CN117279887A - 抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了能够特异性靶向FAM19A5蛋白从而抑制、减少和/或解离LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5蛋白之间相互作用的模拟分子。本公开还提供了通过施用本发明所述的模拟分子促进突起生长的方法。

Description

抑制剂及其用途
技术领域
本PCT申请要求于2021年7月8日递交的第63/219,683号美国临时专利申请的优先权，所述临时专利申请通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
通过EFS-WEB以电子方式提交的序列表的引用
本申请中提交的.XML文件(名称：3763.019PC01_Seqlisting_ST26.xml，大小：159,077字节；创建日期：2022年7月8日)中以电子方式提交的序列表的内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
技术领域
本公开提供了能够特异性抑制、减少和/或解离LRRC4蛋白家族成员和FAM19A5蛋白之间相互作用的LRRC4家族模拟分子。
背景技术
哺乳动物的神经元不断伸出突起，包括轴突和树突，与其他神经元、肌肉和血管形成突触。同时，神经元使突起收缩，以分解不必要的突触(例如长时间未使用的突触)。这种得到和失去突触的平衡对于健康的中枢神经系统和周围神经系统至关重要。
然而，各种因素(例如老化、细胞毒性微环境、急性损伤、基因突变)都会导致突触异常丢失。这种突触丢失的增加与各种神经紊乱有关，包括精神发育迟滞、精神分裂症、自闭症谱系障碍、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化、亨廷顿舞蹈症、朊病毒病、神经性疼痛、脊髓损伤和中风。参见Hayashi-Takagi，《神经科学研究杂志(Neurosci Res)》114:3-8(2017年1月)；Wang等人《神经精神药理学与生物精神病学进展(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry)》84(第B部分)：398-415(2018年6月)；Jha等人《阿尔茨海默病杂志(Alzheimers Dis)》57(4):1017-1039(2017)；Mitoma等人《国际分子科学杂志(Int J Mol Sci)》21(14)::4936(2020年7月)；Brose等人《生物化学学会学报(Biochem Soc Trans)》21(14):443-4(2010年4月)。
由于人们并不总是完全了解神经紊乱的根本原因，因此目前许多治疗方案仅仅侧重于治疗与紊乱相关的症状。而且，在有可用治疗的情况下，它们可能与不良副作用和/或疗效有限相关。因此，目前需要更有效的针对神经紊乱(例如与突触异常丢失相关的紊乱)的替代治疗方案。
发明内容
本发明提供了一种富含亮氨酸重复序列4(“LRRC4”)家族模拟分子，所述分子能够抑制、减少和/或解离序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子并非抗体或其抗原结合部分。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含肽。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含小分子。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子为式I的小分子：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基；
(ii)----是单键或双键；
(iii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C7-C14)双环烯基、(C7-C14)双环烯基、(7-14元)杂双环烷基、(C6-C10)芳基、(5-10元)杂芳基和-CH-C(O)-CH＝CH-Q，其中，Q是(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C6-C10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，每个环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基，
(iv)L是单键、双键或三键，
其中，所述LRRC4家族模拟分子并非选自以下物质的小分子：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子为式II的小分子：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基，
(ii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C7-C14)双环烯基、(C7-C14)双环烯基、(7-14元)杂双环烷基、(C6-C10)芳基、(5-10元)杂芳基和-CH＝CH-Q，其中，Q是(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C6-C10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，每个环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基，
(iii)L是单键、双键或三键。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子选自以下物质：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子为式III的小分子：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基，
(ii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基、-Y-(C3-C8)环烷基、-Y-(C5-C8)环烯基、-Y-(3-8元)杂环烷基、-Y-(C7-C14)双环烯基、-Y-(C7-C14)双环烯基、-Y-(7-14元)杂双环烷基、-Y-(C6-C10)芳基、-Y-(5-10元)杂芳基，其中，Y是键或C1-C3直链或支链亚烷基，其中，所述环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、卤代、C1-C6卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基，
(iii)L是单键、双键或三键，
(iv)n是0或1。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子选自以下物质：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含如下结构域，或由如下结构域组成，或基本上由如下结构域组成，该结构域是LRRC4蛋白家族成员的结构域，其中，所述结构域能够与FAM19A5蛋白(“FAM19A5结合结构域”)结合，其中，与相应的全长LRRC4蛋白家族成员(例如，SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；或SEQ ID NO:6)相比，所述多肽较短。
在一些方面，所述FAM19A5结合域的长度约为约10-约23个氨基酸。在一些方面，所述FAM19A5结合结构域的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22或约23个氨基酸。在一些方面，所述FAM19A5结合结构域的长度为约10个氨基酸。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列(从N端到C端)：
A-(T/S)-B(式IV)，其中：
(i)A包括X1-(T/S)-(Y/F)-F-X5；其中：
X1是酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
(T/S)是苏氨酸(T)或丝氨酸(S)；
(Y/F)是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)；
X5是任何氨基酸；
(ii)B包括(V/I)-T-V-(E/V)；其中：
(V/I)是缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)；
(E/V)是谷氨酸(E)或缬氨酸(V)。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列(从N端到C端)：
A-(T/S)-B(式IV)，其中：
(i)A包括(Y/W/M)-(T/Y)-(Y/W)-(F/Y/W)–(T/Y)；其中：
(Y/W/M)是酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或甲硫氨酸(M)；
(T/Y)是苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)；
(Y/W)是酪氨酸(Y)或色氨酸(W)；
(F/Y/W)是苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)；
(ii)B包括X7-(T/S/Y)-X9-X10；其中：
X7是缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)或甲硫氨酸(M)；
(T/S/Y)是苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或酪氨酸(Y)；
X9是缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)或甲硫氨酸(M)；
X10是谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、异亮氨酸(I)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)或色氨酸(W)。
本发明还提供一种包含多肽的LRRC4家族模拟分子，所述多肽包含一个具有下式的氨基序列(从N端到C端)：
X1-X2-X3-F-X5-T-X7-T-V-X10(式V)，其中：
X1是Y、F、V、L或I；
X2是T或S；
X3是Y或F；
X5是任何氨基酸；
X7是V或I；和/或
X10是E或V，
其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
本发明还提供一种包含多肽的LRRC4家族模拟分子，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列：(从N端到C端)：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(式VI)，其中：
X1是Y、F、V、L、I、W或M；
X2是T、S或Y；
X3是Y、F或W；
X4是F、Y或W；
X5是任何氨基酸，例如T、S或Y；
X6是T、S或Y；
X7是V、I、Y、F、L、W或M；
X8是T、S或Y；
X9是V、I、Y、F、L、W或M；和/或
X10是E、D、V、I、Y、F、M或W，
其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
在一些方面，X1是Y、F、V、L或I。在一些方面，X2是T或S。在一些方面，X3是Y或F。在一些方面，X4是F。在一些方面，X5是T或S。在一些方面，X6是T。在一些方面，X7是V或I。在一些方面，X8是T。在一些方面，X9是V。在一些方面，X10是E或V。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述多肽由SEQ ID NO:29中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述多肽由SEQ ID NO:20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子由SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述多肽由SEQ ID NO:21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子由SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述多肽由SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸残基T12和L13相对于SEQ ID NO:18的相应残基进行修饰(例如取代)。在一些方面，所述多肽包含SEQ IDNO:123-142中任一项所述的氨基酸序列。在一些方面，所述多肽由SEQ ID NO:123-142中任一项所述的氨基酸序列组成。在一些方面，一个或多个氨基酸残基以D-氨基酸形式存在。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子由SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子由SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列组成。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子由SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸残基T12和L13相对于SEQ ID NO:143的相应残基进行修饰(例如取代)。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:123-149中任一项所述的氨基酸序列。在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子由SEQ ID NO:123-149中任一项所述的氨基酸序列组成。
在一些方面，第X2位氨基酸为磷酸化或O-糖基化氨基酸。
在一些方面，本发明提供的任何LRRC4家族模拟分子与一个部分偶联。在一些方面，所述部分能够增加多肽的以下一种或多种性质：(1)与FAM19A5蛋白的结合亲和力，(2)溶解性，(3)对蛋白酶和/或肽酶降解的抗性，(4)体内给药的适宜性，(5)抑制FAM19A5-LRRC4蛋白家族成员相互作用的能力，或(6)(1)-(5)的任何组合。在一些方面，所述部分包含LRRC4蛋白家族成员的近膜序列。在一些方面，所述近膜包含SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)或SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的序列。在一些方面，所述近膜由SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)或SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的序列组成。
本公开进一步提供一种包含多肽的LRRC4家族模拟分子，所述多肽包含与SEQ IDNO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
本发明还提供一种包含多肽的LRRC4家族模拟分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约99％相同的氨基酸序列，并包含相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中分别所述的氨基酸序列的至少一个氨基酸修饰，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
对于这种LRRC4家族模拟分子，在一些方面，所述至少一个氨基酸修饰增加了所述多肽与FAM19A5蛋白的结合。在一些方面，所述至少一个氨基酸修饰增加了所述多肽的稳定性。在一些方面，所述结合和/或稳定性的增加提高了所述多肽抑制、减少或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的能力。在一些方面，与不具备所述至少一个氨基酸修饰的相应的多肽相比，所述多肽抑制、减少或解离FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的能力增加了至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
在一些方面，SEQ ID NO:5第453位(例如SEQ ID NO:29第5位)的氨基酸残基是T或修饰为S或Y。在一些方面，SEQ ID NO:5第454位(例如SEQ ID NO:29第6位)的氨基酸残基是T或修饰为S或Y。在一些方面，SEQ ID NO:5第449位(例如SEQ ID NO:29第1位)的氨基酸残基是Y或修饰为F、V、L、I、W或M。在一些方面，SEQ ID NO:5第450位(例如SEQ ID NO:29第2位)的氨基酸残基是T或修饰为S或Y。在一些方面，SEQ ID NO:5第451位(例如SEQ ID NO:29第3位)的氨基酸残基是Y或修饰为F或W。在一些方面，SEQ ID NO:5第452位(例如SEQ IDNO:29第4位)的氨基酸残基是F或修饰为Y或W。在一些方面，SEQ ID NO:5第455位(例如SEQID NO:29第7位)的氨基酸残基是V或修饰为I、Y、F、L、W或M。在一些方面，SEQ ID NO:5第456位(例如SEQ ID NO:29第8位)的氨基酸残基是T或修饰为S或Y。在一些方面，SEQ ID NO:5第457位(例如SEQ ID NO:29第9位)的氨基酸残基是V或修饰为I、Y、F、L、W或M。在一些方面，SEQ ID NO:5第458位(例如SEQ ID NO:29第10位)的氨基酸残基是E或修饰为D、V、I、Y、F、M或W。
在一些方面，上述LRRC4家族模拟分子的一个或多个氨基酸残基以D型形式存在。在一些方面，所述D型氨基酸位于N端、C端或N端和C端。
在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子(例如上文提供的LRRC4家族模拟分子)与一个部分偶联。在一些方面，所述部分能够增加多肽的以下一种或多种性质：(1)与FAM19A5蛋白的结合亲和力，(2)溶解性，(3)对蛋白酶和/或肽酶降解的抗性，(4)体内给药的适宜性，(5)抑制FAM19A5-LRRC4蛋白家族成员相互作用的能力，或(6)(1)-(5)的任何组合。在一些方面，所述部分包含LRRC4蛋白家族成员的近膜序列。在一些方面，所述近膜包含SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)或SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的序列。在一些方面，所述近膜由SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)或SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的序列组成。
在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子不包含LRRC4蛋白家族成员的跨膜结构域和/或细胞内结构域。在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子能够与LRRC4蛋白家族成员竞争与FAM19A5蛋白结合。
在一些方面，所述LRRC4蛋白家族成员包括LRRC4蛋白、LRRC4B蛋白、LRRC4C蛋白或其组合。
在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子进一步包含位于所述多肽的N端、所述多肽的C端或所述多肽的N端和C端处的一个或多个额外氨基酸。在一些方面，所述一个或多个额外氨基酸为亲水性氨基酸。在一些方面，所述一个或多个额外氨基酸为D-氨基酸。
在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子包含多肽，其中，所述多肽的N端、C端或N端和C端包含增加所述多肽稳定性的修饰。在一些方面，所述修饰包含芴甲氧羰基、聚乙二醇化、乙酰化、甲基化、环化或其组合。
在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子包含融合蛋白。在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子进一步包含半衰期延长部分。在一些方面，所述半衰期延长部分包含Fc、白蛋白、白蛋白结合多肽、Pro/Ala/Ser(PAS)、人绒毛膜促性腺激素β亚基C端肽CTP、聚乙二醇PEG、长非结构化亲水性氨基酸序列XTEN、羟乙基淀粉HES、白蛋白结合小分子或其组合。
本发明提供了一种编码本发明所述LRRC4家族模拟分子的核酸分子。在一些方面，所述核酸为DNA或RNA。在一些方面，所述核酸为mRNA。在一些方面，所述核酸包含核酸类似物。
本发明还提供了一种载体，包含本发明所述的任何核酸。本发明提供了一种细胞，包含本发明所述的任何载体。本发明提供了一种蛋白质偶联物，包含本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子，与药剂连接。
本发明还提供了一种组合物，包含本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物。在一些方面，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
本发明提供了一种试剂盒，包含本发明所述的LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物，以及使用说明书。
本公开还提供了一种产生能够抑制、减少和/或解离FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的分子的方法，其中，所述方法包括在合适的条件下合成本发明所述的任何LRRC4家族小分子，或培养本发明所述的细胞，以产生所述分子。在一些方面，所述方法进一步包括：分离已经产生的分子。
本发明提供了一种增加神经元突起生长和/或突触形成的方法，包括：使神经元与本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物接触。在一些方面，所述接触发生在有需要受试者体内。在这些方面，所述方法可包括在接触前向受试者施用LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，所述接触发生在体外。
在一些方面，与参照组(例如，未接触的相应神经元中的突起生长)相比，所述接触使神经元突起生长增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。在一些方面，与参照组(例如，未接触的相应神经元中的突触形成)相比，所述接触使神经元突触形成增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
在一些方面，突起生长和/或突触形成的增加减少了与选自以下疾病的一种疾病或病症相关的一种或多种症状：从肌萎缩侧索硬化症ALS、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。
本公开进一步提供了一种在有需要受试者中抑制或减少FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。
在一些方面，在给药后，FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物的形成减少了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。在一些方面，FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的减少增加了受试者中LRRC4蛋白家族成员的活性。
本发明还提供了一种治疗有需要受试者的疾病或病症的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物，其中，所述疾病或病症选自肌萎缩侧索硬化症ALS、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。
本发明提供了一种增加神经元突起生长和/或突触形成的方法，包括：使神经元与LRRC4家族模拟分子接触，其中，所述LRRC4家族模拟分子能够抑制、减少和/或解离序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用，其中，所述LRRC4家族模拟分子是选自以下物质的小分子：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述接触发生在有需要受试者体内。在这些方面，所述方法可包括在接触之前向受试者施用所述LRRC4家族模拟分子。在一些方面，所述接触发生在体外。
在一些方面，与参照组(例如，未接触的相应神经元中的突起生长)相比，所述接触使神经元突起生长增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。在一些方面，与参照组(例如，未接触的相应神经元中的突触形成)相比，所述接触使神经元突触形成增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
在一些方面，突起生长和/或突触形成的增加减少了与选自以下疾病的一种疾病或病症相关的一种或多种症状：肌萎缩侧索硬化症ALS、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。
本公开还提供一种在有需要受试者中抑制或减少FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的方法，包括：向受试者施用LRRC4家族模拟分子，其中，所述LRRC4家族模拟分子能够抑制、减少和/或解离序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用，其中，所述LRRC4家族模拟分子是选自以下物质的小分子：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，在给药后，FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物的形成减少了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。在一些方面，FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的减少增加了受试者中LRRC4蛋白家族成员的活性。
本发明提供了一种治疗有需要受试者的疾病或病症的方法，包括：向受试者施用LRRC4家族模拟分子，其中，所述LRRC4家族模拟分子能够抑制、减少和/或解离FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用，其中，所述LRRC4家族模拟分子是选自以下物质的小分子：
或其药学上可接受的盐，其中，所述疾病或病症选自肌萎缩侧索硬化症ALS、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。
附图说明
图1A、1B、1C和1D显示了使用免疫共沉淀法(图1A和1B)或免疫荧光测定法(图1C和1D)测量的LRRC4蛋白家族不同成员(即LRRC4C、LRRC4和LRRC4B蛋白)与FAM19A5蛋白结合的能力。在图1A中，采用抗FLAG抗体对细胞裂解物(来自HEK293细胞，所述HEK293细胞表达FLAG标记LRRC4C、LRRC4或LRRC4B蛋白并用重组FAM19A5蛋白进行处理)进行免疫沉淀，并采用抗FLAG(上排)和抗FAM19A5(3-2)(下排)抗体对免疫沉淀的蛋白进行免疫印迹。在图1B中，采用人IgG(“IgG”)或抗FAM19A5(1-65)抗体(“1-65”)对细胞裂解物(来自HEK293细胞，所述HEK293细胞表达FLAG标记LRRC4B蛋白并用重组FAM19A5蛋白进行处理)进行免疫沉淀。采用抗FLAG(上排)和抗FAM19A5(3-2)(下排)抗体对免疫沉淀蛋白质进行了免疫印迹。在图1C中，采用重组FAM19A5蛋白对表达FLAG标记LRRC4B蛋白的HEK293细胞进行处理，并采用抗FLAG和抗FAM19A5(3-2)抗体进行免疫染色。在图1D中，采用重组FAM19A5蛋白对原代皮层神经元进行处理，并采用抗FAM19A5(3-2)和抗LRRC4B抗体对原代皮层神经元进行免疫染色。在图1C和1D中，采用Hoechst33342对细胞核进行染色。此外，图1C和1D的第2排(单独FAM19A5蛋白染色)、第3排(单独LRRC4B蛋白染色)和第4排(FAM19A5和LRRC4B染色的叠加)中提供的图像是第一排中提供的图像中框区的放大视图。用箭头表示共定位信号。比例尺＝30μm。
图2A、2B、2C和2D显示了采用免疫荧光法(图2A和2B)或免疫共沉淀分析法(图2C和2D)测量的LRRC4B蛋白与FAM19A5蛋白异构体1和异构体2的结合。图2A提供了显示LRRC4B蛋白和FAM19A5异构体1之间相互作用的免疫荧光数据。图2B提供了显示LRRC4B蛋白和FAM19A5异构体2之间相互作用的免疫荧光数据。在图2C中，采用抗FLAG抗体对来自共转染HEK293细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀，然后采用抗FLAG(上排)和抗FAM19A5(3-2)(下排)抗体对所述细胞裂解物进行免疫印迹。在图2D中，采用以下物质对来自共转染HEK293细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀：(i)人IgG抗体(“IgG”)；(ii)抗FAM19A5(1-65)抗体(“1-65”)；或(iii)抗FAM19A5(3-2)抗体(“3-2”)。采用抗FLAG(上排)和抗FAM19A5(3-2)(下排)抗体对免疫沉淀蛋白质进行了免疫印迹。
图3A和3B显示了不同LRRC4B蛋白缺失构建体与FAM19A5蛋白的结合。图3A提供了LRRC4B蛋白不同结构域的示意图，同时显示了不同缺失构建体中包含的结构域。所示LRRC4B结构域包括：“SP”＝信号肽；“LRR”＝富含亮氨酸重复序列；“IG”＝免疫球蛋白样C2型；“Thr”＝富含苏氨酸；“TM”＝跨膜；“PB”＝PSD95结合。“结合”一栏显示了特定LRRC4B蛋白片段是否能够与FAM19A5蛋白结合：“O”＝结合；“X”＝无结合；“N.D.”＝未确定。图3B显示了采用免疫共沉淀法测量的不同LRRC4B蛋白缺失构建体与FAM19A5蛋白的结合。
图4A和4B显示了采用ELISA法测量的FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员胞外域的结合。图4A提供了显示FAM19A5蛋白与LRRC4(SEQ ID NO:1的氨基酸39-527；即SEQ ID NO:4)(“1”)、LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸36-576；即SEQ ID NO:5)(“2”)和LRRC4C(SEQ IDNO:3的氨基酸45-527；即SEQ ID NO:6)(“3”)蛋白全长胞外域结合的数据。图4B提供了显示FAM19A5蛋白与LRRC4B蛋白不同片段结合的数据：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸453-576(即SEQID NO:7)；(b)SEQ ID NO:2的氨基酸484-576(即SEQ ID NO:8)；(c)SEQ ID NO:2的氨基酸482-576(即SEQ ID NO:9)；(d)SEQ ID NO:2的氨基酸482-497(即SEQ ID NO:10)；(e)SEQID NO:2的氨基酸498-576(即SEQ ID NO:11)。
图5A和5B显示了FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员的以下蛋白片段的结合：(1)LRRC4(SEQ ID NO:1的氨基酸451-483)(即SEQ ID NO:12)；(2)LRRC4C(SEQ ID NO:3的氨基酸451-484)(即SEQ ID NO:13)；(3)LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸484-522)(即SEQ ID NO:14)。图5A提供了存在于LRRC4蛋白家族成员内的不同结构域的示意图，包括已测试蛋白片段的氨基酸序列。所示结构域包括：“SP”＝信号肽；“LRR”＝富含亮氨酸重复序列；“IG”＝免疫球蛋白样C2型；“Thr”＝富含苏氨酸；“TM”＝跨膜；“PB”＝PSD95结合。“结合”一栏显示了特定LRRC4B蛋白片段是否能够结合FAM19A5蛋白：“O”＝结合；“X”＝无结合；“N.D.”＝未确定。图5B显示了FAM19A5蛋白与不同LRRC4家族蛋白片段之间的相互作用。采用抗FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，采用抗FLAG(顶部凝胶)和抗FAM19A5(3-2)(底部凝胶)抗体对免疫沉淀蛋白质进行免疫印迹。
图6显示了包含LRRC4B蛋白的YTYFTTVTVETLE(SEQ ID NO:15)序列的以下肽片段与FAM19A5蛋白结合的能力：(1)“FB-16”＝长度为16个氨基酸(SEQ ID NO:17)；(2)“FB-20”＝长度为20个氨基酸(SEQ ID NO:18)；(3)“FB-28”＝长度为28个氨基酸(SEQ ID NO:19)。
图7显示了利用免疫荧光显微镜术测量的LRRC4B肽片段(SEQ ID NO:2的氨基酸453-576)(即SEQ ID NO:7)(下排)在HEK293细胞中诱导FAM19A5(异构体2)和全长LRRC4B蛋白之间相互作用解离的能力。以采用LRRC4B肽片段(含有SEQ ID NO:2第488位和第489位的丙氨酸取代)(“MT”)的突变形式处理的HEK293细胞作为对照。将方框中的图像(见下排，左起第4个方框)放大为单独使用抗hIgG进行染色的图像(顶部)和同时使用抗hIgG和抗FLAG抗体进行染色的图像(底部)。在放大的图像中，封闭箭头表示与LRRC4B脱离的FAM19A5信号。开箭头表示保留在LRRC4B所在位置的LRRC4B(453-576)-hFc。比例尺＝30μm。
图8A和8B提供了竞争性抑制测定数据，这些数据比较了不同的LRRC4B肽片段抑制FAM19A5蛋白与LRRC4B蛋白(即SEQ ID NO:2的氨基酸36-576)(SEQ ID NO:5)全长胞外域结合的能力。图8A提供了以下LRRC4B肽片段的数据：(1)LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸453-576)(SEQ ID NO:7)；(2)LRRC4B突变体(SEQ ID NO:2的氨基酸453-576，具有第488位和第489位AA突变)(SEQ ID NO:16)；(3)LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸484-576)(SEQ ID NO:8)；(4)LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸482-576)(SEQ ID NO:9)；(5)LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸482-497)(SEQ ID NO:10)；(6)LRRC4B(SEQ ID NO:1的氨基酸498-576)(SEQ ID NO:11)。图8B提供了竞争性抑制测定数据，这些数据显示了(1)FB-28、(2)FB-20和(3)FB-16肽(如图6所述)抑制FAM19A5蛋白与LRRC4B蛋白全长胞外域结合的能力。
图9A、9B和9C比较了不同LRRC4B肽片段抑制FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族不同成员的全长胞外域结合的能力：分别为LRRC4(SEQ ID NO:1的氨基酸残基39-572)(即SEQ IDNO:4)、LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸残基36-576)(即SEQ ID NO:5)和LRRC4C(SEQ ID NO:3的氨基酸残基45-527)(即SEQ ID NO:6)。所示的不同LRRC4B肽片段包括：(1)LRRC4B(SEQID NO:2氨基酸453-576)(SEQ ID NO:7)；(2)LRRC4B突变体(SEQ ID NO:2氨基酸453-576，具有第488位和第489位AA突变)(即SEQ ID NO:16)；(3)FB-20(即包含LRRC4B蛋白YTYFTTVTVETLE序列的长度为20个氨基酸的肽片段；GYTYFTTVTVETLETQPGEE；SEQ ID NO:18)。
图10A和10B比较了FBC4-23和FBC4C-23肽片段抑制FAM19A5蛋白与LRRC4B蛋白全长胞外域(图10A)或LRRC4B蛋白质(即SEQ ID NO:2的氨基酸453-576；即SEQ ID NO:7)富含苏氨酸的结构域(图10B)结合的能力。FBC4-23肽片段包含LRRC4蛋白的FAM19A5结合结构域(用粗体和斜体书写)，并具有以下序列：FBC4C-23肽片段包含LRRC4C蛋白的FAM19A5结合结构域(用粗体和斜体书写)，并具有以下序列：NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR(SEQ ID NO:21)。FB-20肽(参见图6)也用于比较。
图11A和11B显示了不同FB-20肽片段变体抑制FAM19A5蛋白与LRRC4B蛋白全长胞外域(图11A)或包含FAM19A5结合结构域的LRRC4B蛋白片段(即SEQ ID NO:2的氨基酸453-576；SEQ ID NO:7)结合的能力(图11B)。所示的不同FB-20变体如下：(1)FB-m11dC，(2)FB-m10dC，(3)FB-m9dC，(4)FB-m8dC，(5)FB-m7dC，(6)FB-m6dC，(7)FB-m10dN，(8)FB-m9dN，(9)FB-m8dN，(10)FB-m7dN。如示例6所述，每个FB-20变体在LRRC4B蛋白结构域的C端或N端包括一个或多个氨基酸缺失，所述LRRC4B蛋白结构域能够结合FAM19A5蛋白YTYFTTVTVETLE(SEQID NO:15)。表9中提供了FB-20变体的特异性氨基酸序列。
