TWI290226B - Method for detecting human HCCR-1 protein and a kit for diagnosing liver cancer using the same - Google Patents

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1290226 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種經由使用可特異地結合到從人類原_致癌基因 表現出的蛋白質之抗體進行抗原，抗體結合反應以偵檢一樣品内所含人類 HCCR-1蛋白質之方法，與一種使用彼診斷肝癌所用之套組。 【先前技術】 一般而言，為了增加肝癌患者的存活率，最重要者為在早期經由讓具有高 度罹患肝癌危險率的人到醫院定期健康檢驗以偵檢出Hcc (肝細胞癌) (Hepatocellularcarcinoma)的存在。具有高度罹患肝癌風險率的人稱為，，高肝 癌危險組’’。與肝癌相關聯的危險因素大部分經分類為生理學因素與病理學 因素。生理學因素的例子包括年齡、性別、種族等，而病理學因素的例子 包括B型肝炎病毒或C型肝炎病毒感染，肝硬化，酒精濫用，暴露於黃麴 毒素(aflatoxin)，相當罕見的新陳代謝疾病，性激素，化學物質等。 到目前為止，根據正常成人血清中的AFP濃度幾乎為零但是在許多患有肝 癌的患者體内卻劇烈增加之發現而將〇；_胎蛋白水平有利地用於肝癌早期偵 檢的診斷中作為諸篩選因素之一。不過，事實上，MP的濃度不僅會在肝 癌中增加而且也會在良性疾病，例如慢性肝炎或肝硬化，惡性疾病，例如 絨毛膜癌(choriocarcinoma)或肝母細胞瘤(hepatoblastoma)，或懷孕等之中增 加。相反地，經報導AFP不能有利地用於肝癌的早期診斷，如指出早期hcc 血清中的AFP濃度都呈實質地正常水平之許多臨床實驗所揭露出者 (Collier J and Sherman M? Hepatology 27:273-278, 1998; Okuda K5 J. Hepatol 32(1 Suppl):225-237, 2000)。根據此報告，於某些患有慢性肝炎或肝硬化但 1290226 沒有HCC的患者經觀察出血清細水平有非特別地增加。而且，大約篇 HCCs患者展現出正常AFP水平，且超過8〇%具有直徑不大於2厘米的小 HCC之患者顯示出在AFP水平上的統計無_差異，使得鮮與正常成人 所具者實質地不能相比。 有關HCC患者體_ AFP水平是否適合祕賴辑巾，有數份先前報告 可以提及如τ。有-純告歧㈣46.2%m患直财狀5 _的hccs 之患者_的AFP水平係實質地正常者。有另—份報絲示出於約 25.5% 罹患直徑不大於5厘米的HCCs之患者_之App水平係實f地正常者而 於約34.8%罹患不大於3厘米的相當小直徑HCCs之患者體内展現出正常 AFP 水平(Collier J and Sherman M，//epato/og)； 27: 273_278, 1998; κ，』 /fepato/· 32(1 Suppl): 225-237, 2000)。因此等理由之故，雖然Αρρ檢驗經認 為可以到某種程度地作為在慢性肝病患者中篩選出HCCs患者之必需步 驟，不過以AFP水平為基礎的肝癌診斷需要許多考慮事項。因此，有需要 發展出一種新的血清學檢驗，其比傳統AFP檢驗具有遠較為高的敏感度和 特異性。 有關一部分此種研究，最近發現依照AFP二醇系列構造(giycol_series structures)的多樣亞型而定，外源凝集素-反應性部分(lectin_reactive fracti〇ns) 會有所不同。