TWI313300B - Saponin-decomposing enzyme, gene thereof and large-scale production system for producing soyasapogenol - Google Patents

Description

1313300 A7 B7 五、發明説明（i ) 發明的領域 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於新穎的皂角苷分解酶、其基因其使用其 之新穎大豆皂醇B之製造方法。 先前技術 大丑巷醇 B (soyasapogenol B) (12-oleanane-3，22，24-triol)係爲含於豆科植物中皂角苷類的配基（aglyc〇ne)之一， 自古來有報告出其種種生理活性。例如，有關血小板凝集 抑制作用，抗補體活性、胃炎、風濕、全身性紅斑性狼瘡 的免疫性疾病、自身免疫疾病或血栓症之預防及治療作用 之報告（Chem. Pharm. Bull.:24， 12卜129， 1 976， Chem.

Pharm. bull.·_30, 2294-2297，1 982,化學與生物 2 1:224-232,1983，特開昭6 1 — 3 7 7 4 9號）。又，有報告記載 對來自人類大腸癌及人類卵巢癌之細胞具有增殖抑制作用 (特開昭6 1 - 3 7 7 4 9號、特開平1 0 — 2 3 4 3 9 6 號）。 經濟部智慈財產苟員工消費合作社印^ 有關大豆皂醇Β的製造方法，例如可舉出，將以配糖 體狀態含於大豆種子的皂角苷類（大豆皂醇I〜V)之糖 鏈’經化學水分解之方法。然而，此方法經酸水分解之條 件會產生副產物而效率不佳。又，已知大豆種子中亦含有 ，配基上具有大豆皂醇Α (大豆皂醇A 1〜A 6 )或大豆 皂醇E之皂角苷類。因此，由大豆欲得到大豆皂醇B時因 較易夾雜大豆皂醇A或大豆皂醇E，由其中僅純化大豆皂 醇B係爲困難的事。又，含於大豆種子的皂角苷之比率’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4 - 1313300 A7 B7 五、發明説明（2 ) —般約爲0 . 2% (藥學雜誌104，162 - 168， 1 9 8 4 )，期待更高效率地製造。 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 作爲使用微生物製造大豆皂醇B的方法，例如已知有 可舉出放射線菌屬（Chem. Pharm. Bull. :32, 1 287- 1 293,1 984 )及青黴菌屬（特開平1 〇 - 2 3 4 3 9 6號）所使用的 方法。然而，使用這些微生物時，大豆皂醇B的生產性較 低’且無實用性。 又，使用放射線菌屬的微生物所生產之酵素（/9 -葡 萄苷酸酶）、或含有該酵素之培養物，水分解Θ -葡萄苷 酸皂角苷類，製造葡糖醛酸作爲還原末端之酸性寡糖的方 法中，會產生副產物的大豆皂醇B (特公平7 -32714號）。然而，該方法係爲酸性寡糖的製造方法 ’該報告中，大豆皂醇B僅能做定性確認。又該報告中， 具有目的活性之酵素而言，可判斷出其分子量，但無法明 確其胺基酸序列。 經濟部智慧財凌局a(工消費合作社印製 另一方面，檢索作爲配基的配糖體進行選擇性水分解 後可高效率地生產大豆皂醇B之微生物結果，發現 Neocosmospora 屬及 Eupenicillum 屬的絲狀菌。 Neocosmospora屬及Eupenicillum屬的絲狀菌，培養於含有 皂角苷類（大豆皂醇B作爲配基的配糖體）的培養基中， 於培養物中可生產、累積高濃度的大豆皂醇B (參照國際 公開W0 01/81612號）。 作爲如此的絲狀菌，例如可舉出 Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF1 225 株、Eupenillium 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） -5- 1313300 A7 B7 五、發明説明（3) brefeldianumPF1226 株（參照國際公開W〇 〇 1/ 8 1 6 1 2 號）。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 因可直接使用該菌，可依據培養基中所添加的皂角苷 類的量，而達到生產大豆皂醇B的目的’但皂角苷類因有 表面活性作用而較易起泡，故限制添加於培養基的皂角音 類的量。又，添加皂角苷類的培養物，因有表面活性作用 而推測粘度會提高。因此，由該培養物生產目的物時，欲 提升回收率，必須重複數次操作萃取歩驟。且，作爲可有 效率地供給皂角苷類之天然資源，一般爲大豆萃取物，但 該大豆萃取物中，一般含有皂角苷類以外的成分，例如油 酯、蛋白質及多糖類等。因此，培養基中可添加的皂角苷 類的量，依舊依據該大豆萃取物的純度而決定，效率地進 行生產並非容易。 作爲無需如過去的方法必須依賴大豆萃取物中的皂角 苷含量，可有效率地生成大豆皂醇B，且維持其高回收率 之方法，係爲必須使用皂角苷分解酶之酵素反應而大量製 造大豆皂醇B之方法。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明的內容 本發明者成功地由具有皂角苷分解活性的微生物，單 離純化具有皂角苷分解活性之蛋白質（以下稱爲「皂角苷 分解酶」），且定義出該編碼基因。本發明者更使用所得 到之基因，於異種宿主中使其表現，得到高活性之皂角苷 分解酶。且使用所得之皂角苷分解酶進行酵素反應，而有 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6- 1313300 A7 B7 五、發明説明（4 ) 效率地製造出大豆皂醇B。本發明即基於此所完成者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此，本發明的目的爲提供，可生產具有皂角苷分解 活性之蛋白質，更詳細而言，大豆皂醇B作爲配基之配糖 體經分解可生產大豆皂醇B之蛋白質，編碼如此蛋白質的 聚核苷酸，及使用其可大量生產大豆皂醇B之方法。 本發明的蛋白質係選自下述所成群； (a )含有選自序列號碼2、4及6所示胺基酸序列 所成群之胺基酸序列所成的蛋白質、 (b )含有對於含前述（a )胺基酸序列之蛋白質而 言，至少具有5 0 %相同性之胺基酸序列，且具有皂角苷 分解活性之蛋白質、或 (c )含有前述（a )胺基酸序列中1或複數個胺基 酸殘基經缺失、取代、插入或附加之胺基酸序列，且具有 皂角苷分解活性之蛋白質。 本發明的聚核苷酸係選自下述所成群者： (i )有選自序列號碼1 、3及5所示鹼基序列所成 群之鹼基序列所成的聚核苷酸、 經濟部皙慧財4局員工消費合作社印製 (i i )對於前述（i )鹼基序列所成之聚核苷酸而 言，具有至少7 0 %相同性之鹼基序列所成，且編碼皂角 苷分解活性之蛋白質之聚核苷酸、 (i i i )前述（i )的胺基酸序列中1或複數個鹼 基經缺失、取代、插入或附加之鹼基序列所成，且編碼具 有皂角苷分解活性之蛋白質之聚核苷酸、及 (i v )與前述（i )的鹼基序列所成之聚核苷酸’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1313300 A7 B7 五、發明説明（5 ) 於嚴謹條件下進行雜交，且編碼具有皂角苷分解活性之蛋 白質之聚核苷酸。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的重組載體含有本發明的聚核音酸所成。 又，本發明的宿主係經上述重組載體而轉形所成者。 本發明的目的蛋白質之製造方法係含有，培養上述經 轉形之宿主，由所得之培養物中採收具有皂角苔分解活性 之蛋白質者。 本發明可得到高活性的皂角音分解酶。又，使用彼可 由皂角苷有效率地得到大量大豆皂醇B。該方法中，例如 不會因大豆萃取物中皂角苷含量，而得到大豆皂醇B。 〔圖面的簡單說明〕 圖1表示，質體p C B - S B e的構成及限制酶圖譜 〇 經濟部智慧財產局，h工"費合作社印製 圖2表示，實施例5的重組皂角苷分解酶之最適PH 結果。圖中，野生型SDN表示來自 Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF1225 株的巷角音分解酶’又重 組型S D N表示重組皂角苷分解酶。 圖3表示，實施例5的重組皂角苷分解酶之最適溫度 結果。圖中，野生型SDN表示來自 Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF1225 株的皂角苷分解酶’又重 組型S D N表示重組皂角苷分解酶° 圖4表示，質體pCB — SDAe的構成及限制酶圖 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1313300 A7 B7 五、發明説明（6) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖5表示，實施例8的重組皂角苷分解酶之最適pH 結果。圖中，野生型SDA表示來自麴菌（Aspergillus sp. )PF1224株的皂角苷分解酶，又重組型SDA表示 重組皂角苷分解酶。 圖6表示，實施例8的重組皂角苷分解酶之最適溫度 結果。圖中，野生型SDA表示來自麹菌（Aspergillus sp. )PF1224株的皂角苷分解酶，又重組型SDA表示 重組皂角苷分解酶。 圖7表示，質體PCB — SDE s的構成及限制酶圖 譜。 圖8表示，實施例1 2的重組皂角苷分解酶之最適 PH結果。圖中，野生型SDE表示來自 Eupenillium brefeldianum PF 1 226株的皂角苷分解酶，又重組型S D E 表示重組皂角苷分解酶。 經濟部智恁財產^7員工消f合作社印製 圖9表示，實施例1 2的重組皂角苷分解酶之最適溫 度結果。圖中，野生型SD E表示來自 Eupenillium brefeldianum PF1226株的皂角苷分解酶，又重組型s D E表 示重組皂角苷分解酶。 圖1 0表示S D N、S D A、及S D E的相同性比較 結果。 〔發明的具體說明〕 微牛物的寄存

Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF1225 株於 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部智慧財產局a(工消費合作社印製 1313300 A 7 ______B7 五、發明説明（9 ) 分生孢子柄形成粗麵、無色、頂囊爲棒狀〜亞球形，幾乎 全面形成aspergilla。aspergilla爲混合1條、2條者，但一 般爲2條。細錐體爲8〜1 2 X 4〜5 β m、擔子柄爲8 〜1 2x 3〜4/im。分生孢子爲球形〜亞球形、平滑面 ’ 4 〜6 # m。 使用麴菌（Aspergillus sp_ ) P F 1 2 2 4 株，進行 /3 一葡萄苷酸酶的確定時，本發明者由麴菌（Aspergillus sp. )P F 1 2 2 4株單離、純化之皂角苷分解酶爲分子量 9OkDa ，最適pH5〜6 ，最適溫度爲45〜50°C (參照參考例）。 且，由 Eupenicillium brefel dianum PF1226 株所分離 、純化之皂角苷分解酶爲分子量90kDa ，最適PH5 〜6，最適溫度爲45〜45 °C。 該公報中因未揭示/3 -葡萄苷酸酶的胺基酸序列等之 情報，而無法比較胺基酸序列等之相同性，故由蛋白質的 分子量及亞單位構造來做比較判斷，其結果，得知與該公 報所記載的；5 -葡萄苷酸酶爲相異的蛋白質。 如前述，本發明爲提供選自如下述所成群之蛋白質。 (a )含有選自序列號碼2、4及6所示胺基酸序列 所成群之胺基酸序列所成的蛋白質、 (b )含有對於含前述（a )胺基酸序列之蛋白質而 言，至少具有5 0 %相同性之胺基酸序列，且具有皂角苷 分解活性之蛋白質、或 (c )含有前述（a )胺基酸序列中1或複數個胺基 本紙铁尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -----.---1#表------、玎------Φ— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1313300 Α7 Β7 五、發明説明（10) 酸殘基經缺失、取代、插入或附加之胺基酸序列’且具有 皂角苷分解活性之蛋白質。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 即，本發明的蛋白質爲，含有與序列號碼2 ' 4或5 所示的胺基酸序列相同、或實質上相同之胺基酸序列的蛋 白質。 其中，與序列號碼2、4或6所示胺基酸序列實質上 相同的胺基酸序列中，與這些序列號碼所示的任意胺基酸 序列之相同性爲，典型爲5 0 %以上，較佳爲7 0 %以上 、較佳爲8 0 %以上，更佳爲9 0 %以上，特佳爲9 5 % 以上，最佳爲9 8 %以上之胺基酸序列。 且，本發明說明書中所示的該相同性之任意數値，僅 爲斯業者使用公知的相同性檢索程式所算出的數値即可， 例如FASTA、BLAST等中可使用初期設定之參數 而容易算出。 例如使用相同性檢索程式（Genetyx公司製）之初期設 定之參數可算出相同性數値爲， S D N與S D A之間的相同性爲5 1 %、 經濟部智总財產局員工消費合作社印製 S D A與S D E之間的相同性爲5 2 %、 S D E與S D N之間的相同性爲5 1 %。 又，含有與序列號碼2、4或6所示的胺基酸序列與 實質上相同之胺基酸序列的蛋白質係爲，任意的這些胺基 酸序列中含有1或數個胺基酸序列經缺失、取代、插人或 附加之胺基酸，且具有皂角苷分解活性之蛋白質。 其中，可缺失、取代、插入或附加的胺基酸殘基數目 ϋ伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ ' '~~'~~ !3133〇〇 A7 B7 五、發明説明（η) ’ 1〜50個爲佳，較佳爲1〜30個、更佳爲1〜10 個、特佳爲1〜5個、最佳爲1〜2個。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明較佳型態之一中，前述C b )的蛋白質爲，前 述胺基酸序列（a )的1或複數個胺基酸殘基由經保存性 取代之胺基酸序列所成，且具有皂角苷分解活性之蛋白質 0 經濟部智慈財產笱肖工消費合作社印製 該「保存性取代」意味著實質上不改變蛋白質的活性 下’將1或複數個胺基酸殘基，由其他化學性類似的胺基 酸殘基所取代。例如可舉出某疏水性殘基以別的疏水性殘 基取代之狀況、與具有某極性殘基相同的電荷之其他極性 殘基所取代之狀況。與如此可進行保存性取代之功能性類 似之胺基酸，於該技術領域而言爲公知的。若舉出公知例 ，作爲非極性（疏水性）胺基酸可舉出丙胺酸、纈胺酸、 異亮胺酸、亮胺酸 '脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸 等。作爲極性（中性）胺基酸可舉出甘胺酸、絲胺酸、蘇 胺酸、酪胺酸、谷氨醯胺、天門冬醯胺、半胱胺酸 '組胺 酸、賴胺酸等。又，作爲具有負電荷的（酸性）胺基酸可 舉出天門冬醯胺基酸、谷胺酸等。 本發明中，「具有皂角苷分解活性之蛋白質」定義爲 可由斯業者評估確認可分解皂角苷之活性的蛋白質，例如 亦可意味，於實施例5相同條件下測定時評估確認有皂角 苷分解活性的蛋白質。該蛋白質可由後述的「具有皂角苷 分解活性之生物」單離、純化而得。 本發明的蛋白質例如可由下述獲得。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14 - 1313300 A7 B7 五、發明説明（12) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 培養具有皂角苷分解活性的生物，由該培養液中以巷 角苷分解活性作爲指標，單離、純化具有皂角苷分解活性 之蛋白質。解析所得之純化蛋白質之胺基酸序列’合成編 碼此之寡核苷酸，該生物的D N A作爲模版進行P C R ( Polymerase Chain Reaction)合成長鏈探針。使用該探針使 用逆向（inverse ) PCR 或 RACE ( Rapid Amplification of cDNA Ends，快速c D N A末端增幅方法）法解析皂角苷 分解酶基因的轉譯區之D N A序列。將此所得之皂角苷分 解酶轉譯區與，使用於表現的宿主內功能控制序列連接， 得到表現載體。使用該表現載體轉形該宿主，培養該轉形 體而可得到皂角苷分解酶。 經濟部智慧財4局肖工消費合作社印製 其中「具有皂角苷分解活性之生物」，僅爲具有皂角 苷分解活性者並無特別限制，包含微生物、植物等。如此 微生物例如包含Neocosmospora屬、麹菌屬或Eupenicillum 屬的絲狀菌。這些菌使用於味增或醬油的釀造，其具有皂 角苷分解活性係爲已知的事。又可預測該微生物中，放射 線菌及細菌等亦具有皂角苷分解活性存在，故包含這些生 物。作爲該植物，例如可預測到對豆科植物的皂角苷類之 糖轉移酵素具有可逆反應之觸媒的存在，故包含如此的植 物體、植物細胞、來自如此植物的癒傷組織、或培養細胞 〇 本發明的較佳型態之一，即爲本發明的蛋白質或聚核 苷酸來自微生物，較佳爲絲狀菌的微生物。該絲狀菌的微 生物較佳爲Neocosmospora屬、麴菌屬或Eupenicillum屬的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15- 1313300 A7 B7 五、發明説明（13) 絲狀菌。 其中，作爲 Neocosmospora屬的絲狀菌，例如可舉出 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF1 225 株（寄存號 碼FERM BP - 7475)或其突變株。作爲麴菌屬 的絲狀菌例如可舉出麹菌（Aspergillus sp.) P F 1 2 2 4 株（寄存號碼FERM P— 1 8344)或其突變株6 又作爲Eupen】ci]】um屬的絲狀菌，例如可舉出Eupenicillium brefel dianum PF1 226 株（寄存號碼 FERM BP — 7476)或其突變株。 聚核苷酸 本發明提供一種編碼蛋白質的聚核苷酸。 本發明典型的聚核苷酸係選自前述（1 )〜（i V) 所成群者。 即，本發明的其中一型態，聚核苷酸係選自於序列號 碼1、3及5所示的鹼基序列所成群之鹼基序列所成。 經濟部智慈財凌苟肖工消費合作社印製 本發明的另一型態爲，具有對聚核苷酸爲序列號碼1 、3或5所示的鹼基序列所成的聚核苷酸而言至少7 0% 相同性之鹼基序列所成，且編碼具有皂角苷分解活性之蛋 白質者。序列號碼1 、3或5所示的鹼基序列的相同性， 較佳爲8 0 %以上，更佳爲9 0 %以上，特佳爲9 5 %以 上，最佳爲98%以上。 且，本發明說明書所記載的任意相同性數値，僅爲斯 業者使用公知的相同性檢索程式所算出的數値即可，例如 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】〇乂297公釐） -16- 1313300 A7 B7 五、發明説明（14) 使用例如FAS TA、BLAST等中可使用初期設定之 參數而容易算出。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的另一型態爲，聚核苷酸係由序列號碼1 、3 或5所示的鹼基序列中1或數個鹼基經缺失、取代、插入 或附加之鹼基序列所成，且編碼具有皂角苷分解活性之蛋 白質者。 其中，可缺失、取代、插入或附加的鹼基數目，1〜 5 0個爲佳，較佳爲1〜30個、更佳爲1〜1 〇個、特 佳爲1〜5個、最佳爲1〜2個。 本發明的更另一型態爲，聚核苷酸與序列號碼1 、3 或5所示的鹼基序列所成的聚核苷酸，於嚴謹條件下進行 雜交，且編碼具有皂角苷分解活性之蛋白質者。又本發明 的聚核苷酸包含，對於如此編碼具有皂角苷分解活性之蛋 白質之聚核苷酸爲互補性聚核苷酸。 經濟部智惡財產^肖工消費合作社印製 於此的「嚴謹條件」係爲，含有編碼本發明蛋白質的 一部份或全部胺基酸序列之鹼基序列的探針，與編碼相同 體之基因進行雜交時，控制該探針不會與具有特公平7 -3 2 7 1 4號所記載的分子量之/3-葡萄苷酸酶進行雜交 之條件而言。具體而言，例如作爲探針使用具有編碼經標 識化序列號碼1 、3或5所示胺基酸序列之聚核苷酸全長 者，依據E C L直接D N A / R N A標識檢測系統（阿馬 夏公司製作）的方法，首先做1小時的預雜交（4 2 °C ) 後，添加前述的探針，進行1 5小時的雜交（4 2 °C ) ’ 再使用添加0·4%SDS及6M尿素之0·5M濃度 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公嫠） -17- 1313300 A7 B7 五 '發明説明（15)