图12A和12B显示了具有丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)取代的不同FB-20肽片段变体抑制FAM19A5蛋白与LRRC4B蛋白全长胞外域(图12A)或包含FAM19A5结合结构域的LRRC4B蛋白片段(即SEQ ID NO:2的氨基酸453-576；SEQ ID NO:7)结合的能力(图12B)。如示例7所述，在能够与FAM19A5蛋白即YTYFTTVTVETLE(SEQ ID NO:15)结合的LRRC4B蛋白结构域的一个氨基酸残基处，将丙氨酸或天冬酰胺取代单独引入FB-20肽片段中。表10中提供了FB-20变体的特异性氨基酸序列。对于所示的每一个FB-20肽变体(FB-20[12-L]和FB-20[13-E]除外)，第一个条形为丙氨酸取代，第二个条形为天冬酰胺取代。对于变体FB-20[12-L]和FB-20[13-E]，仅显示了丙氨酸取代。
图13A和13B显示了小鼠海马培养物中FAM19A5家族成员(图13A)或LRRC4B和PTPRF基因(图13B)的转录水平。如示例8所述，将来源于出生后第1天小鼠大脑的原代海马神经元进行15天体外培养。在初始培养后第1天、第3天、第7天、第10天和第15天测量不同基因的转录水平，并进行RNA-seq定量分析。在图13A中，对于所示的每一天，第一个、第二个和第三个条形(由左至右)分别对应于FAM19A1、FAM19A2和FAM19A5。未检测到FAM19A3和FAM19A4转录。数据为三组数据的平均值±SEM。
图14A、14B、14C和14D显示了LRRC4B肽片段(SEQ ID NO:2的氨基酸残基453-576；SEQ ID NO:7)在体外在各种浓度(x轴)(0.006-60nM)下促进小鼠原代皮层神经元突起生长的能力。如示例8所述，在初始培养后第1天和第2天，采用LRRC4B蛋白片段处理小鼠原代皮层神经元(出生后第1天)，并在第3天通过用β-微管蛋白III型抗体免疫染色对以下项目进行定量：(i)平均总突起生长(图14A)，(ii)主树突的数量(图14B)，(iii)分支点的数量(图14C)，(iv)次级神经突起的数量(图14D)。数据代表平均值±SEM。利用单因子方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验，评估统计显著性；a.与溶媒对照组相比，P<0.01。
图15A、15B和15C显示了LRRC4B肽片段(SEQ ID NO:2的氨基酸残基453-576；SEQID NO:7)对小鼠海马神经元突触素(SYP；一种突触前标记物)和PSD95(突触后标记物)表达的影响。图15A和15B分别显示了使用IMARIS软件(IMARIS 9.0Bitplane，瑞士)测量的具有LRRC4B肽片段(6或60nM)的海马神经元树突/突起中SYN和PSD-95的总荧光强度。图15C显示了海马神经元经处理的树突/突起中SYP和PSD95信号之间的共定位体素的数量。在图15A-15C中，以经溶媒(“Veh”)和LRRC4B肽片段突变体(MT)(60nM)(即在SEQ ID NO:2第488位和第489位包含丙氨酸取代；SEQ ID NO:16)处理的小鼠海马神经元作为对照。如本公开其他部分所述，LRRC4B MT无法与FAM19A5蛋白结合。数据代表平均值±SEM。用于荧光强度量化的神经元数量标在条形图的括号内。利用单因子方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验，评估统计显著性；a.与Veh相比，P<0.05；b.与LRRC4B MT(60nM)相比，P<0.05。
图16A、16B和16C显示了LRRC4B肽片段(SEQ ID NO:2的氨基酸残基453-576；“WT”)(即SEQ ID NO:7)促进APP/PS1小鼠海马CA1区突触形成的能力。根据示例8的进一步描述，连续四周采用LRRC4B肽片段(30mg/kg；静脉给药)处理APP/PS1小鼠，然后利用抗SYP和PSD95抗体通过荧光显微法评估突触形成。对照动物未接受处理(“对照”)或突变体LRRC4B肽片段(60nM)(即SEQ ID NO:2第488位和第489位包含丙氨酸取代；SEQ ID NO:16)。图16A提供了代表性荧光显微照片。图16B和16C分别显示了SYP和PSD95强度。
图17A、17B和17C显示了LRRC4B肽片段(SEQ ID NO:2的氨基酸残基453-576；“WT”；SEQ ID NO:7)促进APP/PS1小鼠海马CA3区突触形成的能力。如图16A-16C所述，对动物进行处理和分析。图17A提供了代表性荧光显微照片。图17B和17C分别显示了SYP和PSD95强度。
图18A、18B、18C、18D和18E显示了经FB-16、FB-20和FB-28肽体外处理的小鼠原代皮层神经元中的突起生长情况(如图6所述)。经过两天的原代皮层神经元处理，在第3天，通过用抗β-微管蛋白III型抗体进行免疫染色，评估突起生长。图18A提供了来自每个处理组的代表性显微影像。图18B、18C、18D和18E分别显示了(i)总突起生长的平均长度，(ii)主树突的数量，(iii)分支点的数量，(iv)次级突起的数量。数据代表平均值±SEM。利用单因子方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验，评估统计显著性；a.与对照组(CTRL)相比，P<0.01。
图19A、19B和19C显示了经过FB-16、FB-20和FB-28肽体外处理的小鼠原代海马神经元的突触素(SYP；一种突触前标志物)和PSD95(突触后标志物)的表达增加(如图6所述)。图19A和19B分别显示了使用IMARIS软件(IMARIS 9.0Bitplane，瑞士)测量的海马神经元树突/突起中SYN和PSD-95的总荧光强度。图19C显示了海马神经元经处理的树突/突起中SYP和PSD95信号之间的共定位体素的数量。数据代表平均值±SEM。用于荧光强度量化的神经元数量标在条形图的括号内。利用单因子方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验，评估统计显著性；*，与CTRL相比，P<0.05；**，与CTRL相比，P<0.05。
图20显示了来自不同脊椎动物物种的LRRC4蛋白家族成员中的目标结构域(即能够与FAM19A5蛋白结合)的序列比对。
图21A和21B提供了通过使用Schrodinger平台对FAM19A5-LRRC4家族复合物进行计算机残基扫描而评估的不同氨基酸修饰对LRRC4B片段结合亲和力的影响。图21A提供了FB-20片段(SEQ ID NO:18)每个氨基酸残基处丙氨酸取代时吉布斯自由能变化的预测值。图21B提供了对FAM19A5蛋白具有增强亲和力的前二十个FB-20双突变体(包含SEQ ID NO:18残基T12和L13处的氨基酸取代)的吉布斯自由能变化的预测值。示例9中提供了所示的FB-20双突变体序列(表12)。
图22A、22B和22C显示了不同FB-21肽突变体与FAM19A5蛋白结合的能力。图22A提供了通过竞争性抑制测定法测定的以下FB-21肽片段对hFc融合hLRRC4B和rcFAM19A5之间相互作用的抑制作用的比较：(1)野生型FB-21(SEQ ID NO:143)，(2)FB-21(P12Y13)(SEQID NO:144)，(3)FB-21(H12F13)(SEQ ID NO:145)，(4)FB-21(Q12R13)(SEQ ID NO:146)，(5)FB-21(W12Y13)(SEQ ID NO:147)，(5)FB-21(M12R13)(SEQ ID NO:148)，(6)FB-21(I12F13)(SEQ ID NO:149)。图22B提供了通过竞争性抑制测定法测定的以下FB-21肽片段对HIS0TEV LRRC4B和rcFAM19A5蛋白之间相互作用的抑制作用的比较：(1)FB-21(野生型)(SEQ ID NO:143)，(2)FB-21(W12Y13)(SEQ ID NO:147)，(3)FB-21(D12Y13)(SEQ ID NO:131)，(4)FB-21(F12F13)(SEQ ID NO:132)，(5)FB-21(H12Y13)(SEQ ID NO:133)，(6)FB-21(D12F13)(SEQ ID NO:135)，(7)FB-21(D12I13)(SEQ ID NO:136)。图22C提供了以下FB-21肽片段的结果，所述FB-21肽片段在氨基和羧基末端含有D型氨基酸，在所有其他残基处含有L型氨基酸：(1)具有近膜(JM)序列的D型FB-21肽(“dFB-JM-31”)；(2)序列两端各有一个血脑屏障(BBB)穿透序列的D型FB-21肽(“dFB-BBB-39”)；(3)具有DY替换和额外JM序列的D型FB-21突变型肽(“dFB-DY-JM31”)。
图22D提供了LRRC4家族不同成员(即LRRC4、LRRC4B和LRRC4C蛋白)的序列比对。以下结构域加方框：(1)FAM19A5结合结构域(“FB”)；(2)近膜结构域(“JM”)，(3)跨膜结构域(“TM”)。
图23A、23B、23C和23D显示了本发明所述的不同FB-21肽片段对淀粉样蛋白β诱导的小鼠原代神经元突触缺失的影响。图23A提供了经FB-21、FB-13-JM或FB-BBB-39(均为6.6nM；关于已测试的不同FB-21肽片段的描述，参见图22C)处理的海马神经元的PSD95(上排)、SYP(中排)和合并(下排)的代表图像。用Hoechst(蓝色)对细胞核进行染色。比例尺＝50μm。图23B提供了经FB-21、FB-13-JM或FB-BBB-39(均为6.6nM)处理的海马神经元的SYP和PSD95信号树突/突起之间的共定位体素数量比较。通过IMARIS软件(左侧图，IMARIS9.0Bitplane，瑞士)计算出共定位体素的数量。图23C和23D分别提供了使用IMARIS测量的经FB-21、FB-13-JM或FB-BBB-39(均为6.6nM)处理的海马神经元树突/突起中PSD95和SYN的总荧光强度比较。数据代表平均值±S.E.M。利用单因子方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验，评估统计显著性；*，P<0.05，并且*，与NT相比，P<0.01。
图24A和24B显示了本发明所述的某些FB-21肽片段(即dFB-dWY-JM31和dFB-DY-JM31)对促进原代小鼠脊髓运动神经元突起生长的作用。图24A提供了经Tau-5抗体免疫染色的未处理(NT)或FB-21肽片段处理的脊髓运动神经元的代表性合并图像。用Hoechst(蓝色)对神经胞体进行染色和检测。比例尺＝100μm。图24B提供了来自不同处理组的原代脊髓运动神经元的平均总突起长度的定量比较。数据代表平均值±S.E.M。利用单因子方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验，评估统计显著性；*，与NT相比，P<0.01。
图25A和25B显示了本发明所述FB-21肽变体(dFB-dWY-JM31)对LUHMES细胞中6-OHDA诱导的细胞死亡的作用。图25A提供了经FB-21肽变体处理(采用或未采用6-OHDA处理)后的发光表达的定量比较。图25B提供了经FB-21肽变体处理(采用6-OHDA处理)后的发光表达的定量比较。数据代表平均值±S.E.M。利用单因子方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验，评估统计显著性；*，与NT相比，P<0.01。
图26A和26B显示了本发明所述某些FB-21肽变体(dFB-dDY-JM31)在慢性压迫性伤害(CCI)大鼠模型中的作用。图26A提供了在经溶媒对照(圆圈)或FB-21肽变体(正方形)处理的小鼠中，在CCI诱导后的各个时间点对机械性触诱发痛做出反应时的缩足阈值的比较。数据代表平均值±S.E.M。图26B提供了图26A中提供数据的整体曲线下面积(AUC)的比较。通过单尾非配对t检验进行AUC统计分析。*，p<0.05。
图27显示了本发明所述FB-21肽变体(dFB-dDY-JM31)对视网膜功能障碍和神经振荡调节的作用。利用糖尿病视网膜病变小鼠模型(db/db)记录视网膜电图(ERG)，以测量视网膜对闪光做出反应时发出的电信号。各组间测量的b波ERG振幅；异质性野生型(WT，db/+，黑色)、DR对照(db/db，红色)和dFB-dDY-JM31处理的DR(蓝色)。数据代表平均值±S.E.M。利用单因子方差分析(ANOVA)和Bonferroni多次对比检验，进行统计分析；***，p<0.001，**，p<0.01。
图28A和28B显示了本发明所述FB-21肽变体(dFB-dWY-JM-31)对创伤性脑损伤小鼠模型的作用。图28A提供了每组的代表性Hoechst染色。图28B提供了基于图28A中提供数据的病灶体积的定量比较。数据代表平均值±S.E.M。通过双尾非配对t检验进行统计分析。***，p<0.001。
图29A和29B提供了竞争性抑制测定结果，显示了本发明所述各种化合物抑制Fc偶联LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸453-576；SEQ ID NO:7)蛋白片段与FAM19A5蛋白之间相互作用的能力。在图29A中，提供了以下化合物的结果：(1)KB734、(2)KB761、(3)KB763、(4)KB1157、(5)KB1161、(6)KB1542、(7)KB1543、(8)KB2256、(9)KB2258、(10)KB2310、(11)KB2357、(12)KB2718、(13)KB2719、(14)KB3111、(15)KB3112、(16)KB3220、(17)KB3201、(18)KB3250和(19)KB3251。图29B显示了KB734、KB2310和KB2357化合物在各种浓度下抑制LRRC4B-FAM19A5相互作用的能力。
图30A和30B提供了竞争性抑制测定结果，显示了不同KB2357衍生物抑制Fc偶联LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸453-576；SEQ ID NO:7)蛋白片段与FAM19A5蛋白之间相互作用的能力。图30A提供了以下衍生物的结果：(1)KB2304、(2)KB2305、(3)KB2308、(4)KB2309、(5)KB2314、(6)KB2315、(7)KB2324、(8)KB2325、(9)KB2328、(10)KB2329、(11)KB2336、(12)KB2337、(13)KB2350、(14)KB2356、(15)KB2358、(16)KB2359、(17)KB2369、(18)KB2372和(19)KB2399。图30B显示了KB2356、KB2358和KB2399化合物在各种浓度下抑制LRRC4B-FAM19A5相互作用的能力。在图30A和30B中，为了比较起见，还包括KB2357。
具体实施方式
本发明公开了一种能够抑制、减少和/或解离FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间结合的模拟分子。具体地，本申请首次表明FAM19A5蛋白可以与LRRC4蛋白家族成员结合，从而抑制LRRC4蛋白家族成员的活性。所公开的模拟分子共有某些性能(例如结构和/或功能性能)，使得它们可以靶向FAM19A5蛋白。通过抑制、减少和/或解离FAM19A5与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用，本发明所述的模拟分子可以恢复内源性LRRC4蛋白家族成员的活性。在整个申请中提供了本公开的附加方面。
为便于理解本发明公开的内容，定义了大量术语和短语。在整个具体实施方式中提出了附加定义。
I.定义
在整个公开中，“一个(a)”或“一个(an)”实体系指一个或多个所述实体；例如，“一个分子”可以理解为代表一个或多个分子。因此，在本发明中，“一个(a)”(或“一个(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”可以互换使用。
此外，本发明中使用的“和/或”应视为两个指定特征或组成部分中每一个特征或组分的特定公开(有或没有另一个特征或组成部分)。因此，本发明中“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
应理解，凡本发明中使用“包含”字样描述各个方面的，同时也提供了用“由……组成”和/或“基本上由……组成”字样描述的其他类似方面。
除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开相关领域普通技术人员通常理解的相同含义。例如，《生物医学和分子生物学简明词典》，Juo,Pei-Show，第2版，2002年，CRC出版社(the Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,2nd ed.,2002,CRC Press)；《细胞与分子生物学词典》，第3版，1999年，美国学术出版社(The Dictionary of Cell and Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press)；以及牛津大学出版社2000年修订的《牛津英语词典生物化学与分子生物学》(the Oxford Dictionary Of Biochemistry And MolecularBiology,Revised,2000,Oxford University Press)为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
采用国际单位制(SI)接受的形式表示单位、前缀和符号。数值范围包括对范围做出定义的数字。除非另有说明，否则氨基酸序列从左到右以氨基到羧基的方向写出。本发明提供的标题并非对本公开各个方面进行限制，可从整体上参考说明书即可了解这一点。因此，通过从整体上参考说明书，即可更全面地定义以下定义的术语。
术语“大约”在本发明中用于表示大约、大致、左右或在某区域内。当“大约”一词与数值范围结合使用时，它通过将边界扩展到所列数值的上方和下方来修改此范围。“大约”一词一般可以利用方差(例如10％)将高于和低于规定值的数值向上或向下(更高或更低)修改。
本发明中使用的术语“烯基”系指包含氢和碳并包含至少一个碳碳双键的基团。
本发明中使用的术语“烷氧基”系指通过氧原子固定到母体分子部分的烷基。
本发明中使用的术语“烷基”系指包含氢和碳且不含双键的基团。
本发明中使用的术语“炔基”系指包含氢和碳并包含至少一个碳碳三键的基团。
本发明中使用的术语“氨基”系指-NH2。
本发明中使用的术语“双环烯基”系指包含至少一个双键的稠合、螺环或桥接的双环烃环系统。
本发明中使用的术语“双环烷基”系指包含稠合、螺环或桥接的双环烷基环。
本发明中使用的术语“环烯基”系指具有零个杂原子的不饱和非芳香族单环烃环系统。环烯基的代表性示例包括但不限于环戊烯基、环己烯基、环庚烯基和环辛烯基。
本发明中使用的术语“环烷基”系指具有零个杂原子的饱和单环烃环系统。环烷基的代表性示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
本发明中使用的术语“甲酰基”系指-CHO。
本发明中使用的术语“卤代(halo)”和“卤素(halogen)”系指Cl、Br、I或F。
本发明中使用的术语“卤代烷氧基”系指通过氧原子固定到母体分子部分的卤代烷基。
本发明中使用的术语“卤代烷基”系指用一个、两个、三个或四个卤素原子取代的烷基。
本发明中使用的术语“杂芳基”系指含有独立选自氮、氧和硫的一个、两个或三个杂原子的芳香环。杂芳基的代表性示例包括但不限于呋喃基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡咯基、噻唑基和噻吩基。
本发明中使用的术语“杂双环烷基”系指含有独立选自氮、氧和硫的一个、两个、三个或四个杂原子并且任选含有一个或多个双键的非芳香族双环系统。本公开的杂双环烷基可以通过基团中的任何碳原子或氮原子固定到母体分子部分。
本发明中使用的术语“杂环烷基”系指含有独立选自氮、氧和硫的一个、两个、三个或四个杂原子并且任选含有一个或多个双键的非芳香族环。本公开的杂环烷基可以通过基团中的任何碳原子或氮原子固定到母体分子部分。杂环烷基的代表性示例包括但不限于吗啉基、哌嗪基、哌啶基、四氢呋喃基、四氢吡喃基和硫代吗啉基。
术语“富含亮氨酸重复序列4蛋白家族”或“LRRC4蛋白家族”(包括其衍生物)系指作为关键突触组织者并已描述为在神经回路形成的各个步骤(包括神经元迁移、突起生长以及突触性接触的形成和功能组装)中发挥作用的蛋白家族。参见Woo等人《分子和细胞神经科学(Mol Cell Neurosci)》42(1):1-10(2009年9月)。LRRC4蛋白家族包括三个成员：(1)LRRC4，(2)LRRC4B，(3)LRRC4C(本发明中统称为“LRRC4蛋白家族成员”或“LRRC4蛋白家族的成员”(或其衍生物))。LRRC4蛋白家族的成员通常包含位于LRR N端和C端侧面的9个富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域(参见图3A)。已知这些LRR结构域与突触前受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)蛋白的III型纤连蛋白结构域相互作用。参见Won等人《细胞生物学(Mol Cells)》41(7):622-630(2018年7月)。LRR结构域之后是免疫球蛋白样C2型(IG)和富含苏氨酸(Thr)的结构域，它们共同形成LRRC4蛋白家族成员的细胞外部分。与其他成员不同，在富含IG和Thr的结构域之间，LRRC4B蛋白具有一个额外富含甘氨酸(Gly)结构域。除了所述的细胞外部分，LRRC4蛋白家族的成员另外还包含位于蛋白C端的跨膜(TM)结构域和突触后致密区结合(PB)结构域。
在人类中，编码LRRC4蛋白的基因位于7号染色体上(GenBank登录号NC_000007.14的核苷酸128,027,071-128,032,107；负链方向)。已知LRRC4蛋白有同义词，示例包括：“鼻咽癌相关基因14蛋白”、“脑肿瘤相关蛋白BAG”、“Netrin-G2配体”、“NAG14”、“NGL-2”和“BAG”。LRRC4蛋白的氨基酸序列长度为653个氨基酸，如表1(下文)所示。LRRC4蛋白的全长胞外域对应于SEQ ID NO:1(即SEQ ID NO:4)的氨基酸残基39-527。除非另有说明，否则“LRRC4蛋白”(包括其同义词)包括细胞自然表达的LRRC4蛋白的任何变体或异构体。
表1.LRRC4蛋白序列
在人类中，编码LRRC4B蛋白的基因位于19号染色体上(GenBank登录号NC_000019.10的核苷酸50,516,892-50,568,435；负链方向)。已知LRRC4B蛋白有同义词，非限制性示例包括：“Netrin-G3配体”、“LRIG4”、“NGL-3”、“HSM”和“DKFZp761A179”。LRRC4B蛋白的氨基酸序列长度为713个氨基酸，如表2(下文)所示。LRRC4B蛋白的全长胞外域对应于SEQID NO:2(即SEQ ID NO:5)的氨基酸残基36-576。除非另有说明，否则“LRRC4B蛋白”(包括其同义词)包括细胞自然表达的LRRC4B蛋白的任何变体或异构体。
表2.LRRC4B蛋白序列
在人类中，编码LRRC4C蛋白的基因位于11号染色体上(GenBank登录号NC_000011.10的核苷酸40,107,066-41,460,419；负链方向)。已知LRRC4C蛋白有同义词，示例包括：“NGL-1”、“Netrin-G1配体”和“KIAA1580”。LRRC4C蛋白的氨基酸序列长度为640个氨基酸，如表3(下文)所示。LRRC4C蛋白的全长胞外域对应于SEQ IDNO:3(即SEQ ID NO:6)的氨基酸残基45-527。除非另有说明，否则“LRRC4C蛋白”(包括其同义词)包括细胞自然表达的LRRC4C蛋白的任何变体或异构体。
表3.LRRC4C蛋白序列
在本发明中，术语“FAM19A5结合结构域”系指能够与FAM19A 5蛋白结合的LRRC4蛋白家族成员的片段/碎片。
术语“序列相似家族19成员A5”或“FAM19A5”系指一种属于五种高度同源蛋白的TAFA家族(又称为FAM19家族)并且主要在大脑和脊髓中表达的蛋白。FAM19A5又称为“TAFA5”或“趋化因子样蛋白TAFA-5”。
在人类中，编码FAM19A5的基因位于22号染色体上。存在多个人FAM19A5(UniProt:Q7Z5A7)异构体，人们认为可通过选择性剪接产生这些异构体：异构体1(UniProt:Q7Z5A7-1)，由132个氨基酸组成，异构体2(UniProt:Q7Z5A7-2)，由125个氨基酸组成，异构体3(UniProt:Q7Z5A7-3)，由53个氨基酸组成。人们认为人FAM19A5蛋白以膜结合型和可溶型(分泌型)两种形式存在。人们认为异构体1是一种具有一个跨膜区的膜蛋白。在Tang T.Y.等人《基因组学(Genomics)》83(4):727-34(2004年)中报道的作为分泌型蛋白(可溶型)的异构体2含有氨基酸第1-25位的信号肽。人们认为异构体1是一种基于EST数据进行预测的膜蛋白。表4(下文)提供了三种已知人FAM19A5异构体的氨基酸序列。除非另有说明，否则“FAM19A5”包括细胞自然表达的FAM19A5蛋白的任何变体或异构体。因此，在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5结合结构域)能够抑制FAM19A5异构体1、异构体2和/或异构体3与LRRC4蛋白家族成员的结合。
表4.FAM19A5蛋白序列
当用于描述LRRC4蛋白家族的成员时，术语“内源性”系指自然存在于受试者中的LRRC4家族蛋白。如本发明所述，本公开的模拟分子(在结构和/或功能上)与内源性LRRC4蛋白家族成员不同。
“结合亲和力”通常指分子的单个结合位点(例如，LRRC4模拟分子)与其结合配偶体(例如FAM19A5蛋白)之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则本发明中使用的“结合亲和力”系指反映结合配对成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X(例如本发明所述的模拟分子，其包含LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5结合结构域)对其配偶体Y(例如FAM19A5)的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以用本领域已知的多种方式进行测量和/或表达，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD根据koff/kon的商进行计算，并表示为摩尔浓度(M)，而KA根据kon/koff的商计算。kon系指抗体与抗原的结合速率常数，koff系指抗体与抗原的解离。可利用本领域普通技术人员已知的技术确定kon和koff，例如免疫测定法(例如酶联免疫吸附测定法ELISA)、或动力学排除测定法(KinExA)。
本发明中使用的术语“特异性结合(specifically binds)”、“特异性识别”、“特异性结合(specific binding)”、“选择性结合”和“选择性地结合”是类似语，系指与抗原(例如FAM19A5蛋白)结合的分子(例如LRRC4家族模拟分子)，而本领域技术人员可以理解这种结合。例如，根据免疫测定法、KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments，爱达荷州博伊西)或本领域已知其他测定法的测定结果，与抗原特异性结合的分子可以与其他肽或多肽结合，通常具有较低的亲和力。在一些方面，与抗原特异性结合的分子以KA与抗原结合，所述KA比分子与另一抗原结合时的KA大至少约2个对数、至少约2.5个对数、至少约3个对数、至少约4个对数或更大。
本发明中使用的术语“抗原”系指任何自然或合成的免疫原性物质，如蛋白质、肽或半抗原。从本公开中可以明显看出，抗原可以是FAM19A5蛋白或其片段。
“与另一种蛋白竞争以与靶标结合”的分子(例如LRRC4家族模拟分子)系指抑制(部分或完全)另一种蛋白(例如LRRC4蛋白家族的自然存在成员)与靶标结合的分子。可以利用已知的竞争性实验确定两种化合物是否相互竞争与靶标结合，即本发明所述的LRRC4家族模拟分子是否抑制LRRC4蛋白家族的自然存在成员与FAM19A5蛋白的结合以及在多大程度上抑制。在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子与LRRC4蛋白家族的自然存在成员竞争，并抑制所述成员与FAM19A5蛋白至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％的结合。可以如本发明所述进行竞争性测定，或如Ed Harlow和David Lane《冷泉港方案(ColdSpring Harb Protoc)》；2006年；doi:10.1101/pdb.prot4277所述进行竞争性测定，或如EdHarlow和David Lane的“使用抗体(Using Antibodies)”第11章(冷泉港实验室出版社，美国纽约冷泉港，1999年)所述进行竞争性测定。
可与本公开结合使用的其他竞争性结合测定法包括：固相直接或间接放射免疫法(RIA)、固相直接或直接酶免疫测定法(EIA)、夹心竞争测定法(参见Stahli等人《酶学方法(Methods in Enzymology)》9:242(1983年))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等人《免疫学杂志(J.Immunol.)》137:3614(1986年))；固相直接标记测定法，固相直接标记夹心测定法(参见Harlow和Lane《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港出版社(1988年))；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人《分子免疫学(Mol.Immunol.)》25(1):7(1988年))；固相直接生物素-抗生物素EIA(Cheung等人《病毒学(Virology)》176:546(1990年))；直接标记RIA(Moldenhauer等人《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》32:77(1990年))。
本发明中使用的术语“自然发生”或“自然存在”系指可以在自然界中发现某个对象(如蛋白质)。例如，可以从自然界来源中分离出来，并且尚未经人类在实验室中有意修饰的存在于有机体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是自然发生的。根据本公开其他部分的进一步描述，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子并非自然发生的多肽。
“模拟分子”系指在结构和/或功能上类似于另一个分子(“参考分子”)的分子。例如，在一些方面，模拟分子可与参考分子共有局部结构或序列，使模拟分子能够表现出参考分子的一项或多项性质。然而，从本公开中可以明显看出，并不总是需要结构或序列相似性。在一些方面，模拟分子可以存在结构上的差异，但表现会类似于参考分子。如本发明所述，在一些方面，模拟分子包含小分子。在一些方面，模拟分子包含肽。在一些方面，模拟分子并非抗体或其抗原结合部分。
“多肽”系指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，链的长度没有上限。蛋白中的一个或多个氨基酸残基可以包含修饰，例如但不限于糖基化、磷酸化或双硫键形成。“蛋白”可包含一个或多个多肽。
本发明中使用的术语“核酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链分子，并且可以是cDNA。
本发明中使用的术语“载体”旨在指一种能够运输与之相连的另一核酸的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，指可在其中连接其他DNA片段的环状双链DNA环。另一种载体类型是病毒载体，其中，其他DNA片段可连入病毒基因组。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和其他游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能够引导与其操作性连接的基因的表达。这类载体在本发明中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般情况下，重组DNA技术中的实用表达载体通常以质粒的形式存在。在本说明书中，质粒是最常用的载体形式，因此“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，也包括其他形式的表达载体，如具有等同功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本发明中使用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)旨在指包含并非自然存在于细胞中的核酸的细胞，并且这种细胞可以是已经引入重组表达载体的细胞。应理解，这类术语不仅旨在指特定的受试者细胞，而且也指这类细胞的子代。由于突变或环境影响，某些修饰会在后代中发生，因此这类后代实际上不能与亲本细胞完全相同，但仍纳入本发明中使用的“宿主细胞”范围内。
本发明中使用的“给药”系指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将分子(例如LRRC4模拟分子)或包含该分子的组合物物理引入受试者。可采用的给药途径的非限制性示例包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、脊髓内或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。本发明中使用的短语“胃肠外给药”表示肠内和局部给药以外的给药模式，通常通过注射实现，包括但不限于静脉内、腹腔内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、皮内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及活体电穿孔。可替代地，本发明所述的分子(例如本发明所述的LRRC4家族模拟分子)可以通过非胃肠外途径进行给药，例如局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给药。也可进行一次、多次给药和/或在一个或多个延长期内给药。
本发明中使用的术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
术语“神经元”包括通过电信号和化学信号处理和传输信息的电可兴奋细胞。神经元是中枢神经系统(CNS)大脑和脊髓以及周围神经系统(PNS)神经节的主要组成部分，可以相互连接形成神经网络。典型的神经元由细胞体(胞体)、树突和轴突组成。神经元的胞体(细胞体)包含细胞核。神经元的树突是具有许多分支的细胞扩展，神经元的大部分输入发生在这些分支。轴突是一个自胞体延伸出的更纤细的电缆状突起，它会将神经信号从胞体中带走，并将某些类型的信息带回胞体。
本发明中使用的术语“治疗有效量”系指单独或与另一种治疗剂相结合的物质(例如本发明所述的LRRC4模拟分子)可有效“治疗”受试者的疾病或紊乱，或降低疾病或紊乱(例如本发明所述的神经系统疾病)的风险、潜在性、可能性或发生的用量。“治疗有效量”包括一定量的物质或治疗剂，所述物质或治疗剂为患有疾病或紊乱(例如本发明所述的神经系统疾病)或存在患有疾病或紊乱(例如本发明所述的神经系统疾病)风险的受试者提供了一些改善或益处。因此，“治疗有效”量是降低疾病或紊乱的风险、潜在性、可能性或发生的用量，或提供某种减轻、缓解，和/或减少疾病或紊乱的至少一个指标和/或减少至少一种临床症状的用量。
II.模拟分子
本发明公开了LRRC4蛋白家族成员的模拟分子(本发明称为“LRRC4家族模拟分子”)。本发明首次证明(参见示例1)FAM19A5蛋白对LRRC4蛋白家族的所有成员表现出高结合亲和力。本发明所述的模拟分子类似于LRRC4家族的成员，原因在于这些模拟分子能够进行竞争与FAM19A5蛋白结合。在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子表现出一种或多种性质(例如，结合亲和力和/或稳定性增加)，使其能够与自然存在的LRRC4蛋白家族成员竞争与FAM19A5蛋白结合。如本发明所示，这种情况可导致对LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5蛋白之间相互作用的抑制、减少和/或解离。
从本公开中可以明显看出，虽然本发明所述的LRRC4家族模拟分子与LRRC4蛋白家族成员共有某些性质，但是LRRC4家族模拟分子(在结构和/或功能上)与自然存在的LRRC4蛋白质家族成员不同。例如，在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含小分子。根据本公开其他部分的进一步描述，在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含多肽，其中，所述多肽包含如下结构域，或由如下结构域组成，或基本上由如下结构域组成，该结构域是LRRC4蛋白家族成员的结构域，其中，所述结构域能够与FAM19A5蛋白(本发明中又称为“FAM19A5结合结构域”)结合。就这些方面而言，所述多肽可包含FAM19A5结合结构域内的一个或多个氨基酸取代。根据本公开其他部分的描述，在一些方面，此类氨基酸取代可以改善多肽的一种或多种性质，例如，增加多肽对FAM19A5蛋白的稳定性和/或结合亲和力。在一些方面，所述多肽可包含FAM19A5结合结构域，但是缺少LRRC4蛋白家族成员的一个或多个其他结构域。例如，在一些方面，多肽包含FAM19A5结合结构域，但不包含跨膜结构域。在一些方面，多肽包含FAM19A5结合结构域，但不包含LRRC4蛋白家族成员的细胞内结构域(例如突触后致密区结合(PB)结构域)。在一些方面，多肽包含FAM19A5结合结构域，但不包含跨膜结构域和细胞内结构域。因此，在一些方面，与自然存在的LRRC4蛋白家族成员相比，本发明所述的多肽较短。此外，在进行生物活动(例如神经回路形成)时，LRRC4蛋白家族的成员(LRRC4、LRRC4B和LRRC4C)与其配体(分别为netrin-G2、受体酪氨酸磷酸酶LAR和netrin-G1)相互作用。参见Li等人《癌症分子学(Mol Cancer)》13:266(2014年12月)。由于本公开的多肽不包含LRRC4蛋白家族成员的所有结构域，在一些方面，多肽不会与LRRC4蛋白质家族配体结合，而是特异性靶向FAM19A5蛋白。因此，在一些方面，本发明所述的多肽并未取代内源性LRRC4蛋白家族成员。相反，在一些方面，通过抑制、减少和/或解离FAM19A5与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用，本公开的多肽可以释放内源性LRRC4家族蛋白，并允许它们进行其天然生物活动。
