TWI314457B

TWI314457B -

Info

Publication number: TWI314457B
Application number: TW091105096A
Authority: TW
Inventors: Siga Akihiko; Ono Takashi; Yamada Katsutoshi; Hanasaki Kohji
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2002-03-18
Publication date: 2009-09-11
Also published as: ES2324766T3; WO2002074342A1; CN1553814A; EP1378246B1; EP2044958A3; CA2441110C; ATE428425T1; BR0208275A; US20040248898A1; EP1378246A4; KR20030085026A; JP4499361B2; KR100908968B1; CN1553814B; CA2441110A1; PT1378246E; EP1378246A1; EP2044958A2; MXPA03008440A; JPWO2002074342A1

Description

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發明説明技術領域 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係有關於一種用以阻礙v型或x型分泌型磷脂酶A2(V型或XSSPLA2)對血清脂蛋白之強力變性作用之V 型及/或乂型"1^八2阻礙劑，更詳而言之係有關於一種用以治療、預防及診斷以動脈硬化為基礎之缺血性疾病之醫藥組成物。背景技術 -訂_ 峰動脈硬化係動脈壁呈現肥厚及硬化之病變總稱。動脈硬化病變於病理學上可大致分為粥狀動脈硬化、細動脈硬化及中膜壞死等三種，其中，粥狀動脈硬化因可成為心肌梗塞及腦梗塞等缺血性疾病之成因而最受重視。與粥狀動脈硬化關聯密切者則為高血脂症，其係指血清中膽固醇及中性脂肪等血清脂質之量呈增加之狀態。血清脂質係與蛋白質形成複合體’呈脂蛋白後而存在；特別係含膽固醇之脂蛋白又依其密度而分類為超低密度脂蛋白（very 1〇w density lipopr〇tein，VLDL)、低密度脂蛋白（1〇w density lipoprotein，LDL)及高密度脂蛋白（high density lipoprotein， HDL)等》其中，LDL係藉末梢組織之受體而被攝入細胞内，以擔負對細胞供給膽固醇之任務。粥狀動脈硬化之初期病態中，前述LDL係發生某種變性V與正常之LDL相較下，產生脂質之過氧化、粒子整體之陰性電荷增加、填脂質分解所造成之成分變化及隨其而來之結構變化以及小型化（密度增加）等（Yok〇de等人，臨床檢查44，1052-1058(2000))，而發生此種變性之ldl係經浸· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） -4- 1314457 A7 ___B7_ 五、發明説明（2 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 潤於血管内膜之單球及巨噬細胞而藉清道夫受體被攝取，結果’產生蓄積有膽留基S旨之油滴之泡珠細胞，而於形成 τ淋巴球及血管平滑肌之同時形成脂肪線條（fatty streak)。之後，因存在於脂肪線條之細胞間之相互作用，使病變持續進行，而進展為被稱作纖維性硬斑之血管内腔之硬性隆起病變’更因周圍之結合組織增加而進展為伴隨石灰化及附著血栓之病態，即，粥狀動脈硬化。另一方面， HDL·係擔負將末梢組織之剩餘膽固醇運送至肝臟之責任，故對動脈硬化之進展有抑制作用。但，若血中HDL層級降低或發生HDL之變性’則因其機能降低而使血中游離膽固醇量增加，而成為動脈硬化發病之原因。 t- 如前所述，LDL、HDL等脂蛋白之變性，即性質變化係於動脈硬化發病上佔有非常重要之因素。而變性則已知有氧化性變性，此時氧化LDL隨陰性電荷增加而小型化且密度增加。除實際之動脈硬化病變部位中檢測出氧化ldl 之顯現外’人為氧化之LDL將引起巨嗤細胞之泡珠化且使細胞活性化而使各種細胞激素之產生發生亢進，故該種氧化變性被認為與動脈硬化病態之進展相關。另一方面，變性LDL中發現有磷脂質之成分變化（磷脂質之分解）’且因著眼於此點之研究而使鱗脂酶A2(PLA2) 作為與LDL·與HDL之變性相關之分子廣受注目。填脂酶 A2(PLA2 ’ EC3· 1.1.4)係使3-sn-稱酸甘油酯之2_醯基酯鍵水解之磷脂質分解酵素之總稱。其中，分泌型PLA2(sPLa2) 係分泌至細胞外之低分子量（13-18kDa)之PLA2分子群，人本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） -5- 1314457 A7 _B7_ 五、發明説明（3 ) 類則已知有IB、IIA、IID、IIE、IIF、V型、X型及XII等8 種類。任一分子種均於其結構内具有12〜16個Cys殘基，而於分子内形成有二硫化物鍵，且保存有Hip-Asp殘基所構成之活性中心部位。更具有共通之Ca2+結合領域，且於酵素活性之顯現上需mM級之Ca2+(Ishizakis等，J. Biol. Chem. 274，24973-24979(1999); Suzuki 等，J. Biol. Chem. 275, 5785-5793(2000) ; Six 等，Biochim. Biophys. Acta 1488, 1-19(2000)；及 Gelb 等，J. Biol. Chem. 275, 39823-39826(2000))。其中，檢測出IIA型sPLA2於動脈硬化病變部位之血管平滑肌及泡沫細胞中顯現，因而認為該顯現與動脈硬化進展之程度具有相關性（Elinder等， Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17，2257-2263(1997);及 Menschikowski等，Atherosclerosis 118，173-181(1995))。又，使其高度呈現有人類IIA型sPLA2之基因轉殖小鼠除引起LDL上昇及HDL減少而出現動脈硬化病變（Tietge等，J· Biol. Chem. 275, 10077-10084(2000))外，於使其攝取高脂肪食物時，與正常小鼠相較下觀察到動脈硬化病變之惡化 (Ivandic 等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19, 1284-1290(1999))，而使本酵素與動脈硬化病態進展之關係受到矚目。另一方面，以來自蜂毒之sPLA2處理LDL時，發現有粒子全體之陰性電荷增加、磷脂質之組成發生變化及巨嗤細胞之攝入增加等現象（Avirams等，Biochem. Biophys Res. Commun. 185, 465-472(1992))，明顯呈現與被認為係缺血性疾病之危險因子之一之小粒子高密度LDL(small 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） -6- (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) • *可· 峰 1314457 A7 _B7 五、發明説明（4 ) dense LDL)非常類似之特徵（Sartipy等，j. Biol. Chem. 274, 25913-25920(1999))。以來自蛇毒之spla2處理HDL時’已知伴隨填脂質分解，HDL之尺寸及密度發生變化，且肝細胞之攝入增加（Collets等，Biochem. Biophys. Acta 1043, 301-310(1990))。如前所述，人類sPLA2分子中，IIA型雖檢測出分解脂蛋白中之磷脂質之活性，但對LDL之分解活性與來自蜂毒之sPLA2相較下，ΠΑ型之活性相當弱 (Hurt-Camejo 等，Curr. Opin. Lipidol. 11， 456-471(2000))，且已知其對HDL之活性較對LDL強 (Pruzanskis等，J. Lipid. Res. 39, 2150-2160(1998))。因此，動脈硬化初期病態中之與LDL變性化相關之内因性SPLA2 之實際狀態仍存有許多不明處，雖亦慮及IIA型以外之 sPLA2相關之可能性，但該等sPLA2分子之脂蛋白變性作用及其於動脈硬化病變時之呈現則尚未明瞭。人類X型sPLA2係由DNA資料庫中以sPLA2相關序列為基礎，而於1997年由胎兒肺組織選殖出（Cupillards等，J. Biol. Chem. 272, 15745-15752(1997)) » 人類X型 sPLA2之基因與其他sPLA2不同，係位於第16號染色體上》本8卩1^八2於分子内具有16耽胺酸殘基，包含所有存於IB型sPLA2及II 型（IIA/IID/IIE/IIF型）sPLA2之特徵性分子内二硫化物交聯。且II型sPLA2中具有特有之羧基末端延長結構。X型 sPLA2存有於N-末端具有由11胺基酸殘基構成之前肽序列之非活性行之前（pro)型、及藉胰蛋白酶等蛋白酶切斷、去除該前肽部分而生之活性型等兩分子種（Morioka等，Arch. -7- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .t. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公愛） 1314457 A7 ___B7_ 五、發明説明（5 )

Biochem. Biophys. 381, 31-42(2000))。活性型之X型 spLA2 與來自哺乳動物之其他sPLA2，特別係與IB、IIA型sPLA2 相較下，與係基質之磷脂質之種類及性狀無關而具有高度之酵素活性，且作用於細胞時，使來自細胞膜之二十四碳四烯酸游離之能力及產生二十碳化合物與卵磷脂等脂質性介體之能力較IB、ΠΑ型sPLA2高出甚多（Hanasaki等，J. Biol· Chem_ 274，34203-34211(1999); Saiga等，Biochem. Biophys. Acta 1530, 67-76(2001))。藉使用特異抗體之免疫組織化學性解析，除於II型肺泡上皮細胞及脾臟巨噬細胞發現有X型sPLA2之顯現外，於人類大腸癌組織之癌細胞之顯現亦明顯可見有亢進之現象，故顯示本酵素與炎症免疫反應及大腸癌病態之發病進展相關（Morioka等，FEBS Lett. 487，262-266(2000))。但，並無報告指出X型sPLA2之脂蛋白變性作用及於動脈硬化病變部位之顯現，尚未得知本酵素與動脈硬化病態之發病進展相關。 V型sPLA2係於1994年被選殖出（Chen等，J. Biol. Chem.，1994, 269, 2365-2368)。人類 V 型 sPLA2 之基因與 IIA 型相同地位於第1號染色體上。本sPLA2較IIA型少2個胱胺酸殘基而於分子内具有12個胱胺酸殘基，亦不包含HA型可見之羧基末端延長結構。V型之顯現係以心臟為主’可見於肺及炎症系細胞（脂肪細胞及巨嚷細胞等）’而已有報告指出該等細胞與脂質介體之產生有關（村上誠、工藤一郎，現代醫療2〇〇〇，32，517-548)。但尚無有關V型sPLA2 之脂蛋白變性作用之報告’而尚未得知本酵素與動脈硬化本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210><297公爱） -8- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -、?τ— .f. 1314457 A7 _____B7 五、發明説明（6 ) 病態之發病進展有關。發明之揭示本案發明人以解析人類V型或X型sPla2之生理機能為目的並反覆精心鑽研，結果發現V型或X型sPLA2具有強烈使脂肪酸由存在於血中脂蛋白之填脂質游離之作用。以相關認知為基礎’並證明SPLA2阻礙化合物對V型或 X型sPLA2之脂蛋白變性作用之抑制作用，進而得以完成本發明。 sPLA2阻礙化合物已知有EP-620214(特開平 7-010838、US-5578634)、EP-620215(特開平 7-025850、 US-5684034)、EP-675110(特開平 7-285933、US-5654326)、 W096/03120(特開平 10-505336)、WO96/03376(特開平 10-503208 、 US-5641800) 、 WO96/03383(特開平 10-505584) 、 W097/21664(EP-779271) 、 W097/21716(EP-779273)、WO98/18464(EP-839806)、 W098/24437(EP-846687) > W098/24756、W098/24794、 WO98/25609、WO99/51605及W099/59999等之化合物、對溴苯曱醯曱基溴化物（Roberts M. F.等，J. Biol. Chem. 1977, 252, 2405-2411)、麥帕克林（Mepacrine，Vadas P•等，Lab. Invest. 1986，55，391-404)、馬諾阿來德（Lombardo D.等，J. Biol. Chem.1985，260，7234-7240)、奇耶羅辛（Yoshida T_ 等，J. Antibiotics. 1991, 44，1467-1470)、引朵奇薩姆 (Hanasaki K.等，J. Biol· Chem. 1999 Nov 26 ; 274(48): 34203-1 1 ; Suzuki N.等，J. Biol. Chem. 2000 Feb 25 ; 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -9- -----------§------------------訂——.........· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1314457 A7 B7 五、發明説明（7 275(8)5785-93)等’但並無該等sPLA2阻礙化合物對血清脂蛋白變性具有抑制作用之報告。本發明係基於以上認知而得以完成者。即，本發明係： (1) 一種醫藥組成物，含有v型及/或又型31>1^八2阻礙化合物作為有效成分’且係用以抑制血清脂蛋白變性、治療或預防動脈硬化症或以動脈硬化為基礎之缺血性疾病者。 (2) 如（1)之醫藥組成物，其中前述v型及/或X型spLA2 阻礙化合物係通式⑴所示化合物、該化合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物； [式中，A環係以下（a)〜(d)所示之基

