ES2324766T3 - Inhibidores de spla2 contra la arteriosclerosis. - Google Patents
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Abstract
Uso de un compuesto inhibidor de las sPLA2 de los grupos V o X representado por la fórmula general (I):** ver fórmula** donde el anillo A es:** ver fórmula** donde cualquiera de R 1 y R 2 es un grupo de fórmula: -(L 1 )-(grupo ácido) donde L 1 es un grupo de enlace al grupo ácido y la longitud del enlace es de 1-5, y el otro es un átomo de hidrógeno, o un substituyente no interfiriente, o -(L 1 )-(grupo ácido) donde L 1 es como se ha definido anteriormente; y cada uno de R 3 y R 4 es independientemente un átomo de hidrógeno, un substituyente no interfiriente, un grupo carbocíclico, un grupo carbocíclico substituido por un substituyente no interfiriente, un grupo heterocíclico o un grupo heterocíclico substituido por un substituyente no interfiriente; y donde -B- es un grupo entre (e)-(h): ** ver fórmula** donde R 5 es un substituyente seleccionado entre el grupo consistente en (j) un grupo alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C 2-C 20 o carbocíclico o un grupo heterocíclico; (k) un grupo (j) como se ha descrito antes que está substituido por uno o más substituyentes no interfirientes, cada uno de los cuales es independientemente seleccionado; o un grupo de fórmula: -(L 2 )-R 8 en el que L 2 es un grupo de enlace divalente de 1-18 átomos seleccionados entre un átomo de hidrógeno, un átomo de nitrógeno, un átomo de carbono, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre, y R 8 es un grupo seleccionado entre (j) y (k); R 6 es un átomo de hidrógeno, un halógeno, un alquilo C1-C3, un cicloalquilo C3-C4, un cicloalquenilo C3-C4, un alquiloxi C1-C3 o un alquiltío C1-C3; R 7 es un átomo de hidrógeno o un substituyente no interfiriente; R A es un grupo de fórmula: ** ver fórmula** donde cada uno de R 9 y R 10 es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo C1-C3 o un halógeno; cada uno de X e Y es independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; y Z es -NH2 o -NHNH2; R B es -CONH 2 o -CONHNH 2; y el anillo D es un anillo de ciclohexeno o un anillo de benceno; a condición de que, cuando -B- es un grupo (e) o (f), entonces el anillo A sea un anillo (b) o (c); o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato o un éster de alquilo C1-C6 del mismo, para la fabricación de un medicamento para suprimir la degeneración de las lipoproteínas del suero y/o tratar o prevenir la arteriosclerosis y/o tratar o prevenir una enfermedad isquémica basada en la arteriosclerosis.
Description
Inhibidores de sPLA_{2} contra la
arteriosclerosis.
La presente invención se relaciona con el uso de
inhibidores de la fosfolipasa A_{2} secretora del grupo V o X
para la fabricación de un medicamento para suprimir la degeneración
de las lipoproteínas séricas y/o para tratar o prevenir la
arteriosclerosis y/o tratar o prevenir la enfermedad isquémica
basada en arteriosclerosis.
La arteriosclerosis es un término general que
significa una patología en la que la pared arterial se engrosa y
endurece. La lesión arteriosclerótica se clasifica patológicamente
en los tres tipos siguientes: aterosclerosis, arteriosclerosis
arteriolar y necrosis medial, y, entre ellos, se ha destacado la
aterosclerosis en las causas de enfermedades isquémicas tales como
el infarto de miocardio y el infarto cerebral. La hiperlipemia, que
es una condición en la cual el nivel de lípidos séricos, tales como
el colesterol y las grasas neutras en suero, está aumentado, está
estrechamente asociada al desarrollo de aterosclerosis. Los lípidos
séricos aparecen como lipoproteínas que forman complejos con una
proteína. Concretamente, las lipoproteínas que contienen colesterol
se clasifican dependiendo de la densidad en lipoproteína de muy baja
densidad ("VLDL"), lipoproteína de baja densidad ("LDL"),
lipoproteína de alta densidad ("HDL") y similares. Entre ellas,
la LDL es captada por células de los tejidos periféricos a través
del receptor de LDL y es responsable de la administración de
colesterol a las células.
Las LDL en la fase inicial de la aterosclerosis
se degeneran de cualquier modo para inducir lípidos peroxidados,
con implicación de una mayor carga negativa de las partículas
totales, composición alterada por fosfolipolisis y alteración
estructural, disminución de tamaño (aumento de densidad) y
similares, en comparación con las LDL normales (Yokode y col.,
Rinshokensa 44, 1052-1058 (2000)), y las LDL
degeneradas son captadas por monocitos y macrófagos que se
infiltran en los tejidos de la íntima vascular mediante receptores
capturadores, depositando así gotitas oleosas de ésteres de
colesterilo en las células espumosas y acelerando la formación de
franjas grasas en asociación con los linfocitos T y el músculo liso
vascular. A continuación, la patología continúa por interacción
entre las células que residen en la franja grasa para formar
lesiones rígidas que sobresalen en las luces vasculares, llamadas
placas fibrosas, y se desarrolla entonces para producir
aterosclerosis, que se asocia a calcificación y sucesos
trombóticos, con aumento de los tejidos conectivos circundantes. Por
otra parte, las HDL desempeñan un papel en el suministro de un
exceso de colesterol de los tejidos periféricos al hígado y son
responsables de la supresión del desarrollo de la arteriosclerosis.
Así, en caso de que el nivel de HDL en sangre esté disminuido o de
que la HDL esté degenerada, entonces las funciones de la HDL están
disminuidas y el nivel de colesterol liberado en sangre aumenta, lo
cual es uno de los factores etiológicos de la arteriosclerosis.
Como se ha mostrado anteriormente, la
degeneración o la alteración cualitativa de las lipoproteínas tales
como la LDL y la HDL son uno de los factores etiológicos mayores en
el desarrollo de la arteriosclerosis. Como degeneración, se conoce
la modificación oxidativa, donde las LDL oxidadas aumentan su carga
negativa, disminuida, y aumentan su densidad. Se ha pensado que la
modificación oxidativa es responsable del desarrollo de la
patología arteriosclerótica, ya que se detectan las LDL oxidadas en
las lesiones arterioscleróticas reales y las LDL artificialmente
oxidadas inducen espumación del macrófago y activan las células para
promover la producción de diversas citokinas.
Por otra parte, se ha visto que la composición
de fosfolípidos en las LDL degeneradas está alterada
(fosfolipolisis) y, por lo tanto, este descubrimiento ha centrado
la atención en una enzima fosfolipolítica, la fosfolipasa A_{2}
(PLA_{2}) como molécula responsable de la degeneración de LDL y
HDL. Fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}; EC 3.1.1.4) es un término
general que representa una enzima fosfolipolítica que hidroliza el
enlace éster de 2-acilo de los
3-sn-fosfoglicéridos. Entre ellas, la PLA_{2} secretora
(sPLA_{2}) representa moléculas de PLA_{2} que tienen un peso
molecular inferior (13-18 kDa) y que se segregan
extracelularmente y que se sabe incluyen ocho tipos de grupos IB,
IIA, IID, IIE, IIF, V, X, y XII en humanos. Cualquiera de las
especies moleculares contiene de 12 a 16 residuos de Cys en su
estructura, que forman enlaces disulfuro intramoleculares, y
contiene el centro activo conservado compuesto por residuos de
His-Asp. También contienen el sitio común de unión
a Ca^{2+} y requieren un nivel de Ca^{2+} de orden mM para
expresar la actividad enzimática (Ishizaki y col., J. Biol. Chem.
274, 24973-24979 (1999); Suzuki y col., J. Biol.
Chem. 275, 5785-5793 (2000); Six y col., Biochim.
Biophys. Acta 1488, 1-19 (2000); y Gelb y col., J.
Biol. Chem. 275, 39823-39826 (2000)). Se vio que la
sPLA_{2} del Grupo IIA se expresaba en los músculos lisos
vasculares y las células espumosas en lesiones arterioscleróticas
humanas y se ha reconocido que la expresión guarda correlación con
el desarrollo de arteriosclerosis (Elinder y col., Arterioscler.
Thromb. Vase. Biol. 17, 2257-2263 (1997), y
Menschikowski y col., Atherosclerosis 118, 173-181
(1995)). Además, se vio que en ratones transgénicos que expresan un
alto nivel de sPLA_{2} del Grupo IIA humana aumentaba el nivel de
LDL y disminuía el nivel de HDL y que tenían lesiones
arterioscleróticas (Tietge y col., J. Biol. Chem. 275,
10077-10084 (2000)), así como que se producía un
deterioro de la arteriosclerosis en comparación con ratones normales
cuando se administraba una dieta rica en grasas (Ivandic y col.,
Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19, 1284-1290
(1999)), por lo que la sPLA_{2} del Grupo IIA atrajo la atención
en la contribución al desarrollo de la arteriosclerosis. Se ha visto
también que las LDL tratadas con sPLA_{2} de veneno de abeja
tienen una mayor carga negativa de la partícula total, una
composición de fosfolípidos alterada y una mayor captación por los
macrófagos (Aviram y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 185,
465-472 (1992)) y que tienen caracterizaciones muy
similares a las LDL de pequeña densidad, que se consideran como uno
de los factores de riesgo de las enfermedades isquémicas (Sartipy y
col., J. Biol. Chem. 274, 25913-25920 (1999)).
Además, se sabe que las HDL tratadas con sPLA_{2} de veneno de
serpiente tienen un tamaño y una densidad alterados en asociación
con la fosfolipolisis y que tienen una mayor captación por los
hepatocitos (Collet y col., Biochim. Biophys. Acta 1043,
301-310 (1990)). Aunque entre las moléculas de
sPLA_{2} humana la sPLA_{2} del grupo IIA tiene particularmente
una potencia hidrolizante para los fosfolípidos de las
lipoproteínas como se ha descrito anteriormente, se ha visto que la
sPLA_{2} del grupo IIA es extremadamente más débil en cuanto a
fosfolipolisis para la LDL que la sPLA_{2} del veneno de abeja
(Hurt-Camejo y col., Curr. Opin. Lipidol. 11,
465-471 (2000)) y que es más potente en cuanto a
fosfolipolisis para la HDL que para la LDL (Pruzanski y col., J.
Lipid. Res. 39, 2150-2160 (1998)). A la vista de
estos descubrimientos, especies moleculares de sPLA_{2} distintas
de la sPLA_{2} del grupo IIA serían responsables del desarrollo
de arteriosclerosis y no se sabe qué molécula de sPLA_{2} endógena
sería responsable del desarrollo de arteriosclerosis, lo que
muestra que se desconoce la actividad exacta de degeneración
de estas moléculas de sPLA_{2} sobre las lipoproteínas y sus perfiles exactos de expresión en la arteriosclerosis.
de estas moléculas de sPLA_{2} sobre las lipoproteínas y sus perfiles exactos de expresión en la arteriosclerosis.
Se clonó sPLA_{2} del grupo X humana a partir
de tejidos pulmonares fetales en 1997 en base a secuencias
relacionadas con sPLA_{2} de la base de datos de ADN (Cupillard y
col., J. Biol. Chem. 272, 15745-15752 (1997)). El
gen de la sPLA_{2} del grupo X humana se localiza en el cromosoma
16, a diferencia de las otras sPLA_{2}. La enzima contiene 16
residuos de cisteína en la molécula y contiene todas las uniones
disulfuro intramoleculares localizadas en posiciones
características tanto de la sPLA_{2} del grupo IB como de la
sPLA_{2} del grupo II (grupos IIA/IID/IIE/IIF). Adicionalmente, la
enzima posee una estructura de extensión basada en el extremo
carboxilo única de la sPLA_{2} del grupo II. La sPLA_{2} del
grupo X existe en dos especies moleculares, una de las cuales es
una forma inactiva, o proforma, que posee una secuencia propeptídica
consistente en 11 residuos de aminoácidos unida al extremo N, y la
otra de las cuales es una forma activa que se produce por escisión
y deleción de la secuencia propeptídica con una proteasa, tal como
tripsina (Morioka y col., Arch. Biochem. Biophys. 381,
31-42 (2000)). Se ha visto que la sPLA_{2} del
grupo X activa tiene una actividad enzimática más potente que otras
sPLA_{2} de mamíferos, tales como las sPLA_{2} de los grupos IB
y IIA, independientemente del tipo y de la propiedad de los
substratos, fosfolípidos, y además que tiene actividades mucho más
potentes de liberación de ácidos araquidónicos de las membranas
celulares en contacto con las células y de producción de mediadores
lipídicos, tales como eicosanoides y lisofosfolípidos, que la
sPLA_{2} de los grupos IB y IIA (Hanasaki y col., J. Biol. Chem.
274, 34203-34211 (1999); Saiga y col., Biochim.
Biophys. Acta 1530, 67-76 (2001)). El análisis
inmunohistoquímico utilizando los anticuerpos específicos reveló
que la sPLA_{2} del grupo X se expresa en células epiteliales
alveolares de tipo II y macrófagos esplénicos y que su expresión se
acelera en células de cáncer de colon humanas, lo que sugiere que la
enzima sería responsable de respuestas inflamatorias e
inmunológicas, así como de la aparición y el desarrollo de cánceres
de colon (Morioka y col., FEBS Lett. 487, 262-266
(2000)). Sin embargo, dado que ninguna publicación describe la
actividad de degeneración de la sPLA_{2} del grupo X sobre
lipoproteínas y su expresión en las lesiones arterioscleróticas, no
se ha sabido que la enzima fuera responsable de la aparición y el
desarrollo de la arteriosclerosis.
Se clonó sPLA_{2} del grupo V humana en 1994
(Chen y col., J. Biol.Chem., 1994, 269, 2365-2368).
