KR100487693B1 - 골아세포의 부착을 촉진하는 자연골 대체용 인공골 구조재료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우수한 초기 강도를 가지고 있으며 생체내분해성인 유산글리콜산중합체과 자연골 유기성분인 제1형 콜라겐의 비면역화 유도체인 아텔로콜라겐을 복합화 하되, 이 때 골형성의 석회화과정시 핵으로 작용하는 칼슘의 침착을 유도하여 골형성을 촉진시키기 위해 음이온화 수식한 아텔로콜라겐을 우선 사용하며, 골아세포의 부착을 촉진하기 위하여 세포접착성당단백인 화이브로넥틴을 주성분으로하는 혼탁액과 자연골의 주요 무기성분인 탄산아파타이트 및 수산화아파타이트 반소결체를 복합화 제조함으로서, 기존에 사용중인 자연골의 수복뿐만 아니라, 골아세포의 초기 부착을 촉진시켜 골의 재생을 촉진하는 새로운 자연골 재생형 인공골 구조체를 제공하는 것이다.

Description

골아세포의 부착을 촉진하는 자연골 대체용 인공골 구조재료{Osteoblast adhesion conductive natural bone replaceable artificial structural material}

골격계는 인체의 장기를 보호하고, 구조를 지지하며, 운동성을 보장하는 장기로서 일반적으로 망상구조를 지닌 해면골은 높은 강도를 지닌 피질골이 둘러싸고 있으며, 피질골은 다시 골막이 덮고 있는 형태로 구성되어 있다. 해면골내에는 골수조직이 차지하고 있어 조혈기능을 제공하고 있으며, 피질골은 높은 석회화를 이루어 생체역학적 지지기능을 유지하고, 골막은 골조직을 보호하는 역할을 한다.

지금까지 골의 일부가 결손될 경우, 이를 수복하기 위한 골충전재료로서 자가 골이식, 또는 타인의 골조직 이식을 통하여 수복하거나, 탈회한 골의 유기조직이나 수산화아파타이트 또는 3인산칼슘과 같은 인산칼슘계 무기재료를 충전하여 골조직의 골아세포가 침윤하도록하는 방법이 주로 사용되고 있으며, 최근에는 골의 유기질과 무기질을 복합화한 재료가 소개되고 있고, 더 나아가 이들 복합체에 줄기세포를 배양하여 이식하는 방법이 연구되고 있다.

자가골 이식의 경우 환자자신의 건강한 골조직을 절제하여 옮기기 때문에 안전하지만 조직을 얻을수 있는 부위가 제한적이며, 타인의 골을 동결건조하여 이식하기도 하지만 면역학적 거부반응 때문에 널리 사용할 수가 없고 사체의 이용 또한 윤리적 문제 때문에 상업화하는데 걸림돌이 된다. 한편 탈회골, 즉 유기조직만 이식하는 경우, 골 구조단백질인 교원질이 주요 성분으로써 이식후 주변골에 존재하는 골아세포의 분화를 촉진하지만 자체가 지닌 강도가 매우 낮기 때문에 생체역학적 부하를 지지하기가 매우 어렵다. 인산칼슘계 무기질의 경우, 수산화아파타이트가 매우 높은 생체친화성을 가지고 있어 가장 널리 사용되고 있으며, 분말을 섭씨 1200도 이상에서 소결하면 매우 단단한 결정체를 형성하며 이식후 표면에 골아조직이 직접 부착되어 성장하면서 견고한 골충전재로서의 역할을 하지만 높은 취성 때문에 역시 생리적 부하가 많은 부위에는 사용할 수가 없다. 또한 소결하지 않은 수산화아파타이트와 3인산칼슘은 체내에서 높은 생분해성을 가지고 있으나 낮은 강도때문에 단독으로 사용하지 않고 있다. 이들 골충전의 단점을 개선하기 위해, 가장 널리 연구되고 있는 것이 골의 유기질과 무기질을 복합화하는 방법이다. 골아세포에 의해 생성되는 오스테오칼신은 이 유기질내에 존재하는 음이온성 아미노산인 카르복시글루타메이트의 카르복실기가 골형성의 석회화과정시 핵으로 작용하는 칼슘의 침착을 유도하여 골형성에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 위의 원리에 기초하여 카르복실기가 많이 있는 음이온성 I형 아텔로콜라겐을 이용하여 석회화의 유도를 향상시킬 수 있다.