根據AFP-L3部分為對肝癌較具特異性的亞型之發現，有一份 報告述及可以經由測定AFP-L3部分作出比習用的App檢驗對肝癌更具特 異性之診斷檢驗(Okuno M et al·，』G如咖她ra/./^7偷/. 16(12):1329_1335, 2001)。不過，由於與臨床診斷相關的數項限制，此種嘗試不能得到作為有 用的肝癌疹斷工具之效效用性。 1290226 另一種可能的診斷檢驗為超聲波篩選，其可用簡單，安全的方式實施。不 過，此種方法具有不良的預測能力，轉而不能偵檢直徑小於丨厘米的微小 病變。而且，由於此種技術有賴於檢驗員的技術或經驗，因此在診斷正確 性上可能導致根據檢驗員所致頗為不同的結果，可推測出其缺乏客觀性 (objectivity)。再者，頗難以將超聲波應用於患有嚴重肝硬化徵候且具有高 度肝癌危險性的患者，使其實質地不能準確地鑑別出病變。 所以’為了達浙癌的早期賴財效_測，有高度需要發展出一種新 的’具有改良的敏感度和特異性之血清學檢驗。 綜上所述，為了發展出_種有效的肝癌早期診斷的檢驗方法，本案發 明人乃進行精心探討研究且鑑別出經由使用可特異地結合到從人類原致癌 基因HCCR-1表現出的蛋白質之抗體進行抗原_抗體結合反應可以有效地偏 檢出肝癌，人類原-致癌基因HCCm經寄存於知，登錄號碼 AF1956卜如韓國專利公報第2〇〇1_39556號中所述者。此項發現導致本案 發明人完成本發明。 【發明内容】 為了解决上述制題’本判的—項目的為提出—種使用人麵致癌基因 HCCR 1有效地在早期階段偵檢職之方法與—種使用彼診斷肝癌所用之 套組。 為了凡成上述本發崎目的，提出—種經由使用可特異地結合到從人類原-致癌基因HCCR_1表現㈣蛋白f之抗舰行抗原_抗體結合反應而測量一 樣品的活體内(in咖赋叫蛋自質表現水平以診斷肝癌之方法，與一種 1290226 使用彼診斷肝癌所用之套組。 【圖式簡單說明】 圖1圖解祝雜縣發賢從獅到ρΜΑ£·ρ；2χ/Ηα^_ι雜内的大腸桿 菌(Escherichia coli (Ε· coli)) BL21菌株離析和純化出之HCCR_i重組蛋白 實施免疫點潰的結果； 圖2圖解說明根據本發明制HCCR]重組蛋白作為抗原實施肌财以筛 選會產生HCCR-1早株抗體的融合瘤細胞系之結果； 圖3圖解說明根據本發明使用配❿丨單株抗體對Hcc組織實施免疫檢定 之結果，其中A和B顯示出者為HCC組織的免疫檢定結果，c顯示出肝炎 組織的免疫檢定結果，且D顯示出正常肝組織的免疫檢定結果；且 圖4a至4e圖解說明根據本發明以使用HCCR_i單株抗體的診斷套組偵檢 HCC和肝炎患者的血清，母體血清和正常血清中hccrj蛋白質的表現所 得肝癌診斷結果，其中圖4a顯示出得自HCC患者的血清之吸光度， 圖4b顯示出得自肝炎患者的血清之吸光度，圖4c顯示出母體血清的吸光 度’圖4c顯示出正常血清的吸光度，且圖4e顯示出根據從標準曲線截止值 對個別樣品的吸光度水平所做比較之結果。 【實施方式】 後文中，要參照所附圖式詳細說明本發明具體實例。 人類原-致癌基因HCCR-1 (GenBank Accession No· AF195651;韓國專利公 報第2001-39556號），其係位於第12號染色體(Chromosome No. 12 的長臂之中且具有開放編閱架構(0Penreading frame)，其再哺乳動物體内過 1290226 度表現(overexpressed)之時，具有成為致癌基因之作用，且從該基因會衍生 出具有約4〇kDa的大小之蛋白質(稱為HCCR]蛋白質）。 HCCR_1蛋白質特異性抗體較佳者係從經由在動物體内免疫化抗 原蛋白質所得抗血清純化出。更佳者，從經由在母雞體内免疫化 HCCR-1 蛋白貝所知血清或蛋純化出Ηα：ΙΜ抗原蛋白質特異性抗體。蛋 白質特異性抗體可為多株抗體或為單株抗體。 要合成可特鏡_ HCOM蛋白f之抗體，魏要取得hccim蛋白 質。HCCR-1蛋白質可以經由使記知的胺基酸序列予以合成或經由基因 工程法製造成為纽蛋自麵。例如，可以使肖包括下列轉的方法進行 製備：使用在the NIH program GenBank資料庫中所列的hccr]基因之 驗序列製備出可魏丨呈纽蛋白形式的蛋㈣之重組 蛋白的表現载體；經由將表現載體轉形到大腸桿菌_以得到要產生 HCCR 1重組蛋白所用的轉形體；及培養該轉形體以離析/純化出人類原_ 致癌基因HCCR-1重組蛋白。