El gen de la sPLA_{2} del grupo V humana se localiza en el
cromosoma 1, al igual que la sPLA_{2} del grupo IIA. La enzima
contiene 12 residuos de cisteína en la molécula, lo cual es inferior
a la sPLA_{2} del grupo IIA en dos residuos, y no contiene
estructura de extensión basada en el extremo carboxilo como la que
se encuentra en la sPLA_{2} del grupo II. La expresión de la
sPLA_{2} del grupo V se detecta principalmente en el corazón, así
como en el pulmón y en células inflamatorias, tales como las células
cebadas y los macrófagos, y en tales células se sabe que la enzima
conlleva la producción de mediadores lipídicos (Makoto Murakami,
Ichirou Kudou, Gendaiiryou, 2000, 32, 517-548). Sin
embargo, como ninguna publicación describe la actividad degenerativa
de la sPLA_{2} del grupo V sobre lipoproteínas, no se ha sabido
que la enzima fuera responsable de la aparición y el desarrollo de
la arteriosclerosis.
Los inventores de la presente solicitud
investigaron las actividades fisiológicas de la sPLA_{2} humana
del grupo V o X y vieron que estas enzimas exhiben una potencia que
libera intensamente ácidos grasos del fosfolípido comprendido en
lipoproteínas en la sangre.
En base al descubrimiento, los inventores
demostraron que los compuestos que inhiben la sPLA_{2} del grupo
V y/o X suprimen la actividad degenerativa de la sPLA_{2} del
grupo V o X sobre las lipoproteínas del suero, logrando así la
presente invención.
Para compuestos que inhiben la sPLA_{2},
EP-620214 (Publicación de Patente Japonesa (kokai)
Nº 7-010838, US-5578634),
EP-620215 (Publicación de Patente Japonesa (kokai)
Nº 7-025850, US-5684034),
EP-675110 (Publicación de Patente Japonesa (kokai)
Nº 7-285933, US-5654326), WO96/03120
(Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº
10-505336), WO96/03376 (Publicación de Patente
Japonesa (kokai) Nº 10-503208,
US-5641800), WO96/03383 (Publicación de Patente
Japonesa (kokai) Nº 10-505584), WO97/21664
(EP-779271), WO97/21716 (EP-779273),
WO98/18464 (EP839806), WO98/24437 (EP846687), WO98/24756,
WO98/24794, WO98/25609, WO99/51605 y WO99/59999 describen algunos
compuestos; Roberts M.F. y col., J. Biol. Chem. 1977, 252,
2405-2411 describen el bromuro de
p-bromofenacilo; Vadas P. y col., Lab. Invest.
1986, 55, 391-404 describen la mepacrina; Lombardo
D. y col., J. Biol. Chem. 1985, 260, 7234-7240
describen la manoalida; y Yoshida T. y col., J. Antibiotics. 1991,
44, 1467-1470 describen la tielocina A1; y Hanasaki
K. y col., J.Biol.Chem. 26 de Nov. de 1999; 274 (48):
34203-11, y Suzuki N y col., J.Biol.Chem. 2000 Feb
25; 275 (8): 5785-93, describen el indoxam. Sin
embargo, ninguna publicación describe que los compuestos que
inhiben la sPLA_{2} según se describe en ellas tengan alguna
actividad inhibidora sobre la degeneración de las lipoproteínas del
suero.
La presente invención ha sido lograda en base a
los hallazgos antes mostrados.
Específicamente, la presente invención se
relaciona con el uso de un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del
grupo V o X representado por la fórmula general (I):
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donde
el anillo A es:
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donde cualquiera de R^{1} y
R^{2} es un grupo de fórmula: -(L^{1})-(grupo ácido) donde
L^{1} es un grupo de enlace al grupo ácido y la longitud del
enlace es de 1-5, y el otro es un átomo de
hidrógeno, o un substituyente no interfiriente, o -(L^{1})-(grupo
ácido) donde L^{1} es como se ha definido anteriormente;
y
cada uno de R^{3} y R^{4} es
independientemente un átomo de hidrógeno, un substituyente no
interfiriente, un grupo carbocíclico, un grupo carbocíclico
substituido por un substituyente no interfiriente, un grupo
heterocíclico o un grupo heterocíclico substituido por un
substituyente no interfiriente; y
-B- es un grupo entre (e)-(h):
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donde
R^{5} es un substituyente seleccionado entre
el grupo consistente en (j) un grupo alquilo
C_{1}-C_{20}, alquenilo
C_{2}-C_{20}, alquinilo
C_{2}-C_{20} o carbocíclico o un grupo
heterocíclico; (k) un grupo (j) como se ha descrito antes que está
substituido por uno o más substituyentes no interfirientes, cada uno
de los cuales es independientemente seleccionado; o un grupo de
fórmula: -(L^{2})-R^{8} en el que L^{2} es un
grupo de enlace divalente de 1-18 átomos
seleccionados entre un átomo de hidrógeno, un átomo de nitrógeno,
un átomo de carbono, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre, y
R^{8} es un grupo seleccionado entre (j) y (k);
R^{6} es un átomo de hidrógeno, un halógeno,
un alquilo C_{1}-C_{3}, un cicloalquilo
C_{3}-C_{4}, un cicloalquenilo
C_{3}-C_{4}, un alquiloxi
C_{1}-C_{3} o un alquiltío
C_{1}-C_{3};
R^{7} es un átomo de hidrógeno o un
substituyente no interfiriente;
R^{A} es un grupo de fórmula:
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donde cada uno de R^{9} y
R^{10} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo
C_{1}-C_{3} o un halógeno; cada uno de X y Y es
independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; y Z es
-NH_{2} o
-NHNH_{2};
R^{B} es -CONH_{2} o -CONHNH_{2}; y
el anillo D es un anillo de ciclohexeno o un
anillo de benceno;
a condición de que, cuando -B- es un grupo (e) o
(f), entonces el anillo A sea un anillo (b) o (c);
o una sal farmacéuticamente aceptable o un
solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del
mismo, para la fabricación de un medicamento para suprimir la
degeneración de las lipoproteínas del suero y/o tratar o prevenir
la arteriosclerosis y/o tratar o prevenir una enfermedad isquémica
basada en la arteriosclerosis.
Preferiblemente, el compuesto inhibidor de la
sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I)
en la que
R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo de
fórmula: -(L^{3})-R^{11} donde L^{3} es
-OCH_{2}-, -SCH_{2}-, -NH-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-,
-O-CH(CH_{3})- o
-O-CH-(CH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5})-, y R^{11}
es -COOH, -CONHSO_{2}C_{6}H_{5}, -SO_{3}H o
-P(O)(OH)_{2}; y
R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo de
fórmula: -(L^{4})-R^{12} donde L^{4} es un
grupo de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
donde cada uno de R^{13} y
R^{14} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo
C_{1}-C_{10}, un aralquilo
C_{1}-C_{10}, un carboxi, un alquiloxicarbonilo
o un halógeno; y R^{12} es -COOH, -SO_{3}H o
-P(O)(OH)_{2},
a condición de que R^{1} y R^{2} no sean un
átomo de hidrógeno simultáneamente; o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del mismo o una sal
farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
\newpage
Más preferiblemente, el compuesto inhibidor de
la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general
(I) en la que
R^{3} es un átomo de hidrógeno, un alquilo
C_{1}-C_{6}, un cicloalquilo
C_{3}-C_{6}, un arilo o un grupo heterocíclico,
y R^{4} es un átomo de hidrógeno o un halógeno; o un profármaco
del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto inhibidor de la
sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I)
en la que
R^{5} es un grupo
-(CH_{2})_{1-6}-R^{15},
donde R^{15} es un grupo de fórmula:
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donde cada uno de b, d, f, h, j, m
y o es independientemente un número entero de 0 a 2; cada uno de
R^{16} y R^{17} es un grupo seleccionado independientemente
entre un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{10}, un
alquiloxi C_{1}-C_{10}, un alquiltío
C_{1}-C_{10}, un ariloxi, un fenilo y un
haloalquilo C_{1}-C_{10}; \alpha es un átomo
de oxígeno o un átomo de azufre; \beta es -CH_{2}- o
-(CH_{2})_{2}-; \gamma es un átomo de oxígeno o un
átomo de azufre; c, i y p son un número entero de 0 a 5; e es un
número entero de 0 a 7; g es un número entero de 0 a 4; y cada uno
de k y n es independientemente un número entero de 0 a 3; o un
éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal
farmacéuticamente aceptable o un solvato de
éstos.
\newpage
Incluso mucho más preferiblemente, el compuesto
inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la
fórmula general (I) en la cual
R^{5} es un grupo de
-CH_{2}-R^{18}, donde R^{18} es un grupo de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
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donde \beta es -CH_{2}- o
-(CH_{2})_{2}-; R^{19} es un átomo de hidrógeno, un
alquilo C_{1}-C_{3} o un halógeno; y E es un
enlace sencillo, -CH_{2}-, o
-O-;
o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del mismo o una sal
farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto
inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la
fórmula general (I) en la que R^{1} es -OCH_{2}COOH, o un éster
de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una sal
farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto
inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la
fórmula general (I) en la que R^{2} es un átomo de hidrógeno, o un
éster de alquilo C_{1}-C_{6} del mismo o una
sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto
inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la
fórmula general (I) en la que R^{6} es un alquilo
C_{1}-C_{3}; o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del mismo o una sal
farmacéuticamente aceptable o un solvato de éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto
inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la
fórmula general (I) en la que R^{A} es -CH_{2}CONH_{2} o
-COCONH_{2}; o un éster de alquilo C_{1}-C_{6}
del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de
éstos.
Incluso más preferiblemente, el compuesto
inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} o una sal farmacéuticamente
aceptable o un solvato de
éstos.
Específicamente, el compuesto inhibidor de la
sPLA_{2} del grupo V es mostrado por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} o una sal farmacéuticamente
aceptable o un solvato de
éstos.
\newpage
Alternativamente, el compuesto inhibidor de la
sPLA_{2} del grupo X es mostrado por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del mismo o una sal
farmacéuticamente aceptable o un solvato de
éstos.
La Fig. 1 representa un gráfico que muestra la
liberación dosis-dependiente de ácido araquidónico
de LDL inducida por sPLA_{2} del grupo IB, IIA y X (a 37ºC
durante una hora).
La Fig. 2 representa un gráfico que muestra los
efectos de los inhibidores sobre la liberación de ácido araquidónico
de LDL inducida por sPLA_{2} del grupo X (inhibidor de
sPLA_{2}: indoxam, inhibidor de COX: indometacina, inhibidor de
5-LOX: AA-861, cada uno a 10
\mumol/L; los resultados son expresados como porcentaje de ácido
araquidónico liberado por la sPLA_{2} del grupo X en ausencia de
inhibidores).
La Fig. 3 representa un gráfico que muestra
cambios en los contenidos de un fosfolípido mayor de LDL, la
fosfatidilcolina (FC) (Fig. 3A) y su lisoforma
(liso-FC) (Fig. 3B) cuando la LDL reacciona con las
sPLA_{2} del grupo IB, IIA y X y CuSO_{4} durante 3, 6 y 24
horas.
La Fig. 4 representa un substituto fotográfico
de dibujo que muestra los resultados del análisis de electroforesis
en gel de agarosa para la carga eléctrica de la LDL sometida a las
reacciones con sPLA_{2} del grupo IB, IIA y X y CuSO_{4}
durante 3, 6 y 24 horas (parte superior: cátodo, parte inferior:
ánodo).
La Fig. 5 representa un gráfico que muestra
cambios en la peroxidación del lípido contenido en la LDL (A) y la
HDL (B) sometidas a reacciones con sPLA_{2} del grupo IB, IIA y X
y CuSO_{4} durante 3, 6 y 24 horas, donde se expresan las
substancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (SRATB) en términos
de malondialdehído (MDA).
La Fig. 6 representa un gráfico que muestra la
reducción en el eflujo de colesterol inducido por HDL degenerada
por sPLA_{2} del grupo X. La adición de HDL no degenerada (HDL
natural) al medio redujo significativamente el nivel de éster de
colesterol intracelular en comparación con el medio solo, mientras
que la adición de HDL degenerada con el grupo X
(X-HDL) suprimió significativamente la
reducción.
La Fig. 7 representa un gráfico que muestra la
liberación de ácidos grasos dependiente del tiempo de la LDL
inducida por sPLA_{2} del grupo IIA o V (a 37ºC, adición de 50
nmol/L de sPLA_{2}).
La Fig. 8 representa un gráfico que muestra los
efectos de inhibidores sobre la liberación de ácido linoleico de la
LDL inducida por sPLA_{2} del grupo V (inhibidor de sPLA_{2}:
indoxam, inhibidor de COX: indometacina, cada uno a 10 \muM; los
resultados son expresados como porcentaje de ácido linoleico
liberado por sPLA_{2} del grupo V en ausencia de
inhibidores).
La Fig. 9 representa un gráfico que muestra los
cambios en los contenidos de un fosfolípido mayor de la LDL, la
fosfatidilcolina (FC) (A) y su lisoforma (liso-FC)
(B), cuando la LDL reacciona con sPLA_{2} del grupo IIA y V o
CuSO_{4} durante 24 horas (a 37ºC, adición de 50 nmol/L de
sPLA_{2}).
La Fig. 10 representa un substituto fotográfico
de dibujo que muestra los resultados del análisis de electroforesis
en gel de agarosa para la carga eléctrica de la LDL sometida a
reacciones con sPLA_{2} del grupo V durante 3, 6 y 24 horas
(parte superior: cátodo, parte inferior: ánodo).
Los inventores de la presente invención vieron
que las sPLA_{2} del grupo V y X humanas liberan potentemente
ácidos grasos de los fosfolípidos de las lipoproteínas de la sangre.