Ssc (SSC;15mM檸檬酸三鈉、15〇mM氯化 鈉）以4 2°C下2 0分鐘的洗淨重複2次，再使用5倍濃 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 度的S S C於室溫（約2 5 t )下進行2次的洗淨之條件 0 重組載體 本發明提供含有前述聚核苷酸的重組載體。 本發明的重組載體的構築順序及方法，可使用基因工 程學領域的習用方法。 作爲可使用於本發明的表現載體，可舉出可插入宿主 .染色體DMA者或具有可自身複製的自律性複製序列之在 體，於宿主細胞內以質體狀態存在者。例如，可舉出 PUC 系（pUC18 或 PUC118 等）、pBluescript 系（pBluescriptll KS +等）、及PBR322等之質體。存在 於宿主細胞內的基因重複數，可單一或複數皆可。 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 重組載體的控制序列，僅爲宿主中有功能之控制序列 即可，並無特別限制，例如可使用啓動子及終止密碼子等 。如此控制序列可與，編碼具有皂角苷分解活性之蛋白質 的基因連結而表現。 對於控制序列的連結，例如可依常法將編碼目的蛋白 質的基因（目的基因）的轉譯區’插入於啓動子下游順方 向而進行。此時，目的基因與編碼其他蛋白質的轉譯區之 外來基因連結，作爲融合蛋白質而表現。 被表現的具有皂角苷分解活性之蛋白質或具有該活性 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18- 1313300 A7 B7 五、發明説明（16) 之融合蛋白質’可產生於使用於表現的宿主細胞內或分泌 於培養基中亦可。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如來自 Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF 1 225株（寄存號碼F E R Μ B P - 7 4 7 5 )的皂角 苷分解酶，由D N A序列解析及N末端胺基酸解析可知N 末端邊具有2 6個胺基酸殘基之信號序列（參照實施例 )。同樣地，得知來自麴菌（Aspergillus sp.) P F 1 2 2 4 株（寄存號碼FERM P—18344)的皂角苷分解 酶，及來自 Eupenicillium brefel dianum PF 1 226 株（寄存號 碼FERM BP—7476)的皂角苷分解酶’分別於 N末端邊具有2 8個胺基酸殘基及1 7個胺基酸殘基之信 號序列。 因此，使用例如木黴菌屬及麴菌屬等的絲狀菌作爲宿 主使用時，可直接利用含於本序列的信號序列而分泌於培 養基中。 經齊部智慈財4笱8工消費合作社印製 又，來自 Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF1 225株的皂角苷分解酶的分子量約7 7 kD a係由，推 定胺基酸組成之預測分子量6 8 k D a與大腸桿菌及 Trichoderma viride株中表現之蛋白質分子量約爲6 8 k D a ，而推測爲糖蛋白質。同樣地，來自麴菌（ Aspergillus sp.) P F 1 2 2 4株的皂角苷分解酶的分子量 約9 0 k D a及Trichoderma viride株中表現之蛋白質分子 量約爲8 0 k D a係由，推定胺基酸組成之預測分子量 65kDa ，而推測爲糖蛋白質。又，來自Eupenicillium 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19- 1313300 A7 B7 五、發明説明（17) brefel dianum PF 1 226株的皂角苷分解酶的分子量約爲9 Ο k D a係由推定胺基酸組成之預測分子量6 5 k D a而推 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 測爲糖蛋白質。 這些糖鏈雖預測對活性表現並無太大影響，但期待對 耐熱性或最適P Η的變化、保存安定性等有貢獻效果，可 進行種種糖鏈的附加等轉譯後修飾。 本發明的重組載體更與藥劑耐性基因及/或營養缺陷 型互補基因等之選擇標記基因連結而製作。 經濟部智怂財4笱員工消費合作社印製 標記基因依轉形體的選擇方法而適當做選擇。例如可 使用編碼藥劑耐性的基因或與營養缺陷型互補的基因。作 爲藥劑耐性基因例如可舉出，對於D e s t 〇 m y c i η、B e η 〇 m y 1、 寡黴素、Hygromycin、G418、Bleomycin、Biaraphos、保米 黴素S、腐草黴素、Phosphinothrcin、安比西林、鏈黴素、 嘉寧黴素等藥劑的基因。作爲與營養缺陷型互補之基因， 例如可舉出 a m d S 、p y r G 、a r g B 、 t r d C 、 n i a D ' T R P 1、L E U 2、U R A 3 等基因。又， 使用於表現如各種胺基酸合成系、維他命合成系、核酸合 成系等之宿主與原來具有的營養缺陷型互補之標記基因’ 或加以各種突變處理賦予缺陷型，可含有對於此之與營養 缺陷型互補之標記基因。 轉形體及日的蛋白質的牛.產 本發明提供經由前述重組載體的轉形宿主。 作爲可使用於本發明的宿主，僅爲編碼具有皂角苷分 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20- Α7 Β7 1313300 五、發明説明（18) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 解活性之蛋白質的基因可正確轉錄或轉譯的生物即可，並 無特別限制，例如可舉出大腸菌及桿菌等的細菌、放射線 菌、酵母、木黴菌屬等絲狀菌、或屬於這些的微生物之突 變菌株等。 使用於導入宿主的基因表現之重組載體，可依據常法 進行。作爲導入法，例如可舉出電穿透作用法、聚乙二醇 法、原野菌法、鋰法或氯化鈣法等，選擇宿主細胞較佳效 果之方法。 轉形體（經轉形的宿主細胞）之培養，依據一般方法 ，選擇適當的培養基、培養條件等進行。 經濟部智慧財產局爵工消費合作社印製 作爲培養基，一般常用的成分，例如作爲碳源，可舉 出葡萄糖、蔗糖、纖維素、麥芽糖、糊精、澱粉'甘油、 糖蜜、動植物油等。又，作爲氮素源，可舉出大豆粉、小 麥胚芽、玉米粉、棉子粕、肉湯'腺'酵母菌萃取物、硫 酸銨、硝酸鉀、尿素等。若必要可添加可生成鈉、鉀、鈣 、鎂、鈷、氯、磷酸、硫酸及其他離子的無機鹽類，例如 氯化鉀、硫酸鎂、磷酸一鉀、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸銅等 亦有效。又，若必要可添加各種維他命、胺基酸、核苷酸 等微量營養素、抗生素等的藥劑。且，適當添加幫助轉形 體的發育、促進導入基因的表現之有機物及無機物。 含有選自這些成分之培養基進行培養。 作爲培養方法，例如使用液體培養基的狀況下，可舉 出好氣性條件下的培養法、振動培養法、通氣攪拌培養法 或深部培養法。培養基ρ Η可例如爲ρ Η 5〜8程度。培 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210'Χ297公釐） -21 - A7 1313300 __ B7 五、發明説明（19) 養溫度爲一般條件，例如溫度1 4 °C〜4 0 t，較佳爲 2 6 t：〜3 7 °C。培養日數爲1天〜2 5天條件下進行。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 對於本發明的目的蛋白質之製造方法，由經轉形的細 胞之培養物中，可取得作爲目的的基因表現物之具有皂角 苷分解活性的蛋白質β由培養物取得目的蛋白質可依據一 般方法進行，例如由培養物的萃取（磨碎處理、加壓破碎 等）、回收（過濾、離心分離等）、及/或純化（鹽析法 '溶劑沈澱法等）等的方法經適當地組合而進行。又，這 些步驟中，若必要可添加苯基甲基磺醯氟（PMSF)、 苯甲脒或亮肽素等蛋白酶阻斷劑。 本發明的其他型態而言，編碼具有皂角苷分解活性之 蛋白質的基因經由表現於大豆、四季豆、紅豆、豌豆、花 生、蠶豆或苜蓿花等，創造出含有大豆皂醇Β的植物體， 由此亦可直接得到大豆皂醇Β。此時可使用於肌動蛋白、 泛醌、菜花嵌合病毒3 5 S啓動子等、或種子等部位會表 現特異性的基因之控制區。 經濟部智慈財產局8工消費合作社印製 如此的控制區可正確與編碼具有皂角苷分解活性之蛋 白質的基因連結，且若必要更可與Biaraphos、嘉寧黴素或 保米黴素S等藥劑耐性標記基因連結。對此可使用基因槍 、P E G法、電穿透法或微注射法等直接導入法、或經由 原野菌屬的T 1質體載體進行間接導入法等而導入植物細 胞，而做出轉形植物細胞。對於植物細胞或植物的基因導 入法，例如可依據Vaeck M.氏的方法（Nature: 328，3 3- 37, 1987 )所記載的方法實施。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐") ~ 1313300 A7 B7 五、發明説明（20) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如此經轉形的植物細胞，可經由斯業者熟悉的方法進 行再分化’而得到完全植物體的轉形植物。且，栽培該轉 形植物’由取得編碼該植物全體及/或具有皂角苷分解活 性之蛋白質的基因所表現的器官、例如種子等，再由此依 據該性狀的方法，例如溶劑萃取法等，取得大豆皂醇B ^ 大豆皂醇B的牛高 本發明的另一型態爲提供大豆皂醇B的製造方法，其 爲含有使用前述經轉形的宿主中可得到含具有皂角苷分解 活性蛋白質之培養物，分解以大豆皂醇B作爲配基之配糖 體的大豆皂醇B製造方法。 又’本發明的另一型態，係含有使用至少一種選自前 述蛋白質、及前述經轉形的宿主所得之蛋白質所成群，分 解以大豆皂醇B作爲配基之配糖體的大豆皂醇B製造方法 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其中，「以大豆皂醇B作爲配基的配糖體」，係主要 含有豆科植物體者，例如，soyasaponin I 、II、III、IV、V 、 azukisaponin II 、 V 、 astragaloside VIII 、 sophoaraflavoside I 等 ° 又，作爲含有大豆皂醇B爲配基的配糖體之物質，例 如可舉出由大豆或脫脂大豆（大豆粕）經熱水、醇或含有 醇萃取之物質，較佳爲依據一般方法將蛋白質、糖質、脂 質糖之雜物除去所得之物質。 本發明中，如此含有以大豆皂醇B作爲配基的配糖體 -23 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS >八4規格（2丨〇乂297公釐） 1313300 A7 B7 五、發明説明（21) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 之物質、及/或該配糖體中，使具有皂角苷分解活性的蛋 白質、或由本發明宿主所得之蛋白質進行作用’得到大豆 皂醇B。 舉出具體例子，例如皂角苷（小城製藥公司製作）溶 解於1重量％〜1 0重量％的水或緩衝液，例如溶解於醋 酸緩衝液或磷酸緩衝液等，於此添加皂角苷分解酶。於適 當溫度，例如2 0 °C〜5 0 t：下進行反應，該反應液以醋 酸乙酯等有機溶劑進行萃取，得到大豆皂醇B。 〔實施例〕 由下述實施例對本發明做詳細說明’但本發明不被限 制於此。 參考例1 :麴菌屬的皂角苷 麴菌PF1224株（寄存號碼FERM P — 1 8 3 4 4 )的P D A傾斜培養約1 c m 2植菌於分裝有 lOOmiTS培養基（2 · 0%可溶性澱粉、1 . 0% 經濟部智慧財產苟2(工消費合作社印製 的葡萄糖、0 . 5 %的聚肽、0 · 6 %的小麥胚芽、 0 . 3%的酵母菌萃取物、0 _ 2%的大豆粕、及0 . 2 %的碳酸鈣C殺菌前PH7 · 0))的500ml的三角 錐形瓶中，於2 5 °C下振動培養3天。該4 m 1再植菌於 分裝有1 0 Om 1之添加4 . 0%的大豆皂角苷（小城製 藥公司製作）的MY培養基（4·〇%麥芽萃取物' 2 · 0%酵母菌萃取物、0 . 2%硫酸銨、〇 . 03%硫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -24- 1313300 A7 B7 五、發明説明（22) 酸鎂· 7水合物、〇 . 0 3 %氯化鈣· 2水合物（P Η (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 7 . 〇))之500ml的三角錐形瓶中，振動培養3天 〇 且，以下的來自麴菌屬的皂角苷分解酶之純化，以試 驗例1所示的皂角苷分解活性作爲指標。 約8 0 0 m 1的該培養液以玻璃過濾器（G 3 )過濾 後’經離心分離（8 , 0 0 0 r p m，3 0分鐘）後除去 菌體殘渣。對約5 7 0 m 1的該培養液之澄淸液而言，加 入2 9 4 g的硫酸銨，所生成的沈澱物經離心分離（ 8， 000rpm，30分鐘）而回收。該沈澱物溶解於 約1 2 0 m 1的緩衝液A ( 〇 . 1 Μ硫酸鈉緩衝液、1 Μ 硫酸錢（ρΗ5 8))，提供於 ButylToyopearl 6 50 S (26mm i.d.X 330mm)(東曹公司製 )的疏水色層分析儀。溶離則使用由緩衝液B ( 〇 . 1 μ 磷酸鈉緩衝液、1 Μ硫酸銨（Ρ Η 5 . 8 ))進行〇 . 1 Μ磷酸鈉緩衝液（p Η 5 . 8 )的濃度梯度，回收非吸附 分率及硫酸銨濃度爲1 Μ至0 . 5 Μ之間所溶離的分率。 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 經回收的分率使用Pellicon XL (分率分子量 1 0, 0 0 0 ) ( milipore公司製）經濃縮後，加入1 μ的

