosystems 473A 型，Foster City，CA)的 邵份胺基酸序列分析，證實與Hu Asp2受質或融合多肽之預 期分子量一致之蛋白質譜帶的身分。 或者，可將编碼含有預測受質之融合多肽的DNA序列， 選殖到含有想要之啓動基因，並可視需要含有前導序列的 s 體内（參見’例如 Better 等人，Science，240: 1041-43, 1988) 。可耠著自動定序證實該構築體的序列。然後使用標準程 序’使用CaCh培養和細菌的熱休克處理（Sambr〇〇k等人， 在岫），將質體轉化至大腸桿菌内。使經過轉化的細菌在補 充有羧芊青黴素的LB培養基中生長，並藉著使其在適當的 培養基中生長，誘導表現蛋白質的產製。如果出現，前導 序列將影響成熟HuAsp2受質或融合蛋白質的分泌，並在分 泌期間將其切開。 藉著在全文中描述的方法，從細菌培養基中純化分泌的 重組蛋白質。 同樣地，可使用得自包括酵母菌屬（Sacchar〇myces)、畢 赤酵母屬（Pichia)和克魯維酵母屬（Kluver〇myces)的酵母菌 宿主細胞，來產製重組的肽。酵母菌載體通常將含有得自 2T酵學菌質體的複製起點序列 ' 自主複製序列叫 '啓 動基因區、聚腺菩酸化作用的序列、轉綠終止的序歹：，Z 及可遠擇標記基因。亦可使用可在酵母菌和大腸桿菌中複 製的載體（稱爲往返載體）。除了以上提及之酵母菌載體的 特徵之外，往返載體亦將含有在大腸桿菌中複製和選=的 序列。可藉著在編碼受質之核：y；酸序列的5，末端，包本編 LL：-----------IT------00. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -58 - 1316960 A7 __ B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（56 ) 碼酵母菌[-因子前導序列的核苷酸序列，達成在酵母菌宿 主中表現之多肽的直接分泌。 一般而T，可在酵母菌中使用市售的表現系統，例如 Pichia表現系統（invitr〇gen，San Dieg〇，ca)，依據製造者的 指示，以重組方式表現特定的受質。該系統亦依賴前-原_α 序列而直接分泌，但插入物的轉錄則是在藉著甲醇謗導時 ’由醇氧化酶（ΑΟΧΙ)啓動基因駕馭。 藉著例如從細菌和哺乳動物細胞上清液中純化受質所使 用的方法，從酵母菌生長培養基中，純化分泌的重組受質 〇 或者’可將編碼本發明之新穎受質的合成DNA，選殖到 桿狀病毒表現載體pVL 1393 (PharMingen，San Diego, CA ;Luckow和 Summers，Bio/Technology 6 : 47 (1988))内。然 後根據製造者的指示（PharM in-gen)，使用該含有受質之載 體來感染在不含sF9蛋白質之培養基中的秋黏蟲 (Spodoptera frugiperda)細胞，並產生重組蛋白質。使用肝 素-道脂糖管柱（Pharmacia, Piscataway, NJ)，和照分子大小 連續排列的管柱（Amicon, Beverly，MA)，純化並從培養基 中濃縮蛋白質或肽，並再懸浮於PBS中。S.DS-PAGE分析顯 示單一的譜帶，並證實蛋白質的尺寸，而在Proton 2090肽 定序器上的Edmaa定序，證實其N -終端之序列。 或者，可在昆蟲系統中表現HuAsp2受質。蛋白質表現的 昆蟲系統已爲熟諳此藝者所熟之。在一種這類的系統中， 使用苜蓿尺墁顆粒體病毒（Aiitographa California nuclear -59- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 線 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4规格（210X 297公釐） 1316960 A7 _____B7 五、發明説明（57~~) polyhedrosis virus)，作爲在秋黏蟲細胞中，或在夜蛾 (Trichoplusia)幼蟲中表現外來基因的載體。將受質密碼序 列選殖到遺病母的非必要區域，像是多面素（p〇lyhedrin)基 因，並置於多面素啓動基因的控制之下。受質的成功插入 ，將使多面素基因成爲失活的’並產生缺乏外殼蛋白質的 重組病毒。然後使用該重組病毒感染秋黏蟲細胞或夜蛾的 幼蟲’在其中表現該受質（Smith等人，J. Virol 46 : 584, 1983 ;Engelhard EK等人，Pr〇c Nat Acad Sci 91 : 3224-7，1994) ο 表現重組蛋白質的哺乳動物宿主系統，亦爲熟諳此藝者 已熟知的。可就表現蛋白質之加工處理，或產生某些將可 用來提供蛋白質活性之轉譯，後修改的特定能力，來選擇宿 主細胞品系。這類的多肽修改，包括但不限於乙醯化作用 、叛基化作用、糖基化作用、磷酸化作用、脂質化作用和 醯化作用。切開蛋白質之"前原"形式的轉譯_後加工；對於 正確的插入、折疊及/或功能，也可能是很重要的。不同的 宿主細胞’像是CHO、HeLa、MDCK、293、WI38及其類似 者，對於這類轉譯-後的活性，具有獨特的細胞機器和特徵 性的機制，並可加以選擇，以確保導入之外來蛋白質的正 確修改和扣工處理。 爲了長-期、高-產量的蛋白質產製，最好是使用經過轉 化的細胞’且希望本身穩定地表現。一旦以含有可選擇標 記連同想要之表現卡匣一起的載體轉化這類細胞，可容許 該細胞在豐富的培養基中生長丨-2天，之後再移至選擇性培 -60 -
A7 1316960 B7 五、發明説明（58 ) 養基中。設計可選擇標記，賦與對選擇的抵抗力，而它的 存在容許成功表現該導入序列之細胞的生長和回收。可使 用適合该細胞的組織培養技術’使具有抵抗力之穩定轉化 的細胞叢增殖。 關於重組蛋白質之產製’可使用許多選擇細胞，來回收 已經轉化的細胞。這類選擇系統’在tk_、hgprt-或aprt-細 胞中，分別包括’但不限於HSV胸腺核苷激酶、次黃嘌呤_ 鳥嘌呤轉鱗酸核糖基酶，和腺嘌呤轉嶙酸核糖基酶基因。 亦可使用抗-代謝產物之抵抗力，作爲選擇的基礎，關於dhfr ’其賦與對胺甲碟呤的抵抗力；gpt，其賦與對黴酚酸的抵 抗力；neo，其賦與對胺基糖：y： G4 1 8的抵抗力；ais，其賦 與對氣硫昂（chlorsulfuron)的抵抗力；以及hygro，其賦與 對潮黴素的抵抗力。其他有用的可選擇標記包括trpB，其 容許細胞利用吲哚來代替色胺酸，或hisD，其容許細胞利 用組胺—（histinol)來代替組胺酸。爲了確認轉化物而给與 視覺指示的標記，包括花青素站、β·尿甘酸酶及其受質GUS ，以及蟲螢光素酶及其受質蟲螢光素。 C _指定位置之突變生成作用 指定位置之突變生成作用，在製備個別的Hu-Asp2受質肽 ，更特定而言，以及包括作爲組份之本發明Hu-Asp2受質肽 的融合多肽上’是另一種有用的技術。該技術使用隱藏 DNA(其編碼爲修改作用之標靶的胺基酸序列）的指定突變 生成作用。A技術藉著將一或多個核：y：酸序列的改變導入 DNA中，更提供了製備和測試序列變體的便捷能力，合併 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l0 x 297公慶） ' {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部中央樣窣局員工消费合作社印装 1316960 經濟部中央標準局員工消费合作杜印裝 A7 B7 五、發明説明（59) 一或多個前述的理由。指定位置之突變生成作用容許經由 使用編碼具有想要突變之DNA序列的特定寡核苷酸序列， 以及足夠數目的相鄰核苷酸，產生突變種，以便提供具有 足夠尺寸和序列複雜性的引子序列，在待通過之刪除接合 點的兩邊形成穩定的雙股。通常，長度約爲1 7至2 5個核钻 酸之引子是較佳的，在待改變之序列的接合點兩邊大約5 至1 0個殘基。 技術通常使用以單股和雙股兩種形式存在的噬菌體載體 。在指定位置之突變生成作用中有用的代表性載體，包括 諸如ΜΠ噬菌體之類的載體。這些噬菌體載體是市售的， 且其用途通系爲熟請此藝者已熟知的。雙股的質體亦爲指 疋位置二突變生成作用例行所使用的，其排除了將感興趣 之基因從噬菌體移轉至質體的步驟。 叙而s，藉著首先獲得單股的載體，或融解在其序列 中包含垮碼想要蛋白質之DNA序列的雙股載體之兩股，進 行指定位置之突變生成作用。以合成之方式製備攜帶想要 疋哭變序列的寡核：y：酸引子。然後將該引子與單股的dna 製品黏接，在選擇雜交（黏接）條件時考量誤配的程度，並 經歷DNA聚合酵素，像是大腸桿菌聚合酶I kUn〇w片段，以 便冤成攜帶突變股的合成作用。因此，形成異形雙螺旋鏈 ，其中一股編碼原始未-突變的序列，而第二股則攜帶想要 的突變。然後可使用該異形雙螺旋鏈載體轉化適當的宿主 ，像是大腸桿菌細胞，並選擇含有攜帶突變序列排列之重 組載體的純種系。 ^ 裝·ΐτ------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -62- 1316960 A7 B7 五、發明説明（6〇 ) 當然，指定位置之突變生成作用的上述方法，不是唯— 產生可能有用之突變種肽物種的方法，且本身不意味爲其 限制。本發明亦期待其他達成突變生成作用的方法，像是 例如以諸如羥胺之類的致突變劑處理帶有感興趣之基因的 重組載體，以便獲得序列變體。 D.蛋白質純化 應希望純化本發明之肽。蛋白質的純化技術爲熟諳此藝 者已热知的。這些技術在一層面，涉及粗略地將細胞環境 分級分離成多肽和非-多肽的溶離份。從其他蛋白質中分離 本發明之肽或多肽’可使用層析和電泳技術進一步純化感 興趣的多肽或肽，完成部份或全部的純化（或純化成同質性 )。特別適合製備純肽的分析方法，是離子-交換層析法、 排阻層析法；聚丙締醯胺凝膠電泳；等電聚焦法。特別有 效之純化肽的方法是快速蛋白質液態層析法（FPLC)或高效 率液態層析法（HPLC)。 本發明的某些方面’係關於純化作用，並在特定的具體 實施例中，係關於編碼多肽、蛋白質或肽的實質純化作用 。當在本文中使用 '經過純化之多肽、蛋白質或肽，，一詞時 ’企圖意指從其他組份中分離出的組合物，其中相對於其 天然-可獲得之狀態，將該多肽、蛋白質或肽純化至任何程 度。因此’經過純化的多肽、蛋白質或肽亦意指不含可在 其中天然存在該多肽、蛋白質或肽之環境的多肽、蛋白質 或月太。 一般而言，"經過純化的，，將意指已經接受分級分雜，移 __ - 63 - 本紙張尺度逋用t固國家標準(CNS) A4規格(210X297公-：---- 1316960 A7 _ B7 經濟部中央橾孳局員工消費合作社印裝 五、發明説明（61 ) 除各種其他組份的多狀、蛋白質或肤组合物，且該組合物 實質上保留其表現之生物活性。在使用"實質上經過純化的" —時之處，該稱呼將意指組合物，其中多肽、蛋白質或肽 形成該組合物的大多數組份，像是構成在該組合物中，大 約5 0%、大約60%、大約70%、大約80%、大約90%、大約 95%或更多的蛋白質。 各種定量多肽、蛋白質或肽之純化程度的方法，從本發 明之揭示内容來看’均爲熟諳此藝者已知的。這些包括， 例如判定活性溶離份的比活性，或藉著SDS/PAGE分析評估 在溶離份中之多肽的含量。評估溶離份之純度的較佳方法 ’是計算該溶離份的比活性，將其與原始萃取物的比活性 做比較’並因此計算出純度的等級，在本文中藉著倍純 化數”來評估。用來代表活性含量的實際單位，當然將依據 所選擇遵循純化作用的特定測定技術，以及所表現之多月太 、蛋白質或肽是否顯示出可檢測的活性。 適用於蛋白質純化的各種技術，將是熟諳此藝者已熟知 的。這些包括，例如利用硫酸銨、PEG、抗體及其類似物 沉殿’或藉著熱變性作用，接著離心；層析步驟，像是離 子X換、凝膠過濾 '逆相、羥基磷灰石和親和力層析法； 等電聚焦作用；凝膠電泳；以及這類及其他技術的組合。 因爲是此項技藝中普遍已知的，咸相信可改變進行各種純 化步驟的順序’或可省略某些步驟，而仍產生適合製備實 質上經過純化之多肽、蛋白質或肽的方法。 並非普遍需要總是以其最大純化狀態來提供多肽、蛋白 ____ - 64 - 本紙張尺度適用中國國家標準（Cns ) Μ規格（21 〇χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 線 1316960 A7 B7 五、發明説明（62 ) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 質或狀。確實，預期實質上純化程度較差的產物，將在某 些具體實抱例中具有利用性。可藉著在組合中使用較少的 純化步驟’或藉著利用相同的一般純化計劃之不同形式， 疋成邵份的純化作用。例如，了解使用HPLC裝置來進行的 陽離子-父換官柱層析法，通常將導致比利用低壓層析系統 的相同技術更高 '倍”的純化。顯示出較低程度之相對純化 作用的方法，可能在蛋白質產物的總回收上，或是在維持 表現蛋白質之活性上具有利益。 已知可利用不同的SDS/PAGE條#，有時明顯地改變多肽 的私動（Capaldi等人，B10chem Bi〇phys ^ 義，％ : 425’ 1977)。因此，應了解在不同的電泳條件下，可改變經 過純化或部份純化之表現產物的明顯分子量。 V.用來產製本發明之受質的表現構築體 在本發明中’可能有必要表現本發明之肽受質或肽·受質 融合蛋白質。欲達成這類表現，本發明將❹包括编碼本 發明之肽受質或融合蛋白質之多料酸分子的載體，以及 利用這類載體轉化的宿主細胞。可將這類多核芬酸分子斑 載體連接，其通常包含可選擇標記和複製起點，以便在宿 ::繁殖。在下文中更詳細地描述在本發明中使用之表現 構築體的這些元件。 表現載體包含編碼任何上文或下文描述之特定肽或融合 多肽Hu-Asp2受質的DNA，以可操作之方t Τ 姑·^ . 万式與適當的轉錄或 轉澤調郎序列連接’像是衍生自哺乳動物、微生物、病 或昆蟲基因的那些。調節元件的實例包括轉綠欠動 ___-65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝一 訂 線 1316960 A7 _ B7 五、發明説明（63 ) 操縱基因或促進子、mRNA核糖體結合位置，以及控制轉 綠和轉譯的適當序列。 "表現載體"、"表現構築體"或"表現卡匣"等詞，在本說明 書中可交替使用，並意指包含任何類型之遺傳構築體，其· 含有編碼基因產物的核酸，其中能夠轉錄部份或全部的核 酸密碼序列。 爲了表現本發明之肽或多肽，選擇適當的表現載體，當 然將依據所使用的指定宿主細胞，並亦在熟諳此藝者的領 域内。適當之表現載體的實例包括pcDNA3 (Invitrogen)和 pSVL (Pharmacia Biotech) »在本發明中表現的較佳載體爲 pcDNA 3.1-Hygro (Invitrogen)。在哺乳動物宿主細胞中使 用的表現載體，可包括衍生自病毒基因組的轉錄和轉譯控 制序列。可在本發明中使用之常用的啓動基因序列和促進 子序列，包括但不限於衍生自人類細胞巨大病毒（CMV)、 腺病毒之、多瘤病毒和猿病毒40 (SV40)的那些》在例如 Okayama和Berg (Mol. Cell. Biol. 3 : 280 (1983)) ; Cosman 等人（Mol. Immunol. 23 : 935 (1986)) ; Cosman等人（Nature 3 12 : 768 (1984));歐洲專利- A-0367566號和 WO 91/1 8982 中，揭示了建構哺乳動物表現載體的方法。 表現構築體將包括编碼本發明之特定肽受質或融合多肽 的核酸區。在建構這類表現載體時所使用的密碼區，應該 至少編碼在本文中描述之肽的β -促泌酶切開位置，雖然期 待可編碼較大的多肽，只要其產生一個包括由天冬胺醯基 蛋白酶’且最好是Hu-Asp負責切開之β-促泌酶切開位置的 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準((：；1^3) Α4规格(210X297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（64 ) 月大即可。 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在本發明的某些方面，表現構築體尚可包括可選擇標記 ，其谷a午檢測该肽或多肽的表現。通常包含藥物選擇標記 ’協助轉化物的選殖和選擇，例如新黴素、嘌呤黴素、潮 黴素、DHFR、辛歐西（ze〇cjn)和組胺醇。或者，可使用諸 如單純疱疹病毒胸腺核：y：激酶（tk)(眞核生物）、半乳糖菩 酶、蟲螢光素酶或氣黴素乙醯轉移酶（CAT)(原核生物）之類 的酵素。亦可使用免疫學標記。可使用例如，抗原決定位 “藏’像是 FLAG 系統（ibi，New Haven, CT) ' HA和 6xHis 系統（Qiagen，Chatsworth, CA)。另外，亦可使用穀胱甘肽s-轉和酶（GST)系統（Pharmacia, Piscataway，NJ)，或麥芽糖結 合蛋白質系統（NEB，Be-verley，ΜΑ)。不認爲使用可選擇標 C是很重要的，只要它能夠與編碼基因產物之核酸同時表 現即可。可選擇標記的更多實例爲熟諸此藝者已熟知的。 在本發明中可使用的特佳之可選擇標記是新黴素抗藥性或 GFP標記。 經濟部中央橾準局員工消费合作社印裝 表現需要在載體中提供適當的信號。本段包括討論各種 調節元件，像是得自病毒和哺乳動物來源的促進子/啓動基 因’可在宿主細胞中使用它們來駕馭感興趣之核酸的表現 。亦定義計劃在宿主細胞中，使信使RN Α之穩定性和可轉 錄性發揮最大效用的元件。爲了建立表現產物之永久、穩 定的細胞純種系，亦提供使用一些優勢藥物選擇標記的條 件’像是連接該藥物選擇標記之表現的元件，以便表現突 變種表現型。 __ _ -67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐"i 1316960 Α7 Β7 經濟部中央檫準局貝工消費合作杜印製 五、發明説明（65) 在較佳的具體實施例中，編碼特定肽之核酸，或编碼可 選擇標記之核酸，是在啓動基因的轉綠控制之下。"啓動基 因"意指由細胞之合成機器認出，或引導合成機器，：動ς 因之指定轉錄作用所需的DNA序列。 讓序列以可操作的方式連接，此時調節序列在功能 上與編碼肽受質或融合多肽之DNA有關。因此，如果户欠動 基因核芬酸序列指揮某序列的轉譯，則啓動基因核^序 列便以可操作之方式與該特定的01^八序列連接。同樣的， 片語”在轉綠的控制之下"，意指啓動基因相對於核酸，是 在正確的位置和方位上，以便控制RNA聚合酶開始，以及 基因的表現。 在此處將使用之名詞”啓動基因"，意指一群轉錄控制組 件，其圍聚在RNA聚合酶II之起始位置四周。許多有關於 如何組織啓動基因的想法，衍生自數個病毒啓動基㈣分 析，包#HSV胸腺核苷激酶(tk)和SV4〇早期轉綠單位的那 些。這些研究，藉著近來的努力而加以擴大，已經顯示啓 動基因由不同功能的組件所構成，分別包括大約7_2〇個^ 基對的DNA，並含有一或多個轉綠活化劑或阻遏蛋白質的 識別位置。 在每個啓動基因中，至少有一個組件具有定出Rna合成 之起始k置的位置之功能。已徹底知曉的實例爲T a丁 a盒子 在二皂動基因中缺乏盒予.，像是哺乳動物的末 端轉脱氧核酶酶酶基因，和SV4〇晚期基因的啓動基因，一 個覆蓋起始位置的個別元件，本身幫助固定開始的地方。 -68 - — .------S-----IT------^#1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 A7
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（2⑹X297公釐） 1316960 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（67 ) 因’可在轉移感染或轉化之後，使感興趣之蛋白質的表現 程度和模式發揮最大效用。 選擇反應特定之生理學或合成信號而進行調節的啓動基 因’可容許基因產物的可誘導表現。爲了產製病毒的载體 ’可利用數個可誘導的啓動基因系統。一種這類的系統是 虫兑皮素系統（Invitrogen，Carl-sbad，CA)，將其設計成容許在 哺乳動物細胞中，調節感興趣之基因的表現。其由緊密調 節的表現機制所組成，幾乎不容許轉殖基因的基本程度表 現，但具有200-倍以上的誘導性。 其他有用的可謗導系統’是Tet-OffTM或Tet-0nTM系統 (Clontech，PaloAlto，CA)’最初是由 Gossen和 Bujard發展.的 (Gossen和 Bujard，Proc Natl Acad Sci USA. 15 ; 89 (12): 5547-5 1，1992 ; Gossen等人 ’ Science, 268 (52 18) ·· 1766-9, 1995)。 在哺乳動物細胞中，如果常使用CMV速發早期啓動基因 ’則提供強的轉綠激活作用。當想要降低轉殖基因的表現 程度時’亦已經使用效力較低之CMV啓動基因的修改版本 。期待逆轉綠病毒之啓動基因，像是得自ML V或MMTV的 LTRs，在本發明中是有用的。可使用的其他病毒之啓動基 因，包括SV40、RSV LTR、HIV-1 和 HIV-2 LTR、腺病毒啓 動基因，像是得自E1A、E2A或MLP區域的、AAV LTR、花 椰菜花葉病毒、HSV-TK和禽肉瘤病毒。 在一些具體實施例中，可調節之啓動基因可證實是有用 的。這類啓動基因包括例如爲荷爾蒙或細胞分裂素可調節 -70- 本紙張尺度適用中國國家標华< CNS > Μ規格（210X 297公麓) --- t--------^------IT------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 五、發明説明（μ ) 的那些。荷爾蒙可調節 . 基因包括mmtv、mt-i、蛻 u lsc〇 ’以及其他碕爾蒙調節的啓動基因，像是反 應〒狀腺'腦下垂體和腎上腺荷爾蒙的那些。 '企圖在本發明中使用的其他調節元件是促進子。這些促 進子是增加來自啓動基因之轉錄作用的遺傳元件，該戍動 基因係位在相同DNA分子上的不同位置。组織促進子非常 類似啓動基因。也就是説，它們由許多個別的元件所構成 ’分別與-或多個轉錄蛋白質結合。在促進子與啓動基因 之間的基本差別是在操作上的。總括而論，促進子區域必 須能夠刺激遠距離的轉綠；這不一定適用於啓動基因或其 組份元件。換句話説，啓動基因必須具有一或多個元件 其在特定的位置並以特定的方位，指揮成開始，而 促進子則缺乏這些特異性。啓動基因和促進子通常是部份 重疊且相鄰的’通常似乎具有極類似的標準尺寸組織化作 用。在夺發明中有用的促進子爲熟諳此藝者已熟知的，且 將依賴待使用的特定表現系統（Scharf D等人（1994) Results