Además, los inventores mostraron que la sPLA_{2} del grupo V y/o
X es muy potente en cuanto a la degeneración de la LDL y de la HDL,
incluyendo la fosfolipolisis, la liberación de ácidos grasos, la
producción de lisofosfolípidos, el aumento de la carga negativa y
la captación por macrófagos, por comparación con la sPLA_{2} del
grupo IB y del IIA, y vieron que estas acciones de las sPLA_{2}
del grupo V y X difieren de las acciones degenerativas de las
lipoproteínas causadas por oxidación anteriormente descritas. En
este contexto, el término "degeneración de las lipoproteínas
séricas" según la presente invención se refiere a la
fosfolipolisis, a la liberación de ácidos grasos, a la producción
de lisofosfolípidos, al aumento de carga negativa, a la captación
por macrófagos y similares y no incluye la degeneración por
oxidación.
"Un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del
grupo V y/o X" o "un inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o
X", tal como se usa en la invención y se define en la
reivindicación 1, incluye un compuesto que inhibe la sPLA_{2} del
grupo V, un compuesto que inhibe la sPLA_{2} del grupo X y un
compuesto que tiene actividad inhibidora sobre las sPLA_{2} de
los grupos tanto V como X. En una realización, la presente invención
incluye una composición farmacéutica que contiene tanto un
compuesto que inhibe la sPLA_{2} del grupo V como un compuesto
que inhibe la sPLA_{2} del grupo X como ingredientes activos.
Los inventores vieron también que la sPLA_{2}
del grupo X se expresa en las células espumosas en lesiones
vasculares en un modelo patológico animal de arteriosclerosis
mediante el empleo de un anticuerpo específico para la sPLA_{2}
del grupo X. Así, la presente invención incluye una composición
farmacéutica para el tratamiento o la prevención de la
arteriosclerosis o para el tratamiento o la prevención de una
enfermedad isquémica basada en arteriosclerosis, que contiene un
compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X como
ingrediente activo. El término "arteriosclerosis", tal como se
usa aquí, es un término general que significa una patología en la
cual la pared arterial se engrosa y endurece y se refiere a
cualquier condición patológica que dé lugar a un ataque isquémico
cerebral, a infarto cerebral, a angina de pecho, a infarto de
miocardio y a claudicación intermitente, todos ellos causados por
constricción y oclusión de la arteria. Según la presente invención,
se trata preferiblemente la aterosclerosis entre las
arteriosclerosis. El término "enfermedad isquémica basada en
arteriosclerosis", tal como se usa aquí, se refiere a una
enfermedad isquémica causada por, o asociada a, arteriosclerosis.
Las enfermedades isquémicas incluyen, en general, diversas
condiciones patológicas clínicas causadas por anemia tópica, tal
como necrosis. Sin embargo, según la presente invención, el término
"enfermedad isquémica" se refiere a una enfermedad cardíaca
isquémica causada por isquemia oclusiva debida a alteraciones en
los vasos o de los propios vasos, tal como la angina de pecho, el
infarto de miocardio, el fallo cardíaco y el infarto cerebral.
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El término "alquilo" tal como se usa en la
fórmula (I), solo o en combinación con otros términos, significa un
radical hidrocarbonado monovalente lineal o ramificado, que tiene un
número indicado de átomos de carbono. Los radicales incluyen, por
ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
n-butilo, isobutilo, sec-butilo,
terc-butilo, n-pentilo,
n-hexilo, n-heptilo,
n-octilo, n-nonilo,
n-decanilo, n-undecanilo,
n-dodecanilo, n-tridecanilo,
n-tetradecanilo, n-pentadecanilo,
n-hexadecanilo, n-heptadecanilo,
n-octadecanilo, n-nonadecanilo,
n-eicosanilo y similares.
El término "alquenilo" tal como se usa en
la fórmula (I), solo o en combinación con otros términos, significa
un radical hidrocarbonado monovalente lineal o ramificado, que tiene
un número indicado de átomos de carbono y tiene uno o más dobles
enlaces. Los radicales incluyen, por ejemplo, vinilo, alilo,
propenilo, crotonilo, isopentenilo, diversos isómeros de butenilo y
similares.
El término "alquinilo" tal como se usa en
la fórmula (I), solo o en combinación con otros términos, significa
un radical hidrocarbonado monovalente lineal o ramificado, que tiene
un número indicado de átomos de carbono y tiene uno o más triples
enlaces. Los radicales incluyen, por ejemplo, etinilo, propinilo,
6-heptinilo, 7-octinilo,
8-nonilo y similares.
El término "grupo carbocíclico", tal como
se usa en la fórmula (I), significa un radical derivado de un núcleo
orgánico de 5 a 14, preferiblemente de 5 a 10, más preferiblemente
de 5 a 7, miembros saturado o insaturado, substituido o sin
substituir, cuyos átomos formadores del anillo (aparte del
hidrógeno) son únicamente átomos de carbono. El término incluye un
grupo donde se conectan dos o tres de los radicales antes
mencionados entre sí. Como grupos carbocíclicos típicos, se
incluyen cicloalquilos tales como ciclopropilo, ciclobutilo,
ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo;
cicloalquenilos tales como ciclobutenilo, ciclopentenilo,
ciclohexenilo, cicloheptenilo y ciclooctenilo, fenilo, naftilo,
norbornanilo, bicicloheptadienilo, indenilo, estilbenilo,
terfenililo, fenilciclohexenilo, acenaftilo, antrilo, bifenililo,
bibencililo y derivados fenilalquilfenilo mostrados por la fórmula
(II):
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Como grupo carbocíclico preferido en R^{3} y
R^{4}, se incluyen fenilo, ciclohexilo y similares.
El término "grupo heterocíclico", tal como
se usa en la fórmula (I), significa un radical derivado de núcleos
heterocíclicos monocíclicos o policíclicos, saturados o insaturados,
substituidos o sin substituir que tienen de 5 a 14 átomos de anillo
y contienen de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo
consistente en nitrógeno, oxígeno y azufre. Como grupos
heterocíclicos, se incluyen, por ejemplo, piridilo, pirrolilo,
furanilo, benzofuranilo, tienilo, benzotienilo, pirazolilo,
imidazolilo, fenilimidazolilo, triazolilo, isoxazolilo, oxazolilo,
tiazolilo, tiadiazolilo, indolilo, carbazolilo, norharmanilo,
azaindolilo, benzofuranilo, dibenzofuranilo, dibenzotiofenilo,
indazolilo, imidazo[1,2-a]piridinilo,
benzotriazolilo, antranililo, 1,2-benzisoxazolilo,
benzoxazolilo, benzotiazolilo, purinilo, piridinilo, dipiridinilo,
fenilpiridinilo, bencilpiridinilo, pirimidinilo, fenilpirimidinilo,
pirazinilo, 1,3,5-triazinilo, quinolinilo,
ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo y similares.
Como grupo heterocíclico preferido en R^{3} y
R^{4}, se incluyen furilo, tienilo y similares.
Como grupo carbocíclico y grupo heterocíclico
preferidos en el grupo R^{5}, se incluye un radical mostrado por
la fórmula:
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donde h es un número entero de 0 a
2; cada uno de R^{16} y R^{17} es un grupo seleccionado
independientemente entre un halógeno, un alquilo
C_{1}-C_{10}, un alquiloxi
C_{1}-C_{10}, un alquiltío
C_{1}-C_{10}, un ariloxi, un fenilo y un
haloalquilo C_{1}-C_{10}; \alpha es un átomo
de oxígeno o un átomo de azufre; \beta es -CH_{2}- o
-(CH_{2})_{2}-; \gamma es un átomo de oxígeno o un
átomo de azufre; c, i y p son un número entero de 0 a 5; e es un
número entero de 0 a 7; g es un número entero de 0 a 4; y cada uno
de k y n es independientemente un número entero de 0 a 3. Cuando c,
e, g, i, k, n y/o p son 2 o más, entonces cada uno de los grupos
R^{16} y de los grupos R^{17} pueden ser diferentes entre sí.
Cuando R^{16} es un substituyente sobre un grupo naftilo,
R^{16} puede substituir en cualquier posición sobre el grupo
naftilo.
Como grupos más preferibles, se incluyen un
radical mostrado por la fórmula:
donde R^{19} es un átomo de
hidrógeno, un alquilo C_{1}-C_{3} o un halógeno;
E es un enlace sencillo, -CH_{2}- o -O-; y \beta es -CH_{2}-
o
-(CH_{2})_{2}-.
Como grupo R^{5} preferido, se incluye un
"grupo carbocíclico"-alquilo C_{1}-C_{3} y
un "grupo heterocíclico"-alquilo
C_{1}-C_{3}.
El término "substituyente no
interfiriente", tal como se utiliza en la fórmula (I), significa
un radical adecuado para substitución sobre un "grupo
carbocíclico" y un "grupo heterocíclico" tal como se han
definido anteriormente y el núcleo básico. Como ejemplos de
radicales no interfirientes, se incluyen un alquilo
C_{1}-C_{10}, un alquenilo
C_{2}-C_{6}, un alquinilo
C_{2}-C_{6}, un aralquilo
C_{7}-C_{12} (tal como bencilo y fenetilo), un
alcarilo C_{7}-C_{12}, un cicloalquilo
C_{3}-C_{8}, un cicloalquenilo
C_{3}-C_{8}, fenilo, tolilo, xililo, bifenilo,
un alquiloxi C_{1}-C_{10}, un alquiloxi
C_{1}-C_{6}-alquilo
C_{1}-C_{6} (tal como metiloximetilo,
etiloximetilo, metiloxietilo y etiloxietilo), un alquiloxi
C_{1}-C_{6}-alquiloxi
C_{1}-C_{6} (tal como metiloximetiloxi y
metiloxietiloxi), un alquil
C_{1}-C_{6}-carbonilo (tal como
metilcarbonilo y etilcarbonilo), un alquil
C_{1}-C_{6}-carbonilamino (tal
como metilcarbonilamino y etilcarbonilamino), un alquiloxiamino
C_{1}-C_{6} (tal como metiloxiamino y
etiloxiamino), un alquil
C_{1}-C_{6}-oxiaminocarbonilo
(tal como metiloxiaminocarbonilo y etiloxiaminocarbonilo), un mono-
o dialquilamino C_{1}-C_{6} (tal como
metilamino, etilamino, dimetilamino y etilmetilamino), un alquiltío
C_{1}-C_{10}, un alquil
C_{1}-C_{6}-tiocarbonilo (tal
como metiltiocarbonilo y etiltiocarbonilo), un alquilsulfinilo
C_{1}-C_{6} (tal como metilsulfinilo y
etilsulfinilo), un alquilsulfonilo C_{1}-C_{6}
(tal como metilsulfonilo y etilsulfonilo), un haloalquiloxi
C_{2}-C_{6} (tal como
2-cloroetiloxi y 2-bromoetiloxi), un
haloalquilsulfonilo C_{1}-C_{6} (tal como
clorometilsulfonilo y bromometilsulfonilo), un haloalquilo
C_{1}-C_{10}, un hidroxialquilo
C_{1}-C_{6} (tal como hidroximetilo e
hidroxietilo), un alquil
C_{1}-C_{6}-oxicarbonilo (tal
como metiloxicarbonilo y etiloxicarbonilo),
-(CH_{2})_{1-8}-O-(alquilo
C_{1}-C_{6}), benciloxi, un ariloxi (tal como
feniloxi), un ariltío (tal como feniltío), -(CONHSO_{2}R^{20},
donde R^{20} es un alquilo C_{1}-C_{6} o un
arilo), -CHO, amino, amidino, un halógeno, carbamilo, carboxilo,
carbalquiloxi,
-(CH_{2})_{1-8}-COOH (tal
como carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo), ciano,
cianoguanidino, guanidino, hidrazido, hidrazino, hidroxi,
hidroxiamino, nitro, fosfono, -SO_{3}H, tioacetal, tiocarbonilo,
un carbonilo C_{1}-C_{6}, un grupo
carbocíclico, un grupo heterocíclico y similares. Estos
substituyentes pueden estar substituidos por uno o más
substituyentes seleccionados entre el grupo consistente en un
alquilo C_{1}-C_{6}, un alquiloxi
C_{1}-C_{6}, un haloalquiloxi
C_{2}-C_{6}, un haloalquilo
C_{1}-C_{6} y un halógeno.
Como substituyentes no interfirientes preferidos
usados en el contexto de "substituidos por un substituyente no
interfiriente" en R^{3}, R^{4} y R^{5}, se incluyen un
halógeno, un alquilo C_{1}-C_{6}, un alquiloxi
C_{1}-C_{6}, un alquiltío
C_{1}-C_{6} y un haloalquilo
C_{1}-C_{6}. Como más preferidos, se incluyen
un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{3}, un
alquiloxi C_{1}-C_{3}, un alquiltío
C_{1}-C_{3} y un haloalquilo
C_{1}-C_{3}.
Como substituyentes no interfirientes preferidos
usados R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{7}, se incluyen un
alquilo C_{1}-C_{6}, un aralquilo, un alquiloxi
C_{1}-C_{6}, un alquiltío
C_{1}-C_{6}, un hidroxialquilo
C_{1}-C_{6}, un haloalquiloxi
C_{2}-C_{6}, un halógeno, un carboxi, un alquil
C_{1}-C_{6}-oxicarbonilo, un
ariloxi, un ariltiol, un grupo carbocíclico y un grupo
heterocíclico. Como más preferidos, se incluyen un alquilo
C_{1}-C_{6}, un aralquilo, un carboxi, un
hidroxialquilo C_{1}-C_{6}, fenilo y un alquil
C_{1}-C_{6}-oxicarbonilo.
El término "halógeno", tal como se usa en
la fórmula (I), significa fluoro, cloro, bromo o yodo.