(d) -----------f…： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (式中R及R中之任一者為式_(L!)_(酸性基）所示之基 (式中’ L1為與酸性基間之連結基，且與酸性基間之連結基之長度為Μ ’而另—者為氫原子、非干擾性取代基或 -(L〗H酸性基）(於此，Ll與前述者意義相同）；且 R及R各為獨立之氫原子、非阻擾性取代基、碳環基、已被非阻擾性取代絲狀碳縣、㈣基或已被非阻擾性取代基取代之雜環基；且

-10- 1314457 或

Z A7 B7 五、發明說明（8 ) 係以下（e)〜(h)所示之基

(式中 ’ R5為（j)Cl-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20块基、破環基或雜環基、（k)各自獨立之已被1或i以上之非阻擾性取代基取代之前述⑴所示之基或式_(L2)_R8所示之基 (式中，L為選自氫原子、氮原子、氮原子、氧原子及硫原子之1〜18原子之2價連結基；且R8為選自⑴或（k)之基）； R6為氫原子、鹵素、C1-C3烷基、C3-C4環烷基、C3-C4 環稀基、C1-C3烷氧基或C1-C3烷硫基； R為氫原子或非阻擾性取代基； RA為式

X 人^nh2 r9>^ 或 y 所不之基（式中，R9及R1G各為獨立之氫原子、C1-C3烷基或齒素；X及Y各為獨立之氧原子或硫原子；且Z為_Nh2或 -NHNH2); rb為-C〇NH2或-CONHNH2;且 D環為環己烯環或苯環；但’ _B-為（e)或（f)所示之基時，A環為（b)、（C)或（d所示之環）]; 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） .................訂 ...... (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -11-

R1 »13 R13 ch2'9~(ch2)i-3- 或 1314457 A7 B7 五、發明説明（9 ) 本發明之醫藥組成物宜前述V型及/或X型sPLA2阻礙化合物係通式（I)中： R1為氫原子或式-(L3)-Rn所示之基（式中，L3為 -och2-、-SCh2_、_NH_CH2_、CH2 CH2、0 CH(CH3)或 -0-ch(ch2ch2c6h5)-;且 r^-cooh、_CONHS〇2c6H5、 _S03H或-P(〇)(〇h)2);且 R2為氫原子或式_(L4)-R丨2所示之基[式中，L4為式 •Η 十(CHA•广 R14 * (式中’R與r〗4各獨立為氫原子、C1C10烷基、C卜d 芳炫基H院氧㈣或自素）；且r1、_cqc>h、_S〇3] 或-P⑼(〇H)2]; 不同時為氫原子之化合物、削合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶齊合物；本發明之醫藥組成物較宜前述V型及/或X型sPLa2|JJ 礙化合物係通式（I)中： R為氫原子、C1_C6烷基、C3_C6環烷基、芳基或雜環本紙張尺度適用中國國表標準（CNS) A4規格（210X297公楚）

-12- 1314457 五、發明説明（l〇 ) 基’且R為氫原子或鹵素之化合物、該化合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物；本發明之醫藥組成物更宜前述V型及/或X型spLA2阻礙化合物係通式⑴中： R5為-(CHJwR、於此，R15為式 •(CH— /=^(Rte)c ^1β)( (CH2)h

~ (CH2)f (R^®)g ， W~(CH2)h"^3~(R、， (CH2)〇· 〇Tx(Ri % -----------f..........................訂：…-……-If. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所不之基（式中，b、d、f、h、j、m及〇各為獨立之〇〜2之整數，R16與R17各為獨立之鹵素、C1_C10烷基、Cl_Ci〇烷氧基、ci-cio烷硫基、芳氧基、苯基及選自clcl〇^烷基之基；α為氧原子或硫原子；0為_(：112_或_((：112)2_; γ為氧原子或硫原子；c、i及ρ為〇〜5之整數；6為〇〜7之整數；8為〇〜4 之整數；且k及η各獨立為〇〜3之整數）之化合物、該化合物本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） •13- 1314457 A7 B7 五、發明説明（11 別驅樂或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物，本發明之®条組成物更宜前述V型及/或X型spla2阻礙化合物係通式⑴中：R為-CH8所示之基[於此，r18為式 R18 或斤之基（式中，“-CH2_C或-(CH2)2; R19為氫原子、C1-C3 、元基或鹵素，且£為單鍵、_CH2或_〇)]之化合物、該化合物之刖驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物；本發明之醫藥組成物更宜前述V型及/或X型spL心阻礙化合物係通式⑴中Rl為-OCI^COOH之化合物、該化合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物；本發明之醫藥組成物更宜前述V型及/或乂型sPLa2阻礙化Ο物係通式⑴中R2為氫原子之化合物、該化合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物；本發明之醫藥組成物更宜前述V型及/或X型spL a2阻礙化合物係通式⑴中R6為C1_C3烷基之化合物、該化合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物；本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -t -14- 1314457 A7 _B7_ 五、發明説明（12 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之醫藥組成物更宜前述V型及/或X型sPLA2阻礙化合物係通式（I)中RA為-CH2CONH2或-COCONH2之化合物、該化合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物；本發明之醫藥組成物更宜前述V型及/或X型sPLA2阻礙化合物係式

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -15- 1314457 A7 B7 五、發明説明（u

NHj H3COOC-

(24) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 或所示化合物、該化合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物；具體言之，本發明之醫藥組成物中，前述V型sPLA2 阻礙化合物係式：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -16- 1314457 A7 B7 五、發明説明（14

HOOC ;八〇 0丫 NH2 HOOC 八0 〇丫阳 2 ό^ό 6^6Α 、cr0xyw、

(19) (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)

HOOC

或所示化合物、該化合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物；本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐〉 -17- 1314457 A7 B7 五、發明説明（i5 ) 或，前述X型sPLA2阻礙化合物為式

---# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐〉 -18- 1314457 A7 B7 五、發明説明（l6

HOOC^^O

HOOC

(17)