其中，所述LRRC4家族模拟分子包含小分子化合物，在一些方面，所述模拟分子为：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基；
(ii)----是单键或双键；
(iii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C7-C14)双环烯基、(C7-C14)双环烯基、(7-14元)杂双环烷基、(C6-C10)芳基、(5-10元)杂芳基和-CH-C(O)-CH＝CH-Q，其中，Q是(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C6-C10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，每个环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基，
(iv)L是单键、双键或三键。
在一些方面，R1、R2和R3选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基和氟甲氧氧基。在一些方面，R1、R2和R3选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基。在一些方面，R1、R2和R3选自氢、羟基和甲氧基。在一些方面，R1和R2从羟基和甲氧基，R3是氢。
在一些方面，Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基和-CH-C(O)-CH＝CH-Q，其中，Q选自(C6-C10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，芳基和杂芳基可选用独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基和羟基的一个、两个或三个取代基取代。在一些方面，Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基和-CH-C(O)-CH＝CH-Q，其中，Q是可选用独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基和羟基的一个、两个或三个取代基取代的(C6-C10)芳基。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子为式I的小分子，其中：
(i)R1、R2和R3选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基和氟甲氧氧基；
(ii)----是单键或双键；
(iii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基和-CH-C(O)-CH＝CH-Q，其中，Q选自(C6-C10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，芳基和杂芳基可选用独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基和羟基的一个、两个或三个取代基取代；
(iv)L是双键或三键。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子为式I的小分子，其中：
(i)R1、R2和R3选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基；
(ii)----是单键或双键；
(iii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基和-CH-C(O)-CH＝CH-Q，其中，Q是可选用独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基和羟基的一个、两个或三个取代基取代的(C6-C10)芳基；
(iv)L是双键或三键。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子选自以下物质：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基；
(ii)----是单键或双键；
(iii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C7-C14)双环烯基、(C7-C14)双环烯基、(7-14元)杂双环烷基、(C6-C10)芳基、(5-10元)杂芳基和-CH-C(O)-CH＝CH-Q，其中，Q是(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C6-C10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，每个环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基，
(iv)L是单键、双键或三键，其中，所述LRRC4家族模拟分子并非选自以下物质：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基，
(ii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基、(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C7-C14)双环烯基、(C7-C14)双环烯基、(7-14元)杂双环烷基、(C6-C10)芳基、(5-10元)杂芳基和-CH＝CH-Q，其中，Q是(C3-C8)环烷基、(C5-C8)环烯基、(3-8元)杂环烷基、(C6-C10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，每个环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基，
(iii)L是单键、双键或三键。
在一些方面，R1、R2和R3选自氢、氟、氯、溴、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基和N,N-二甲氨基。在一些方面，R1、R2和R3选自氢、氟、氯、溴、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基和N,N-二甲氨基。在一些方面，R1、R2和R3选自氢、氟、羟基、甲氧基和N,N-二甲氨基。在一些方面，R1和R2选自氟、羟基、甲氧基和N,N-二甲氨基，R3是氢。
在一些方面，Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基和-CH＝CH-Q，其中，Q选自(C6-C10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，芳基和杂芳基可选用独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基和羟基的一个、两个或三个取代基取代。在一些方面，Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基和-CH＝CH-Q，其中，Q是可选用独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基和羟基的一个、两个或三个取代基取代的(C6-C10)芳基。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子为式II的小分子，其中：
(i)R1、R2和R3选自氢、氟、氯、溴、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基和N,N-二甲氨基。在一些方面，R1、R2和R3选自氢、氟、氯、溴、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基和N,N-二甲氨基；
(ii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基和-CH＝CH-Q，其中，Q选自(C6-C10)芳基和(5-6元)杂芳基；其中，芳基和杂芳基可选用独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基和羟基的一个、两个或三个取代基取代；
(iii)L是双键。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子为式II的小分子，其中：
(i)R1、R2和R3选自氢、氟、氯、溴、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基和N,N-二甲氨基；
(ii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基和-CH＝CH-Q，其中，Q是可选用独立选自(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、卤代、(C1-C6)卤代烷氧基和羟基的一个、两个或三个取代基取代的(C6-C10)芳基；
(iii)L是双键。
在一些方面，所述LRRC4家族分子选自以下物质：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基，
(ii)Z选自直链或支链(C1-C8)烷基、直链或支链(C2-C8)烯基、直链或支链(C2-C8)炔基、-Y-(C3-C8)环烷基、-Y-(C5-C8)环烯基、-Y-(3-8元)杂环烷基、-Y-(C7-C14)双环烯基、-Y-(C7-C14)双环烯基、-Y-(7-14元)杂双环烷基、-Y-(C6-C10)芳基、-Y-(5-10元)杂芳基，其中，Y是键或C1-C3直链或支链亚烷基，其中，所述环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、卤代、C1-C6卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基，
(iii)L是单键、双键或三键，
(iv)n是0或1。
在一些方面，R1、R2和R3选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基和氟甲氧氧基。在一些方面，R1、R2和R3选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基。在一些方面，R1、R2和R3选自氢、羟基和甲氧基。在一些方面，R1和R2选自羟基和甲氧基，R3是氢。
在一些方面，Z选自-Y-(C3-C8)环烷基、-Y-(C5-C8)环烯基、-Y-(3-8元)杂环烷基、-Y-(C7-C14)双环烷基、-Y-(C7-C14)双环烯基、-Y-(7-14元)杂双环烷基、-Y-(C6-C10)芳基和-Y-(5-10元)杂芳基，其中，Y是键或C1-C3直链或支链亚烷基，其中，所述环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、卤代、C1-C6卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基。在一些方面，Z选自-Y-(C6-C10)芳基和-Y-(5-10元)杂芳基，其中，Y是键或C1-C3直链或支链亚烷基，其中，芳基和杂芳基可选用一个、两个或三个取代基取代，所述取代基独立选自C1-C6烷氧基和卤代。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子为式III的小分子，其中：
(i)R1、R2和R3选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基和氟甲氧氧基；
(ii)Z选自-Y-(C3-C8)环烷基、-Y-(C5-C8)环烯基、-Y-(3-8元)杂环烷基、-Y-(C7-C14)双环烷基、-Y-(C7-C14)双环烯基、-Y-(7-14元)杂双环烷基、-Y-(C6-C10)芳基和-Y-(5-10元)杂芳基，其中，Y是键或C1-C3直链或支链亚烷基，其中，所述环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、卤代、C1-C6卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基；
(iii)L是三键。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子为式III的小分子，其中：
(i)R1、R2和R3选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基；
(ii)Z选自-Y-(C6-C10)芳基和-Y-(5-10元)杂芳基，其中，Y是键或C1-C3直链或支链亚烷基，其中，芳基和杂芳基可选用一个、两个或三个取代基取代，所述取代基独立选自C1-C6烷氧基和卤代；
(iii)L是三键。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子选自以下物质：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
或其药学上可接受的盐。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子是：
如本发明所述，其中，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含多肽，在一些方面，所述多肽至少包含LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5结合结构域。除非另有说明，否则只要FAM19A5结合结构域能够与FAM19A5蛋白结合，对该结构域的总长度就没有特定限制。在一些方面，FAM19A5结合结构域的长度为至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约7个氨基酸、至少约8个氨基酸、至少约9个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约11个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约13个氨基酸、至少约14个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约21个氨基酸、至少约22个氨基酸、至少约23个氨基酸、至少约24个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约26个氨基酸、至少约27个氨基酸、至少约28个氨基酸、至少约29个氨基酸或至少约30个氨基酸。在一些方面，所述FAM19A5结合域的长度为约10-约23个氨基酸。在一些方面，所述FAM19A5结合结构域的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22或约23个氨基酸。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的FAM19A5结合结构域长度为约10个氨基酸。
在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽包含具有下式的氨基酸序列(从N端到C端)：
A-(T/S)-B(式IV)(SEQ ID NO:25)，其中：
(i)“A”包括X1-(T/S)-(Y/F)-F-X5，(ii)“B”包括(V/I)-T-V-(E/V)，其中：
X1是酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
(T/S)是苏氨酸(T)或丝氨酸(S)；
(Y/F)是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)；
X5是任何氨基酸；
(V/I)是缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)；
(E/V)是谷氨酸(E)或缬氨酸(V)。
在一些方面，本发明所述LRRC4家族模拟分子的多肽包含具有下式的氨基酸序列(从N端到C端)：
A-(T/S)-B(式IV)(SEQ ID NO:26)，其中：
(i)“A”包括(Y/W/M)-(T/Y)-(Y/W)-(F/Y/W)–(T/Y)，(ii)“B”包括X7-(T/S/Y)-X9-X10，其中
(Y/W/M)是酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或甲硫氨酸(M)；
(T/Y)是苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)；
(Y/W)是酪氨酸(Y)或色氨酸(W)；
(F/Y/W)是苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)；
X7是缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)或甲硫氨酸(M)；
(T/S/Y)是苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或酪氨酸(Y)；
X9是缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)或甲硫氨酸(M)；
X10是谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、异亮氨酸(I)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)或色氨酸(W)。
在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列(从N端到C端)：
X1-X2-X3-F-X5-T-X7-T-V-X10(式V)(SEQ ID NO:27)，其中：
X1是Y、F、V、L或I；
X2是T或S；
X3是Y或F；
X5是任何氨基酸；
X7是V或I；和/或
X10是E或V，
其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子包含多肽，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列(从N端到C端)：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(式VI)(SEQ ID NO:28)，其中：
X1是Y、F、V、L、I、W或M；
X2是T、S或Y；
X3是Y、F或W；
X4是F、Y或W；
X5是任何氨基酸，例如T、S或Y；
X6是T、S或Y；
X7是V、I、Y、F、L、W或M；
X8是T、S或Y；
X9是V、I、Y、F、L、W或M；和/或
X10是E、D、V、I、Y、F、M或W，
其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
对于上述任何LRRC4家族模拟分子，在一些方面，(i)X1是Y、F、V、L或I；(ii)X2是T或S；(iii)X3是Y或F；(iv)X4是F；(v)X5是T或S；(vi)X6是T；(vii)X7是V或I；(viii)X8是T；(ix)X9是V；(x)X10是E或V；(xi)(i)-(x)的任何组合。在一些方面，X1是Y、F、V、L或I。在一些方面，X2是T或S。在一些方面，X3是Y或F。在一些方面，X4是F。在一些方面，X5是T或S。在一些方面，X6是T。在一些方面，X7是V或I。在一些方面，X8是T。在一些方面，X9是V。在一些方面，X10是E或V。在一些方面，第X2位氨基酸为磷酸化氨基酸。在一些方面，第X2位氨基酸为O-糖基化氨基酸。
在一些方面，本发明所述LRRC4家族模拟分子的多肽包含SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列，并具有不同于所述氨基酸序列的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸(例如取代)。在一些方面，本发明中公开的LRRC4家族模拟分子的多肽由SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列组成，并具有不同于所述氨基酸序列的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸(例如取代)。在一些方面，本发明中公开的LRRC4家族模拟分子的多肽基本上由SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列组成，并具有不同于所述氨基酸序列的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸(例如取代)。
在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽包含SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽由SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽基本上由SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。如本发明所述，SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列对应于LRRC4B蛋白的FAM19A5结合结构域。
在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽包含SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽由SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽基本上由SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。如本发明所述，SEQ ID NO:30(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列对应于LRRC4蛋白的FAM19A5结合结构域。
在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽包含SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽由SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽基本上由SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。如本发明所述，SEQ ID NO:31(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列对应于LRRC4C蛋白的FAM19A5结合结构域。
如本发明所述，在脊椎动物中，LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5结合结构域很大程度上具有保守性(参见图20)。因此，SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)、SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)和SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中任一项所述的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可以用其他脊椎动物中相应残基中存在的氨基酸取代，而不受任何一种理论的约束。本发明提供了此类取代的示例(参见图20)。
在一些方面，SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)、SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)和SEQ IDNO:31(FSYFSTVTVE)中任一项所述的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可以用具有类似生化性能的氨基酸取代。例如，在SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列中，在一些方面，第1位Y可以用其他疏水性氨基酸(例如F、V、L、I、W或M)取代。在一些方面，第2位T可以用其侧链(例如S或Y)中具有类似羟基(OH)的其他氨基酸取代。在一些方面，第3位Y可由侧链中具有共同芳香环的其他氨基酸取代，所述芳香环可参与范德华相互作用(例如F或W)。在一些方面，第4位F可以用氨基酸(如Y或W)取代。在一些方面，第5位T可以用氨基酸(如S或Y)取代。在一些方面，第6位T可以用氨基酸(如S或Y)取代。在一些方面，第7位V可以用具有疏水性大体积侧链的其他氨基酸(例如，I、Y、F、L、W或M)取代。在一些方面，第8位T可以用其他氨基酸(如S或Y)取代。在一些方面，第9位V可以用其他氨基酸(如I、Y、F、L、W或M)取代。在一些方面，第10位E可以用其他具有酸性侧链的氨基酸(例如I、Y，F、M或W)取代。
在一些方面，本发明所述LRRC4家族模拟分子的多肽包含与SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％相同的氨基酸序列，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽包含与SEQ ID NO:5中所述的氨基酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽包含与SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽包含与SEQ ID NO:6中所述的氨基酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
从本公开中可以明显看出，在一些方面，本发明所述LRRC4家族模拟分子的多肽(例如包含LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5结合结构域)包含一个或多个氨基酸修饰。在一些方面，所述一个或多个氨基酸修饰可以增加LRRC4家族模拟分子与FAM19A5蛋白的结合亲和力。因此，在一些方面，与参照组(例如，无氨基酸修饰的相应LRRC4家族模拟分子或自然存在的LRRC4蛋白家族成员)相比，本发明所述LRRC4家族模拟分子与FAM19A5蛋白的结合亲和力增加了至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍。在一些方面，所述一个或多个氨基酸修饰可以提高LRRC4家族模拟分子的稳定性。因此，在一些方面，与参照组(例如，无氨基酸修饰的相应LRRC4家族模拟分子或自然存在的LRRC4蛋白家族成员)相比，本发明所述LRRC4家族模拟分子的稳定性增加了至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍。
在一些方面，所述一个或多个氨基酸修饰可以提高本发明所述LRRC4家族模拟分子抑制FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的能力(例如，通过增加结合亲和力和/或稳定性)。因此，在一些方面，与参照组(例如，无氨基酸修饰的相应LRRC4家族模拟分子或自然存在的LRRC4蛋白家族成员)相比，所述LRRC4家族模拟分子抑制FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的能力增加了至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍。
在整个公开中提供了可用于本公开的氨基酸修饰的非限制性示例。例如，在一些方面，本发明所述的多肽包含LRRC4蛋白家族成员(即YTYFTTVTVE(SEQ ID NO:29)、YSFFTTVTVE(SEQ ID NO:30)或FSYFSTVTVE(SEQ ID NO:31))的一个FAM19A5结合结构域以及多肽N端、C端或N端和C端的一个或多个氨基酸。在一些方面，可用于本公开的多肽包含多肽N端的至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个额外氨基酸。在一些方面，所述多肽包含多肽C端的至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个额外氨基酸。在一些方面，所述多肽包含：(i)多肽N端的至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个额外氨基酸；以及(ii)多肽C端的至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个额外氨基酸。如本发明所述(参见示例9)，在一些方面，所述一个或多个氨基酸不同于自然存在的LRRC4蛋白家族成员中特定残基处存在的氨基酸。
例如，在一些方面，本发明所述的多肽包含具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，本发明所述的多肽包含具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:18残基T12和L13处。在一些方面，本发明所述的多肽由具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，本发明所述的多肽由具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:18残基T12和L13处。在一些方面，本发明所述的多肽基本上由具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，本发明所述的多肽基本上由具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:18残基T12和L13处。
在一些方面，本发明所述的多肽包含具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列。在一些方面，本发明所述的多肽包含具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:17残基T12和L13处。在一些方面，本发明所述的多肽由具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，本发明所述的多肽由具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:17残基T12和L13处。在一些方面，本发明所述的多肽基本上由具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，本发明所述的多肽基本上由具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:17残基T12和L13处。
在一些方面，本发明所述的多肽包含具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列。在一些方面，本发明所述的多肽包含具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQID NO:19残基T12和L13处。在一些方面，本发明所述的多肽由具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，本发明所述的多肽由具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:19残基T12和L13处。在一些方面，本发明所述的多肽基本上由具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，本发明所述的多肽基本上由具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:19残基T12和L13处。
在一些方面，本发明所述的多肽包含具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列。在一些方面，本发明所述的多肽包含具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:143残基T12和L13处。在一些方面，本发明所述的多肽由具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，本发明所述的多肽由具两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:143残基T12和L13处。在一些方面，本发明所述的多肽基本上由具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，本发明所述的多肽基本上由具有两个氨基酸修饰(例如取代)的SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，氨基酸修饰位于SEQ ID NO:143残基T12和L13处。