El término "cicloalquilo", tal como se usa
en la fórmula (I), significa un radical hidrocarbonado cíclico
monovalente que tiene un número indicado de átomos de carbono. Los
radicales incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo,
ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo y
similares.
El término "cicloalquenilo", tal como se
usa en la fórmula (I), significa un radical hidrocarbonado cíclico
monovalente que tiene un número indicado de átomos de carbono y que
contiene uno o más dobles enlaces. Los radicales incluyen, por
ejemplo, 1-ciclopropenilo,
2-ciclopropenilo, 1-ciclobutenilo,
2-ciclobutenilo y similares.
El término "alquiloxi", tal como se usa en
la fórmula (I), incluye, por ejemplo, metiloxi, etiloxi,
n-propiloxi, isopropiloxi,
n-butiloxi, n-pentiloxi,
n-hexiloxi y similares.
El término "alquiltío", tal como se usa en
la fórmula (I), incluye, por ejemplo, metiltío, etiltío,
n-propiltío, isopropiltío,
n-butiltío, n-pentiltío,
n-hexiltío y similares.
El término "grupo ácido", tal como se usa
en la fórmula (I), significa un grupo orgánico que, cuando se une a
un núcleo a través de átomos de unión adecuados (en adelante aquí
definido como "un grupo de enlace al grupo ácido"), actúa como
donador de protones capaz de formar enlaces de hidrógeno. Los grupos
ácidos incluyen, por ejemplo, un grupo mostrado por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
donde R^{21} es un átomo de
hidrógeno, un metal o un alquilo C_{1}-C_{10} y
cada R^{22} es independientemente un átomo de hidrógeno o un
alquilo C_{1}-C_{10}, siempre que, cuando un
grupo ácido tiene tanto R^{21} como R^{22}, entonces al menos
uno de R^{21} y R^{22} sea un átomo de hidrógeno. Como grupos
preferidos, se incluyen -COOH, -SO_{3}H,
-CONHSO_{2}C_{6}H_{5} o P(O)(OH)_{2} y como
más preferidos, se incluye
-COOH.
El término "un grupo de enlace al grupo
ácido", tal como se usa en la fórmula (I), significa un grupo de
unión divalente simbolizado como -(L^{1})-, que tiene la función
de unir el núcleo a un grupo ácido en una relación general. El
grupo incluye, por ejemplo, un grupo mostrado por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde M es -CH_{2} -, -O-,
-N(R^{25})- o -S- y cada R^{23} y R^{24} son
independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo
C_{1}-C_{10}, un arilo, un aralquilo, un carboxi
o un halógeno, y un grupo mostrado por la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde cada uno de R^{13} y
R^{14} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo
C_{1}-C_{10}, un aralquilo
C_{1}-C_{10}, un carboxi, un alquiloxicarbonilo
o un halógeno. Como preferidos, se incluyen, por ejemplo,
-O-CH_{2}-, -S-CH_{2}-,
-N(R^{25})-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-,
-O-CH(CH_{3})- y
-O-CH((CH_{2})_{2}C_{6}H_{5})-,
donde R^{25} es un alquilo C_{1}-C_{6}, y,
como más preferidos, se incluyen -O-CH_{2} - y
-S-CH_{2}-.
El término "la longitud del enlazante al grupo
ácido", tal como se usa en la fórmula (I), significa el número
de átomos (excluyendo el hidrógeno) de la cadena más corta del grupo
de enlace -(L^{1})- que conecta el núcleo con el grupo ácido. La
presencia de un anillo carbocíclico en -(L^{1})- cuenta como un
número de átomos aproximadamente equivalente al diámetro calculado
del anillo carbocíclico. Así, un anillo de benceno o ciclohexano en
el enlazante al grupo ácido cuenta como 2 átomos al calcular la
longitud de -(L^{1})-. La longitud preferida es de 2 a 3.
El término "haloalquilo", tal como se usa
en la fórmula (I), significa "un alquilo" como se ha definido
anteriormente substituido en cualquier posición por un halógeno
como se ha definido anteriormente. Como haloalquilo, se incluyen,
por ejemplo, clorometilo, trifluorometilo,
2-clorometilo, 2-bromometilo y
similares.
El término "hidroxialquilo", tal como se
usa en la fórmula (I), significa "un alquilo" como se ha
definido anteriormente substituido en cualquier posición por
hidroxi. Como hidroxialquilo, se incluyen, por ejemplo,
hidroximetilo, 2-hidroxietilo,
3-hidroxipropilo y similares, prefiriéndose
hidroximetilo.
El término "haloalquilo" en
"haloalquiloxi", tal como se usa en la fórmula (I), es como se
ha definido anteriormente. Como haloalquiloxi, se incluyen, por
ejemplo, 2-cloroetiloxi,
2-trifluoroetiloxi, 2-cloroetiloxi y
similares.
El término "arilo", tal como se usa en la
fórmula (I), significa un grupo hidrocarbonado aromático monocíclico
o condensado e incluye, por ejemplo, fenilo,
1-naftilo, 2-naftilo, antrilo y
similares, prefiriéndose fenilo o 1-naftilo.
El término "aralquilo", tal como se usa en
la fórmula (I), significa "un alquilo" como se ha definido
anteriormente substituido en cualquier posición substituible por
"un arilo" como se ha definido anteriormente e incluye, por
ejemplo, bencilo, fenetilo, fenilpropilo (v.g.
3-fenilpropilo), naftilmetilo (v.g.
1-naftilmetilo) y similares.
El término "alquiloxicarbonilo", tal como
se usa en la fórmula (I), incluye, por ejemplo, metiloxicarbonilo,
etiloxicarbonilo, n-propiloxicarbonilo y
similares.
El término "ariloxi", tal como se usa en la
fórmula (I), incluye, por ejemplo, feniloxi y similares.
El término "ariltío", tal como se usa en la
fórmula (I), incluye, por ejemplo, feniltío y similares.
El término "halofenilo", tal como se usa en
la fórmula (I), significa un fenilo substituido en una o más
posiciones por "un halógeno" como se ha definido anteriormente
e incluye, por ejemplo, fluorofenilo, clorofenilo, bromofenilo,
yodofenilo, difluorofenilo, diclorofenilo, dibromofenilo,
trifluorofenilo, triclorofenilo, tribromofenilo, clorofluorofenilo,
bromoclorofenilo y similares.
"Anillo de ciclohexeno" en el anillo D, tal
como se usa en la fórmula (I), significa un anillo de ciclohexeno
que tiene, en el anillo, sólo un doble enlace en la parte condensada
que comparte con el anillo adyacente.
\newpage
Son combinaciones preferidas entre el anillo A y
-B- una de las (m) a (r) siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
prefiriéndose más una de las (m) a
(p).
Los compuestos inhibidores de las sPLA_{2} de
los grupos V y/o X mostrados por la fórmula general (I) pueden ser
preparados según la bien conocida preparación descrita en
EP-620214 (Publicación de Patente Japonesa (kokai)
Nº 7-010838, US-5578634),
EP-620215 (Publicación de Patente Japonesa (kokai)
Nº 7-025850, US-5684034),
EP-675110 (Publicación de Patente Japonesa (kokai)
Nº 7-285933, US-5654326), WO96/03120
(Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº
10-505336), WO96/03383 (Publicación de Patente
Japonesa (kokai) Nº 10-505584), WO98/18464
(EP-839806), WO99/51605, WO99/59999 o
similares.
Los compuestos inhibidores de la sPLA_{2} del
grupo X pueden ser seleccionados preparando células que expresan la
sPLA_{2} del grupo X humana y el sobrenadante de cultivo de las
mismas y estudiando luego los candidatos para la actividad
inhibitoria como se describe a continuación. Concretamente, se
inserta la secuencia de ADNc codificante de la sPLA_{2} del grupo
X humana (Cupillard y col., J. Biol. Chem, 1997, 272,
15745-15752) en un vector de expresión en células
animales. Se transfecta con el vector de expresión resultante una
célula huésped para obtener una célula que expresa de manera
estable sPLA_{2} del grupo X humana. Se cultivan las células para
preparar los sobrenadantes de cultivo de las mismas. Se emplea
entonces un ensayo cromogénico como se describe a continuación para
identificar compuestos inhibidores de la sPLA_{2} del grupo X y
valorar su actividad. Las directrices generales de este ensayo
están descritas en el artículo "Analysis of Human Synovial Fluid
Phospholipase A_{2} on Short Chain
Phosphatidylcholine-Mixed Micelles: Development of a
Spectrophotometric Assay Suitable for A Microtiterplate Reader",
Analytical Biochemistry, 204, pp 190-197,1992, de
Laure J. Reynolds, Lori L. Hughes y Edward A. Dennis.
Los compuestos inhibidores de la sPLA_{2} del
grupo V pueden ser seleccionados por un procedimiento similar al
antes descrito, excepto por la utilización de la secuencia de ADNc
codificante de la sPLA_{2} del grupo V humana (Chen y col., J.
Biol. Chem, 1994, 269, 2365-2368).
Cuando un compuesto inhibidor de la sPLA_{2}
del grupo V y/o X tiene un grupo ácido o un grupo básico, puede
formar una sal más soluble en agua y más adecuada fisiológicamente.
Como sales típicas farmacéuticamente aceptables, se incluyen,
aunque sin limitación, sales formadas con un metal alcalino o un
metal alcalinotérreo, tal como litio, sodio, potasio, calcio,
magnesio, aluminio o similar. Se pueden producir sales fácilmente a
partir de un ácido libre tratando el ácido en una solución con una
base, o poniendo en contacto el ácido con una resina de intercambio
iónico. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de
adición preparadas a partir de una base inorgánica u orgánica
relativamente no tóxica de un compuesto para el tratamiento o la
prevención de una lesión por reperfusión isquémica, tal como un
catión de amina, un amonio o un amonio cuaternario derivado de una
base nitrogenada, que sean lo suficientemente básicos como para
formar una sal con el compuesto (por ejemplo, S.M.Berge y col.,
"Pharmaceutical Salts", J.Phar.Sci., 66, 1-19
(1977)). Además, el grupo básico contenido en el compuesto
inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X puede reaccionar con un
ácido orgánico o inorgánico adecuado para formar sales tales como
acetatos, bencenosulfonatos, benzoatos, bicarbonatos, bisulfonatos,
bitartratos, boratos, bromuros, camsilatos, carbonatos, cloruros,
clavulanatos, citratos, edetatos, edisilatos, estolatos, esilatos,
fluoruros, fumaratos, gluceptatos, gluconatos, glutamatos,
glicolilarsanilatos, hexilresorcinatos, hidroxinaftoatos, yoduros,
isotionatos, lactatos, lactobionatos, lauratos, malatos, malseatos,
mandelatos, mesilatos, metilbromuros, metilnitratos, metilsulfatos,
mucatos, napsilatos, nitratos, oleatos, oxalatos, palmitatos,
pantotenatos, fosfatos, poligalacturonatos, salicilatos, estearatos,
subacetatos, succinatos, tanatos, tartratos, tosilatos,
trifluoroacetatos, trifluorometanosulfonatos, valeratos y similares.
Los solvatos, tal como se utilizan aquí, incluyen los formados con
un solvente orgánico y/o agua. Se pueden formar hidratos con
cualquier número de moléculas de agua.
Cuando un compuesto inhibidor de la sPLA_{2}
del grupo V y/o X tiene uno o más centros quirales, éstos pueden
existir en formas ópticamente activas. De igual modo, cuando los
compuestos contienen un grupo alquenilo o alquenileno, existe la
posibilidad de formas isoméricas cis y trans de los compuestos. Esta
invención contempla los isómeros R y S y sus mezclas, incluyendo
las mezclas racémicas, así como las mezclas de isómeros cis y
trans. Puede haber presencia de átomos de carbono asimétricos
adicionales en un grupo substituyente, tal como un grupo alquilo.
Todos esos isómeros, así como sus mezclas, pretenden quedar
incluidos en la invención. Si se desea un estereoisómero
particular, se puede preparar por métodos bien conocidos en la
técnica utilizando reacciones estereoespecíficas con materiales de
partida que contengan los centros asimétricos y ya resueltos, o,
alternativamente, por métodos que den lugar a mezclas de los
estereoisómeros y posterior resolución por métodos conocidos.
El término "farmacéuticamente aceptable"
significa soportes, diluyentes o aditivos que sean compatibles con
otros ingredientes de la composición e inocuos para un receptor.
Las composiciones para tratamiento o prevención
según la presente invención pueden ser administradas por una
variedad de vías, incluyendo la oral, en aerosol, la rectal, la
transdérmica, la subcutánea, la intravenosa, la intramuscular y la
intranasal. Se preparan formulaciones que contienen los compuestos
inhibidores de la sPLA_{2} del grupo V o X combinando (v.g.,
mezclando) una cantidad terapéuticamente efectiva de los compuestos
junto con un soporte o diluyente para los mismos farmacéuticamente
aceptable. Las formulaciones son preparadas por procedimientos
conocidos usando ingredientes bien conocidos y de fácil
adquisición.
Al preparar las composiciones, se mezcla el
ingrediente activo con un soporte o se diluye mediante un soporte,
o se encierra en un soporte, que puede estar en forma de cápsula,
bolsita, papel u otro recipiente. Cuando el soporte sirve como
diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido que
actúe como medio, o puede estar en forma de tabletas, píldoras,
polvos, pastillas masticables, elixires, suspensiones, emulsiones,
soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido en un medio líquido)
ó ungüentos, que contengan, por ejemplo, hasta un 10% del compuesto
activo. Los compuestos que exhiben una actividad
antiarteriosclerosis de la presente invención son preferiblemente
formulados antes de su administración.
