TWI306406B

TWI306406B - Regenerative bone implants

Info

Publication number: TWI306406B
Application number: TW091120185A
Authority: TW
Inventors: Thomas Lai Wen-Fu; Wen Ping Deng; Yu Hmi Tsai; Wing P Chan; Wei Chung Yang; Pham Wellington
Priority date: 2001-09-05
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2009-02-21
Also published as: CN1440731A; HK1059206A1; CN1268307C; US20030045942A1; JP2003175098A; JP4796261B2

Description

1306406 五、發明說明（1) 【發明背景】當骨無法以正常速度進行自身修復或由於骨折、疾病而受損時，就必須進行骨植入。金屬植入材可作為内部固定以幫助骨折癒合，但由於其誘變性（mutagenicity)與機械特性限制了它的使用。參見，例如：L a f t m a η ( 1 9 8 0 ) Acta Orthop Scand 51(2): 215-22; (1989) supra 60(6): 718-22; van der List et al. (1988) Acta Orthop Scand 59(3): 328-30; and Penman et al. (1984) J Bone Joint Surg Br 66(5): 632-4。骨植入材也可為移植物，例如：自體移植物、同種異體移植物或異種移植物。使用自體移植物是將病人組織由一個位置移至另一個位置，它具有避免免疫反應之優點，然而它需要兩次外科手術，因此感染的危險較高。同種異體移植物是取自相同物種不同生物體之組織，而異種移植物則來自不同物種之生物體，同種異體移植物與異種移植物均會誘導免疫反應。【發明概述】本發明係一骨再生植入材，包括：具孔之基質（包括空隙）；及置於孔中與基質共價鍵結之生物聚合物。前述之基質與生物聚合物均具有生物相容性與生物降解性。前述之骨再生植入材進一步可包括同樣位於孔中之骨生成刺激物(bone formation promoter )，並且視需求該刺激物也可與基質共價鍵結。本文中之''基質"係指以無機化合物（例如：經填灰石

1306406 五、發明說明（2) (hydroxyapatite ))或以有機聚合物（例如：聚乳酸 (polylactic acid)或聚乙醇酸（polyglycolic acid) )所製備之材料，具有擬被替代的骨之機械強度。本文中之”生物聚合物''是一種蛋白（例如··膠原）或含有蛋白之大分子（例如：蛋白多醣），係可作為細胞附著與遷移的支架以利於新生骨組織之再生。前述生物聚合物置於基質之孔中，使細胞更有效的遷移與向内生長。前述骨生成刺激物係一種促進骨組織生長與維持骨質量之試劑（a g e n t )，ϊ列士〇：骨生成素(osteoprotegerin ) ° 本發明亦提供一種製備骨再生植入材之方法，其係至少包括：提供前述具孔之基質；提供含有前述生物聚合物之液體；及將前述基質浸入前述液體中從而使生物聚合物置於孔中。此方法可進一步包括將生物聚合物共價鍵結於基質上。前述之液體還可包含置於基質孔中之骨生成刺激物。前述之骨生成刺激物可選擇性地共價鍵結於基質上。使用前述骨再生植入材取代體内受損骨之方法也屬於本發明範圍。本發明之其他特點或優點將通過下述幾個實施態樣之詳細說明及所附專利申請範圍進行闡明。【發明之詳細說明】本發明係為一具有生物相容性與生物降解性之骨再生植入材。更明確的講，骨再生植入材包括：多孔基質、生物聚合物及選擇性之骨生成刺激物。生物聚合物置於基質之孔中並以共價鍵與基質結合。如果存在骨生成刺激物，

1306406 五、發明說明（3) 其也同樣置於基質之孔中，並且可與基質共價鍵結或不共價鍵結。用於製備本發明之骨再生植入材之一種基質之實施例係以經填灰石為主之基質（hydroxyapatite-based ma t r i x )，其主要成分為羥磷灰石。羥磷灰石天然存在於，例如：骨、釉質或牙本質中，多年來已用於骨替代物或被覆材料。參照，例如：F r a η e ( 1 9 8 7 ) I n t. J · 0 r a 1