T r i s - N a C 1緩衝液及硫酸銨至與緩衝液C ( 5 〇 m M Tr i s—NaC 1緩衝液、1Μ硫酸銨（pH 5 · 8 ))相同濃度，提供於Resource PHE，6 m 1 (阿 馬夏生科公司製作）的疏水色層分析儀。溶離則由緩衝液 C 進行 5〇mM Tr i s—NaC 1 緩衝液（pH >25- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公瘦） 1313300 A7 B7 五、發明説明（23) 7 · 5 )的濃度梯度，回收非吸附分率。 所得分率使用Ultrafreel5(分率分子量5，0 0 0 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (mUipore公司製）進行濃縮，提供於Superdex 200 P g (16mm i.d.X 600mm)(阿馬夏生 科·公司製作）的膠體過濾色層分析儀。溶離則使用緩衝液 D ( 2 5 m Μ磷酸鈉緩衝液、〇 · 1 5 Μ氯化鈉（p Η 5.8)進行，分率分子量約爲90kDa的分率。 對該分率進行SDS - PAGE，結果觀察到分子量 約爲9 0 k D a的單一帶。 例1 :皂角苷分解活件的測定 · 經濟部智慧財產局資工消費合作社印製 將含有目的酵素之酵素液，經P D — 1 〇管柱（阿馬 夏生科公司製作）經脫鹽後，混合等量的2 %皂角苷溶液 ’於3 7 °C下反應約1 6小時。將此以等量的醋酸乙酯進 行萃取，將此萃取液以T L C (所使用的溶劑系爲氯仿： 甲醇=9 5 : 5 )進行展開。利用香草醛硫酸進行顯色反 應’檢測出R f値〇 . 3 5的大豆皂醇B而測定出目的酵 素液的酵素活性。 14驗例2 :皂角苷分解活件的定量分析 5 0 # 1的2%皂角苷溶液中，加入經稀釋的酵素至 1 〇 〇 V丨’機此進行3 0分鐘。再將此以等量的醋酸乙 酯進行萃取，其中50β 1以450// 1的移動相進行稀 釋。其中1 〇 # 1提供於下述的筒速液體色層分析儀中， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） -26- 1313300 A7 B7 五、發明說明（24 ) 測定保持時間約7 . 5分鐘之波峰高度。此與標準大豆皂 醇B的波峰高做比較，定量該酵素的皂角苷分解活性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 管柱：InertsilODS-2.5"m ( 4 . 6 i . d _ X 2 5 0 n m )

管柱溫度：4 Ο °C 移動相：乙腈：甲醇··水=5 Ο : 3 5 ·· 1 5 移動相流速：0 · 8 m 1 /m i η

青施例1 :來自 Neocosmospara屬的皂角符分辉酿（S D bL )夕跫離純化

Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF1225 株（寄存號碼 FERM BP — 7475 ) 的P D A傾斜培養約1 c m 2植菌於分裝有1 〇 〇 m 1 T S培養基的5 0 0 m 1三角錐形瓶中，於2 5 °C下振動 培養3天。該4ml再植菌於分裝有1〇〇ml之添加 4 · 0%的大豆皂角苷（小城製藥公司製作）的MY培養 基之5 0 0 m 1的三角錐形瓶中，經振動培養3天。 經濟部智慧財產s工消費合作社印製 且，以下的來自Neocosmospara屬的巷角音分解酶之純 化，以試驗例1所示的皂角苷分解活性作爲指標。 約8 0 0 m 1的該培養液以約2倍的水稀釋，經離心 分離（8, 000rpm，30分鐘）後除去菌體。於此 加入1 7 1 g的硫酸銨，所生成的沈澱物經離心分離（ 8，0 0 0 r pm，3 0分鐘）而回收。該澄淸液再加入 573g的硫酸銨經離心分離（8, 000 r pm ’ 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27- 1313300 A7 B7 五、發明説明（25 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 分鐘）回收沈澱物’將此溶解於約7 0 m 1的緩衝液c。 提供於 ButylToyopearl 650S (26mm i.d.x 110mm)(東曹公司製）的疏水色層分析儀。溶離則 使用由緩衝液C進行5 OmM磷酸鈉緩衝液（PH7 . 5 )的濃度梯度，回收非吸附分率。 約5 0 0m 1的該分率加入約2 3 9 g的硫酸銨，得 到的沈澱物經離心分離回收。再將此經回收的沈澱物，溶 解於4 m 1的緩衝液B中，提供於Phenyl Sepharose FF ( 16mm i.d.X 100mm)(阿馬夏生科公司 製作）的疏水色層分析儀。溶離則由緩衝液B進行〇 . 1 M Tris—NaCl緩衝液（ρΗ5.8)的濃度梯 度，回收硫酸銨濃度爲0 . 4M的分率。 再將回收的分率提供於Superdex 2 0 0 P g ( 1 6 mm i.d.X 6 0 0 mm)(阿馬夏生科公司製作 )的膠體過濾色層分析儀。溶離則使用緩衝液E ( 5 0 m Μ磷酸鈉緩衝液、〇 · 1 5 Μ氯化鈉（p Η 7 . 5 )進 行，分率分子量約爲76, 000的分率。 經濟部智慧財4¾員工消費合作社印製 對該分率進行SDS - PAGE ’結果觀察到分子量 約爲7 7 k D a的單一帶。 竇施例2 :皂角苷分解酶（S D N )的胺基酸序列解析 2 a ) N末端胺某酸序列 如實施例1調製出的分率提供於s D s 一 p A G E ’ 點印（b 1 o t )於 P V D F 膜（imoviron-PSQ)(minipor 公 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -28- 經濟部智慧財產苟S工消費合作社印製 1313300 A7 ____B7 五、發明説明（26) 司製）後，經水洗風乾。將此提供於蛋白質序列儀model 492 (阿普來得生物系統公司製），解析該胺基酸序列。 解析所得之胺基酸序列如下。 N末端胺基酸序列：ASPPASVPNNPSSEEITLQ (序列號 碼7 ) 2—b )__內部胺基酸序列的解析（肽圖譜） 實施例1所調製出的分率提供於S D S - PAG E， 使用科麥西豔靛藍R 2 5 0進行蛋白質染色。切出經染色 之分子量約7 7 k D a所示的單一帶，以調製成5 0%乙 腈的0 . 2M碳酸氫鈉緩衝液（ph8 . 0)進行脫色， 於室溫下風乾約2小時。 其此將該膠片浸漬於含〇 . 〇2%Twe e η - 20 的0 _ 2Μ碳酸氫鈉緩衝液（ΡΗ8 · 0)後，加入胰蛋 白酶（Promega公司製），3 7 °C下進行2天反應。反應後 回收澄淸液，膠片更以60%乙腈、及0.1%三氟醋酸 洗淨3次。合倂該洗液與反應澄淸液，經濃縮提供於Model 172pPreparativeHPLC系統（阿馬夏生科公司製作）（R P —30(^]!：1^口〇^(318，2 2 0父2.1111111，由〇.1%三截醋 酸、35%乙腈至0 . 085%三氟醋酸、35%乙腈的 濃度梯度），得到下述的5種肽。

Trp26.8:LVFNPSPK(序列號碼 8) Trp27.59:WNVAADGSGPSGEIR(序歹(1 號碼 9) Trp32_07:VTILHNPEGVAPITAK(序歹!1 號碼 10) ^•張尺度適用中國國家標準（〇呢）八4規格（210父297公釐） ~' -29- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1313300 A7 B7 五 '發明説明（27)