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEPYETQPGEE(SEQ ID NO:123)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEPYETQPGEE(SEQ ID NO:123)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEPYETQPGEE(SEQ ID NO:123)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEMRETQPGEE(SEQ ID NO:124)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEMRETQPGEE(SEQ ID NO:124)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEMRETQPGEE(SEQ ID NO:124)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEIFETQPGEE(SEQ ID NO:125)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEIFETQPGEE(SEQ ID NO:125)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEIFETQPGEE(SEQ ID NO:125)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEHFETQPGEE(SEQ ID NO:126)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEHFETQPGEE(SEQ ID NO:126)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEHFETQPGEE(SEQ ID NO:126)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEWYETQPGEE(SEQ ID NO:127)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEWYETQPGEE(SEQ ID NO:127)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEWYETQPGEE(SEQ ID NO:127)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEQRETQPGEE(SEQ ID NO:128)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEQRETQPGEE(SEQ ID NO:128)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEQRETQPGEE(SEQ ID NO:128)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEWFETQPGEE(SEQ ID NO:129)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEWFETQPGEE(SEQ ID NO:129)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEWFETQPGEE(SEQ ID NO:129)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEERETQPGEE(SEQ ID NO:130)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEERETQPGEE(SEQ ID NO:130)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEERETQPGEE(SEQ ID NO:130)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEDYETQPGEE(SEQ ID NO:131)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEDYETQPGEE(SEQ ID NO:131)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEDYETQPGEE(SEQ ID NO:131)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEFFETQPGEE(SEQ ID NO:132)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEFFETQPGEE(SEQ ID NO:132)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEFFETQPGEE(SEQ ID NO:132)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEHYETQPGEE(SEQ ID NO:133)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEHYETQPGEE(SEQ ID NO:133)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEHYETQPGEE(SEQ ID NO:133)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEMMETQPGEE(SEQ ID NO:134)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEMMETQPGEE(SEQ ID NO:134)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEMMETQPGEE(SEQ ID NO:134)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEDFETQPGEE(SEQ ID NO:135)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEDFETQPGEE(SEQ ID NO:135)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEDFETQPGEE(SEQ ID NO:135)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEDIETQPGEE(SEQ ID NO:136)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEDIETQPGEE(SEQ ID NO:136)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEDIETQPGEE(SEQ ID NO:136)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVELIETQPGEE(SEQ ID NO:137)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVELIETQPGEE(SEQ ID NO:137)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVELIETQPGEE(SEQ ID NO:137)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEEIETQPGEE(SEQ ID NO:138)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEEIETQPGEE(SEQ ID NO:138)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEEIETQPGEE(SEQ ID NO:138)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEAFETQPGEE(SEQ ID NO:139)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEAFETQPGEE(SEQ ID NO:139)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEAFETQPGEE(SEQ ID NO:139)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEHHETQPGEE(SEQ ID NO:140)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEHHETQPGEE(SEQ ID NO:140)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEHHETQPGEE(SEQ ID NO:140)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEPFETQPGEE(SEQ ID NO:141)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEPFETQPGEE(SEQ ID NO:141)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEPFETQPGEE(SEQ ID NO:141)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEDWETQPGEE(SEQ ID NO:142)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEDWETQPGEE(SEQ ID NO:142)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEDWETQPGEE(SEQ ID NO:142)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEPYETQPGEEA(SEQ ID NO:144)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEPYETQPGEEA(SEQ ID NO:144)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEPYETQPGEEA(SEQ ID NO:144)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEHFETQPGEEA(SEQ ID NO:145)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEHFETQPGEEA(SEQ ID NO:145)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEHFETQPGEEA(SEQ ID NO:145)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEQRETQPGEEA(SEQ ID NO:146)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEQRETQPGEEA(SEQ ID NO:146)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEQRETQPGEEA(SEQ ID NO:146)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEWYETQPGEEA(SEQ ID NO:147)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEWYETQPGEEA(SEQ ID NO:147)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEWYETQPGEEA(SEQ ID NO:147)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEMRETQPGEEA(SEQ ID NO:148)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEMRETQPGEEA(SEQ ID NO:148)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEMRETQPGEEA(SEQ ID NO:148)组成。
在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)包含氨基酸序列GYTYFTTVTVEIFETQPGEEA(SEQ ID NO:149)。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)由氨基酸序列GYTYFTTVTVEIFETQPGEEA(SEQ ID NO:149)组成。在一些方面，本发明所述的多肽(例如包含LRRC4B的FAM19A5结合结构域)基本上由氨基酸序列GYTYFTTVTVEIFETQPGEEA(SEQ ID NO:149)组成。
在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子包含一个或多个组分，所述组分可提高多肽抑制FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的能力。例如，在一些方面，分子包含(i)本发明所述的任何多肽，以及(ii)多肽N端、多肽C端或多肽N端和C端的一个或多个额外氨基酸。在一些方面，可用于本公开的分子包含多肽N端的至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个额外氨基酸。在一些方面，分子包含多肽C端的至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个额外氨基酸。在一些方面，分子包含：(i)多肽N端的至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个额外氨基酸；以及(ii)多肽C端的至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个额外氨基酸。
在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含：(i)具有SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述氨基酸序列的多肽，(ii)所述多肽N端的至少1个额外氨基酸。在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含：(i)具有SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述氨基酸序列的多肽，(ii)所述多肽C端的至少1个额外氨基酸。在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含：(i)具有SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述氨基酸序列的多肽，(ii)N端和C端的至少1个额外氨基酸。在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列。在一些方面，LRRC4家族模拟分子由SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，LRRC4家族模拟分子基本上由SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列。在一些方面，LRRC4家族模拟分子由SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，LRRC4家族模拟分子基本上由SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列。在一些方面，LRRC4家族模拟分子由SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，LRRC4家族模拟分子基本上由SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列组成。
在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含：(i)具有SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)中所述氨基酸序列的多肽，(ii)所述多肽N端的至少1个额外氨基酸。在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含：(i)具有SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)中所述氨基酸序列的多肽，(ii)所述多肽C端的至少1个额外氨基酸。在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含：(i)具有SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)中所述氨基酸序列的多肽，(ii)N端和C端的至少1个额外氨基酸。在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)中所述的氨基酸序列。在一些方面，LRRC4家族模拟分子由SEQID NO:20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，LRRC4家族模拟分子基本上由SEQ ID NO:20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)中所述的氨基酸序列组成。
在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含：(i)具有SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中所述氨基酸序列的多肽，(ii)所述多肽N端的至少1个额外氨基酸。在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含：(i)具有SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中所述氨基酸序列的多肽，(ii)所述多肽C端的至少1个额外氨基酸。在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含：(i)具有SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中所述氨基酸序列的多肽，(ii)N端和C端的至少1个额外氨基酸。在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含SEQ ID NO:21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)中所述的氨基酸序列。在一些方面，LRRC4家族模拟分子由SEQID NO:21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)中所述的氨基酸序列组成。在一些方面，LRRC4家族模拟分子基本上由SEQ ID NO:21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)中所述的氨基酸序列组成。
在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽包含与SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％相同的氨基酸序列，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，其中，所述氨基酸序列进一步包含N端的一个或多个疏水性氨基酸。在一些方面，所述疏水性氨基酸包含N端的至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少9个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸或至少50个氨基酸。
在一些方面，LRRC4家族模拟分子的多肽包含与SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％相同的氨基酸序列，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，其中，所述氨基酸序列进一步包含N端和/或C端的一个或多个氨基酸。在一些方面，连接到N端和/或C端的一个或多个氨基酸包含衍生自LRRC4B蛋白的一个或多个氨基酸序列。在一些方面，连接到N端的一个或多个氨基酸包含N端的至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸或至少50个氨基酸。在一些方面，连接到C端的一个或多个氨基酸包含C端的至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸或至少50个氨基酸。在一些方面，连接到N端和/或C端的所述一个或多个氨基酸通过连接子连接。在一些方面，所述连接子是肽连接子。
在一些方面，N端和/或C端添加的一个或多个额外氨基酸可包含本领域已知的任何合适的氨基酸。在一些方面，所述一个或多个额外氨基酸为亲水性氨基酸。在一些方面，所述一个或多个额外氨基酸可包含D-氨基酸。在一些方面，多肽N端和/或C端添加一个或多个D-氨基酸可以增强LRRC4家族模拟分子的持久性(例如向受试者给药时)，而不受任何一种理论的约束。例如，包含D-氨基酸可保护多肽免受受试者血液中蛋白酶和肽酶的降解。因此，如本发明所述(参见示例10)，在一些方面，可用于本公开的多肽可同时包含D-氨基酸和L-氨基酸。例如，在一些方面，本发明所述的多肽包含N端的D-氨基酸，以及所有其他氨基酸残基处的L-氨基酸。在一些方面，本发明所述的多肽包含C端的D-氨基酸，以及所有其他氨基酸残基处的L-氨基酸。在一些方面，本发明所述的多肽包含N端和C端的D-氨基酸，以及所有其他氨基酸残基处的L-氨基酸。
如本发明所述，在一些方面，上述LRRC4家族模拟分子包含具有SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)、SEQ ID NO:30(YSFFTTVTVE)和SEQ ID NO:31(FSYFSTVTVE)中任一项所述的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有与所述氨基酸序列不同的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸(例如取代)。
在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含所述多肽N端、C端或N端和C端的额外修饰，其中，所述额外修饰可增加多肽的稳定性。例如，在一些方面，多肽的N端已经甲基化。可以在N端和/或C端进行的额外修饰的非限制性示例包括：Fmoc、聚乙二醇化、乙酰化或其组合。在一些方面，为了增加稳定性，可以进行多肽环化。可以采用本领域已知的任何合适方法进行此类修饰。
根据本公开其他部分的进一步描述，在一些方面，可用于本公开的分子包含LRRC4家族蛋白成员的FAM19A5结合结构域和能够提高分子的一个或多个性能的额外部分(例如，分子与FAM19A5蛋白的结合亲和力)。如本发明所述(参见示例10)，申请人已经确定添加LRRC4蛋白家族成员的近膜序列可以极大地提高分子与FAM19A5蛋白的结合亲和力。如SEQID NO:151(LDEVMKTTK)(LRRC4和LRRC4B)和SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)(LRRC4C)所述(另见图22D)，在LRRC4家族的成员中，所述近膜序列高度保守。
因此，在一些方面，本发明所述的分子包含LRRC4蛋白的FAM19A5结合结构域(即YSFFTTVTVE；SEQ ID NO:30)和SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)中所述的近膜序列。在一些方面，本发明所述的分子包含LRRC4蛋白的FAM19A5结合结构域(即YSFFTTVTVE；SEQ ID NO:30)和SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的近膜序列。在一些方面，本发明所述的分子包含LRRC4B蛋白的FAM19A5结合结构域(即YTYFTTVTVE；SEQ ID NO:29)和SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)中所述的近膜序列。在一些方面，本发明所述的分子包含LRRC4蛋白的FAM19A5结合结构域(即YTYFTTVTVE；SEQ ID NO:29)和SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的近膜序列。在一些方面，本发明所述的分子包含LRRC4B蛋白的FAM19A5结合结构域(即FSYFSTVTVE；SEQ ID NO:31)和SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)中所述的近膜序列。在一些方面，本发明所述的分子包含LRRC4蛋白的FAM19A5结合结构域(即FSYFSTVTVE；SEQ ID NO:31)和SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的近膜序列。在一些方面，所述近膜添加到所述分子的C端。
从本公开中可以明显看出，本发明所述的任何修饰可以组合使用，以提高分子的一个或多个性能(例如氨基酸取代、添加近膜序列、D-氨基酸)。例如，在一些方面，可用于本公开的分子(例如多肽)包含：(i)SEQ ID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列，其具有残基T12和L13处的氨基酸修饰；(ii)所述分子C端的近膜序列(例如SEQ IDNO:151或SEQ ID NO:152)。在一些方面，可用于本公开的分子(例如多肽)包含：(i)SEQ IDNO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列，其具有残基T12和L13处的氨基酸修饰；(ii)N端和/或C端的D-氨基酸；(iii)所述分子C端的近膜序列(例如SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:152)。在一些方面，可用于本公开的分子(例如多肽)包含：(i)SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列，其具有残基T12和L13处的氨基酸修饰；(ii)所述分子C端的近膜序列(例如SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:152)。在一些方面，可用于本公开的分子(例如多肽)包含：(i)SEQ ID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列，其具有残基T12和L13处的氨基酸修饰；(ii)N端和/或C端的D-氨基酸；(iii)所述分子C端的近膜序列(例如SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:152)。在一些方面，可用于本公开的分子(例如多肽)包含：(i)SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列，其具有残基T12和L13处的氨基酸修饰；(ii)所述分子C端的近膜序列(例如SEQ ID NO:151或SEQID NO:152)。在一些方面，可用于本公开的分子(例如多肽)包含：(i)SEQ ID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列，其具有残基T12和L13处的氨基酸修饰；(ii)N端和/或C端的D-氨基酸；(iii)所述分子C端的近膜序列(例如SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:152)。在一些方面，可用于本公开的分子(例如多肽)包含：(i)SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列，其具有残基T12和L13处的氨基酸修饰；(ii)所述分子C端的近膜序列(例如SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:152)。在一些方面，可用于本公开的分子(例如多肽)包含：(i)SEQ ID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列，其具有残基T12和L13处的氨基酸修饰；(ii)N端和/或C端的D-氨基酸；(iii)所述分子C端的近膜序列(例如SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:152)。
在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子可包含一种或多种额外的肽，所述额外的肽在向受试者给药时可使所述分子特异性靶向不同的组织，。例如，在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含可使分子穿透血脑屏障的肽(本发明中又称为“血脑屏障(BBB)穿梭体”)。在本领域中，这种BBB穿梭体的示例是已知的。表5(下文)中提供了非限制性示例。例如，参见Oller-Salvia等人《化学学会评论(Chem Soc Rev)》45:4690(2016年)。
表5.BBB穿梭体
环肽(&)的命名法适应于3位字母氨基酸编码，该编码来自于Spengler等人《肽研究杂志(J Pept Res)》65:550-555(2005)中描述的一个编码；[Dap]代表二氨基丙酸。
在一些方面，可用于本公开的LRRC4家族模拟分子包含一个融合蛋白。例如，在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子可包含：(i)本公开的任何多肽，(ii)半衰期延长部分。本领域已知的任何合适的半衰期延长部分可用于产生本公开的融合蛋白。此类半衰期延长部分的非限制性示例包括：Fc、白蛋白、白蛋白结合多肽、Pro/Ala/Ser(PAS)、人绒毛膜促性腺激素β亚基C端肽CTP、聚乙二醇PEG、长非结构化亲水性氨基酸序列XTEN、羟乙基淀粉HES、白蛋白结合小分子或其组合。
在一些方面，LRRC4家族模拟分子包含蛋白质-药物偶联物。例如，在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子的多肽可与治疗剂(例如可用于治疗疾病或紊乱的治疗剂)偶联。
本发明所述的蛋白质-药物偶联物可以采用本领域已知的方法进行制备。在一些方面，偶联方法产生了基本上(或几乎)非免疫原性的键联，例如肽-(即酰胺-)、硫化物-、(空间位阻)、二硫化物-、腙-和醚键联。这些键联几乎为非免疫原性键联，并且在血清中表现出合理的稳定性(参见Senter，P.D.《生物化学当代观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)》13(2009年)235-244；WO 2009/059278；WO 95/17886，所述各出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分)。
根据所述部分和多肽的生物化学性质，可以采用不同的偶联策略(参见Hackenberger，C.P.R.和Schwarzer，D.《德国应用化学杂志(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》47(2008年)10030-10074)。在一些方面，位点特异性反应和共价偶联基于将天然氨基酸转化为具有反应性(其正交于存在的其他官能团的反应性)的氨基酸。例如，稀有序列背景下的特异性半胱氨酸可以在醛中经酶转化(参见Frese，M.A.和Dierks，T.《化学生物学杂志(ChemBioChem.)》10(2009年)425-427)。还可以利用某些酶与给定序列背景下的天然氨基酸的特异性酶反应性来获得所需的氨基酸修饰(参见Taki，M.等人《蛋白质工程设计与选择(Prot.Eng.Des.Sel.)》17(2004年)119-126；Gautier，A.等人《化学生物(Chem.Biol.)》15(2008年)128-136；Bordusa，F.在《生物有机化学亮点(Highlights in BioorganicChemistry)》(2004年)389-403中使用了蛋白酶催化的C-N键形成)。
也可通过末端氨基酸与适当修饰试剂的选择性反应，实现位点特异性反应和共价偶联。N端半胱氨酸与苄腈的反应性(参见Ren，H.等人《德国应用化学杂志(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》48(2009年)9658-9662)可用于实现位点特异性共价偶联。自然化学连接也可依赖于C端半胱氨酸残基(Taylor，E.Vogel；Imperiali，B《核酸与分子生物学(Nucleic Acids and Molecular Biology)》(2009年)，22(蛋白质工程(ProteinEngineering))，65-96)。
所述部分也可以是合成肽或肽模拟物。在这种情况下，可以化学合成多肽，在这种合成期间，可以掺入具有正交化学反应性的氨基酸(参见de Graaf，A.J.等人《生物共轭化学(Bioconjug.Chem.)》20(2009年)1281-1295)。为了获得单标记多肽，可以采用色谱法将化学计量为1:1的偶联物与其他偶联副产物分离。使用染料标记结合对成员和带电连接子有利于完成此程序。由于可以利用电荷和分子量的差异进行分离，因此利用这种标记的带高度负电荷的结合对成员，可以很容易地使单偶联多肽从未标记的多肽和携带一个以上连接子的多肽中分离出来。荧光染料可用于从未结合组分中纯化复合物，比如标记单价结合剂。
IV.药物组合物
本发明提供了组合物，包含本发明所述的LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物，所述LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物在生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(《雷氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(1990年)，马克出版公司，美国宾夕法尼亚州伊斯顿)中具有所需的纯度。在使用剂量和浓度下，可接受载体、赋形剂或稳定剂对受体无毒，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如或聚乙二醇PEG。
在一些方面，可用于本公开的药物组合物包含本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物，可选包含药学上可接受的载体中的一种或多种额外的预防剂或治疗剂。在一些方面，药物组合物包含本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物，可选包含药学上可接受的载体中的一种或多种额外的预防剂或治疗剂。在一些方面，本发明所述的LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物是药物组合物中包含的唯一活性成分。本发明所述的药物组合物可用于抑制、减少和/或解离FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员的相互作用。根据本公开其他部分的描述，抑制、减少和/或解离FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员的相互作用可以改善神经回路形成(例如，通过促进突起生长和突触形成)。
用于胃肠外制剂的药学上可接受的载体包括水性溶媒、非水性溶媒、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其他药学上可接受的物质。水性溶媒的示例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸林格注射液。非水性胃肠外溶媒包括来源于植物的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂添加到包装在多剂量容器中的胃肠外制剂中，所述制剂包括酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80金属离子掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水混溶性溶媒的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于pH值调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
药物组合物经配制可用于受试者的任何给药途径。给药途径的具体示例包括鼻内、口服、非肠道、鞘内、脑室内、肺内、皮下或脑室内给药。本发明还考虑到了以皮下注射、肌肉内注射或静脉注射为特征的胃肠外给药。注射剂可以按常规形式制备，或者作为液体溶液，或者作为悬浮液，适合注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或作为乳液。注射剂、溶液和乳液还包含一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。此外，如有需要，需要给药的药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂和其他此类药剂，如乙酸钠、山梨醇酐月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。
本发明所述LRRC4家族模拟分子的胃肠外给药制剂包括准备用于注射的无菌溶液、使用前准备与溶剂结合的无菌干溶性产品(如冻干粉)，包括皮下注射片、准备用于注射的灭菌混悬剂，使用前准备与溶媒结合的无菌干不溶性产品以及无菌乳液。溶液可以是水溶液或非水溶液。
如果通过静脉给药，则合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
根据描述，制备包含LRRC4家族模拟分子的局部混合物，进行局部和全身给药。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液或类似物，并可配制成乳膏、凝胶、软膏、乳液、溶液、万能药、润肤乳、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或适合局部给药的任何其他制剂。
药物组合物(例如包含本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物)可配制为气雾剂进行局部施用，例如通过吸入(参见第4,044,126号、第4,414,209号和第4,364,923号美国专利)。这些用于呼吸道给药的制剂可具有气雾剂或喷雾器溶液的形式，或作为用于吹入的超细粉末，可单独使用或与惰性载体(如乳糖)组合使用。在这种情况下，在一些方面，所述制剂的颗粒直径约小于50微米，例如约小于10微米。
以凝胶、乳膏和润肤乳形式存在的药物组合物(例如包含本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物)经配制可用于局部施用，如皮肤和粘膜的局部施用(例如眼内施用)，并可用于眼部或脑池内或脊柱内施用。透皮给药可考虑局部施用，眼睛或粘膜施用也可考虑局部施用，或吸入疗法也可考虑局部施用。也可进行抗体鼻用溶液单独给药或与其他药学上可接受的赋形剂联合给药。
透皮贴剂(包括离子电渗和电泳装置)为本领域技术人员所熟知，可用于施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物。例如，第6,267,983号、第6,261,595号、第6,256,533号、第6,167,301号、第6,024,975号、第6,010,715号、第5,985,317号、第5,983,134号、第5,948,433号和第5,860,957号美国专利中公开了这类贴剂。
在一些方面，本发明所述的药物组合物是冻干粉，可对其进行重组，以便作为溶液、乳液和其他混合物进行给药。所述药物组合物也可重组并配制成固体或凝胶。将本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物或其药学上可接受的衍生物溶解在合适的溶剂中，即可制备冻干粉。在一些方面，所述冻干粉是无菌冻干粉。溶剂可含有赋形剂，所述赋形剂提高了粉末或由粉末制备而成的重组溶液的稳定性或其他药理活性成分。可使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的药剂。溶剂还可包含缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾，或本领域技术人员已知的其他此类缓冲剂。在一些方面，缓冲剂的pH值约呈中性。随后溶液经过无菌过滤后，在本领域技术人员已知的标准条件下进行冻干处理，得到所需的制剂。在一些方面，所得溶液可分装到小瓶中进行冻干。每个小瓶中可含有单剂量或多剂量的化合物(例如LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物中的任一项)。冻干粉可在适当的条件(例如约4℃到室温)下储存。
将冻干粉与注射用水重组，得到胃肠外给药用制剂。重组时，将冻干粉添加到无菌水或其他合适的载体中。用量是否精确取决于所选用的化合物。可以凭经验确定用量。
在一些方面，包含本发明所述任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞或蛋白质偶联物的药物组合物经配制也可靶向待治疗受试者的特定组织、受体或其他身体部位。关于靶向法的非限制性示例，参见第6,316,652号、第6,274,552号、第6,271,359号、第6,253,872号、第6,139,865号、第6,131,570号、第6,120,751号、第6,071,495号、第6,060,082号、第6,048,736号、第6,039,975号、第6,004,534号、第5,985,307号、第5,972,366号、第5,900,252号、第5,840,674号、第5,759,542号和第5,709,874号美国专利。