Probl Cell Differ 20: 125-62; Bittner等人（1987) Methods in Enzymol 153 : 5 16-544) 〇 在表現構築體使用cDNA插入物之處，通常將希望包含聚 腺甞酸化作用信號序列，以便完成基因轉錄本的適當聚腺 誓酸化作用。任何由所選出之基因轉殖動物物種的細胞認 得的聚腺名：酸化作用信號序列，均適用於本發明的實行， 像是人類或牛生長荷爾蒙和SV40聚腺#酸化作用信號。 亦企圖成爲表現卡匣之元件的是終止轉綠之序列。這些 -71 本紙張尺度適用中國躅家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1316960 A7 A7 ________ B7 五、發明説明（69 ) 疋件可達到提高信息量’並將從卡匣至其他序列的讀取減 至最‘少。王要使用的終止轉綠序列區，將就方便性來選擇 ，因爲可供應用的終止轉綠序列區，像是本發明企圖應用 的那些，似乎相對上是可互換的。終止轉錄區可對轉綠開 始而言是天然的’或可對感興趣之DNa序列而言是天然的 ，或可以是由其他來源衍生的。 在本發明的某些具體實施例中，企圖使用内部的核糖體 入口位置（IRES)元件，創造多基因或多順反子的信息。IRES 疋件能夠繞過5'甲基化Cap依賴性轉譯作用的核糖體掃描 模式’並在内部位置處開始轉譯作用（pe丨丨etie$ s〇nenberg， Nature，334 : 320-325, 1988)。已經描述了得自細小核糖核 酸病毒家族之兩個成員（脊髓灰白質炎病毒和腦心肌炎）的 IRES元件（Pelletier和Son enberg，1988在前），以及得自哺乳 動物 # 息的 IRES (Macejak和 Sarnow，Nature, 353 : 90-94, 1991)。IRES元件可與異種的開放編閱架構連接β可一起轉 綠多個分別由IRES分開的開放編閲架構，產生多順反子的 信息。由於IRES元件，使每個開放编閲架構得以接近核糖 體，而進行有效的轉譯。使用單一的啓動基因/促進子來轉 錄單一的信息，可有效地表現多個基因。 任何異種的開放編閲架構，均可與IRES元件連接。這包 括分泌性蛋白質、多-亞單元之蛋白質、由獨立基因編碼之 蛋白質、細胞内或與膜結合之蛋白質，和可選擇標記的基 因。以此方式’利用單一的構築體和單一的可選擇標記， 可同時在細胞内策畫數個蛋白質的表現。 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格.（2丨0X 297公釐） ' --- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 1316960 A7 B7 五、發明説明（7〇 ) V1.受質在H u - A s p 2測定中的用途 在特定的具體實施例中，本發明涉及監視Hu-Asp2之活性 及’或功能的測定’且更特定而言，β·促泌酶活性及/或 Hu-Asp2之功能。這些測定將涉及在溶液中，將Hu_Asp2多 肽與本發明之適當受質一起培養，利用肽受質之切開作用 來測量Hu-Asp2的蛋白水解活性。 A.測定格式 在特定的具體實施例中’本發明係關於確認調節人類 Asp2天冬胺醯基蛋白酶（Hu_Asp2)活性之製劑的方法。例如 ’在一個變化中，這類方法包括下列步骤： (a) 在丈試製劑的存在和缺乏之下，使任何本發明之肽或 融合蛋白質，與包括Hu-Asp2活性之組合物接觸； (b) 在党試製劑的存在和缺乏之下，判定在匕和匕，之間的 位置處，被該Hu-Asp2切開該肽或融合蛋白質的程度； 並 - 經濟部中央樣準局員工消费合作社印褽 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (c) 將在受試製劑的存在下，Hu-Asp2的切開活性，與缺乏 該党試製劑時的活性相比較，以便確認調節由Hu_Asp2 切開之作用的製劑，其中在受試製劑的存在下，在 Hu-AsP2活性上的改變，可確認該製劑是Hu_Asp2活性 的調節劑。 卞相對於對照組（無受試製劑）’引起增加之切開作用的製 劑，圮綠爲Asp2蛋白水解活性的激動劑或剌激劑，而引起 降低之切開作用的製劑則記錄爲抑制劑。對抑制劑是特別 感興趣的’因爲Asp2活性之抑制劑，對於治療和預防早老 本紙張尺度ϋ用中國國家麟（ (710 y -73 1316960 經濟部中央樣隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（71 ) 性癡呆徵候群或其症狀或進行’具有治療务預防的跡象。 可藉著使用本發明之肤和融合蛋白質（代替A p p和A p p肽 序列），來修改在？(：丁公告第\¥〇 00/173 69號中，以及在1999 年10月13日建樓之美國專利申請案第09/416,901號中描述 的代表性測定’兩者均就其關於Asp2活性測定和Asp2活性 之調節劑的測定的敎導，以引用的方式併入本文中。Asp2 可以是例如Hu-Asp2(a) ' Hu-Asp2(b) ’或其具有生物活性 的片段、類似物或變體。在測定中亦可使用人類入叩2的非_ 人類之正類似物。 可在無細胞的系統中利用Hu-Asp多肽，或與表現Hu_Aps 及其變體或同功型的細胞一起培養，來進行這類測定。例 如，在無細胞的系統中，可藉著在受試製劑的存在或缺乏 之下，將Hu-Asp2酵素與本發明之肽或蛋白質受質混合，來 進行該接觸步驟。爲了最佳的結果，酵素和受質最好實質 上是經過陳化的，按照限定和經過控制之含量來混合，並 在適當的緩衝溶液中混合，以便使酵素活性發揮最大效用 ，並/或模仿生理學之條件。判定步驟可能涉及小終端片段 、（:-終端片段或兩者的測量，或可能涉及其他代表切開之 參數的測量。例如，肽受質可能含有中止標記，因爲只有 在切開時，從中止部份分開標記而更务檢測到。或者，可 將肽受質的N-終端或C-終端固定在固體支撑物上。在這種 女排下，可藉著從固體支撑物中釋故出切開片段，來測量 切開作用。可藉著在培養基中增加的標記，或減少附接在 固體支撑物上的標記，來測量釋放。或者，可藉著已釋玫 _______^74- I紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4現格（21^χ 297公釐 ----__ IU Lr I U1 _ —^1 ----- I .(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ιτ 1316960 經濟部中央標隼局員工消费合作杜印袈 A7 五、發明説明（72) 之肽的定量捕捉（例如，利用抗體），來測量釋放。 在代表性的捕捉測定中，以BSA酵素（75 nM)封阻384· 微量滴定盤，並與50 μΜ受試化合物一起培養i小時，
辜曰著加入250 nM丈質’例如生物素_KveanyevEGERC
[cys俄勒岡綠]KK，開始反應。在最終的測定條件中，體 積爲30微升/孔（pH 5_0): 50 μΜ化合物：7.5 nM酵素（或15 毫微克/孔）；250 nM受質；5% DMSO和0.001%吐溫_20。在 ΐ溫下培養該測定過夜，並藉著加入Tds_HC丨，pH 8.3使反 應中止。移出含有6.25微微莫耳受質的一等份，並在鏈黴 菌抗生物素蛋白塗覆的盤中，捕捉已切開及/或未切開的生 物素基化之受質。沖洗該盤3次，並加入緩衝溶液。藉著在 LJL Analyst (Ex 485/Em 530)上讀取俄勒岡綠的螢光發出 ，來監視該捕捉測定。 另一種在本文中可使用的測定，是螢光偏振測定。螢光 偏振作巧是一種敏感的、輕便的和非-破壞性的測定，可利 用它來監視本發明之β _促泌酶受質的作用。可使用它來監 視這些受質與Hu-Asp2酵素的交互作用。在、趣過控制的條件 下’螢光偏振測量可顯示螢光分子在溶液中的"分子滚動" 程度。例如，預期具有緊密莫耳體積的小分子將快速地滚 動。如果以偏振光照射在溶液中快速移動的分子，將導致 光的廣泛消偏振作用，並將產生"低"偏振値的讀出。在相 同的條件下，具有增加莫耳體積的大分子或大的複合物’ 將減慢分子旋轉（滾動）的過程。結果，產生偏振光的入射 面之偏振越小，則測量到的偏振値就越高。 -75- --r — ^------^_wi (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度通用十國國家樣準（〇阳）八4規格（210乂 297公釐） 1316960 A7 _____ B7 五、發明説明（73 ) 藉著以螢光探針標示小配體，可測量到由於配該體與其 他系統组份妁交互作用，而在螢光偏振上產生的改變。可 應用這類方法，來測量在酵素（HuAsp2)與螢光酵素受質之 間的交互作用之強度。 在代表性的螢光偏振測定中，在預先-封阻之低親和力的 黑色盤（384-孔）中，將酵素（0.5 nM)和化合物（10-20 μΜ) — 起培養30分鐘，並藉著加入1 50 ηΜ受質（例如生物素 -GLNIKTEEISEISY-EVEFR[cys-俄勒岡綠]ΚΚ，或在 Ργ-Ρ〆 位置處含有不可·水解之鍵結的類似受質），至3 0微升/孔之 終體積’使反應開始《最終的測定條件爲：30微升/孔之體 積，pH 4.5 ; 50 μΜ化合物；0.5 ηΜ酵素或1毫微克/孔；150 ηΜ受質；2% DMSA和0.001°/。吐溫-20。在379C下培養該測 定3小時’並藉著加入飽和濃度之在免疫上純的鏈黴菌抗生 物素蛋白使該反應中止。在室溫下培養該盤1 5分鐘，然後 在LJL Acquest (Ex 485/Em530)上測量螢光偏振。 本發明亦企圖利用結合測定，來檢測與酵素之活性位置 ’或在酵素的異位處結合的化合物。爲了這類判定5使用 本發明受質之不可-水解的衍生物是特佳的。在這類測定的 代表性衍生物中，在P!處出現抑胃酶胺酸衍生物，使本發 明之肽在Ρι--Ρι'位置處成爲不可-水解的。可利用加入適當 的螢光標籤，例如BODIPY FL，進一步修改該受質，而有 助於檢測。. 在特定的實例中，合成含有抑胃酶胺酸的肽 (SEVN[Sta]VAEFRGGC;序列識別196號），並顯示其抑制. -76- ·· 本紙張尺度適用中國S家標準(CNS) A4規格（210 X 297公爱）----- 1316960 A7 B7 五、發明説明（74
HuAsp酵素活性。亦合成該抑制劑的螢光衍生物 (SEVN[Sta]VAEFRC (Bodipy FL))，並按照下述使用之。這 些抑胃酶胺酸-衍生之受質，在溶液中的螢光偏振極少。然 而，當與HuAsp2產生交互作用時，在螢光偏振的結果上有 戲劇化的增加。雖然在本段中討論的實例，提及抑胃酶胺 酸衍生物，但亦企圖在螢光偏振的測定中，使用其他含有 螢光部份的不可-水解之衍生物。 可按照上文的討論來標示本發明之受質，並用來展開 HuAsp2的螢光偏振結合測定。藉著測量起因於以酵素滴定 受質的螢光偏振變化，來判定在酵素和受質之間交互作用 的平衡解離常數（KD) » 欲判定本發明之受質與HuAsp2之間交互作用的KD，可將 各種用量的β-促泌酶與3.1 ηΜ之螢光受質混合，並在室溫 下培養3小時。在培養之後，使用LJL Analyst (96孔之格式 )或Pan Vera Beacon(單比色杯格式）定出螢光偏振。在25 mM乙酸鈉，20%甘油，pH 4.75中進行代表性的測定。所獲 得之數據的圖解，在縱軸上提供偏振値’並在橫軸上提供 酵素的濃度，提供了用來判定酵素與受質之交互作用的KD 的結合等溫線。然後可使用關係Px==PF + (PB-pF)’[E]/ (KD + [E])來分析數據’其中P=偏振値’ x=試樣，F=自由的 抑制劑，已結合之抑制劑，促泌酶（Fluorescence Polarization Applications Guide, 1998 ： PanVera, Madison, WI)，而獲得KD。可使用該測定來篩選與酵素之活性位置 結合的化合物。 -77- 本紙張尺度適用中困國家搮準(CNS> A4規格(210 X 297公f 1316960 經濟部中夬橾準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（75) 使用上文的測定，可批准螢光偏振結合測定，並針對含 有野外型或Swedish突變的肽受質測量KD。例如，可使用螢 光衍生物，（SEVN[Sta]VAEFRC (Bodipy FL))來進行這類的 最初測定。接著，可爲了以競爭性結合之格式，用來判定 本發明之有用受質的活性，而修改該測定。利用可能的競 爭性抑制劑’例如nM SEVN[Sta]VAEFRC (BodipyFL) 受質），滴定含有SEVN[SU]VAEFRC (Bodipy FL)受質的溶 液，將48 ιιΜ酵素和各種濃度之可能的競爭性抑制劑一起培 養一段適當的時間，容許反應進行。可將得自該測定的數 據製成圖表，其中縱軸代表偏振，而橫軸代表競爭性抑制 劑之濃度。 亦出現許多以細胞爲基礎的具體實施例。例如，在一個 又化中，在細胞中表現Hu-Asp2，且接觸包括使該細胞在肽 的存在下，並在受試製劑的存在和缺乏下生長。可選擇天 然表現Asp2的細胞。在較佳的具體實施例中，以重組之方 式修改細胞，以便表現增加含量的Asp2。無論所使用的變 化爲何，均可將受質肽或融合蛋白質加至該.細胞·系統中（ 例如在培養基中），或可由該細胞連同Asp2*同-表現之。 例如，在較佳的具體實施例中，該細胞以重組之方式表現 在本文中描述的融合多肽，其包括致使肽局限在ER或高爾. 基氏體上的穿透膜功能部位，且更包括適當的標籤、標記 、融合夥伴、報告者蛋白質或其類似物，如同在本文中描 述的，而有助於切開作用的檢測。 在代表性的細胞測定中，以App變體轉移感染表現附加 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1316960 A7 _____B7_ 五、發明説明（76 ) Η A &戴之酵素的穩定η e K. - 2 9 3細胞株。在轉移感染之後4 § 小時’製備細胞萃取物，以供藉著西方墨點法，利用抗體 C8來測量Hu-Asp切開產物C99。使用等量的受條件限制之 培養基’以抗體22C11 (BoehringerMann-heim)測量總分泌 性APP片段的含量，並以抗體6E10 (Senetek, St^uis，MO) 測量分泌性ΑΡΡα，一種由α-促泌酶切開之片破岛含量。 應瞭解可平行地，或以任一種順序連續地進行在受試製 劑的存在和缺乏之下的.活性測量。此外，—呈已經對特定 的反應條件獲得酵素活性的可靠基準線，可能就不需要對 母個受試製劑平行地重覆對照組的測量（也就是在缺乏受 試製劑下的切開測量）。可使用在缺乏抑制劑之下，針對特 疋受質而獲得的Asp2之酵素活性的知識，作爲進行比較步 驟的基礎。 再者’雖然通常參考Hu-Asp2活性之調節劑而進行以上的 討論’但本發明之測定亦將確認改變Hu-Asp2之產製，藉以 增加或降低Hu-Asp2含量的候選物質，以對抗每單位 Hu-Asp2活性來表示。降低Hu-Asp2之產製的製劑，亦具有 治療或預防早老性癡呆徵候群之跡象。 經濟部中央樣準局員工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) B.候選受質 當在本文中使用"候選物質"或”受試物質"一詞時，意指 任何能夠調節Hu-Asp2活性，且最好是Hu-Asp2 β-促泌酶活 性的分子。在特定的具體實施例中，該分子是調節Hu-Asp2 活性的分子。候選物質可以是蛋白質或其片段、小分子抑 制劑’或甚至是核酸分子。可證實大多數經由篩選測定之 ___________ -79- 本紙張尺度適用中國國家棣率（CNS ) A4規格（21〇x 297公爱) : ' 1316960 μ Β7 立、發明説明（77 ) 應用而確認的有用藥學化合物，將是經“選大化合物庫 來確認，4在結構上與其他已知之App加王的調節&目關 的化合物。活性化合物可包括天然存在之化合物的片段戈 部份’或可能僅以與另行失活之已知化合物的活性組合體 而被發現。然而，在人類或動物模式中測試這類化合物之 前，將需要測試各種候選者，以便判定何者具有潛力。 因此，活性化合物可包括天然存在之化合物的片段或部 份’或可能僅以與另行失活之已知化合物的活性組合體而 被發現。因此，本發明提供篩選測定，來確認刺激或抑制 細胞之APP加工的製劑。提議可針對出現可能有用之藥學 製劑的候選者’來測定分離自天然來源，像是動物、細菌 、眞菌、植物來源，包括葉和樹皮，以及海洋試樣的化合 物。 將瞭解待篩選之藥學製劑’亦可能衍生自或由化學組合 物’或人造化合物合成。因此’由本發明確認的候選物質 當然可以是多肽、多核苷酸、小分子抑制劑或任何其他無 機或有機的化學化合物，其可經由合理的藥物設計，從已 知的Hu-Asp2活性及/或APP加工之刺激劑或抑制劑開始設 計。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 簡單地建立候選者篩選測_定並進行之。因此，在測定候 選物質時，在獲得表現有功能之Hu-ASp的細胞之後，在容 許發生可測量之Hu-Asp2活性的條件下，將候選物質與細胞 混合。以此模式，可在缺乏候選物質之下，測量候選物質 刺激細胞之活性的能力。同樣地，在抑制劑的測定中，在 _ -80- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X 297公釐)'' "'~~~ - 1316960 A7 B7 五、發明説明（78 ) 獲得表現有功能之Hu-Asp的細胞之後，將候選物質與細胞 混合。以此模式，可檢測候選抑制物質降低、廢除或另行 減少由得自該細胞之Hu-Asp2調節之生物效力的能力。 在某行情況下，物質之”有效含量”是以本發明之肽受質 的β-促泌酶切開位置的切開作用與其在缺乏候選物質之下 的切開正常含量相比較之形式，可再現地改變特定之 Hu-Asp2活性或ΑΡΡ加工的那些含量。將使用在活性上達到 顯著適當之改變的化合物。 在Hu-Asp2活性或功能上的顯著改變，例如使用本發明之 新穎Hu-Asp2肽受質的切開作用來測量（參見例如，實例1) ，藉著在活性上至少大約30%-40%的增加/減少來表示，最 佳的是至少大約50%的改變，當然可能有更高的値。 使用本發明之新穎Hu-Asp2受質的上述測定，遵守許多高 輸貫量篩選（HTS)方法（關於回顧，參見Jayawickreme和 Kost，Curr. Opin. Biotechnol. 8 : 629-634 (1997))。在例如
Houston和 Banks Curr.Opin. Biotechnol. 8 :.734-740 (1997) 中，亦嘗試描述自動化和小形化的HTS測定。 使用許多不同的庫來確認小分子調節劑，包括化學庫、 天然產物庫，以及包括或隨機或設計之肽、多核芬較或有 機分子的综合庫。化學庫由已知化合物的結構類似物，或 經由天然產物篩選，或從對有潛力之治療標靶的筛選中， 確認爲命中或指標的化合物所構成。天然產物庫是得自微 生物、動物、植物、昆蟲或海洋生物之產物的集合，藉著 例如得自土壤、植物或海洋生物之肉湯的發酵和萃取作用 -81 - 本紙張尺度適用中8國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公着) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 1316960 Δ Α7 Β7 五、發明説明（79 ) ，用它來創造篩選的混合物。天然產物庫包括多肽、非_ 核糖體的肽，及其非-天然存在的變體。關於回顧，參見 Science 2 82 : 63-68 ( 1 998)。综合庫由大量的肽、寡核苷酸 或有機化合物，以混合物的形式所構成。它們藉著傳統的 自動合成法、PCR選殖：’或其他的合成方法，以相對上較 簡單的方式製備。特別感興趣的將是包括肽、蛋白質、肽 模仿物 '多平行合成之收集、重組和多肽庫的庫。综合庫 以及從那裏創造庫的回顧，參見Myers Curr. Opin. Biotechnol. 8 : 70 1-707 (1997)。然後經由例如，合理的藥 物設計，使藉著使用所描述的各種庫來確認的候選調節劑 發揮最大效用。 當然，將瞭解本發明所有的篩選方法，本身均是有用的 ，雖然事實是可能未發現有效的候選者。本發明提供篩選 這類候選者的方法，不僅是發現它們的方法。 C.在活體内的測定 本發明亦包括各種動物模式的應用。提供本發明之揭示 内容，將可能產生APP加工的非-人類模式，其中已經由本 發明之肽受質代替正常的ΑΡΡ β-促泌酶切開位置。這將產 生極佳的機會，檢查在完整動物系統中，在那裏正常表現 之Hu-Asp2的功能。藉著發展或確認表現本發明之新穎β-促泌酶受質的老鼠，可提供在人類或其他哺乳動物中，極 具早老性癡呆徵候群之預兆的模式，並有助於確認可能的 療法。在本説明書中，另行詳述創造這類動物的方法。 以受試化合物治療動物，將涉及以適當之形式將化合物 -82- 本紙張尺度適用f US家鮮（CNS ) Α4規格（21GX297公釐Τ" ' ^ ,訂------^ ---；--Γ.I ^— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 經濟部中央標準局員工消費合作杜印¾ A7 五、發明説明（8〇 ) 投與動物。投藥將藉由任何可供臨床或# -臨床目的利用的 途徑’包括但不限於口月民、經鼻、頰内、直腸、陰道或局 邵之途徑。或者，可藉著氣管内滴下、支氣管滴下、皮内 、皮下、肌肉内、腹腔内或靜脈内注射來投藥。特別期待 的是全身性靜脈内注射，經由血液、腦脊髓液（CSF)或淋巴 配送的區域性投藥，以及腫瘤内的注射。 在活Si内判足化合物的有效性，可涉及各種不同的標準 這連b準包括但不限於存活、增加活性含量’和改善食 物攝取《其他的評估方法包括病理學檢查，特別是腦組織 ’查看改變β促泌酶活性的指標.，像是減少澱粉樣P或澱粉 樣β斑的產生，以及減少腦部的萎縮。 D ·藥物的製造 本發明 < 測定將確認β促泌酶的調節劑，其代表治療特徵 馬異常含量之β促泌酶活性的疾病，包括早老性癡呆徵候群 的候選辛法。因此，在確認調節劑製劑之後，本發明之方 法可視需要包括製造/合成該製劑，以及使用在藥學上可接 受的稀釋劑、佐劑或載劑，將該製劑調配成組合物的額外 步驟或步驟群。在下文中將更詳細地描述醫藥組合物。 VII.製造基因轉殖動物的方法 如同上文提及的，本發明的特定具體實施例企圖產製包 括ΑΡΡ突變種的基因轉殖動物，像促泌酶一樣切開—個本 發明之肽。使用表現卡匣，其在5'—3,的轉錄方向中，包括 與在宿主動物中表現有關的轉綠和轉譯開始區（如同^述 的啓動基因區）、編碼突變種ΑΡΡ基因的dNa，去、 ^ s以蛋白質· -83- M氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） ILIIMK----------訂------線---.——Γ·— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960