於本發明-較佳具體實例中，係經由轉形到含有hccr心基因的 pMALp2X/HCCR_l紐之大腸桿_ blu產^具有、麵合到队端的麥芽 糖之重組蛋白，接著用恰當的酵素離析/純化以移轉麥芽糖之既CR_1蛋 白質以作為抗原蛋白質。為了鑑定出經如此產生的蛋白質為-種HCCIU 重、且蛋白乃用西方氏點潰分析(Western blot analysis)觀察具有分子量約％ kDa的HCCR-1重組蛋白之特異性谓檢。 使用從大鱗轉频騎且純化㈣纽蛋自作為抗原以筛 選與分析可以經由小鼠的免疫化與細胞融合產生單株抗體的融合瘤細胞 1290226 系。 發展出融合瘤細胞系所需的免疫化小鼠係經由將HCCR_1重組蛋白與一相 當量的Freimd，S完全佐劑充分混合直到混合物乳化為止再將其經由腹膜内 注射到小鼠體内，接著加強注射以增加小鼠的免疫原性而產生的。較佳者， 後續加強注射只用HCCR-1重組蛋白經由腹膜内途徑投到小鼠三次而不使 用佐劑。 收集透過注射HCCR-1重組蛋白抗原予以免疫化的小鼠血清且測量抗體滴 定度。 將形成抗體的小鼠之脾細胞與細胞融合的母細胞以1〇:丨的細胞數目比例 混合且接著在聚乙二醇内融合，然後添加培養基予以稀釋。然後，將融合 瘤細胞轉移到篩選培養基，且隨即予以培養。於清楚地觀察到融合瘤細胞 組的生長之時，將培養基更換成篩選培養基策進細胞的增生。可用的細胞 融合母細胞之例子包括SP2/0 Agl4細胞系，P3x653細胞系，和NS-1細 胞系。可以使用的培養基之例子包括PMI培養基，dmem培養基，imdm 培養基，和F12培養基。可用的篩選培養基之例子包括jjat培養基。 於在篩選培養基内生長的諸融合瘤細胞組中，以間接酵素聯結免疫吸著檢 定(mdifeet enzyme_linked immunosorbant assay) (ELISA)法只篩選出能夠與 HCCR-1蛋白質抗原特異地反應的融合瘤細胞組別。換言之，以eusa讀 取器測量吸光度以篩選會分泌出對經純化出的HCCR4蛋白質具有高度結 合性之抗體的融合瘤細胞系，經由限制性稀釋將融合瘤細胞稀釋以使篩選 出的細胞成為單株系，藉此建立由從一單一細胞增生出的細胞所構成的細 胞系。 1290226 對人類原姻基因HCCW蛋白質財類性之單株抗射峨用已建立 的細胞系透過下列諸步驟大量產生： 1) 將融合瘤細胞系經由腹膜内途徑注射到小氣體内； 2) 從小鼠的肥大腹部收集腹水液；及 3) 從腹水液騎㈣HCQM蛋自質具树異性之單株抗體蛋白質。 經由使用如此產生的HCOM特異性抗白㈣行抗原_抗體結合反應 以診斷癌症可以經由測定該蛋白質在取自一檢體的一樣品内之活體内表現 於以完成。表現水平可以用技藝中已知的技術予以舰，包括酵素聯結免籲 疫吸著檢定(ELISA>，放射免疫檢定(RIA)，夾層檢定，和在聚丙稀酿胺凝 膠上進行的西方氏點潰或免疫點潰（immun〇bl〇tting)分析。 於-較佳具體實例中，係透過下列諸步驟使用Ηα：ΙΜ蛋白質特異性抗體 進行ELISA技術： 1) 將-檢體和-對照組樣品放到一塗覆著Η(：αΜ特異性抗體的反應器内 以誘發抗原-抗體反應； 2) 使用繼發性抗體-標記拼合物(sec〇ndary antib〇dy撼d⑽_ 兄物質的顏色顯現受質溶液偵檢抗原―抗體反應產物；及 3) 比較檢體的偵檢結果與對照組的結果。 