用于体内给药的组合物可以是无菌组合物。在一些方面，此无菌组合物通过无菌过滤膜的过滤即可实现。
V.核酸、载体、宿主细胞
本发明所述的进一步方面涉及编码分子(例如本发明所述的LRRC4家族模拟分子)的一个或多个核酸分子(本发明中又称为“核酸”或其衍生物)。核酸可以以细胞裂解物的形式或部分纯化或基本纯化的形式存在整个细胞中。在一些方面，所述核酸是DNA序列和/或RNA序列(例如mRNA)。在一些方面，所述核酸包含修饰的核酸类似物。利用标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱色谱法、限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他方法)，当从其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如其他染色体DNA，例如与自然界中分离的DNA相连的染色体DNA)或蛋白质)中纯化时，核酸是“分离”或“基本上纯净”的。参见F.Ausubel等人编著的(1987年)《现代分子生物学实验指南》，格林出版与威利交叉科学，纽约(Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and WileyInterscience,New York)。在一些方面，核酸分子可以包含内含子序列，也可以不包含内含子序列。在一些方面，所述核酸是cDNA分子。利用本领域已知的标准分子生物学技术，可以获得本发明所述的核酸。
在一些方面，本公开提供了一种载体，包含编码本发明公开的治疗剂的分离的核酸分子(例如本发明所述的LRRC4家族模拟分子)。适合于本公开的载体包括但不限于表达载体、病毒载体和质粒载体。在一些方面，所述载体是病毒载体。
本发明中使用的“表达载体”系指任何核酸构建体，当引入到适当的宿主细胞中时，所述核酸构建体包含已插入编码序列的转录和翻译所需的必要元件，或者对于RNA病毒载体，所述核酸构建体包含复制和翻译所需的必要元件。表达载体可包括质粒、噬菌粒、病毒及其衍生物。
本发明中使用的“病毒载体”包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，如莫洛尼氏鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；慢病毒；腺病毒；腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；以及RNA病毒，如逆转录病毒。某些病毒载体基于非细胞病变真核病毒，其中非必需基因已替换为目的基因。非细胞病变病毒包括逆转录病毒，其生命周期涉及将基因组病毒RNA逆转录到DNA中，随后前病毒整合到宿主细胞DNA中。
在一些方面，载体来源于腺相关病毒。在一些方面，载体来源于慢病毒。WO9931251、WO9712622、WO9817815、WO9817816和WO9818934中公开了慢病毒载体的示例，所述各示例通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
其他载体包括质粒载体。参见Sambrook等人《分子克隆：实验室手册》，第2版，美国冷泉港实验室出版社，1989年(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。在过去几年里，研究发现，由于不能在宿主基因组内复制并整合到宿主基因组中，质粒载体特别有利于将基因递送到体内细胞。然而，这些质粒具有与宿主细胞相容的启动子，可以表达来自基因(在质粒内可操作地编码)的肽。可从商业型供应商处获得的一些常用质粒包括pBR322、pUC18、pUC19、各种pcDNA质粒、pRC/CMV、各种pCMV质粒、pSV40和pBlueScript。特异性质粒的其他示例包括pcDNA3.1，产品货号V79020；pcDNA3.1/hygro，产品货号V87020；pcDNA4/myc-His，产品货号V86320；pBudCE4.1，产品货号V53220，上述产品均来自英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。此外，可以利用标准分子生物学技术进行质粒定制设计，以去除和/或添加特异性DNA片段。
本发明还包括一种本发明所公开的分子(例如本发明所述的LRRC4家族模拟分子)的制备方法。在一些方面，此类方法可包括在包含编码所述分子的核酸分子的细胞中表达所述分子(例如本发明所述的LRRC4家族模拟分子)。本发明包括了包含这些核苷酸序列的宿主细胞。可使用的宿主细胞的非限制性示例包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、人羊水衍生细胞(CapT细胞)、COS细胞或其组合
VI.试剂盒
本发明还提供了试剂盒，包含本发明所述一种或多种LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，本发明提供了一种药包或试剂盒，其包括一个或多个容器，容器中装有本发明所述药物组合物的一种或多种成分(如本发明提供的一种或多种LRRC4家族模拟分子)；所述药包或试剂盒可选包括使用说明书。在一些方面，所述试剂盒包含本发明所述的药物组合物以及任何预防剂或治疗剂，例如本发明所述的预防剂或治疗剂。
VII.公开方法
如本发明所述，所述LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物可用于抑制、减少和/或解离FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。相应地，在一些方面，本发明提供了一种在有需要受试者中抑制、减少和/或解离FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的方法，包括：向受试者施用本发明所述的有效量的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，与参照组相比(例如，给药前受试者中的对应值或未接受给药的对应受试者中的值)，给药后复合物形成减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
根据本公开其他部分的描述，FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员的结合可以抑制LRRC4蛋白家族成员的活性。例如，在一些方面，FAM19A5-LRRC4家族蛋白复合物的形成会使神经回路形成受损，导致突触的动态增加和损失失衡，这一点对中枢和外周神经系统中神经元的健康作用至关重要。
相应地，在一些方面，FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的减少可以增加LRRC4蛋白家族成员的活性。在一些方面，与参照组(例如，给药前受试者的对应值或未接受给药的对应受试者中的值)相比，给药后，LRRC4蛋白家族成员的活性增加了至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍。这种活性的非限制性示例可包括突起生长、神经元迁移以及突触性接触的形成和功能组装。
从本公开中可以明显看出，在一些方面，本公开涉及一种增加神经元中突起生长和/或突触形成的方法，包括：使神经元与本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物接触。在一些方面，所述接触发生在体内(例如有需要受试者中)。在这些方面，所述方法可进一步包括：在接触前向受试者施用任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，所述接触发生在体外。在一些方面，与参照组(例如，未与本发明所述的任何多肽、分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物接触的相应神经元中的突起生长)相比，所述接触使神经元突起生长增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。在一些方面，与参照组(例如，未与本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物接触的相应神经元中的突触形成)相比，所述接触使神经元突触形成增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
在一些方面，所述LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物的治疗作用(例如，减少FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物的形成；增加突起生长；和/或增加突触形成)可以减少疾病或病症的一种或多种症状，例如与受损神经回路形成相关的症状。
相应地，在一些方面，本公开涉及一种治疗有需要受试者的疾病或病症的方法，包括：向受试者施用治疗有效量的本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物，其中，所述疾病或病症选自肌萎缩侧索硬化症ALS、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。根据下文的进一步描述，在一些方面，本发明提供了一种治疗肌萎缩侧索硬化症ALS的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗阿尔茨海默病的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗青光眼的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗糖尿病性视网膜病变的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗神经性疼痛的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗脊髓损伤的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗创伤性脑损伤的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗中风的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗帕金森病的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。
相应地，本公开的一些方面涉及一种治疗有需要受试者ALS的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，可以采用本公开治疗的ALS包括散发性ALS、家族性ALS或两者兼有。本发明中使用的术语“散发性”ALS系指与ALS发病的任何家族史无关的ALS。约90％或更多的ALS诊断针对的是散发性ALS。本发明中使用的术语“家族性”ALS系指一个家族中发生超过一次的ALS，表明该疾病存在遗传组分。在一些方面，可以采用本公开治疗的ALS包括原发性侧索硬化症(PLS)。PLS会影响手臂和腿部的上位运动神经元。然而，超过75％患有明显PLS的患者在症状发作后四年内出现下位运动神经元体征，这意味着在此之前无法对PLS做出明确诊断。PLS的预后优于典型ALS的预后，原因在于PLS进展较慢，功能退化较少，不影响呼吸能力，体重减轻得不那么严重。在一些方面，ALS包括进行性肌萎缩(PMA)。PMA会影响手臂和腿部的下位运动神经元。虽然与典型ALS相比，PMA的平均存活时间更长，但随着时间的推移，PMA仍会进展到其他脊髓区，最终导致呼吸衰竭和死亡。在PMA过程中，上位运动神经元体征可能发展较晚，在这种情况下，诊断可能会变为典型ALS。
在一些方面，施用本发明所述的任何治疗剂(例如本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物)可以改善与ALS相关的一种或多种症状。症状的非限制性示例包括：行走困难或难以进行正常的日常活动；绊倒和跌倒；四肢无力；口齿不清；吞咽困难；肌肉痉挛和抽搐；不恰当哭泣、大笑或打哈欠；痴呆；认知和行为改变；及其组合。
如本发明所述(参见示例11)，在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要受试者阿尔茨海默病的方法，包括：施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。在一些方面，治疗阿尔茨海默病包括减少受试者(例如，患有阿尔茨海默病)中的β淀粉样蛋白(Aβ)斑块负荷，而不受任何一种理论的约束。本发明中使用的术语“β淀粉样蛋白斑块”系指所有形式的β淀粉样蛋白异常沉积，包括一些β淀粉样蛋白肽的大聚集体和小缔合，并可包含β淀粉样蛋白肽的任何变异。已知β淀粉样蛋白(Aβ)斑块会引起神经元变化，例如突触组成、突触形状和突触密度的畸变、突触传导性丧失、树突直径变化、树突长度变化、树突棘密度变化、树突棘面积变化、树突棘长度变化或棘头直径变化。在一些方面，Aβ斑块负荷的增加会导致神经元突触丢失。相应地，在一些方面，本发明提供了一种减少神经元突触丢失的方法，包括：使神经元与本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物接触。在一些方面，所述接触可发生在体内。在一些方面，所述接触可发生在体外。
如本发明所述(参见示例13)，在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要受试者帕金森病的方法，包括：施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。本发明中使用的术语“帕金森病”(PD)系指导致运动和非运动表现(即症状)的神经退行性疾病，其特征是黑质纹状体系统中广泛的多巴胺能神经元变性。本公开的其他部分提供了PD的运动和非运动表现的非限制性示例。蛋白质病(α-突触核蛋白异常聚集)是PD的标志。PD的其他示例性特征包括多巴胺能神经元损伤、线粒体功能障碍、神经炎症、蛋白质稳态(例如，受损蛋白质和细胞器神经胶质细胞功能障碍的自噬清除)及其组合。
如本发明所述(参见示例14)，在一些方面，本发明提供的治疗剂(例如本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物)可用于增加有需要受试者对外部刺激(例如机械刺激和/或热刺激)的阈值或潜伏期。相应地，在一些方面，给药后，与参考对照组(例如未接受本发明所述LRRC4家族模拟分子的相应受试者)相比，受试者具有较高的对外部刺激的阈值。本发明中使用的术语“对外部刺激的阈值”系指受试者对刺激做出反应(例如拉离)之前压力(来自外部刺激)的大小。
对于本领域技术人员显而易见的是，这种治疗效果可用于治疗与神经性疼痛相关的一种或多种症状。相应地，在一些方面，本发明提供了一种治疗、预防或改善有需要受试者神经性疼痛的方法，包括：向受试者施用本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。
在一些方面，神经性疼痛是中枢神经性疼痛，即由于影响任何水平的CNS(包括中枢体感神经系统)的损伤或损害(例如脑损伤和脊髓损伤)而引起的疼痛，或与中风、多发性硬化症或延髓外侧梗死等疾病或紊乱相关或作为其结果的疼痛。在一些方面，神经性疼痛是外周神经性疼痛，即由于影响任何水平的外周神经系统的损伤或损害(例如运动神经、感觉神经、自主神经或其组合的损伤)而引起的疼痛，或由疾病或紊乱引起的疼痛或与疾病或紊乱相关的疼痛。
在一些方面，本发明提供的治疗剂(例如本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物)可用于治疗视网膜病变。在一些方面，可以采用本公开治疗的视网膜病变包括糖尿病性视网膜病变。术语“糖尿病性视网膜病变”包括所有类型的糖尿病性视网膜病变，包括但不限于非增生性糖尿病视网膜病变(NPDR)、增生性糖尿病视网膜病(PDR)、糖尿病性黄斑病变和糖尿病性黄斑水肿。在一些方面，治疗视网膜病变(例如糖尿病性视网膜病变)包括改善有需要受试者的视网膜电位，而不受任何一种理论的约束。在一些方面，与参照组(例如，未采用本发明所述LRRC4家族模拟分子进行治疗的相应受试者)相比，改善后的视网膜电位包括A波、B波和/或振荡电位值的增加。对于本领域技术人员显而易见的是，治疗视网膜病变可用于治疗其他类型的眼障碍，包括但不限于黄斑变性和青光眼。
在一些方面，本发明所述的方法(例如，增加突起生长、增加突触形成，和/或减少FAM19A5与LRRC4蛋白家族成员之间复合物的形成)可包括向受试者施用额外治疗剂。所述的额外治疗剂可包括治疗和/或减轻与任何上述适应症相关的一种或多种症状的任何已知药剂。在一些方面，所述的额外治疗剂包括乙酰胆碱酯酶抑制剂。在一些方面，所述的额外治疗剂包括多巴胺促进剂。在一些方面，所述的额外治疗剂包括多巴胺受体拮抗剂。在一些方面，所述的额外治疗剂包括抗精神病药。在一些方面，所述的额外治疗剂包括单胺氧化酶(MAO)抑制剂。在一些方面，所述的额外治疗剂包括儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂。在一些方面，所述的额外治疗剂包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂。在一些方面，所述的额外治疗剂包括免疫调节剂。在一些方面，所述的额外治疗剂包括免疫抑制剂。
此类药剂的非限制性示例包括：丁苯那嗪抗精神病药(如氟哌啶醇/>氯丙嗪、利培酮/>喹硫平/>左旋多巴(含或不含卡比多巴)/>)、多巴胺促进剂(如普拉克索/>罗匹尼罗和罗替戈汀/>)和阿朴吗啡/>司来吉雷沙吉兰/>恩他卡朋/>苯托品苯海索、金刚烷胺、多奈哌齐/>加兰他敏/>利斯的明/>醋酸格拉替雷/>富马酸二甲酯/>芬戈莫德特立氟胺/>那他珠单抗/>阿仑单抗/>米托蒽醌/>利鲁唑/>水杨酸毒扁豆碱/>硫酸毒扁豆碱/>美曲磷酯、新斯的明、更斯的明、吡啶斯的明/>安贝氯铵/>地美卡林、Debio 9902(又称为/>Debiopharmladostigil，NP-0361)、他克林/>托丝胺酸、马来酸维吖啶、美莫昆、石杉碱甲(/>NeuroHitech)、苯羟基丙氨酸、腾喜龙(/> )、INM-176、阿朴吗啡/>溴隐亭卡麦角林/>二受体激动剂、二氢麦角隐亭、非诺多泮/>麦角乙脲/>特麦角脲培高利特/>吡贝地尔喹吡罗、SKF-82958(葛兰素史克)、卡利拉嗪、帕多芦诺、沙立佐坦、氯丙嗪、氟奋乃静洛沙平、利培酮、硫利达嗪、替沃噻吨、三氟拉嗪、7-羟基阿莫沙平、氟哌利多/> 多潘立酮/>L-741742、L-745870、雷氯必利、SB-277011A、SCH-23390、依考匹泮、SKF-83566、甲氧氯普胺鲁拉西酮(/>又称为SM-13496；Dainippon Sumitomo)、阿立哌唑氯丙嗪/>伊潘立酮/>噻吨癸酸酯利血平/>哌咪清/>癸氟奋乃静、盐酸氟奋乃静、丙氯拉嗪/>阿塞那平/>洛沙平/>吗茚酮奋乃静、硫利达嗪、替沃噻吨、三氟拉嗪/>拉米替隆、氯氮平去甲氯氮平(ACP-104)、帕利哌酮/>美哌隆、奥氮平他尔奈坦、阿米舒必利、齐拉西酮/>布南色林/>ACP-103(阿卡迪亚制药)、盐酸司来吉兰(丙炔苯并胺、/>)、二甲基丙炔苯丙胺、溴法罗明、苯乙肼/>反苯环丙胺/>吗氯贝胺/> 贝氟沙通、沙芬酰胺、异卡波肼/>尼亚拉胺/>异丙肼CHF-3381(意大利凯西制药公司)、异丙氯肼、托洛沙酮/>二苯美伦、脱氧鸭嘴花碱、哈尔明碱(又称为骆驼蓬碱或巴那特林)、骆驼蓬灵、利奈唑胺/>帕吉林/>硝替卡朋、托卡朋/>托酚酮、美金刚/>金刚烷胺阿坎酸/>besonprodil、氯胺酮/>德芦西明、地塞米诺、右依法克生、右美沙芬、右啡烷、曲索罗地、CP-283097、西玛坦、爱大塔多、伊培沙宗、L-701252(德国默克)、拉西赛明、左啡诺/>LY-233536和LY-235959(均为美国礼来品牌)、美沙酮、/>奈拉美、培净福太、苯西克定、噻奈普汀地佐环平(又称为MK-801)、EAB-318(惠氏)、伊博格碱、老刺木碱、替来他明、阿替加奈/>加维斯替奈、瑞玛西明、MBP-8298(合成髓鞘碱性蛋白肽)、罗喹美克/>拉喹莫德(又称为ABR-215062和SAIK-MS)、ABT-874(人抗IL-12抗体；Abbott)、利妥昔单抗/>来氟米特、环索奈德、达克珠单抗/>甲氨蝶呤/>甲磺司特、吗替麦考酚酯/>霉酚酸钠硫唑嘌呤/>巯嘌呤/>环磷酰胺伏环孢素、PUR-118、AMG 357、AMG 811、BCT197、苯丁酸氮芥克拉屈滨/>甲胎蛋白、依那西普/>来氟米特、环索奈德、氯喹、羟氯喹、青霉胺、金诺芬、柳氮磺吡啶、金硫丁二钠、环孢菌素、色甘酸、英夫利西单抗、阿达木单抗、塞妥珠单抗、戈利木单抗、利妥昔单抗、奥瑞组单抗、奥法木单抗、4-苄氧基-5-((5-十一烷基-2H-吡咯-2-亚基)甲基)-2,2'-二-1H-吡咯(又称为PNU-156804)及其组合。
在一些方面，本发明所述的任何LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物通过静脉内、口服、肠道外、经鞘、鞘内、脑室内、玻璃体内、肺部、皮下、皮内、肌内或心室内给药。
以实例说明的方式而非限制的方式提供以下示例。
示例
示例1：FAM19A5与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的分析
为了理解FAM19A5与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用，对HEK293细胞进行了修饰，以表达LRRC4蛋白家族的FLAG标记成员，即LRRC4C蛋白、LRRC4蛋白或LRRC4B蛋白。然后，采用重组FAM19A5蛋白(1μM)处理HEK293细胞或原代皮层神经元30分钟，并利用免疫共沉淀和免疫荧光测定，评估FAM19A5蛋白与不同LRRC4蛋白家族成员之间的结合。
对于免疫共沉淀测定，收集了来自不同的FAM19A5处理的HEK293细胞的细胞裂解物，并采用抗FLAG抗体、抗FAM19A5(1-65)抗体或人IgG抗体(对照)进行免疫沉淀。采用抗FLAG和抗FAM19A5(3-2)抗体对免疫沉淀蛋白质进行了免疫印迹。对于免疫荧光测定，采用抗FAM19A5(3-2)(检测FAM19A5蛋白表达)和抗FLAG抗体(检测LRRC4蛋白家族的成员)，对采用重组FAM19A5蛋白进行处理的HEK293细胞进行免疫染色。采用抗FAM19A5(3-2)和抗LRRC4B抗体，对采用重组FAM19A5蛋白处理的原代皮层神经元进行免疫染色。采用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行染色。
如图1A所示，抗FLAG抗体能够对FAM19A5蛋白进行免疫共同沉淀。同样，如图1B所示，抗FAM19A5(1-65)抗体能够对LRRC4B蛋白进行特异性免疫共同沉淀。利用免疫荧光测定观察到了类似的结果。在LRRC4B表达HEK293细胞和原代皮层神经元中，FAM19A5蛋白在很大程度上与存在LRRC4B蛋白高表达的树突样端突或突起相关(参见图1C和1D)，从而表明LRRC4蛋白家族的成员(例如LRRC4B)与FAM19A5蛋白之间存在相互作用。
接下来，为了评估上述结果是否对FAM19A5蛋白的某些异构体具有特异性，采用编码FLAG标记LRRC4B蛋白的cDNA和编码FAM19A5蛋白异构体1或异构体2的cDNA，对HEK293细胞进行共转染。然后，利用免疫荧光和免疫共沉淀分析对结合进行评估。
对于免疫荧光测定，采用抗FAM19A5(1-65)和抗FLAG抗体，对共转染的HEK293细胞进行免疫染色，以分别确定FAM19A5和LRRC4B蛋白的亚细胞定位。采用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行染色。对于免疫共沉淀测定，采用抗FLAG抗体、抗FAM19A5(1-65)抗体、抗FAM19A5(3-2)抗体或人IgG抗体(对照)，将来自共转染HEK293细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀。采用抗FLAG和抗FAM19A5(3-2)抗体对免疫沉淀蛋白质进行了免疫印迹。
与早期结果类似，在共转染HEK293细胞中，FAM19A5蛋白的两种异构体似乎与LRRC4B蛋白高度共定位，特别是在质膜附近的囊泡样点纹和树突样端突中(参见图2A和2B)。同样，采用抗FLAG和抗FAM19A5(1-65)抗体进行的免疫沉淀证实了LRRC4B蛋白与两种FAM19A5蛋白异构体之间的相互作用。例如，抗FLAG抗体能够对FAM19A5蛋白异构体1和2进行免疫共沉淀(参见图2C)。同样，抗FAM19A5(1-65)抗体能够对LRRC4B蛋白进行免疫共沉淀(参见图2D)。值得注意的是，抗FAM19A5(3-2)抗体并未对LRRC4B蛋白进行免疫共沉淀。由于已知1-65和3-2抗FAM19A5抗体与FAM19A 5蛋白内的不同表位结合，因此由于抗体的结合表位，采用1-65和3-2抗FAM19A5抗体时就会观察到差异，而不受任何一种理论的约束。参见第20200299373号美国出版物，所述出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
上述结果证明了FAM19A5蛋白与不同LRRC4蛋白家族成员(例如LRRC4B)之间的相互作用。通过抑制、减少和/或解离这种相互作用，在一些方面，本公开的多肽可用于调节与这种相互作用相关的生物活性。
示例2：LRRC4B蛋白FAM19A5蛋白结合结构域的鉴定
为了确定负责与FAM19A5蛋白结合的LRRC4B蛋白的特异性基序或结构域，产生了各种FLAG标记的LRRC4B缺失构建体(参见下表6)。采用不同的缺失构建体转染HEK293细胞，然后采用示例1中所述的重组FAM19A5蛋白对HEK293细胞进行处理。然后，采用抗FLAG抗体对来自不同HEK293细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀。采用抗FLAG和抗FAM19A5(3-2)抗体对免疫沉淀蛋白质进行了免疫印迹。
表6.FLAG标记的LRRC4B缺失构建体
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如图3A和3B所示，所有包含LRRC4B蛋白富含苏氨酸结构域(图3A中的“Thr”)的缺失构建体都能不同程度地与FAM19A5蛋白结合。这些构建体包括：LRRC4B(36-713)(即1号构建体)；LRRC4B(157-713)(即2号构建体)；LRRC4B(230-713)(即3号构建体)；LRRC4B(364-713)(即4号构建体)；LRRC4B(453-713)(即5号构建体)；LRRC4B(36-576)(即7号构建体)；LRRC4B(364-576)(即10号构建体)；LRRC4B(453-576)(即11号构建体)；以及LRRC4B(484-576)(即12号构建体)。特别地，LRRC4B蛋白第484-497位氨基酸序列似乎在结合方面起到重要作用，这是因为含有氨基酸484-576的缺失构建体(即12号构建体)能够与FAM19A5蛋白结合，而含有氨基酸498-576的缺失构建体(即13号构建体)不能与FAM19A5蛋白结合(参见图3A和3B)。
接下来，为了证实上述免疫共沉淀结果，使用ELISA测定测量FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员全长胞外域或各种LRRC4B胞外域蛋白片段的结合。具体地，采用一种以下列LRRC4B胞外域蛋白包被ELISA板，所述蛋白与人Fc(100nM/孔)偶联：(1)LRRC4蛋白的全长胞外域(SEQ ID NO:1的氨基酸残基39-527)(SEQ ID NO:4)；(2)LRRC4B蛋白的全长胞外域(SEQ ID NO:2的氨基酸36-576；即表6中的7号构建体)(SEQ ID NO:5)；(3)LRRC4C蛋白的全长胞外域(SEQ ID NO:3的氨基酸45-527)(SEQ ID NO:6)；(4)LRRC4B胞外域片段(SEQ IDNO:2的氨基酸453-576；即表6中的11号构建体)(SEQ ID NO:7)；(5)LRRC4B胞外域片段(SEQID NO:2的氨基酸484-576；即表6中的12号构建体)(SEQ ID NO:8)；(6)LRRC4B胞外域片段(SEQ ID NO:2的氨基酸482-576)(SEQ ID NO:9)；(7)LRRC4B胞外域片段(SEQ ID NO:2的氨基酸482-497)(SEQ ID NO:10)；(8)LRRC4B胞外域片段(SEQ ID NO:2的氨基酸498-576；即表6中的13号构建体)(SEQ ID NO:11)。然后，将重组FAM19A5蛋白(0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5和10nM)加入到相关孔中，板在37℃下孵育1小时。然后，使用HRP偶联的抗FAM19A5(1-65)抗体检测LRRC4B结合的FAM19A5蛋白的量。
如图4A所示，所有LRRC4蛋白家族成员(即LRRC4、LRRC4B和LRRC4C蛋白)的全长胞外域能够在不同程度上与FAM19A5蛋白结合。LRRC4和LRRC4B蛋白的全长胞外域分别以0.48nM和0.64nM的EC50结合FAM19A5蛋白。在10nM浓度的FAM19A5条件下，未观察到全长LRRC4C蛋白出现结合饱和。并且，与共免疫沉淀测定一致的是，含有SEQ ID NO:2第484-497位序列的LRRC4B胞外域蛋白片段对FAM19A5具有显著亲和力，而缺少该序列的胞外域蛋白片段(即LRRC4B(498-576))未能与FAM19A5结合(参见图4B)。
作为进一步的证实，构建了包含SEQ ID NO:2氨基酸484-497(即YTYFTTVTVETLET；SEQ ID NO:65)的三种合成多肽：(1)FB-16(GYTYFTTVTVETLETQ；SEQ ID NO:17)，(2)FB-20(GYTYFTTVTVETLETQPGEE；SEQ ID NO:18)，(3)FB-28(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD；SEQID NO:19)。肽的区别在于其总长度。利用如上所述的ELISA测定，评估这些多肽与重组FAM19A5蛋白结合的能力。由图6B可知，与含有SEQ ID NO:2氨基酸484-497(即SEQ ID NO:65)的LRRC4B胞外域蛋白片段类似，FB-16、FB-20和FB-28都能以高亲和力与重组FAM19A5蛋白结合。
总之，上述结果表明了LRRC4B蛋白第484-497位(即SEQ ID NO:65)，特别是484-493位(即YTYFTTVTVE；SEQ ID NO:29)内的氨基酸序列在与FAM19A5蛋白结合中的重要性(本发明中又称为“FAM19A5结合结构域”)。如图20所示，在不同脊椎动物的LRRC4蛋白家族中，该序列在进化上通常较保守。
示例3：其他LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5蛋白结合结构域的鉴定
如示例2所述，所有LRRC4蛋白家族成员均能不同程度地与FAM19A5蛋白结合。因此，为了比较结合结构域，对LRRC4B、LRRC4和LRRC4C蛋白的氨基酸序列进行了比对。如图5A所示，经对比，LRRC4B第484-522位氨基酸序列与LRRC4和LRRC4C蛋白相应位置的氨基酸序列非常相似。因此，为了评估LRRC4和LRRC4C的相应位置在这些蛋白与FAM19A5蛋白的结合中是否重要，构建了编码(i)LRRC4C蛋白片段(SEQ ID NO:3的氨基酸354-527；SEQ ID NO:66)或(ii)LRRC4蛋白片段(SEQ ID NO:1的氨基酸353-527；SEQ ID NO:67)的cDNA(参见表7)。转染HEK293细胞以表达任一蛋白片段，然后用示例1中所述的重组FAM19A5蛋白对HEK293细胞进行处理。然后，采用抗FLAG抗体对来自不同HEK293细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀。采用抗FLAG和抗FAM19A5(3-2)抗体对免疫沉淀蛋白质进行了免疫印迹。
表7.LRRC4C和LRRC4蛋白片段
如图5B所示，LRRC4C和LRRC4肽片段均能与FAM19A5蛋白结合。这一结果突显了不同LRRC4家族成员的结合结构域的相似性。
示例4：FAM19A5结合结构域在抑制FAM19A5与LRRC4B蛋白相互作用中的作用分析
由于含有示例2中所述结合结构域的LRRC4B蛋白片段(例如，LRRC4B(453-576)；即表6中的11号构建体)能够以高亲和力与FAM19A5蛋白结合，接下来评估这些蛋白片段是否能与自然存在的LRRC4B蛋白竞争与FAM19A5蛋白结合，从而解离FAM19A5-LRRC4蛋白家族复合物。简言之，采用LRRC4B(453-576)-hFc或突变型LRRC4B(453-576)-hFc(包括SEQ ID NO:2第488位和第489位的丙氨酸取代；SEQ ID NO:16)蛋白片段，对表达FAM19A5异构体2和LRRC4B蛋白的HEK293细胞进行体外处理，并持续30分钟。然后，采用抗FAM19A5(1-65)和抗LRRC4B抗体对细胞进行免疫染色，以分别测定FAM19A5和全长LRRC4B蛋白的表达。使用抗hIgG抗体测定hFc融合的LRRC4B蛋白片段。采用Hoechst 33342对细胞核进行染色。
根据早期的观察(参见图2A和2B)，当FAM19A5蛋白与全长LRRC4B蛋白结合时，特别是在质膜和树突样端突中，所述复合物高度共定位。在采用LRRC4B(453-576)-hFc处理的细胞中，FAM19A5在很大程度上与全长LRRC4B蛋白解离(参见图7，下排)。相反，在采用突变体LRRC4B(453-576)-hFc处理的HEK293细胞中，FAM19A5蛋白在很大程度上仍与全长LRRC4B蛋白结合，表明了示例2中鉴定的FAM19A家族结合结构域的重要性。
接下来，为了进一步评估LRRC4B蛋白结合结构域对FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的作用，使用竞争抑制测定法，以确定来自示例2的不同LRRC4B缺失构建体是否可以抑制FAM19A5与LRRC4B蛋白全长胞外域(即SEQ ID NO:2的氨基酸36-576；SEQID NO:5)的结合。简言之，使用100nM的LRRC4B蛋白全长胞外域包被板，然后将重组FAM19A5蛋白(5ng/mL)与以下LRRC4B缺失构建体(浓度增加)经组合后加入到板中：(1)LRRC4B(453-576)(即表6中的11号构建体)；(2)LRRC4B(453-576)突变体(包括SEQ ID NO:2第488位和第489位的丙氨酸取代；SEQ ID NO:16)；(3)LRRC4B(484-576)(即表6中的12号构建体)；(4)LRRC4B(482-576)；(5)LRRC4B(482-497)；(6)LRRC4B(498-576)。在37℃下孵育板，然后使用HRP偶联的抗FAM19A5(1-65)抗体测量与包被的LRRC4B胞外域蛋白结合的FAM19A5的量。
如图8A所示，LRRC4B(453-576)能够抑制FAM19A5蛋白与包被的全长LRRC4B胞外域蛋白的结合。包含SEQ ID NO:2氨基酸残基484-497(即LRRC4B蛋白的结合结构域；SEQ IDNO:65)的其他LRRC4B蛋白片段也能抑制FAM19A5和全长LRRC4B胞外域蛋白之间的相互作用——参见LRRC4B(484-576)、LRRC4B(482-576)和LRRC4B(482-497)。采用合成肽FB-16、FB-20和FB-28时，观察到了类似的结果(参见图8B)。相反，缺少SEQ ID NO:2氨基酸残基484-497的LRRC4B蛋白片段在抑制相互作用的能力方面要差得多——参见LRRC4B突变体和LRRC4B(498-576)(参见图8A)。
总之，上述结果证明，含有LRRC4B蛋白结合结构域的肽片段(例如合成的肽片段)可用于抑制FAM19A5-LRRC4B蛋白质复合物的形成。
示例5：LRRC4蛋白家族结合结构域在抑制FAM19A5-LRRC4蛋白家族复合物形成中的作用分析
如示例3所述，不同LRRC4家族成员的结合结构域似乎非常相似。因此，为了评估包含LRRC4B结合结构域的多肽是否也能够抑制其他LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5蛋白的结合，采用一种以下蛋白包被ELISA板(100nM/孔)：(1)LRRC4蛋白的全长胞外域(SEQ ID NO:1的氨基酸残基39-527；SEQ ID NO:4)；(2)LRRC4B蛋白的全长胞外域(SEQ ID NO:2的氨基酸36-576；即表6中的7号构建体；SEQ ID NO:5)；(3)LRRC4C蛋白的全长胞外域(SEQ ID NO:3的氨基酸45-527；SEQ ID NO:6)。然后，将重组FAM19A5蛋白(5ng/mL)与一种以下物质组合后加入到板中：(i)LRRC4B(484-576)蛋白片段，(ii)LRRC4B(453-576，AA)蛋白片段，(iii)合成FB-20肽。在37℃下孵育板，然后使用抗FAM19A5(1-65)抗体测量与包被的LRRC4、LRRC4B或LRRC4C蛋白结合的FAM19A5蛋白的量。
如图9A、9B和9C所示，LRRC4B(484-576)蛋白片段和合成FB-20肽均能抑制FAM19A5蛋白与包被的LRRC4和LRRC4C蛋白结合。并且，与早期数据一致的是，具有SEQ ID NO:2第488位和第489位丙氨酸取代的LRRC4B片段(即LRRC4B突变体(SEQ ID NO:16))的作用微乎其微。
接下来，为了评估包含LRRC4或LRRC4C蛋白结合结构域的多肽是否对LRRC4B蛋白结合具有类似的抑制作用，构建了以下合成肽：(1)FBC4-23(包含LRRC4蛋白的结合结构域，即YSFFTTVTVETTE)；(2)FBC4C-23(包含LRRC4C蛋白的结合结构域，即FSYFSTVTVETME)。然后，利用竞争抑制测定，评估肽抑制LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5蛋白结合的能力。简言之，采用100nM 1号LRRC4B蛋白片段(SEQ ID NO:2的氨基酸36-576；SEQ ID NO:5)或2号LRRC4B蛋白片段(SEQ ID NO:2的氨基酸453-576；SEQ ID NO:7)包被板。然后，将重组FAM19A5蛋白(采用1号LRRC4B片段包被的板为5ng/mL；采用2号LRRC4B片段包被的板为1ng/mL)与20nM的FBC4-23、FBC4C-23和FB-20肽组合后添加到板中。在37℃下孵育板，然后使用HRP偶联的抗FAM19A5(1-65)抗体测量与包被的LRRC4B蛋白片段结合的FAM19A5蛋白的量。
如图10A和10B；以及表8(下文)所示，三种肽(即FB-20、FBC4-23和FBC4C-23)均显著降低了FAM19A5蛋白与包被的LRRC4B蛋白片段之间的相互作用。
表8.