Maxillofacial Surgery 16 : 642-55 ，及Parsons 等 (1988 ) Annals N. Y. Academy of Sciences 523 ： 1 9 0 - 2 0 7。羥磷灰石之製備可以使用熟知的方法或從供應商處購買，它可以為一種分子式為Ca1Q(P04)6(0H)2之純化合物，或是一種含有其他離子，例如：碳酸鹽，氟離子，氣離子，或鋇離子之組合物。在使用以羥磷灰石為主之基質製備本發明骨植入材時，基質可進行熱液處理 (hydrothermal ly process )以獲得所欲之孑L徑大小，例如：直徑150mm 至350 mm，或200mm至300mm。為了使生物聚合物共價鍵結於以羥磷灰石為主之基質上，基質表面，尤其是孔的内表面要先用官能基修飾，例如：氨基或羥基。官能基之導入（introduced)可藉由電漿沈積 (plasma deposition )或化學引 4务（chemical priming )。用於電漿沈積之材料包括，但不局限於，氨電漿、烯丙胺電漿、烯丙醇電漿及任何含有氨基、羥基或其他活性基團之氣體之電漿。用於化學引發之化合物可以為氨基矽烷、羥基矽烷或含有氨基、羥基或其他活性基團之其他矽

1306406 五、發明說明（4) 院。參照，例如：Sano 等（1993 ) Biomaterials 14 : 817-822 ;及Wang 與Hsiue (1993)J. Polymer Science， Part A ： Polymer Chemistry 31 :2601-2607 。用於製備本發明骨植入材之生物聚合物之一實施例為膠原。膠原，例如：第1型膠原，能夠從人體或動物組織中，例如：肌腱、皮膚、骨或韌帶中分離出來。參照， m : Miller 與Rhodes ， (1982 ) Methods in

Enzymology 82 :33-64。膠原可以用保留端肽之 (t e 1 ο p e p t i d e )方法進行純化（例如：美國專利第 3，1 1 4 , 5 9 3號），或用去除端肽之方法進行純化（例如：美國專利第4，2 3 3 , 3 6 0號），還可以使用化學試劑（例如，美國專利第5, 876, 444號與第6, 177, 514號）或使用其他方法（例如，紫外光照）進行交聯（c r 〇 s s - 1 i n k i n g ) 而重建。膠原可與以羥磷灰石為主之基質進行共價鍵結，共價鍵可直接形成於膠原之官能基（例如：羧基）與修飾過的羥磷灰石之官能基（例如：氨基）之間，也可以藉由第三種分子，例如：交聯劑（c r 〇 s s - 1 i n k e r )，而間接形成共價鍵結。交聯劑是一種具有兩個官能基之試劑，其中之一個官能基可與生物聚合物形成鍵結而另一個官能基與基質形成鍵結。交聯劑之實例包括，但不局限於，戍二醛 (glutaraldehyde) ，tresyl氣化物，及N —經基破珀醯亞胺(N-hydroxy-succinimide )。骨生成刺激物之一實施例為骨生成素，其可置於前述基質之孔中，骨生成素係腫瘤壞死因子（TNF)家族中之

1306406 五、發明說明（5) 一蛋白質，其活性與骨代謝有關，尤其具有抑制骨吸收從而增加骨密度之活性。參考Simonet等（1997 )Cell 89 (2 ); 3 0 9 - 1 9。大鼠骨生成素為40 1個氨基酸之蛋白質，與小鼠及人類的骨生成素分別有8 5 %及9 4 %的同源性，本文中之"骨生成素”係指具有全部或部分大鼠、小鼠或人骨生成素氨基酸序列的多肽（參照，例如：美國專利第6，0 1 5 , 9 3 8號）或其衍生物，並具有抑制骨吸收的活性。在植入材用於替代骨缺損時，較適宜選擇含有足量之骨生成刺激物（例如：0 . 0 2 %至0 . 1 %重量百分比）以刺激骨生長並抑制骨再吸收（bone resorption)。骨生成刺激物可藉由本領域熟知的方法共價鍵結於基質上。本領域之骨植入材可以如下製備：根據，例如：Roy 與Linnehan(1974)Nature 247 : 220-222 中所述之熱液處理方法，或根據，例如-Liu ( 1996 ) Biomaterials 17 ： 1 9 5 5 - 5 7，與 L i u ( 1 9 9 7 ) C e r a m i c I n t e r n a t i ο n a 1 2 3 : 1 3 5 中所述之有機顆粒方法製備多孔羥磷灰石。製備過程中，將多孔羥磷灰石模塑成設計之形狀而獲得以羥磷灰石為主之基質，接著將成形基質浸入含有具兩個官能基之交聯劑之溶液中，其中一個官能基與基質反應並在交聯劑與基質間形成共價鍵。製備另一種含有生物聚合物與選擇性之骨生成刺激物之溶液，尤其可以將含生物聚合物之溶液與含骨生成刺激物之溶液混合形成同質溶液，然後將含交聯劑之基質浸入前述溶液一段足夠的時間，藉由交聯劑之第二官能基在交聯劑與生物聚合物（及骨生成刺激物，如果存