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1316960 A 7 B7 五、發明説明（82 ) 專用雄性：不孕的專用雄性，用來產生假懷孕的雌性：擔 任假-懷孕接受者和養母的雌鼠；以及基因轉殖的動物，包 括創始動物和衍生自這類創始者的基因轉殖家系。 目前，最廣泛使用C57BL/6J近親繁殖品系的雌性，來交 配和產生受精卵。然而，通常可利用從F丨雜種雄鼠與雌鼠 父配（例如 C5 7BL/6J，xCBA/J)Fl雌鼠xC5 7BL/6JxCBA/J)F1 雄机）而產生的F 2雜種來進行注射。已經成功地使用得自F ^ 4種的F2雜種合子，產生基因轉殖的老鼠。這些η雜種包 括但不限於 C57BL/6JxCBA/J ; C57BL/6JxSJL ; C3H/ HeJxC57BL/6J ; C3H/HeJxDBA/2J和 C57BL/6JxDBA/2J。熟 箱此蟄者將知曉可由其產生受精胚胎的其他品系之雌鼠。 在某些具體實施例中，可使用在129sv雌鼠中生長，得自 129sv老鼠品系的ES細胞，來創造本發明之基因轉殖的老鼠 。然後使這些基因轉殖的老鼠回頭與C57BL/6品系雜交。 一般而έ ’如果F2合子是供微量注射使用，則基因轉殖動 物的產生及其後續的繁殖是較有效的。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 用來產生基因轉殖老鼠的群落，亦包含有繁殖力的專用 雄a·%。將這類雄鼠飼養在分開的籠子中，以避免打鬥和受 傷。應該在送交給將用來產生受精卵的過度排卵之雌鼠之 削，先將這些雄鼠放在分開的籠子中數週。這^必要的， 因爲佔優勢的雄性將壓抑睪错酮，並因此壓抑其同胎老鼠. 的精子產生。將每隻過度排卵的雌鼠分別與專用雄鼠放在 —起0 需要不孕的雄鼠進行交配，產生假_懷孕的接受者，1其 -85- 本紙張尺度適用令國國家標準（CNS > A4規格（210><2?7公餐） 1316960 A7 五、發明説明（83 ) 通2藉著輸精管切除術而產生的。或者，可使用以遺傳 :式產生的不孕專用動物。藉著使具有自，然之子宮的雌鼠 與經過輸精管切除或以遺傳方式產生的不孕雄鼠交配，; 產生懷孕的雌鼠。假'懷孕的雌鼠有接受胚胎的資格， 二其不：任何受精卵。假，孕的雌_製造基因轉殖的 为而5疋很重要的，因爲她們擔任已經注射DNA或胚胎 幹細胞之胚胎的養母。声社@ a t ^瑕佳的假-懷孕接受者是已經養育過 一窩動物的雌氣。 經濟部t夬樣率局員工消費合作社印装 王射印發月成&老鼠稱爲，,創始老鼠"。一確認出創 始老氣，就使其配對’開始基因轉殖的家系。通常藉著對 得自尾巴的萃取物進行南方或小墨點雜交作用，就被注射 (基因的存在與否，來筛選有潛力的創始基因轉殖老鼠。 使用熟諳此藝者已知的方法，分析蛋白質和隱表現，並 決足轉殖基因的副本數目及/或表現程度。在斷奶的動物 (4 5週）中’判疋蛋白質、RNA表現和轉殖基因的副本數目 。當在斷奶年齡和較老的動物中，使用在組成上具有活性 的。動基因時，將不認爲在超過斷奶年齡之動物中，在基 因轉殖之RNA表現的程度上會有改變。當使用在發育上及/ 或組織專一的啓動基因時，監視蛋白質的含量，判定與年 齡有關的表現程度。亦觀察基因轉殖動物的臨床變化。評 7神經行爲障礙的實例，是不良的交配反應、騷動、在新 袤境中減少探查的行爲，而失去活性則可能完全是與抑鬱 有關的重要行爲特徵。已經在例如美國專利第5m，399號 :美國專利第5,387,742號：美國專利第5，川，633號中描述 -86 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公後） 1316960
了 AD的某些基因轉殖之動物模式。 B ·製造基因轉殖動物的方法 可以許多方式製備基因轉殖的動物。基因轉殖之生物是 具有併入其基因組内的外在或外源之DNA片段，有時代替 DNA之内源斷片的生物。至少爲了本發明的目的，將已經 修改其基因組，在天然APP中導入突變的任何動物，以: 其突變種子代，均視爲是基因轉殖的動物。爲了獲得外在 或外源之DNA的穩定遺傳，整合作用必須發生在可導致有 功能之生殖細胞的細胞類型中。兩種用來產生基因轉殖動. 物的動物細胞類型，是受精卵細胞和胚胎幹細胞。可從在 活體外的培養物將胚胎幹（ES)細胞恢復成”宿主”胚胎，其 中將它們併入發育中的動物内，並可在所有的組織中引起 基因轉殖之細胞，包括生殖細胞。在培養物中轉移感染ES 細胞’然後藉著將細胞注射到胚胎内，將突變傳送至生殖 種系内。然後使帶有突變生殖細胞的動物交配，產生基因 轉殖的子孫。在老鼠的生殖種系中，使用ES細胞來製造遺 傳的改變，是已徹底認可的。關於該技術的回顧，熟諳此 藝者參考 Bronson 和.Smithies，J. Biol. Chem.，269 (44)， 27155-27158, (1994)； Torres, Curr. Top. Dev. Biol., 36, 99-114 ; 1998，以及其中所包含的參考文獻。 通常，在發育的特定階段，從懷孕的老鼠中分離胚囊， 例如，可在發育的第4天（將第1天定義爲塞子的那一天）從 老鼠中分離胚囊，放在適當的緩衝溶液内，其將使ES細胞 維持在不分化、多能的狀態。可藉著許多熟諳此藝者已熟 -87 - 本纸張尺度適用中國明家標準(CNS> A4规格(210 X 297公釐) 1316960 Λ7 Α7 __Β7 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（85 ) 知的方法，分離E S細胞株。例如，可容許胚囊與培養皿附 接，並在大約7天之後，挖起長得過大的内細胞群，以胰蛋 白酶消化’並移至另一個培養皿，放在相同的培養基中。 在2_3週之後出現ES細胞菌落，從每個人工培養的内細胞群 中產生5-7個之間的個別菌落。然後擴充eS細胞株以供進一 步分析。或者，可使用免疫手術技術（描述在Martin，Pr〇c. Natl· Acad. Sci. USA 78 : 7634-7638 (1981)中），來分離ES 細胞株，其中在人工培養内細胞群之前，先使用抗-老鼠抗 體破壞滋養外胚層（trophectoderm)細胞。 在產製基因轉殖動物時，藉著胚囊注射將已經藉著同種 重組作用操縱的ES細胞再度導入胚胎環境内（按照在 Williams等人，Cell 52 : m-131 (丨988))中的描述。簡言之 ，從懷孕的老鼠中分離胚囊並擴大之。在培養之前，將已 經擴大的胚囊維持在4 Ό的油-滴培養物中1 〇分鐘。藉著挑 選個別的菌落來製備E S細胞’然後將其培養在嶙酸_緩衝之 生理鹽水，0.5 mM EGTA中5分鐘；藉著在4〇C下，在含有 1 %(體積/體積）之雞血清的胰蛋白酶-EDTA溶液中培養5分 在里’製備單細胞的懸浮液。將5至2 0個E S細胞（在帶有1 〇%( 骨豆％ /體積）胎牛血清和3,000單位/毫升在2〇 HEPES [pH 8]中緩衝之DNA酶1的杜貝可氏經過修改的鹰氏培養 基（Dulbecco's modified Eagle's Medium)中）注射到每個胚 囊中。然後將胚囊移至假-懷孕的接受者中，並容許正常地 發育。藉著外殼標記來確認基因轉殖的老鼠（H〇gan等人， Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor, .N.Y. ·*, -88- (請先閲讀背面之注*-事領再填寫本f) 装· 訂 線 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 1316960 A7 _ B7 五、發明説明（86 ) (1986》^可在例如美國專利第5,166,065號；美國專利第 5,449,620號；美國專利第5,453,357號；美國專利第 5,670,372號·，美國專利第5,753,506號；美國專利第 5,985,659號中找到分離和製備ES細胞的其他方法，分別以 引用的方式併入本文中。 另一種方法涉及用來製造基因轉殖動物的合子注射法， 描述在例如美國專利第4,736,866號中，以引用的方式併入 本文中。通常由Wagner和Hoppe(美國專利第4,873，191號； 以引用的方式併入本文中），Brinster等人（Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 82 (13) 443 8-4442, 1985;全部以引用的方式併 入本文中），以及在"Manipulating the Mouse Embryo ; A Laboratory Manual"第 2 版（编輯 Hogan，Beddington， Costantimi和 Long, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994;全部以引用的方式併入本文中）中描述了其他產製基 因轉殖4動物的方法。 簡吕之’該方法步及將D N A注射到受精印或合子中，然 後容許該卵在假-懷孕的母親中發育。可使用相同品系的雄 和雌性動物，或從不同品系的雄和雌性動物中獲得合子。 使生出的基因轉殖動物，創始者交配，產生具有相同DNA 插入物的更多動物。在該製造基因轉殖動物的方法中，藉 著非-同種重組事件，通常將新的DNA隨機地整合在基因組 内。可將一至數千個DNA的副本整合在基因組中的位置上 〇 一般而T ’將DNA注射到一個原核（pronuclei)内，經常 -89- 本纸張尺度適用中s g家標準(CNS) A4：%格(21G X 297公;#)" ' 1316960 A7 B7 是較大的雄性原核。然後在同-天，或培養過& κ 2_ 個細胞的胚胎，再將合子移至假-懷孕的雌鼠輸卵管内。就 想要整合之DNA的存在，篩選出生的動物。 可藉著任何此項技藝中已知的方法’來製備可供微量注 射的DNA純種系。例如，可利用適合移除細菌質體序列的 酵素’切開可供微量注射的DNA，並使用標準技術，在10/〇 在ΤΒΕ緩衝溶液中之瓊脂糖凝膠上，對dNa片段進行電泳 。藉著以溴化乙錠染色，使DNA譜帶呈現，並切下含有表 現序列的譜帶。然後將切下的譜帶放在含有0 3 酸鈉， pH 7.0的透析袋中。將DNA電洗脱至透析袋内，以丨：i之 酚：氣仿溶液萃取，並藉著兩份體積的乙醇使其沉澱。將 DNA再溶解於1毫升低鹽的緩衝溶液（〇.2 M Na(n，20 mM Tris，pH 7·4和 1 mM EDTA)中，並在 Elutip-DTM管柱上純化 。首先以3毫升高鹽緩衝溶液（1 M NaCl，20 mM Tris，pH 7.4 和1 mM EDTA)注入管柱，接著以5毫升低鹽緩衝溶液沖洗 。使DNA溶液通過該管柱三次，使DNA與管柱基質結合。 在以3毫升低鹽缓衝溶液沖洗一次之後，以0.4毫升高鹽緩 衝溶液洗脱出DNA，並藉著兩份體積的乙醇使其沉澱。在 UV分光光度計中，藉著在260毫微米處的吸光度來測量 DNA的滚度。爲了微量注射，以5 mM Tris，pH 7.4和0_ 1 mM EDTA，將DNA濃度調整成3毫克/毫升。 其他爲了微量注射而純化DNA的方法，描述在Hogan等 人，Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor, NY，1986) ; Palmiter等人 -90- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(21〇x 297公釐) 1316960 A7 B7 五、發明説明（88 ) » Nature 300 ： 61 1 ( 1982) ; The Qiagenologist, Application Protocols’ 第 3版’由 Qiagen，Inc., Chatsworth, CA公告； 以及在 Sambrook等 A 4^jM:olecular Cloning : A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY，1989)中。 在代表性的微量注射程序中，誘導六週齡的雌鼠過度排 卵。將過度排卵的雌鼠與雄鼠放在一起，並容許交配。在 大約2 1小時之後，將已經交配的雌鼠犧牲，並從切下的輸 卵管中回收胚胎，放在適當的緩衝溶液中，例如帶有〇.5〇/0 牛血清白蛋白（BSA : Sigma)的杜貝可氏鱗酸緩衝之生理鹽 水β利用玻尿酸酶（1毫克/毫升）移除周圍堆積的細胞。然後 沖洗原核胚胎，並放在含有0.5°/❶BS Α的Earle's平衡鹽溶液 中，放在帶有5% C02，95%空氣之潮濕氣壓的37.5。(：恆溫 箱中，直到注射時間爲止。可在兩-個細胞的階段移植胚胎。 將隨機循環的成年雌鼠與輸精管切除的雄性配對。爲了 該目的可使用C57BL/6或Swiss老鼠，或其他可相比擬的品 系。在與捐贈雌鼠相同的時間，使接受者雌鼠交配。在移 交胚胎時，以腹腔内注射每克體重0.015毫升的2.5%奥佛；丁 (avertin)將接受者雌鼠麻醉。藉著單一的中線背側切開， 露出輸卵管。然後經由體壁直接在輸卵管上進行切開。然 後利用錶匠鎮子撕裂卵巢囊。將待移交之胚胎放在DPBS( 杜貝可氏磷酸緩衝之生理鹽水）中，並在移交吸移管的尖端 内（大約10至1 2個胚胎）。將吸移管的尖端插入輸卵管漏斗 ’並移交胚胎。在移交之後，以兩針關閉該切口。.然後懷 >· _ -91- 本紙張尺度適；18 g家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) ~
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經濟部中央標準局貝工消費合作.杜印製 1316960 A7 A7 B7 五、發明説明（89 ) 孕的動物生出創始動物，用牠來建立基因轉殖家系。 v I丨Ϊ ·醫藥組合物 Μ 最後可將由本發明確認之Hu.Asp、ΑΡΡ加工，及/或卜促 泌酶切開的調節劑，調配成醫藥組合物，也就是以適人在 活體内應用的形式。-般而言，這將f要製備基本含 熱原，以及其他可能對人類或動物有害之雜質的组合物。° 通常將希望使用適當的鹽類和緩衝溶液，使組合^成爲 穩定的，且容許由標靶細胞攝入◎當將重組細胞導入患者 中時，亦將使用緩衝溶液。"在製藥學或藥理學上可接受“的，， 片語，意指分子的實體和組合物，當投與動物或人類時， 不會產生不利的、過敏性的，或其他不幸的反應。當在本 $中使用"在藥學上可接受的載劑"時，包括任何和全部的 岭《I!、分散介質、塗料、抗細菌和抗眞菌劑、等張和延遲 吸收之製劑，及其類似物。關於具有藥學活性之物質，這 類介質和製劑的使用爲此項技藝中已熟知的。除了與由本 發明確認之調節劑不相容的任何傳統介質或製劑之外，均 期待其在治療性組合物中的用途。亦可將補充的活性成份 併入該組合物内。 本發明之調節劑組合物包含典型的藥學製品。根據本發 明投與這些組合物，將經由任何普遍的路徑，只要經由該 可達到標靶組織即可。可藉著任何的傳統方法，將醫 藥’且〇物導入個體内，例如藉著靜脈内、皮内、肌肉内、 礼房内、腹腔内、鞘内、眼内、眼球後、肺臟内的（例如界 限釋放）；藉著口服、舌下、經鼻、肛門、陰道或經皮遞送 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝： 訂
A7 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 1316960 五、發明説明（9〇 ) ’或在特定的位置藉著外科移植，例如埋在牌囊、『之下 、二=。治療可由單次劑量’或在—段期間；由多 \劑f所組成。 爲：：自由驗或在藥理學上可接受之鹽類的溶液形式投 樂，可私使用本發明確認的調節劑化合物，在水中與表面 活性劑，像是經丙基纖維素適當地;昆合，來製備之^亦可 在甘油、液態聚乙二醇及其混合物中，以及在油中，製備 分散體。在普通的儲存和使用條件下，這些製品含有防腐 劑’以避免微生物的生長。 、適合注射使用的藥學形式包括無菌的水溶液或分散液， 以及可供臨時製備無菌可注射溶液或分散液的益菌散劑。 在所有的情況下，該形式必須是無菌的，且必須具有可輕 易抽吸的流動程度。其在製造和儲存的條件下必須是穩定 的，且必須保護它以避免微生物的序染作用，像是細菌和 眞菌。以是容劑或分散液介質，含有例如水、乙醇 、多元醇（例如甘油、丙二醇和液態聚乙二醇及其類似物） 其k ^之此5物，以及植物油。例如，可藉著使用.塗料 ’像是卵嶙脂’在分散液的案例巾，藉著維持所需的顆粒 並藉著使用表面活性劑’來維持適當的流動性。可 藉著各種抗細菌和抗眞菌劑，例如對羥基苯f酸酯 (paraben)、氣丁醇、酚、山梨酸、乙基汞硫代水楊酸鈉， 及其類似物，導致微生物作用的預防。在許多情況下，最 好將包含等’藥劑，例如糖或氣化鈉。可藉著使用延遲吸收 之製劑的組合物’例如單硬脂酸酯和明膠，導琢可注射組 I. 装 I n 訂 11 線 _---^--1 __ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -93- 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 1316960 A7 B7 五、發明説明（91 ) 合物的延長吸收。 藉著以所需之量，將活性化合物併入按照需要，帶有各 種上文列舉之其他成份的適當溶劑中，接著進行滅菌過滤 ’來製備無菌可注射之溶液。一般而言’藉著將各種已滅 囟之活性成份併入含有基本分散介質，以及來自.上文列舉 那些的所需之其他成份的無菌媒劑中，來製備分散液。在 用來製備無菌可注射溶液之無菌散劑的案例中，較佳的製 備方法是眞空脱水和冷凍脱水技術，其產生活性成份加上 任何得自其先前滅菌過濾溶液之額外想要成份的散劑。 當在本文中使用”在藥學上可接受之載劑，，時，包括任何 和全邵的溶劑、分散介質、塗料 '抗細菌和抗眞菌劑 '等 張和延遲吸收之製劑及其類似物。關於具有藥學活性之物 質，這類介質和製劑的使用爲此項技藝中已熟知的。除了 與活性成份不相容.的任何傳統介質或製劑之外，均期待其 在治療性組合物中的用途。亦可將補充的活性成份併入該 組合物内。 關於口服投藥可將由本發明確認之調節劑與賦形劑合 併，並以不-可食之漱口藥水和牙膏的形式使用。可以所需 之量’將活性成份併入適當的溶劑中，像是四硼酸鈉溶液 (Dobell's落液）’來製備漱口藥水。或者，亦可將活性成份 併入含有四硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的防腐沖洗液中。亦 可將活性成份分散在牙膏中，包括：凝膠、軟膏、散劑和 於漿。以在治療上有效的含量，將活性成份加至牙膏中， 其可包括水、黏合劑、研磨劑、調咮劑、發泡劑和濕潤劑。 _______ _ 94 - 本紙張尺度通用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2lOX"J97公慶）-——-- --·Ί-----ΙΦ-. (請先閲讀背面之注意事項為填寫本頁) 訂 1316960 A7 B7 五、發明说明（92) 可以中性或鹽的形式，調配本發明之組合物。在藥學上 可接受的鹽類，包括酸加成鹽（與蛋白質之自由胺基基團形 成），且其是與無機酸，像是例如氫氣酸或增酸，或諸如乙 酸、草酸、酒石酸、杏仁酸之類的有機酸’及其類似物所 形成的。與自由羧基基團形成的鹽類，亦可衍生自無機鹼 ，像是例如氫氧化鈉、鉀、按' 約或鐵，以及諸如異丙胺 、三甲胺、組胺酸、普魯卡因之類的有機鹼，及其類似物 0 在調配時，將以可與劑量調配物相容的方式，並以在治 療上有效的含量，來投與溶液。可容易地投與各種劑量形 式的調配物，像是可注射的溶液、藥物釋放之膠囊，及其 類似物。關於水溶液形式的非經腸投藥，例如，若須要應 適當地緩衝該溶液，並利用充份的生理鹽水或葡萄糖，使 液態稀釋劑先成爲等張的。這些特定的水溶液，特別適合 靜脈内、肌肉内、皮下和腹腔内投藥。 經濟部中央橾挛局貝工消f合作社印製 將"單位劑量"定義爲分散在適當載劑中之治療性組合物 的個別含量。例如，可利用最初的團塊，接著連續輸液以 維持藥物產物的治療循環之含量，進行非經腸投藥。熟諳 此藝者將藉著良好的醫學慣例和個別患者的臨床狀況’迅 速判定最佳的有效劑量和投藥攝生法。更特定而言，應該 選擇降低、抑制、減少或另行廢止Αβ-肽之形成，以及更特 定而言，在顯示出AD的個體腦中之斑形成的劑量。大意是 說’熟諸此藝者將能夠使用A D之動物模式（例如按照在美 國專利第5,877,399號：美國專利第5,387,742號：美國專利 ___________ -95- 本‘張尺度適财關家料（CNS ) A4規格（21GX297公餐) ' '一^' 經濟部中央樣準局員工消費合作.杜印製 1316960 B7 五、發明説明（93 ) 第5，8 1丨，6 3 _>號中揭示的），以便獲得最佳的劍量投藥草安， 並預測在人類個體中干擾AD所需之藥學製劑的相對含量。 投藥的頻率將依據該製劑之藥物動力學參數和投藥的途 徑。將由熟諳此藝者依據投藥途徑和想要之劑量，定出最 佳的樂學調配物。參見例如Remington’s Phamaeeutical Sciences ’ 第 18版（1990, Mack Publ. Co, EaSton PA 18〇42) ，第143 5- 17 1 2頁，以引用的方式併入本文中。這類調配物 可影響所投與之製劑‘物理狀態、穩定性、在活體内之釋 放速率’以及在活體内之清除速率。依據投藥的途徑，可 根據體重、體表面積或器官大小，來計算適當的劑量。由 熟諳此藝者例行地進行判定適當治療劑量所需的更精確之 計算，而不需過度的實驗，特別依照在本文中揭示的劑量 資訊和測定，以及在動物或人類臨床試驗中觀察到的藥物 動力學數據。 可經由使用用來判定血液含量連同相關之劑量-反應數 據的已確立測定，來探知適當的劑量。將由負責的臨^醫 師，根據修改藥物作用之因素，例如藥物的特定活性損 傷的嚴重性和患者的反應、患者的年齡、狀況、體重、性 別和飲食’任何感染的嚴重性、投藥的時間和其：臨床因 素，來決定最終的劑量攝生法。隨著研究的進行，將顯現 更多與特定疾病和病況之適當劑量含量知治療期間有關 資訊。 應了解本發明之醫藥組合物和治療方法，可用在人類醫 子和獸醫醫學的領域中。因&，待治療之個體可以是哺乳 本紙張尺國家縣（CNS) A4規格（2igx 297公董- — _ r J — ^---.丨裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 A 7 五' ~) " —' ' 最好是人類或其他動物。爲了獸醫學之目的，個體 己括例如農場動物，包括牛、綿羊、豬、馬和山羊，同伴 ’像是狗和描，野生動物及/或動物園的動物，實驗動 包括老鼠、大鼠、兔子、天竺鼠和倉鼠；以及家禽， 像是雖、火雞、鴨和鵝。 IX.實例 下列的實例提供了較佳的具體實施例和技術，但並非企 圖加以限制。熟諳此藝者將依據本揭示内容，瞭解可利用 所揭不之特定材料和方法，進行許多的改變，而仍獲得類 似或相同的結果’且不違背本發明之精神及範圍。 實例1 β-促泌酶測定