현재 가장 대표적인 방법으로서, 국제공개 제87-06843호팜프렛(1987)(인공생체 복합재료)는 다공질 인산칼슘 소결체와 포점막체로서 콜라겐 유도물체를 사용하고 있으며, 원하는 형상 및 치수로 정형 가공된 인공생체 경조직 재료부(인공골부)와 이 인공골부를 유기 고분자가 주요 구성성분으로 형성된 포접막체로 피막하는 인공생체복합재료(청구범위1)로서, 인공골로는 세라믹스, 카본, 금속 및 유기합성수지를(청구범위 2), 인공골을 둘러싸는 막으로는 유기고분자재료로부터 되는 섬유로서 만들어진 직물, 편물, 펠트, 망상물 및 부직웨이브 및 유기고분자재로로서 만들어진 필름(청구범위 7)으로서 시트, 튜브 또는 봉지체 형상을 하고 있는 것(청구범위 8)이다. 즉, 각종 인공골재료를 유기고분자재료로 만든 막으로 둘러싼 형태의 것을 대상으로 하는 것이며, 인공골로서 세라믹스, 카본, 금속 및 경질 유기합성수지 가운데 청구범위 3, 4, 19, 20, 24에 인산칼슘, 포접막체로서 폴리에스테르 등 각종 합성수지와 함께 청구범위 13, 14에 골유도단백질과 콜라겐유도물질이 등재되어 있다.

또한 일본특허공개 평 1-170463(의료용 경화조성물)과 동 평 3-158164호(골결손부 및 골공극부 충전재)에서는 인산칼슘과 콜라겐 또는 체액을 함유시키는 것이 공개되어 있다. 평 1-170463 " 의료용 경화조성물" 은 인산칼슘분말과 콜라겐 및 탄닌산을 함유하는 연화액으로서 구성되는 의료용 경화조성물(청구범위 1)로서, 인삼칼슘계 분말로서 α-3인산칼슘, 4인산칼슘, 하이드록시아파타이트, 8인산칼슘, 탄산아파타이트를 제시하고(청구범위 2), 연화액으로 저항원성 콜라겐과 탄닌산을 무기산수용액, 유기산 수용액, 불포화카르본산 수용액 등(청구범위 3) 산성용액에 혼합하여 사용하는 것을 내용으로 한다. 즉, 이것은 종래에 사용하던 인산아연세멘트, 폴리카르본산 세멘트, 글라스7이오노마 세멘트등 메타아크릴계 골세멘트의 단점을 해결하기 위한 것으로서, 콜라겐과 경화물질인 탄닌산을 함께 포함하는 산성수용액인 연화액과 탄산아파타이트 등 인산칼슘계 분말을 마치 세멘트처럼 반죽하여 골접착체(골세멘트)로 사용하는 것이며, 화학용제인 탄닌산(가죽 무두질에 사용하는 용액)에 의해 콜라겐이, 산성 수용액에 의해 인산칼슘이 서서히 굳게 되는 것이다. 평 3-158164 " 골결손부 및 골공극부 충전제" 는 골수세포를 포함하는 동물로부터 채취한 체액과 인산칼슘화합물을 함유하는 특징을 가진 골결손부 및 골공극부 충전재(청구범위)로서, 인산칼슘화합물로서는 수산아파타이트, 인산3칼슘, 인산4칼슘, 물소계 아파타이트, 탄산아파타이트 가운데 수산아파타이트를 사용하는 것이 유리하며(과제를 해결하기 위한 수단 참조), 실시예 1에서는 골수채취액을 플라스틱샤레(뚜껑이 함께 있는 납짝하고 투명한 원형 용기)에 넣고 수산아파타이트 과립을 각반하면서 혼합하여 골 결손부나 골공극부에 넣는 방법, 실시예2에서는 수산아파타이트, 인산3칼슘, 석신산4칼슘 혹은 수산아파타이트와 인산3칼슘 혼합물과 골수채취액을 실시예 2과 같은 방법으로 혼합한 것을 대상으로하고 있다. 즉, 각종 인산칼슘화합물을 골수채취액과 혼합하여 골 결손부나 공극부에 충전하는 것이다.

한편, 발명자 역시 대한민국특허 제122680호 " 자연골치환형 인공골과 그 제조방법" 을 출원하여 1997년 등록한 바 있다. 즉, 무기질로서 실리카를 포함하는 생분해성 탄산아파타이트와 콜라겐용액을 혼합한 후 제형을 만들어, 콜라겐의 가교 화결합에 화학용제를 사용하지 않고 자외선을 이용하여 견고하게 만들며, 최종적으로는 건조한 상태의 복합체를 보관하다가 사용하게되는 것이었다. 그러나, 이 방법에 의해 제조된 탄산아파타이트와 콜라겐 복합체의 경우, 궁극적으로 자연골로 치환되지만 실제에서는 초기 강도를 유지하기 위해 금속제 골고정기구를 반드시 사용 해야하는 어려움이 있다.