总之，上述结果证明，包含任何LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5结合结构域的肽可以抑制FAM19A5与LRRC4B蛋白之间的相互作用，从而进一步突显出LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域的保守性质。
示例6：抑制FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用所需的最小FAM19A5结合结构域序列的鉴定
接下来，为了确定抑制FAM19A5与LRRC4蛋白家族成员的相互作用所需的最小序列，通过从FB-20肽的N端或C端连续删除一个或多个氨基酸来构建10个FB-20肽变体。参见表9。然后，利用竞争抑制测定，评估不同FB-20肽变体抑制FAM19A5与LRRC4B蛋白之间相互作用的能力。再次，采用100nM 1号LRRC4B蛋白片段(SEQ ID NO:2的氨基酸36-576；SEQ IDNO:5)或2号LRRC4B蛋白片段(SEQ ID NO:2的氨基酸453-576；SEQ ID NO:7)包被板。然后，将重组FAM19A5蛋白(采用1号LRRC4B片段包被的板为5ng/mL；采用2号LRRC4B片段包被的板为1ng/mL)与20nM的上述不同的肽组合后添加到板中。在37℃下孵育板后，使用HRP偶联的抗FAM19A5(1-65)抗体测量与包被的LRRC4B蛋白片段结合的FAM19A5蛋白的量。
如图11A和11B以及表9所示，包含LRRC4B蛋白结合结构域的前10个氨基酸的肽片段(即YTYFTTVTVE；SEQ ID NO:29)基本抑制了FAM19A5与包被的LRRC4B蛋白片段之间的相互作用(参见“FB-m11dC”和“FB-m10dC”)。相反，LRRC4B蛋白结合结构域第1-10位缺少一个或多个氨基酸的肽片段未能显著抑制FAM19A5-LRRC4B蛋白相互作用(参见“FB-m10dC”、“FB-m9dC”、“FB-m8dC”、”FB-m7dC“、”FB-m6dC“、”FB-m10dN“、”FB-m9dN“、“FB-m8dN”和“FB-m7dN”)。
表9.
上述结果表明，LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5结合结构域的至少前10个氨基酸在抑制、减少和/或解离LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5蛋白之间相互作用方面具有重要性。
示例7：抑制LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5蛋白之间相互作用的重要结合结构域残基的鉴定
为了鉴定关键的氨基酸残基，构建了多个FB-20肽突变体，其中核心结合结构域的单个残基(即YTYFTTVTVETLE；SEQ ID NO:15)由丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)取代。参见表10。然后，如示例3和4所述，评估这些FB-20肽突变体抑制LRRC4B与FAM19A5蛋白之间相互作用的能力。
如图12A和12B以及表10所示，在核心结合结构域的第5位、第11位、第12位和第13位具有丙氨酸或天冬酰胺取代的FB-20肽突变体仍然能够显著抑制FAM19A5与LRRC4B蛋白之间的相互作用。相反，第1位、第2位、第3位、第4位、第6位、第7位、第8位、第9位和第10位丙氨酸或天冬酰胺取代使肽抑制LRRC4B蛋白与FAM19A5结合的能力显著降低，这表明核心结合结构域内的这些氨基酸位置在抑制、减少和/或解离FAM19A5与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用方面具有重要性。
表10.
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示例8：包含LRRC4蛋白家族成员结合结构域的多肽的治疗效果分析
为了评估本发明所述多肽的治疗潜力，利用RNA测序在培养后的不同时间点评估原代海马神经元(来源于出生后第1天的小鼠大脑)中FAM19A5、LRRC4B和PTPRF(LRRC4B的突触后配偶体)的转录水平。如图13A所示，即使早在培养后第1天，与其他FAM19家族成员相比，FAM19A5转录水平就显著较高，直到培养后第15天仍然很高。如图13B所示，原代海马神经元也表达了LRRC4B和PTPRF的高转录水平，这两种转录水平再次维持到培养后至少第15天。这些基因在原代神经元中的高表达水平表明，它们在神经发生的各个方面发挥着重要作用。
接下来，用不同浓度(0.006-60nM)的LRRC4B(453-576)蛋白片段(即SEQ ID NO:2的氨基酸残基453-576；SEQ ID NO:7)体外培养原代皮层神经元(出生后第1天)，然后在初始培养后第3天，通过用抗β-微管蛋白III型抗体对细胞进行免疫染色来评估对突起生长的影响。将采用二甲基亚砜(DMSO)(“Veh”)培养的细胞作为对照。
如图14A、14B、14C和14D所示，采用LRRC4B(453-576)蛋白片段处理的原代皮层神经元以剂量依赖性方式表现出突起生长增加。与对照组相比，LRRC4B蛋白片段处理的神经元的突起长度增加(图14A)、原代和传代突起的数量增加(分别为图14B和14D)以及分支点数量增加(图14C)。当用FB-16、FB-20和FB-28肽代替LRRC4B(453-576)蛋白片段时，还观察到突起生长增加(参见图18A、18B、18C、18D和18E)。FB-16、FB-20和FB-28肽似乎对突起生长都有类似的积极作用。
接下来，众所周知，从其他突起中生长出来的突起能够分化为轴突，形成突触前。其他突起仍然是小突起，并分化为树突，形成突触后。因此，还评估了LRRC4B(453-576)蛋白片段是否也能影响突触前和突触后形成。简言之，采用LRRC4B(453-576)蛋白片段(6nM或60nM)在体外培养小鼠原代海马神经元。采用DMSO(“Veh”)或不能与FAM19A5蛋白结合的突变体LRRC4B(453-576)蛋白片段(包含第488位和第489位丙氨酸取代)处理对照细胞。然后，在初始培养后的第3天和第6天，评估突触素(SYP；突触前标志物)的表达水平。在初始培养后的第7天，评估突触后致密区95(PSD95；一种突触后标志物)的表达水平。
如图15A和15B所示，LRRC4B(453-576)蛋白片段(在两种浓度下)增加了神经元中SYP和PSD95的表达，证实了观察到的突起生长增加可导致突触形成增加。作为支持，如图15C所示，在肽处理的小鼠原代海马神经元中，与SYP和PSD95共标记的斑点数量增加，表明突触前和突触后发生融合。如图19A、19B和19C所示，FB-16、FB-20和FB-28肽(每种肽均为60nM)的观察结果类似。
此外，为了证实上述对体内突起生长的影响，使用了APP/PS1小鼠(阿尔茨海默病小鼠模型)。从突触前和突触后标志物(如SYP和PSD95)的共标记斑点分别减少50％可以看出，在出生后4个月，APP/PS1小鼠出现海马CA1区突触缺失。Hong等人《科学(Science)》352(6286):712-716(2016年5月)。这些突触缺失和神经元缺失很有可能与空间学习和记忆能力障碍有关。Yoshiyama等人《神经元(Neuron)》53:337-351(2007年)。海马体CA1区是从EC到海马体的输入的主要目的地。来自EC的信息通过两个主要通路到达CA1。一种是从EC到CA1的直接穿孔通路，另一种是采用从EC到齿状回(第一突触)到CA3(第二突触)到CA1(第三突触)的三突触回路的间接通路。因此，研究了LRRC4B(453-576)蛋白片段(包含LRRC4B蛋白的FAM19A5结合结构域)的给药是否对海马体中的突触连接，特别是CA1区和CA3区的突触连接存在任何影响。简言之，采用(i)野生型LRRC4B(SEQ ID NO:2的氨基酸残基453-576)蛋白片段(SEQ ID NO:7)或(ii)突变体LRRC4B蛋白片段(即包含SEQ ID NO:2第488位和第489位的丙氨酸取代)(SEQ ID NO:16)，对APP/PS1小鼠进行处理。
如图16A-16C和17A-17C所示，与采用突变体LRRC4B蛋白片段处理过的APP/PS1小鼠相比，采用野生型LRRC4B蛋白片段处理过的APP/PS1小鼠在小鼠CA1区和CA3区中表现出SYP和PSD95免疫反应性增加。其水平与未经处理的正常动物(“对照”)中观察到的水平相似。
总之，上述结果证明，任何包含LRRC4蛋白家族成员核心结合结构域的肽都可以作为FAM19A5的诱饵受体，从而阻止FAM19A5蛋白对LRRC4蛋白家族成员活性的抑制作用(例如，促进突起生长和突触形成)。
示例9：利用SCHRODINGER平台对FAM19A5-LRRC4家族复合物进行计算机残基扫描
为了进一步表征在FAM19A5蛋白与LRRC4家族成员之间相互作用中发挥作用的残基，使用SCHRODINGER对FAM19A5-LRRC4家庭成员复合物的每一个单个非丙氨酸残基进行了计算机丙氨酸扫描，并确定吉布斯自由能的变化代表了与每个氨基酸残基的结合亲和力。具体而言，FB-20(LRRC4B蛋白的一个片段，包含FAM19A5结合结构域)的所有非丙氨酸残基(即GYTYFTTVTVETLETQPGEE；SEQ ID NO:18)突变为丙氨酸。表11提供了不同FB-20肽变体的序列(下文)。
表11.FB-20肽变体蛋白序列
如图21A所示(并且与早期数据一致——参见示例7)，FB-20肽片段的某些特定残基(例如从Y2到E11残基)似乎在FAM19A5蛋白与LRRC4B之间的相互作用中起到重要作用，这是因为在这些残基处引入丙氨酸突变后，自由能变化大幅度增加。同样，由于某些残基(例如T12和L13残基)上的丙氨酸取代并没有极大地改变蛋白-肽结合亲和力，因此这些残基似乎作用不大。
接下来，为了评估是否可以提高FB-20肽片段的结合亲和力，采用所有其他可能的氨基酸进行T12和L13残基(在FAM19A5蛋白与LRRC4B之间的相互作用中似乎作用最小)取代，然后使用SCHRODINGER确定结合亲和力。由于组氨酸在质子化状态下可以具有三种不同的分子结构(缩写为HIP、HID和HIE；HIP：+1带电，δ-和ε-氮均发生质子化；HID：中性，δ-氮质子化，HIE：中性，ε-氮质子化)，每个残基都能用21种不同的其他氨基酸进行取代。因此，T12和L13上的双重突变产生了441个突变体。表12(下文)提供了经预测可增强FAM19A5与LRRC4B之间结合亲和力的前二十个FB-20肽双突变体(在T12和L13处)的序列。
表12.具有T12和/或L13取代的示例性FB-20肽片段的序列
如图21B所示，包含某些T12/L13双突变体(例如T12P-L13Y和T12I-L13F)的LRRC4B肽片段与FAM19A5蛋白的结合亲和力增加。
上述结果进一步证实了LRRC4B肽片段的某些氨基酸残基(例如Y2至E11)在与FAM19A5蛋白结合时起到重要作用。上述结果进一步证明，LRRC4B肽片段的结合亲和力能够得到改善，例如，通过使在结合过程中不会自然地起到重要作用的氨基酸残基发生突变，从而有助于稳定本发明所述多肽(其包含LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5结合结构域)与FAM19A5蛋白之间的相互作用。
示例10：各种不同FB-21肽突变体的结合亲和力分析
示例9中提供的计算机分析强调，在提高本公开的多肽与FAM19A5蛋白的结合亲和力方面，某些T12和L13双突变体可能起到重要作用。因此，测试了野生型FB-21肽(与本发明所述的FB-20肽相同，但FB-21肽在C端另外含有丙氨酸)和几种FB-21突变体对hFc融合的hLRRC4B和FAM19A5复合物形成的抑制影响。具体而言，表13(下文)提供了所测试的不同FB-21肽片段的序列。简言之，采用100nM的LRRC4B(453-576，TT/TT)-hFc包被板，然后在37℃温度下，在存在浓度不断增加的不同FB-21肽片段(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300和1000nM)的条件下，孵育1ng/mL的rFAM19A5。使用HRP偶联的1-65抗体，测量LRRC4B结合的FAM19A5水平。
表13.示例性FB-21肽片段的序列
肽 氨基酸序列
FB-21(野生型)(SEQ ID NO:143) GYTYFTTVTVETLETQPGEEA
FB-21(P12Y13)(SEQ ID NO:144) GYTYFTTVTVEPYETQPGEEA
FB-21(H12F13)(SEQ ID NO:145) GYTYFTTVTVEHFETQPGEEA
FB-21(Q12R13)(SEQ ID NO:146) GYTYFTTVTVEQRETQPGEEA
FB-21(W12Y13)(SEQ ID NO:147) GYTYFTTVTVEWYETQPGEEA
FB-21(M12R13)(SEQ ID NO:148) GYTYFTTVTVEMRETQPGEEA
FB-21(I12F13)(SEQ ID NO:149) GYTYFTTVTVEIFETQPGEEA
如图22A所示(并且与示例9中提供的数据一致)，所测试的几个FB-21肽突变体能够抑制hFc融合的hLRRC4B蛋白与FAM19A5蛋白之间的相互作用(抑制的IC50见表14)。例如，与野生型FB-21相比，FB-21(W12Y13)突变体解离LRRC4B-FAM19A5复合物的能力提高了2.9倍。
表14.对人LRRC4B蛋白与重组FAM19A5蛋白(1ng/mL)之间复合物形成的抑制(IC50)
肽 IC50(nM)
FB-21(野生型)(SEQ ID NO:143) 11.9
FB-21(P12Y13)(SEQ ID NO:144) 39
FB-21(H12F13)(SEQ ID NO:145) 9.8
FB-21(Q12R13)(SEQ ID NO:146) 39.9
FB-21(W12Y13)(SEQ ID NO:147) 4.1
FB-21(M12R13)(SEQ ID NO:148) 47.9
FB-21(I12F13)(SEQ ID NO:149) 9.9
为了进一步评估FB-21突变体的抑制作用，对示例9所述的额外FB-21突变体抑制FAM19A5蛋白与LRRC4B蛋白之间相互作用的能力进行测试。简言之，采用100nM的His-TEVLRRC4B包被板，然后在37℃温度下，在存在浓度不断增加的FB-21肽片段(0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000和10000nM)的条件下，孵育1ng/mL的rFAM19A5。使用HRP偶联的1-65SS01抗体，测量LRRC4B结合的FAM19A5水平。如图22B所示(IC50见表15)，大多数(如果不是全部)FB-21突变体抑制LRRC4B与重组FAM19A5蛋白之间相互作用的能力有所提高。例如，FB-21(D12Y13)突变体在解离LRRC4B-FAM19A5复合物形成方面的有效性分别是FB-21和FB-21(W12Y13)的2.4倍和7倍。
表15.对抗FAM19A5抗体与重组FAM19A5蛋白(1ng/mL)之间复合物形成的抑制(IC50)
接下来，为了评估是否可以提高本发明所述多肽的其他性质(例如，溶解度、阻止蛋白酶和肽酶降解以及体内给药)，构建了以下额外FB-21肽突变体，并测试了其抑制FAM19A5蛋白与LRRC4B之间相互作用的能力：(1)d型FB-21肽(“dFB-21”)，(2)具有近膜(JM)序列的d型FB-21-肽(“dFB-JM-31”)；(3)序列两端各有一个血脑屏障(BBB)穿透序列的d型FB-21肽(“dFB-BBB-39”)；(4)具有DY替换和额外JM序列的d型FB-21突变型肽(“dFB-DY-JM31”)。d型FB-21肽的序列如SEQ ID NO:153所述(nYTYFTTVTVETLETQPGEEa；其中，小写氨基酸表示氨基酸的D型，大写氨基酸表示氨基酸的L型)。dFB-BBB-39的序列如SEQ ID NO:154所述(nYTYFTTVTVETLETQPGEEALRKLRKRLLLRKLRKRLl；其中，小写氨基酸表示氨基酸的D型，大写氨基酸表示氨基酸的L型)。dFB-JM-31的序列如SEQ ID NO:155所述(nYTYFTTVTVETLETQPGEEALDEVMKTTKa；其中，小写氨基酸表示氨基酸的D型，大写氨基酸表示氨基酸的L型)。dFB-DY-JM31的序列如SEQ ID NO:156所述(nYTYFTTVTVEDYETQPGEEALDEVMKTTKa；其中，小写氨基酸表示氨基酸的D型，大写氨基酸表示氨基酸的L型)。总体实验方法与上述方法相同。如图22D所示，JM序列是LRRC4家族基因近膜区中的保守基序。如图22C所示，从T12L13取代到D12Y13的含有JM基序的FB-21(包括突变肽)在抑制复合物形成方面的有效性比野生型FB-21提高4倍。
上述结果证实，本发明所述的某些修饰(例如，LRRC4家族成员的FAM19A5结合结构域的T12和L13残基处的氨基酸取代；以及LRRC4家庭成员的近膜基序的添加)能够提高本公开的多肽抑制FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的能力。
示例11：包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域的多肽对淀粉样蛋白β诱导的突触缺失的影响
阿尔茨海默病(AD)与β-淀粉样蛋白(Aβ)的代谢障碍密切相关。为了开始评估本发明提供的多肽(即，包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域)对AD是否具有任何治疗作用，评估了本发明所述各种FB-21肽片段对毒性Aβ低聚物诱导的突触变形和随后的结构恢复的影响。具体而言，测试了以下FB-21肽片段：FB-21、FB-JM-31和FB-BBB-39(参见示例10)。
如图23B所示，当采用有毒的Aβ低聚物进行共同处理时，仅具有JM序列的FB肽出现PSD95和突触素共定位体素的明显增加。此外，对于PSD95和突触素，未观察到显著的强度变化(参见图23C和23D)。这些结果强调了本发明提供的多肽(即包含LRRC4蛋白家族成员的FAM19A5结合结构域)针对有毒Aβ低聚物的结构保存和神经保护特性。
示例12：包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域的多肽对突起生长的影响脊髓损伤(SCI)系指对脊髓的损伤，导致损伤水平以下脊髓所服务的身体部位的运动和/或感觉和/或自主功能发生暂时性或永久性改变。在大多数情况下，损伤由跌倒、车祸或运动损伤等物理创伤造成，但也可由感染或肿瘤等非创伤性原因造成。为了评价损伤(如SCI)后运动神经元的再生能力，对本发明所述多肽对脊髓运动神经元的治疗效果进行了评估。简言之，在1DIV和2DIV，采用10nM FB-21肽片段(dFB-dWY-JM31和dFB-DY-JM31)处理出生后第1天采样的小鼠脊髓运动神经元，在3DIV，采用Tau-5抗体进行免疫染色。使用未经处理的细胞(“NT”)作为对照。
如图24A和24B所示，在采用本发明所述的LRRC4B肽片段处理过的SCI诱导的小鼠中，观察到脊髓运动神经元的总突起长度有所增加。这样的结果进一步强调了本发明所述多肽(即包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域)的治疗潜力，包括用于SCI治疗。
示例13：包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域的多肽对6-OHDA诱导的细胞死亡的影响
帕金森病(PD)是一种长期中枢神经系统退行性疾病，主要通过多巴胺能神经元的退化影响运动系统。为了评价对PD可能的神经保护能力，对本发明所述多肽对多巴胺能神经元(常见于PD)的神经退行性病变和细胞死亡的影响进行了评估。简言之，Lund人中脑(LUHMES)细胞分化为多巴胺能神经元，并采用6-OHDA(一种诱导多巴胺能神经元PD样变性的已知神经毒素)单独处理或与不同剂量(10nM、30nM和100nM)的FB-21肽片段(dFB-dWY-JM31)组合处理12小时。部分LUHMES细胞单独采用FB-21肽片段进行处理(即不进行6-OHDA处理)。然后，使用CellTiter-Glo测定法测量发光表达。
如图25所示，采用FB-21肽(dFB-dWY-JM31)进行的6-OHDA处理表面，LUHMES细胞活力以剂量依赖性方式出现逆转，强调了本发明所述多肽(即包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域)作为PD治疗的新型治疗剂的潜在用途。
示例14：包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域的多肽对神经性疼痛的影响
神经性疼痛是一种由外周和中枢神经系统的神经损害或损伤引起的难治性病。疼痛通常被描述为烧灼感，受影响区域通常对触摸非常敏感。为了评价本发明所述多肽在神经病性条件下的镇痛作用，使用了慢性压迫性伤害(CCI)动物模型。简言之，经过CCI诱导，每周两次向动物鞘内注射溶媒或50μg FB-21肽变体(dFB-dDY-JM31)，共注射五次。然后，在CCI诱导后第8天、第11天、第15天和第18天通过Von Frey测试测量机械性触诱发痛。
如图26A所示，在采用FB-21肽片段(dFB-dDY-JM31)处理过的CCI诱导的小鼠中，与溶媒对照组相比，在评估过的所有时间点都存在缩足阈值(PWT)增加的情况。当总体结果转换为曲线下面积(AUC)时，已处理动物和对照动物之间的显著差异甚至更加明显(参见图26B)。这些结果证明，本发明提供的多肽(例如dFB-dDY-JM31)的给药可用于逆转CCI诱导的机械性触诱发痛，强调了其作为止痛药的潜在用途。
示例15：包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域的多肽对视网膜功能障碍和神经振荡调节的影响
为了评价本发明提供的多肽(即包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域)对视网膜功能障碍(例如，由糖尿病性视网膜病变(DR)诱导)的治疗作用，通过视网膜电图(ERG)测试，在转基因糖尿病模型小鼠中测量了双极细胞和穆勒细胞的反应相关b波的振幅(db/db)。通过玻璃体内(ivt)注射每周用溶媒或10μg dFB-dDY-JM31处理，共处理12-18周。
如图27所示，与野生型同窝出生的动物相比，db/db对照动物表现出显著降低的B波振幅(db/+)。然而，当采用FB-21肽片段(dFB-dWY-JM31)处理db/db对照动物时，B波的振幅显著增加。这些结果强调了本发明所述多肽(即包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域)对视网膜功能障碍的治疗潜力，包括DR诱导的视网膜功能障碍。
示例16：包含LRRC4蛋白家族成员FAM19A5结合结构域的多肽对创伤性脑损伤引起的脑损伤的影响
为了进一步评价本发明所述多肽的治疗效果，使用了创伤性脑损伤(即冷诱导TBI)的小鼠模型。TBI诱导后约24小时，采用溶媒对照或dFB-dWY-JM31肽(100μg)处理动物(通过鼻内给药)。然后，在治疗后约24小时，获得脑组织，然后使用Hoechst对脑组织进行染色。
如图28所示，与TBI对照动物(即，在TBI诱导后采用溶媒对照进行处理)相比，采用FB-21肽片段处理的TBI动物表现出损伤体积显著减少。这些结果证明，本发明所述的多肽(例如dFB-dWY-JM31)可以减少TBI诱导的脑损伤尺寸，说明其具备作为TBI治疗剂的潜力。
示例17：开发能够抑制LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5之间相互作用的化合物为了开发抑制、减少和/或解离LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5之间相互作用的其他途径，如下所述，开发了一系列骨架化合物。
试剂和条件：(i)叔丁基二甲基氯硅烷，咪唑，CH2Cl2，室温，18小时；(ii)PPh3，CBr4，CH2Cl2，室温，3小时；(iii)己烷(3.0当量)中的n-BuLi 1.6M，THF，室温，2小时；(iv)己烷(1.1当量)中的n-BuLi 1.6M，N-甲氧基-N-甲基己酰胺，THF，-78℃至室温，16小时；(v)NaBH4，MeOH，室温，1小时；(vi)RuCl[(R,R)-TsDPEN(均三甲苯)]，KOH，2-丙醇，4小时；(vii)RuCl[(S,S)-TsDPEN(均三甲苯)]，KOH，2-丙醇，4小时；(viii)林德拉催化剂，H2气体，1,4-苯醌，MeOH，0℃，1小时；(ix)n-Bu4NF，THF中0.1M，室温，1小时。
4-((叔丁基二甲基氯硅烷)氧)-3-甲氧基苯甲醛(化合物1)的合成：在0℃下，将咪唑(1.29g，18.96mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(1.42g，9.39mmol)加入到搅拌后的香草醛(1.00g，6.57mmol)的干燥CH2Cl2(50mL)溶液中。在氩气下，将反应混合物在室温下搅拌16小时，用水淬火，并用CH2Cl2(3×25mL)萃取。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥并过滤，然后减压浓缩。在硅胶(己烷/EtOAc＝4:1，v/v)上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到无色油状化合物17，产率为94％。Rf＝0.89(己烷/EtOAc＝1:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.85(s,1H),7.40(d,J＝1.9Hz,1H),7.37(dd,J＝4.0and 8.0Hz,1H),6.97(d,J＝8.0Hz,1H),3.87(s,3H),1.00(s,9H),0.20(s,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ191.19,151.80,151.51,131.09,126.40,120.87,110.25,55.61,25.74,18.66,-4.41。
叔丁基(4-(2,2-二溴乙烯基)-2-甲氧基苯氧基)二甲基硅烷(化合物2)的合成：在0℃下，将PPh3(5.32g，20.28mmol)加入到溶于搅拌后的CBr4(3.37g，10.14mmol)的干燥CH2Cl2(30mL)溶液中。在氩气下，在相同温度下搅拌1小时后，10分钟内缓慢加入到化合物1(1.35g，5.07mmol)的干燥CH2Cl2(10mL)溶液。在氩气下将反应混合物搅拌2小时，并用CH2Cl2萃取(3×25mL)。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥并过滤，然后减压浓缩。在硅胶(己烷/EtOAc＝15:1，v/v)上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到无色油状化合物2，产率为98％。Rf＝0.87(己烷/EtOAc＝8:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.42(s,1H),7.19(d,J＝2.0Hz,1H),7.03(dd,J＝4.1and 8.3Hz,1H),6.84(d,J＝8.2Hz,1H),3.83(s,3H),1.02(s,9H),0.19(s,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ150.62,145.64,136.59,128.77,121.96,120.68,112.03,87.10,55.51,25.69,25.66,18.47,-4.58。
叔丁基(4-乙炔基-2-甲氧基苯氧基)二甲基硅烷(化合物3)的合成：在-78℃下，将n-BuLi(己烷中1.6M，5.30mL，8.35mmol)加入到搅拌后的化合物2(1.41g，3.34mmol)的干燥THF(20mL)溶液中。在氩气下，将反应混合物在相同温度下搅拌2小时，用含水NH4Cl(10mL)淬火，并用EtOAc(3×25mL)萃取。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥并过滤，然后减压浓缩。在硅胶(己烷/EtOAc＝16:1至10:1，v/v)上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到无色油状化合物3，产率为96％。Rf＝0.80(己烷/EtOAc＝8:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.00(dd,J＝4.0 and 8.1Hz,1H),6.97(d,J＝1.9Hz,1H),3.80(s,3H),2.99(s,1H),0.99(s,9H),0.15(s,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ150.66,146.23,125.46,120.90,115.66,115.04,83.96,75.57,55.45,25.67,18.47,-4.64。
1-(4-((叔丁基二甲基氯硅烷)氧)-3-甲氧基苯基)辛-1-炔-3-酮(化合物4)的合成：在-78℃下，将n-BuLi(1.1当量)加入到搅拌后的化合物3(400mg)的THF(40mL)溶液中。在氩气下，将溶液在相同温度下搅拌1小时，然后滴加N-甲氧基-N-甲基己酰胺(364mg，2.28mmol)。在氩气下，将反应混合物在相同温度下搅拌，直至TLC分析显示完成转换(12小时)，用含水NH4Cl(10mL)淬火，并用EtOAc(3×25mL)萃取。用盐水洗涤有机层，在MgSO4上干燥并过滤，然后减压浓缩。在硅胶(己烷/乙醚＝120:1至80:1，v/v)上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到化合物4。Rf＝0.75(己烷/EtOAc＝8:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.12(d,J＝8.1Hz,1H),7.07(s,1H),6.84(d,J＝8.2Hz,1H),3.82(s,3H),2.65(t,J＝7.4Hz,2H),1.77-1.75(m,2H),1.38-1.37(m,4H),1.00(s,9H),0.93(t,J＝6.5Hz,3H),0.18(s,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ188.36,150.90,148.19,127.18,121.14,116.48,112.74,91.88,87.48,55.51,45.41,31.21,25.62,23.99,22.43,18.48,13.92,-4.59。
1-(4-((叔丁基二甲基氯硅烷)氧)-3-甲氧基苯基)辛-1-炔-3-醇(化合物5)的合成：在0℃下，将NaBH4(33.0mg，0.874mmol)加入到搅拌后的化合物4(210mg，0.582mmol)的MeOH(15mL)溶液中。在氩气下，将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩，然后用EtOAc(3×25mL)萃取。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥并过滤，然后减压浓缩。在硅胶(己烷/EtOAc＝8:1，v/v)上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到无色油状化合物5，产率为77％。Rf＝0.59(己烷/EtOAc＝4:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.94-6.92(m,2H),6.77(d,J＝7.9Hz,1H),4.58(q,J＝6.4Hz,1H),3.79(s,3H),1.92(d,J＝5.2Hz,1H),1.81-1.76(m,2H),1.53-1.49(m,2H),1.35-1.34(m,4H),0.98(s,9H),0.91(t,J＝7.0Hz,3H),0.15(s,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ150.66,145.84,124.96,120.90,115.69,115.31,88.72,85.01,63.08,55.44,37.97,31.51,25.68,24.95,22.60,18.47,14.04,-4.65。