如下可使用本發明的合成肽受質，進行Asp2(a)的活性測 定。可在適當的緩衝溶液中進行反應，像是例如5〇 mM 2-[N-嗎琳基]乙烷-磺酸酯（"Na-MES”，pH 5.5)，或 50 mM 乙酸’在4.0至6.0之間的pH値範圍内，70 mM肽受質和重 組的AsP2(a)(l-5微克蛋白質），在37°C下進行各種時間。代 表性的緩衝溶液包括1% β-辛基葡萄糖：藉著RP-HPLC定 量反應產物，在30分鐘内使用從0-70B的直線梯度（A=〇,l〇/0 在水中之TFA，Β = 0·1% TFA/10%水/90% AcCN)〇 藉著在 214 毫微米處的吸光度監視洗脱輪廓。 在這類測定中，在完整的肽受質之前，洗脱出兩個產物 高峰，可使用例如Edman定序或質譜分析，證實爲p^.Pi 序列和— '序列。藉著將兩個產物肽的積分高峰面積與 -97- 本紙張尺度適用中國國家橾準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1316960 A7 --- B7 五、發明説明（95 ) 奸生自2丨4毫微米處之吸光度的起始物質，.計算出肽受質的 水解百分比。可使用Edman定序和MADLI-TOF質譜分析， 證實切開/水解產物的序列。 可藉著在8 μΜ胃蛋白酶抑制素a的存在下，以及在蛋白 西母抑制劑之雞尾酒（例如1 〇 μ Μ亮肽素（1 e Up e p t丨n)，1 〇 μ μ E64和5 mM EDTA)的存在下，進行β_促泌酶測定，來判定 蛋白酶切開反應的專一性β β -促泌酶蛋白水解活性對胃蛋 白酶抑制素（組織蛋白酶D和其他天冬胺醯基蛋白酶的抑制 荆）’或雞尾酒（分別爲絲胺酸蛋白酶、半脱胺醯基蛋白酶 和金屬蛋白酶的抑制劑）不敏感，表示卜促泌酶活性的專一 .性。 另一種測定可使用在CHO細胞中表現，並使用以β_辛基 葡萄糖穿萃取之相同條件純化的Hu_Asp2(b)，並接著在 Mono Q®和Mono S®上進行層析。 另一種β -促泌酶測定則利用内部中止的螢光受質，來監 視酵素活性，以單一試樣或多孔之格式，使用螢光光譜分 析。每個反應含有例如50 mM Na-MES (pH 5.5)，本發明之 肽受質（50 μΜ)和經過純化的hu-Asp-2酵素。在37°C下平衡 這些組份各種時間，並藉著加入受質開始該反應。在33〇 毫微米處進行激發，並藉著在39〇毫微米處測量螢光放出， 來監視反應動力學。欲檢測調節Hu_ Asp-2活：性的化合物， 在反應的培養前期加入受.試化合物，並按照上述監視反應 的動力學。將增加螢光出現之比率的化合物記錄爲活化劑 ，而降低螢光出現之比率的則是抑制劑。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂
A7 1316960 五、發明説明（96 在另#選擇中’使用以細胞爲基礎之測定系統來進行 Hu-AsP2P·促泌酶測定，其中細胞，像是例如眼μ細胞 二表現融合多肽’其包括：包括衣發明之Η —〕受質肽的 第個邛彳77，包括穿透膜功能部位的第二個部份，其將該 肤固定在該細胞之高爾基氏體或内質網上，以及包括報告 者基因，像是例如SEA的第三個部份。穿透膜功能部位將 用來確保將肽受質有效地遞送至細胞環境中，其中它可與 有活性之Hu-Asp2結合並將其切開。以測量釋放至培養基内 的SEAP活性來檢測切開作用。 實例2 藉著胺基酸分析定量肽的方法 本實例提供藉著胺基酸分析定量肽受質的代表性方法。 使用該方法來定量本發明的各種受質。 使用CEM Corpoeation’s MDS 2000微波爐，利用微波水 解作用來定量肽。將含有大約2微克蛋白質的Hewlett
Packard 300微升微量小瓶放在含有4毫升6 n HC1 (Pierce Constant Boiling)，連同0.5%(體積對體積）之酚 (Mallinckrodt)的鐵氟龍 ®PFA 消化試管（CEM Corporation) 的内側。然後以N2交替地抽空和沖洗試樣五次。使用兩個-階段的方法將蛋白質水解。在第一個階段期間，50%的全 力（大約650瓦）使溫度增加至l〇〇°C，並維持該溫度1分鐘。 接著馬上以75%的力量’使溫度增加至1 50°C，並維持該溫 度25分鐘。在冷卻之後，將試樣脱水（Savant Speed Vac) 〇 對使用6-胺基·»奎啉基-N-羥基琥珀醯亞胺基胺基甲酸酯衍 -99.- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 丨hf丨卞----- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 1316960 A7 _____B7 五、發明説明（97 ) 生的試樣進行胺基酸分析，產生穩定的脉，其在3 9 5毫微米 處產生螢光.（Wate.rs AccQ . Tag Chemistry Package)。在 Hewlett Packard 11 00系統上，藉著逆相HPLC分析試樣，並 使用Hewlett Packard’s ChemStation增強積分儀進行定量。 實例3 以泛素/氧化之胰島素B鏈的結構爲基礎，測試本發明代表 性的肽 本實例描述本發明之代表性Hu-Asp2受質的產製，並在本 發明的Hu-Asp2測定中使用之。 使用藉著固相技術，使用得自Applied Biosystems Inc.之 433A型合成的受質KVEANY-EVEGERKK(序列識別5號）。 藉著HPLC分析評估該受質之純度〇簡言之，將粗製的肤溶 解於稀乙酸中，過濾並裝載在製備逆相管柱（Vydac C-19， 22x250毫米，10微米）上，以4毫升/分鐘100% A (A : 0.1 〇/β 在水中之TFA，Β : 0.07%在乙腈中之TFA)。所使用的梯度 爲0— 10% B，10分鐘，然後10— 50%B，200分鐘。藉著在 220毫微米和280毫微米處的吸光度，監視管柱的流出物。 在分析逆相系統（Vydac C 1 8，4.6><250毫米，5微米）上監視 容離份。溶劑和波長如上。該RP-HPLC的直線梯度爲從 0-70% B，以1.0毫升/分鐘進行20分鐘。 使用質譜分析判定該肽的化學眞實性。更特定而言，藉 著使用裝設有 Hewlett Packard Series 1050 HPLC 系統之 Micromass Platform II質譜分析儀的質譜分析，建立每個狀 的化學眞實性。藉著將5微升試樣注入1〇〇微升/分鐘之1 : -100- 本紙張足度適用t國歯i標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1316960 五、發明説明（98 ) 1 =甲醇：水的流中，證實肽的身份。以電噴霧電離的模式 操作該質譜分析儀’具有針頭電壓3千伏，溫度120。(：，而 錐體電壓30伏特。 在37 °C下，在包括200 mM乙酸鈉，pH 4.5，200 μΜ受質 ’ 200 nM Hu-Asp2酵素的反應中，就Hu_Asp2活性之受質 來測試上述的肽。容許處理該反應混合物1至3小時《按照 在實例1中的描述來監視該反應產物，並發現 KVEANY-EVEGERKK(序列識別5號）是Hu-Asp的良好受質 〇 藉著將Cys殘基插入R和KK之間的作用，進一步修改 KVEANY-EVEGERKK(序列識別5號），得到肽 KVEANY-EVEGERCKK(序列識別6號）。將該肽的N-終端生 物素基化，並藉著在Cys殘基處共價附接俄勒岡綠，做成有 螢光的。簡言之，關於生物素基化作用，可將今樹脂結合 的肽懸年於（大約10毫升）含有二異丙基乙胺（0.15毫升）的 二甲基甲醯胺中，並在室溫下與50毫克EZ-連接NHS-LC-生物素（Pierce)反應。容許該反應進行24小時（或直到水合 茚三酮陰性爲止）。然後在室溫下，在1〇毫升含有乙基酽基 硫醚：茴香醚：1，2-乙二硫醇（1 : 3 : 1 ;總共5%)的三氟乙 酸中切開該生物素基化的肽2小時。通過燒結玻璃漏斗過濾 切開溶液，並在減低的壓力下蒸發至接近無水。利用冰冷 的二乙醚使粗製的肽從切開溶液中沉澱出來。在燒結玻璃 漏斗上收集已經沉澱的肽，以二乙醚沖洗，溶解於稀乙酸 中’並在減低的壓力下蒸發至無水。將殘餘物溶解於冰錯 ___ -101- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1316960 A 7 B7 五、發明説明（99 ) 酸中，並將其冷凍乾燥。 將經過純化之生物素基化的肽交# 7肽/合角千於已經先脱氣的大約 5毫升之N) NaH2P〇4(pH 8.q)中。然後加人溶解於〇5 毫升二甲基甲醯胺中的5毫克俄勒岡綠488順丁烯二醯亞胺 (M〇leCular Probes)，並在暗處在室溫下檀拌該混合物贈 鐘。在該反應之後，藉著加入15毫克耽胺酸，持續額 外的30分鐘，使未反應的試劑中止。然後使最後的混合物 通過燒結玻璃漏斗過濾，藉著加入冰醋酸酸化，並按照上 述藉著製備逆相HPLC純化，除了最初的洗脱條件（1〇〇% A) 維持不變之外’直到洗脱出突破的DMF高峰爲止》 使用下列的條件，就Hu-Asp2活性之受質測試所得的化合 物，生物素-KVEANY-EVEGERC(俄勒岡綠）KK : 200 mM乙 酸鈉’ pH 4.5，10 μΜ受質，50 nM酵素，在37。(：下。容許 該反應進行2小時’並數次取回試樣。結果顯示在丨5、3〇 、60和120分鐘之後，分別發生20%、37%、57%和82%的切 開。它們對於天然或APP-S W具有比較編號嗎？ 質譜分析顯示切開僅出現在Tyr和Glu之間。該新穎的生 物素基化螢光肽具有比先前衍生自Swedish突變種肽的生 物素基化之螢光受質：SEVNL-DAEFR(序列識別19號）至少 好兩倍的Vmax和Km。 實例4 含有突變β -促泌酶切開位置的A P P構築體 本實例描述使用重組方法，創造APP突變，導入本發明 之合成的Asp2受質之序列的方法。 ___ - 102- ^張尺度通用中國ϋ家標準（CNS ) A4規格（210X297公竣） ^^1» 1^—· il^i · 丨-.-I.------^0- — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ιτ 經濟部中央標準局員工消費合作.社印製 1316960 A7 B7 經濟部中央棟準局員工消費合作社印袈 五、發明説明（1〇〇) 將表現二順反子之構築體的哺乳動物細胞稱爲丨2 5 ’其在 C-終端含有Swedish突變種APP695，和外在的二離胺酸殘 基，使用它作爲產製含有本發明序列之新穎APp突變種的 起始物質。使用指定位置之突變生成作用，以VS YEA(序列 識別189號）、ISY-EV(序列識別179號）或VSYEV(序列識別 177號）代替在該APP695之殘基593至597處，編碼VNLDA的 序列。 使用下列的引子，利用市售的套組（QUICKCHANGE，指 定位置之突變生成作用，Stratagene, La Jolla, CA)，進行指 定位置之突變生成作用： #ISYEV5 5'-GAG ATC TCT GAA ATT AGT TAT GAA GTA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GG-3,(序列識別 171 號） #ISYEV3 5'-TGA GTC ATG TCG GAA TTC TAC TTC ATA ACT AAT TTC AGA GAT CTC CTC-3'(序列識別 172 號） #VSYEV5. 5'-GAG ATC TCT GAA AGT AGT TAT GAA GTA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GG-3'(序列識別 173 號） #VSYEV3 5'-TGA GTC ATG TCG GAA TTC TAC TTC ATA ACT ACT TTC AGA GAT CTC CTC-3,(序列識別 174號） #VSYEA5 5-GAG ATC TCT GAA ATT AGT TAT GAA GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GG-3,(序列識別 175 號） #VSYEA3 5'-TGA GTC ATG TCG GAA TTC TGC TTC ATA ACT AAT TTC AGA GAT CTC CTC-3f(序列識別 Π6號） 進行指定位置之突變生成作用的PCR條件如下：在95 下變性1分鐘，在56°C下黏接30秒，並在68°C下擴大16分鐘 -103 - 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） —^-----裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ιτ 線 1316960 A7 B7 五、發明説明（101 ) 。在50微升的反應溶液中進行該反應，其含有每種引子各 150毫微克，50毫微克的模板DNA，2.5單位的pfu Turbo DNA聚合酶，以及200 μΜ的dNTP。以限制酵素Dpnl消化擴 大產物60分鐘，接著進行轉化作用。製備質體DNA的迷你-製備，並進行DNA定序，以便確認含有想要之修改序列的 突變純種系。 實例5 對設計成野外型APP序列之本發明肽序列，進行以細胞爲 基礎的測試 本發明者按照在之前實例4中的描述，利用KM-DA594.597 (序列識別139號）至SYEV594.597(序列識別140號）或 SYEA594.597(序列識別187號）的突變，修改APP表現構築體 ，以便測試這些突變是否將容許所得的經過修改之（突變種） APP，被細胞中的β-促泌酶有效地進行蛋白水解加工。修改 所得的表現構築體，其含有駕馭野外型ΑΡΡ695序列之表現 的CMV啓動基因，使其包含C-終端的二離胺酸，並進一步 以上述的指定突變加以修改。因爲將ΑΡΡ變體繼代選殖到 pIRES-EGFP 載體（Clonetech，Palo Alto, CA)内，可藉著綠 色螢光信號的出現來監視表現的效力。在利用不同的APP 變體轉移感染高程度表現Hu-Asp2之HEK293衍生細胞48小 時之後，製備細胞的萃取物，並藉著從4轉移至12%之 SDS-PAGE凝膠的西方墨點分析。可藉著觀察可由專-抗體 C8認出之β-促泌酶切開產物CTF-99的增加，來監視 Hu-Asp2活性。如同在圖3中所示，兩個突變的ΑΡΡ變體均 -104 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐） 1316960 A 7 B7 五、發明説明（1〇2 ) 被Asp2熟練地切開。與在活體外的酵素測定類似，帶有 SYEV594.597(序列識別 140號）的 APP 比帶有 SYEA594-597(序 列識別1 87號）的APP更有效率地被切開。 作爲APP加工的一種指標，測量從經過轉化的HEK-293 細胞培養基中分泌的Αβ含量。藉著ELIS A，使用捕捉Αβ的 抗體6£1〇(8丫1^]^，31.[〇11丨3，厘〇)，以及人0 4〇之抗體2〇8和 Αβ 42之抗禮165進行測量。208和1 65兩者均賭自Research Foundation of Mental Hygiene (Staten Island, NY)，且其獨 立地判定D596A597至E596A597或E596V597之突變（其影響Αβ之 义終端），但不影響八0肽的£1^8八檢測。在以這兩個八？卩突 變形式轉移感染的細胞中，觀察到分泌性Αβ 4〇和Αβ 42的增 加產製。在肽活性測定中使用額外的構築體，判定如果以 Ser取代Asn殘基，得到SEVNY- i -EVEFR(序列識別170號） ，則該肽具有的活性僅爲SEVSY- i -EVEFR(序列識別141 號；表4)的1/5。該觀察再度肯定在某些位置的胺基酸最優 化作用，依賴其餘的受質序列。 對這類測定有用的其他細胞包括 總括而言，SEVSY- i -EVEFR(序列識別141號）對Asp2而 言是優異的APP-修改受質，其在以細胞爲基礎的測定中， 提供了可輕易測量的Αβ含量。 實例6 表現突變種ΑΡΡ形式的細胞株 前述的測定使用經過轉化的ΗΕΚ-293細胞株。其他有用 的細胞株包括但不限於人類HeLa ' IMR-32、SK-N-MC、 -105- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作·杜印裝 五、發明説明（1〇3) SHY-5Y細胞、中國倉鼠印巢細胞、老鼠n⑽七細胞，和 大藏PC12細胞。這些細胞全都可迅速地獲自ATc(：。在車六 佳的具體實施例中，用來導人經過修改之㈣形式的載㈣ ’亦可包括抗生素抗藥性基因，例如，得以在以18抗藥性 的條件下選擇穩定的細胞株。在其他較佳的具體實施例中 ，所產製之細胞株可表現上述的突變種App，並以重組方 式表現ASP2。在一種變化中，使用第二個構築體導入Asp2 ’其容許在不同的選擇性抗生素下進行選擇（例如潮徵素的 選擇作用）。認爲這類細胞株特別適合以高輸貫量篩選 Asp2-調節之APP加工的調節劑。 實例7
Asp2調節劑之鬲輸貫量' 以細胞爲基礎的測定 當諸如在實例5中描述的那些測定可快速地利用自動化 進行，並平行地篩選數個試樣時，將是最有用的。對各種 細胞株應用後文描述的共同程序，包括上文確認的那些。 以細胞爲基礎的測定，最好是以96-孔的格式進行，並以一 式兩份測量每個候選化合物。 在處理前一天’在每孔中放置大约2 5, 〇 〇 〇個細胞，並在 正常的細胞培養條件（3 7X：，5% C02)下生長。 在D M S Ο中製備適當濃度的化合物母液。理想的母液是 待測試之最高濃度的大約1，〇〇〇倍。在微量培養盤上，以 DMSO將化合物連續稀釋1 : 3 (25微升+ 200微升DMSO)， 然後以培養基稀釋’按照比例1 : 5體積/體積的化合物：培 養基（50微升+ 100微升培養基），產生中間物培養盤，以供 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） — Ρ 丨------MW-----ΐτ------00— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 A7 B7 五、發明説明（104 ) 進一步稀釋使用。以1 : 20稀釋中間物培養盤（1 3微升+247微 升培養基），產生一式兩份，爲最終想要之濃度十倍的濃度。 欲開始該測定，將20微升終化合物稀釋物加至含有1 80 微升培養基的細胞培養盤中，並將該盤放回組織培養恆溫 箱中，繼續培養。在培養3小時之後，收集培養基，並再度 以1 80微升培養基加20微升化合物處理細胞，然後培養過夜 。第二天從細胞中收集培養基，並測定之，測量APP加工 的證據。例如，藉著ELISA測量收集到之培養基中的Αβ含 量。亦可測量由於ΑΡΡ加工而產生的Ν-終端片段。 實例8 包括ΜΒΡ和ΑΡΡ和本發明之Asp2認知序列的嵌合型蛋白質 藉著合成表現MBPC125構築體，並將該構築體轉化至大 腸桿菌宿主内，來產製包括麥芽糖結合蛋白質（序列識別 194號），連同得自APPC-終端之125個胺基酸的融合蛋白質 。MBP (NEB，Beverley, ΜA)對於檢測伴隨著本發明受質之 Asp2切開的切開作用，提供了有用的檢測受質。 基本上按照在美國專利第5,744,346號和美國專利第 4,942,400號中的描述（除了在融合蛋白質中包括本發明之 β-促泌酶受質之外），產生APP和麥芽糖-結合蛋白質（MBP) 的融合作用。這些文獻亦描述測定，其係藉著將融合多肽 暴露在β-促泌酶之下來執行，該β-促泌酶切開ΑΡΡ在βΑ之 胺基-終端125個胺基酸的部份。然後可捕捉ΜΒΡ部份，並 藉著以β-促泌酶切開，露出ΑΡΡ片段的羧基-終端，而可利 用對該終端專一的192抗體確認之。在本發明中，在這些測 -107- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中央樣隼局員工消费合作社印裝 五、發明説明（105) 定中使用的APP將包括在β-促泌酶切開位置的本發明之肽。 在先前的實例中描述了使正常ΑΡΡ之β-促泌酶切開位置 (VKM-DA，序列識別180號）突變成VSY-EV(序列識別177 號）、VSY-DA(序列識別178號）或ISY-EV(序列識別179號） 的方法。 在相關的程序中，藉著在殘基VSY之後導入終止密碼子 ，其與位置ρ3ρ2ρ,—致，進一步修改含有MBPC125-VSYEV 的MBPC125構築體。該構築體容許產生末端在----VSY的 MBPC 125融合蛋白質之截短版本。該截短蛋白質可用來建 立測量MPBC125蛋白質之Asp2切開產物的標準測定曲線 ，因爲其與預期的切開產物一致。可使用下列的引子對來 進行突變生成作用。 #VSYEND5 5'-GAC ATC TCT GAA GTG AGT TAT TAG GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GG-3X 序列識別 181 號） #VSYEND3 5'-TGA GTC ATG TCG GAA TTC TGC CTA ATA ACT CAC TTC AGO GAT CTC CTC-3’(序列識別 182號） 可使用在先前實例中描述的PCR程序，來導入突變。 實例9 創造包括SEAP、胰島素B鏈和本發明之Asp2認知序列的代 表性融合蛋白質 本實例描述融合蛋白質，其中利用經過修改之最佳Asp2 切開位置和Hu-Asp2之穿透膜功能部位（殘基454-477)，將 分泌性驗性嗜酸酶（SEAP)與部份或全長的胰島素B鍵融合 ，連同短C-終端附加Flag-標蕺的尾巴。在圖1中敘述這類 -108 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS 規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) s'.