본 발명은 우수한 초기 강도를 가지고 있으며 생체내분해성인 유산글리콜산 중합체과 자연골 유기성분인 제1형 콜라겐의 비면역화 유도체인 아텔로콜라겐을 복합화 하되, 이 때 골형성의 석회화과정시 핵으로 작용하는 칼슘의 침착을 유도하여 골형성을 촉진시키기 위해 음이온화 수식한 아텔로콜라겐을 우선 사용하며, 골아세포의 부착을 촉진하기 위하여 세포접착성당단백인 화이브로넥틴을 주성분으로하는 혼탁액과 자연골의 주요 무기성분인 탄산아파타이트 및 수산화아파타이트 반소결체를 복합화 제조함으로서, 기존에 사용중인 자연골의 수복뿐만 아니라, 골아세포의 초기 부착을 촉진시켜 골의 재생을 촉진하는 새로운 자연골 재생형 인공골 구조체를 제공하는 것이다.

본 발명은 우수한 초기 강도를 가지고 있으며 생체내분해성인 유산글리콜산 중합체에 자연골 유기성분인 제1형 콜라겐의 비면역화 유도체인 아텔로콜라겐을 복합화하고, 골아세포의 부착을 촉진하기 위하여 세포접착성당단백인 화이브로넥틴을 주성분으로하는 혼탁액과 자연골의 주요 무기성분인 탄산아파타이트 및 수산화아파타이트 소결체를 복합화 제조함으로서, 기존에 사용중인 자연골의 치환 뿐만 아니라, 골아세포의 향상된 초기 부착과 음이온성 I형 아텔로콜라겐의 사용으로 골형성의 석회화과정시 핵으로 작용하는 칼슘의 침착 유도에 의해 골아세포에 의한 석회화를 촉진시켜 골의 재생을 촉진하는 새로운 자연골 재생형 인공골 구조체를 제조하는 것이다.

본 발명을 실시예로서 상세히 설명한다. 본 발명이 본 실시예로서 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1

1. 음이온성(숙신화, 술폰화 등) I형 아텔로콜라겐을 pH 약 7.0에서 증류수에 0.1% (wt%)의 농도로, 예를 들어 100㎖의 3차 증류수에 100mg의 음이온성 I형 아텔로콜라겐을 넣고 4℃에서 약 24시간 동안 250rpm의 속도로 교반시키면서 용해하여 음이온성 I형 아텔로콜라겐 용액을 제조하고, 4℃에 보관한다.

2. 분자량 50,000 - 100,000 정도의 유산글리콜산중합체(Poly lactic glycolic acid: FLGA)분말을 pH 약 7.0의 증류수에 0.1% (wt%)의 농도로, 예를 들어 100㎖의 3차증류수에 100mg의 유산글리콜산중합체 분말을 250rpm의 속도로 교반시키면서 혼합시킨 유산글리콜산중합체 용액을 제조한다. 제조한 유산글리콜산중합체 용액은 4℃에 보관한다.

실시예 2

음이온성 I형 아텔로콜라겐과 유산글리콜산중합체의 혼합 용액제조

1. 위에서 제조한 음이온성 제 I형 아텔로콜라겐 용액과 유산글리콜산중합체 용액을 약 1 : 1의 비율로 섞은 후, 250rpm의 속도로 교반시키면서 혼합시킨 음이온성 I형 아텔로콜라겐과 유산글리콜산 중합체의 혼합액을 제조한다. 제조한 음이온성 I형 아텔로콜라겐과 유산글리콜산중합체의 혼합 용액은 4℃에 보관한다.

2. 1의 용액에 화이브로넥틴을 100ml당 2000 - 5000unit 혼합한다

실시예 3

탄산아파타이트와 수산화아파타이트 혼합 반소결 분말의 제조.

( 소결은 섭씨 950 - 1050도에서 행한다.)

시약의 조제 (탄산아파타이트 용)

1) 0.058M (NH4)2CO3 용액의 제조 [용액 1]

1.392g의 암모니움 카보네이트를 250㎖의 3차 증류수에 용해시켜 0.058M 농도의 (NH4)2CO3 용액을 제조한다.