第9頁 1306406 五、發明說明（6) 在）間形成另一個共價鍵結，接著從溶液中取出基質並冷凍乾燥。如果在前述獲得之骨植入材中不包括骨生成刺激物，可將骨植入材浸入含骨生成刺激物之溶液中使刺激物與基質鍵結，接著再風乾或冷凍乾燥。使用任一方法均可將骨生成刺激物置於多孔基質之外表面與内表面。前述製備之骨再生植入材能夠用於一般外科手術以替代骨缺損。下述特定實施例僅用於舉例說明，並不適宜用於限制本發明。根據本文詳述無須進一步說明，熟習本技術領域之任何人員均可將本發明作最大程度之應用。本文引用之出版物，包括專利，以其全文引入作為參考。材料製備製備以羥磷灰石為主之多孔基質。羥磷灰石粉末使用濕式化學法製備，包括如下反應：1 0Ca(NO3)2 + 6(NH4) 3P04 + 2NH3H20 = Ca1(1(P04)6(0H)2 + 20NH4N〇3。以羥磷灰石為主之多孔基質按如下步驟製備：（i )製備含有羥磷灰石粉末、碳化矽、氧化鎂，與水之漿料；（i i )將網狀基材（例如：聚氨基甲酸酯（ρ ο 1 y u r e t h a n e )、聚氯乙稀 (polyvinyl chloride)或聚乙二醇 (polyethyleneglycol ))模塑成所欲之形狀；（iii ) 用漿料包覆網狀基材；及（i v )離心去除多餘之漿料。如有必要，可以重複步驟（i )至（i v )。將獲得之含羥磷灰石基材在1 2 0 0 t燒結，接著冷卻，溫度緩慢上升使網

第10頁 1306406 五 '發明說明（7) 狀基材逐漸分解而不形成裂縫，如此即可獲得以羥磷灰石為主之多孔基質，平均孔徑大小2 0 0至3 5 0 m m，洗滌後，基質用g射線照射（20 kGy )消毒。萃取及純化第I型膠原。第I型膠原從紐西蘭白兔之肌腱中萃取並純化。解剖肌腱並切成片狀，用冷蒸餾水多次清洗去除血漿蛋白，接著置於0.5 M NaCl (溶解於50 mM Tr i s-HC 1 pH 7. 4 )中於4 t：持續攪拌過夜而萃取。輕輕倒出上清液，剩餘物用冷蒸餾水清洗，換水數次以除去鹽類’然後與pH 2. 5的HO Ac —起於4 °C培養過夜以獲取水相萃取物。在萃取物中加入鹽溶液（〇 · 9 Μ N a C 1 )形成沈;殿物，以1 3，0 〇〇 r pm速度下離心3 0分鐘以收集沈澱物，之後以0 . 0 5 M HO Ac溶解沉澱物，如此便形成含有膠原之溶液。於2 4至4 8小時之期間，於該含有膠原之溶液中兩次加入另一種鹽類溶液（0 _ 0 2 Μ N HP04 )形成沈澱物，離心收集沈澱物並溶解於5 0 m Μ Η 0 A c以獲得另一種含膠原之溶液，將其對5 m Μ Η 0 A c透析，最後冷東乾燥。表現重組骨生成素。建構一表現質體為本領域熟知之技術。參照 S i m ο n e t 等（1 9 9 7 ) c e 1 1 8 9 ( 2 ) : 3 0 9 - 1 9。例如：人類全長（2. 4 kb )骨生成素（〇pG ) _Fc融合蛋白係藉由PCR放大及複製於質體栽體pCEp4 (Invitr〇gen，聖地牙哥，加州），然後根據廠商推薦方法將pCEp4〇pG_Fc 載體利用脂質體轉染入細胞，例如：2 9 3_EBNAM細胞 (Invitrongen，聖地牙哥，加州），或中國倉鼠印巢細胞，使OPG-Fc融合蛋白表現，迷進一步使用蛋白A/G_親和