(19) 或所示化合物、該化合物之前驅藥或該等之製藥上可允許之鹽或者該等之溶劑合物； (3) —種用途’係使用v型及/或X型spla2阻礙化合物製造用以治療或預防動脈硬化症或以動脈硬化症為基礎之缺血性疾病之藥品；及 (4) 一種用於哺乳動物之治療或預防之方法，係由將可顯不治療效果之量之V型及/或X型sPLA2阻礙化合物投藥至包括人類之哺乳動物所構成，以缓和動脈硬化症或以動脈硬化為基礎之缺血性疾病所造成之影響者。圖示之簡單說明第1圖係用以顯示IB型、ΠΑ型及X型sPLA2所造成之二十四碳四烯酸自LDL游離作用之作用依賴性者（37<=c，反應 1小時）。第2圖係用以顯示對X型spla2k造成之二十四碳四烯酸自LDL游離作用的阻礙化合物之影響者（sPLA2b礙化合物：引朵奇薩姆、cox阻礙化合物：引朵美薩辛、5_L〇x (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 訂— Φ, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） •19· 1314457 A7 B7 ~ ~~ 五、發明説明（17 ) 阻礙化合物：AA-861，各ΙΟμιηοΙ/L，以無阻礙化合物時相對於X型sPLA2所造成之一十四碳四稀酸自LDL游離量之 %表示）。第3圖係用以顯示使LDL與1B型、ΠΑ型及X型sPLA2或 CuS04反應（3、6、24小時）後’ LDL中主要磷脂質之磷醯基膽鹼（pc)之含量（第3A圖）及其溶解體Oyso-Pc)之含量（第 3B圖）之變化者。第4圖係用以顯示使[131^與]^型、IIA型及X型sPLA2或 CuS04反應（3、6、24小時）後，以瓊脂糖凝膠電泳法針對 LDL作解析之結果者，且係以照片替代圖示（凝膠上侧：陰極、下側：陽極）。第5圖係用以顯示使1^1^…）或HDL(B)與IB型、ΠΑ型及 X型sPLA2或CuS〇4反應（3、6 ' 24小時）後，將硫代巴比土酸反應物質（TBARS)換算為丙二酸醛（MDA)量以顯示各脂蛋白中之脂質過氧化之變化者。第6圖係用以顯示X型sPLA2變性HDL之膽固醇抽除量降低作用者。對單獨培養基添加非變性HDL(天然HDL)可見膽固醇酯量之有意義降低，但若以X型變性HDL(X-HDL) 則HDL之降低作用被有意義抑制。第7圖係用以顯示IIA型或V型sPLA2之來自LDL之脂肪酸游離作用之時間經過者（37°C，添加50nmol/L sPLA2)。第8圖係用以顯示對V型sPLA2造成之亞油酸自LDL游離作用的阻礙劑之影響者（sPLA2阻礙劑：引朵奇薩姆、c〇X 阻礙劑：引朵美薩辛，各1 〇μΜ，以無阻礙劑時對v型spla2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •一^· -20- 1314457 A7 _B7_ 五、發明説明（18 ) 之亞油酸自LDL游離量之％表示）。第9圖係用以顯示使LDL與IIA型或V型sPLA2反應（3、 6、24小時）後，LDL中主要磷脂質之磷醯基膽鹼（PC)之含量（A)與其溶解體（lyso-PC)之含量（B)之變化者（37°C，添加 50nmol/L sPLA2)。第10圖係用以顯示使LDL與V型sPLA2反應（3、6、24 小時）後，以瓊脂糖凝膠電泳法針對LDL作解析之結果者 (凝膠上側：陰極、下側：陽極）。本發明之最佳實施型態 (1)含有V型及/或X型sPLA2阻礙化合物作為有效成分，且係用以抑制血清脂蛋白變性之醫藥組成物本案發明人發現人類V型及X型sPLA2具有強烈之使脂肪酸自存在於血中脂蛋白之磷脂質游離之作用。更進一步將V型與X型sPLA2對LDL及HDL之變性作用，即磷脂質分解、脂肪酸游離、溶解磷脂質之產生、陰性電荷增加及攝入至巨噬細胞等與IB型及IIA型之sPLA2比較，而發現V型及X型sPLA2之作用非常強烈，且該等之作用與習知者所提出之因氧化而起之脂蛋白變性作用不同。因此，本發明中「血清脂蛋白變性」係指磷脂質分解、脂肪酸游離、溶解磷脂質之產生、陰性電荷增加及攝入至巨噬細胞等，不包含因氧化而起之變性。本發明所用之「V型及/或X型sPLA2阻礙化合物」係指 V型sPLA2阻礙化合物、X型sPLA2阻礙化合物或具有V型及 X型sPLA2阻礙作用兩者之化合物。本發明之型態亦包含含本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） —-----------SW------------------訂................費. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -21- 1314457 A7 B7 五、發明說明（l9 有V型sPLA2阻礙化合物及X型sPLA2阻礙化合物等兩化合物作為有效成分之醫藥組成物。使用X型sPLA2特異抗體’而於動脈硬化病態樣本動物之也管病變部位之泡洙細胞中顯示有X型sPLA2之呈現。因此，本發明亦包括含有V型及/或X型sPLA2阻礙化合物作為有效成分而用以治療或預防動脈硬化症之醫藥組成物、或用以治療或預防以動脈硬化為基礎之缺血性疾病之醫藥組成物。本發明中，「動脈硬化症」係指動脈壁顯示肥厚及硬化等病變之總稱，且因動脈之狹窄閉塞而導致腦缺血發作、腦梗塞、狹心症、心肌梗塞及間歇性跛行等，顯示種種病態。本發明可適當處置動脈硬化症中之粥狀動脈硬化症。「以動脈硬化為基礎之缺血性疾病」係指起因於動脈硬化或伴隨動脈硬化發生之缺血性疾病◊「缺血性疾病」一般係指局部性貧血造成之壞死等種種臨床性病態，但與本發明之關連中係指起因於血管内或血管本身之變化所造成之閉塞性缺血，特別係指狹心症、心肌梗塞、心室不全及腦梗塞等。 (2)含有前述通式⑴所示v型及/或χ型spLA2阻礙化合物作為有效成分之本發明醫藥組成物通式（I)中’單獨或與其他用語組合使用之「烷基」用語係指具有指定數量範圍之碳原子數之直鍊或分歧鍊狀之 1價烴基。舉例言之，可列舉如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正葵基、正十一烷基、本紙張尺度適用中關轉準（CNS) A4規格⑵GX297公楚） --------------------------1…： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ’、τ· -22- 1314457 五、發明説明（2〇十一烷基、正十二烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十、烧基、正十七院基、正十八烧基、正十九烧基及正二十燒基等。通式（I)中’單獨或與其他用語組合使用之「稀基」用 m係心具有指定數量範圍之碳原子數及工個或2個以上雙鍵之直鍊或分歧鍊狀之1價煙基。舉例言之，可列舉如乙烯土烯丙基、丙烯基、巴豆醯基、異戊烯基及各種丁稀基異構體等。通式（I)中’ A基」係指具有指定數量範圍之碳原子數及1個或2個以上三鍵之直鍊或分歧鍊狀之i價煙基。亦可具有雙鍵。舉例言之，可列舉如乙炔基、丙炔基、6-庚炔基、7-辛炔基、8_壬炔基等。通式（I)中，「碳環基」係指由呈飽和或不飽和、被取代或未被取代且形成環之原子除氫原子外僅為碳原子之 14員環（較宜為5〜1〇員環而更宜為5〜7員環）之有機骨架衍生之基。亦包括前述碳環呈2〜3個連續者。代表性之碳環基可列舉如環絲（如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基）' 環烯基（如環丁晞基、環戍稀基、環己稀基、環庚烯基及環辛稀基）、苯基、萘基、降箱基、雙環戊二烯基、節基、笑基、聯三笨基、苯基環己稀基危基、蒽基聯笨基、一亞窄基及式所示之苯烧苯基衍生物。 (Π) R3及R4之碳環基宜為苯基及環己基等本紙張尺度適用中國國家標準（q^S) A4規格（210X297公楚) -23- 1314457 A7 B7 五、發明説明（2i ) 通式（I)中，「雜環基」係指由呈單環或多環、飽和或不飽和且具有含選自氮原子、氧原子、硫原子所構成之群中1〜3個雜原子之5〜14環原子且被取代或未被取代之雜環骨架所衍生之基。舉例言之，可列舉如吡啶基、吡咯基、呋喃基、笨并呋喃基、噻吩基 '苯并噻吩基、„比唑基、咪唑基、苯咪唑基、三唑基、異哼唑基、噚唑基、嘍唑基、噻二唑基、吲哚基、咔唑基、氮吲哚基、苯并呋喃基、二苯并。夫喃基、二苯并硫笨基、吲唑基、咪唑π，2_&]吡啶基、苯并三嗤基、蒽基、1，2-苯并異噚唑基、苯并哼唑基、苯并喧π坐基、嗓吟基、嗓吟咬基（pUridinyl)、°比咬基、二0比啶基、苯吡啶基、爷吡啶基、嘧啶基、苯嘧啶基、吡啩基、 1，3, 5-三畊基、喹啉基、呔阱基、喳唑啉基及喳哼啉基等。 R3及R4之雜環基宜為呋喃基及噻吩基等。 R5之碳環基及雜環基宜為式 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 『 α (R1\

(Rie)g ._. (R,e)c

(R16)g (CH2)h

(R17)i («16)η

(R16)〇 (CH2)h-|r ^j-(R16)k 或 CX/-(R,7)p

所示之基（式中，h為0~2之整數；R16及R17各為獨立選自鹵素、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷硫基、C卜CIO 本紙張尺度適用中國國家標準（CKS) A4規格（210X297公釐） -24- 1314457 A7 __________B7_ 五、發明説明（22 ) —'" :……：—…-章，： C請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 芳氧基、苯基及Cl_Cl〇卣院基之基· 〇為氧原子或琉原子； β為CH2或（CH2)2-，γ為氧原子或硫原子；c、土及口為〇〜5 之整數；e為0〜7之整數；g為〇〜4之整數；且Un各獨立為〇 3之整數”。'^卜卜让^及/或卩為之以上時丨多數個 R16及多數個R17可各自相異。Rl6為萘基之取代基時可於該秦基上任忍之位置進行取代。更理想者可列舉如式： ~〇^R，^Ό~ε-〇, 所示之基（式中，R19為氫原子、C1-C3烷基或鹵素；e為單鍵、-CH2-或-〇_ ; β為-CH2-或-(CH2)2-)。 R5宜為前述「碳環」C1-C3烷基及前述「雜環」C1-C3 院基。通式（I)中’ 「非妨礙性取代基」係指作為前述「碳環基」、「雜環基」及基本骨架之取代基係適當之基。舉例言之，可列舉如C1-C10烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、 C7-C12芳烷基（如苄基及2-苯乙基）、C7-C12烷芳基、C3-C8 環烷基、C3-C8環烯基、苯基、曱苯基、茬基、聯苯基、 C1-C10烷氧基、C1-C6烷氧C1-C6烷基（如曱氧曱基、乙氧曱基、甲氧乙基及乙氧乙基）、C1-C6烷氧C1-C6烷氧基（如曱氧曱氧基及曱氧乙氧基）、C1-C6烷羰基（如曱羰基及乙羰基）、C1-C6烷羰胺基（如曱羰胺基及乙羰胺基）、C1-C6烷氧本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1314457 A7 ~-----— —__B7__ 五、發明説明（¾ ) 胺基（如曱氧胺基及乙氧胺基）、C1-C6烷氧胺羰基（如曱氧胺幾基及乙氧胺羰基）、單或二Cl-C6烷胺基（如曱胺基、乙胺基' 二甲胺基及乙甲胺基）、C1-Ci〇烷硫基、C1-C6烷硫羰基（如甲硫羰基及乙硫羰基）、C1-C6烷亞磺醯基（如曱亞磺醯基及乙亞磺醯基）'C1-C6烷磺醯基（如曱磺醯基及乙續醯基）、C2-C6鹵烷氧基（如2-氣乙氧基及2-溴乙氧基）、 C1-C6鹵烷磺醯基（如氣曱磺醯基及溴曱磺醯基）、ci-Cl〇鹵烷基、C1-C6羥烷基（如羥曱基及羥乙基）、C1-C6烷氧羰基（如曱氧羰基及乙氧羰基）、-(CUs-CKCl-CG烷基）、苄氧基、芳氧基（如苯氧基）、芳硫基（如苯硫基）、 (C0NHS02R2°)(R2°為C1-C6烷基或芳基）、-CHO、胺基、曱脒基、i素、胺甲醯基、羧基、烷氧羰基、 -(CHJm-COOH(如羧甲基、羧乙基及羧丙基）、氣基、氰胍基、胍基、卡肼基、肼基、羥基、羥胺基、硝基、膦酸基、-S03H、硫縮醛、硫羰基、C1-C6羰基、碳環基及雜環基等。且該等亦可被選自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6 鹵烷氧基、C1-C6鹵烷基及齒素所構成之群中1或2以上之取代基取代。 R3、R4及R5之「被非妨礙性取代基取代」之「非妨害基性取代基」宜為鹵素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6 烷硫基及C1-C6鹵烷基。更宜者可列舉如鹵素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷硫基及C1-C3鹵烷基等。 R1、R2、R3、R4及R7之「非妨礙性取代基」宜為C1-C6 烷基、芳烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、C1-C6羥烷本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） -26- ......-鬢................訂-----...........費. ί請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 1314457 發明說明（¾ (請先閲讀背面之注意事項-«-填窩本貰〕基C2-C6由垸氧基、函素、幾基、ci_c^氧数基、芳氧基芳硫基、妷環基或雜環基。更宜為CK6烷基、芳烷土羧基C1-C6羥烷基、笨基或^以烷氧羰基等。通式⑴中’「函素」係指氟、氣、漠、碘。通式⑴中，「環烧基」係指具有指定數量範圍之破原子數之環狀1價烴基。舉例言之，可列舉如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基等。通式（I)中，「環稀基」係指具有指定數量範圍之碳原子數及1個或2個以上雙鍵之環狀丨價烴基。可列舉如卜環丙烯基、2-環丙烯基、卜環丁烯基及2_環丁烯基等。通式（I)中，「烷氧基」若舉例言之則可列舉如曱氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正τ氧基、正戊氧基及正己氧基等。通式（I)中，「酸性基」係指藉適當之連結原子（之後係作為「與酸性基之連結基」定義）與基本骨架結合時，作為可令氫結合之質子給予體而發揮效用之有機基。可列舉如如式