,1T 1316960 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（1〇6) 肽/構築體的序列。 當在細胞株中，將融合蛋白質以重組方式與Hu_Asp2共同 -表現’或在具有内源Hu-Asp2活性的細胞株中表現時， Hu-Asp2將切開該融合蛋白質，將SEAP釋放至細胞培養基 中。因此，可以在培養基中之SEAP的活性爲基礎，來監視 蛋白酶的活性。 融合蛋白質之產製： 欲製造帶有擔任報告者之分泌性鹼性嶙酸酶的融合蛋白 質，使用得自 Topix (Bedford，MA)的 pCMV/SEAP載體 ϋΝΑ 。然後藉著指定位置之突變生成作用，將SEAP密碼區的終 止密碼子TTA突變成EcoRI位置GAATTC。然後以EcoRut 底地消化已經突變之質體，並以牛腸道鹼性磷酸酶處理， 使載體DNA脱鱗酸。使用該經過處理的載體dna，進行涵 蓋下文表4中組份2至4的DNA片段之後續插入作用。 合成編碼人類姨島素β-鏈的單鏈CDNA片段，並藉著pcr 擴大作用’使用該鏈作爲模板，產製雙股的DNA。5'-引子 含有EcoRI切開位置的突出部份。3，-引子含有BglII位置。 亦藉著PCR擴大作用’利用懸於flag-標籤密碼序列和£c〇Ri 選殖位置上的3·-引子，以及帶有Bglll位置的51-引子，產製 人類Asp2的穿透膜功能部位。以限制酵素EcoR^Bgin消 化兩個DNA片段，隨後連接到上文的載體dna内。藉著指 定位置之突變生成作用，產製跨越β-促泌酶切開位置的各 種本發明之肽。 -109· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） |_r. Ί 裝 φ-----1T—-----0ΙΦ---.— -rl (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 at B7 五、發明説明（1〇7) 表8 組份1(報告者) 組份2(切開位置） 組份3(膜標靶序列） 組份4(細胞溶質尾） SEAP序列 (殘基 1-506) VEANY-EVEGE (序列識別184號） Asp2穿透膜 flag標籤序列 蟲螢光素酶 (全長） VEANY-AVEGE (序列識別185號) APP 殘基598-661 DYKDDDDK (序列識別186號） CAT(全長） APP 殘基662-695 β-半乳糖甞酶 (全長） 半乳糖基轉移酶 (殘基4-27) Asp 1穿透膜功能部 位(殘基470-492) 唾液基轉移酶 (殘基 10-33) 賽特辛6 (殘基 261-298) 乙醯胺基葡糖轉移 酶(殘基7-29) 其他類型的融合蛋白質企圖使用APP的C -終端區。產 — k — i-----^#1 (.請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部中央檫隼局員工消費合作社印裝 -Ur. 與APP之C -終端97個胺基酸（殘基598-695)—致的PCR產物 。在殘基598處有天然的EcoRI位置，並將該Ec〇RI位置包含 在3，-引子上。以EcoRI消化PCR產物，並插入SEAP載體内 。藉著指定位置之突變生成方法’將編碼各種本發明中描 述之Hu-Asp2肽受質的DNA序列，插入APP之β-促泌酶切開 區内。 -110- [紙張尺度iijnt國國家標準（CNS) Α4規格（210Χ 297公嫠)一 1316960 A7 五、發明説明（108) 實例1 0 產製構築體，以便產生突變種APP之基因轉殖老鼠 按照上述，包括本發明之合成的P促泌酶認知序列的基因 轉殖動物，包含疾病狀態的有用動物模式。例如，這些動 物將是早老性癡呆徵候群的有用模式。本實例描述將這類 序列導入老鼠内的適當構築體。 創造基因轉殖老鼠的材料和方法目前已爲吾人所熟知， 並已經在文獻中描述，而可經易地改编，來製造本發明之 基因轉殖老鼠。例如，美國專利第5,877,399號（以引用的方 式併入本文中）描述表現APP Swedish突變的基因轉殖老鼠 。在美國專利第5,387,742號中描述了其他的基因轉殖老鼠 。企圖使用與在上文提及之專利中描述的那些類似的技術 ，連同本發明的敎導，產生老鼠模式。特別是在本發明中 產生基因轉殖老鼠的構築體，將包括已經突變（最好是在戋 接近其天然β-促泌酶認知序列之密碼子處）成包含編碼— 個本發明肽之序列的ΑΡΡ。 經濟部中央樣隼局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在特別具代表性的基因轉殖老鼠中，突變種Αρρ將在Αρρ 中’具有圍繞β -促泌酶切開位置之四個胺基酸的置換，也 就是以…SY- i -EV...(序列識別140號）代替….ΚΜ-丄 -DA.··.(序列識別139號）。在其他特定的具體實施例中，期 待突變的APP(例如人類APP695的突變種）將包括任何帶有 C -終端二離胺酸之添加的本發明之肽。較佳的構築體是帶 有C-終端二離胺酸添加’並帶有本發明之sYEVp促泌酶热 知序列的突變種人類APP695。 -111 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨OX 297公釐） 1316960 Α7 Β7 五、發明説明（1〇9) 選擇從Lite Tech購得的老鼠脫病毒（prion)蛋白質載體來 進行實驗。以Xhol消化該載體，並將末端弄鈍。將弄鈍的
Attr序列選殖到PrP載體的Xh〇][位置内，並藉著序列分析選 擇方位。 選擇用來導入老鼠内的β促泌酶受質，包括帶有C ·終端二 離胺酸添加’並帶有本發明之SYEVP促泌酶認知序列 (APP-kk-syev，序列識別183號）的人類app695。將經過修 改的APP序列選殖到pDONR2〇i内，而該重組反應將 APP-kk-syev序列插入prP載體内，在老鼠朊病毒啓動基因 的下游，和老鼠PRP31側面序列的上游。 使用此項技藝中已熟知及/或上述的同種重組技術，可使 用該構築體將經過修改的APP序列導入老鼠的胚胎幹細胞 内，並可使用該細胞產生藏匿有含有本發明之人造β促泌酶 受質序列之ΑΡΡ的基因轉殖老鼠。 顯然可使用與在前面的説明和實例中特別描述的不同的 方式來實行本發明。 經濟部中央樣隼局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 鑑於上文的敎導，許多本發明的修改和變化均是可能的 ，並因此仍在本發明的範圍内。所有在本文中提及之公告 的完整揭示内容，均以引用的方式併入本文中。 -112- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4現格（210X297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明（”〇) 序列-f表 <110> Van. Riqiang Tomasselli. Alfredo G. Gumey, Mark E. Emmons, Thomas L. Bienkowski. Mike J. Heinrikson, Robert L. <120> β-促泌酶活性的受質和測定 <130> 29915/00281 <140> 60/219,795 <141> 2000-07-19 <160> 197 <170> Patendn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2070 <212> DNA <213>人類 <4〇〇> i atggcccaag ccctgccctg gctcctgctg tggatgggcg cgggagtgct gcctgcccac 60 ggcacccagc acggcacccg gcrgcccctg cgcagcggcc cggggggcgc ccccctgggg 120 ctgcggccgc cccgggagac cgacgaagag cccgaggagc ccggccggag gggcagcar 180 gtggagatgg-tggacaaccc gaggggcaag tcggggcagg gciaccacgi: ggagatgacc 240 gtgggcagcc ccccgcagac gctcaacatc ctggtggata caggcagcag taactttgca 300 Stgggtgag^^cccccaccc cttcctgcat cfeiactacc «gaggcagct gtccagcaca，360 caccgggacclccggaaggg tgtgratgtg cccracaccc agggcaagtg ggaaggggag 420 ctgggcaccg acctggtaag catcccccat ggceccaacg tcactgtgcg tgccaacacr 480 gcigcMtca ctgaatcaga caagttcttc atcaacgga ccaactggga aggcatcctg 540 gggctggcct acgctgagat tgccaggcct gacgactccc tggagccttt ctttgactct 600 ctggtaaagc agaeceacg: ccccaacctc ttctccctgc acctttgtgg tgctggcttc 660 cccctcaacc agtcrgaagc gctggcctcc gtcggaggga gcatgaccac cggaggtatc 720 gaccactcgc tgtacacagg cagtctctgg tacacaccca tccggcggga gtggcaaac 780 gaggtcatca ttgcgcgggt ggagatcaac ggacaggacc cgaaaacgga ctgcaaggag 840 cacaacratg acaagagcac tgtggacagt ggcaccacca accctcgttt gcccaagaaa 900 gtgtrtgaag ctgcagtcaa atccatcaag gcagcctcct ccacggagaa gttccctgat 960 ggtttccggc taggagagca gctggtgcgc cggcaagcag gcaccacccc ttigaacatt 1020 ttcccagcca tctcactcta cctaatgggt gaggttacca accagrcctt ccgcaccacc L080 atccticcgc agcaatacc: gcggccagtg gaagatgtgg ccacgtccca agacgactgt 1140 tacaagtttg ccatctcaca gtcatccacg ggcaagtta tgggagctgttatcatggag 1200 ggcttctacg ccgcctttga ccgggcccga aaacgaattg gccttgctgt cagcgcagc 1260 catgcgcacg atgagctcag gacggcagcg gcggaaggcc cctttgtcac cttggacatg 1320 gaagactgtg gctacaacac tccacagaca gacgagtcaa ccctcatgac catagccta: 1380 gtcatggctg ccacctgcgc cctcttcatg ctgccactci: gcctcatggt gtgtcagcgg 1440 cgctgcctcc gctgcctgcg ccagcagcat gatgactttg ctgatgacat ctccctgctg 1500 aagtgaggag gcccatgggc agaagacaga gattcccctg gaccacaccc ccgcggctca 1560 ccttggtcac aagcaggaga cacagacggc acccgcggcc agagcacctc aggaccctcc 1620 ccacccacca aatgcctctg ccttgatgga gaaggaaaag gccggcaagg cgggctccag 1680 ggactgcacc tgcaggaaac agaaaagaga agaaagaagc accctgccgg cgggaacacc [740 cctggtcacc ccaaacttaa gtcgggaaac tccgccgcct gaaacctcag ccctgaacct 1800 ttgcccacca ctcctttaaa ttctccaacc caaagcattc ctcttttctt agtttcagaa 1860 -113- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（111) ^taccgycat cacacgcagg ttaccttgyc gtgcgtccct gt^^taccct ^gcagagaag 1920 ayaccaagct tgcttccctg ctggccaaa^ tcagtagga^ agyatgcaca gtttgcaitt 1980 t抑tw娜 aca哪actg tataaacaag cctaaamg gtgcaaagat tgcctatg;i 2040 attaaaaaaa naaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2070 <210>2 <21ί>501 <2L2>蛋白質 <2Π>人類 <400〉 2 Mec Ala Gin Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val 1 5 10 15 Lea Pro Ala His Gly Thr Gin flis Gly He Arg Leu Pro Leu Arg Ser 20 25 30 Gly Leu Gly Gly Aia Pro Leu Gly Leu Aj：g Leu Pro Arg Glu Thr Asp 35 40 45 Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Mec Val 50 55 60 Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Giy Gin Gly Tyr Tyr Val Glu iMec Thr 65 70 75 80 Vai Gly Ser Pro Pro Gin Tnr Lsu Asn He Leu Vai A.so Thr Giy Ser 85 90 95 ' Ser Asn Phe Ala Vai Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr 10G i05 110 Tyr Gin Arg Gin Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asd Leu Axg Lys Gly Val 115 120 125 Tyr Vai Pro Tyr Thr Gin Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asd 130 135 140 ' Leu Val Ser lie Pro His Gly Pro Asn Vai Thr Vai <^rg Ala Asn lie 145 L50 155 160 Ala Ala lie Thr Giu Ser Asp Lys Phe Phe He Asn Gly Ser Asn Trp 165 170 175 Glu Giy lie Leu Gly Leu Aia Tyr Ala Glu He Ala <^u:g Pro Asp Aso 180 185 190 " Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gin Thr His Val Pro 195 200 205 Asa Leu Phe Ser Leu Eiis Lea Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gin 210 215 220 Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Giy Ser Mec 0e [le Gly Gly He 225 230 235 240 Asp His Ser Leu Tyr Tnr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro tie Arg Arg 245 250 255 -114- 本紙張尺度適用令國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） n^i HIV— i —HI— i n^— In (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 A7 B7 五、發明説明（112) 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製
Glu Τφ Tyr Tyr Glu Val fie [le Val Arg Val Glu [le Ain Gly Gin 260 265 270 Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser [le Val 275 280 285 Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala 290 295 300 Ala Val Lys Ser He Lys Ala Ala Ser Ser Tor Gla Lys Phe Pro Asp 305 310 315 320 Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gin Leu Val Cys Trp Gin Ala Gly Thr Thr 325 330 335 Pro Τφ Asn lie Phe Pro Val He Ser Leu Tyr Lea Mec Gly Glu Vai 340 345 350 Tnr Asn Gin Ser Phe Arg lie Thr lie Leu Pro Gin Gin Tyr Leu Arg 355 300 365 Pro Val Glu Asp Vai Ala Tar Ser Gin Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala 370 375 380 Ue Ser Gin Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val He Mec Glu 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Axg Lys Arg lie Giy Phe Ala 405 410 415 Vai Ser Ala Cys His Vai His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu 420 425 430 Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn He Pro 435 440 445 Gin Tnr Asp Glu Ser Thr Leu Met Γπτ lie Ala Tyr Val Mec Ala Ala 450 455 460 lie Cys Ala Leu Phe iMec Leu Pro Leu Cys Lea Met Val Cys Gin Ti-p 465 470 475 480 ' Arg Cys Lea Arg Cys Lea Gin Gin His Asp Asd Phe Ala Aso Asp 485 490 495 ' ' He Ser Leu Leu Lys 500 <210>3 <2U> 1977 <212>DNA <213〉人類 <4〇〇> 3 atggcccaag ccctgccctg gctcctgctg cggacgggcg cgggagcgcc gcctgcccac 60 ggcacccagc acggcacccg gctgcccctg cgcagcggcc tggggggcgc ccccccgggg 120 -115 - 本紙張尺度適用中國國家橾隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 1316960 at B7 五、發明説明（113) ctgcgyctgc cccgggagac cgacgaagag cccgaggagc ccgyccgyug gjjycagcttc ISO gtggagatgg tggacaacct gaggggcaag tcggggcugg gctactacgt ggagatgacc 241) gtgggcagcc ccccgcaguc gctcaacatc ccggtggata caggcagcag taactttgca 300 gtgggtgctg ccccccaccc ctccctgcac cgctactacc agaggcagct gtccagcaca 36() taccgggacc tccggaaggg tgtgtatgtg ccctacaccc agggcaagtg ggaaggggag 420 ctgggcaccg acctggtaag catcccccat ggccccaacg tcactgtgcg tgccaacatt 480 gccgccatca ctgaatcaga caagttcttc atcaacggct ccaactggga aggcatcccg 540 gggccggcct acgctgagac cgccaggcct cgtggtgccg gcttccccct caaccagtct 600 gaagcgccgg cccctgccgg agggagcatg accactggag gcatcgacca cccgctgcac 660 acaggcagcc tctggcacac acccatccgg cgggagtggt actacgaggc gatcattgtg 720 cgggtggaga tcaatggaca ggatctgaaa atggaccgca aggagtacaa ctacgacaag 780 agcattgcgg acagcggcac caccaacctt cgtttgccca agaaagtgtt tgaagctgca 840 gtcaaatcca tcaaggcagc ctcctccacg gagaagttcc ctgatggttt ccggctagga 900 gagcagctgg tgcgctggca agcaggcacc accccttgga acattttccc agtcatctca 960 ccctacctaa tgggcgaggt taccaaccag cccnccgca tcaccatcct cccgcagcaa 1020 tacccgcggc cagcggaaga tgtggccacg tcccaagacg accgttacaa gtttgccatc 1080 tcacagtcat ccacgggcac cgtiatggga gctgctatca tggagggctt ctacgttgtc 1140 tttgatcggg cccgaaaacg aattggctrt gctgtcagcg cttgccatgc gcacgatgag 1200 ttcaggacgg cagcggcgga aggcccttn gccacctrgg acatggaaga ccgcggctac L260 aacactccac agacagatga gtcaaccctc acgaccatag cctatgtcat ggctgccacc 1320 tgcgccctcr tcacgctgcc actccgcctc atggtgtgtc agcggcgctg cctccgccgc 1380 ctgcgccagc agcacgatga ccttgccgat gacatcrccc tgctgaagtg aggaggccca 1440 tgggcagaag atagagattc ccctggacca cacctccgtg gttcactttg gtcacaagta 1500 ggagacacag atggcacctg tggccagagc acctcaggac cctccccacc caccaaatgc 1560 crctgccttg atggagaagg aaaaggccgg caaggtgggc iccagggaci: gcacccgtag 1620 gaaacagaaa agagaagaaa gaagcactcc gcrggcggga acactcttgg tcaccccaaa 1680 tnaagccgg gaaactccgc tgccrgaaac n:cagccc:g aaccurgtc caccaacct 1740 ttaaattctc caacccaaag cactcttctt ticttagiit cagaagtact ggcatcacac 1800 gcaggctacc uggcgtgrg tccctgtggi accctggcag agaagagacc aagcttgtn 1860 ccctgctggc caaagtcagt aggagagga: gcacagtttg ctamgctt tagagacagg i920 gactgcataa acaagcctaa cactggtgca aagattgcct cttgaaaaaa aaaaaaa 1977 <210>4 <21l>476-<212>蛋白質 <213>人類 <4〇〇>4
Mec Ala Gin Ala Leu Pro Trp Leu Lsu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val 1 5 10 L5
Leu Pro Ala His Gly Thr Gin His Gly lie Arg Leu Pro Leu Arg Ser 20 25 30
Gly Leu Gly Gly Ala Pro Laa Gly Leu Arg Lsu Pro Arg Glu Tnr Asp 35 40 45
Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val 50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gin Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr 65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gin Tar Lea Asn fie Leu Val Asp Thr Gly Ser 85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 〖LQ -116- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填鸾本頁) -—J . 訂 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（114)
Tyr Gin Arg Gin Leu Ser Ser Thr Tyc Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val U5 120 125 Tyr Val Pro Tyr Thr Gin Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp 130 135 140 Leu Val Ser [le Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn ile 145 150 155 160 Ala Ala [le Thr Giu Ser Asp Lys Phe Phe He Asa Gly Ser Asn Trp 165 170 175 Glu Gly He Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu He Ala Arg Leu Cys Gly 180 185 190 Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gin Ser Glu Vai Leu Ala Ser Val Gly Gly 195 200 205 Ser Mec Ha lie Gly Gly lie Aso His Ser Leu Tyr Thr Glv Ser Leu 210 215 220 ' Trp Tyr Thr Pro lie Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val lie He Val 225 230 235 240 Arg Vai Glu lie Asn Gly Gin Asp Lsu Lys Mec Asp Cys Lys Glu Tyr 245 250 255 Asn Tyr Asp Lys Ser lie Val Asp Ser Gly Thr Tnr Asn Leu Arg Leu 260 265 270 Pro Lys Lys Val Phe Giu Ala Ala Val Lys Ser lie Lys Ala Ala Ser 275 280 285 Ser Tnr Glu Lys Phe Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gin Leu Vai 290 295 300 Cys Trp Gin Ala Gly Tnr Tnr Pro Tro Asn lie Phe Pro Val lie Ser 305 310 315 320 Lsu Tyr Leu Met Gly Glu Val Tnr Asn Gin Ser Phe «Axg lie Thr He 325 330 335
Leu Pro Gin Gin Tyr Lsu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gin 340 345 350 Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala He Ser Gin Ser Ser Thr Gly Thr Val 355 360 365 Met Gly Ala Vai lie Met Glu Gly Phe Tyr Vai Val Phe Asp Arg Ala 370 375 380 Arg Lys Arg He Gly Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu 385 390 395 4〇〇 Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Giu 405 410 415 -117 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） >-----I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ' tj. · 訂 線 1316960 A7 B7 五、發明説明（115)
Asp Cys Gly Tyr Asn He Pro Gin Thr Asp Gtu Set' Thr Leu Met Thr 420 425 430 [le Aki Tyt· Val Met Ala Aki [le Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu 435 440 445
Cys Leu Met Val Cys Gin Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gin Gin 450 455 460
His Asd Asd Phe Ala Asp Asd He Ser Leu Leu Lys 465 470 475 <210>5 <2U> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <400>5
Lys Vai Glu Ala Asn Tyr Glu Val GIu Gly Glu Arg Lys Lys 1 5 10 <210>6 <21i> 15 <212>蛋红質 <213〉人造的序列 <220> 一 <223>人造序列的說明·_合成的肽序列-<400>6
Lys Vai Glu Ala Asn Tyr Glu Val Glu Gly Glu Arg Cys Lys Lys i 5 L0 15 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <210〉 7 <211> 14 <212>蛋白質 <2 Π>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 7
Lys Val Glu Aia Asn Tyr Ala Vai Glu Gly Glu Arg Lys Lys l 5 10 <210>8 <21l> 15 -118 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ 297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中夬標.準局員工消費合作社印製 五、發明説明（116) <2丨2>蛋白質 <2[3>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 8 Lys Val Glu Ala Asa Tyr Ala Val Glu Gly Glu ArgCys Lys Lys I 5 10 15 <210>9 <211>8 <2i2>蛋白質 <2Π>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 9 Glu Ala Asn Tyr Glu Val Glu Phe <210> 10 <211>8 <212>蛋白質 <213〉人造Θ序列 <220> <223>人考序列的說明：合成的肤序列 1:400〉10 Gly Val Leu Lsu Ala Ala Gly Trp <210> 11 <2U>8 <212>奎白質 <2 Π>人造的序列 <220> <223〉人造序列的説明：合成的肤序列 <400> 11 νϊϊ：; He He Lys iMet Asp Asn Phe Gly <210> 12 <21l> 10 <2[2>蛋白質 <2〖3>人造的序列 -119- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 1316960 Λ7 Α7 Β7 五、發明説明（117) <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 * <4〇〇> [2 * Asp Ser Ser Asn Leu Giu Mec Thr His Ala 1 5 10 <'210> 13 <21t>8 <2i2>蛋白質 ' <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (7) <223>Xaa=磺基丙胺酸 <400> 13
Thr His Gly Phe Gin Leu Xaa Kis 1 5 <210> 14 <211>8 <2i2>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：合成的肽序列 <4〇〇> 14
Cys Tyr Par His Ser Phe Ser Pro 1 5 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <210> 15 <2il>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222> (4) “ <223> Xaa=任何胺基酸 <220> -120- 本紙張尺度適用中國國家標準（.CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（118) <221>位置 <222> (7) <223> Xaa=任何胺基酸 <400> 15 Ser Thr Phe Xaa Gly Ser Xaa Gly <2I0> 16 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明 合成的肽序列 <220〉 <22i>位置 <222>(1) <223〉Xaa=任何胺基酸 <220> <221>位置 <222〉⑷..(7) <223> Xaa=任何胺基酸 <400> 16 Xaa Phe Aia Xaa Xaa Xaa Xaa Asn <210> 17 ~ <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明 合成的肽序列 := I - - - - - Hr· ....... n (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線< 經濟部中央橾準局員工消费合作.杜印装 <220> <221>位置 <222> (1)..(2) <223> i(aa=任何胺基酸 <220〉 <221>位置 <222> (4)..(7) <223> Xaa=任何胺基酸 <400〉 17 Xaa Xaa Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Ser <2L0> 18 -121 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0'X 297公釐） 1316960 A7 A7 B7 經濟部中夬樣_局員工消費合作社印製 五、發明説明（119) <2H>3 <212>蛋白質 <2【3>人造的序列 <220〉<223〉人造序列的說明：合成的肽序列 <220> <22丨> 位置 <222〉⑴..⑵<223>.Xaa=任何胺基酸 <220> <22丨> 位置<222> (4)..(7^<223> Xaa=任何胺基蘇<400> 18Xaa Xaa Glu^Xaa Xaa Xaa Xaa Glu <210> 19 <21l> 10 <2i2>蛋白質 <2i3>人造私序列 <220><223>人造序列的說明：合成的肽序列 <400> 19 Ser Glu: ValAsn Leu Asp Ala Glu Phe Ais .1 5 10 <210>20 <211> 10 <212>蛋_白質 <2i3>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400〉 20 Ser Glu Val Lys iVIet Asp Ala Glu Phe Arg <210>2L <2il> 10 <2丨2>蛋白質 人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 -122 - 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4現格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4° 1316960 A7 B7 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 五、發明説明（12〇) <220> <22l>MOD_RES <222> (5) <223> iMie <400>21 Ser Glu Val Asn Xaa Asp Ala Glu Phe Arg l 5 10 <210〉 22 <2U> 15 <2Π>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇0> 22 Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly He Ser Lea Aso Asn Lys Trp 1 5 iO i5 ' <210>23 <211> 17 <212>蛋白質 的序列 <220〉 <223>人填序列的説明：合成的肽序列 <400> 23 Trp Lys Lys Gly Ala He He Gly Leu Met Vai Gly Gly Val Val Lys 15 10 15 Lys <210> 24 <2il> 11 <212>蛋白質 <213>人造序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 24 Ala Asn Leu Ser Thr Phe Ala Gin Pro Arg Arg l 5 10 <210> 25 -123 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 A7 B7 五、發明説明（121 ) <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 25 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val l 5 10 15 Phe Phe Aia Glu20 <210〉 26 <211> 16 <212>蛋白質 <213〉人造^[序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 26 Leu Thr Gly Lys Thr He Γπτ Lsu Glu Val Giu Pro Ser Aso Tnr lie 15 10 15 ' <210〉 27 <211> 30 <212>蛋白質 <213〉人i£的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的狀序列 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) άφ. 經濟部中央樣隼局員工消費合作社印製 <220> <22i>位置 <222> (7) <223>Xaa=磺基丙胺酸 <220〉 <221>位置 <222〉（19) <223>Xaa=磺基丙胺酸 <400> 27 Phe Vai Asn Gin His Leu Xaa Gly Ser His Lsu Vai Giu Ala Lea Tyr l 5 10 15 Leu Val Xaa Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala 20 25 30 <210> 28 -124- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1316960 Α7 Β7 五、發明説明（122) <2ll>2l <2[2>蛋白質 <2[3>人造為序列<220> <223>人造序列的說明：合成的肽序叫<220> <221>位置 <222〉⑹ <223> kaa=靖基丙胺酸<220> <221>位置 <222〉（7) <223> j(aa=續基丙胺酸<220〉 <221>位置 <222>(11) <223〉續基丙胺酸 <220> <221>位置 <222〉(20) <223> j(aa=碎基丙胺較 <400> 28 Gly He Vai Glu Gin Xaa Xaa Ala Ser Val Xaa Ser Leu Tyr Gin Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Xaa Asn20 <210〉29 <211>23 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明 合成的肽序列 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣準局員工消費合作社印装 <4〇〇>29Tyr Arg Tyr Gin Ser His Asp Tyr Aia Phe Ser Ser Val Glu Lys Leu 1 5 10 15Leu His Ala Leu Gly Gly Cys 20 <210> 30 <2U>23 <2[2>蛋白質 <2Π>人造的序列 -125- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) /U規格（210Χ 297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（123) <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400〉 30 Tyr Arg Tyr Gin Ser His Asp Tyr Aia Phe Ser Ser Val Gla Lys Lea ί 5 iO 15 Leu His Ala Leu Gly Gly Cys 20 <210>3L <211〉8 <212>蛋白質 <2Π>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 31 Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp <210〉 32 <211>8 <212>蛋白_复 <213>人造尚序列 人造序列的説明：合成的肽序列 <400>32 Arg Gly Ser Met Ala Gly Val Leu —I— —SI I sms 言 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --線 經濟部中央櫺隼局員工消費合作社印製 <2i0> 33 <211〉8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：合成的肽序列 <400>33 - Gly Γπτ Gin His Gly He Arg Leu <210> 34 <21ί>8 <2i2>蛋白質 <213>人造的序列 -126- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（124) <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 34 Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Aia <2iO>35 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造β序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400〉 35 Gly Leu Ala Tyr Aia Glu lie Ala <210> 36 <21i>8 <212>蛋白質 <2i3>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 36 ~ His Leu Cys Gly Ser His Leu Val (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 <210〉37 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 37 Cys Gly Glu Axg Gly Phe Phe Tyr <210> 38 <2L1>7 <212>蛋白質 <2 Π>人造的序列 <220〉 -127 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（125 ) <223>人造序列的說明··合成的肽序列 <400> 38
Gly Vul Leu Leu Ser Arg Lys <210>39 <211>7 <212>蛋白質 <2i3>人造序列 <220> <223>人造序列的說明 合成的肽序列 <400> 39 Val Gly Ser Gly Val Leu Leu (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 <210> 40 <211>5 <2L2>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明 合成的肽序列 訂 <400>40
Vai Gly Ser Gly Vai 1 -5 <210>41 <211> 12 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> 合成的肽序列 <223>人造序列的説明 經濟部中央樣隼局員工消费合作杜印策 <220〉 <221>位置 <222> (9) <223>Xaa=磺基丙胺酸 <4〇〇>41
Lys Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Xaa Gly Glu Arg l 5 10 <210> 42 <21l> 15 <2〖2>蛋白質 -128- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公f ) 1316960 A7 B7 五、發明説明（126 ) <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <400> 42
Trp Arg Arg Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Glu Gly Glu Arg Lys 15 10 15 <210〉 43 <211> L4 <2i2>蛋白質 <213>人造的序列 <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <4〇〇> 43
Lys Val Glu Ala Asn Tyr Leu Val Glu Gly Glu Arg Lys Lys i 5 10 <210> 44 <2U>4 <212>蛋白_質 <213>人邊的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <400>44 Met Leu Leu Leu -- Hr »=- J In I — I ......a i- - —1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部中央橾準局員工消费合作.杜印製 <2i0>45 <211>6 <2i2>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <4〇〇> 45
Asp Ala Ala His Pro Gly <210>46 <2Ll> 14 <212>蛋白質 <213〉人造的序列 -129- 本紙張尺度適用t國國家橾準（CMS ) A4現格（210X^97公鳞） 1316960 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（127) <220> <22]>人造序列的説明：合成的3大序列 <4〇0> 46 Lys Val Glu Ala Asa Tyr Asp Val Glu Gly Glu Arg Lys Lys l 5 10 <'210> 47 <211> 14 <212>蛋白質 <213〉人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 47 Lys Vai Glu Ala Asn Leu Ala Val Glu Gly Giu Arg Lys Lys 1 5 10 <210>48 <2U> 14 <212>蛋白質 <2i3>人造的序列 <220> 一 <223>人造序列的說明：合成的肤序列 <400>48 Lys Val Glu*Ala Leu Tyr Ala Val Glu Gly Glu Arg Lys Lys 1 5 10 <210> 49 <211>8 <2i2>蛋白質. <213>人造序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222〉⑴ <223> Xaa = E，G，I，D，T，靖基丙胺酸或s <400> 49 Xaa Ala Asn Tyr Glu Val Glu Phe <210> 50 <2ll>8 -130- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 A7 B7 五、發明説明（128) <212>蛋白質 <2!3>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <22〖> 位置 <222〉⑵ <223>Xaa=A, V, [,S，H, Υ,Τ 或 F <4〇〇> 50 Glu Xaa Asn Tyr Glu Val Glu Phe <210>5l <2H>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (3) <223> Xaa= N，L, K, S, G，T, D, A, Q,或 E <400〉51 Glu Ala Xaa Tyr Glu Val Glu Phe <210> 52 <2L1>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 <220〉 <221>位置 <222> ⑷ <223>Xaa= Y，L，M，tVIe，F 或Η <400> 52 Glu Aia Asn Xaa Glu Val Glu Phe <210> 53 <21l>8 <212>蛋白質 -131 - 本紙伕尺度適用t國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1316960 A7 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（129) <213>人造的序列 <220> <2：23>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221〉位置 <222> (5) <223> Xaa= E，A，D, Q, S 或G <400〉53 Glu Ala Asn Tyr Xaa Val Glu Phe <2I0> 54 <211>8 <212>蛋白質 <213〉人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <220〉 <22〖> 位置 <222> (6) <223> Xaa= V, A, N, T, L, F 或 S <400> 54 Glu Ala Asn Tyr Glu Xaa Glu Phe <210〉 55 <211>8 <212〉蛋白質 <2Π>人造的序列 <220> <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (7) <223> Xaa= E, G, F, Η,磺基丙胺酸或S <400> 55 Glu Ala Asn Tyr Glu Val Xaa Phe <210> 56 <21l>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 -132 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 五、發明説明（130) <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <22[>位置 <222> (8) <223> Xaa= F, W, G，A, Η, P，G, N, S 或 E <400> 56 Glu Ala Asn Tyr Glu Val Glu Xaa 1 5 <210> 57 <2il>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> - <223〉人造序列的說明：合成的肽序列 <220> 位置 <222> ⑴ <223> Xaa= E，G, I, D, T,磺基丙胺酸或S <400> 57 Xaa Val Leu Leu Ala Ala Gly Trp <210> 58 <211>8 <2i2>蛋白質_ <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明 合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222> (2) <223> Xaa= A, V, I, S, Η, Y, T 或F <400> 58 Gly Xaa Leu Lea Ala Ala Gly Trp <210>59 <21l>8 <212>蛋白質 <2Π>人造的序列 -133 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本I) •i. 訂 線 1316960 atB7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（131) <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序叫 <220> <22[>位置 <222〉（3) <223> Xaa= N, L, K, S，G, T, D, A, Q 或 E <400〉 59 Gly Val Xaa Leu Ala Ala Gly Trp <210〉60 <2H>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222〉⑷ <223〉Xaa= Y, L, M, Nle, F 或 Η <400> 60 Gly Val Leu Xaa Ala Ala Gly Trp <210〉61 ' <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <22i>位置 <222> (5) <223> Xaa= E, A, D, M, Q, S 或 G <400〉01 Gly Val Leu Leu Xaa Ala Gly Trp <2L0> 62 <2U>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>-134 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,-----批衣 訂 線 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（132) <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221〉位置 <222> (6) <223>Xaa=V, A, N,IL, F 或 S <400> 62 Gly Val Leu Leu Ala Xaa Gly Trp <210> 63 <2U>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <翌3>人造序列的説明：合^的肽序列 <220> · <22丨> 位置 <222> (7) <5Ϊ3> Xaa= E，G, F, H,靖基丙胺酸或S <400> 63 Gly Val Leu Leu Ala Ala Xaa Trp <210>64 _ <21i>8 <2i2>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222〉（8) <223> Xaa= F, W，G, A, Η, P, G, N或 S <400> 64 Gly Val Leu Leu Ala Ala Gly Xaa <210> 65 <2U>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 -135 - 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
•IT 線 1316960 at B7 五、發明説明（133) <220><22〖> 位置 <222〉⑴ <223> Xaa= E. G，[，D，丁，靖基丙胺酸或s <400> 65 Xaa He Lys Met Asp Asn Phe Gly <210>66 <2U>8 <2i2>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222^2) <223> Xaa= A, V, I, S, Η, Y, T或 F <400> 66 He Xaa Lys Met Asp Asn Phe Gly (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 #1.