Trp39.43:EHSDTIPWGVPYVPGSQ(序歹丨J 號碼 11) Trp41.3:LTDYSFDWYSDIR(序歹[J 號碼 12) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例3 :皂角苷分解酶（S D N )的潠殖（clonind及序 列解析 _3 a )使用P C R的長鏈探針之調製 P CR 用模版使用由 Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF1225 株（寄存號碼 FERM BP - 7475 )培養菌調製出基因組D N A。 基因組D N A的單離依據 Horiuchi氏的方法（J. Bacteriol. :170, 272-278，1988)。首先離心分離（ 7，500rpm，l〇mi n) TS培養基所培養出的 菌體而回收。所得之菌體經冷凍乾燥後，懸浮於Τ Ε ( lOmMTr i s - NaC 1 緩衝液，ImM EDTA (p Η 8 . 0 ))，於3%SDS溶液中於60°C下進行 3 0分鐘處理，再以Τ E飽和酚萃取，由此除去菌體殘渣 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 萃取液以乙醇沈澱後，以核糖核酸酶A (日本基因公 司製）及蛋白酶K (和光純藥公司製）處理’且以1 2% 聚乙二醇6 0 0 0沈澱核酸。將此以Τ E飽和酚萃取，以 乙醇進行沈澱，同沈澱物溶解於Τ E，將此作爲基因組 D N A。 P C R用引子，由實施例2所得之肽序列合成編碼下 述之的寡核苷酸。 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） 1313300 A? A7 B7 五、發明説明（28) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) primerNl:CCIGCITCNGTNCCNAA^5!^®13) primerN2:CCIGCIAGYGTNCCNAA(序歹(1 號碼 14) primer2A:CCRTCIGCNGCNACRTT(序歹丨J 號碼 15) primer3A:CCCCAIGGDATNGTRTC(序歹1]號 5馬 16) primer4A:ACICCYTCNGGRTTRTG(序歹[j 號碼 17) P C R使用Takara Taq (保酒造公司製）進行，經 94 °C下1分鐘的熱變性處理後，94 °C下30秒，45 t下3 0秒、及5 5 t下3分鐘的一連步驟做1 0次循環 ，再9 4 t：下3 0秒，4 7 °C下3 0秒、及6 0 °C下3分 鐘的一連步驟做2 0次循環，增幅片段。其結果，組合引 子N 1與引子N 2可特異性增幅約〇 · 8 k b之片段。使 用 T〇PO TA cloning kit (Invitrogen 公司製）克隆化成 p C R 2.1— T〇P〇（pCR2.1-2)。 經濟部智慧財產苟㈣工消費合作社印製 D ΝΑ 序列的解析使用 dRhodamine Terminator cycle sequencing ready reaction (阿馬夏生科公司製作）及A B I PRISM 3 1 0基因記錄裝置（阿馬夏生科公司製作 )進行，解讀克隆（clone)化成pCR2 . 1 — 2的 P C R產物後，判斷出該片段爲序列號碼1所示中第8 8 號至第8 1 2號的區域所增幅者。 _3 b )使用南方解析與逆向（inverse ) p c R解讀序列 南方解析法，即對經E c 〇 R I分解的基因組D N A 進行瓊脂糖膠電泳，點印（b 1 〇 t )於Hibond N + ( 阿馬夏生科公司製作）上。雜交則使用E C F random- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 - 1313300 A7 B7 五、發明説明（29) prime labelling and detection system (阿馬夏生科公司製作 )’片段的檢測則使用Molecular imager FX(Biorad公司製） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 〇 作爲探針使用實施例3的3 a )所得之P C R產物， 檢測出約2 k b的片段（bond)。 其次，基因組D N A以E c 〇 R I分解後，回收約2 k b的片段，使用D N A連接套組（DNA ligation kit ver.2 )(寶酒造公司製）進行環化。將此作爲模版使用L a Taq (寶酒造公司製），且使用如下述的逆向PCR用 引子，經9 4 °C下1分鐘的熱變性處理後，9 4 °C下3 0 秒，5 0 °C下3 0秒、及7 2 °C下4分鐘3 0秒的一連步 驟做2 5次循環，增幅片段。經增幅約2 k b的片段，使 用丁 ΟΡΟ TA cloning kit (Invitrogen 公司製）克隆（clone) 化成 pCR2 · 1 - T〇PO (pCR2 · 1-2)，以 引子步進（primer walking )進行序列的解析。 逆向 PCR 用弓| 子 1:TGACGCTGATACCAACGGCG(序歹!1 號 碼1 8) 經濟部智想財產苟"貝工消費合作社印製 逆向 PCR 用引子 2:CTAGTGGCAGTATTGGACAG(序歹!J號 碼19) 3c)使用3’ RACE及5’ RACE法決定轉譯區 轉譯區的決定，使用cDNA 模版於3’ RAC E與5’ RACE法。調製出cDNA如下述進行。 與實施例1相同，於T S培養基下培養1 m 1的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2]0乂297公釐） -32 - 1313300 A7 _ B7 _ 五、發明説明（3〇 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Neocosmospara vasinfecta var. vasinfecta PF 1 225 株（寄存號 碼FERM BP-7475)的培養液，植菌於分裝於 含有1 0 0m 1的1%大豆皂角苷之MY培養基的5 0 0 m 1容積三角錐形瓶。將此於2 5 t細振動培養3 2小時 後，尼龍篩子（5 0 /2 m )下過濾菌體，經過濾菌體以液 態氮進行凍結。使用缽與棒磨碎凍結菌體，由磨碎菌體萃 取全RNA。全RNA的萃取，使用ISOGEN (日本基因公 司製），依照附件手冊方法進行。由全R N A純化 m R N A，使用OIig〇tex-dT30<Super> (羅西•大亞格諾斯 公司製）依照附件手冊方法進行。 對該mRNA，使用5’ / 3’ RACE套組（羅西 •大亞格諾斯公司製），3’ RACE與5’ RACE依 照附件手冊方法進行。進行5 ’及3 ’區的增幅。此時， 經濟部智"財產笱工消費合作社印製 3 ’ R A C E 法的 1 次 P C R 中，使用 AmpnTaq Gold (阿 普來得生物系統公司製），2次PCR使用PCR supermix 111211〖1(^1七（來迪克歐立元塔公司製）。3’ RACE法的 1 次及 2 次 P C R 使用 P C R supermix high fidelity (來 迪克歐立元塔公司製）。 3 ' R A C E與5 ’ R A C E特異性引子的序列如以 下所示。 3’RACE 特異性 1 次 PCR 用弓| 子：CCCAGGCCTTTAAGG ATGGC(序列號碼20) 3’RACE 特異 1生 2 次 PCR 用弓[子：CTAGTGGCAGTATTGG ACAG(序歹丨」號碼19) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) "~~ ~ 33 - 1313300 A7 B7 五、發明説明（31) 5’RACE 特異性 cDNA 合成用引子：tgacgctgataccaacggcg (序列號碼18) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5，RACE 特異性 1 次 PCR 用弓[子：CTGCTTGAGGGTAATG GGCTC(序歹!]號碼21) 5，RACE 特異性 2 次 PCR 用弓1 子：ACAGACGCCGGAGGAG AAGCG(序歹丨J號碼22) 如上述決定序列號碼1所示的s D N基因的轉譯區。 其中由實施例2 a )的結果得知，S D N胺基酸序列 的成熟蛋白質之N末端係爲，轉譯開始點的M e t數來第 2 7號β 且，轉譯區中的內含子（intron)存在之確認，以比較 基因組D N A及c D N A的鹼基序列而進行。判斷出該轉 譯區中未存在內含子。 富施例4 :皂角苷分解酶（S D N )於大腸桿蔺之表現 以實施例3所得之c D N A作爲模版，使用下述所示 的大腸桿菌表現用引子，進行P c R。 經濟部智慧財1¾¾工消費合作社印製 使用PCR supermix high fidelity (來迪克歐立元塔公司 製），經9 4 °C下1分鐘的熱變性處理後，9 4 °C下3 0 秒，5 0 °C下3 0秒 '及7 2 °C下2分鐘一連步驟做2 5 次循環，增幅S D N基因的轉譯區片段。將此以限制酶 N d e I及B a m Η I分解之片段’與以相同限制酶分解 之質體P E T 1 5 b (Novagen公司製），使用DNA連結 套組v e r . 2 (保酒造公司製）進行連結。使用此，將 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -34- 1313300 A7 B7 五、發明説明（32) 大腸菌B L 2 1 ( D E 3 )株依常法進行轉形，得到具有 安匹西林耐性的菌落。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 大腸菌表現用N末端：弓丨子GGGCATGTGGCTTCTCCTCC TGCTTCTG(序歹!]號碼 23) 大腸菌表現用C末端：弓1子GGGGGATCCTTAAGTGCCGC TCTGAGGACTACG(序歹!1 號碼 24) 所得到菌落提供於實驗上。 由菌落取出的菌，於分裝含有5 0 // g/m 1安匹西 林之50ml LB培養基之250ml三角錐形瓶中，進 行3 7°C —晚的培養，其中2m 1更植菌於分裝含有5 ◦ /i g/m 1安匹西林之5 0m 1 LB培養基之2 5 〇m 1 三角錐形瓶中，3 7 °C下培養3小時。將此中加入異丙基 一召一 D -硫代吡喃半乳糖至最終濃度爲〇 . 4 M m，且 經過3小時的誘導培養。 所得之培養菌體，經離心分離而集菌，將菌體懸浮於 緩衝液 經濟部智惡財產苟R工消費合作社印製 F ( 5 0 m M Tr i s-NaC 1 緩衝液、2mM E D T A ( p Η 8 ))後，再次離心分離回收菌體。該菌 體於-8 0 °C下冷凍後，懸浮於5 m 1的緩衝液F，於此 加入溶菌酶與Tritonx 1 〇 〇至最終濃度分別爲1 〇 〇 # g /ml及〇 · 1%，將此於室溫下靜置20分鐘。將此於 冰浴下，使用 Sonifier 450(BRANS〇N 公司製）以 50 % duty cycle進行3 0分鐘的超音波處理重複2次使細胞破碎，經 離心分離將菌體殘渣除去。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 -35- 1313300 A7 B7 五 '發明説明（33 ) 如此所得之菌體萃取物作爲粗酵素液，依據試驗例1 進行皂角苷分解活性的測定。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其結果，TLC中分解物的大豆皂醇b的點印（bi〇t ) ’僅由皂角苷分解酶的轉譯區經克隆（cl〇ne)化之菌體萃取物 中觀察到。 星·Α例5 :使用Trichoderma viride的鸟角昔分解酶（ ID N )之表現 ia )轉形用載體的槿结 以實施例3所得之c D N A作爲模版，使用下述所示 的Trichoderma屬表現用引子，進行與實施例4相同的 p C R。 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 使用P C R產物經限制酶S m a I及P s t I分解之 片段，與以S t u I及P s t I分解之質體pCBl—M 2 (參照國際公開W 0 9 8/1 1 2 3 9號的實施例5 ) ，使用D N A連結套組v e r . 2 (保酒造公司製）進行 連結。將此以X b a I分解，脫磷酸後，與經X b a I分 解切斷之來自Neurospora crassa的p y r 4基因連結，構 築質體PCB — SBe (圖1)。

Trichoderma 表現用 N 末端弓I 子：GGGCCCGGGGCGCATC ATGCACTTCTTTGACAAAGCGAC(序歹[J 號碼 25)