ο Ν-Ν -S-OH N Η Ο ♦ -Ρ-ΟΗ OR21

R22 Ο Ο OR21 R22 22 —〇-P-(CH2)w-N-r22 〇R21 ^，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） •27·

HO

N

R 1314457

、發明説明 25

•L' 一Lnhso^Q 或為身工中’ R為氫原子、金屬或C1-C10烷基；R22 之氫原子或Cl-C10烷基；但為同時具有R2!及R22之酸性基時，R 21 s 22 R及R中至少一者為氳原子）。且宜為 -COOH X .cn n a 3Ϊ1…·<：〇ΝΗ802(：6Η5 或 P(〇)(〇h)2。而更宜為 -COOH 〇一通式（1)中，「與酸性基之連結基」係指以-(L1)-之記號表不之2價連結基，於一般之關係中係用以連結基本骨架與「酸性基」。可列舉如式 ,23 •M-C~ R24 所示之基（式中，Μ為-CH2-、-0-、-N(R25)_4_S_ ;尺23及尺24 各獨立為氫原子、C1-C10烷基、芳基、芳烷基、羧基或函素）。且較宜為-〇-CH2-、-S-CH2-、_N(R25)-CH2-、 -ch2-ch2-、-〇-ch(ch3)-或-o-ch((ch2)2c6h5)-(式中，R25 為C1-C6烧基）。而更宜為_〇_ch2-或-S-CH2-〇通式（I)中，「與酸性基之連結基長度」係指連結基本骨架與「酸性基」之連結基-(L1)-之最短鏈原子數（除氮原本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）

•28- 1314457 A7

1314457 A7 B7 五、發明説明（27 ) ' 苯基、二氧笨基、二氣笨基、二演苯基、三氣苯基、三氣苯基、三演苯基、氣氟笨基及漠氣苯基等。 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁} 通式⑴中’ D環之「環己烯環」係指僅於環内具有與鄰接之環的縮合部分中所具有之一雙鍵之環己稀環。 A環及-B_之較佳組合宜為以下以（m)〜⑴所示之組合：

其中尤以（m)〜(p)所示組合為佳。則述通式⑴所示之具有V型或/及X型sPLA2阻礙作用之化合物可藉記載於Ep_62〇214(特開平7_〇1〇838、 US-5578634)、ΕΡ-620215(特開平 7-025850、US-5684034)、 EP-6751 10(特開平 7-285933、US-5654326)、WO96/03383(特開平 10-505584)、WO98/18464(EP839806)、WO99/51605、 W099/59999等之習知方法加以製造。具有X型sPLA2阻礙作用之化合物之揀選係如下述般’首先調製人類X型sPLA2顯現細胞及其培養上清液，再針對候補化合物分析其阻礙活性。即，使將人類X型SPLA2 編碼之cDNA序列（Cupillard等，J. Biol. Chem，1997, 272, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -30- 1314457 A7 ____B7___ 五、發明説明（28 ) 15745-15752)插入動物細胞用顯現載體。再將所得顯現載體轉染至宿主細胞，而製得安定顯現人類X型sPLA2之細胞。於培養基中培養顯現細胞，並調製其培養上清液。接著，為鑑定及評估X型sPLA2之阻礙化合物，係使用以下之色原質分析法（chromogenic assay)。該分析法之一般說明係記載於Laure J. Reynolds，Lori L. Hughes 及 Edward A_ Dennis 之記事「Analysis of Human Synovial Fluid Phospholipase A2 on Short Chain Phosphatidylcholine-Mixed Micelles: Development of a Spectrophotometric Assay Suitable for a Microtiterplate Reader」（Analytical Biochemistry，204, pp 190-197，1992:)。具有V型sPLA2阻礙作用之化合物之揀選除可使用將人類 V型 sPLA2編碼之 cDNA序列（Chen 等，J. Biol. Chem， 1994, 269, 2365, 2368)外，可如上述般進行。具有V型及/或X型sPLA2阻礙作用之化合物為具有酸性或鹼性官能基之化合物時，較其原本之化合物水溶性更高，且可形成適於生理之各種鹽。代表之製藥學上可容許之鹽係包含鋰、納、钟、#5、鎮及銘等驗金屬或驗土類金屬鹽，但並不限定於該等鹽。可藉鹼處理溶液中之酸或使酸與離子交換樹脂接觸而簡便地由游離之酸製得鹽。亦包含具有治療或預防缺血再灌流障礙作用之化合物的較無毒性無機鹼及有機鹼之附加鹽，如，形成該化合物及鹽時具有充分鹼性的由氮鹼衍生之胺陽離子、銨及第四級銨亦包含於製藥學上可容許之鹽之定義（如S. M· Berge等， -31- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1314457 A7 ____B7_______ 五、發明説明（29 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) “Pharmaceutical Salts，，，J. Phar. Sci.，66,卜 19(1977))。且可使具有V型及/或X型splA2阻礙作用之化合物之鹼性基與適當之有機酸或無機酸反應而形成苯磺酸鹽、苯曱鹽、二碳酸鹽、二硫酸鹽、二酒石酸鹽、硼酸鹽、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氣化物、克拉維酸鹽、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸鹽（EDTA)、edisylate*、依托酸鹽（estolate)、醯化物、氟化物、富馬酸鹽、gluceptate*、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇醯阿散酸鹽、己基雷索酸鹽、羥基、萘甲酸鹽、碘化物、異硫酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、苦杏仁酸鹽、曱磺醯酸鹽、甲基溴化物、曱基硝酸鹽、曱基硫酸鹽、黏酸鹽、萘續酸鹽（napSylate)、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、鹼式乙酸鹽、琥珀酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、曱苯磺醯酸鹽、三氟乙酸鹽、三氟曱磺醯酸鹽及戊酸鹽等鹽（*所示者尚無對應中文譯名）。溶劑合物則包含與有機溶劑及/或水之溶劑合物。且形成水合物時可與任意數量之水分子配位。具有V型及/或X型SPLA阻礙作用之化合物具有1或1以上之對掌性中心時，可作為光學活性體存在。同樣地，該化合物含烯基或伸烯基時，則存有順式及異式異構體之可能性。R-與S-異構體之混合物及含外消旋混合物之尺·與& 異構體之混合物亦包含於本發明之範圍内。不對稱碳原子亦可存在於如烷基般之取代基。所有該種異構體及其等之混合物同樣地包含於本發明之範圍内。所需者為特定之立本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） •32- 1314457 五、發明説明（30 ) 體異構體時，可藉對本業界人本不系界人士而s係習知方法者加以製造，即，使已預先分割之具有$ s+ 有不對稱中心之出發物質賦予立體特異性反應；或以製诰办秘s , 教坆立體異構物後藉習知方法分割之方法加以製造。本說明書中，前驅藥係指具有化學上或代謝上可分解之基且具V型及/或x.PLA2阻礙作用之化合物之衍生物，且藉加溶劑分解或於生理學條件下，於活體内將成為具藥理學活性之化合物。該化合物之衍生物於酸衍生物或驗衍生物兩者均具有活性，但酸衍生物在哺乳類動物之溶解性' 組織結合性及放出控制之點上有利（Bungard，H·， Desigh of Pr〇drugs，pp. 7_9, 21_24, ε1_6γ，Αηι— 1985)舉例。之，使將成為根本之酸性化合物與適當之醇反應而製出之酯、或使將成為根本之酸性化合物與適當之胺反應而製出之酿胺等含酸性衍生物之前驅藥已廣為本業界人士所知。而由具有前述化合物之酸性基衍生而來之單純脂肪族或芳香族酯係較佳之前驅藥。更佳者為酸性基之 C1-C6烷基酯（如甲基酯、乙基酯）。視情況，亦可製造（醯氧基）烷基酯或（（烷氧羰基）氧基）烷基酯般之雙重酯型前驅藥。「製藥學上可容許」之用語係指適於製劑中其他成分且對接受者不為有害之載體、稀釋劑或添加劑。本發明之治療或預防劑可經由各種通路投藥，該等通路包含經口、噴霧劑、直腸、經皮膚、皮下、靜脈内、肌肉内、鼻腔内等。可將治療有效量之化合物與製藥學上允本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂_ -33- 1314457 A7 B7 _ 五、發明説明（31 )' " " --- 許之載體或稀釋劑組合（如混合）而製得本發明之製劑。又，本發明之製劑可使用習知且易於獲得之成分並以習知方法製得。製造本發明之組成物時，可使活性成分與載體混合或以載體稀釋之，或放入呈膠囊、小藥囊、紙或其他容器型態之載體。載體作為稀釋劑用時，該載體係作媒介用之固體、半固體或液體之材料，而可呈鍵劑、丸劑、粉劑、口含劑、酏劑、懸濁劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、喷霧劑(液體媒質中之固體）及軟骨等型態，舉例言之，含有最高之活性化合物。本發明之具有抗癌作用之化合物宜於投藥前預先製劑化。可使用對本業界人士而言為習知之任一適當載體以進行該製劑。該製劑中之載體為固體、液體或固體與液體之混合物。如為用於靜脈注射而將具有治療或預防缺血再灌流障礙之化合物溶解於4%右旋糖/〇5%檸檬酸鈉水溶液中而呈2mg/ml之濃度。固體之製劑包含粉末、錠劑及膠囊。固體載體係作為香料、潤滑劑、溶解劑、懸濁劑、結合劑、錠劑崩解劑、膠囊劑之材料亦有功效之丨或丨以上之物質。用以經口投藥之錠劑則包含玉米澱粉、褐藻酸等崩解劑、及/或明膠、阿拉伯膠等結合劑、及硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石等潤滑劑以及碳酸鈣、鈉酸鈉、乳糖、磷酸鈣等成型劑。粉末劑中’載體係與被細細粉碎之活性物質混合，而呈細碎之固體。錠劑中，活性成分係以適當之比例與具有必要結合性之載體混合，而被固定為所需之形狀及大小。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）

— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .訂I .會- -34· 1314457 A7 ____ B7 7、發明説明（32 ) "--- 粉末劑及錠劑含有約卜99重量％之係本發明化合物之活性成分。適當之固體載體為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、砂糖、 C請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 葡萄糖、果膠、糊精、殿粉、明膠、西黃考膠、甲基纖維素、鈉羧基甲基纖維素、低熔點纖及可可脂。無菌液體製劑包含懸濁劑、乳劑、糖漿劑及酏劑。活性成分可溶解或懸濁於滅菌水、滅菌有機溶劑或兩者之現合物等製藥上可容許之載體。活性成分可溶解於適當之有機溶劑，如丙二醇水溶液中。亦可將細碎之活性成分散佈於水性澱粉、鈉羧基甲基纖維素溶液或適當之油中而製出其他組成物。投藥量視疾病之狀態、投藥經路、患者之年齡或體重而不同’但對成人以靜脈注射投藥時，通常為 0.01〜10mg/kg/時。且較宜為0.1〜img/kg/時。實施例以下藉實施例更詳盡地說明本發明，但本發明不限於該等實施例。實施例1 X型sPLA2所造成之脂肪酸自離析人類脂蛋白質游離之作用 LDL與HDL係以南速離心法（Havel等，J. Clin. Invest. 34，1345-1353(1955))由人類血漿離析出者。使O.5nnl〇l/L 至 500nmol/L之人類 IB、IIA及 X型 sPLA2於 12.5mmol/L三鹽酸緩衝液（PH8.0)、125mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L氣化鈣所構成之反應液中與LDL或HDL(0.35-lmg/ml)於37Ϊ：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐） -35· 1314457 A7 __B7___ 五、發明説明（33 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 下反應。再以Dole等之方法抽提自脂蛋白質游離之脂肪酸 (Dole等，J. Biol· Chem. 235, 2595-2599(1960))，並以習知方法（Hanasakis 等，J. Biol· Chem. 274, 34203-34211(1999)) 藉9-蔥基二重氮曱烷標記之。接著，檢測藉使用逆向柱 (LichroCART 125-4 Superspher 100 RP-18 columnmol /Lerck)之高速液體柱色譜法（HPLC)而溶出之標記物（脂肪酸）之螢光，再進行游離脂肪酸之定量。為調查各sPLA2所造成之脂肪酸游離反應之用量依賴性，而使〇·5、5、50、 500nmol/L之 X型 sPLA2 以及 50、500nmol/L之 IB 型及 ΙΙΑ型 sPLA2作用60分鐘。又，為調查sPLA2所造成之脂肪酸游離反應之經時變化，而使用50nmol/L之各sPLA2，調查添加 sPLA24小時後之經時變化。於調查藥物之阻礙作用之實驗中，與於反應液中添加sPLA2大致同時地添加sPLA2阻礙化合物（引朵其薩姆；Yokota等 ’ Biochim. Biophys. Acta 1438, 213-222(1999))、環氧酶（COX)阻礙化合物（引朵美薩辛）或 5-脂氧化酶（5-LOX)阻礙化合物（AA-861 ; 2，3，5-三曱基 -6-(12-羥基-5，10-十二雙炔基）-1，4-苯酕（Yoshimoto 等， Biochem. Biophys. Acta. 713, 470-473(1982))至各最終浪度為 ΙΟμιηοΙ/L。結果，由調查經時變化之實驗可知，1B、IIA、X型sPLA2 之中，僅有X型sPLA2有顯著之脂肪酸游離作用。X型sPLA2 所造成之脂肪酸游離反應係於添加60分後達到高原值 (plateau)，另一方面，自LDL游離之脂肪酸量至4小時後止係隨時間變化增加。其次，調查脂肪酸游離反應之用量依本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公爱） -36- 1314457 A7 __B7__ 五、發明説明（34 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 賴性之結果，低用量5nmol/L之X型sPLA2即具有意義之使脂肪酸自LDL及HDL游離之作用，而該反應雖有用量依賴性，但若IB、IIA型sPLA2則即使為500nmol/L之高用量，亦僅有微量之游離（第1圖）。該sPLA2所造成之脂肪酸游離作用雖會受到sPLA2阻礙化合物（引朵其薩姆）阻礙，但卻完全不受COX阻礙化合物（引朵美薩辛）及5-L0X阻礙化合物 (AA-861)影響。實施例2 X型sPLA2對脂蛋白磷脂質組成之作用 LDL與HDL係以高速離心法（Havel等，J. Clin. Invest. 34, 1345-13 53(195 5))由人類血漿離析出者。使50nmol/L之人類 IB、IIA 及 X 型 sPLA2 以及 20pmol/L 之 CuS〇4 於 12.5mmol/L三鹽酸緩衝液（PH8.0)、125mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L氣化鈣所構成之反應液中與LDL或 110[(111^/1111)於37°(：下反應3、6及24小時。之後，使用1^1^ 進行LDL、HDL之磷脂質組成變動之解析。再以習知方法 (Bligh 等，Can. J. Biochem· Physiol. 37, 911-917(1959))由 LDL樣本10pg及HDL樣本15pg進行磷脂質之抽提。接著，依既有報告（Saiga 等，Biochim. Biophys. Acta 1530, 67-76(2001))而添加至順向 HPLC柱（Ultrasphere silica，4.6 x 250mm與4.6x 45mm, Beckman)，分別取出鱗醯基膽驗 (PC)及其溶解體（lyso-PC)，以進行其磷之定量。

結果，LDL係於CuS04及X型sPLA2處理群中隨3 ' 6、 24小時之時間變化PC含量隨之減少（第3A圖），而lyso-PC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -37- 1314457 A7 _______B7_ 五、發明説明（35 ) 含量則對應PC之減少而增加（第3B圖）。而HDL係於CuS04 處理群與LDL時相同地有隨著時間PC減少與lyso-PC增加。另一方面，X型SPLA2所造成之HDL之PC分解與LDL時相較下快速甚多，處理3小時即減少至1 〇%，且lyso-PC量亦相對於PC減少量，3小時後較CuS〇4處理之HDL產生多至 6倍。另一方面，於IB、IIA型sPLA2處理群中，磷脂質之組成並未有明顯變化（第3A、B圖）。實施例3 X型sPLA2對離析人類脂蛋白之陰性電荷之作用 LDL與HDL係以高速離心法（Havel等，J. Clin. Invest· 34, 1345-1353(1955))由人類血漿離析出者。使50nmol/L之人類18、11人、乂型8?1^2及2(^111〇1/1^之(1；118〇4於12.5111111〇1/1^ 三鹽酸緩衝液（PH8.0)、125mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L 氣化鈣所構成之反應液中與LDL或HDL(0.35-lmg/ml)於37 °C下反應（3、6及24小時）。之後，針對lpgLDL及2pgHDL 進行壤脂糖凝膠電泳（Helena Laboratories，TITAN GEL Lipoprotein; 90V，25分鐘）。電泳後，以50-60°C使凝膠乾燥 1 小時後，再以 6ml 染色液（Helena Laboratories, Fat Red7B 瓊脂糖溶液）染色約3分鐘後，以25ml之脫色液（70%甲醇）進行脫色。於調查藥物作用之實驗中，與於反應液中添加 sPLA2大致同時地添加sPLA2阻礙化合物（引朵其薩姆）、 COX阻礙化合物（引朵美薩辛）或5-LOX阻礙化合物 (AA-861)至最終濃度各為ΙΟμηιοΙ/L。

所得結果係示於第4圖。以CuS04處理時，LDL及HDL -38- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1314457 A7 ____F7_ 五、發明説明（36 ) 與未處理時相較下均隨時間朝陽極侧大移動（未針對HDL 顯示資料）。而以人類sPLA2處理時，僅有已被X型splA2 處理之LDL及HDL與藉CuS04處理時同樣地隨時間而朝陽極側移動，而因X型SPLA2之作用使脂肪酸游離且鱗脂質組成發生變化之結果，已確認各脂蛋白之陰性荷電增加。該因X型sPLA2而造成之脂蛋白變性作用將受spLA2阻礙化合物（引朵其薩姆）阻礙，但完全不受COX阻礙化合物（引朵美薩辛）及5-L0X阻礙化合物（AA-861)之影響。實施例4 X型sPLA2對脫辅基蛋白變性之作用 LDL與HDL係以高速離心法（Havel等，J. Clin. Invest. 34，1345-13 53(1955))由人類血漿離析出者。使5〇11111〇1/£之人類 IB、IIA、X型 sPLA2 及 20pmol/L之 CuS04 於 12.5mmol/L 三鹽酸緩衝液（PH8.0)、125mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L 氯化鈣所構成之反應液中與LDL或HDL(0.35-lmg/ml)於37 °C下反應3、6及24小時。之後，以丙酮：乙醇（1 : 1)溶液進行脫脂處理後，再溶解於泳動用緩衝液（l〇mmol/L三鹽酸緩衝液（PH6.8)，2%SDS, 30% 甘油，0.1%2ME， 0.1%BPB)，並以SDS-聚丙烯基醯胺凝膝電泳（SDS-PAGE) 分析。各添加5%之LDL(脫輔基B-100)至4%凝膠及5%之 HDL(脫輔基A-1)至4-20%梯度凝膠後再進行電泳。結果，發現以CuS04處理之脫輔基A-1中’原本之蛋白分子量位置之鍵結幾乎消失而朝引起凝集之廣範圍高分子侧轉移，且LDL中之脫輔基B-100亦有朝高分子側之鍵結轉 -39- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 1314457 A7 _______B7___ 五、發明説明（37 ) 移。另一方面，經X型SPLA2處理之脫輔基B-100及脫輔基 A-1雖未如CuS04處理時般顯著，但處理24小時後亦有部分朝相同高分子側轉移之現象。另一方面，IB型及IIA型sPLA2 處理與未處理之情況相較下並無發現變化。實施例5 X型sPLA2對脂蛋白之脂肪過氧化之作用 A.對產生硫代巴比土酸反應物質之作用 LDL與HDL係以高速離心法（Havel等，J. Clin. Invest. 34, 1345-1353(1955))由人類血漿離析出者。使50nmol/L之人類 IB、IIA、X型 sPLA2及 20μιηο1/Ιν之 CuS〇4於 12.5mmol/L 三鹽酸緩衝液（PH8.0)、125mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L 氣化鈣所構成之反應液中與LDL或HDL(0.35-lmg/ml)於37 °C下反應（3、6及24小時）。之後，將LDL、HDL各10pg以生理食鹽水調製為200μ1，再依習知方法（Nagano等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6457-6461(1991))，並加入500μ1 之20%TCA及500μ1之硫代巴比土酸（3.35mg/ml)後煮沸60 分鐘。冷卻後，以正丁醇（2ml)將係脂肪過氧化指標之一的硫代巴比土酸反應物質（TBARS)抽提出，並測定上澄液中之螢光（激發波長：515nm、螢光波長：55 0nm)。又，使用四乙氧丙烷作為標準物質，並由其校正曲線換算TBARS之量。所得結果係示於第5A及B圖。LDL(第5A圖）及HDL(第 5B圖）均於CuS04處理群具有以6小時為峰值之顯著TBARS 上升。另一方面，包含X型sPLA2之所有處理群中，均無本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） -40- ..................訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1314457 A7 ___ B7_ 五、發明説明（38 ) TBARS之上升。 B.對產生共軛二烯之作用 LDL與 HDL係以超離心法（Havel 等，J. Clin. Invest. 34, 1345-1353(1955))由人類血漿離析出者。使50nmol/L之人類 IB、IIA、X型 sPLA2及 20pmol/L之 CuS04於 2.5mmol/L三鹽酸緩衝液（PH8.0)、25mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L氣化鈣所構成之反應液中與LDL或HDL(0.2mg/ml)於37°C下反應0〜6小時。之後，以習知方法（Esterbauer等，Free Rad. Res. Comms. 6, 67-75(1989))監看234nm吸光度之經時變化以調查係脂肪過氧化指標之一的共軛二烯之產生。結果，CuS〇4處理群無論LDL或HDL均於添加後至90 分鐘為止具有234nm之隨時間而變化之吸光度上升，其後便顯示有漸漸減少之傾向。另一方面，包含X型sPLA2之所有sPLA2處理群中均無234nm之吸光度變化。由以上結果可確認：乂型sPLA2之脂蛋白變性作用（脂肪酸游離、麟脂質組成變化、陰性荷電增加、脫輔基蛋白質高分子化）雖顯示有與CuS〇4處理之氧化變性相同之變化，但卻不依賴脂蛋白之氧化作用。實施例6 X型sPLA2之變性LDL朝小鼠腹腔巨嗟細胞攝入之作用將2ml之4%硫代乙二醇酯溶液注入C57BL/6J小鼠（雄性、生後8周），益於4日後採取腹腔内細胞後撒於載玻培養皿（chamber slide)，於無血清培養基（BIO WHITTAKER: X-VIVO15)存在下培養2小時’並以洗淨操作除去非附著性 «41- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱〉 1314457 A7 __B7__ 五、發明説明（39 ) 細胞’而調製出小鼠腹腔巨噬細胞。再於本細胞中加入 0.2mg/ml之LDL(Sigma)與 50nmol/L之X型 sPLA2，以無血清培養基培養48小時。藉4%甲醛固定細胞20分鐘後，再藉〇il Red 0染色液進行脂肪染色，以確認LDL朝巨噬細胞之攝入情形。調查藥物作用之實驗中，與添加SPLA2大致同時地添加sPL A2阻礙化合物（引朵其薩姆）、COX阻礙化合物（引朵美薩辛）或5-LOX阻礙化合物（AA-861)至各最終濃度為 ΙΟμιηοΙ/L 〇結果，以X型sPLA2處理時，檢測出Oil RedO染色陽性之信號，而綠認朝LDL細胞内被攝入，但未處理之細胞則未能檢測出陽性之信號》由以上之結果可明確得知，X型 sPLA2可使LDL朝巨噬細胞之攝入增加，亦暗示本酵素與動脈硬化病變部位出現之泡沫細胞形成相關之可能性。可藉於細胞中添加X型sPLA2及LDL時同時加入sPLA2阻礙化合物（引朵奇薩姆）而阻礙前述X型sPLA2所造成之LDL朝細胞内攝入之反應，但若以COX阻礙化合物（引朵美薩辛）或 5-LOX阻礙化合物（NDGA)，則該反應完全不受影響。實施例7 使用抗X型sPLA2多株抗體之小鼠動脈硬化病變組織之免疫組織化學解析作為動脈硬化病態樣本動物而用於實驗者係發表並記載於 The Journal of Clinical Investigation Vol. 94， pp. 937-945(1994)之脫輔基脂蛋白E基因欠缺小鼠，而自 Jackson Lab.購入雌性且生後 8週齡之 C57BL/6J-ApoetmlUnc •42· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公爱） 1314457 A7 B7 五、發明説明（4〇 )