Para las formulaciones, se puede usar cualquier
soporte adecuado conocido en la técnica. En dicha formulación, el
soporte puede ser un sólido, un líquido o una mezcla de un sólido y
un líquido. Por ejemplo, se disuelve un compuesto para el
tratamiento o la prevención de la lesión por reperfusión isquémica
en una solución acuosa de dextrosa al 4%/citrato de sodio al 0,5%
para obtener una concentración de 2 mg/ml para inyección
intravenosa. Las formulaciones en forma sólida incluyen polvos,
tabletas y cápsulas. Un soporte sólido puede ser una o más
substancias que pueden también actuar como agentes saborizantes,
lubricantes, solubilizantes, agentes suspensores, ligantes, agentes
de desintegración de tabletas y material encapsulante. Las tabletas
para administración oral pueden contener excipientes adecuados,
tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa o
fosfato de calcio, junto con agentes desintegrantes, tales como
almidón de maíz o ácido algínico, y/o agentes ligantes, tales como
gelatina o acacia, y agentes lubricantes, tales como estearato de
magnesio, ácido esteárico o talco.
En los polvos, el soporte es un sólido finamente
pulverizado en mezcla con el ingrediente activo finamente
pulverizado. En las tabletas, se mezcla el ingrediente activo con un
soporte que tiene las propiedades de unión necesarias en
proporciones adecuadas y se compacta para obtener la forma y el
tamaño deseados. Los polvos y las tabletas contienen
preferiblemente de aproximadamente un 1 a aproximadamente un 99 por
ciento en peso del ingrediente activo, que es el nuevo compuesto de
esta invención. Son soportes sólidos adecuados carbonato de
magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina,
dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa,
carboximetilcelulosa sódica, ceras de bajo punto de fusión y manteca
de cacao.
Las formulaciones estériles en forma líquida
incluyen suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires. Se puede
disolver o suspender el ingrediente activo en un soporte
farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, un solvente
orgánico estéril o una mezcla de ambos. El ingrediente activo puede
con frecuencia ser disuelto en un solvente orgánico adecuado, por
ejemplo, propilenglicol acuoso. Se pueden preparar otras
composiciones dispersando el ingrediente activo finamente dividido
en una solución acuosa de almidón o de carboximetilcelulosa sódica
o en un aceite adecuado.
Aunque la forma apropiada de dosificación varía
dependiendo del tipo de enfermedad, de la vía de administración y
de la edad y el peso corporal del paciente, en el caso de la
administración intravenosa la dosificación para un adulto puede
ser, en general, de 0,01 a 10 mg/kg/hora y preferiblemente de 0,1 a
1 mg/kg/hora.
Los siguientes Ejemplos son ilustrativos de la
presente invención.
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). Se hicieron reaccionar
sPLA_{2} humanas de los grupos IB, IIA y X (de 0,5 nmol/L a 500
nmol/L) con LDL y HDL (0,35-1 mg/ml) a 37ºC en una
solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl
(pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de
calcio. Se extrajeron los ácidos grasos liberados de las
lipoproteínas según el método de Dole (Dole y col., J. Biol. Chem.
235, 2595-2599 (1960)) y se marcaron con
9-antrildiazometano por un método conocido (Hanasaki
y col., J. Biol. Chem. 274, 34203-34211 (1999)). Se
determinaron entonces los ácidos grasos liberados detectando la
fluorescencia de los productos marcados (ácidos grasos) eluidos por
cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") en columna
de fase invertida (LichroCART 125-4 Superspher 100
RP-18 columnmol/Merck). Para examinar la liberación
dosis-dependiente de ácidos grasos inducida por
cada sPLA_{2}, se hizo reaccionar a la lipoproteína con 0,5, 5, 50
y 500 nmol/L de sPLA_{2} del grupo X y 50 y 500 nmol/L de
sPLA_{2} de los grupos IB y IIA durante 60 minutos. Además, con
objeto de examinar la liberación de ácidos grasos
tiempo-dependiente inducida por sPLA_{2}, se
usaron 50 nmol/L de cada sPLA_{2} y se trazó el cambio en la
liberación en el curso del tiempo durante un período de tiempo de 4
horas tras la adición de sPLA_{2}. En el experimento para la
determinación de la actividad inhibidora de un inhibidor de
sPLA_{2} (indoxam; Yokota y col., Biochim. Biophys. Acta 1438,
213-222 (1999)), un inhibidor de la ciclooxigenasa
(COX) (indometacina) o un inhibidor de la
5-lipoxigenasa (5-LOX)
(AA-861;
2,3,5-trimetil-6-(12-hidroxi-5,10-dodecadiinil)-1,4-benzoquinona
(Yoshimoto y col., Biochem. Biophys. Acta. 713,
470-473 (1982)), se añadieron estos agentes a la
reacción, para obtener una concentración final de 10 \mumol/L,
virtualmente con simultaneidad a la adición de sPLA_{2}.
El experimento para la liberación
tiempo-dependiente reveló que sólo la sPLA_{2} del
grupo X entre las sPLA_{2} de los grupos IB, IIA y X liberaba los
ácidos grasos significativamente. La liberación de ácidos grasos de
la HDL inducida por la sPLA_{2} del grupo X alcanzaba una meseta a
los 60 minutos de la adición, mientras que la liberación de ácidos
grasos de la LDL continuaba aumentando de un modo dependiente del
tiempo durante 4 horas. El experimento para la liberación
dosis-dependiente de ácidos grasos mostró que la
sPLA_{2} del grupo X a tan sólo 5 nmol/L liberaba
significativamente ácidos grasos de la LDL y de la HDL de un modo
dosis-dependiente, mientras que la sPLA_{2} de
los grupos IB y IIA liberaba sólo cantidades menores de ácidos
grasos de ácidos grasos incluso a una dosis elevada de 500 nmol/L
(Fig. 1). La liberación de ácidos grasos inducida por la sPLA_{2}
del grupo X resultó inhibida por un inhibidor de la sPLA_{2}
(indoxam) y no resultó afectada ni por un inhibidor de la COX
(indometacina) ni por un inhibidor de la 5-LOX
(AA-861) (Fig. 2).
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). Se hicieron reaccionar
sPLA_{2} humanas de los grupos IB, IIA y X (50 nmol/L) y
CuSO_{4} (20 \mumol/L) con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante
3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón
Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y
1 mmol/L de cloruro de calcio. Se trazó entonces el cambio en la
composición de fosfolípidos de la LDL y de la HDL por HPLC. Se
extrajeron los fosfolípidos de una muestra de 10 \mug de LDL y de
una muestra de 15 \mug de HDL según un método conocido (Bligh y
col., Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959)).
A continuación, se cargaron los fosfolípidos en una columna de HPLC
de fase normal (Ultrasphere silica, 4,6 x 250 mm y 4,6 x 45 mm,
Beckman) para fraccionar la fosfatidilcolina (FC) y la
lisofosfatidilcolina (liso-FC) eluidas y se
determinó la cantidad de fósforo como se ha descrito previamente
(Saiga y col., Biochim. Biophys. Acta 1530, 67-76
(2001)).
El resultado mostró que el tratamiento con
CuSO_{4} y sPLA_{2} del grupo X disminuía los contenidos en FC
en la LDL en el curso del tiempo, como puede verse en los puntos
temporales de 3, 6 y 24 horas (Fig. 3A), y los contenidos en
liso-FC aumentaban de acuerdo con la disminución de
FC (Fig. 3B). El tratamiento con CuSO_{4} provocó una disminución
de los contenidos en FC en la HDL y aumentó los contenidos en
liso-FC en el curso del tiempo de forma similar al
caso de la LDL. El tratamiento con sPLA_{2} del grupo X descompuso
la FC en la HDL mucho más rápidamente que en el caso de la LDL y el
tratamiento de 3 horas disminuyó el contenido en hasta un 10% del
nivel original, mientras que los contenidos en
liso-FC aumentaron de acuerdo con la disminución de
la FC y se produjeron en una cantidad de 6 veces la cantidad de la
HDL tratada con CuSO_{4} después de 3 horas. Por otra parte, el
tratamiento con sPLA_{2} de los grupos IB y IIA no mostró cambios
significativos en la composición de fosfolípidos (Fig. 3A, B).
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). Se hicieron reaccionar
sPLA_{2} humanas de los grupos IB, IIA y X (50 nmol/L) y
CuSO_{4} (20 \mumol/L) con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante
3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón
Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y
1 mmol/L de cloruro de calcio. Se sometieron entonces una muestra
de 1 \mug de LDL y una muestra de 2 \mug de HDL a electroforesis
en gel de agarosa (Helena Laboratories, TITAN GEL Lipoprotein; 90V,
25 minutos). Tras la electroforesis, se secó el gel a una
temperatura de 50 a 60ºC durante aproximadamente 1 hora, se tiñó con
6 ml de una solución de tinción (Helena Laboratories, Fat Red 7B
agarose solution) durante aproximadamente 3 minutos y se decoloró
después con 25 ml de una solución decolorante (metanol al 70%). En
el experimento para la determinación de la actividad de un
inhibidor de sPLA_{2} (indoxam), un inhibidor de COX
(indometacina) o un inhibidor de 5-LOX
(AA-861), se añadieron estos agentes a la reacción
para obtener una concentración final de 10 \mumol/L, virtualmente
con simultaneidad a la adición de sPLA_{2}.
En la Fig. 4 se muestra el resultado. El
tratamiento tanto de la LDL como de la HDL con CuSO_{4} dio lugar
a un gran desplazamiento migratorio hacia el ánodo en el curso del
tiempo en comparación con las lipo no tratadas (sin datos para la
HDL). Entre los tratamientos con sPLA_{2} humanas, sólo el
tratamiento con la sPLA_{2} del grupo X dio lugar a un
desplazamiento migratorio dependiente del tiempo hacia el ánodo
similar al del tratamiento con CuSO_{4}, lo que muestra que el
cambio en la composición de fosfolípidos provocado por la
liberación de ácidos grasos inducida por sPLA_{2} del grupo X
causó el aumento de carga negativa de cada lipoproteína. Este tipo
de degeneración de lipoproteínas inducida por sPLA_{2} del grupo X
era inhibido por un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam) y no resultó
afectado ni por un inhibidor de COX (indometacina) ni por un
inhibidor de 5-LOX (AA-861).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos
IB, IIA y X (50 nmol/L) y CuSO_{4} (20 \mumol/L) reaccionaron
con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante 3, 6 y 24 horas en una
solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón
Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y
1 mmol/L de cloruro de calcio. Después de deslipidar con una
solución de acetona:etanol (1:1), se disolvieron las mezclas de
reacción en un tampón para electroforesis (10 mmol/L de tampón
Tris-HCl (pH 6,8), 2% de SDS, 30% de glicerol, 0,1%
de 2ME, 0,1% de BPB) y se analizaron por electroforesis en
SDS-gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE). En la electroforesis, se cargaron 5
\mug de cada de LDL (apoB-100) y de HDL
(apoA-1) en gel al 4% y gel en gradiente al
4-20%, respectivamente.
El resultado mostró que la banda de la
apoA-1 tratada con CuSO_{4} desaparecía en la
posición original a la tenía que migrar a la vista del peso
molecular de la proteína y se desplazaba hacia el lado de alto peso
molecular como una banda ancha que parecía una forma de agregación,
mientras que la banda de la apoB-100 en la LDL
también se desplazaba hacia el lado de alto peso molecular. Por otra
parte, una parte de apoB-100 y
apoA-1 tratadas con sPLA_{2} del grupo X se
desplazó hacia el lado de alto peso molecular como se ha mostrado
antes 24 horas después del tratamiento, aunque no tan
significativamente como en el tratamiento con CuSO_{4}. El
tratamiento con sPLA_{2} de los grupos IB y IIA no causó cambios
en comparación con la ausencia de tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos
IB, IIA y X (50 nmol/L) y CuSO_{4} (20 \mumol/L) reaccionaron
con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC durante 3, 6 y 24 horas en una
solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón
Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y
1 mmol/L de cloruro de calcio. Se añadieron entonces 500 \mul de
TCA al 20% y 500 \mul de ácido tiobarbitúrico (3,35 mg/ml) a una
preparación de 10 \mug de cada de LDL y HDL en 200 \mul de
solución salina fisiológica y se hirvió la mezcla a 95ºC durante 60
minutos, según el método conocido (Nagano y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 88, 6457-6461, (1991)). Después de
enfriar, se extrajeron las substancias reactivas con ácido
tiobarbitúrico (SRATB), que son uno de los indicadores para la
peroxidación de lípidos, con n-butanol (2 ml) y se
determinó la fluorescencia en el sobrenadante (longitud de onda de
excitación: 515 nm, longitud de onda de fluorescencia: 550 nm). Se
calculó la cantidad de SRATB por referencia a una curva estándar
generada usando tetraetoxipropano como patrón.
En las Fig. 5A y B se muestran los resultados.
Se observó una cantidad significativamente elevada de SRATB que
tenían un pico a las 6 horas tanto en LDL (Fig. 5A) como en HDL
(Fig. 5B) tratadas con CuSO_{4}. Por otra parte, no se observó
elevación de la cantidad de SRATB en el tratamiento con todas las
sPLA_{2}, incluyendo la sPLA_{2} del grupo X.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos
IB, IIA y X (50 nmol/L) y CuSO_{4} (20 \mumol/L) con LDL y HDL
(0,2 mg/ml) a 37ºC durante 0 a 6 horas en una solución que contenía
12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L
de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio. Se analizó
entonces la producción de dieno conjugado, que es uno de los
indicadores para la peroxidación de lípidos, monitorizando los
cambios en la absorbancia a 234 nm en el curso del tiempo según el
método conocido (Esterbauer y col., Free Rad. Res. Comms. 6,
67-75 (1989)).