2) 0.12M NH4H2PO4 용액의 제조 [용액 2

3.45g의 암모니움 포스페이트를 250㎖의 3차 증류수에 용해시켜 0.12M 농도의 NH4H2PO4 용액을 제조한다.

3) 0.2M Ca(CH3COO)2 ·H2O 용액의 제조 [용액 3

15.82g의 칼슘 아세테이트를 500㎖의 3차 증류수에 용해시켜 0.2M 농도의 Ca(CH3COO)2 ·H2O 용액을 제조한다.

4) 1.3M CH3COONH4 용액의 제조 [용액 4]

100.2g의 암모니움 아세테이트를 1ℓ의 3차 증류수에 용해시켜 1.3M 농도의 CH3COONH4 용액을 제조한다.

5) 5N HCl 용액의 제조 [용액 5]

41㎖의 37% 염산 용액을 100㎖의 3차 증류수와 혼합시켜 5N 농도의 HCl 용액을 제조한다

6) 5N NaOH 용액의 제조 [용액 6]

20의 소디움 하이드록사이드를 100㎖의 3차 증류수에 용해시켜 5N 농도의 NaOH 용액을 제조한다.

실시예 4

탄산아파타이트 반소결 분말의 제조

1) 제조한 0.058M (NH4)2CO3 용액 1과 0.12M NH4H2PO4 용액 2를 1:1의 비율로 즉, 각각 250㎖씩 서로 혼합한다.

2) 제조한 0.2M Ca(CH3COO)2 ·H2O 용액 3을 1)에서의 혼합액만큼 즉, 500㎖을 준비한다.

3) 제조한 1.3M CH3COONH4 용액 4를 1)의 혼합액과 2)의 용액을 합한 양만큼 즉, 1ℓ를 준비한다.

4) 3)의 용액을 2ℓ의 비이커에 넣고 가열기로 가열하여 58℃까지 미리 온도를 올린다.

5) 1)의 혼합액과 2)의 용액을 각각 500㎖ 비이커에 넣고, 마이크로튜브 펌프를 이용하여 시간당 280㎖의 유속으로 미리 가열된 4)의 용액에 공급한다.

6) 교반기를 이용하여 300rpm의 속도로 5)의 용액을 잘 섞으며 혼합한다.

7) 용액의 혼합 중 그리고 혼합 종료 후에, 조제한 5N HCl 용액 ⑤ 및 NaOH 용액 ⑥로 pH를 7.4로 조절한다.

8) 용액의 혼합이 종료되면, 50㎖ 센트리튜브에 나누어 담고 3,200×g (≒4,000rpm)의 속도로 10분 동안 원심분리한다.

9) 생성된 침전물을 3차 증류수로 24시간 동안 세척한다.

10) 유리재질의 패트리 디쉬에 세척한 침전물을 모아서 58±2℃에서 600± 50mbar의 압력으로 24시간 동안 진공건조 시킨다.

11) 건조된 분말을 유리재질의 패트리 디쉬에 넣고 parafilm으로 완전히 봉합하여 4℃에서 보관한다.

12) 합성된 탄산아파타이트 분말을 취하여 도가니에 넣고, 뚜껑을 닫지 않은 상태로 소결로에 올려 놓는다.

13) 소결로의 panel에 dry time (2min), low temp (400℃), vacuum level (off), heat rate (60℃/min), high temp (980℃/1,200℃), hold time (2min), cool time(20min) 등을 미리 입력하여 프로그램을 설정한 다음, 소결을 진행시킨다.

14) 소결이 완료되어 도가니가 소결로 밖으로 내려오면 재빨리 뚜껑을 덮고 실온에서 천천 히 식힌 다음, 유리재질의 패트리 디쉬에 옮겨 담고 parafilm으로 완전히 봉합하여 4℃에서 보관한다.

실시예 5

수산화아파타이트 반소결 분말의 제조

1) Ca(NO3)2 용액을 100rpm/min의 속도로 교반시키면서 180분동안 (NH4)3PO4를 첨가한다.

2) 위에서 얻어진 용액은 끓을 때까지 가열시키고, 침전물은은 Bihner's funnel을 사용한 filtration을 통해서 분리된다.

3) 얻어진 filter cake는 암모니아 냄새가 없어질 때까지 따뜻한 증류수로 씻어 낸다.

4) pH는 수산화아파타이트를 안정시키기 위해서 암모니아를 첨가함으로서 10이상으로 맞춘다.