小鼠。對照群則係使用雄性且同週齡之C57BL/6。自購入後，即給予高脂肪之餌食（於CA-1(—般飼育用固體飼料) 中添加可可脂15_8%、膽固醇1.25%及膽酸鈉0.5%)並一面飼育之。再對生後12週齡、17週齡及22週齡之小鼠進行灌流驅血，接著以4%之曱醛水溶液使血管化學固定，再解剖採取心臟附近之上行大動脈組織。浸潰於該固定液一晝夜後’再以磷酸缓衝液洗淨，並如定法般藉乙醇施行暫時脫水後包埋於石蠟中。使用顯微切片製得厚度5μιη之内外石蠟切片，再貼附於載玻片上以製作染色用病理標本。免疫組織化學係將各標本切片浸潰於混合二甲苯並去除石蠟，再與含0.3%Η2〇2之曱醇反應30分鐘而去除内因性過氧酶後，以5%之正常山羊血清處置20分鐘。接著，將標本切片浸潰於含0 _ 1牛血清白蛋白之PB S水溶液中3 0分鐘後，與記載於The Journal of Biological Chemistry Vol. 274，No. 48, pp. 34203-34211(1999)之抗人類X型SPLA2(兔）多株抗體 (6pg/mL)以4°C反應14小時。之後，以含有0.1%聚環氧乙烯 (20)山梨糖醇針-月桂酸鹽（tween20; Wako Pure Chemical Industries, Ltd· Osaka)之PBS水溶液充分洗淨，並與結合有生物素之山羊抗兔IgG抗體反應30分鐘，並處理含有過氧酶之抗生物素蛋白-生物素複合體試劑（Vector Laboratories)後放置30分鐘。以PBS水溶液洗淨後於含有 200pg/mL 之二胺基聯苯胺與 0.006%H202 之 50mmol/L Tris-HC1(PH7.6)緩衝液中反應10分鐘，藉此使已於標的X 型分子周圍增幅之過氧酶活性呈色，進而使組織標本中X 43- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1314457 五、發明説明（41 ) 型SPLA2之局部存在可視化，本解析中，XsspLA2信號係作為二胺基聯苯胺之茶褐色沉澱而被檢測出者。X型信號之吸收中和實驗係於將抗體添加至切片前，與已純化之小鼠X型sPLA2蛋白質（3〇〇pg/mL)反應2小時，再使用其抗體及蛋白質反應物處理切片而進行者。又，亦使組織標本於洋蘇木精溶液處理而進行細胞核之對比染色。結果’所採取之生後12、17、22週齡之脫輔基脂蛋白 E基因缺損小鼠之血管中，特別於動脈硬化病變初期症候之泡泳細胞之集積部位係局部性地檢測出X型spLA2之陽性信號。另一方面，對照之正常小鼠之血管組織則未有動脈硬化病變’亦完全未檢測出X型陽性信號。又，藉使用小鼠型X型sPLA2蛋白之吸收中和處理，於脫輔基蛋白£基因缺損小鼠之動脈硬化病變部位檢測出之信號完全消失，故可確認該陽性反應對X型sPLa2分子甚為特異。又，該等陽性信號不可見於由非免疫之兔調製出之IgG。由以上結果可確認’小鼠動脈硬化樣本中血管病變部位之泡沫細胞中顯著地高度顯現有X型sPLA2。實施例8 X型sPLA2變性LDL所造成之巨噬細胞内膽固醇酯量之增加作用使50nmol/L之X型sPLA2於由12.5mmol/L三鹽酸緩衝液（pH8.0)、125mg/L牛血清白蛋白及lmmol/L氣化鈉所構成之反應液中與自人類血漿離析出之LDL在37。(：下作用24 小時，而調製出X型sPLA2之變性LDL。再將2ml之3%硫代本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐〉 -44- 1314457 A7 B7 五、發明説明（42 ) 〈請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 乙二醇酯溶液注入C57BL/6J小鼠（雄性、生後8週齡），並於 4曰後採取腹腔内細胞後撒於24井培養盤，並於無血清培養基（BIO WHITTAKER: X-VIV015)存在下培養2小時，再以洗淨操作除去非附著性細胞，而調製出小鼠腹腔巨噬細胞。於本細胞中加入0.2mg/ml之LDL，並以無血清培養基培養48小時後洗淨細胞，再於己烷及異丙醇之混合液（3 : 2)中靜置30分鐘，以抽提蓄積於巨噬細胞内之膽固醇。抽提出之膽固醇係於將溶劑取代為異丙醇後，依習知方法 (Gambles 等，J· Lipid. Res. 19，1068-1070(1978))於由 0.1M 磷酸緩衝液、lunit/ml之膽固醇氧酶（Roche)、10unit/ml之過氧酶（Boehringer Mannheim)、40pg/ml 之 p-經苯基乙酸 (Sigma)及lunit/ml之膽固醇酯酶（TOYOBO)所構成之反應液中以37°C反應30分鐘，再測定溶液中之螢光（激發波長： 305nm、螢光波長：420nm)以測定總膽固醇量（游離型膽固醇+膽固醇酯）。更於不含膽固醇酯酶之反應液中以37°C反應30分鐘，藉此得以僅測出游離型膽固醇量。又，使用膽固醇及膽固醇油酸酯作為標準物質，由其校正曲線算出總膽固醇量及游離型膽固醇量，再令由總膽固醇量減去游離型膽固醇量之值為膽固醇酯量。結果，攝入已藉X型sPLA2處理之LDL時，與攝入非經處理之LDL之群相較下，檢測出細胞内膽固醇酯量有意義增加，而顯示出經本酵素修飾之LDL可能對出現於動脈硬化病變部位之泡洙細胞之形成具有促進性作用。實施例9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -45- 1314457 A7 _B7_ 五、發明説明（43 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) X型sPLA2變性對HDL之膽固醇抽出能力之影響使50nmol/L之X型sPLA2於由12.5mmol/L三鹽酸緩衝液（pH8.0)、125mg/L牛血清白蛋白及lmmol/L氣化納所構成之反應液中與自人類血漿離析出之HDL在37°C下作用3 小時，而調製出X型sPLA2之變性HDL。再回收ICR小鼠（雌性，生後12週齡）之腹腔内洗淨液後撒於24井培養盤，並於含10%牛胎仔血清之培養基（GIBCO BRL: Dulbecco’s Modified Eagle Medium)存在下培養2小時，再以洗淨操作除去非附著性細胞，而調製出小鼠腹腔巨噬細胞。於本細胞中加入 50pg/ml 之乙醯化 LDL(Biomedical Technology Inc.)並培養24小時，以進行巨噬細胞之泡沫化。去除培養基内過剩之乙醯化LDL後，於血清不存在下加入lOOpg/ml 之HDL並培養24小時後，進行細胞内膽固醇之抽提及定量，並針對HDL自泡沐細胞抽出膽固醇量之能力作檢討。結果，經X型sPLA2之變性HDL處理之細胞群之細胞内膽固醇抽出量相對於以非變性HDL處理之細胞群顯示有意義之減少。由以上結果可知，本酵素之HDL變性可能對動脈硬化病變部位出現之泡沫細胞的HDL之膽固醇抽出作用具有抑制性作用（第6圖）。實施例10 V型sPLA2所造成之脂肪酸自離析人類脂蛋白游離之作用 A.人類V型sPLA2顯現細胞之製作及由其培養上清液純化酵素本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐〉 -46- 1314457 A7 _B7_ 五、發明説明（44 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將人類V型sPLA2編碼之cDNA係以CLONTECH社之 human heart marathon ready cDNA為模型並藉PCR法而製得者。PCR法係使用以下所示之啟發劑。 hGV-S:5 ’-caaagaacgcgtccaccatgaaaggcctcctcccactggct-3’（序列編號1) hGV-AS:5’-ctcgctgcggccgcctaggagcagaggatgttgggaaa-3’（序列編號2) hGV-S係具有科薩克序列及限制酵素Mlul認知部位。又，hGV-AS則具有限制酵素Notl認知部位。PCR係於94°C 0.5分、55°C 0.5分及72°C 2.5分之條件下進行35循環。以Mull 及Notl截斷PCR增幅截片，並插入至改變型 pBluescript-SK(-)。使用 Seqenase Ver. 2.0(USB社）確認驗基序列。接著，使用hGV-S啟發劑及hGV-H6AS啟發劑 (5，-ctcgctgcggccgcctaatggtgatggtgatgatgggagcagaggatgttgg gaaag-3’）（序列編號3)，以PCR法構築出係作為人類V型 sPLA2質粒DNA模型且於羧基末端附加有6個His殘基之V 型sPLA2-HisTag體。再以Smal及Notl切斷PCR增幅截片，並與V型sPLA2質粒（plasmid)DNA對應之部位取代。確認藉 PCR增幅之新領域後，將該cDNA插入哺乳類細胞用顯現載體之SR-α促進劑下方。再使用LipofectAMINE試劑（Gibco BRL社），依使用說明書將所得顯現載體轉染至宿主細胞 CHO，而製得安定顯現有人類V型sPLA2之CHO細胞。接著，將本顯現細胞置於含有10%牛胎兒血清之a-MEN培養基中並培養至匯合前，再收集其培養上清液以作為純化材本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） -47- 1314457 A7 _______Β7 五、發明説明（45 ) 料。使用已鎳螯合之 HiTrap Chelating HP 柱（Amersham Pharmacia Biotech社），由該培養上清液中，將人類V型 sPLA2於SDS-PAGE電泳上純化至單一為止（分子量約 14kDa)，再針對以下脂蛋白變性作用作解析。 B. V型sPLA2所造成之脂肪酸自離析人類脂蛋白質游離之作用 LDL與HDL係以高速離心法（Havel等，J. Clin· Invest. 34, 1345-1353(1955))由人類血漿離析出者。使人類IIA或V 型sPLA2於12.5mmol/L三鹽酸缓衝液（PH8.0)、125mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L氣化鈣所構成之反應液中與LDL或 HDL(lmg/ml)於37°C下反應。再以Dole等之方法（Dole等， J. Biol. Chem. 235, 2595-2599(1960))抽提已自脂蛋白質游離之脂肪酸，並以習知方法（Hanasakis等，J. Biol. Chem. 274, 34203-3421 1(1999))藉9-蔥基二重氮甲烷進行標記。接著，檢測藉使用逆向枉（LichroCART 125-4 Superspher 100 RP -1 8 columnmol /Lerck)之高速液體柱色譜法（HPLC)而溶出之標記物（脂肪酸）之螢光，再進行游離脂肪酸之定量。為調查IIA型及V型sPLA2所造成之脂肪酸游離反應之經時變化，而使用50nmol/L濃度之sPLA2 ’調查添加sPLA23、6 及24小時後之經時變化。於調查藥物之阻礙作用之實驗中，與於反應液中添加sPLA2時大致同時地添加sPL A2阻礙化合物（引朵其薩姆）或COX阻礙化合物（引朵美薩辛）至各最終濃度為ΙΟμιηοΙ/L。 •48- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（哪）A4規格（210 X 297公I) _ 1 ... 1314457 A7 ____B7_ 五、發明説明（46 ) 結果，V型SPLA2具有非常顯著之脂肪酸游離作用，自 HDL·之游離反應係於添加後3小時達到高原值並維持24小時。另一方面，自LDL游離之脂肪酸量於V型splA2時係隨著時間上升至24小時後為止，相對於此，ΠΑ型sPLA2時僅有極少量之脂肪酸游離（第7圖）。該V型SPLA2所造成之脂肪酸游離作用中，雖亞油酸游離作用會受到SPLA2阻礙化合物（引朵其薩姆）阻礙，但卻完全不受COX阻礙化合物（引朵美薩辛）影響（第8圖）。實施例11 V型sPLA2對脂蛋白磷脂質組成之作用 LDL與HDL係以高速離心法（Havel等，J. Clin. Invest. 34, 1345-1353(1955))由人類血漿離析出者。使50nmol/L之人類IIA或V型sPLA2於12.5mmol/L三鹽酸緩衝液（PH8.0)、 125mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L氣化鈣所構成之反應液中與LDL或HDL(lmg/ml)於37°C下反應3、6及24小時。之後，使用HPTC對LDL、HDL之磷脂質組成變動進行解析。再以習知方法（Bligh 等，Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917(1959))由LDL樣本10μδ及HDL樣本15pg進行磷脂質之抽提後，依既有報告（雜賀等，Biochim· Biophys. Acta 1530, 67-76(2001))而添加至順向 HPLC 柱（Ultrasphere silica, 4.6x 250mm與 4.6x 45mm, Beckman)，分別取出鱗醯基膽鹼（PC)及其溶解體（lyso-PC) ’以進行其磷之定量。