1306406 五、發明說明（8) 層析法純化。製備骨植入材純化之膠原（第I型）用胃蛋白酶消化去除端肽，經幾個修飾步驟重建形成戊二醛-聚合物胺複合物（參照，例如：美國專利第5 , 8 7 6 , 4 4 4號）。膠原與骨生成素均由 T射線照射消毒，並分別溶解於5 mM HO Ac與填酸鹽緩衝溶液中。輕輕混合含有膠原與含有骨生成素之溶液，如果有必要，加熱至3 0至4 0 ° C以幫助混合，如此便獲得含有重建之膠原與骨生成素之溶液，其包括0.2-1 % (重量）之骨生成素，及99. 8% (重量）之膠原。如上所述製備以羥磷灰石為主之多孔基質。藉由氨等離子將氨基引入以羥磷灰石為主之多孔基質之表面，接著，將基質浸入含有戊二醛之溶液中，在氨基與戊二醛間形成共價鍵結。將如此獲得之基質再浸入前述含重建之膠原與骨生成素之溶液中，經過足夠的時間後，在戊二醛與膠原間以及戊二醛與骨生成素間形成另一個共價鍵結。最後，從溶液中取出基質並冷凍乾燥形成骨植入材。骨植入材中膠原之孑L徑大小介於50mm至200mm。【其他實施態樣】本說明書中描述之所有特徵可以任何方式相互組合。本說明書中的每一種特徵可以由達到相同的、相當的或相似之目的之另一種特徵取代。因此，除非另有說明，每一個描述之特徵僅僅是這一類相當的或相似的系列特徵之一個實施例。

第12頁 1306406 五、發明說明（9) 根據上文詳述，熟習本技術領域之人員能夠輕易確定本發明的基本特徵，並且在不脫離本發明的主旨和範疇之下對本發明做出各種變動和修改使其適用於各種用途和條件。所以，其他實施態樣也屬於權利要求範圍。

第13頁 1306406 圖式簡單說明 ··

第14頁

Claims

公告本纟Ά正 r-- j申請專利範圍】 -------一------------------ 1 . 一種骨再生植入材，其至少包含：一具有生物相容性與生物降解性之多孔基質；一置於前述基質之孔内並與前述基質共價鍵結之且具有生物相容性與生物降解性之生物聚合物；其中前述基質係由無機物質組成。、2.如申請專利範圍第1項所述之骨再生植入材，進步包含一種骨生成刺激物，其亦置於前述基質之孔中。、 3二如申請專利範圍第2項所述之骨再生植入材，其中丽述骨生成刺激物與前述具有生物相容性與生降解性之基質共價鍵結。、 4丄如申請專利範圍第2項所述之骨再生植入材，其中丽述具有生物相容性與生物降解性之基質係一以羥磷灰石為主之基質。、、 5二如申請專利範圍第4項所述之骨再生植入材，其中前述具有生物相容性與生物降解性之生物係膠原。 6 ·,如申請專利範圍第5項所述之骨再生植入材，其中前述骨生成刺激物係骨生成素。 7二如申請專利範圍第2項所述之骨再生植入材，其中荊述具有生物相容性與生物降解性之基質係一種以輕磷灰石為主之基質。 1306406 8 ·如申請專利範圍第2項所述之骨再生植入材，其中前述具有生物相容性與生物降解性之生物聚合物係膠原。 9 ·如申請專利範圍第1項所述之骨再生植入材，其中前述具有生物相容性與生物降解性之基質係一種以輕鱗灰石為主之基質。 10 .如申請專利範圍第9項所述之骨再生植入材，其中前述具有生物相容性與生物降解性之生物聚合物係膠原。 11 ·如申請專利範圍第1項所述之骨再生植入材，其中前述具有生物相容性與生物降解性之生物聚合物係膠原。 12 . —種製備骨再生植入材之方法，其至少包含：提供一具有生物相容性與生物降解性之多孔基質，其中前述基質係由無機物質組成；以官能基修飾前述基質的表面；及提供一含有具生物相容性與生物降解性之生物聚合物之液體，藉此將前述基質浸入前述液體中，從而使前述生物聚合物共價鍵結至前述基質。 13.如申請專利範圍第12項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述具有生物相容性與生物降解性之基質係一種以羥磷灰石為主之基質。 1306406 14. 如申請專利範圍第13項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述具有生物相容性與生物降解性之生物聚合物係膠原。 15. 如申請專利範圍第12項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述具有生物相容性與生物降解性之生物聚合物係膠原。 16. 如申請專利範圍第12項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述液體進一步含有一種置於前述基質之孔中之骨生成刺激物。 17. 如申請專利範圍第16項所述製備骨再生植入材之方法，進一步包含使孔中之骨生成刺激物與前述具有生物相容性與生物降解性之基質共價鍵結。 18·如申請專利範圍第16項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述具有生物相容性與生物降解性之基質係一種以羥磷灰石為主之基質。 19·如申請專利範圍第18項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述具有生物相容性與生物降解性之生物聚合物係膠原。 20*如申請專利範圍第19項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述骨生成刺激物係骨生成素。 21·如申請專利範圍第16項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述具有生物相容性與生物降解性之生物聚合物係膠原。 22.如申請專利範圍第21項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述骨生成刺激物係骨生成素。 Ι3Θ6406 23 ·如申請專利範圍第16項所述製備骨再生植入材之方法，其中前述骨生成刺激物係骨生成素。