*1T <210〉67 <211>8 <212>蛋萏質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (3) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印策
<223> Xaa= N, L, K, S, G, T, D, A, Q 或 E <4〇〇> 67 lie lie Xaa Met Asp Asn Phe Gly <210〉68 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 合成的肽序列 <220> <223>人造序列的説明 -136- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1316960 at B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明（134) <220> <22t>位置 <222> (4) <223〉Xaa= Y, L，M, Mle，F或 Η <400> 68 [le Ue Lys Xaa Asp Asn Phe Gly <210>69 <211〉8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> ,, <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221〉位置 <222〉（5) <223> 父aa= E，A,.D, M, Q, S 或 G <400> 69 lie lie Lys Met; Xaa Asn Phe Gly <210> 70 <211>8 <212>蛋吞質 <213>人造h序列 <220> <223〉人造序列的説明 合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222> (6) <223>Xaa= V，A，N，T，L，F 或 S <4〇〇> 70 lie lie Lys Met Asp Xaa Phe Gly <210>71 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 -137 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印褽 五、發明説明（135) <220> <22〖> 位置 <222> (7) <223> Xaa= E, G, F，H,靖基丙胺酸或S <400>71 He [le Lys Met Asp Asn Xaa Gly <210〉72 <2U>8 <2i2>蛋白質 <2I3>人造4序列 <2乏3>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (8) <223> X拉=F, W，G, A, Η, P, G，N 或 S <400> 72 lie lie Lys Met Asp Asn Phe Xaa <210〉 73 <211> 10 <212>蛋岂質 <213〉人造的沣列 <220> <223>:人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222>(1) <223> Xaa= E, G, I, D, T, cj <400> 73 Xaa Ser Ser Asn Leu Glu Met Thr His Ala I 5 L0 <210> 74 <21l> 10 <2i2>蛋白質 <2〖3>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 -138 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
•1T 線 1316960 Α7 Β7 五、發明説明（136) <220> <221> 位 1 <222> (2) <223> A, V, [, S，Η，Υ, Τ 或 F <400> 74
Asp Xaa Ser Asn Leu Glu Met Thr His Ala ί 5 10 <210> 75 <2U> 10 <2〖2>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (3) <223> Xaa= N, L, K, S, G，T, D, A, Q 或 E <400> 75
Asp Ser Xaa Asn Leu Glu Met Tor His Ala 1 5 10 — 14-----裝 _· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 <210〉 76 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (4) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 <223>Xaa=Y，L，M，Nle，F 或Η <400> 76
Asp Ser Ser Xaa Met Tnr His Ala <210>77 <21l> L0 <212>蛋白_質 <2Ϊ3>人造6序列 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 -139 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消费合作社印装 五、發明説明（137) <221〉位置 <222> (7) . <223> X:ui= E, A, D, iV[, Q, S 或 G <400> 77 Asp Ser Ser Asn Leu Glu Xaa Thr His Ala t 5 ίΟ <2lO> 78 <21l> 10 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (8) <223>Xaa= <400> 78 Asd Ser Ser Asn Leu Gla Met Xaa His Ala 1 5 10 <210> 79 <2U>9 <2Π>蛋白質 <2Π>人造的序列. <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221〉位置 <222> (8) <223> Xaa= Ε, G, F, Η,續基丙胺酸或S <400> 79 Asp Ser Asn Leu Glu Met Thr Xaa Ala <210> 80 <211>9 <212>蛋白質 <213>人造序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置-140 - 本紙張尺度通用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 LT . 1316960 at B7 五、發明説明（138) < 7T7> ⑼ <2‘23> Xaa二 F, W, G，A. Η，P. G, Ν 或 S <400> 80
Asp Ser Asn Leu Giu Met Thr His Xaa <210>81 <2Il>8 <2〖2>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <22丨> 位置 <222> (1) <223> Xaa= E，G, I，D，T，磺基丙胺酸或S <220〉 <221>位置 <222> (7) <22欠站=續基内胺酸 <400>81 Xaa His Gly Phe Gin Leu Xaa His (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝一 訂 <210> 82 _ <211〉 8 <212>蛋白質 <213>人造'的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 經濟部_央標準局員工消費合作社印製 <22i>位置 <222〉⑺
<223> iaa= A, V, I, S, Η, Y, T或 F <220> <221>位置 <222〉(7) <223>Xaa=績基丙胺酸 <4〇0> 82
Thr Xaa Giy Phe Gin Leu Xaa His <210> 83 <2L1>8 -141 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（139) <212>蛋白質 <213〉人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的形c序列 <220〉 <221>位置 <'^22> (3) <公3> Xaa= N, L，K, S, G, T, D, A, Q或 E <220> <22丨> 位置 <222> (7) <iZ3>Xaa=磺基丙胺酸 <400> 83 Thr Kis Xaa Phe Gin Leu Xaa His <210> 84 <211>8 <2Π>蛋白質 <213>人造的序列 <22〇> <泛23>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位1 <222〉⑷— <223> Xaa= Y, L，M，NK F或 Η <220> <221〉位置 <222> (7) <223〉kaa= |績基丙胺酸 <400〉 84 Thr His Gly Xaa Gin Leu Xaa His <210〉 85 <21l>8 <212>蛋白質 <2i3>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <22〖> 位置 <222〉(5)-142 - 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --*··-------裝-11^— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 at B7 五、發明説明（140) <223〉Xaa= E, A. D, M, Q，S 或 G <220> <22〖> 位置 <222> (7) <22j> Xaa=靖基丙胺酸 <400> 85 Thr His Gly Phe Xaa Leu Xaa His l 5 <2L0> 86 <2il>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (6) <223> Xaa= V, A, N，T, L，F或 S <220> <22丨> 位置 <222〉（7) <223> Xaa=績基丙胺酸 <400> 86 ihr iiis G1_y Phe Gin Xaa Xaa His 1 5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 <210〉87 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的>列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 <220> <221>位置 <222〉（7) <223> Xaa= E，G, F, H，靖基丙胺酸或s <400〉87 _
Thr His Gly Phe Gin Leu Xaa His l 5 <210> 88 <2ll>8 <2[2>蛋白質 143 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 at B7 五、發明説明（141) <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <220> <22〖> 位置 <222> (7) <223> Xaa= cysceic acid <220> <22丨> 位置 <222〉（8) <223> Xaa= F, W, G, A, Η, P, G, N 或 S <400〉 88 Thr His Gly Phe Gin Leu Xaa Xaa <2i0> 89 <211>8 <212>蛋白質 <2Γ3>人造的序列 <220> <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-裝I 訂 <220> <221>位置 <222〉（1) _ <223〉XaaS Ε，G, I, D, Τ，磺基丙胺酸或S. <400> 89 線
Xaa Tyr Thr His Ser Phe Ser Pro i 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 <210>90 <211>8 <2i2>蛋白質 <2i3>人造4序列 <220〉 <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222〉⑴ <223> Xaa= cysceic acid <220> <221〉位置 <222> (2)
<223〉Xaa= A，V,[, S, Η, Y, T或 F -144 - 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（142) <400> 90 Xaa Xaa Thr His Ser Phe Ser Pro <2l0>9l <2H>8 <2[2>蛋白質 <2Π>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221〉位置 <222>(1) <223> j(aa=續基丙胺酸 <220> <221>位置 <222> (3) <223> Xaa= N，L, K, S, G, T, D, A, Q 或 E <400>91 Xaa Tyr Xaa His Ser Phe Ser Pro <210> 92 <2U>8 <212>蛋白質 <213〉人蓬4序列 <220〉 <223>:人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222〉⑴ <223>Xaa=磺基丙胺酸 <220> <221>位置 <222> (4) <223〉Xaa= Y, L, M, Nle, F 或 Η <400> 92 '' Xaa Tyr Thr Xaa Ser Phe Ser Pro <210> 93 <21l>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 -145 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝-----訂--- 1316960 Λ7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（143) <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221〉位置 <222>(1) <223>Xaa=磺基丙胺酸 <220> <221>位置 <222> (5) <223> Xaa= E，A, D, M, Q, S 或 G <400〉93 Xaa Tyr Γητ His Xaa Phe Ser Pro <210>94 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (1) <223> |續基丙胺 <220〉 <221>位置 <222〉⑹ <223> Xaa= V, A, Μ T, L, F 或 S <400〉94 Xaa Tyr Thr His Ser Xaa Ser Pro <210〉95 <2U>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222〉⑴ <223〉命基丙胺酸 -146 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公f ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) άφ. ,ιτ 線 1316960 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（144) <220> <221>位置 <222> (7) <云3> Xaa=E, G，F. H，.績基丙胺酸或s <40〇> 95 Xaa Tyr Thr His Ser Phe Xaa Pro <210>96 <21l>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222〉⑴ <223>父aa=績基丙胺酸 <220> <221>位置 <222> (8) <223> Xaa= F，W, G, Α，Η, P, G, N 或 S <400> 96 Xaa Tyr Γητ His Ser Phe Ser Xaa <210> 97 <2H>8 <2Π>蛋白質 <213>人邊銬岸列 <220> ' <223>人造序列的說明 合成的肽序列 <220> <221>位置 <222〉（1) <223> Xaa= E, G, I, D, T,磺基丙胺酸或S <220〉 <22i>位置 <222> (7) <223>kaa=任何胺基酸 <220> <22〖> 位置 <222> ⑷ <223> Xaa=任何胺基酸 -147 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 Λ7 B7 五、發明説明（145) <4()()> 97
Xaa Thr Asp Xaa Gly Ser Xaa Gly <2l0> 98 <2ll>8 <2I2>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <22i>位置 <222> (2) <223> Xaa=A, V, I, S，Η, Y, T 或 F <220〉 <221>位置 <222〉⑷ <223> Xaa=任何胺基酸 <220〉 <221>位置 <222> (7) <223> 任何胺基酸 <4〇〇> 98 Ser Xaa As? Xaa Gly Ser Xaa Gly (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·.
*1T <210〉99 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的岸列 <220> <223〉人造序列的説明：合成的肽序歹5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 <220〉 <221>位置 <222> (3)
<公3> Xaa= K L, K, S, G, T, D, A, Q 或 E <220〉 <221>位置 <222> (4) <223〉Xaa=任何胺基酸 <220> <221>位置 <222> (7) <223> Xaa=任何胺基酸 -148 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X297公f ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1316960 Λ7 B7 五、發明説明（146) <4〇〇> 99
See Thr Xaa Xaa Gly Ser Xaa Gly <2l0> 100 <2ll>8 <2i2>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223〉人造序列的說明··合成的肽序列 <220〉 <22i>位置 <222> (4) <223〉Xaa= Y，L，M，Nle，F 或Η <220> <22i>位置 <222> (7) <223> Xaa=任何胺基酸 <400> 100
Ser Γπγ Asp Xaa Gly Ser Xaa Gly <210〉101 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造·的序列 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <221>位置 <222〉⑷ <223> Xaa=任何胺基酸 <220〉 <221>位置 <222> (7) <223> Xaa=任何胺基酸 <220> <221>位置 <222> (5) <223> Xaa= E，A, D，M，Q，S 或 G <400> 101
Ser Thr Asp Xaa Xaa Ser Xaa Gly -149 - 本紙張尺度適用中國國家標準（0~5)人4規格（2丨0>< 297公釐） --IJt-----裝·-----.玎------0Φ— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1316960 at B7 五、發明説明（147) <2I0> I02 <2ll>8 <2丨2>蛋白質 <2丨3>人造的序列 含梁人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <22〖> 位置 <222〉⑷ <223> Xaa=任何胺基酸 <220> <221>位1 <222> (7) <223> Xaa=任何胺基酸 <220〉 <221>位置 <222> (6) <223> Xaa= V，A, N, T, L，F 或 S <400> 102
Ser Tnr Asp Xaa Giy Xaa Xaa Gly <210> L03 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222〉⑷ <223> Xaa=任何胺基酸 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <220〉 <221>位置 <222> (7) <223> j(aa= E，G, F，H,續基丙胺酸或s <400> 103
Ser Thr Asp Xaa Gly Ser Xaa Gly <210> 104 <2ll>8 . <212>蛋白質 <2丨3>人造的序列 -150- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X 297公f ) 1316960 Λ7 B7 經濟部中夬標隼局員工消费合作杜印製 五、發明説明（148) <220> <i23>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222〉(4) <2泛3> Xaa=任何胺基酸 '<220> <22〖> 位置 <222> (7) <223> Xaa=任何胺基酸 <220〉 <221>位置 <222〉（8) <223〉Xaa= F, W, G，A, H，P, G，N 或 S <4〇〇> 104 Ser Γπτ Asp Xaa Gly Ser Xaa Xaa <2L0> 105 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的;f列 <22〇> <乏23>人造序列的説明：合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222^1) <223〉Xaa= E，G, I, D, T，磺基丙胺酸或S <220> <221〉位置 <222> (4)..(7) <223> Xaa=任何胺基酸 <400> 105 Xaa Phe Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Asn <210> 106 <21l>8 <212>蛋白質 <2i3>人造的序列 <220〉 <223>丨人造序列的説明：合成的肽序列 -151 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱請背面之注意事項再填寫本頁) 裝·-
,1T 線 1316960 at Β7 五、發明説明（149) <220> β <221>^S <222> (1) <H5> Xaa=任何胺基酸 <220> <22丨> 位置 <2^> (2)
<2g>xi=A，V，I，S,H.Y，l^F <220> <221>位置 <222> (4)..(7^ <223〉Xaa=任何胺基酸 <4〇0> 106
Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Asn <210> 107 <211>8 <212>蛋白質 <2I3>人造的岸列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 <220〉 <221>位置 <222〉（1) <223> Xaa^任何胺基酸 <220〉 <221>位置 <222> (3) 七23> Xaa= N, L，K, S，G，T, D，A, Q 或 E <220〉 <221>位置 <222〉⑷.·⑺ <223> Xaa=任何胺基酸 <400> 107 Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn <2i0> 108 <2U>8 <2i2>蛋白質 <2〖3>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明 合成的肽序列 線 -152 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（15〇) <220> <22[>位置 <222> (I) <2^> Xaa=任何胺基酸 <220> <22[> 位1 <222> (4) <223〉Xaa= Y, L，M, Nle, F 或 Η <220> <221>位1 <222〉（5)··⑺ <223> kaa=任何胺基酸 <400> 108 Xaa Phe Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Asn <210> 109 <21l>8 <2i2>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣準局員工消費合作社印裝 <220> <221>位置 <222〉⑴ <223> Xaa_5任何胺基酸 <220> . β <221>位置 <222> ⑷ <223>Xaa=任何胺基酸 <220> <22i>位置 <222〉（5) <223> 3(aa= E, A, D, iVi, Q, S 或 G <220> <221>位置 <222> (6)..(7) <223> Xaa=任何胺基酸 <400> 109 Xaa Phe Aia Xaa Xaa Xaa Xaa Asn <210> 110 <21L>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 -153 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 訂 1316960 A7 B7 五、發明説明（151 <220> <223〉人造序列的説明 合成的肽序列 <220> <22丨> 位置 <222>(1) <223>Xaa=任何胺基酸 <220> <221>位置 <222> (4)..(5) <223> kaa=任何胺基酸 <220> . „ <221>位置 <222〉⑹- 一 <223〉kaa= V, A, N, T, L，F 或 S <220> <221>位置 <222> (7) <223> Xaa=任何胺基酸 <400> 110 Xaa Phe Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Asn (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂 <210> 111 <211>8 <212>蛋鱼質 <213>人造的序列 合成的肽序列 <220> <223>人造序列的説明 線 <220> w <221>位置 <222> (1) <223〉任何胺基 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 <220〉 <221>位置 <222> (4)..(6) <223> Xaa=任何胺基酸 <220> <22〖> 位置 <222> (7) ^ <223> Xaa= E, G, F, H,磺基丙胺酸或S <4〇0> 111
Xaa Phe Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Asn -154 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 A7 B7 合成的肽序列 五、發明説明（152 ) <2l0> U2 <211>8 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明 <220> <221>位置 <222>(1) <公弘Xaa=任何胺基酸 <220> „ <22丨> 位置 <222> (4)..(7) <223>i(aa=任何胺基酸 <220> <221>位置 <222> (8) 上 <223> Xaa= F，W; G，A，H，P, G，N 或 S <400> 112
Xaa Phe ,\ia Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 <210〉 113 <211>9 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明 合成的肽序列 <400> 113 Glu Val Asn Leu Asp Ala Giu Phe Arg 線 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製. <210> 114 <21L>7 <2i2>蛋白質 <213>人造的序列 人造序列的説明 合成的肽序列 <400> ί L4 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys -155 - 本紙張尺度適用中國國家標羋（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 at Β7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（153) <21ϋ> 115 <21ί> 17 <2丨2>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 1L5 Ala Cys Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly [le Ser Leu Asp Asn Lys 15 10 15 Trp <210> 116 <211> 17 <212>蛋白質 <213〉人造的序列 <220〉 <223〉人造序列的說明：合成的肽序列 <4〇〇> 110 Trp Lys Lys Gly Ala De lie Giy Lsu Met Val Gly Gly Val Vai Lys 1 5 10 15 Lys <210> 117 <21i> 11 <212>蛋白質 <213〉人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <4〇〇> 117 Ala Asn Leu Ser Tbx Phe Ala Gin Pro Arg Arg l 5 10 <2i0> 118 <211>22 <212>蛋白質 <2Π>人造的年列 <220> <223>.人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 113 -156- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） --Γ--------裝·1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（154)
Tyr Arg Tyr Gin Ser His A^p Tyr Ala Plie Ser See Vat Glu Ly.s Leu ί 5 10 [5 Leu His Leu Gly Gly Cys 20 <210> 119 <211>22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 119 Tyr Arg Tyr Gin Ser His Asp Tyr Ala Phe Ser Ser Val Glu Lys Leu Leu His Leu Gly Gly Cys 20 <210> 120 <211> 10 <212>蛋白質 <213〉人造的舁列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 120- Lys Thr fle Tnr Leu Glu Val Glu Pro Ser 1 5 10 <210> 121 <211> 12 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <220> <22丨> 位置 <222> (9) <223>Xaa=磺基丙胺酸 <400> 121 Val Gla Ala Leu Tyr Leu Val Cys Xaa Gly Glu Arg I 5 10 <210> 122 -157 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·- 訂 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五 '發明説明（155) <2ll> II <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的太序列 <400> 122 Val GIu Ala Leu Tyr Leu Val Glu Gly Glu Arg l 5 10 <210> I23 <21l>363 <2i2>蛋白質 <213>人類 <220〉 <223>半乳糖基轉移酶 <400> 123 Mec Ala Ser 乙ys Ser Trp Leu Asn Phe Leu Thr Phe Leu Cys Gly Ser 1 5 10 15 Ala Ue Gly Phe Lau Leu Cys Ser Gin Lau Phe Ser lie Lsu Lsu Gty 20 25 30 Glu Lys Val Asp Thr Gin Pro Asn Val Leu His Asn Asd Pro His .Aia 35 40 45 ' Arg His Ser Asp Asp Asn Gly Gin Asn His Leu Glu Gly Gin Met Asn 50 _ 55 60 Phe Asn Ala Asp Ser Ser Gin His Lys Asp Glu Asn Tnr Asp lie Ala 65 70 75 80 Glu Asn Leu Tyr Gin Lys Vai Arg lie Lsu Cys Trp Val Met Tnr Gly 85 90 95 Pro Gin Asn Leu Glu Lys Lys Ala Lys His Val Lys Aia Thr Trp Ala 100 105 110 Gin Arg Cys Asn Lys Val Leu Phe Mec Ser Ser Glu Glu Asn Lys Asp 115 120 125 Phe Pro Ala Val Gly Lsu Lys Thr Lys Glu Gly Arg Asp Gin Leu Tyr 130 135 140 Trp Lys Tor He Lys Ala Phe Gin Tyr Val His Glu His Tyr Leu Glu 145 150 155 160 Asp Ala Asp Trp Phe Leu Lys Ala Asp Asp Asp Tnr Tyr Val He Leu 16) 170 17) Asp Asn Leu Arg Trp Leu Leu Ser Lys Tyr Asp Pro Glu Glu Pro He [80 185 190 -158- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 五、發明説明（156) Tyr Phe Gly Arg Arg Phe Lys Pro Tyr Val Lys Gin Gly Tyr Met Sec [95 200 205 Glv Gly Ala Gly Tyr Val Leu Ser Lys Glu Ala Lea Lys Arg Phe Val 210 215 220 Asp Ala Phe Lys Thr Asp Lys Cys Thr His Ser Ser Ser ile Glu Asp 225 230 235 240 Leu Ala Leu Gly Arg Cys Met Glu He Met Asn Vai Glu Ala Gly Asp 245. 250 255 Ser Arg Asp Thr lie Giy Lys Glu Thr Phe His Pro Phe Vai Pro Glu 260 265 270 His His Leu He Lys Gly Tyr Leu Pro Arg Thr Phe Trp Tyr Trp Asn 275 280 285 Tyr Asn Tyr Tyr Pro Pro Vai Glu Gly Pro Gly Cys Cys Ser Asp 乙eu 290 295 300
Ala Vai Ser Phe His Tyr Val Asp Ser Thr Thr Mec Tyr Glu Leu Glu 305 310 315 320 Tyr Leu Val Tyr His Leu Arg Pro T：/r C4y T；/r Leu Tyr Arg Tyr Gin 325 330 335 Pro Tor Leu Pro Glu Arg lie Leu Lys Glu Qe Ser Gin Aia Asn Lys 340 345 350 Asn Glu Asp Thr Lys Vai Lys Leu Gly Asn Pro . 355 ^ 360 <210> 124 <2U>4〇5 <2i2>蛋白質 <213>人類 <220> _ <223>人類唾液基轉移酶1 <4〇〇> 124 Qe His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val Phe 1 5 10 15 Lsu Leu Phe Aia Vai lie Cys Val Tro Lys Glu Lys Lys Lys Giy Ser 20 25 ' 30 Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Lea Gla Thr Lys Glu Phe Gla Val Leu Lys 35 40 45 Ser Leu Gly Lys Leu Ala Mec Gly Ser Asp Ser Gin Ser Val Ser Ser 50 55 60 Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser Leu 65 70 75 80 -159 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 at B7 五 經濟部中央樣隼局員工消費合作社印製 發明説明（157)