結果，LDL時係V型sPLA2處理群中PC含量係隨3、6、 24小時之時間變化而隨之減少，而lys〇-PC含量則相對PC -49- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21〇χ297公釐） 1314457 A7 __B7_ 五、發明説明（47 ) 之減少而增加（第9A及B圖）。而HDL時V型sPLA2所造成之 HDL之PC分解甚為快速，處理3小時即減少至約30%，且 lyso-PC量亦相對於PC之減少而快速增加。另一方面，於ΠΑ 型sPLA2處理群中，磷脂質之組成並未有具意義之變化。實施例12 V型sPLA2對離析人類脂蛋白之變性作用 LDL與HDL係以高速離心法（Havel等，J. Clin. Invest. 34，1345-1353(1955))由人類血漿離析出者。使50nmol/L之人類IIA或V型sPLA2於12.5mmol/L三鹽酸緩衝液（PH8.0)、 125mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L氣化鈣所構成之反應液中與LDL或HDL(lmg/ml)於37°C下反應（3、6及24小時）後，針對lpgLDL及2pgHDL進行90V、25分鐘之瓊脂糖凝膠電泳（Helena Laboratories, TITAN GEL Lipoprotein)。電泳後，以50_60°C使凝膠乾燥1小時後，再以6ml染色液（Helena Laboratories, Fat Red7B環脂糖溶液）染色約3分鐘，再以 25ml之脫色液（70%甲醇）進行脫色。於調查藥物作用之實驗中，與於反應液中添加sPLA2時大致同時地添加sPLA2阻礙化合物（引朵其薩姆）及COX阻礙化合物（引朵美薩辛）至最終濃度各為ΙΟμηιοΙ/L。結果，以V型sPLA2處理時，LDL及HDL與未處理時相較下均隨時間朝陽極侧大移動。HDL朝陽極侧之移動度係與脂肪酸游離作用相同，於3小時達到高原值且持續24小時。又，LDL朝陽極側之移動度係持續隨著時間增加至24 小時後止。如前所述，V型sPLA2造成脂肪酸游離之結果， -50- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1314457 A7 _________B7_ 五、發明説明（姑） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 可確定各脂蛋白之陰性電荷有變化（變性）（第10圖）。令一方面’以人類IIA型sPLA2處理時，各脂蛋白並未朝陽極側移動。該V型splA2造成之脂蛋白變性作用將受sPLA2阻礙化合物（引朵其薩姆）阻礙，但完全不受COX阻礙化合物（引朵美薩辛）影響。實施例13 V型sPLA2對脂蛋白之脂質過氧化 (硫代巴比土酸反應物質）之作用 LDL與HDL係以高速離心法（Havel等，J. Clin. Invest. 34, 1345-1353(1955))由人類血漿離析出者。使50nmol/L之人類ΠΑ型或V型sPLA2於12.5mmol/L三鹽酸緩衝液 (PH8.0)、125mg/L牛血清白蛋白質、lmmol/L氣化鈣所構成之反應液中與LDL或HDL(lmg/ml)於37°C下反應（各為24 及3小時）後，將LDL、HDL各lOpg以生理食鹽水調製為 200μΐ，再依Nagano 等人之習知方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6457-6461(1991))，加入 500μ1 之 20%TCA及 500μ1 之硫代巴比土酸（3.35mg/ml)後以95°C煮沸60分鐘。冷卻後，以2ml正丁醇將係脂肪過氧化指標之一的硫代巴比土酸反應物質（TBARS)抽提出，並測定上澄液中之螢光（激發波長：515nm、螢光波長：550nm)。又，使用四乙氧丙烧作為標準物質，並由其校正曲線換算TBARS之量。結果，IIA型及V型sPLA2所有處理群均無TBARS之上升。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐〉 -51- 1314457 A7 B7 五、發明説明（49 實施例14 (請先閱讀背面之注意事项再填寫本頁) V型sPLA2之變性LDL朝小鼠腹腔巨噬細胞攝入之作用將2ml之4%硫代乙二醇酯溶液注入C57BL/6J小鼠（雄性、生後8周），並於4日後採取腹腔内細胞後撒於載破培養皿，於無血清培養基（BIO WHITTAKER: X-VIV015)存在下培養2小時，並以洗淨操作除去非附著性細胞，而調製出小鼠腹腔巨嗤細胞。再於本細胞中加入0.2mg/mi之 LDL(Sigma)與50nmol/L之X型sPLA2，以無jk清培養基培養 48小時。藉4%甲醛固定細胞20分鐘後，再藉Oil Red 〇染色液進行脂肪染色，以確認LDL朝巨噬細胞之攝入情形。結果，以V型sPLA2處理時，檢測出Oil RedO染色陽性之信號，而確認朝LDL細胞内攝入，但以IIA型sPLA2處理及未處理之細胞則未能檢測出陽性之信號。由以上之結果可明確得知’ V型sPLA2可使LDL朝巨嗟細胞之攝入增加，亦暗示本酵素與動脈硬化病變部位出現之泡沫細胞形成相關之可能性。以下之參考例係用以顯示本發明之較佳化合物中人類 V型或X型SPLA2之阻礙活性。參考例 A.人類V型或X型sPLA2顯現細胞之作成及其培養上清液之調製將用以將人類V型及X型sPLA2編碼之cDNA序列（Chen 等，J_ Biol. Chem，1994, 269, 2365-2368 ;及 Cupillard等，J. Biol. Chem，1997, 272，15745-15752)順方向插入動物細胞本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -52· 1314457 A7 _____B7___ 五、發明説明（50 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用顯現載體之 pSVL SV40 Late Promoter Expression Vector(Amersham Pharmacia Biotech社）之促進劑下流域。再使用LipofectAMINE試劑（Gibco BRL社），依使用說明書將所得顯現載體轉染至宿主細胞CHO，而製得安定顯現有人類V型、X型sPLA2之CHO細胞。接著，將各顯現細胞置於含有10%牛胎兒血清之α-ΜΕΝ培養基中培養3日，再將其培養上清液用於各酵素活性之測定。 Β ·阻礙活性之測定為鑑定及評估V型或X型sPLA2之抑制劑（inhibitor)，係使用以下之色原質分析法（chromogenic assay)。該分析法適用於使用96井微滴定盤之高容量篩選。而該分析法之一般說明係記載於 Laure J. Reynolds，Lori L. Hughes 及 Edward A. Dennis之記事「Analysis of Human Synovial Fluid Phospholipase A2 on Short Chain Phosphatidylcholine-Mixed Micelles: Development of a Spectrophotometric Assay Suitable for a Microtiterplate Reader j(Analytical Biochemistry, 204, pp 190-197, 1992:)° 依預先設定之順序加入被檢測化合物（或空白溶劑），而反應係於三缓衝液（25mM，ρΗ7·3)、CaCl2(10mM)、 KCL(lOOmM)、牛血清白蛋白質（1.0mg/ml)中且特里頓 X100(0.3mM)、5.5’-二硫代雙（2-硝基苯曱酸）（125μΜ)存在下使二庚醯基硫代PC(lmM)與人類V型或X型之sPLA2反應，再測定405nm時之吸光度變化，進而算出阻礙活性者。人類V型酵素時，係以40pl/well進行40°C且45分鐘之本紙張尺度適用中國國家標準（.CNS〉A4規格（210X297公釐） -53- 1314457 A7 _B7_ 五、發明説明（5i ) 反應，而人類X型酵素時係以15μ1/\νε11進行40°c且30分鐘脂粉應。 IC5G係將示於如下表1-4之被檢測化合物之log濃度相對於10%〜90%阻礙範圍之阻礙值繪圖而求得者。茲將V型sPLA2阻礙實驗之結果示於以下之表5,而將X 型sPLA2阻礙實驗之結果示於以下之表6。表1 V型sPLA2阻礙劑 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