El resultado mostró que la absorbancia a 234 nm
aumentaba de un modo tiempo-dependiente durante 90
minutos desde la adición en el tratamiento tanto de la LDL como de
la HDL con CuSO_{4} y la absorbancia decreció luego gradualmente.
Por otra parte, no se observó ningún cambio en la absorbancia a 234
nm en el tratamiento con todas las sPLA_{2}, incluyendo la
sPLA_{2} del grupo X.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los resultados antes descritos demostraron que
la degeneración de lipoproteínas inducida por sPLA_{2} del grupo
X (liberación de ácidos grasos, cambio en la composición de
fosfolípidos, mayor carga negativa, polimerización de apoproteína)
es similar a la degeneración por oxidación del tratamiento con
CuSO_{4}, pero no es dependiente de la oxidación de
lipoproteínas.
Se inyectaron ratones C57BL/6J (machos, 8
semanas) peritonealmente con 2 ml de una solución de tioglicolato
al 4% y, 4 días después, se recogieron las células de los fluidos
peritoneales. Se plaquearon las células en un portaobjetos de
cámara y se incubaron durante 2 horas en presencia de medio libre de
suero (BIO WHITTAKER: X-VIVO 15). Se extrajeron
entonces las células no adherentes por un procedimiento de lavado
para preparar macrófagos peritoneales. Se añadieron a las células
0,2 mg/ml de LDL (Sigma) y 50 nmol/L de PLA2 del grupo X y se
incubaron en el medio libre de suero durante 48 horas. Se confirmó
la captación de LDL por los macrófagos inmovilizando las células
con formaldehído al 4% durante 20 minutos y tiñendo luego los
lípidos con una solución de tinción Oil Red O. El experimento para
determinar la actividad inhibidora de un inhibidor de sPLA_{2}
(indoxam), un inhibidor de COX (indometacina) o un inhibidor de
5-LOX (AA-861), se añadieron estos
agentes a la reacción para obtener una concentración final de 10
\mumol/L, virtualmente con simultaneidad a la adición de
sPLA_{2}.
Los resultados mostraron que se detectaba una
señal positiva para la tinción con Oil Red O en las células
tratadas con sPLA_{2} del grupo X, lo que demuestra la captación
de LDL por las células, mientras que no se detectó ninguna señal
positiva en las células no tratadas. Esto revelaba que la sPLA_{2}
del grupo X aumentaba la captación de LDL por los macrófagos y
tiene el potencial de contribuir a la formación de células
espumosas desarrolladas en lesiones arterioscleróticas. El efecto de
la sPLA_{2} del grupo X sobre la captación de LDL por las células
resultó inhibido por un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam), que se
añadió a las células simultáneamente a la adición de sPLA_{2} del
grupo X y LDL, y no resultó afectado ni por un inhibidor de COX
(indometacina) ni por un inhibidor de 5-LOX
(NDGA).
Se compraron ratones deficientes en el gen de la
apolipoproteína E, C57BL/6J - ratones Apoe^{tmlUnc} (hembras, 8
semanas) descritos en The Journal of Clinical Investigation Vol. 94,
pp. 937-945 (1994), a Jackson Lab. y se usaron como
modelo animal para la arteriosclerosis. Como control, se usaron
ratones C57BL/6 (machos, 8 semanas). Inmediatamente después de la
compra, se mantuvo y alimentó a los animales con una dieta alta en
grasas suplementada con un 15,8% de manteca de cacao, un 1,25% de
colesterol y un 0,5% de colato de sodio en un gránulo convencional,
CA-1. Se practicó una expulsión de la sangre por
perfusión en cada uno de los ratones de 12 semanas, 17 semanas y 22
semanas de edad y se inmovilizaron los vasos químicamente con
paraformaldehído acuoso al 4% y se disecaron para retirar la aorta
ascendente yuxtacardíaca. Se sumergió el tejido en el mismo líquido
de inmovilización durante la noche, se lavó con un tampón fosfato,
se deshidrató convencionalmente con etanol acuoso brevemente y se
embebió en cera de parafina. Se usó un microtomo para preparar
secciones de parafina con un grosor de aproximadamente 5 \mum y
se montaron después en un vidrio portaobjetos para obtener muestras
patológicas para tinción. Para la inmunohistoquímica, se sumergió
cada portaobjetos con la muestra en xilol para eliminar la cera de
parafina, se le hizo reaccionar con metanol que contenía un 0,3% de
H_{2}O_{2} para eliminar las peroxidasas endógenas y se le trató
luego con suero normal de cabra al 5% durante 20 minutos. A
continuación, se sumergieron los portaobjetos con las muestras en
PBS que contenía un 0,1% de seroalbúmina bovina durante 30 minutos
y se les hizo reaccionar con anticuerpo policlonal de conejo anti-
sPLA_{2} humana del grupo X (6 \mug/mL) a 4ºC durante 14 horas
como se describe en The Journal of Biological Chemistry Vol. 274,
Nº 48, pp. 34203-34211 (1999). Se lavaron entonces
bien los portaobjetos con PBS que contenía un 0,1% de monolaurato
de polioxietilen(20)sorbitán (Tween 20; Wako Pure
Chemical Industries, Ltd. Osaka), se les hizo reaccionar con
anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo biotinilado
durante 30 minutos y se trataron con un reactivo de complejo de
avidina-biotina que contenía peroxidasas (Vector
Laboratories), dejando reposar a continuación durante 30 minutos.
Después de lavar con PBS, la reacción en un tampón
Tris-HCl a 50 mmol/L (pH 7,6) que contenía 200
\mug/mL de diaminobencidina y un 0,006% de H_{2}O_{2} durante
10 minutos desarrolló coloración de la actividad peroxidasa
amplificada alrededor de las moléculas diana del grupo X, de tal
modo que se visualizaba la localización de la sPLA_{2} del grupo X
en las muestras de tejidos. Este análisis detectará la señal
positiva para las moléculas de sPLA_{2} del grupo X como una
pigmentación marrón hígado de diaminobencidina. En el experimento
de absorción-neutralización para la señal de la
sPLA_{2} del grupo X, el anticuerpo reaccionó con proteínas
sPLA_{2} del grupo X de ratón purificadas (300 \mug/mL) durante
2 horas antes de añadirlo a los portaobjetos y se trataron entonces
los portaobjetos con la reacción de anticuerpo y proteína. Además,
se trató la muestra de tejido con una solución de hematoxilina al
0,4% para contrateñir los núcleos celulares.
Los resultados mostraron que la señal positiva
para la sPLA_{2} del grupo X en los vasos aislados de los ratones
deficientes en el gen de la apolipoproteína E de 12 semanas, 17
semanas y 22 semanas de edad se detectaba localmente sólo en la
población de células espumosas, lo cual es el signo inicial de la
arteriosclerosis. Por otra parte, en los tejidos vasculares control
de ratones normales no se detectó ningún signo inicial de
arteriogénesis y no se detectó ninguna señal positiva para la
sPLA_{2} del grupo X. Además, la señal detectada en la lesión
arteriosclerótica en los ratones deficientes en el gen de la
apolipoproteína E desapareció mediante el tratamiento de
absorción-neutralización usando proteína sPLA_{2}
de ratón del grupo X, lo que sugiere que la reacción positiva es
específica para las moléculas de sPLA_{2} del grupo X. No se
detectaron esas señales positivas con IgG preparada a partir de
conejos no inmunizados. Los resultados antes descritos muestran que
las moléculas de sPLA_{2} del grupo X se expresan
significativamente en un elevado nivel en las células espumosas de
lesiones vasculares del modelo de arteriosclerosis en ratón.
Se hizo reaccionar sPLA_{2} del grupo X (50
nmol/L) con LDL de plasma humano a 37ºC durante 24 horas en una
solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl
(pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de
calcio para preparar LDL degenerada por sPLA_{2} del grupo X. Se
prepararon macrófagos peritoneales inyectando 2 ml de una solución
de tioglicolato al 3% a ratones C57BL/6J (machos, 8 semanas)
peritonealmente, recogiendo las células de los fluidos peritoneales
4 días después, plaqueando las células en una placa de 24 pocillos,
incubando durante 2 horas en presencia de medio libre de suero (BIO
WHITTAKER: X-VIVO 15) y separando luego las células
no adherentes por lavado. Se añadieron a las células 0,2 mg/ml de
LDL, se incubaron éstas en el medio libre de suero durante 48 horas
y se dejó que reposaran en una mezcla de hexano e isopropanol (3:2)
durante 30 minutos para extraer el colesterol depositado en los
macrófagos. Después de reemplazar el solvente con isopropanol, los
colesteroles extraídos reaccionaron con 1 unidad/ml de colesterol
oxidasa (Roche), 10 unidades/ml de peroxidasa (Boehringer
Mannheim), 40 \mug/ml de acetato de
p-hidroxifenilo (Sigma) y 1 unidad/ml de colesterol
esterasa (TOYOBO) en un tampón fosfato 0,1 M a 37ºC durante 30
minutos según un método conocido (Gamble y col., J. Lipid. Res. 19,
1068-1070 (1978)) y se determinó el colesterol total
(incluyendo el colesterol libre y los ésteres de colesterol)
midiendo la fluorescencia de la solución (longitud de onda de
excitación: 305 nm, longitud de onda de fluorescencia: 420 nm).
Además, se llevó a cabo una reacción en una mezcla de reacción
libre de colesterol esterasa a 37ºC durante 30 minutos y se
determinó solamente el colesterol libre. Se calcularon las
cantidades del colesterol total y del colesterol libre en relación a
una curva estándar generada usando colesterol y oleato de
colesterol como patrones y se restó la cantidad de colesterol libre
de la cantidad de colesterol total para obtener la cantidad de
ésteres de colesterol.
Los resultados mostraron que la cantidad de
ésteres de colesterol en la captación de la LDL tratada con
sPLA_{2} del grupo X aumentaba significativamente en comparación
con la de la captación de la LDL no tratada y, por lo tanto, que la
LDL modificada por la enzima tiene el potencial de acelerar la
formación de células espumosas desarrolladas en lesiones
arterioscleróticas.
Se hizo reaccionar sPLA_{2} del grupo X (50
nmol/L) con HDL de plasma humano a 37ºC durante 3 horas en una
solución que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl
(pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de
calcio para preparar HDL degenerada por sPLA_{2} del grupo X. Se
prepararon macrófagos peritoneales recogiendo el lavado de fluidos
peritoneales de ratones ICR (hembras, 12 semanas), plaqueándolo en
una placa de 24 pocillos, incubando durante 2 horas en presencia de
medio que contenía un 10% de suero de ternera fetal (GIBCO BRL:
Medio de Eagle modificado de Dulbecco) y extrayendo luego las
células no adherentes por lavado. Se añadieron a las células 50
\mug/ml de LDL acetilada (Biomedical Technology Inc.) y se
incubaron durante 24 horas para preparar macrófagos espumosos.
Después de retirar el exceso de LDL acetilada del medio, se
añadieron 100 \mug/ml de HDL al medio y se incubó entonces el
medio en ausencia de suero durante 24 horas. Se extrajo y determinó
el colesterol intracelular y se determinó después la capacidad de la
HDL para provocar eflujo del colesterol celular de las células
espumosas.
Los resultados mostraron que el eflujo de
colesterol intracelular de las células tratadas con HDL degenerada
con sPLA_{2} del grupo X disminuía significativamente en
comparación con el de las células tratadas con HDL no degenerada.
Esto demostró que la degeneración de la HDL por la enzima tiene el
potencial de suprimir el eflujo de colesterol por la HDL en las
células espumosas desarrolladas en placas arterioscleróticas (Fig.
6).
Se obtuvo ADNc codificante de la sPLA_{2}
humana del grupo V por PCR usando Marathon Ready cDNA® de corazón
humano de CLONTECH como plantilla. Se usaron los siguientes
cebadores en la PCR:
| hGV-S: | 5'-caaagaacgcgtccaccatgaaaggcctcctcccactggct-3' | (SEC. ID. Nº 1) |
| hGV-AS: | 5'-ctcgctgcggccgcctaggagcagaggatgttgggaaa-3' | (SEC. ID. Nº 2) |
\global\parskip1.000000\baselineskip
hGV-S contiene la secuencia
Kozak y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Mlu
I. hGV-AS contiene un sitio de reconocimiento para
la enzima de restricción Not I. Se llevó a cabo la PCR en 35 ciclos
en condiciones de 94ºC durante 0,5 minutos, 55ºC durante 0,5 minutos
y 72ºC durante 2,5 minutos. Se digirieron los fragmentos de
amplificación por PCR con Mlu I y Not I y se insertaron en el
pBluescript-SK(-) modificado. Se confirmó la
secuencia de bases usando Sequenase Ver. 2,0 (USB). Se construyó
entonces un marcaje sPLA_{2} del grupo V-His
donde los seis residuos de His estaban unidos al extremo carboxilo
por PCR usando un cebador hGV-S y un cebador
hGV-H6AS
(5'-ctcgctgcggccgcctaatggtgatggtgatgatgggagcagaggatgttgggaaag-3')
(SEC. ID. Nº 3) y utilizando ADN plasmídico de sPLA_{2} humana
del grupo V como plantilla. Se digirieron los fragmentos de
amplificación por PCR con Sma I y Not I y se reemplazaron con el
sitio correspondiente al ADN plasmídico sPLA_{2} del grupo V.
Después de confirmar la secuencia de bases de la región como recién
amplificada por PCR, se insertó el ADNc secuencia abajo del
promotor SR-\alpha del vector de expresión para
células de mamíferos. Se transfectó el vector de expresión en
células huésped CHO usando un reactivo Lipofect AMINE (Gibco BRL)
según las instrucciones del fabricante para preparar células CHO que
expresaban de forma estable la sPLA_{2} humana del grupo V. Se
incubaron las células hasta casi la fase de confluencia en medio
\alpha-MEM que contenía un 10% de suero de
ternera fetal y se recogió el sobrenadante de cultivo para obtener
materiales para la purificación.