本發明也提出-蛋白質晶片，其可以經由將HCCW特異性抗體蛋白質固 定在-生物微晶片之上’促成彼與收集自一個體的活體内樣品之間的反應 而保漢該HCCR-1特異性抗體蛋白質的抗原。使用已知技術，例如eLisa、 生物微晶片或自動微陣列系統，可以分析大量的樣品。 另外，本發明提供一種用以診斷肝癌之套組，其包括可與HCCR4特異地 11 1290226 反應之抗體，藉此促成肝癌的早期診斷。 本發明診斷套組包括： 1) 一經塗覆著HCCR-1特異性抗體的反應器； 2) 含有一 HCCR-1標準抗原的陽性對照組與一含有於其體内注射入該抗 原的動物之抗血清的陰性對照組； 3) 龜發性抗體拼合物，其具有一經拼合的標記物質，該標記物質可以經 由與一受質反應而產生顏色； 4) 一顏色顯現性受質溶液，可與該標記物質反應以產生顏色； 5) —用於每一步驟中的洗滌溶液；與 6) 一酵素反應停止溶液。 該W斷套組可以經由抗原_抗體結合反應定量地或定性地分析抗體蛋白質的 抗原而診斷肝癌。該抗原_抗體結合反應可以用通常為技藝中已知的技術予 以偵檢，包括ELISA，RIA，夾層檢定，在聚丙烯醯胺凝膠上的西方氏點 /貝，與免疫點潰分析。例如，可以提供該診斷套組以供使用塗覆著重組單 株抗體蛋白質的96-洞微滴定板之ELISA所用。 了 乂用來在其上面塗覆抗體蛋白質的反應器之例子包括硝酸纖維素膜，聚 乙烯樹脂製造成的96_洞板，聚苯乙烯樹脂製造成的96_洞板，和載玻璃。 如上面所述者’根據本發明的抗體較佳者係從在一動物體内免疫化 抗原蛋白質所得抗血清純化出者。HCCRq蛋白質特異性抗體較佳者係對 母反應器以約1至1〇微克/lQ〇微升的比率塗覆。 在根據本發明的診斷套組中所含對照組包括陽性對照組和陰性對照組。陽 Μ十，展組為含有HCCR-1蛋白質標準抗原的混合物，且陰性對照組為沒有 12 1290226 感染到HCCR-1蛋白質抗原的動物血清。於本發明實施例中，係使用具有 多種蛋白質濃度：0毫微克/毫升（ng/ml) (A)，2〇毫微克/毫升(B)，4〇毫微 克/毫升(C)，80毫微克/毫升（D)，160毫微克/毫升(E)，320毫微克/毫升(F) 和640毫微克/毫升(G)之HCCR_1蛋白質標準抗原溶液。 有關繼發性抗體標記物質’較佳者為使用已知的可誘導顏色顯現的顏色顯 現劑，且可用於本發明中的標記物質之例子包括辣根過氧化酶（HRp)，鹼 性磷酸酶，膠體金，螢光素例如聚L_離胺酸_螢光素異硫氰酸酯(p〇ly L_lysine_fluorescein iS0thi0cyanate) (FITC)或若丹明办異硫氰酸酯 (rh〇damine-B_is〇thi〇Cyanate) (RITC)，和染料。於本發明中，係使用，例如， 山羊抗-兔子 IgG-HRP 拼合物(g0at anti_rabbit c〇njugate) (IgG HRp 拼合物）。 較佳者，所使用的顏色顯現受質係根據顏色顯現所包括的標記物質而變 異，且其可用的例子包括3,3，，5,5，_四甲基聯苯胺(3,3，，5,5，擔_邮^述叫 (TMB) ’ 2,2’-井基-雙（3_乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸） (2,2 ·&ζίηο-1^(3_6%^ηζ(Λΐώζο1ή^_6-3ΐι1ίόιήο acid) (ABTS)，與鄰申苯二胺 (0PD)。更佳者，顏色顯現受質係以溶解在一緩衝溶液(〇丨Μ 内的狀態提供。該顏色顯現受質例如TMB係經用為繼發性抗體拼合物的 標記物質之所分解HRP以產生一顏色顯現沉澱物。顏色顯現沉殿物的沉 澱水平係用肉眼觀察，藉此測定HCCR4蛋白質抗原之存在。 該洗滌溶液較佳地包括磷酸鹽緩衝液，Naa，和Tween 2〇，更佳者為含有 〇·〇2 Μ磷酸鹽緩衝液，〇·13 M NaC1，和〇 〇5% Tween 2〇之緩衝溶液。