Trichoderma 表現用 C 末端弓ί 子：GGGCTGCAGTTAAGTG CCGCTCTGAGGACT(序歹[J 號碼 26) 且，pyr4基因的X b a I卡匣（cassettte)之構築 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1313300 at B7 五、發明説明（34) 方法，如下所示。 首先 p F B 6 ( Biochem. Biophys. Res. Commun. :112, (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 284-289,1983)以 B g 1 I I 分解後’ Hind I I 做部分 分解，回收約1 . 9 k b的片段。將此與經B g 1 I I及 H i n d I I 分解之 pL【TMUS28(New England Biolabs 公司 製）連結，再OJ R g 1 I I分解後，使用D N A鈍化套組（ DNA blunting kit，寶酒造公司製作）進行平滑化’再連結 磷酸化連結體pxbaI (寶酒造公司製作）’作爲 p y r 4基因的X b a I卡匣。 5 b )來自Trichodermaviride的尿喃ϋ定缺陷株之取得 1 · Ox l〇9CFU/ml 的 Trichoderma viride MC 3 0 0_ 1株的胞子懸浮液’於3 0 cm高度之2個 U V燈下照射，邊緩和混合’邊以U V燈照射該懸浮液。 將此塗抹於選擇培養基中，經2 8 °C下7天培養後，選出 生長出的菌株。 經濟部智慈財產芍8工消費合作社印製 作爲選擇性培養基，使用於基礎培養基（0 _ 2%的 磷酸二氫鉀、0 . 4%的硫酸銨、0 _ 03%的尿素、 0 . 0 3 %的硫酸鎂七水合物、0 . 0 3 %的氯化鈣、 0 . 5%的葡萄糖、2 . 5%瓊脂膠、0 . 01%的微量 元素（5mg的硫酸鐵七水合物、1 . 56mg的硫酸錳 七水合物、1 · 4mg的硫酸鋅七水合物、2 . Omg的 氯化鈷溶解於1 L水中者）中添加1 0 u g/m 1的尿苷 及1 · Omg/ml的5 -氟化乳淸酸。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) μ規格（210X297公釐） -37- 1313300 A7 B7 五、發明説明（35) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Tnchoderma vinde_J^形铤各重鉬體的皂角苷分解 适复輪測 將實施例5的5 b )所得之尿嘧啶缺陷Trichoderma vinde株植菌於分裝5 〇m丨的菌體形成培養基（丄.〇% 酵母菌萃取物、1.〇%麥芽萃取物'2.〇%聚腺、 2 . 5%葡匍糖' 〇 . 1%磷酸氫二鉀、〇 . 〇5%硫酸 鎂7水合物（滅菌前pH7·〇))之2〇〇ml三角錐 瓶中，於2 8。(：下振動培養2天。所得之培養液經離心分 離回收菌絲體。由該菌絲體調製出原生質體後，加入質體 P C B - S B e的D N A溶液，進行轉形（參照國際公開 w〇98/11239號的實施例7)。 且’轉形體的複製使用加入〇 _ 5 Μ蔗糖的基礎培養 基’將長出的菌落再次移植至基礎培養基中，於此所長出 的菌落作爲轉形體。 經濟部智慧財產苟肖工消費合作社印製 將質體P C Β - S B e導入尿嘧啶缺陷Trichoderma viride株結果’得到每1 "g的p cb - SB e中3個轉形 體。培養2 5株該轉形體後（參照國際公開 W ◦ 9 8 / 1 1 2 3 9號的實施例1 )，將培養澄淸液提 供於SDS - PAGE，僅於轉形體上觀察到分子量約 68kDa的片段。 使用該培養澄淸液，依據試驗例1測定皂角苷的分解 活性時’於T L C觀察到分解產物之大豆皂醇B的點印（ blot)。另一方面，由母株的尿哺η定缺陷Trichoderma viride株 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38- 1313300 A7 B7 五、發明説明（36) 中並未觀察到該點印（b〗〇t)。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) R d )重細皂角苷分解酶（重組型S D N )的純化、及與 來自 Neocosmospara vasinfecta var, vasinfecta PF1225 株的巷 角苷分解醃（野牛铟S D N )的活性比較 經濟部智慈財產局員工消贽合作社印製 由實施例5的5 c )所得之培養液約7 0 0 m 1經離 心分離（8，0 0 0 r p m，3 0分鐘）後除去菌體殘渣 。對約5 6 0 m 1的該培養液之澄淸液而言，加入6 4 g 的硫酸銨，所生成的沈澱物經離心分離（8，0 0 0 rpm，30分鐘）將沈澱物除去。且，約600ml的 該澄淸液加入7 4 g的硫酸銨，經離心分離回收沈澱物。 所得之沈澱物中，加入1 0 0 m 1的0 . 0 5 Μ Τ I· i s - N a C 1 緩衝液（ρ Η 7 . 5 )與 1 6 g 的硫 酸銨，提供於 ButylToyopearl 650S (26mm 1 · d . X 3 3 0 mm)(東曹公司製）的疏水色層分 析儀。溶離則使用由緩衝液C 5 0 m Μ T r i s -N a C 1緩衝液（p h 7 · 5 )的濃度梯度進行，回收非 吸附分率及硫酸銨濃度爲1M至〇.6M之間所溶離出的 分率。 所得分率使用Ultrafreel5(分率分子量5，〇〇〇) 進行濃縮，對約8 m 1的該濃縮液加入1 · 3 g的硫酸銨 與2ml的〇 . 5M磷酸鈉緩衝液（PH5 _ 8)，提供 於Resource PHE，6 m 1 (阿馬夏生科公司製作）的疏水 色層分析儀。溶離則由緩衝液B進行〇 . 1 Μ T r i s 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（21〇x；297公釐） -39- 1313300 A7 B7 五、發明説明（37) 一 N a C 1緩衝液（p Η 5 _ 8 )的濃度梯度’回收非吸 附分率。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所得分率使用milipore公司製的Ultrafree15 (分率分 子量5 , 0 0 0 )進行濃縮，該濃縮液提供於SuperdeX 200 pg ( 1 6 m m i.d_X 6〇〇mm)(阿馬夏生科 公司製作）的膠體過濾色層分析儀。溶離則使用緩衝液G (5 0 m Μ磷酸鈉緩衝液、0 · 1 5 Μ氧化鈉（ ΡΗ7· 0)進行，分率分子量約爲68， 〇〇〇的分率 〇 對該分率進行S D S - P A G Ε，結果觀察到分子量 約爲6 8 k D a的單一帶。 如上述所純化的重組皂角苷分解酶（以下稱爲「重組 型S D N」），對於實施例1所純化的皂角苷分解酶（以 下稱爲「野生型S D N」），依據試驗例2測定出其最適 P Η及最適溫度。 經濟部智慧財產笱資工消費合作社印製 最適pH的測定，首先於5 0 # 1的2%皂角苷溶液 中，加入2 0 β 1的〇 · 5 Μ之各緩衝液（醋酸鈉（P Η 4·5、ρΗ5.0、ρΗ5.8)、磷酸鈉（ ρΗ5·0、ρΗ5·8、ρΗ7.0)、Tris-NaCl (ρΗ7·0'ρΗ8·0、ρΗ9.0))與 經稀釋的酵素液，總計1 0 0 # 1 。將這些於3 7 °C下反 應3 0分鐘後，定量所生成的大豆皂醇B量。 結果如圖2所示。 最適溫度的測定，首先於5 0 # 1的2 %皂角苷溶液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -40- A7 B7 13133〇〇 五、發明説明（38) 中’加入20β 1的0 . 5M之磷酸鈉緩衝液（PH 5.8)，加入經稀釋的酵素液’總計1 0 0 " 1。將這 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本萸) 些於各溫度下反應3 0分鐘後’定量純化的大豆皂醇B量 〇 結果如圖3所不。 由這些結果可知’經由SD S- PAGE確認出分子 鼍有差異，但活性並無太大差異。 蠶施例F):來自麴蔺（Aspergillus sp·) PF1 224株的 皇角苷分解酶（S D A )的胺某酸序列解析 由麵菌（Aspergillus sp_) P F 1 2 2 4株（寄存號碼 Perm p_i8344)所純化之皂角苷分解酶（ SDA)(參考例1)與實施例2的2b)相同，切出約 9 〇 k D a片段後，與實施例2的2 b )相同提供於 HPLC中，得到下述的4種 。

Trp23.67:LYNPDSPQPISAK(序列號碼 27) Trp24.0:LQFNPAPK(序列號碼 28) 經濟部智惡財4苟肖工消費合作社印製

Trp3 8_05:VDWFSDLTSTGQVTGSK(序歹!]號碼 29) 丁卬24.5训¥3〇$八3¥511則序歹!]號碼30) 實施例7 : S D A基因的潠殖（cloning )與序列解析 7 a )使用P CR的長鏈探針之調製 基因組D N A由如參考例1所培養之菌體中，以與實 施例3相同方法進行單離而得 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2Ϊ0Χ297公釐） ' 41 - 1313300 A7 B7 五、發明説明（39) 使用於P C R的引子，使用依據實施例6所得之 序 列，其所合成之編碼這些的以下所示核苷酸。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

Pnmer23.67sl:TAYAAYCCIGAYTCNCC(0 5[lMft^31) Primer2 3.67s2:TAYAAYCCNGAYAGYCC(序歹!j號碼32) Primer24.0s:CARTTYAAYCCIGCNCC(序歹丨J 號碼 33) Primer24.0a:GGIGCNGGRTTRAAYTG(ff?!^』34) Primer3 8.05al:AARTCNGARAACCARTC(序列號碼 35) Primer3 8.0a2:AARTCRCTRAACCARTC^5!^®36) P CR與實施例3之3 a )相同方法進行。 其結果，發現組合上述引子中 primer24.0s與 primer38.05al會使約1 k b的片段作特異性增幅，將此使 用 TOPO TA cloning kit(Invitrogen 公司製），對 p C R 2 . 1— TOP ◦進行克隆（clone )化（pSDAPCR 1 ) 對pSDAPCRl進行克隆（clone )化的片段，由 序列解析結果得知，係爲增幅序列號碼3所示的序列中由 第709號至第1748號區域所得者。 經濟部智您財產笱貨工消費合作社印製 7 b )南方解析與使用大腸桿菌菌落基因庫之篩選 南方解析法，即對經B a m Η I 、E c 〇 R I 、 Hind I I I分解的基因組D N A進行瓊脂糖膠電泳， 點印（b 1 o t )於Hibond N+ (阿馬夏生科公司製作）上 。雜交貝[J 使用 ECF random-prime labelling and detection system (阿馬夏生科公司製作），片段的檢測則使用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1313300 A7 B7 五、發明説明（40)