A partir del sobrenadante de cultivo, se
purificó la sPLA_{2} humana del grupo V usando una columna de
quelato de níquel HiTrap Chelating HP (Amersham Pharmacia Biotech)
hasta un estado homogéneo, según se vio por migración como una sola
banda en electroforesis SDS-PAGE (peso molecular:
aproximadamente 14 kDa), que se usó después en el siguiente
análisis para la degeneración de lipoproteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos
IIA o V reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC en una solución
que contenía 12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH
8,0), 125 mg/L de seroalbúmina bovina, y 1 mmol/L de cloruro de
calcio y se extrajeron los ácidos grasos liberados según el método
de Dole (Dole y col., J. Biol. Chem. 235, 2595-2599
(1960)). Se marcaron los ácidos grasos con
9-antrildiazometano por un método conocido (Hanasaki
y col., J. Biol. Chem. 274, 34203-34211 (1999)) y
se determinaron luego detectando la fluorescencia de los productos
marcados (ácidos grasos) eluidos por cromatografía líquida de alto
rendimiento ("HPLC") en columna de fase invertida (columna
LichroCART 125-4 Superspher 100
RP-18, Merck). Para examinar la liberación de ácidos
grasos dependiente del tiempo inducida por sPLA_{2} de los grupos
IIA y V, se usaron 50 nmol/L de cada sPLA_{2} y se trazó el
cambio en la liberación en el curso del tiempo en los puntos
temporales de 3, 6 y 24 horas tras la adición de sPLA_{2}. En el
experimento para la determinación de la actividad inhibidora de un
inhibidor de sPLA_{2} (indoxam) o un inhibidor de COX
(indometacina), se añadieron estos agentes a la reacción para
obtener una concentración final de 10 pmol/L, virtualmente con
simultaneidad a la adición de sPLA_{2}.
El resultado mostró que la sPLA_{2} del grupo
V liberaba los ácidos grasos muy significativamente y que la
liberación de ácidos grasos de la HDL alcanzaba una meseta 3 horas
después de la adición y continuaba durante 24 horas. Por otra
parte, la liberación de ácidos grasos de la LDL inducida por la
sPLA_{2} del grupo V continuaba aumentando durante 24 horas en el
curso del tiempo, mientras que se vio liberación de ácidos grasos
inducida por sPLA_{2} del grupo IIA en una cantidad bastante
pequeña (Fig. 7). La liberación de ácido linoleico en la liberación
de ácidos grasos inducida por sPLA_{2} del grupo V resultó
inhibida por un inhibidor de sPLA_{2} (indoxam) y no resultó
afectada por un inhibidor de COX (indometacina) (Fig. 8).
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos
IIA y V (50 nmol/L) reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC
durante 3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de
tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L de seroalbúmina
bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio y se trazó luego el cambio en
la composición de fosfolípidos de la LDL y la HDL por HPLC. Se
extrajeron los fosfolípidos de una muestra de 10 \mug de LDL y una
muestra de 15 \mug de HDL según el método de Bligh y col. (Bligh
y col., Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917
(1959)) y a continuación se cargaron los fosfolípidos en una
columna de HPLC de fase normal (sílice Ultrasphere, 4,6 x 250 mm y
4,6 x 45 mm, Beckman) de tal forma que se fraccionaron la
fosfatidilcolina (FC) y la lisofosfatidilcolina
(liso-FC) eluidas y se determinó la cantidad de
fósforo como se ha descrito con anterioridad (Saiga y col.,
Biochim. Biophys. Acta 1530, 67-76 (2001)).
El resultado mostró que el tratamiento de la LDL
con sPLA_{2} del grupo V disminuía los contenidos en FC en el
curso del tiempo, como pudo verse en los puntos temporales de 3, 6 y
24 horas, y que los contenidos en liso-FC
aumentaban de acuerdo a la disminución de la FC (Fig. 9A y B). El
tratamiento de la HDL con sPLA_{2} del grupo V descompuso la FC
mucho más rápidamente y un tratamiento de 3 horas disminuyó el
contenido en hasta aproximadamente un 30% del nivel inicial,
mientras que los contenidos en liso-FC aumentaron
también de acuerdo con la disminución de la FC. Por otra parte, el
tratamiento con sPLA_{2} del grupo IIA no mostró cambio
significativo en la composición de fosfolípidos.
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos
IIA y V (50 nmol/L) reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC
durante 3, 6 y 24 horas en una solución que contenía 12,5 mmol/L de
tampón Tris-HCl (pH 8:0), 125 mg/L de seroalbúmina
bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio y se depositaron 1 \mug de
la LDL y 2 \mug de la HDL sobre un el de agarosa (Helena
Laboratories, TITAN GEL Lipoprotein), seguido de electroforesis a 90
V durante 25 minutos. Tras la electroforesis, se secaron los geles
a una temperatura de 50 a 60ºC durante aproximadamente una hora, se
tiñeron con 6 ml de una solución de tinción (Helena Laboratories,
solución de agarosa Fat Red 7B) durante aproximadamente tres
minutos y se decoloraron después con 25 ml de una solución
decolorante (metanol al 70%). En el experimento para determinar la
actividad de un inhibidor de la sPLA_{2} (indoxam) o un inhibidor
de la COX (indometacina), se añadieron estos agentes a la reacción
para obtener una concentración final de 10 pmol/L, virtualmente de
forma simultánea a la adición de sPLA_{2}.
El resultado mostró que el tratamiento tanto de
la LDL como de la HDL con sPLA_{2} del grupo V daba lugar a un
gran desplazamiento migratorio hacia el ánodo en comparación con las
no tratadas. La migración de la HDL hacia el ánodo alcanzó una
meseta 3 horas después de la adición, de forma similar a la
liberación de ácidos grasos, y continuó durante 24 horas. La
migración de la LDL hacia el ánodo continuó aumentando durante 24
horas en el curso del tiempo. Como se ha mostrado anteriormente, la
liberación de ácidos grasos inducida por sPLA_{2} del grupo V
reveló que la carga negativa de cada lipoproteína había cambiado
(degenerada) (Fig. 10). Por otra parte, el tratamiento de cada
lipoproteína con sPLA_{2} humana del grupo IIA no dio lugar a
desplazamiento migratorio hacia el ánodo.
La degeneración de las lipoproteínas inducida
por sPLA_{2} del grupo V resultó inhibida por un inhibidor de
sPLA_{2} (indoxam) y no resultó afectada por un inhibidor de COX
(indometacina).
\vskip1.000000\baselineskip
(Efecto sobre la producción de
substancias reactivas con el ácido
tiobarbitúrico)
Se aislaron LDL y HDL de plasma humano por
ultracentrifugación (Havel y col., J. Clin. Invest. 34,
1345-1353 (1955)). sPLA_{2} humanas de los grupos
IIA y V (50 nmol/L) reaccionaron con LDL y HDL (1 mg/ml) a 37ºC
durante 24 y 3 horas, respectivamente, en una solución que contenía
12,5 mmol/L de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 125 mg/L
de seroalbúmina bovina y 1 mmol/L de cloruro de calcio y se
añadieron entonces 500 \mul de TCA al 20% y 500 \mul de ácido
tiobarbitúrico (3,35 mg/ml) a la preparación de 10 \mug de cada de
LDL y HDL en 200 \mul de solución salina fisiológica, seguido de
ebullición a 95ºC durante 60 minutos según el método de Nagano y
col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6457-6461,
(1991)). Después de enfriar, se extrajeron las substancias
reactivas con ácido tiobarbitúrico (SRATB), que son uno de los
indicadores de la peroxidación de lípidos, con
n-butanol (2 ml) y se determinó la fluorescencia en
el sobrenadante (longitud de onda de excitación: 515 nm, longitud
de onda de fluorescencia: 550 nm). Se calculó la cantidad de SRATB
en relación a una curva estándar generada usando tetraetoxipropano
como patrón.
Los resultados mostraron que no se observaba
ninguna cantidad elevada de SRATB en ninguno de los tratamientos
con sPLA_{2} de los grupos IIA y V.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon macrófagos peritoneales inyectando
2 ml de una solución de tioglicolato al 4% a ratones C57BL/6J
(machos, 8 semanas) peritonealmente, recogiendo las células
peritoneales 4 días después, plaqueando las células en un
portaobjetos de cámara, incubando durante 2 horas en presencia de
medio libre de suero (BIO WHITTAKER: X-VIVO 15) y
extrayendo luego las células no adherentes por lavado. Se añadieron
a las células 0,2 mg/ml de LDL (Sigma) y 50 nmol/L de sPLA_{2} de
los grupos IIA o V y se incubó el cultivo en el medio libre de suero
durante 48 horas. Se confirmó la captación de LDL por los
macrófagos inmovilizando las células con formaldehído al 4% durante
20 minutos y luego tinción de los lípidos con una solución de
tinción Oil Red O. Los resultados mostraron que se detectaba una
señal positiva para la tinción Oil Red O en las células tratadas con
sPLA_{2} del grupo V, lo que demostró la captación de LDL por las
células, mientras que no se detectó señal positiva alguna en las
células tratadas con sPLA_{2} del grupo IIA y en las células no
tratadas. Esto reveló que la sPLA_{2} del grupo V aumentaba la
captación de LDL por los macrófagos y tiene el potencial de
contribuir a la formación de células espumosas desarrolladas en
lesiones arterioscleróticas.
Los siguientes ejemplos de referencia demuestran
la actividad de los compuestos preferidos de la presente invención
en la inhibición de la sPLA_{2} humana de los grupos V o X.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Se insertó una secuencia de ADNc codificante de
la sPLA_{2} humana de los grupos V o X (Chen y col., J. Biol.
Chem, 1994, 269, 2365-2368; y Cupillard y col., J.
Biol. Chem, 1997, 272, 15745-15752) en dirección
hacia delante secuencia abajo del promotor de un vector de expresión
para células de mamíferos, el Vector de Expresión del Promotor
Tardío pSVL SV40 (Amersham Pharmacia Biotech). Se transfectó el
vector de expresión en células huésped CHO usando un reactivo
Lipofect AMINE (Gibco BRL) según las instrucciones del fabricante,
para obtener células CHO que expresaban de manera estable la
sPLA_{2} humana de los grupos V o X. Se incubaron las células en
medio \alpha-MEM que contenía un 10% de suero de
ternera fetal durante 3 días y se usó el sobrenadante de cultivo
para determinar la actividad de las enzimas.
Se usa el siguiente ensayo cromogénico para
identificar y evaluar inhibidores de la sPLA_{2} de los grupos V
o X. El ensayo ha sido adaptado para un rastreo de alto volumen
usando placas de microtitulación de 96 pocillos. Se encuentra una
descripción general de este en el artículo "Analysis of Human
Synovial Fluid Phospholipase A_{2} on Short Chain
Phosphatidylcholine-Mixed Micelles: Development of a
Spectrophotometric Assay Suitable for A Microtiterplate Reader",
de Laure. J. Reynolds, Lori L. Hughes y Edward A Dennis, Analytical
Biochemistry, 204, pp 190-197,1992.
Se añadió un compuesto de ensayo (o un blanco de
solvente) según la disposición predeterminada de la placa y se
provocó la reacción de diheptanoiltio-FC (1 mM) con
sPLA_{2} humana del grupo V o X en presencia de Tritón
X-100 (0,3 mM), 5,5'-ditiobis(ácido
2-nitrobenzoico) (125 \muM) en un tampón Tris (25
mM, pH 7,3), CaCl_{2} (10 mM), KCl (100 mM) y seroalbúmina
bovina. Se lee la absorbancia a 405 nm para evaluar la actividad
inhibidora.
Se llevó a cabo la reacción con sPLA_{2}
humana del grupo V a razón de 40 \mul/pocillo a 40ºC durante 45
minutos y se llevó a cabo la reacción con sPLA_{2} humana del
grupo X a razón de 15 \mul/pocillo a 40ºC durante 30 minutos.
Se determinaron los valores de la CI_{50}
representando las concentraciones logarítmicas de los compuestos de
ensayo descritos en las Tablas 1-4 frente a los
valores de inhibición en el rango de un 10-90% de
inhibición.
En la Tabla 5 se muestran los resultados de las
pruebas de inhibición de la sPLA_{2} del grupo V y en la Tabla 6
se muestran los resultados de las pruebas de inhibición de la
sPLA_{2} del grupo X:
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\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los siguientes Ejemplos de Formulación 1 a 8 son
ilustrativos. El término "ingrediente activo" significa un
compuesto que inhibe la sPLA_{2} de los grupos V y/o X, un
profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable o un
solvato de éstos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Formulación
1
Se prepara una cápsula de gelatina dura usando
los siguientes ingredientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Formulación
2
Se prepara una tableta usando los siguientes
ingredientes:
Se mezclan los ingredientes y se comprimen para
formar tabletas, con un peso cada una de 665 mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Formulación
3
Se prepara una solución de aerosol que contiene
los siguientes ingredientes:
Se mezcla el ingrediente activo con etanol y se
enfría la mezcla añadida a una porción del propulsor 22 a -30ºC y
se transfiere a un dispositivo de llenado. Se alimenta entonces la
cantidad necesaria en un recipiente de acero inoxidable y se diluye
con el resto del propulsor. Se ajustan luego las unidades de válvula
al recipiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Formulación
4
Se preparan tabletas, cada una con un contenido
de 60 mg de un ingrediente activo, como sigue.