Ai'g Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Scr Phe Gla Val Tip Asn S5 90 95 Lys Asp Ser S^r Ser Lys Asn Leu Ue Pro Arg Leu Gin Lys [le Tip I00 105 110 Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asa Lys Tyr Lys Vai Ser Tvr Lys Gly Pro 115 120 125 Gly Pro Gly Ue Lys Phe Ser Ala Gla Ala Leu Arg Cys His Leu Arg 130 135 140 Asp His Val Asn Val Ser iVfei: Vai Glu Vai Thr Asp Phe Pro Phe Asn 145 150 155 160 T'or Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Lsu Pro Lys Glu. Ser He Axg Thr Lys 165 170 175 Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys ,Aia Vai Val Ser Ser Ala Gly Ser Lau 180 185 190 Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu Ue Asd Asp His Asd Ala Val Lea 195 200 205' Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gin Gin Aso Vai Gly Thr· 2i0 215 220 ' Lys Thr Tnr He Axg Lsu Met Asn Ser Gin Leu Vai Tnr Tor Glu Lys 225 230 235 240 Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly He Leu He Vai Trp 245 250 255 Asd Pro Ser Val Tyr His Ser Asp lie Pro Lys Tro Tyr Gin Asn Pro 260 265 270 · Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His Pro 275 280 285 Asa Gin Pro Phe Tyr lie Lea Lys Pro Gin Met Pro Tro Giu Leu Trp 290 295 300 ' Asp He Leu Gin Giu lie Ser Pro Glu Glu lie Gin Pro Asn Pro Pro 305 310 315 320 Ser Ser Gly Met Leu Gly lie He lie Met Met Thr Leu Cys Asp Gin 325 330 335 Val Asp tie Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asd Val Cys 340 345 350 ' Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr 355 360 365 His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asa Gin Gly 370 375 380 -160 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CMS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 1316960 at B7 經濟部中央樣隼局員工消费合作社印製 五、發明説明（158) Thr Asp Glu Asp He Tyr Leu Leu Gly Lvs Ala Thr Leu Pro Gly Phe J85 390 j95 400 Arg Thr [le His Cys 405 <210> 125 <2U>518 <212>蛋白質 <2〖3>人類 <220> <223>人類天冬胺醯基蛋白酶i <400> 125 Met Gly Ala Leu Ala Arg Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gin Tro 1 5 10 15 Leu Leu Arg Ala Ala Pro Glu Leu Ala Pro Ala Pro Phe Thr Leu Pro 20 25 30 Leu Vai Ala Ala Ala Tnr Asn Arg Vai Val Ala Pro Γπτ Pro Gly 35 40 45 Pro Gly Thr Pro Ala Glu Arg His Ala Aso Giy Leu Ala Leu Ala Leu 50 55 60 ' Glu Pro Ala Leu Ala Ser Pro Ala Gly Ala Aia Asn Phe Lsu Ala Met 65 70 75 80 Vai Asp Asn Leu Gin Gly Asp Ser Gly Arg Gly Tyr Tyr Lsu Glu Met P 90 95 Leu lie Gly Thr Pro Pro Gin Lys Leu Gin lie Leu Val Asp Thr Gly LOO 105 110 Ser Ser Asn Phe Ala Vai Ala Gly Thr Pro His Ser Tyr He Asd Thr 115 120 125 ' Tyr Phe Asp Thr Glu Arg Ser Ser Thr Tyr Arg Ser Lys Gly Phe Aso 130 135 140 ' Val Thr Val Lys Tyr Thr Gin Gly Ser Trp Tnr Gly Phe Val Gly Glu 145 150 155 160 Asp Leu Val Thr lie Pro Lys Giy Phe Asa Tnr Ser Phe Leu Val Asn 165 L7Q 175 lie Ala Thr He Phe Gla Ser Glu Asn Phe Phe Leu Pro Gly He Lys 180 185 190 Trp Asn Gly He Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Ala Lys Pro Ser 195 200 205 Ser Ser Leu Glu Thr Phe Phe Asp Ser Leu Val Thr Gin Ala Asn tie 210 215 220 ----Η-----#丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -161 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 五、發明説明（159)
Pro Λ^η Vai Phe Ser iVfet Gin Met Cys Gly Ala Gly Lai Pro Val Ala 225 230 235 24() Gly Ser Gly Thr Asn Gly Gly Ser Leu Vai Leu Gly Gly [le Gin Pro 245 250 255 Ser Leu Tyr Lys Gly Asp [le Trp Tyr Thr Pro Oe Lys Glu Glu Ttp 260 265 270 Tyr Tyr Gin He Glu He Leu Lys Leu Glu Qe Gly Gly Gin Ser Leu 275 280 285
Asn Leu Asp Cys Arg Glu Tyr Asn Ala Asd Lys Ala He Vai Asp Ser 290 295 300 ' Gly Tar Thr Leu Leu Axg Leu Pro Gin Lys Val Phe Asp Ala Val Vai 305 310 315 320 Glu Ala Val Ala Arg Ala Ser Leu He Pro Glu Phe Ser Asp Gly Phe 325 330 335 Tro Tor Gly Ser Gin Leu Ala Cys Tro Thr Asn Ser Glu Thr Pro Tro ' 340 345 ' 350 ' Ser Tyr Phe Pro Lys He Ser He Tyr Leu Arg Asd Giu Asn Ser Ser 355 300 365 ' Arg Ser Phe Arg He Thr lie Leu Pro Gin Leu Tyr lie Gin Pro Met 370 375 380 Mec Gly Ala Gly Leu Asn Tyr Glu Cys Tyr Arg Phe Gly lie Ser Pro 385 390 395 400 Ser Tnr Asn Ala Leu Val lie Gly Ala Tnr Val Met Glu Gly Phe Tyr 405 410 415 Val lie Phe Asp Arg Ala Gin Lys Arg Val Gly Phe Ala Ala Ser Pro 420 425 430 Cys Ala Glu He Ala Gly Ala Ala Val Ser Glu lie Ser Gly Pro Phe 435 440 445 Ser Thr Glu Asp Val Ala Ser Asn Cys Val Pro Ala Gin Ser Leu Ser 450 455 460 Glu Pro lie Leu Trp He Val Ser Tyr Aia Leu Met Ser Val Cys Gly 465 470 475 480 Aia lie Leu Leu Vai Leu He Val Leu Leu Leu Leu Pro Phe Arg Cys 485 490 495 Gin Arg Arg Pro Αχ-g Asp Pro Glu Val Val Asn Asp Glu Ser Ser Leu 500 505 510 Val Arg His Arg Trp Lys 515 -162- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 丨 L—j------I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 1316960 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明（) <210> 126 <211 >255 <2丨2>蛋白質 <2[3>人類 <220> <223>人類赛特辛6 <400> 126 iVfec Ser Met Glu Asp Pro Phe Phe Val Val Lys Gly Glu Val Gin Lys I 5 10 15 Ala Val Asn Thr Ala Gin Gly Leu Phe Gin Arg Tro Thr Glu Leu Leu 20 25 30 ' Gin Asp Pro Ser Thr Ala Thr Arg Glu Glu lie Asd Trp Thr Thr Asn 35 40 45 ' Glu Leu Arg Asn Asn Leu Aig Ser lie Glu Trp Asp Leu Glu Asp Leu 50 55 60 Asp Glu Tnr lie Ser lie Val Glu Ala Asn Pro Arg Lys Phe Asn Leu 65 70 75 30 Asp Ala Thr Glu Leu Ser ile ^jrg Lys Ala Phe ile Thr Ser Thr Arg 85 90 95 Gin Vai Val Arg Asp Met Lys Asp Gin Met Ser Thr Ser Ser Val Gin 100 105 110 Ala Leu Ala Glu Arg Lys Asn Arg Gin Ala Leu Leu Gly Asp Ser Gly 115 _ 120 125 Ser Gin Asn Trp Ser Tnr Gly Thr Thr Asd Lys Tyr Gly Arg Lea Asp 130 135 140 ' Arg Glu Leu Gin Arg Ala Asn Ser His Phe lie Giu Glu Gin Gin Ala 145 150 155 160 Gin Gin Gin Leu He Val Glu Gin Gin Aso Glu Gin Leu Glu Leu Val 165 170 '175 Ser Gly Ser lie Gly Val Leu Lys Asn Met Ser Gin Arg He Gly Gly 180 185 190 Glu Leu Glu Glu Gin Ala Val Met Leu Giu Asp Phe Ser His Glu Lea 195 200 205 Glu Ser Tnr Gin Ser Arg Leu Asp Asn Val Met Lys Lys Leu Ala Lys 210 215 220 Val Ser His Met Thr Ser Asp ,Axg Arg Gin Trp Cys Ala He Ala He 225 230 235 240 Leu Phe Ala Val Leu Leu Val Val Leu He Leu Phe Leu Val Leu 245 250 255 -163 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） — L-------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 線 -VI · 五、發明説明（161) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 1316960 at B7 <2tO> I27 <211> 1723 <2I2> DNA <213>人造的序列 <赶3>人造序列的説明：編碼重组融合蛋白質的核酸 <400> 127 ^ acgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg aggctacagc tcuccctggg catcacccca 60 gttgaggagg agaacccgga cttctggaac cgcgaggcag ccgaggcccc gggtgccgcc 120 aagaagctgc agcctgcaca gacagccgcc aagaacctca tcaccttccc gggcgatggg 180 acgggggtgc ctacggcgac agctgccagg accctaaaag ggcagaagaa ggacaaactg 240 gggcccgaga cacccccggc cacggaccgc ttcccatatg tggctccgtc caagacacac 300 aacgcagaca aacacgtgcc agacagcgga gccacagcca cggcctacct gtgcggggtc 360 aagggcaacc tccagaccac tggcttgagt gcagccgccc gctttaacca gtgcaacacg 420 acacgcggca acgaggtcat ctccgtgatg aaccgggcca agaaagcagg gaagccagtg 480 ggagtggtaa ccaccacacg agtgcagcac gcctcgccag ccggcaccta cgcccacacg 540 gtgaaccgca actggtactc ggacgccgac gtgcctgcct cggcccgcca ggaggggtgc 600 caggacatcg ctacgcagct catctccaac atggacattg acgcgatcci: aggtggaggc 660 cgaaagtaca tgctrcccat gggaacccca gaccctgagt acccagatga ccacagccaa 720 ggtgggacca ggctggacgg gaagaatctg gtgcaggaar ggctggcgaa gcgccagggt 780 gcccggratg tgcggaaccg cactgagctc atgcaggcti cccrggaccc gccigigacc 840 catctcatgg gtccctrrga gcctggagac atgaaacacg agacccaccg agactccaca 900 ctggacccct ccccgatgga gacgacagag gcrgccccgc gcctgctgag caggaacccc 960 cgcggctict tcctcrtcgi ggagggtggt cgcatcgacc atggtcatca cgaaagcagg 1020 gcttaccggg cactgactga gacgatcatg ttcgacgacg ccatrgagag ggcgggccag 1080 crcaccagcg aggaggacac gctgagcctc gicacrgccg accactccca cgtccctcc 1140 ctcggaggct accccccgcg agggagctcc atcttcgggc tggcccctgg caaggcccgg 1200 gacaggaagg cctacacggt cctcctatac ggaaacggtc caggctatgt gctcaaggac 1260 ggcgcccggc_cggargttac cgagagcgag agcgggagcc ccgagtatcg gcagcagtca 1320 gcagtgcccc tggacgaaga gacccacgca ggcgaggacg tggcggtgtt cgcgcgcggc 1380 ccgcaggcgc acctggrtca cggcgtgcag gagcagacct tcatagcgca cgtcatggcc 1440 ticgccgcct gcctggagcc ctacaccgcc tgcgacctgg cgccccccgc cggcaccacc L500 gacgccgcgc acccaggtaa ccatgaagtt gaattccgaa gagcactcta cgtagagggt 1560 gaaagaggat tcttctacac tccaaaggca ccctaccccg tagagggtga aagaggattc 1620 ttctacacta gtctcatgac catagcctat gtcacggctg ccatctgcgc cctcacatg 1680 ccgccactct gcctcatggc ggactacaag gacgatgacg acaagtag 1728 <210> 128 <21ί> 575 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：重組融合蛋白質序列 <400> 128
Mec Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Axg Leu Gin Leu Ser Leu I 5 10 15
Gly [le Uf〇Pro Vai Glu glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gin Pro Ala Gin Thr -164- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1316960 A7 B7 五、發明説明（162) J5 40 45
Ala Ala Lys Asn Leu [!e [le Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Vai Set' 50 55 60
Thr Vai Thr Ala Ala Arg [le Leu Lys Gly Gin Lys Lys Asp Lvs Leu 65 70 75 80 '
Gly Pro Glu [le Pro Lea Ala Met Asp Axg Phe Pro Tyr Vai Ala Leu 35 90 95
Ser Lys Thr Tyr Asn Vai Asp Lys His Vai Pro Asp Ser Gly Ala Thr 100 105 110
Ala Thx Ala Tyr Leu Cys Gly Vai Lys Gly Asn Phe Gin Tor lie Gly 115 120 125
Lsu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gin Cys Asn Tnr Tnr Gly Asn 130 135 140
Glu Vai lie Ser Vai Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Vai 145 150 155 160
Gly Vai Vai Tnr Tnr Tnr Arg Vai Gki His Aia Ser Pro Ala Gly Tnr 165 Π0 175
Tyr .\la His Thr Vai Asn Aa-g Ain TrD Tyr Ser Asp Aia Aso Vai Pro 180 135 ' 190 '
Ala Ser Ala Arg Gin Glu Gly Cys Gin Aso lie Ala Tnr Gin Leu lie 195 200 205
Ser Asn Met Asp lie Asp Vai lie Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met 210 215 220
Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asd Asp Tyr Ser Gin 225 230 235 240'
Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Vai Gin Glu Tro Leu Ala 245 250 255 '
Lys Arg Gin Gly Ala Arg Tyr Vai Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gin 260 265 270
Ala Ser Leu Asp Pro Ser Vai Thr His Leu Met Gly Lea Phe Glu Pro 275 280 285
Gly Asp Mec Lys Tyr Glu lie His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser 290 295 300
Leu Mec Glu Met Tnr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asa Pro 305 310 315 320
Arg Gly Phe Phe Leu Phe Vai Glu Gly Gly Arg He Asp His Gly His 325 330 335
His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr [le Mec Phe Asp 340 345 350 -165 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（163)
Asp Ala lie Glu Arg Ala Giy Gin Leu Thr Ser Glu Gla Asp Thr Leu 355 360 305 Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Set- Phe Giy Giy Tyr 370 375 330 Fro Leu Arg Giy Ser Ser He Phe Giy Leu Ala Pro Giy Lvs Ala Arg 385 390 395 400 " Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Giy Asn Giy Pro Giy Tyr 405 410 415 Val Leu Lys Asp Giy Ala ,Axg Pro Asp Vai Thr Gla Ser Glu Ser Giy 420 425 430 Ser Pro Glu Tyr Arg Gin Gin Ser Ala Val Pro Leu Asd Glu Glu Tnr 435 440 445 ' His Ala Giy Glu Asd Val Ala Val Phe Ala Arg Giy Pro Gin Ala His 450 455 460 Leu Vai His Giy Val Gin Glu Gin Thr Phe lie Ala His Val Mec Aia 465 470 475 480 Phe Aia Cys Lsu Glu Pro Tyr Thr Aia Cys Asd Leu Ala Pro Pro 485 490 495 ' <\la Giy Thr Tnr Asp Ala ,Aia His Pro Giy Asn Tyr Glu Vai Glu Pro 500 505 510 Arg Arg Ala Leu Tyr Vai Glu Giy Gla Arg Giy Phe Phe Tyr Thr Pro 515 520 525 Lys Ala Leu Tyr Leu Val Glu Giy Glu Arg Giy Phe Phe Tyr Thr Ser 530 535 540 Leu Met Tnr He Ala Tyr Val Mec Ala Aia lie Cys Ala Lau Phe Met 545 550 555 560 Leu Pro Lsu Cys Lau Met Val Asd Tyr Lys Asp Asp Asd Asd Lys 565 570 575 ' ' <210> 129 <21l>5 <2I2>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> [29 Lys Met Asp Ala Glu -166 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4%格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 Δ7 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（164) <2I0> I30 <2ll>5 <212>蛋白質 <2 Π>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 130 G[y Arg Arg Gly Ser <210> 131 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列
<4〇〇> 131 Vai GIu Ala Asn Tyr Giu Val GIu C-lv Glu 1 5 10 J <210> 132 <21L> 10 <2I2>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明··合成的肚序列 <400> 132 Val C-lu Ala Asn Tyr Ala Val Glu Gly Glu 1 5 10 <210> 133 <21l> L0 <2I2>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 133 Lys Thr lie Asn Leu Glu Vai Glu Pro Ser I 5 10 -167 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -^0. 訂 1316960 A7 A7 B7 五、發明説明（165) <2[0> 134 <2U> iO <2丨2>蛋白質 <2 人造的序列 <220> c'l'L·〉人造序列的説明：合成的肽序列 <220> <22I>iV(〇D R£S <222> (5) ~ <223> Nle <400> 134
Lys Thr He Asn Xaa Glu Val Glu Pro Ser 1 5 10 <210> 135 <2ll> 10 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <221> MOD RES <222> (5) <223> Nle <??〇> <翌3>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 135
Lys Thr lie Asn Xaa Glu Vai Asp Pro Ser i 5 10 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 <210> 136 <21l> 10 <2Π>蛋白質 <213〉人造的序列 經濟部中央標準局員工消費合作社印¾ <220> <221>MOD RES <222> (5) <223> Nle <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400〉 136
Lys Thr He Asn Xaa Asp Val Asp Pro Ser l 5 10 -168 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 Λ7 A7 B7 五、發明説明（166) <2[〇>«7 <211> [〇 <212>蛋白質 人造的序列 <220> <云3>人造序列的説明 合成的肽序列 <400〉ί 37 Lys Thr lie Ser Leu Asp Vai Glu Pro Ser l 5 10 <210> 138 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的説明 合成的肽序列 <400> 138 Lys Γητ lie Ser Lea Aso Val A.so Pro Ser l 5 10 <210> 139 <2U>4 <2i2>蛋白質 <213〉人造的專列 <220> <223>人造序列的說明··合成的肽序列 <400> 139 Lys Met Asp Ala (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央樣準局員工消费合作社印製 <210> 140 <211>4 <212>蛋白質 <213>人造的·序列 <220> <223〉人造序列的説明 合成的肽序列 <400> 140 Ser Tyr Glu Val <2I0> 141 <21l> 10 -169- 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明（167) <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 141 Ser Glu Val Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg l 5 10 <2i0> 142 <21I>4 <212>蛋白質 <2Π>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <400> 142 Asn Leu Asp Ala <210> 143 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人逢序列的説明：合成的肽序列 <400> 143 Ser Glu Val Ser Tyr Asp Ala Glu Phe Arg i 5 10 <210> 144 <211> 10 <212>蛋白質 <2I3>人造岛序列 <220> <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 144 Ser Glu Val Ser Tyr Glu Ala Glu Phe Arg L 5 10 <210> 145 <2li>25 <2[2>蛋白質 <213>人造的序列 -170 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） --!---5------! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 •! 1316960 A7 B7 五、發明説明（168) <220> <223〉人造序列的説明 合成的肽序列 <400> I45 Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn lie Lvs Thj· Glu Glu tie Ser l 5 10 15 Glu Vai Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg 20 25 <2I0> 146 <211〉20 <212>蛋白質· <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <4〇0> 146 Gly Lau Γητ Asn Ge Lys Tnr Glu Glu lie Ser Glu Vai Ser Tyr Giu 1 5 10 15 Val Glu Phe Arg 20 <2I0> 147 <21i> 15 <2i2>蛋自質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明 合成的肚·序列 <400> 147 Lys Thr Glu Glu He Ser Glu Val Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg 15 10 15 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 <2I0> 148 <2il> L0 <2i2>蛋白質 <2I3>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明 合成的肽序列 <4〇〇> 148 Tor Glu Val Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg 1 5 10 171 - 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中夾樣準局員工消費合作社印¾ 五、發明説明（169) <2[〇> [49 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的月大序列 <4〇〇> 149 Ser Giu Val Asp Tyr Glu Val Glu Phe Arg 1 5 10 <210> 150 <211> 10 <212>蛋白質 <213〉人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <4〇〇> 150 Tar Glu Val Asp Tyr Glu Val Glu Phe Arg 1 5 10 <210> 151 <211> 10 <2I2>蛋白質 <2i3>人造的序列 <220> — <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 151 Thr Glu He Aso Tyr Glu Val Glu Phe Arg L 5 10 <210> 152 <2ll> 10 <212>蛋白質 <2D>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肤序列 <4〇〇> 152 Ser Glu He Ser Tyr Glu Val Glu Phe I 5 [0 <210> 153 <211> 10 -172- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 A7 B7 五、發明説明（17〇) <2U>蛋白質 <2[3>人造的序列 <220> <223〉人造序列的説明 合成的肽序列 <4〇〇> 153 Ser Glu lie Asp Tyr Gla Val Glu Phe l 5 10 <210> 154 <211> 13 <2i2>蛋白質 <2Π>人造的序列 <220> <221>位置 <222>(11) <223> Xaa=色胺酸 <220> <223>人造序列的説明 合成的肽序列 <400> 154 Ser Glu lie Ser Tyr Glu Val Glu Phe ^j：g Xaa Lys Lys <210> 155 <211> 18 _ <2I2>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <22丨> 位置 <222> (Ιό) <223〉父aa=色胺酸 <220〉 <223〉人造序列的説明 合成的肽序列 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 <400> 155 Lys Thr Glu Glu lie Ser Glu lie Ser Tyr Glu Val Giu Phe Arg Xaa 1 5 10 15 Lys Lys <210> 156 <211>23 <2I2>蛋白質 <2 Π>人造4序列 <220〉 -173 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（171) <二丨> 位置 <222> (21) <223〉Xaa=色胺酸 <220> <另3>人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 156 Gly Leu Thr Asn He Lys Thr GIu G'iu [le Ser Glu He Ser Tyr Clu Val I 5 10 15 GIu Phe Axg Xaa Lys Lys 20 <210> 157 <2ii> 28 <212>蛋白質 <213>人造士序列 <220> 一 <223>人造序列的說明 合成的肽序列 <220> <221>位置 <222> (26) <223> j(aa=色胺酸 <400> 157 Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Tnr Asn lie Lys Thr Glu Glu He Ser 1 _ 5 10 15 Glu lie Ser Tyr GIu Vai Glu Phe Arg Xaa Lys Lys 20 25 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部中央標準局員工消費合作社印$L <210> 158 <2U> 13 <212〉蛋白質 <213>人造的序列 <220> <221〉位置 <222〉（11) <223〉Xaa=：色胺酸 人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 158 Ser Glu [le Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg Xaa Lys Lys 1 5 10 <210> 159 -174 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（172) <2U> 18 <212>蛋白質 <2 人造的序列 <99〇> <赶3>人造序列的説明 合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222> (16) <223〉Xaa=色胺酸 <400> 159 Lys Thr GIu Glu He Ser Glu Qe Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg 15 10 15 Xaa Lys Lys <210〉160 <211>23 <212>蛋白質 <2i3>人造的序列 <220>v. _<；221>位置 <222> (21) <223> Xaa=色胺酸 <220> 一 <223>人造序列的説明 合成的肽序列 <400> 160 Gly Leu Thr Asn lie Lys Thr Glu Glu lie Ser Glu lie Ser Tyr L 5 10 15 Glu Val Glu Phe Arg Xaa Lys Lys 20 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾隼局員工消费合作社印衷 <210> 161 <2U>28 <212>蛋白質 <2〖3>人造的序列 <220〉 <22l>位置 <222> (26) <223〉Xaa=色胺酸 <220> <223>人造序列的説明 合成的肽序列 175 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨Ο X _297公釐） 1316960 A7 B7 經濟部中央櫺準局員工消资合作社印製 五、發明説明（173, <4ϋϋ> i6i Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Tin' Asn He Lys Thr Gla Glu [le [ 5 ΙΟ 15 Ser Glu [le Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg Xaa Lys Lys 20 25 <210> I62 <2U> 13 <2丨2>蛋白質 <2I3>人造的序列 <220> <22i>位置 <222>(11) <223> Xaa=俄勒岡綠 <220> <223〉人造序列的說明 合成的肽序列 <400> 162 Ser Glu lie Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg Xaa Lys Lys 1 5 10 <210> 163 <211> L8 <212>蛋白質 <213>人造序列 <220> <22丨> 位置 <222〉⑽ <223> j(aa=俄勒岡綠 <220〉 <223>人造序列的說明 合成的肽序列 <4(X)> 163 Lys Thr Glu Glu lie Ser Glu He Ser Tyr Glu Vai Glu Phe Arg Xaa 1 5 10 15 Lys Lys <210> 164 <2U>23 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <22l>位置 <222>(2l) <223> kaa=俄勒岡綠 176 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） —：—,------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 A7 B7 五、發明説明（174) <220> <223>人造序列的説明：合成的序列 <400〉164 Gly Leu Thr Asa [le Lys Thr GIu Giu He Ser Glu He Ser Tvr Giu l 5 10 15 Val Glu Phe Arg Xaa Lys Lys 20 <210> 165 <2U>28 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <22i>位置 <222> (26) <223>Xaa=俄勒岡綠 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 105 Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Tnr Asn lie Lys Thr Glu Glu He Ser 15 10 15 Glu He Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg Xaa Lys Lys 20 25 <210〉166 <21i>13 <212>蛋白質 <213>人造4序列 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -4 訂 經濟部中央樣準局員工消费合作社印裝 <220> <221>位置 <222>(ll) <223>Xaa=俄勒岡綠 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <4(D> 166 Ser Glu He Ser Tyr Gla Val Glu Phe Arg Xaa Lys Lys l 5 10 <210> 167 <211> 18 <212>蛋白質 <213>人造的序列 -177 - 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（175) <220> <22丨> 位置 <222〉⑽ <'OXaa=俄勒岡綠 <220〉 <223>人造序列的說明：合成的爿太序列 <400〉 167 Lys Thr Glu Glu lie Ser Glu He Ser Tyr Qu Vai Glu Phe Arg 15 10 15 Xaa Lys Lys <210〉 168 <2U>23 <212>蛋白質 <213〉人造的序列 <220〉， <221>位置<222〉(21) <223> Xaa=俄勒岡綠 <220> <223>;人造序列的說明 合成的肽序列 <400> 168 Gly Leu Thr Asn lie Lys Tnr Glu Glu lie Ser Glu lie Ser Tyr L 5 10 15 Glu Val Glu Phe Arg Xaa Lys Lys20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 訂 經濟部中央橾準局負工消費合作社印袈 <210> 169 <211>28 <212>蛋白質 <213〉人造的序列 <220> ^ 位置 <222> (26) <223> Xaa=俄勒岡綠 <220> <223>人造序列的説明 合成的肽序列 <400> 169 Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn He Lys Thr Glu Glu [le l 5 i〇 15 -178 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（176)