Molecular imager FX(Biorad 公司製）。 (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 作爲探針使用前述7 a )所得之p c R產物，檢測出 約 1 0 k b 的 B a m Η I 片段、2 0 k b 的 E c o R I 片 段、約5 k b的H i n d I I I片段 其次，基因組D N A以Hind I I I分解後，回收 約4 k b〜6 k b的片段。將此與經Hind I I I分解 及脫磷酸化處理後之p ϋ C 1 8連結，轉形大腸桿菌 D Η 5 〇:株。將該大腸菌於添加安匹西林的L B瓊脂膠培 養基中形成菌落，所得約1，〇 〇 〇菌落點印於 Hibond Ν+ (阿馬夏生科公司製作）上。其中上述7 a )所 得之 P C R產物作爲探針，依據 DIGhigh primeDNAlabelling&detection kit (羅西•大亞格諾斯公司製 )’得到1種陽性克隆（pSDAHind5/18 )。該克隆（clone)含 有約5 k b的Hind I I I片段。 經濟部智总財產苟員工消費合作社印製 .7. c )使用3 ’ R A C E及5 ’ R A C E法決定轉譯區 由參考例1所調製出的麴菌（Aspergillus sp.) PF1224 株（寄存號碼 FERM P — 18344) 的培養菌’依據實施例3的3 c )相同方法萃取全rna 。且依據 QuidkPrep mRNA Purification kit (阿馬夏生科公 司製作）’依照附件手冊方法進行m R N A的單離。 對該mRNA’使用5’ / 3 RACE套組（羅西 •大亞格諾斯公司製），進行5’及3’區的增幅。又， 各PCR則使用la Taq(寶酒造公司製作）。 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1313300 A7 ___________B7 五、發明説明（41) 3 R A C E與5， R A C E特異性引子的序列如以 下所示。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 3’RACE 特異性 1 次 PCR 用引子：CCTCGATACCCGAGGG ACCG(序歹[]號碼37) 3’RACE 特異性 2 次 PCR 用引子：CATGGGTTGCATGTTA TCGC(序歹丨J號碼38) 5’RACE 特異性 CDNA 合成用引子：GCGATAACATGCAAC CCATC(序歹丨J號碼39) 5’RACE 特異性 1 次 PCR 用弓丨子：GACCACCTGGTTCAGT GGTG(序歹U號碼40) 5’RACE 特異性 2 次 PCR 用弓1 子：GGGTTATAGAGTCTGG TAACG(序歹丨J號碼41) 由上述可決定序列號碼3所示的S D A基因轉譯區。 其中’將如參考例1經純化的S D A蛋白質，使用與實施 例2 a )相同方法解析成熟N末端之胺基酸序列，其結果 ’ S D A胺基酸序列的成熟蛋白質之N末端係爲，由轉譯 開始點的Me t數來第2 9號。 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 且，轉譯區中的內含子的存在，由比較基因組DNA 及c D N A的鹼基序列而確認。判斷該轉譯區中未存在內 含子。 實施_例 8 :使用 Trichoderma viride 的來自麴菌（Aspergillns sp. 1PF1 224株的皂角苷分解臨（SDA)之表現 用載體的構築 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " 1313300 A7 B7 五、發明説明（42) 首先，實施例7b所得之p SDAH i n d 5/1 8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 作爲模版，使用如下所示Trichoderma表現用引子’進行與 實施例4相同的P c R ° 所得之P C R產物經限制酶S t u I及X h ο I分解 所得之片段，與預先以S t u I及X h ο I分解所得質體 pCBl— M2 (參照國際公開W098/1 1239號 的實施例5 )以D N A連接套組v a r · 2 (寶酒造公司 製）進行連結，構築PCB — SDAe (圖4)。 SDA Trichoderma 表現用 N 末端弓I 子：GGGAGGCCTGCG CATCATGCATGTTGTCGCAAGTACCAC(序歹U 號石I 42) SDA Trichoderma 表現用 C 末端弓丨子：GGGCTCGAGTAC CTCAAGTCCCATTTGCCGGCTGC(序歹U 號碼 43) 8 b ) THchoderma viride的轉形與各基因重組體的皂角苷 分解活件測定 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例5的5 b )所得之尿唾b定缺陷型Trichoderma vhide株作爲宿主，將pCB - SDAe與p y r 4卡匣連 結於PLITMUS28之載體pPYR4 (參照實施例 5 的 5 a ))以 c 〇 - 轉形作用（co-transformation)法， 與實施例5的5 c )相同方法進行轉形。其結果，每1 "g的D N A中得到約1 2株的轉形體。 培養如此所得之轉形體後（參照國際公開 W ◦ 9 8 / 1 1 2 3 9號的實施例1 )，該培養澄淸液提 供於S D S - P A G E後，僅於轉形體上觀察到分子量約 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -45- 1313300 A7 B7 五、發明説明（43) 80kDa的片段。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用該培養澄淸液依據試驗例1進行皂角音分解活性 的測定時’ T L C中觀察到分解物的大豆皂醇b之點印（ blot )。 8 c )重組來自麴菌（Aspergillus sd. ) P F 1 2 4 株的 皂角苷分解酶（重細型S D A )之純伦、及逛f自野牛型 麴菌（Aspergillus SD. ) P F 1 2 2 4株的帛角苷分解酶（ 野生铟S D A )之活件比較 約6 0 0 m 1的前述8 b )所得之培養液以離心分離 (8， 000rpm，30min)，除去該菌體殘渣。 經濟部智悲財產局員工消費合作社印製 所得之約5 0 0 m 1的澄淸液中，加入5 7 g的硫酸銨' 經離心分離後除去不溶的殘渣。且該澄淸液中以6 4 g ( 40%飽和分率）、及70g (60%飽和分率）的順序 加入硫酸銨，得到的沈澱物溶解於〇 . 1 Μ的硫酸鈉緩衝 液（ρΗ5 · 8)中。其中所得之60%飽和分率加入硫 酸鏡至 1 Μ，提供於 Butyl Toyopearl 650S ( 2 6 mm 1·d.X 250mm)(東曹公司製）的疏水色層分 析儀。溶離則使用由緩衝液A至〇 . 1 Μ磷酸鈉緩衝液（ Ρ Η 5 . 8 )的濃度梯度下進行，回收硫酸銨濃度爲 0 . 9Μ至〇 . 2Μ的分率。 所得之分率使用milipore公司製的Pellicon XL (分率 分子量爲10, 〇〇〇)及Ultrafreel5 (分率分子量爲 10，000)進行濃縮，以PD - 10管柱（阿馬夏生 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -46- A7 B7 1313300 五、發明説明（私） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 科公司製作）進行脫鹽，提供於Resouce Q ’ 6 m 1 (阿馬 夏生科公司製作）的離子交換色層分析儀。溶離由5 0 mM的 Tr 1 s - NaC 1 緩衝液（PH7 · 5)至 50 mM的Tr i s— NaC 1緩衝液、0 . 5M氯化鈉（ P Η 7 · 5 )的濃度梯度下進行，回收非吸附分率及 〇 _ 08Μ的鹽濃度分率。 所得之分率以Ultrafreel5 (分率分子量爲 1 0，0 0 0，milipore公司製）進行濃縮，提供於Superdex 2 0 〇 P g (16mm i.d.X 6 0 〇mm)( 阿馬夏生科公司製作）的膠體過濾色層分析儀。溶離以緩 衝液G進行，回收分子量約5 0 k D a的分率。 對該分率進行SD S-PAGE的結果，於分子量約 8 0 kD a上觀察到單一帶。且膠體過濾的分率分子量與 S D S - P A G E測出的分子量相異，可推測爲本蛋白質 與載體有非特異性吸附。 經濟部智^^工"費合作社印製 如上述純化的重組型S D A與，參考例1中純化之皂 角苷分解酶（野生型S D A )，由試驗例2測定出其最適 P Η及最適溫度。 最適Ρ Η及最適溫度的測定如實施例5的5 d )方法 進行。 其結果，重組型SDA爲 pH7的磷酸鈉緩衝液下 之比活性比野生型S D A低者時，顯示T r i s〜M a c + 1緩衝液中的比活性提高。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0Χ297公釐） -47- 1313300 Α7 Β7 五、發明説明（45) 實施例 9 :來自 Eupenicillium brefel dianum PF1 226 株的貝 角苷分解醃（S D E )的單離純化 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) E u p e n i c i 11 i u m b r e f e 1 d i a n u m P F1 2 2 6 株（寄存號碼 FERM BP — 7476) PDA傾斜培養約 1 cm2 植 菌於分裝有1 0 Om 1 TS培養基的5 0 Om i的三角錐 形瓶中，於2 5 °C下振動培養3天。該4m 1再植菌於分 裝有1 0 Om 1之添加1 . 〇%的大豆皂角苷（小城製藥 公司製作）的MY培養基之5 0 〇m 1的三角錐形瓶中， 振動培養7天。 約1 , 0 0 0 m 1的該培養液以玻璃過濾器（G 3 ) 過濾後，除去菌體殘渣。對約6 4 0 m 1的該培養液之澄 淸液而言，加入7 3 g的硫酸銨，所生成的沈澱物經離心 分離（8, 000rpm，30分鐘）而除去。對該約 經濟部智楚財產苟員工消費合作社印製 6 7 Om 1的該澄淸液加入2 5 6 g的硫酸銨，所生成的 沈澱物經離心分離回收。該沈澱物溶解於約5 0 m 1的 〇· 1 Μ硫酸鈉緩衝液（p Η 5 · 8 )，加入1 3 . 2 g 的硫酸銨，加水至最終濃度爲1 Μ硫酸銨，0 . 1 Μ醋酸 鈉緩衝液。 該溶液經離心分離後，提供於B u t y 1Τ 〇 y 〇 p e a r 1 6 5 0 S ( 26mm i.d.X 330mm)(東曹公司製）的 疏水色層分析儀。溶離則使用由緩衝液C 5 0 m Μ Τ r i s - Ν a C 1的濃度梯度進行，回收硫酸銨濃度 0 . 7M至〇 . 5M的分率。 經回收的分率使用Pellicon XL (分率分子量 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） -48 - 經濟部智慈財產苟肖工消費合作社印製 1313300 A7 ____B7_ 五、發明説明（46) 10，0 0 0 ) ( milipore公司製）經濃縮後，加入緩衝；@ A組成之磷酸鈉及硫酸銨，提供於Resource PHE，6 m i (阿馬夏生科公司製作）的疏水色層分析儀。溶離則由！g 衝液A進行0 . 1 Μ磷酸鈉緩衝液（P Η 5 · 8 )的濃度 梯度，回收硫酸銨濃度1 Μ至0 . 3 Μ的分率。 所得分率使用U ltrafree 15(分率分子量5，〇0〇) (milipore公司製）進行濃縮，經P D - 1 0管柱（阿馬夏 生科公司製作）脫鹽後，提供於Resource Q，6 m 1 (阿 馬夏生科公司製作）的離子交換色層分析儀。溶離則由 20mM磷酸鈉緩衝液（pH7 . 0)至20mM磷酸鈉 緩衝液、1 Μ氯化鈉（p Η 7 . 0 )的濃度梯度進行，回 收非吸附分率。 該分率使用Ultrafreel5(分率分子量5，0 0 0 )( milipore公司製）進行濃縮，提供於Superdex 2 0 0 p g (16mm i.d.X 600mm)(阿馬夏生科公 司製作）的膠體過濾色層分析儀。溶離以緩衝液G進行， 回收分子量約9 0 k D a的分率。 對該分率進行SDS - PAGE，結果觀察到分子量 約爲9 0 k D a的單一帶。 實施例1 0 : S D E的胺某酸序列解析 1 0 a ) N末端胺基酸序列 將實施例9所調製出的分率，與實施例2的2 a )相 同進行N末端胺基酸序列的解析。其結果得到如下之胺基 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -----·---^φ衣------、玎------Φ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -49 - A7 B7 13133〇〇 五、發明説明（47 ) 酸序列。 N末端胺基酸序列·· STTPAPPQPEPI (序列號碼4 4 ) -L 0 h )再太製圖（ mapping) 實施例9所純化的SDE ’與實施例2的2b)相同 切出約9 0 kD a的一帶後，使其片段化。與實施例2的 2 b )相同進行Η P L C ’得到如下所示3種肽。 Trp20.73:ADPAFSPDGTR(序列號碼 45) Trp34.21:LHPDDTHMGWSSF(序列號碼 46)

Trp3 6.26:GFSGAGDEILYIGSTR(序列號碼 47) 實施例1 1 : S D E某厌I的潠殖（cloning )趄序列解析 1 1 a )使用P C R的長鏈探針之調製 基因組D N A係由實施例9所培養的菌體中經與實施 例3相同方法進行單離得到。 使用於P C R的引子，使用依據實施例1 0所得之肽 序列，其所合成之編碼這些的以下所示核苷酸。

PrimerNs:CCICARCCNGARCCNAT(序歹[J 號碼 48) Primer20‘37a:CTRAAIGCNGGRTCNGC(序歹丨J 號碼 49) ?^1^34.213:(^八1^(：<：〇八丁1^耶丁1^(：(序歹[1號碼50) PCR與實施例3之3 a )相同方法進行。 其結果，發現組合上述引子中primerNs與primer

2 0 · 7 3 a會使約1 k b的片段作特異性增幅，將此使 用 TOPO TA cloning kit(Invitrogen 公司製），對 p C R (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