V型sPLA2阻礙劑（延續）本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -54- 1314457 A7 B7 五、發明説明（52 )

表3X型sPLA2阻礙劑

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） •55· 1314457 A7 B7 五、發明説明（53 ) 表4 X型sPLA2阻礙劑（延續）

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表5 V型sPLA2阻礙實驗結果化合物編號 IC5〇(nM) 化合物編號 IC5〇(nM) 1 12 7 2 20 11 8 3 2 13 9 1 21 5 10 7 22 13 23 8 3 5 11 2 19 6 表6 X型sPLA2阻礙實驗結果本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） -56- A7 __________B7 五、發明説明（54 ) 化合物編號 ICso(nM) 化合物編號 ICsoinM) 1 10 12 16 2 10 13 19 3 5 14 9 7 5 15 17 8 3 16 7 9 13 17 12 10 12 18 16 11 10 19 26 活性成分澱粉（乾燥）硬脂酸鎂合計製劑例2 使用以下成分製造錠劑。活性成分纖維素（微結晶） 1314457 製劑例以下所示製劑例卜8僅為例示者，並無用以限定本發明之意圖。「活性成分」之用語係指具有v型及/或又型sPLA2 阻礙作用之化合物、該化合物之前驅藥、該等之製藥學上可容許之鹽或該等之溶劑合物。製劑例1 使用以下成分製造硬質明膠膠囊。用量 (mg/勝囊i 250 200 _1〇 460mg 用量 250 4〇〇 ..........................#............... (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（™S) A4规格（210X297公爱） -57- 1314457 A7 B7 五、發明説明（55 ) 二氧化矽 10 硬脂酸 10 合計 665mg 將成分混合並壓縮，而製得各重量為665mg之錠劑。製劑例3 製造含有以下成分之喷霧溶液。用量 (mg/重量）活性成分 0.25 澱粉（乾燥） 25.75 推進劑22(氣化二氟曱烷） 74.00 合計 100.00 將活性成分與乙醇混合，再將該混合物加至推進劑22 之一部份後，冷卻至-30°C，並移至充填裝置。再將相關所需量供至不鏽鋼容器，再以剩下之推進劑稀釋之。之後，將閥單元安裝於容器上。製劑例4 如下述般製造含60mg之錠劑。活性成分 60mg 澱粉 45mg 微結晶性纖維素 35mg 聚乙烯吼咯烷酮（水中10%溶液） 4mg 鈉羧基甲基澱粉 4.5mg 硬脂酸鎂 0.5mg (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -58- 1314457 A7 B7 五、發明説明（56 ) 滑石 lmg 合計 150mg (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使活性成分、澱粉及纖維素經No.45網目U.S.筛子後充分混合。使含聚乙烯吼咯烷酮之溶液與所得粉末混合，並使所得混合物通過No. 14網目U.S.篩子。再使如前述般製得之顆粒以50°(：乾燥後通過^^〇.18網目1；.8.篩子。接著，將已預先通過No.60網目U.S.篩子之鈉羧基曱基澱粉、硬脂酸鎂及滑石加入該顆粒並混合後，藉打錠基加以壓縮而製得各重量150mg之錠劑。製劑例5 如下述般製造含活性成分80mg之膠囊劑。活性成分 80mg 澱粉 59mg 微結晶性纖維素 59mg 硬脂酸鎂 2me 合計 200 mg 將活性成分、澱粉、纖維素及硬脂酸鎂混合，通過No.45 網目U.S.之篩子後再——充填200mg至硬質明膠膠囊。製劑例6 如下述般製造含活性成分225mg之栓劑。活性成分 225mg 飽和脂肪酸甘油醋 2000mg 合計 2225mg 使活性成分通過No.60網目U.S.之篩子，再使其懸濁於本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -59- 1314457 A7 _____B7____ 五、發明說明（π ) 已預先進行最小限度加熱而溶解之飽和脂肪酸甘油酯。再將該混合物倒入外觀2g之模型中冷卻。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 製劑例7 如下述般製造含5 Omg活性成分之懸濁劑。活性成分 50mg 鈉羧基甲基纖維素 50mg 糖漿 1.25ml 苯曱酸溶液 0.10ml 香料 q.v. 色素 q.v. 加上純水合計 5ml 0m, 使活性成分通過No.45網目U.S.之篩子，再與鈉羧基甲基纖維素及糖漿混合而呈滑順之糊。再以部分之水稀釋苯曱酸溶液及香料後加入並攪拌。接著加入充分量之水至所需體積。製劑例8 如下述般製造靜脈用製劑。活性成分 lOOmg 等張食鹽水 1000ml 前述成分之溶劑通常以1分鐘lml之速度對患者進行靜脈投藥。產業上之可利用性如前所述，本案發明人係提出V型及X型sPLA2所造成之血清脂蛋白變性作用以及動脈硬化病變部位顯現V犁及本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） •60- 1314457 A7 _B7_ 五、發明説明（58 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) X型sPLA2，而首度發現V型及X型sPLA2與動脈硬化病變之發病及進展有關。而本發明係以相關知識為基礎，並檢討 sPLA2阻礙化合物對V型或X型sPLA2引起之脂蛋白變性作用之抑制作用，進而使該阻礙化合物對以動脈硬化為基礎之缺血性疾病之有用性明朗化。即，本發明係藉抑制V型及/或X型sPLA2所造成之脂蛋白變性作用，而可作為對以動脈硬化為基礎之缺血性疾病之治療藥及預防藥，故甚為有用。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） •61-

Claims

1314457 Α» Β8 C8 D8

申請專利範圍 cf8^ bn 2 h ,¾ 第91105096號專利申請案申請專利範圍替換本日期：98年6月一種利用V型或X型SPLA2阻礙化合物以抑制血清脂蛋白變性的醫藥組成物，係含有如下式所示V型及/或X型 sPLAz阻礙化合物或其製藥上可允許之鹽作為有效成分者， 1. 經濟部5央標導局員工消費合作社印製智慧財產局

ί 1- . n - - - I I - - - _ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本育) 、va f 本紙張尺度適用中國國家楯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -62- 1314457 六、申請專利範圍 ABCD

-- n n - In - - D - ----1_ 丁 \---- - I ---n (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部^夭標连号員工消費合作社印製智慧財產局 2.如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其係含有如下式所示V型sPLA2阻礙化合物或其製藥上可允許之鹽作為有效成分者，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -63- 1314457 | D8 六、申請專利範圍經濟部a天揉迮扃員工消費合作社印製昝慧N-奎蜀

3.如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其係含有如下式 ------、訂 Γ------IP— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -64- 1314457 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍所示X型sPLA2阻礙化合物或其製藥上可允許之鹽作為有效成分者’ 經濟部°7央標涑局員工消費合作社印製智慧財產局

^-、"--------Aw~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） •65- 1314457 々、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8

-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4. 一種利用V型或X型sPLA2阻礙化合物以治療或預防動脈硬化症的醫藥組成物，係含有如下式所示V型及/或X 型sPLA2阻礙化合物或其製藥上可允許之鹽作為有效成分者， 41JIB | 、言

經濟部a央標準局員工消費合作社印製

衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -66- A8 B8 C8 D8 1314457 經濟部tpjfc標準局員工消費合作社印製

---------I (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -67- 1314457 B? C8 D8 經濟部D央標率局員工消費合作社印製智慧財產局申請專利範圍 5_如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其係含有如下式所示V型sPLA2阻礙化合物或其製藥上可允許之鹽作為有效成分者，

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(J9) I *-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 卜訂-— 衣紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4%格（210X297公釐） -68- 1314457 B88 C8 D8 六、申請專利範圍

6.如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其係含有如下式所示X型sPLA2阻礙化合物或其製藥上可允許之鹽作為有效成分者， --------釦I- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部口天標準局員工消費合作社印製智慧財產局

I訂---- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -69- 1314457 H C8 D8 六、申請專利範圍

1_ :. I-------- (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-— 經濟部&央標導局員工消費合作社印製智慧財產曷 7. —種利用V型或X型sPLA2阻礙化合物以治療或預防以動脈硬化為基礎之缺血性疾病的醫藥組成物，係含有如下式所示V型及/或X型sPLA2阻礙化合物或其製藥上可允許之鹽作為有效成分者，未紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -70- 1314457 六、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8

經濟部°7夹標洚局員工消費合作社印製智慧財產QF

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -71- 1314457 B88 C8 D8 六、申請專利範圍

.—. ^---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---——卜訂經濟部口夹標率局員工消費合作社印製眘慧讨奎荀 8.如申請專利範圍第7項之醫藥組成物，其係含有如下式所示V型sPLA2阻礙化合物或其製藥上可允許之鹽作為有效成分者，

表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -72- 1314457 &、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8

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(請先閱讀背面之注意事項再填寫本Ϊ U 訂 V— ·

Ψ. 經濟勒D夹椟浪一 4β工消費合作衽印製 .智慧蛛產局 9·如申請專利範圍第7項之醫藥組成物，其係含有如所示X型SPLA2阻礙化合物或其製藥上可允許之鹽有效成分者，本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX：297公釐） -73- 1314457 六、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 經濟部D·央椟迆f工消費合作社印製智慧膝產局

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂卜！本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -74- 1314457六、申請專利範圍經濟部〒央標%<^工消費合作社印製.智慧財產局

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -75-