((Z)-1-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧)-3-甲氧基苯基)辛-1-烯-3-醇(化合物6)的合成：将喹啉(7mg，0.06mmol)和林德拉催化剂(7mg，0.02mmol)加入到化合物5(70.0mg，0.19mmol)的MeOH(3mL)溶液中，并在氢气(气球)气氛下，将混合物在0℃下搅拌1小时。化合物5完成转换后(TLC，甲苯/EtOAc＝10:1，v/v)，用硅藻土垫过滤反应混合物，并用MeOH(3×5mL)洗涤。将混合滤液减压浓缩，得到粗产物，采用硅胶柱色谱法(甲苯/EtOAc＝10:1，v/v)纯化，得到无色油状化合物6。Rf＝0.36(甲苯/EtOAc＝10:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.83(d,J＝1.8Hz,1H),6.81(d,J＝8.4Hz,1H),6.77(dd,J＝1.8and8.1Hz,1H),6.46(d,J＝11.4Hz,1H),5.57(dd,J＝9.0 and 12.0Hz,1H),4.60(dd,J＝7.2和15.3Hz,1H),3.80(s,3H),1.69-1.62(m,1H),1.61(brs,1H),1.59-1.52(m,1H),1.46-1.21(m,6H),1.00(s,9H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H),0.16(s,6H)。
(Z)-4-(3-羟基辛-1-烯-1-基)-2-甲氧基苯酚(化合物7，“KB2356”)的合成：在0下，将氟化四丁铵溶液(THF中1M，2.0当量)加入到搅拌后的化合物6的THF(5mL)溶液中。在氩气下，将反应混合物在相同温度下搅拌，直至TLC分析显示完成转换(通常为1小时)，用含水NH4Cl(10mL)淬火，并用EtOAc(3×25mL)萃取。用盐水洗涤有机层，在MgSO4上干燥并过滤，然后减压浓缩。在硅胶(己烷/EtOAc)上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到无色油状化合物7，产率为70％(从化合物5起需要两个步骤。Rf＝0.21(甲苯/EtOAc＝10:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.89(d,J＝8.4Hz,1H),6.88-6.86(m,1H),6.85-6.81(m,1H),6.48(d,J＝11.4Hz,1H),5.64(s,1H),5.57(dd,J＝9.0and 11.7Hz,1H),4.56-4.51(m,1H),3.90(s,3H),1.71-1.63(m,1H),1.61-1.54(m,1H),1.52(brs,1H),1.46-1.23(m,6H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ146.36,145.14,133.27,131.25,129.15,122.29,114.34,111.50,68.20,56.01,37.94,31.94,25.31,22.74,14.13。C15H22O3[M-H]-计算的HRMS m/z：249.1496；发现：249.1523。纯度>95％。
化合物8和9的一般程序：将KOH和催化剂加入到化合物4的2-丙醇溶液(0.1M)中，化合物4:化剂:KOH＝200:1:1.2。在氩气下，将反应混合物在室温下搅拌，直至TLC分析显示完成转换(通常为4时)，然后减压浓缩。在硅胶上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到立体选择性化合物。在手性柱(CHIRALPAK IG，己烷中的10％乙醇)上，通过手性高效液相色谱分析确定ee值。
(R)-1-(4-((叔丁基二甲基氯硅烷)氧)-3-甲氧基苯基)辛-1-炔-3-醇(化合物8)的合成：按照与上述一般程序所述相同的程序，在2-丙醇(4.16mL)、RuCl[(R,R)-TsDPEN(均三甲苯)](1.29mg，2.08μmol)和KOH(0.138mg，2.50μmol)中使用化合物4(150mg，0.416mmol)，制备无色油状化合物8，产率为88％。在硅胶(己烷/EtOAc＝12:1，v/v)上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到化合物8。Rf＝0.59(己烷/EtOAc＝4:1，v/v)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ6.94-6.92(m,2H),6.77(d,J＝7.9Hz,1H),4.58(q,J＝6.4Hz,1H),3.79(s,3H),1.90(d,J＝5.5Hz,1H),1.81-1.76(m,2H),1.53-1.50(m,2H),1.36-1.33(m,4H),0.98(s,9H),0.91(t,J＝7.0Hz,3H),0.15(s,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ150.66,145.84,124.95,120.90,115.68,115.30,88.71,85.02,63.09,55.44,37.97,31.51,25.68,24.95,22.60,18.47,14.04,-4.65。
(S)-1-(4-((叔丁基二甲基氯硅烷)氧)-3-甲氧基苯基)辛-1-炔-3-醇(化合物9)的合成：按照与上述化合物8的一般程序所述相同的程序，使用以下起始材料，制备无色油状化合物9，产率为68％：在2-丙醇(4.16mL)、RuCl[(S,S)-TsDPEN(均三甲苯)](1.29mg，2.08μmol)和KOH(0.138mg，2.50μmol)中使用化合物4(150mg，0.416mmol)。在硅胶(己烷/EtOAc＝12:1，v/v)上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到化合物9。Rf＝0.59(己烷/EtOAc＝4:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.94-6.92(m,2H),6.77(d,J＝7.9Hz,1H),4.58(t,J＝6.5Hz,1H),3.79(s,3H),1.91(s,1H),1.81-1.76(m,2H),1.53-1.49(m,2H),1.35-1.34(m,4H),0.98(s,9H),0.91(t,J＝7.0Hz,3H),0.15(s,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ150.66,145.84,124.95,120.90,115.68,115.31,88.71,85.01,63.08,55.44,37.97,31.51,25.68,24.95,22.60,18.47,14.04,-4.65。
化合物10和11的一般程序：在0℃下，将氟化四丁铵溶液(THF中1M，2.0当量)加入到搅拌后的甲硅烷基保护化合物的THF(5mL)溶液中。在氩气下，将反应混合物在相同温度下搅拌，直至TLC分析显示完成转换(通常为1小时)，用含水NH4Cl(10mL)淬火，并用EtOAc(3×25mL)萃取。用盐水洗涤有机层，在MgSO4上干燥并过滤，然后减压浓缩。在硅胶(己烷/EtOAc)上，采用柱色谱法对粗残留物进行纯化处理，得到化合物。
(R)-4-(3-羟基辛-1-炔-1-基)-2-甲氧基苯酚(化合物10，“KB2357”)的合成：按照以下一般程序，制备白色油状化合物10(28.0mg，0.077mmol)，产率为94％。Rf＝0.21(己烷/EtOAc＝5:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.98(dd,J＝1.7and 8.2Hz,1H),6.92(d,J＝1.7Hz,1H),6.84(d,J＝8.2Hz,1H),5.72(brs,1H),4.58(q,J＝6.4Hz,1H),3.89(s,3H),1.87-1.73(m,3H),1.58-1.47(m,2H),1.39-1.30(m,4H),0.91(t,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ146.29,146.12,125.67,114.46,114.23,113.93,88.32,84.97,63.10,55.98,37.98,31.50,24.94,22.59,14.03。C15H20O3[M-H]–的计算HRMS m/z：247.1339；发现：247.1397。纯度>95％。
(S)-4-(3-羟基辛-1-炔-1-基)-2-甲氧基苯酚(化合物23c，“KB2358”)的合成：按照以下一般程序，制备黄色油状化合物23c(20.0mg，0.055mmol)，产率为93％。Rf＝0.21(己烷/EtOAc＝5:1，v/v)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.97(t,J＝6.6Hz,1H),6.92(d,J＝1.8Hz,1H),6.84(d,J＝7.8Hz,1H),4.58(t,J＝6.6Hz,1H),3.88(s,3H),1.89-1.76(m,2H),1.63-1.55(m,2H),1.43-1.31(m,4H),0.90(t,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ146.30,146.15,125.65,114.50,114.21,113.96,88.34,84.97,63.09,55.97,37.97,31.50,24.95,22.59,14.03。C15H20O3[M-H]–计算的HRMS m/z：247.1339；发现：247.1415。纯度>95％。
具体产生了以下化合物：(1)KB734、(2)KB761、(3)KB763、(4)KB1157、(5)KB1161、(6)KB1542、(7)KB1543、(8)KB2256、(9)KB2258、(10)KB2310、(11)KB2357、(12)KB2718、(13)KB2719、(14)KB3111、(15)KB3112、(16)KB3220、(17)KB3201、(18)KB3250和(19)KB3251。然后，利用竞争抑制测定，评估上述化合物抑制LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5蛋白结合的能力。简言之，采用100nM Fc偶联LRRC4B片段(SEQ ID NO:2的氨基酸453-576；SEQ ID NO:7)包被ELISA板。然后，将重组FAM19A5蛋白(1ng/mL)与一种以下化合物(100μM)组合后加入到板中。单独使用重组FAM19A5蛋白(“对照”)，或将其与DMSO组合后作为对照。在37℃下孵育板，然后使用HRP偶联的抗FAM19A5(1-65)抗体测量与包被的LRRC4B蛋白片段结合的FAM19A5蛋白的量。
如图29A所示，在已测试的19种不同的化合物中，与对照组相比，KB2357能够使FAM19A5与包被的LRRC4B蛋白片段之间的相互作用减少约10％，因此KB2357的作用最大。与对照组相比，已测试的其他18种化合物未起到任何实质性作用。
接下来，为了评估增加化合物浓度是否可以改善抑制作用，对增加KB734、KB2310和KB2357化合物浓度进行与上述相同的竞争抑制测定。KB734和KB2310并未抑制FAM19A5和LRRC4B蛋白之间的相互作用，因此将KB734和KB2310作为阴性对照。如图29B所示，增加KB2357化合物的浓度使FAM19A5和LRRC4B蛋白片段之间的相互作用进一步减少。增加KB734和KB2310的浓度并未产生明显的效果。
为了进一步评估KB2357化合物对FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员的抑制作用，如前所述，合成了以下KB2357化合物衍生物：(1)KB2304、(2)KB2305、(3)KB2308、(4)KB2309、(5)KB2314、(6)KB2315、(7)KB2324、(8)KB2325、(9)KB2328、(10)KB2329、(11)KB2336、(12)KB2337、(13)KB2350、(14)KB2356、(15)KB2358、(16)KB2359、(17)KB2369、(18)KB2372和(19)KB2399。同时也在如上所述的竞争抑制测定中对衍生物化合物进行了测试。如图30A和30B所示，KB2356、KB2358和KB2399的表现类似于KB2357，并能以剂量依赖性方式减少LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5之间的相互作用。
上述结果证明，至少KB2357化合物及其几种衍生物(即KB2356、KB2358和KB2399)可用于抑制、减少和/或解离LRRC4蛋白家族成员与FAM19A5之间的相互作用，特别是在浓度较高(例如大于等于约100μM)的情况下。
示例18：方法和材料
本发明提供的示例(见上文)使用一种或多种以下方法中：
Aβ42制备
Aβ42(#20276)肽购自AnaSpec(美国弗里蒙特)。将Aβ42肽的冻干等分试样(1mg)溶于80μl 1％ NH4OH中，然后溶于920μl无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，得到浓度为1mg/ml的储备溶液(在–20℃下作为100μl等分试样储存)。在处理前一天，通过在Neurobasal培养基(Gibco，Life technologies，美国)中将储备浓度稀释至100nM的最终Aβ肽浓度，制备Aβ工作溶液。将工作溶液在4℃下孵育24小时，以获得Zheng等人《淀粉样蛋白(Amyloid)》20(1):13-20(2013年)所述的低聚条件，所述出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。使用当天，将工作溶液在14000g、4℃条件下离心10分钟，从原纤维中纯化出低聚Aβ馏分。
原代海马神经元培养
根据Beaudoin等人《自然实验手册(Nature protocols)》7(9):1741-1754(2012)之前所述，原代海马神经元由C57BL/6(Nara Biotech，韩国首尔)的出生后幼崽(出生后第1天)制备而成，所述出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。简言之，在Hank’s缓冲盐溶液(HBSS)(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)中解剖皮质，并在37℃下用2.5％胰蛋白酶消化15分钟。去除上清液后，用HBSS洗涤组织。将组织轻轻研碎，并将解离细胞以每皿8×105个细胞的速度接种在60mm培养皿(盛有添加了0.5％葡萄糖、1mM丙酮酸盐、1.2mM L-谷氨酰胺和12％胎牛血清的最低Eagle培养基(MEM))的多聚-D-赖氨酸涂布玻璃盖玻片上。平板接种6小时后，将培养基更换成添加了2％ B-27和0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。在37℃下，在5％ CO2加湿培养箱中保存细胞。Neurobasal培养基每3-4天更换一半。
原代脊髓运动神经元培养
根据Eldeiry等人《视频实验期刊(JoVE，Journal of Visualized Expeirments)》125:255856(2017)之前所述，原代脊髓运动神经元由C57BL/6(Nara Biotech，韩国首尔)的出生后幼崽(出生后第1天)制备而成，所述出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。简言之，在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco，Life technologies，美国)中解剖脊髓，并用木瓜蛋白酶(2.5mg/ml)在30℃下消化30分钟。离心并去除上清液，并用添加了2％ B-27和0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A(Gibco，Life technologies，美国)洗涤组织。将组织轻轻研碎，并将解离细胞以每孔3×105个细胞的速度接种在12孔板(盛有添加了2％ B-27和0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德))的多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白(Thermofisher scientific，美国)涂布玻璃盖玻片上。在37℃下，在5％ CO2加湿培养箱中保存细胞。
免疫染色
在适当的DIV下，采用4％的多聚甲醛(PFA)，固定原代神经元。在室温下，采用3％的牛血清白蛋白(BSA)和0.1％的Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液阻断细胞1小时。然后将一抗应用于细胞在4℃下过夜。本研究中使用的一抗是小鼠抗Tau5(Invitrogen，美国加利福尼亚州)、兔抗PSD95(Invitrogen)和小鼠抗突触素(Sigma)。使用PBS洗涤几次后，在室温下，与Hoechst 33342(Invitrogen)配合应用适当的荧光偶联二抗，并持续30分钟。随后，使用共聚焦显微镜(Leica，德国韦茨拉尔)得到细胞图像。
突触发生的定量分析
在14DIV、17DIV和20DIV，采用6.6nM的FB-21、6.6nM的FB-13-JM和6.6nM的FB-13-BBBX2处理海马神经元，通过对SYP(一种突触前标记蛋白)和PSD95(一种突触后标记蛋白)进行免疫染色，确定21DIV下的突触发生水平。为了量化SYN和PSD95的荧光强度以及SYN和PSD95信号之间共定位体素的数量，使用IMARIS软件(IMARIS9.0，Bitplane AG，瑞士苏黎世)将深度为3μm的共焦z堆叠图像转换为三维图像。IMARIS软件的“Surface工具”用于排除神经元细胞体中检测到的所有信号，利用“Coloc工具”计算突起中SYN和PSD95信号之间的共定位体素数量。然后，获得突起中SYN和PSD95的总荧光强度。
突起生长的定量分析
在1DIV和2DIV，采用LRRC4B肽处理小鼠海马神经元，以测定突起生长。使用3个不同的参数测量突起生长，这3个参数是总突起长度、初级突起的数量和次级突起的数量。在3DIV，采用β-微管蛋白III型对神经元进行染色后，使用Fiji(Image J，美国国立卫生研究院(NIH)，贝塞斯达)测量突起长度和分支点。手动选择个体神经元，并使用Simple neuritetracer插件对这些参数进行计数。简言之，在1DIV和2DIV，采用10nM NS101和LRRC4B肽(dFB-dWY-JM31和dFB-DY-JM31)处理出生后第1天采样的小鼠脊髓运动神经元，在3DIV，采用Tau-5抗体进行免疫染色。使用Neurphology Image J插件，测量图像中的总突起长度和胞体数量。
LUHMES细胞培养和分化
从ATCC(CRL 2927)获得LUHMES人神经元前体细胞。参见Harischandra等人《生物化学与生物物理学报(BBA)-疾病分子基础(Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease)》1866(4):165533(2020年)，所述出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。简言之，采用50μg/mL聚-l-鸟氨酸(Sigma Aldrich)将塑料培养板预涂过夜，在孵育结束时，用细胞培养级用水(Invitrogen)洗涤两次，然后用1μg/mL的纤连蛋白(Sigma)孵育过夜。使用由Advanced Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12、N-2添加剂(1×)、2mM L-谷氨酰胺和40ng/mL重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Sigma)组成的增殖培养基，在温度维持在37℃的CO2培养箱内进行细胞增殖。在增殖过程中，每隔一天更换一半培养基，用0.025％的胰蛋白酶对细胞进行酶解，当培养物达到80％融汇度时，对细胞进行传代培养。简言之，将3.5×106个细胞接种在预包被的T75烧瓶中的增殖培养基中孵育24小时。第二天通过将培养基更换成新制备的分化培养基并孵育48小时来诱导分化。分化培养基由Advanced DMEM/F12、N-2添加剂(1×)、2mM L-谷氨酰胺、1mM双丁酰环磷酸腺苷、1μg/mL四环素和2ng/mL重组人GDNF(R&D Systems)组成。在48小时孵育结束时，用0.025％的胰蛋白酶/EDTA解离细胞，并在分化培养基中以1.5×105个细胞/cm2的细胞密度在预涂板上重新涂布。一旦细胞被重新涂布，每隔一天更换一次分化培养基，除非另有说明，否则所有实验均在分化的第五天完成。
细胞活力的定量分析
采用10nM、30nM、100nM dFB-dWY-JM31处理分化的LUHMES细胞，通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)确定细胞对5μM 6-羟基多巴胺氢溴酸盐(Tocris)的活力水平。为了确定细胞活力水平，在每个孔中存在的细胞培养基处，以1:1的体积添加CellTiter-Glo试剂，并在定轨振荡器上混合内容物，以诱导细胞裂解。板在室温下孵育10分钟，以稳定发光信号，并在酶标仪(Synergy H1，Biotek)中读取发光信号。每个实验重复进行三次。
慢性压迫性伤害(CCI)
对习惯化期间正常的健康受试者进行CCI。首次手术日期设定在第0天。将SD大鼠从麻醉箱中取出并固定。使用聚维酮(必达净)和70％酒精对手术部位进行消毒后，切开左下肢的皮肤(皮肤后方0.5cm，与股端突平行的长度约为3-4cm)。用钳子开一小孔，将一弯曲的持针器插入孔中，分离出坐骨神经。使用显微镜观察时，用钳子夹住坐骨神经两侧的膜(筋膜)，并用显微手术剪切入。用4-0缝线结扎神经三道，每道间距1mm。
缩足阈值(PWT)的测量
每只大鼠在测试环境中至少适应30分钟。为了测量50％缩足阈值(PWT)，使用0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和15.0g冯弗雷(von-frey)纤维丝。采用2.0g冯弗雷纤维丝刺激CCI大鼠后肢4-5秒。当大鼠出现症状(抬起脚或痉挛)时，用于大鼠的冯弗雷纤维丝按比例缩减2.0g。当大鼠没有表现出任何症状时，用于大鼠的冯弗雷纤维丝按比例增加2.0g。因此，在这种方式中，使用了0.4g-15.0g冯弗雷纤维丝。当反应发生变化时(从2.0g冯弗雷纤维丝开始，当大鼠开始做出反应或当大鼠从2.0g冯弗雷纤维丝开始不做出反应时的时间)，给予5次以上的刺激，以获得PWT。
糖尿病性视网膜病变小鼠模型中视网膜电流图(ERG)的测量(db/db)
为了评价糖尿病性视网膜神经退行性病变，使用db/db和db/+小鼠。参见Bogdanov等人《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》9(5):e97302(2014年)，所述出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。记录ERG，以测量视网膜对闪光做出反应时发出的电信号。根据国际临床视觉电生理学会标准，每只小鼠接受眼科检查，以测试ERG，并将每只小鼠置于暗箱中适应12小时。注射后(第6周和第10周时)，进行暗适应ERG。测量b波的ERG振幅，并比较两组之间由-0.9log cd·sm-2的光强度诱发b波的时间。使用LabScribeERG(iWorxDataAcquisition软件)程序进行ERG分析。
冷致创伤性脑损伤(TBI)
通过异氟烷吸入剂暴露麻醉小鼠后，将每只小鼠稳定地放入立体定位装置。在头皮中线上开一个3.0mm的切口。通过将液氮冷却(-80℃)的铜柱杆尖端(2.5mm)施加在右侧额部颅骨上45秒，产生低温损伤，从而执行冷致TBI。参见Keskin等人《神经再生研究》12(5):761-764(2017年)，所述出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。创伤后48小时和通过鼻腔给药注射溶媒或dFB-dWY-JM31肽后24小时，通过心脏灌注处死所有动物。
TBI脑损伤的定量分析
取出受创伤小鼠的脑部，获得脑切片，整个脑部共有8-9个连续的冠状切片(20μm厚)，并使用Hoechst(ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)对切片进行染色。使用Image J软件程序(美国国立卫生研究院(NIH)，美国马里兰州贝塞斯达)区分受伤和非受伤区域的边界。通过从对侧的无损伤同侧半球面积中减去无损伤同侧半球面积来评估损伤面积。通过整合这些损伤区域，计算出损伤体积。分别测量全部8-9个横断面，并计算相应的体积。
统计分析
所有统计分析均采用GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州)进行，数据显示为平均值±平均值标准误差(SEM)。利用学生t检验和/或单向方差分析(ANOVA)以及邦弗朗尼(Bonferroni)事后检验法，对统计显著性进行评估。小于0.05的p值被认为具有统计显著性。
应当理解，具体实施方式部分，而非发明内容和发明摘要部分，旨在用于对权利要求书进行解释。发明内容和摘要部分可以阐述发明人设想的本公开的一个或多个方面，而非所有示例性方面，因此发明内容和摘要部分并非旨在以任何方式限制本公开和所附权利要求。
上文借助说明指定功能及其关系的实现的功能构建块对本公开进行了描述。为了便于描述，本发明中任意定义了这些功能构建块的边界。只要适当执行指定功能及其关系，就可以定义替代边界。
上述对特定方面的描述将充分揭示本公开的一般性质，使得其他人可以在不进行过度实验的情况下，以及在不脱离本公开的一般概念的情况下，通过应用本领域技术范围内的知识，可轻易地修改和/或适应这些特定方面的各种应用。因此，基于本发明提出的教导和指导，这类适应和修改旨在纳入所公开方面的等同内容的含义和范围内。应当理解，本发明中的措辞或术语仅用于描述目的，而非限制目的，使得本说明书的术语或措辞能够由本领域技术人员根据教导和指导做出解释。
本公开的广度和范围不应受上述示例性方面的任何方面的限制，而应仅依据以下权利要求及其等同内容进行定义。
就各方面而言，本发明中引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和登录号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。在相同的程度上，每一份单独的出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列都明确且单独地表示为通过本发明的引用，成为本发明的一部分。

Claims (126)

1.一种富含亮氨酸重复序列4(“LRRC4”)家族模拟分子，所述分子能够抑制、减少和/或解离序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
2.根据权利要求1所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子并非抗体或其抗原结合部分。
3.根据权利要求1或2所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子包含肽。
4.根据权利要求1或2所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子为小分子。
5.根据权利要求4所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子为式I的小分子：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基；
(ii)是单键或双键；
(iii)Z选自直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、直链或支链C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、3-8元杂环烷基、C7-C14双环烯基、C7-C14双环烯基、7-14元杂双环烷基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和-CH-C(O)-CH＝CH-Q，其中，Q是C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、3-8元杂环烷基、C6-C10芳基和5-6元杂芳基；其中，每个环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、卤代、C1-C6卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基，
(iv)L是单键、双键或三键，
其中，所述LRRC4家族模拟分子并非选自以下物质的小分子：
或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求4所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子为式II的小分子：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基，
(ii)Z选自直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、直链或支链C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、3-8元杂环烷基、C7-C14双环烯基、C7-C14双环烯基、7-14元杂双环烷基、C6-C10芳基、5-10元杂芳基和-CH＝CH-Q，其中，Q是C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、3-8元杂环烷基、C6-C10芳基和5-6元杂芳基；其中，每个环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、卤代、C1-C6卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基，
(iii)L是单键、双键或三键。
7.根据权利要求6所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子选自以下物质：
或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求4所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子为式III的小分子：
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)R1、R2和R3独立选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、1-氟乙基、2,2-二氟乙基、1,2-二氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、氟甲氧氧基、乙酰基、丙酰基、正丁醇、异丁酰基、正戊酰基、硝基、氨基、N-甲基氨基、N-乙基氨基、N-正丙基氨基、N,N-二甲基氨基、N-乙酰氨基、N-丙酰氨基、N-(三氟乙酰基)氨基、甲酰基、羟基、甲硫基、乙硫基、正丙基硫基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、苯基、羟甲基、1-羟乙基和2-羟乙基，