，1T .0—· 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐〉 -50- 1313300 A7 B7 五、發明説明（48 ) 2 . 1— ΤΌΡΟ 進行克隆（clone )化（pSDAPCR5) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 對PSDAPCR5進行克隆化的片段，由序列解析結果得 知，係爲增幅序列號碼5所示的序列中由第7 0號至第 1 2 4 7號區域所得者。 11b)南方解析與使用噬菌體某因庫之篩潠 南方解析法，即對經P s t I、S p h I 、X h ο I 分解的基因組D N A進行瓊脂糖膠電泳，點印（b 1 o t )於Hibond N+(阿馬夏生科公司製作）上。雜 交則使用 E C F random-prime labelling and detection system (阿馬夏生科公司製作），片段的檢測則使用 Molecular imager FX(Biorad 公司製）。 作爲探針使用前述1 1 a )所得之P C R產物，檢測 出約3 k b的P s t I片段、約4 k b的S p h I片段、 約6 k b的X h ο I片段。 經濟部智慧財產笱肖工消費合作社印製 其次，基因組D N A以S a u 3 A 1進行部分分解。 將此與λ EMBL 3 / B a m Η I載體（Stratagene公司製 )連結，使用 MaxPlax packing extract 套組（EPICENTRE TECHNOLOGES公司製）進行包裝。該噬菌體基因庫約5x 104PFU點印於Hibond N+(阿馬夏生科公司 製作）上。PSDAPCR5經克隆化的PCR片段作爲 探針依據 DIGhigh primeDNAlabelling&detection kit (羅西. 大亞格諾斯公司製），得到5種陽性克隆。由其中含有 6 k b的X h ο I片段之噬菌體D ΝΑ回收同X h ο I片 i紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） ~ ~ 1313300 A7 B7 五、發明説明（49) 段，使 pBluescriptll KS +克隆化（p S D E X h 〇 / I I K S + 1 )。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) S D E轉譯區的D N A序列，依照以pSDEXho/ I I K S + 1作爲模版進行轉移子（transposon )法，決定 序列號碼5。 其中由實施例1 0 a )的結果得知，SDN胺基酸序 列的成熟蛋白質之N末端係爲，轉譯開始點的M e t數來 第1 8號。 且，轉譯區中的內含子（intron )存在之確認，以比較 基因組D N A及c D N A的鹼基序列而進行。判斷出該轉 譯區中未存在內含子。 實施例 1 2 :使用 Trichoderma viride 的來自 Eupenicillium brefel dianum PF 1 2 26株）的皂角苷分解酶（_ S D A )之表 a_ 1 2 a )轉形用載體的槿筚 經濟部智慧財凌局負工消費合作社印製 首先’實施例11所得之pSDEXho/Ι IKS + 1作爲f吴版’使用如下所示Trichoderma分泌用引子，進 行與實施例4相同的PCR。 所得之P C R產物經限制酶S m a I及X h ο I分解 所得之片段’與預先以S m a I及X h ο I分解所得質體 PCB1—M2 (參照國際公開W098/11239號 的實施例5 )以D N A連接套組v a r · 2 (寶酒造公司 製）進行連結，構築pCB—SDEs (圖7)。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -52- 1313300 A7 A7 B7 五、發明説明（50) SDE Trichoderma 分泌用 N 末端弓1 子：GGGCCCGGGCTC AGACTACCCCGGCACCTCCTCAGCC(序歹U 號 5馬 51) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) SDE Trichoderma 分泌用 C 末端弓[子：GGGCTCGAGTAC CTCATGCACCATTGAGCGGCTGGTGG(序歹[]號碼 52) 1 2 b ) Trichoderma vinde的轉形與各基因重鉬體的皂角 苷分解活件測定 實施例5的5 b )所得之尿喷B定缺陷型Trichoderma viride株作爲宿主，將pCB — SDE s與py r 4卡匣連 結於PLITMUS28之載體pPYR4 (參前述5a )以c 〇 -轉形作用（co-transformation )法，與實施例5 的5 c )相同方法進行轉形。其結果，每1 # g的DNA 中得到約2 8株的轉形體。 培養如此所得之轉形體後（參照國際公開 W ◦ 9 8 / 1 1 2 3 9號的實施例1 )，該培養澄淸液提 供於S D S - P A G E後，僅於轉形體上觀察到分子量約 6 7 k D a的片段。 經濟部智慧財4s工消費合作社印製 使用該培養澄淸液依據試驗例1進行皂角苷分解活性 的測定時，T L C中觀察到分解物的大豆皂醇B之點印（ blot) 0 -53- 1313300 A7 B7 五、發明説明（51) 牛型S D A )之活件比較 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 約9 0 0 m 1的實施例1 2的1 2 b )所得之培養液 以離心分離（8， 000rpm，30min)，除去該 菌體殘渣。所得之約6 9 0 m 1的澄淸液中，加入 7 8 · 7 g的硫酸銨、經離心分離後除去不溶的殘渣。且 對該澄淸液而言，加入8 8 . 6 g ( 4 0 %飽和分率）硫 酸銨，得到的沈澱物溶解於1 2 0 m 1之1 Μ的硫酸銨、 0 · 1Μ磷酸鈉緩衝液（ρΗ5 · 8)中。其中20ml 提供於 Butyl Toyopearl 65〇S ( 2 6 m m i . d . X 2 5 0 mm)(東曹公司製）的疏水色層分析儀。溶離則 使用由緩衝液A至〇 . 1 Μ磷酸鈉緩衝液的濃度梯度下進 行，回收硫酸銨濃度爲0 . 2Μ至0Μ的分率。 所得之分率使用milipore公司製的Pellicon XL (分率 分子量爲10，000)及Ultrafreel5 (分率分子量爲 5 , 0 0 0 )進行濃縮，以P D - 1 0管柱（阿馬夏生科 公司製作）進行脫鹽，提供於Resouce Q，6 m 1 (阿馬夏 經濟部智慈財產笱員工消費合作社印製 生科公司製作）的離子交換色層分析儀。溶離由5 OmM 的 Tr i s— NaCl 緩衝液（ρΗ7 . 5)至 50mM 的T r i s_NaC 1緩衝液、〇 . 5M氯化鈉（pH 7 . 5 )的濃度梯度下進行，回收0 M至0 . 1 M的鹽濃 度分率。 所得之分率以Ultrafreel5(分率分子量爲5，000 ，milipore公司製）進行濃縮，提供於Superdex 200 p g (16mm i . d . X 6 0 0 m m )(阿馬夏生科公 本纸伕尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐） -54- 1313300 Α7 Β7 五、發明説明（52) 司製作）的膠體過濾色層分析儀。溶離以緩衝液G進行’ 回收分子量約5 0 k D a的分率。 對該分率進行SDS — PAGE的結果，於分子量約 6 7 k D a上觀察到單一帶。且膠體過濾的分率分子量與 SD S - PAGE測出的分子量相異，可推測爲本蛋白質 與載體有非特異性吸附。 如上述純化的重組型S D A與，實施例9中純化之皂 角苷分解酶（野生型S D A )，由試驗例2測定出其最適 P Η及最適溫度。 最適Ρ Η及最適溫度的測定如實施例5的5 d )方法 進行。 其結果，重組型SDA爲，Tr i s— NaC 1緩衝 液下活性較野生型S D E掏時，顯示Ρ Η下的活性亦提高 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局資工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4规格（210X297公釐） -55-

Claims (1)

1. 95. 8. l A8 B8 C8 D8 是"1··: .'"-汽貧内容 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 第91112252號專利申請案母案 中文申請專利範圍修正本 民國9 5年8月11日修正 1 . 一種經分離之蛋白質，其特徵爲選自下述所成群 的蛋白質； (a )選自序列號碼4所示胺基酸序列所成的蛋白質 、及 (b )對於前述（a )胺基酸序列之蛋白質而言’至 少具有9 0 %相同性之胺基酸序列，且具有皂角苷分解活 性之蛋白質。 2 . —種經分離之聚核苷酸，其特徵爲編碼如申請專 利範圍第1項之蛋白質。 3 . —種經分離之聚核苷酸，其特徵爲選自下述所成 群之聚核苷酸： (i )含有選自序列號碼3所示鹼基序列所成的聚核 苷酸、 (i i )對於前述（1 )鹼基序列所成之聚核苷酸m 言，具有至少9 0 %相同性之鹼基序列所成，且編碼具有 皂角苷分解活性之蛋白質之聚核苷酸、及 (i i i)與前述（1)的鹼基序列所成之聚核有:@ ，於嚴謹條件爲使用添加0.4% SDS及6M尿素之〇.5倍濃 度SSC，於42°C下洗淨之嚴謹條件下進行雜交，且編碼貞 有皂角苷分解活性之蛋白質之聚核苷酸。 4 如申請專利範圍第2項或第3項之經分離之聚核 本"^尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（21〇><297公釐） ' (請先閲·«背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂I- 1313300 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 苷酸，其來自絲狀菌。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本貰) 5 .如申請專利範圍第4項之經分離之聚核苷酸，其 中絲狀菌爲麹菌（A s p e r g 1 ί 1 u s s p.)屬。 6 .如申請專利範圍第5項之經分離之聚核苷酸，其 中麴菌（Aspergillus sp.)屬爲麴菌（Aspergillus sp. )P F 1 2 2 4株（寄存號碼CCRC 9 30057 )或其突變株。 7 . —種重組載體，其特徵爲含有如申請專利範圍第 2項至第6項中任一項之經分離之聚核苷酸所成。 8 . —種宿主，其特徵爲經由如申請專利範圍第7項 之重組載體進行轉形者。 9 .如申請專利範圍第8項之宿主，其爲微生物。 1 〇 ·如申請專利範圍第9項之宿主，其爲絲狀菌。 1 1 .如申請專利範圍第1 0項之宿主，其中絲狀菌 爲 Trichoderma 屬。 12 .如申請專利範圍第1 1項之宿主，其中 Trichoderma 屬爲 Trichoderma viride MC300-1 株（寄存號 碼爲CCRC 930056 )或其突變株。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 3 ·如申請專利範圍第8項至第1 2項中任一項之 宿主，其可表現皂角苷分解酶。 1 4 · 一種目的蛋白質的製造方法，其特徵爲培養如 申請專利範圍第8項至第1 3項中任一項之宿主，所得之 培養物中採出具有皂角苷分解活性之蛋白質者。 1 5 · —種大豆皂醇B的製造方法，其特徵爲含有， 使用含有可由申請專利範圍第8項第1 3項中任一項之宿 本紙張尺度適用中國國家標準（〇师）六4規格（210><297公嫠)-2 - 1313300 ABCD 六、申請專利範圍 主得到之具有皂角苷分解活性的蛋白質之培養物，進行大 豆皂醇B作爲配基的配糖體之分解者。 1 6 . —種大豆皂醇B的製造方法，其特徵爲含有， 使用至少一種選自如申請專利範圍第1項之蛋白質、及可 由如申請專利範圍第8項至第1 3項中任一項之宿主所得 之蛋白質所成群之蛋白質，進行大豆皂醇B作爲配基的配 糖體之分解者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :裝· -β- ΙΛ- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）