Ser Glu [le Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg Xaa Lys Lys 20 25 <2l0> 170 <211> 10 <212>蛋白質 <2丨3>人邊的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 170 Ser Glu Vai Asn Tyr Glu Val Glu Phe Arg 1 5 10 經濟部中央橾準局員工消费合作社印製
<210> 17 i <211>47 <212>DNA <213>人造的序列 <220〉 <223〉人造序列的說明：APP之指定位置突變生成作用 的合成引子 <400> 171 gagatctccg aaattagtta tgaagtagaa ttccgacatg actcagg 47 <210> 172 <211>48 _ <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：APP之指定位置突變生成作用 的合成引子 <400> 172 tgagtcatgt cggaatrcta cttcacaact aacttcagag atctcctc 48 <210> 173 <21l>47 <212>DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：APP之指定位置突變生成作用 的合成引子 <4〇〇> 173 gagatctccg aaagtagna tgaagtagaa ttccgacacg actcagg 47 <210> 174 <21l>48 <212> DNA -179 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂— 1316960 A7 B7 五、發明説明（177) <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：APP之指定位置突變生成作用 的合成引子 <400> 174 tgagtcatgt cggaattcta cttcataact actttcagag accccctc 48 <210> 175 <'211>47 <212> DNA <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：APP之指定位置突變生成作用 的合成引子 <4〇〇> 175 gagatctccg aaattagtta tgaagcagaa ctccgacacg actcagg 47 <2I0> 176 <21l>48 <212>DKA <213>人造的序列 <220> . <223>人造序列的說明：APP之指定位置突變生成作用 的合成引子 <4〇〇> 176 tgagtcatgt cggaattctg cttcataact aatttcagag atctcctc 48 <210> 177~ <211>5 <212>PRT <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 L~ — —· 嶙— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 <400> 177 Val Ser Tyr Glu Val <210> 178 <211>5 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明_·合成的肽序列 <400> 178 Vai Ser Tyr Asp Ala -180- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 五、發明説明（178) I 5 <210> 179 <211>5 β <_212>蛋白質 <213〉人造的序列 人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> L79 tie SerTyr Gtu Val <210> 180 <21L>5 ^ <212>蛋白質A ~ <213>人造的序列 人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 180 , Vai Lys Me: Asp Ala 1 5 <210> 181 <211>47_ <2i2> DMA <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的説明：產製叫做MBPC125-SYEV之突 變種構築體的合成引子 L-I -------着 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本育) 訂 經濟部中央橾隼局員工消费合作社印製 <4〇〇> 181 /|7 gacatctctg aagigagtta ttaggcagaa ttccgacatg actcagg 4/ <210> 182 <21i>48 <2i2> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：產製叫做MBPC125-SYEV之突 變種構築體的合成引子 <400> 182 cgagtcatgt cggaattctg cctaataact cacttcagag atcccccc <2i0> 183 48 -181 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（179) <211> 6 <212>蛋白質 <2[3>人造的序歹ij <220> <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 183 Lys Lys Ser Tyr Glu Vai <210> 184 <21i> LO <2丨2>蛋白質 <213〉人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 184 Vai Glu Ala Asn Tyr Glu Val Glu Gly Glu l 5 10 <2i0> 185 <211> 10 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 一 <223〉人造序列的説明：合成的肽序列 <400〉 185 Val Glu Ala Asn Tyr Ala Val Glu Gly Glu 1 5 10 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
線I 經濟部中央樣準局員工消费合作.杜印裝 <210> 186 <211>8 <2Π>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽序列 <4〇0> 186 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys <210> 187 <211>4 <212>蛋白質· -182 - 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1316960 A7 B7 五、發明説明（18〇) <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <4〇〇> 187 Ser Tyr Glu Ala <210> 188 <2il>4 <2Π>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 188 Ser Tyr Ala Val <210> 189 <21l>5 <212>蛋白質 <2Π>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明：合成的肽序列 <400> 189
Val Ser Tyr Glu Ala 1 5 經濟部中央樣隼局員工消費合作.杜印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <210> 190 <21L> 13 <212>蛋白質 <213>合成的肽序列 <400> 190
Ser Glu He Ser Tyr Glu Val Giu Phe Arg Trp Lys Lys ί 5 10 <210> 191 -183 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1316960 經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（181) <211> 23 <212〉蛋白質 <213>合成的肽序列 <4〇〇> 191
Gly Leu Thr Asn He Lys Tor Glu Glu He Ser Glu He Ser Tyr Gla 1 5 10 15
Val Glu Phe Arg Trp Lys Lys 20 <210> 192 <211> 15 <212>蛋白質 <2i3>合成的肽序列 <220〉 <221>位置 <222> (1)..(1) <223>將查位置丨處的胺基酸生物素基化 <220〉 <221>位置 <222〉（14)..(14) <223>利用俄勒岡綠衍生在位置丨4處的cys <4〇〇> 192
Lys Giu He Ser Giu lie Ser Tyr Glu Val Glu Phe Arg Lys Lys <210> 193 <211> 22 <212>蛋白質 <213〉合成的肽序列 -184- 本紙張尺度適用令國國家標準（CNS ) A4規格（·210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製 1316960 A7 B7 五、發明説明（182 ) <220> <22ί> 丫立置 <222> (1)..(1) <223>將在位置1處的胺基酸生物素基化 <220〉 <22丨> 位置 <222> (21)..(21) <223>利用俄勒岡綠衍生在位置21處的cys <400> 193
Gly Leu Thr Asn Ge Lys Tnr Glu GIu lie Ser GIu lie Ser Tyr Glu 15 10 15
Val Giu Phe Arg Lys Lys 20
<210> 194 <211> 6806 <212〉DNA <213>融合蛋白質包括麥芽播結合蛋白質帶有125個得 自APPC-終端的胺基酸 <400> 194 ccgacaccat cgaatggcgc aaaaccttrc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga 60 gtcaancag ggtggtgaac gcgaaaccag taacgttaca cgatgtcgca gagtatgccg 120 gtgtctctta tcagaccgcc tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa 180 cgcgggaaaa agtggaagcg gcgacggcgg agctgaatra cactcccaac cgcgcggcac 240 aacaactggc gggcaaacag tcgctgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc 300 acgcgccgtc gcaaattgcc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg 360 tggtggtgcc gacggtagaa cgaagcggcg tcgaagccrg taaagcggcg gcgcacaatc 420 ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaaccatcc gctggatgac caggatgcca 480 -185- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
*1T 經濟部中央標隼局員工消费合作社印裝 1316960 A7 __ B7___ 五、發明説明（183) ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc cctgaccaga 540 cacccatcaa cagtattact ttctcccacg aagacggtac gcgaccgggc gtggagcacc 600 tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg 660 cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaac atctcactcg caatcaaatt cagccgatag 720 cggaacggga aggcgaccgg agtgccatgt ccggctttca acaaaccatg caaacgctga 780 atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ctgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa 840 cgcgcgccac taccgagtcc gggctgcgcg tiggtgcgga tatctcggta gtgggacacg 900 acgataccga agacagctca tgctatatcc cgccgnaac caccatcaaa caggattttc 960 gcctgccggg gcaaaccagc gtggaccgct cgctgcaact ctctcagggc caggcggcga 1020 agggcaatca gctgttgccc gtcrcactgg cgaaaagaaa aaccacccrg gcgcccaata 1080 cgcaaaccgc ctcrccccgc gcgttggccg attcanaat gcagctggca cgacaggni 1140 cccgactgga aagcgggcag cgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 1200 gcacaactct catgtrtgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaac gcttctggcg 1260 icaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc giaaatcact gcataattcg 1320 tgtcgcrcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttrtt gcgccgacat cataacggtt 1380 ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga 1440 actgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagccagt ccgtttaggt gttttcacga 1500 gcacttcacc aacaaggacc acagattatg aaaactgaag aaggtaaact ggtaatctgg 1560 actaacggcg ataaaggcta taacggtctc gctgaagtcg gtaagaaatt cgagaaagac 1620 accggaatta aagtcaccgt tgagcatccg gataaactgg aagagaaat: cccacaggo: 1680 gcggcaactg gcgatggccc tgacattatc ttctgggcac acgaccgctt tggtggciac 1740 gctcaacctg gcctgttggc cgaaatcacc ccggacaaag cgttccagga caagctgcat 1800 ccgtttacct gggatgccgt acgttacaac ggcaagctga ctgccraccc gatcgctgtt 1860 gaagcgrat cgctgattta taacaaagat crgctgccga acccgccaaa aacctgggaa 1920 gagatcccgg cgctggacaa agaactgaaa gcgaaaggca agagcgcgct gacgttcaac 1980 ctgcaagaac cgtacttcac ccggccgctg attgctgctg acgggggtta tgcgttcaag 2040 cacgaaaacg gcaagtacga cattaaagac gtgggcgtgg ataacgctgg cgcgaaagcg 2100 ggtctgaccc ccccggttga cccgactaaa aacaaacaca tgaacgcaga caccgattac 2160 ./阶 cccaccgcag aagccgccct taataaaggc gaaacagcga cgaccaccaa cggcccgcgg 2220 -186- 本紙張尺度適用中國國家棣準（CNS ) A4規格（2】0X 297公釐） —.------I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 經濟部中央樣準局員工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（m) gcatggtcca acatcgacac cagcaaagtg aattatggtg taacggtact gccgaccttc 2280 aagggtcaac catccaaacc gttcgttggc gtgctgagcg caggtattaa cgccgccagt 2340 ccgaacaaag agctggcgaa agagctcctc gaaaacratc tgctgactga tgaaggtctg 2400 gaagcggtta acaaagacaa accgctgggt gccgtagcgc tgaagtctta cgaggaagag 2460 ccggcgaaag acccacgtat tgccgccacc acggaaaacg cccagaaagg cgaaatcatg 2520 ccgaacatcc cgcagacgtc cgctttctgg tatgccgtgc gtactgcggt gatcaacgcc 2580 gccagcggtc gtcagactgt cgatgaagcc ctgaaagacg cgcagactaa ttcgagcicg 2640 gtacccggcc ggggatccat cgagggtagg gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt 2700 tctgggttga caaacancaa gacggaggag atcrctgaag tgaatctgga tgcagaattc 2760 cgacatgact caggatatga agttcaccat caaaaangg tgttctttgc agaagatgtg 2820 ggttcaaaca aaggtgcaac cactggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg 2880 atcgtcatca ccrcggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca ccatggtgcg 2940 gcggaggtrg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc cgtccaagac gcagcagaac 3000 ggctacgaaa atccaaccra caagttcttt gagcagatgc agaactagac ccccgccaca 3060 gcagccrctg aagttggaca gcaaaaccat tgcctcacta cccaccggtg cccatttata 3120 gaataatgtg ggaagaaaca aacccgtttt atgatttact cattatcgcc ttttgacagc 3180 tgtgctgtaa cacaagtaga tgcccgaact tgaattaatc cacacatcag taatgtactc 3240 tatctctctt tacaroxgg tcccratact acarattaa tgggttttgt gtactgtaaa 3300 gaatttagct gtatcaaact agtaatagcc tgaactcagt aacctaaccc tcgatggatc 3360 ccctagagtc gacctgcagg caagcttggc aciggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 3420 ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaaccg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 34θ0 gcgcaatagc gaagaggccc gcaccgaccg ccctrcccaa cagttgcgca gcctgaatgg 3540 cgaacggcag cnggctgtt tlggcggacg agagaagact ttcagcctga tacagattaa 3600 accagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt 3660 cccacctgac cccatgccga actcagaagc gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg 3720 gtctccccac gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaac aaaacgaaag gctcagccga 3780 aagactgggc cmcgtttt acctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa 3840 atccgccggg agcggacttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggcgg cgggcaggac 3900 gcccgccaca aactgccagg caccaaatta agcagaaggc caccccgacg gatggccctt 3960 -187- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇x297公釐） —；--------·_ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 濟部中央樣隼局員工消费合作社印装 1316960 A7 B7 __ 五、發明説明（185) ttgcgcttcc acaaactctt tttgcctatt cttctaaaca cactcaaaca tgcacccgct 4020 catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 4080 ccaacatttc cgtgtcgccc ttattcccrt ttttgcggca ttttgccttc ctgcttttgc 4140 tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggcg cacgagtggg 4200 ttacatcgaa ctggarcrca acagcggtaa gaccccrgag agttttcgcc ccgaagaacg 4260 ctttccaatg acgagcactt ctaaagttct gctatgcggc gcggtattat cccgtgttga 4320 cgccgggcaa gagcaacrcg gtcgccgcat acactatrct cagaatgact tggttgagta 4380 ctcaccagEc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaac tatgcagtgc 4440 tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 4500 gaaggagcta accgctmt tgcacaacat gggggaccat gtaactcgcc ctgatcgttg 4560 ggaaccggag ccgaatgaag ccacaccaaa cgacgagcgc gacaccacga tgcctgtagc 4620 aatggcaaca acgctgcgca aactactaac tggcgaacta crtactctag cticccggca 4680 acaattaata gaccggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttc:gc gctcggccct 4740 tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggta【4800 cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagnatct acacgacggg 4860 gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 4920 taagcattgg iactgtcag accaagttra ctcatatata ctttagattg atttaaaact 4980 tcatttttaa crtaaaagga tctaggrgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 5040 cccttaacgt gagcittcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 5100 txcttgagac cctttttttc tgcgcgtaac ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 5160 accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 5220 cncagcaga gcgcagatac caaatactgt ccctccagtg tagccgtag: taggccacca 5280 cttcaagaac tccgcagcac cgcctacata cctcgccctg ctaatccrg: taccagtggc 5340 tgccgccagc ggcgataagt cgtgtcttac cgggctggac tcaagacgat agctaccgga 5400 iaaggcgcag cggrcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagcnggagcgaac 5460 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 5520 agggagaaag gcggacaggc atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 5580 ggagcttcca gggggaaaeg cctggtatcc ttatagtccc gtcgggcttc gccacctccg 5640 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctacgga aaaacgccag 5700 -188- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） —；------------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1316960 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7 _ 五、發明説明（186) caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctctcc 5760 cgcgttatcc cctgatcctg tggataaccg tatcaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 5820 tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct 5880 gacgcggtac tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggcgcactct 5940 cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt 6000 gactgggcca cggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggcc 6060 tgtccgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg cccccgggag ctgcatgtg: 6120 cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc tgcggtaaag ctcatcagcg 6180 tggtcgtgaa gcgattcaca gacgtctgcc tgttcacccg cgtccagctc gttgagtttc 6240 cccagaagcg ttaatgcctg gciictgata aagcgggcca tgttaagggc ggtmttcc 6300 tgtttggtca cttgatgcct ccgtgtaagg gggaatttct gttcatgggg gtaatgatac 6360 cgacgaaacg agagaggatg crcacgatac gggttactga tgatgaacat gcccggttac 6420 cggaacgctg tgagggtaaa caactggcgg tatggatgcg gcgggaccag agaaaaacca 6480 ctcagggtca atgccagcgc ttcgttaata cagatgtagg tgtrccacag ggtagccagc 6540 agcatcctgc gatgcagatc cggaacataa tggtgcaggg cgccgacttc cgcgcrccca 6600 gactciacga aacacggaaa ccgaagacca ttcatgttgt tgctcaggtc gcagacgutt 6660 tgcagcagca"gtcgcttcac grtcgctcgc gtatcggtga ttcattctgc taaccagtaa 6720 ggcaaccccg ccagcctagc cgggtcctca acgacaggag cacgatcarg cgcacccgrg 6780 gccaggaccc aacgctgccc gaaatt 6806 <210> 195 <2U> 13 <2L2>蛋白質 <213〉合成的肽序列 <220〉 <221〉M〇D_RES <222> (1)..(1) <223>乙醢化作用 （MCA) -189- —本氓张尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2lOX 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) ^0. 訂 1316960 A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（187) <220> <22i>位置 <222> (11)..(11) <223>在位置Η處之Lys之後的2,4-二硝笨基基團 <400> 195 Ser Giu Vai Asn Leu Asp Ala Giu Phe Arg 乙ys Arg Arg 1 5 LO <210> L96 <211> 12 <2i2>蛋白質 <213>合成的肽序列 <220〉 <221:>位置 <222>⑷"⑷ <223>已經利用抑f酶胺酸衍生的在位置4處之胺基酸 <400> 196 Ser Glu Val^Asn Vai Ala Glu Phe Arg Gly Gly Cys <210〉 197 <211> 10 <212>蛋白質 - <213>合成的肽序列 <220> <22l>位置 <222> (4)..(4) <223>己經利用抑胃雖胺酸衍生的在位置4處之胺基酸 -190 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4
、1T 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1316960 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（188 ) <220> <22丨> 位置 <222> (10)..(10) <223〉已經利用Bodipy FL衍生的在位置10處之胺基酸 <400〉197
Ser Glu Val Asn Val Ala Glu Phe Axg Cys 1 5 10 -191 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

  1. 中文申請專利範圍替換本(98年8月） 98· 8.21 修正 年月曰二 補充 公告本 1. 一種經過分離的肽’其包括由選自由序列識別5號’序 列識別6號；序列識別7號；序列識別8號；序列識別9號 ;序列識別10號；序列識別11號；序列識別12號；序列 識別1 3號；序列識別14號；序列識別15號；序列識别 120號；序列識別133號；序列識別134號；序列識別135 號；序列識別13 6號；序列識別13 7號；序列識別13 8號 ，序列識別141號；序列識別143號；序列識別144號； 序列識別145號；序列識別147號；序列識別148號’序 列識別149號；序列識別15〇號；序列識別15 1號；序列 識別152號，·序列識別153號；序列識別154號；序列識 別155號；序列識別156號；序列識別157號；序列識別 158號；序列識別159號；序列識別160號；序列識別161 號；序列識別162號；序列識別163號；序列識別164號 ，·序列識別165號；序列識別166號；序列識別167號； 序列識別168號；序列識別169號；序列識別190號；序 列識別191號；序列識別192號和序列識別193號所組成 的胺基酸序列。 2. —種測定β_促泌酶活性之調節劑的方法，包括下列步 (a) 在假定之調節劑化合物的存在和缺乏之下’使β-促 泌酶與一受質接觸’’其中該受質包括具有根據申 請專利範圍第1項之肽； (b) 在假定之調節劑化合物的存在和缺乏之下，測量受 質肽的切開作用；並 72563-980821.doc 1316960 (C)在假定之調節劑化合物的存在和缺乏之下，從切 作用中的差異來確認卜促泌酶活性的調節劑，其中 調節劑為降低這類切開作用的P _促泌酶拮抗劑，'以 及增加這類切開作用的β_促泌酶激動劑。 3. 根據申請專利範圍第2項之方法，其十該^促泌酶包括 經過純化的人類Asp2多肽。 4. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中該^促泌酶包括 人類Asp2多肽的可溶性片段，其保留了 Asp2召-促泌酶 活性。 5. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中該可溶性片段為 缺乏Asp2穿透膜功能部位的片段。 6. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中該β_促泌酶包括 自包含編碼β-促泌酶多肽之核甞酸序列的多核甞酸轉化 或轉染之細胞中所純化和分離出的多肽。 7. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中在以包含編碼該 β-促泌酶之核甞酸序列的多核苷酸轉化或轉染的細胞中 ，表現該β-促泌酶，且其中測量步驟包括測量細胞中 ΑΡΡ作用活性。 8. —種進行β_促泌酶測定的套組，包括β_促泌酶受質， 其包括根據申請專利範圍第1項之肽，以及β_促泌酶酵 素。 9. 根據申請專利耗圍第8項之套組，尚包括用來檢測該肽 或融合蛋白質之切開作用的試劑。 72563-980821.doc
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