Se mezclan bien el ingrediente activo, el
almidón y la celulosa, todos ellos pasados a través de un tamiz
U.S. de malla del Nº 45. Se mezcla la solución acuosa que contiene
polivinilpirrolidona con el polvo resultante y se pasa entonces la
mezcla a través de un tamiz U.S. de malla del Nº 14. Se secan los
gránulos así producidos a 50ºC y se pasan a través de un tamiz U.S.
de malla del Nº 18. Se añaden luego el carboximetilalmidón sódico,
el estearato de magnesio y el talco, previamente pasados por un
tamiz U.S. de malla del Nº 60, a los gránulos, los cuales, tras la
mezcla, son comprimidos en una máquina de tabletas para obtener
tabletas con un peso cada una de 150 mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Formulación
5
Se preparan cápsulas, cada una con un contenido
de 80 mg de ingrediente activo, como sigue:
Se mezclan el ingrediente activo, la celulosa,
el almidón y el estearato de magnesio, se pasan a través de un
tamiz U.S. de malla del Nº 45 y se introducen en cápsulas de
gelatina duras en cantidades de 200 mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Formulación
6
Se preparan supositorios, cada uno con un
contenido de 225 mg de ingrediente activo, como sigue:
Se pasa el ingrediente activo a través de un
tamiz U.S. de malla del Nº 60 y se suspende en los glicéridos de
ácidos grasos saturados previamente fundidos usando el mínimo calor
necesario. Se vierte entonces la mezcla en un molde de supositorios
de 2 g de capacidad nominal y se deja enfriar.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Formulación
7
Se preparan suspensiones, cada una con un
contenido de 50 mg de ingrediente activo, como sigue:
Se pasa el ingrediente activo a través de un
tamiz U.S. de malla del Nº 45 y se mezcla con la
carboximetilcelulosa sódica y el jarabe para formar una pasta
homogénea. Se diluyen la solución de ácido benzoico, el sabor y el
color con una porción del agua y se añaden con agitación. Se añade
entonces suficiente agua para producir el volumen requerido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Formulación
8
Se puede preparar una formulación intravenosa
como sigue:
Se administra la solución de los ingredientes
anteriores, en general, por vía intravenosa a un sujeto a un ritmo
de 1 ml por minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha descrito antes, los inventores de la
presente invención vieron por vez primera que las sPLA_{2} de los
grupos V y X son responsables de la aparición y el desarrollo de la
arteriosclerosis al demostrar que estas enzimas degeneran las
lipoproteínas del suero y que estas enzimas se expresan en lesiones
arterioscleróticas. La invención se basa en estos hallazgos. Los
inventores examinaron la actividad inhibidora de inhibidores de
sPLA_{2} sobre la degeneración de lipoproteínas inducida por
sPLA_{2} de los grupos V y X y mostraron que dichos compuestos
son útiles en el tratamiento de la enfermedad isquémica basada en
arteriosclerosis. Específicamente, la invención es aplicable a
medicamentos para el tratamiento y la prevención de la enfermedad
isquémica basada en arteriosclerosis debido a la inhibición de la
degeneración de lipoproteínas inducida por sPLA_{2} de los grupos
V y/o X.
Claims (18)
1. Uso de un compuesto inhibidor de las
sPLA_{2} de los grupos V o X representado por la fórmula general
(I):
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\vskip1.000000\baselineskip
donde
el anillo A es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde cualquiera de R^{1} y
R^{2} es un grupo de fórmula: -(L^{1})-(grupo ácido) donde
L^{1} es un grupo de enlace al grupo ácido y la longitud del
enlace es de 1-5, y el otro es un átomo de
hidrógeno, o un substituyente no interfiriente, o -(L^{1})-(grupo
ácido) donde L^{1} es como se ha definido anteriormente;
y
cada uno de R^{3} y R^{4} es
independientemente un átomo de hidrógeno, un substituyente no
interfiriente, un grupo carbocíclico, un grupo carbocíclico
substituido por un substituyente no interfiriente, un grupo
heterocíclico o un grupo heterocíclico substituido por un
substituyente no interfiriente; y
-B- es un grupo entre (e)-(h):
donde
R^{5} es un substituyente seleccionado entre
el grupo consistente en (j) un grupo alquilo
C_{1}-C_{20}, alquenilo
C_{2}-C_{20}, alquinilo
C_{2}-C_{20} o carbocíclico o un grupo
heterocíclico; (k) un grupo (j) como se ha descrito antes que está
substituido por uno o más substituyentes no interfirientes, cada uno
de los cuales es independientemente seleccionado; o un grupo de
fórmula: -(L^{2})-R^{8} en el que L^{2} es un
grupo de enlace divalente de 1-18 átomos
seleccionados entre un átomo de hidrógeno, un átomo de nitrógeno,
un átomo de carbono, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre, y
R^{8} es un grupo seleccionado entre (j) y (k);
R^{6} es un átomo de hidrógeno, un halógeno,
un alquilo C_{1}-C_{3}, un cicloalquilo
C_{3}-C_{4}, un cicloalquenilo
C_{3}-C_{4}, un alquiloxi
C_{1}-C_{3} o un alquiltío
C_{1}-C_{3};
R^{7} es un átomo de hidrógeno o un
substituyente no interfiriente;
R^{A} es un grupo de fórmula:
donde cada uno de R^{9} y
R^{10} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo
C_{1}-C_{3} o un halógeno; cada uno de X e Y es
independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; y Z es
-NH_{2} o
-NHNH_{2};
R^{B} es -CONH_{2} o -CONHNH_{2}; y
el anillo D es un anillo de ciclohexeno o un
anillo de benceno;
a condición de que, cuando -B- es un grupo (e) o
(f), entonces el anillo A sea un anillo (b) o (c);
o una sal farmacéuticamente aceptable o un
solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del
mismo, para la fabricación de un medicamento para suprimir la
degeneración de las lipoproteínas del suero y/o tratar o prevenir
la arteriosclerosis y/o tratar o prevenir una enfermedad isquémica
basada en la arteriosclerosis.
2. El uso según la reivindicación 1, donde el
compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado
por la fórmula general (I) en la cual
R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo de
fórmula: -(L^{3})-R^{11}, donde L^{3} es
-OCH_{2}-, -SCH_{2}-, -NH-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-, -OCH(CH_{3})- o
-O-CH-(CH_{2}CH_{2}C_{6}H_{5})-; y R^{11}
es -COOH, -CONHSO_{2}C_{6}H_{5}, -SO_{3}H o -
P(O)(OH)_{2}; y
R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo de
fórmula: -(L^{4})-R^{12} donde L^{4} es un
grupo de fórmula:
donde cada uno de R^{13} y
R^{14} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo
C_{1}-C_{10}, un aralquilo
C_{1}-C_{10}, un carboxi, un alquiloxicarbonilo
o un halógeno; y R^{12} es -COOH, -SO_{3}H o
-P(O)(OH)_{2},
a condición de que R^{1} y R^{2} no sean un
átomo de hidrógeno simultáneamente;
o una sal farmacéuticamente aceptable o un
solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del
mismo.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, donde
el compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es
mostrado por la fórmula general (I) en la cual
R^{3} es un átomo de hidrógeno o un grupo
alquilo C_{1}-C_{6}, cicloalquilo
C_{3}-C_{6}, arilo o heterocíclico y R^{4} es
un átomo de hidrógeno o un halógeno;
o una sal farmacéuticamente aceptable o un
solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del
mismo.
4. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el compuesto inhibidor de la
sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I)
en la cual
R^{5} es un grupo
-(CH_{2})_{1-6}-R^{15}
donde R^{15} es un grupo de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde cada uno de b, d, f, h, j, m
y o es independientemente un número entero de 0 a 2; cada uno de
R^{16} y R^{17} es un grupo seleccionado independientemente
entre un halógeno, un alquilo C_{1}-C_{10}, un
alquiloxi C_{1}-C_{10}, un alquiltío
C_{1}-C_{10}, un ariloxi, un fenilo y un
haloalquilo C_{1}-C_{10}; \alpha es un átomo
de oxígeno o un átomo de azufre; \beta es -CH_{2}- o
-(CH_{2})_{2}-; \gamma es un átomo de oxígeno o un
átomo de azufre; c, i y p son un número entero de 0 a 5; e es un
número entero de 0 a 7; g es un número entero de 0 a 4; y cada uno
de k y n es independientemente un número entero de
0 a 3;
0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable o un
solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del
mismo.
\newpage
5. El uso según la reivindicación 4, donde el
compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado
por la fórmula general (I) en la cual
R^{5} es un grupo
-CH_{2}-R^{18}, donde R^{18} es un grupo de
fórmula:
donde \beta es -CH_{2}- o
-(CH_{2})_{2}-; R^{19} es un átomo de hidrógeno, un
alquilo C_{1}-C_{3} o un halógeno; y E es un
enlace sencillo, -CH_{2}-, o
-O-;
o una sal farmacéuticamente aceptable o un
solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del
mismo.
6. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde el compuesto inhibidor de la
sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I)
en la cual R^{1} es -OCH_{2}COOH, o un profármaco del mismo o
una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo.
7. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el compuesto inhibidor de la
sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I)
en la cual R^{2} es un átomo de hidrógeno, o una sal
farmacéuticamente aceptable, un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del mismo.
8. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde el compuesto inhibidor de la
sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I)
en la cual R^{6} es un alquilo C_{1}-C_{3}, o
una sal farmacéuticamente aceptable, un solvato o un éster de
alquilo C_{1}-C_{6} del mismo.
9. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde el compuesto inhibidor de la
sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la fórmula general (I)
en la cual R^{A} es -CH_{2}CONH_{2} o -COCONH_{2}, o una
sal farmacéuticamente aceptable, un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del mismo.
10. El uso según la reivindicación 1, donde el
compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado
por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable, un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del
mismo.
11. El uso según la reivindicación 1, donde el
compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V es mostrado por la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
o
o una sal farmacéuticamente
aceptable, o un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del
mismo.
12. El uso según la reivindicación 1, donde el
compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del grupo X es mostrado por la
fórmula:
o una sal farmacéuticamente
aceptable, o un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del
mismo.
13. Un compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del
grupo V o X representado por la fórmula general (I):
\newpage
donde
el anillo A es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde cualquiera de R^{1} y
R^{2} es un grupo de fórmula: -(L^{1})-(grupo ácido) donde
L^{1} es un grupo de enlace al grupo ácido y la longitud del
enlace es de 1-5, y el otro es un átomo de
hidrógeno, o un substituyente no interfiriente, o -(L^{1})-(grupo
ácido) donde L^{1} es como se ha definido anteriormente;
y
cada uno de R^{3} y R^{4} es
independientemente un átomo de hidrógeno, un substituyente no
interfiriente, un grupo carbocíclico, un grupo carbocíclico
substituido por un substituyente no interfiriente, un grupo
heterocíclico o un grupo heterocíclico substituido por un
substituyente no interfiriente; y
-B- es un grupo entre (e)-(h):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde
R^{5} es un substituyente seleccionado entre
el grupo consistente en (j) un grupo alquilo
C_{1}-C_{20}, alquenilo
C_{2}-C_{20}, alquinilo
C_{2}-C_{20} o carbocíclico o un grupo
heterocíclico; (k) un grupo (j) como se ha descrito antes que está
substituido por uno o más substituyentes no interfirientes, cada uno
de los cuales es independientemente seleccionado; o un grupo de
fórmula: -(L^{2})-R^{8} en el que L^{2} es un
grupo de enlace divalente de 1-18 átomos
seleccionados entre un átomo de hidrógeno, un átomo de nitrógeno,
un átomo de carbono, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre, y
R^{8} es un grupo seleccionado entre (j) y (k);
R^{6} es un átomo de hidrógeno, un halógeno,
un alquilo C_{1}-C_{3}, un cicloalquilo
C_{3}-C_{4}, un cicloalquenilo
C_{3}-C_{4}, un alquiloxi
C_{1}-C_{3} o un alquiltío
C_{1}-C_{3};
R^{7} es un átomo de hidrógeno o un
substituyente no interfiriente;
R^{A} es un grupo de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde cada uno de R^{9} y
R^{10} es independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo
C_{1}-C_{3} o un halógeno; cada uno de X e Y es
independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; y Z es
-NH_{2} o
-NHNH_{2};
R^{B} es -CONH_{2} o -CONHNH_{2}; y
el anillo D es un anillo de ciclohexeno o un
anillo de benceno;
a condición de que, cuando -B- es un grupo (e) o
(f), entonces el anillo A sea un anillo (b) o (c);
o una sal farmacéuticamente aceptable o un
solvato o un éster de alquilo C_{1}-C_{6} del
mismo, para uso en el tratamiento de la supresión de la
degeneración de las lipoproteínas del suero y/o el tratamiento o la
prevención de la arteriosclerosis y/o el tratamiento o la prevención
de una enfermedad isquémica basada en la arteriosclerosis.
14. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del
grupo V y/o X según la reivindicación 13, donde el compuesto
inhibidor de la sPLA_{2} del grupo V y/o X es mostrado por la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable, un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del
mismo.
15. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del
grupo V según la reivindicación 13, donde el compuesto inhibidor de
la sPLA_{2} del grupo V es mostrado por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable, o un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del
mismo.
\newpage
16. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del
grupo X según la reivindicación 13, donde el compuesto inhibidor de
la sPLA_{2} del grupo X es mostrado por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable, o un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del
mismo.
17. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del
grupo X según la reivindicación 16 de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable, o un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del mismo para uso en el
tratamiento de la arteriosclerosis y/o de la enfermedad isquémica
basada en la
arteriosclerosis.
\newpage
18. El compuesto inhibidor de la sPLA_{2} del
grupo X según la reivindicación 16 de fórmula:
o una sal farmacéuticamente
aceptable, o un solvato o un éster de alquilo
C_{1}-C_{6} del mismo para uso en el
tratamiento de la arteriosclerosis y/o de la enfermedad isquémica
basada en la
arteriosclerosis.
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