(ii)Z选自直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、直链或支链C2-C8炔基、-Y-C3-C8环烷基、-Y-C5-C8环烯基、-Y-3-8元杂环烷基、-Y-C7-C14双环烯基、-Y-C7-C14双环烯基、-Y-7-14元杂双环烷基、-Y-C6-C10芳基、-Y-5-10元杂芳基，其中，Y是键或C1-C3直链或支链亚烷基，其中，所述环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基和杂芳基可选用一个、两个、三个、四个或五个取代基取代，所述取代基独立选自C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、卤代、C1-C6卤代烷氧基、硝基、氨基、N-甲胺基、N-乙胺基、N-N-丙胺基、N,N-二甲氨基、甲酰基和羟基中，
(iii)L是单键、双键或三键，
(iv)n是0或1。
9.根据权利要求8所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子选自以下物质：
或其药学上可接受的盐。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子包含多肽，所述多肽包含如下结构域，或由如下结构域组成，或基本上由如下结构域组成，该结构域是LRRC4蛋白家族成员的结构域，其中，所述结构域能够与FAM19A5蛋白(“FAM19A5结合结构域”)结合，其中，与相应的全长LRRC4蛋白家族成员(SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；或SEQ IDNO:6)相比，所述多肽较短。
11.根据权利要求10所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述FAM19A5结合结构域的长度为约10-约23个氨基酸。
12.根据权利要求11所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述FAM19A5结合结构域的长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22或约23个氨基酸。
13.根据权利要求12所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述FAM19A5结合结构域的长度为约10个氨基酸。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列(从N端到C端)：
A-(T/S)-B(式IV)，其中：
(i)A包括X1-(T/S)-(Y/F)-F-X5；其中：
X1是酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
(T/S)是苏氨酸(T)或丝氨酸(S)；
(Y/F)是酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)；
X5是任何氨基酸；
(ii)B包括(V/I)-T-V-(E/V)；其中：
(V/I)是缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)；
(E/V)是谷氨酸(E)或缬氨酸(V)。
15.根据权利要求10-13中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列(从N端到C端)：
A-(T/S)-B(式IV)，其中：
(i)A包括(Y/W/M)-(T/Y)-(Y/W)-(F/Y/W)–(T/Y)；其中：
(Y/W/M)是酪氨酸(Y)、色氨酸(W)或甲硫氨酸(M)；
(T/Y)是苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)；
(Y/W)是酪氨酸(Y)或色氨酸(W)；
(F/Y/W)是苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)；
(ii)B包括X7-(T/S/Y)-X9-X10；其中：
X7是缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)或甲硫氨酸(M)；
(T/S/Y)是苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或酪氨酸(Y)；
X9是缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)或甲硫氨酸(M)；
X10是谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、异亮氨酸(I)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)或色氨酸(W)。
16.一种包含多肽的LRRC4家族模拟分子，所述多肽包含一个具有下式的氨基序列(从N端到C端)：
X1-X2-X3-F-X5-T-X7-T-V-X10(式V)，其中：
X1是Y、F、V、L或I；
X2是T或S；
X3是Y或F；
X5是任何氨基酸；
X7是V或I；和/或
X10是E或V，
其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
17.一种包含多肽的LRRC4家族模拟分子，所述多肽包含一个具有下式的氨基酸序列：(从N端到C端)：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(式VI)，其中：
X1是Y、F、V、L、I、W或M；
X2是T、S或Y；
X3是Y、F或W；
X4是F、Y或W；
X5是任何氨基酸，例如T、S或Y；
X6是T、S或Y；
X7是V、I、Y、F、L、W或M；
X8是T、S或Y；
X9是V、I、Y、F、L、W或M；和/或
X10是E、D、V、I、Y、F、M或W，
其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
18.根据权利要求17所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X1为Y、F、V、L或I。
19.根据权利要求17或18所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X2是T或S。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X3是Y或F。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X4是F。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X5是T或S。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X6是T。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X7是V或I。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X8是T。
26.根据权利要求17-25中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X9是V。
27.根据权利要求17-26中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，X10是E或V。
28.根据权利要求10-27中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列。
29.根据权利要求10-27中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ IDNO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。
30.根据权利要求10-27中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQID NO:20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)中所述的氨基酸序列。
31.根据权利要求10-27中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ IDNO:20(NYSFFTTVTVETTEISPEDTTRK)中所述的氨基酸序列组成。
32.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQID NO:30(YSFFTTVTVE)中所述的氨基酸序列。
33.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ IDNO:30(YSFFTTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。
34.根据权利要求10-27中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQID NO:21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)中所述的氨基酸序列。
35.根据权利要求10-27中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQIDNO:21(NFSYFSTVTVETMEPSQDERTTR)中所述的氨基酸序列组成。
36.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQID NO:31(FSYFSTVTVE)中所述的氨基酸序列。
37.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ IDNO:31(FSYFSTVTVE)中所述的氨基酸序列组成。
38.根据权利要求10-27中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQID NO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列。
39.根据权利要求10-27中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ IDNO:18(GYTYFTTVTVETLETQPGEE)中所述的氨基酸序列组成。
40.根据权利要求30或31所述的LRRC4家族模拟分子，其中，氨基酸残基T12和L13相对于SEQ ID NO:18的相应残基进行修饰(例如取代)。
41.根据权利要求32所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQ ID NO:123-142中任一项所述的氨基酸序列。
42.根据权利要求32所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ ID NO:123-142中任一项所述的氨基酸序列组成。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的多肽，其中，一个或多个氨基酸残基以D-氨基酸形式存在。
44.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQID NO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列。
45.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ IDNO:17(GYTYFTTVTVETLETQ)中所述的氨基酸序列组成。
46.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQID NO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列。
47.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ IDNO:19(GYTYFTTVTVETLETQPGEKEPPGPTTD)中所述的氨基酸序列组成。
48.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQID NO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列。
49.根据权利要求1-19中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ IDNO:143(GYTYFTTVTVETLETQPGEEA)中所述的氨基酸序列组成。
50.根据权利要求47或48所述的LRRC4家族模拟分子，其中，氨基酸残基T12和L13相对于SEQ ID NO:143的相应残基进行修饰(例如取代)。
51.根据权利要求50所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽包含SEQ ID NO:123-149中任一项所述的氨基酸序列。
52.根据权利要求50所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽由SEQ ID NO:123-149中任一项所述的氨基酸序列组成。
53.根据权利要求16-52中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，第X2位氨基酸为磷酸化或O-糖基化氨基酸。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽与一个部分偶联。
55.根据权利要求54所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述部分能够增加多肽的以下一种或多种性质：(1)与FAM19A5蛋白的结合亲和力，(2)溶解性，(3)对蛋白酶和/或肽酶降解的抗性，(4)体内给药的适宜性，(5)抑制FAM19A5-LRRC4蛋白家族成员相互作用的能力，或(6)(1)-(5)的任何组合。
56.根据权利要求53或54所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述部分包含LRRC4蛋白家族成员的近膜序列。
57.根据权利要求56所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述近膜包含SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)或SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的序列。
58.根据权利要求56所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述近膜由SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)或SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的序列组成。
59.一种包含多肽的LRRC4家族模拟分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:29(YTYFTTVTVE)中所述的氨基酸序列具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
60.一种包含多肽的LRRC4家族模拟分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所述的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约99％相同的氨基酸序列，并包含相对于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中分别所述的氨基酸序列的至少一个氨基酸修饰，其中，所述多肽能够与FAM19A5蛋白结合，从而抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用。
61.根据权利要求60所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述至少一个氨基酸修饰增加了所述多肽与FAM19A5蛋白的结合。
62.根据权利要求60或61所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述至少一个氨基酸修饰增加了所述多肽的稳定性。
63.根据权利要求61或62所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述结合和/或稳定性的增加提高了所述多肽抑制、减少和/或解离所述FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的能力。
64.根据权利要求63所述的LRRC4家族模拟分子，其中，与不具备所述至少一个氨基酸修饰的相应的多肽相比，所述多肽抑制、减少和/或解离FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的能力增加了至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
65.根据权利要求60-64中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第453位氨基酸残基为T或修饰为S或Y。
66.根据权利要求60-65中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第454位氨基酸残基为T或修饰为S或Y。
67.根据权利要求60-66中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第449位氨基酸残基为Y或修饰为F、V、L、I、W或M。
68.根据权利要求60-67中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第450位氨基酸残基为T或修饰为S或Y。
69.根据权利要求60-68中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第451位氨基酸残基为Y或修饰为F或W。
70.根据权利要求60-69中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第452位氨基酸残基为F或修饰为Y或W。
71.根据权利要求60-70中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第455位氨基酸残基为V或修饰为I、Y、F、L、W或M。
72.根据权利要求60-71中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第456位氨基酸残基为T或修饰为S或Y。
73.根据权利要求60-72中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第457位氨基酸残基为V或修饰为I、Y、F、L、W或M。
74.根据权利要求60-73中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，SEQ ID NO:5第458位氨基酸残基为E或修饰为D、V、I、Y、F、M或W。
75.根据权利要求60-74中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，一个或多个氨基酸残基以D型形式存在。
76.根据权利要求75所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述D型氨基酸位于N端、C端或N端和C端。
77.根据权利要求60-76中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子与一个部分偶联。
78.根据权利要求77所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述部分能够增加多肽的以下一种或多种性质：(1)与FAM19A5蛋白的结合亲和力，(2)溶解性，(3)对蛋白酶和/或肽酶降解的抗性，(4)体内给药的适宜性，(5)抑制FAM19A5-LRRC4蛋白家族成员相互作用的能力，或(6)(1)-(5)的任何组合。
79.根据权利要求77或78所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述部分包含LRRC4蛋白家族成员的近膜序列。
80.根据权利要求79所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述近膜包含SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)或SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的序列。
81.根据权利要求79所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述近膜由SEQ ID NO:151(LDEVMKTTK)或SEQ ID NO:152(IDEVMKTTK)中所述的序列组成。
82.根据权利要求1-81中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子不包含LRRC4蛋白家族成员的跨膜结构域和/或细胞内结构域。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，所述模拟分子能够与LRRC4蛋白家族成员竞争与FAM19A5蛋白结合。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述LRRC4蛋白家族成员包括LRRC4蛋白、LRRC4B蛋白、LRRC4C蛋白或其组合。
85.根据权利要求10-84中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，进一步包含位于所述多肽的N端、所述多肽的C端或所述多肽的N端和C端处的一个或多个额外氨基酸。
86.根据权利要求85所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述一个或多个额外氨基酸为亲水性氨基酸。
87.根据权利要求85或86所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述一个或多个额外氨基酸为D-氨基酸。
88.根据权利要求10-87中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述多肽的N端、C端或N端和C端包含增加所述多肽稳定性的修饰。
89.根据权利要求88所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述修饰包含芴甲氧羰基、聚乙二醇化、乙酰化、甲基化、环化或其组合。
90.根据权利要求10-89中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，所述分子为融合蛋白。
91.根据权利要求10-90中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，进一步包含半衰期延长部分。
92.根据权利要求91所述的LRRC4家族模拟分子，其中，所述半衰期延长部分包含Fc、白蛋白、白蛋白结合多肽、Pro/Ala/Ser(PAS)、人绒毛膜促性腺激素β亚基C端肽CTP、聚乙二醇PEG、长非结构化亲水性氨基酸序列XTEN、羟乙基淀粉HES、白蛋白结合小分子或其组合。
93.一种编码权利要求10-92中任一项所述的LRRC4家族模拟分子的核酸。
94.根据权利要求93所述的核酸，所述核酸为DNA或RNA。
95.根据权利要求94所述的核酸，所述核酸为mRNA。
96.根据权利要求93-95中任一项所述的核酸，包含核酸类似物。
97.一种载体，包含权利要求93-96中任一项所述的核酸。
98.一种细胞，包含权利要求97所述的载体。
99.一种蛋白质偶联物，包含权利要求10-92中任一项所述的LRRC4家族模拟分子，与药剂连接。
100.一种组合物，包含权利要求1-92中任一项所述的LRRC4家族模拟分子、权利要求93-96中任一项所述的核酸、权利要求97所述的载体、权利要求98所述的细胞或权利要求99所述的蛋白质偶联物。
101.根据权利要求100所述的组合物，进一步包含药学上可接受的载体。
102.一种试剂盒，包含权利要求1-92中任一项所述的LRRC4家族模拟分子、权利要求93-96中任一项所述的核酸、权利要求97所述的载体、权利要求98所述的细胞、权利要求99所述的蛋白质偶联物，或权利要求100或101所述的组合物，以及使用说明书。
103.一种产生能够抑制、减少和/或解离FAM19A5蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间相互作用的分子的方法，包括：在合适的条件下合成权利要求1-9中任一项所述的分子，或培养权利要求98所述的细胞，以产生所述分子。
104.根据权利要求103所述的方法，进一步包括：分离已经产生的分子。
105.一种增加神经元突起生长和/或突触形成的方法，包括：使神经元与权利要求1-92中任一项所述的LRRC4家族模拟分子、权利要求93-96中任一项所述的核酸、权利要求97所述的载体、权利要求98所述的细胞、权利要求99所述的蛋白质偶联物或权利要求100或101所述的组合物接触。
106.根据权利要求105所述的方法，其中，所述接触发生在有需要受试者体内。
107.根据权利要求106所述的方法，包括：在接触前向受试者施用LRRC4家族模拟分子、核酸、载体、细胞、蛋白质偶联物或组合物。
108.根据权利要求107所述的方法，其中，所述接触发生在体外。
109.根据权利要求105-108中任一项所述的方法，其中，与参照组(例如，未接触的相应神经元中的突起生长)相比，所述接触使神经元突起生长增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
110.根据权利要求105-109中任一项所述的方法，其中，与参照组(例如，未接触的相应神经元中的突触形成)相比，所述接触使神经元突触形成增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
111.根据权利要求105-110中任一项所述的方法，其中，突起生长和/或突触形成的增加减少了与选自以下疾病的一种疾病或病症相关的一种或多种症状：肌萎缩侧索硬化症ALS、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。
112.一种在有需要受试者中抑制或减少FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的方法，包括：向受试者施用权利要求1-92中任一项所述的LRRC4家族模拟分子、权利要求93-96中任一项所述的核酸、权利要求97所述的载体、权利要求98所述的细胞、权利要求99所述的蛋白质偶联物或权利要求100或101所述的组合物。
113.根据权利要求112所述的方法，其中，在给药后，FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物的形成减少了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。
114.根据权利要求112或113所述的方法，其中，FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的减少增加了受试者中LRRC4蛋白家族成员的活性。
115.一种治疗有需要受试者的疾病或病症的方法，包括：向受试者施用权利要求1-92中任一项所述的LRRC4家族模拟分子、权利要求93-96中任一项所述的核酸、权利要求97所述的载体、权利要求98所述的细胞、权利要求99所述的蛋白质偶联物或权利要求100或101所述的组合物，其中，所述疾病或病症选自肌萎缩侧索硬化症ALS、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。
116.一种增加神经元突起生长和/或突触形成的方法，包括：使神经元与富含亮氨酸重复序列4(“LRRC4”)家族模拟分子接触，其中，所述LRRC4家族模拟分子能够抑制、减少和/或解离序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用，其中，所述LRRC4家族模拟分子是选自以下物质的小分子：
或其药学上可接受的盐。
117.根据权利要求116所述的方法，其中，所述接触发生在有需要受试者体内。
118.根据权利要求117所述的方法，包括：在所述接触之前向所述受试者施用所述LRRC4家族模拟分子。
119.根据权利要求118所述的方法，其中，所述接触发生在体外。
120.根据权利要求116-119中任一项所述的方法，其中，与参照组(例如，未接触的相应神经元中的突起生长)相比，所述接触使神经元突起生长增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
121.根据权利要求116-120中任一项所述的方法，其中，与参照组(例如，未接触的相应神经元中的突触形成)相比，所述接触使神经元突触形成增加至少约0.5倍、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。
122.根据权利要求116-121中任一项所述的方法，其中，突起生长和/或突触形成的增加减少了与选自以下疾病的一种疾病或病症相关的一种或多种症状：肌萎缩侧索硬化症ALS、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。
123.一种在有需要受试者中抑制或减少FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的方法，包括：向受试者施用富含亮氨酸重复序列4(“LRRC4”)家族模拟分子，其中，所述LRRC4家族模拟分子能够抑制、减少和/或解离序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用，其中，所述LRRC4家族模拟分子是选自以下物质的小分子：
或其药学上可接受的盐。
124.根据权利要求123所述的方法，其中，在给药后，FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物的形成减少了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。
125.根据权利要求123或124所述的方法，其中，FAM19A5蛋白和LRRC4蛋白家族成员之间复合物形成的减少增加了受试者中LRRC4蛋白家族成员的活性。
126.一种治疗有需要受试者的疾病或病症的方法，包括：向受试者施用富含亮氨酸重复序列4(“LRRC4”)家族模拟分子，其中，所述LRRC4家族模拟分子能够抑制、减少和/或解离序列相似家族19成员A5(“FAM19A5”)蛋白与LRRC4蛋白家族成员之间的相互作用，其中，所述LRRC4家族模拟分子是选自以下物质的小分子：
或其药学上可接受的盐，其中，所述疾病或病症选自肌萎缩侧索硬化症ALS、阿尔茨海默病、青光眼、糖尿病性视网膜病变、神经性疼痛、脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、帕金森病或其组合。
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