5) filter cake는 상온에서 진공상태로 수분이 30%가 될 때까지 건조시킨다.

6) spherical granules를 체를 이용하여 만든다.

7) 건조된 granules들은 1100℃로 6시간동안 calcined된다.

실시예 6

자연골 재생형 인공골의 제조

1) 탄산아파타이트 반소결 분말과 수산화아파타이트 반소결분말을 중량비 약 1:1로 혼합한다.

2) 실시예 2의 용액을 120rpm의 속도로 교반하면서 실시예 6의 분말을 용액 : 분말이 10-15 : 90-85 wt% 비율이 되도록 혼합한 다음, 1,200 x g의 중력에서 15분간 원심분리한다..

3) 원심분리후 침전물을 테프론으로 만든 주형에 넣고, 상방에서 1 cm2당 1kg의 압력을 가하여 원하는 모양으로 성형한다.

4) 성형물내의 음이온성 I형 아텔로콜라겐을 가교화시키고 유산글리콜산중합체의 용융을 위해 5% 질소 포함 상태의 건열오븐내에 7에서 얻은 재료를 넣고 200℃에서 30 - 60분간 가열하여 제조한다.

본 발명에서 제조된 골아세포의 부착을 촉진하는 자연골 대체용 인공골 구조재료는 다음과 같은 장점이 있다.

1. 자연골의 유기질 구조체인 콜라겐과 세포부착성 당단백질인 화이브로넥틴을 혼합하여, 골아세포의 부착을 능동적으로 촉진한다.

2. 자연골의 유기질 구조체인 콜라겐과 우수한 강도를 가진 생분해성 유산글리콜산중합체를 복합화하여 이식된 인공골의 초기 강도를 보장한다.

3. 골재생초기 섬유조직형성기간이 제공된 콜라겐에 의하여 단축되므로 골재생기간을 단축시킨다.

4. 음이온성 I형 아텔로콜라겐의 카르복실기가 골형성의 석회화과정시 핵으로 작용하는 칼슘의 침착을 유도하여 골형성을 촉진시킨다.

5. 이식후 반소결상태인 탄산아파타이트와 수산화아파타이트가 재생골형성에 필요한 무기성분의 공급원으로서 작용하며, 점차 흡수되어 피질골과 해면골을 모두 자연골로 완전히 치환된다.

6. 골결손부에 단독으로 사용하거나, 골막층세포, 골아세포, 골수줄기세포등을 배양하는 구조체로 사용한다.

제 1-1)도는 반소결 탄산아파타이트 분말의 전자현미경 사진이며,

제 1-2)는 제 1-1)의 반소결 탄산아파타이트 분말과 아텔로콜라겐-화이브로넥틴 혼합상의 전자현미경 사진이며,

제 1-3)은 반소결 탄산아파타이트 + 아텔로콜라겐-화이브로넥틴 혼합상과 유산중합체의 혼합상의 전자현미경 사진이며,

제 1-4)는 제조물의 형상을 나타낸 것이다.

제 2도는 본 발명이 반소결 탄산아파타이트 분말과 아텔로콜라겐-화입로넥틴 혼합상의 전자현미경 사진,

제 3도는 반소결 탄산아파타이트 분말 + 아텔로콜라겐-화이브로넥틴 혼합상+유산중합체의 혼합상의 전자현미경 사진,

도 4는 동물실험순서를 나타낸 것,

도 4-1은 골내이식형태(막성골의 경우)를 나타낸 사진

도 4-2는 본 발명의 구조체 이식후 방사선 평가(이식 6주후)결과를 나타낸 사진,

도 4-3은 본 발명의 구조체 이식부위 조직사진,

도 4-4는 토끼경골에 본 발명의 구조체를 이식한 경우의 X-선사진,

도 5는 본 발명의 구조체에 대한 골형성인자 투여후 골아세포 증식시험결과를 나태낸 그래프이다.

Claims (2)

1. 화이브로넥틴을 함유한 숙신화 I형 콜라겐, 유산글리콜산중합체, 반소결 탄산아파타이트 및 반소결 수산화 아파타이트를 포함하는 조성물을 가교화시키고, 가열하여 제조된 골조직 대체용 복합재료.
2. 화이브로넥틴을 함유한 숙신화 I형 콜라겐, 유산글리콜산중합체, 반소결 탄산아파타이트 및 반소결 수산화 아파타이트를 포함하는 조성물을 성형하고, 가교화시키고, 가열하여 제조된 골조직 대체용 복합재료 구조체.