於抗 原-抗體結合反應，與抗原-抗體拼合物上的繼發性抗體反應之後，將一恰當 13 1290226 量的洗餘液供給到反應H内。用絲溶液進行的洗難經重複地實施3 到6次。較佳者係使用含G_1% BSA的磷酸鹽緩衡液作為阻斷溶液且較佳 者使用2N硫酸溶液作為酵素反應停止溶液。 至此要·制本發曝斷套組傭在_檢雌品内的抗原以在 早期階段麟肝狀松。將HOW單魏體分顺在雜和陰性對照 組内的檢雜品反應，抑絲溶液絲。紐，於所得録巾加入經用 可與受質反縫生顏色的標記物f標記著之繼發餘簡合物且再使用洗 務溶液洗蘇。織，於所得產物中加人含有受f的溶液以誘導顏色顯現。 然後’測量在4〇5奈米的吸光度。此處，標準抗原溶液A的平均吸光度係 大於或等於0·_到、於鱗於綱。標準抗縣液f的平均吸光度係大 於或等於1.200且小於或等於3._。標準抗原溶液A和f的吸光度之間的 平均值伽奴為-餘似祕後絲狀㈣為雜減或陰性檢 體。當檢_吸錢大於鮮抗絲液F的吸歧之時，_檢體稀釋且 再度測1其吸光度。具有高域止_吸光度之檢斷鑑定為陽性，而具 有低於截止值的吸光度之檢體即鑑定為陰性。 經確定者根據本個含有人__致絲因Ηα:]Μ特紐抗_肝癌診斷 套組，為-驗㈣者血相卿免鮮輯卫具，具有轉統聊檢 驗工具更高的準確度和再現性(reproducibility)。而且根據本發日月的診斷套 組能夠對即使是AFP陰性的檢體細綺癌畴在。細言之，根據本發 明的肝癌早__⑽輯學腦^檢義—約Μ⑽的診斷正確 性’此在統計有效性上高於傳統AFP檢驗。而且，即使對於卿陰性的 肝癌組織，也可得到約93.1%_著地較為高之偵檢率。再者，根據本發 14 1290226 明的HCCR_1診斷對於直徑不大於2厘米的小Hcc檢體也比傳統App診 斷顯示出約91.7%的相對較高之診斷績效。亦即，於使用根據本發明的 HCCR_1以免疫染著法染著正常肝組織，硬化組織和HCC組織之時，於正 常肝組織與肝硬化組織中沒有偵檢到會與HCCR4反應的抗原，而在只有 在HCC組織中才偵檢到會與HCCR-1反應的抗原，展現出深棕色的顯現。 所以，根據本發明的診斷方法與套組可以非常有利地用於肝癌的早期診斷 與小HCC的診斷，因為彼等相對於傳統App檢驗具有高準確度與再現性之 至此要藉由下面的實施例詳細闡明本發明，但是絕不將本發明範圍限制到 諸實施例中所述特定具體實例。 <實施例1>HCCR_1多株抗體之產生 <1-1> HCCR-1重組蛋白之產生 為了產生人類原-致癌基因HCCR-丨特異性抗體作為肝癌診斷所用的腫瘤標 記性物質，乃將部分人類原致癌基因（對胁GenBank &⑽i〇n n〇 AF195651 的驗序歹,jID.N〇s: 123_473，胺基酸4mDN〇s: 39i5置於 pET-32(+)載

位而製備出 HCCR-lpET-32b㈩脱⑴載體。將該載體轉形到大腸桿g el2i(atcc Accession Νο· 4趣)之内並用i碰異丙基叫硫代半乳糖基-吼喃料 (IPTG)(Sigma Chemical Co.所製)以誘導出表現，產生具有融合到其上的 2〇Kda硫氧化還原蛋白(thioredoxin)(Trix)標籤(tag)蛋白質之35现HCCR1 融合蛋白質，且使用 01/27149)將其純化出。

His-Hind套組(Novagen所製）（國際專利公報w〇 對純化出的重組蛋自進行免疫點潰，確定其中含有 15 1290226 大里的約35kDa之融合蛋白質(圖i)。使用經如此離析和純化出的船 重組蛋白作為抗顧於抗原_抗體結合反應巾以賴和分析可產生用於小鼠 免疫化的單株抗體之融合瘤細胞系。 <1·2>兔子之免疫化

使用七個月大的雄紐西蘭白兔作為產生實施例〇中所製備的HCH 重組蛋白特細罐· _物。將纽蛋自(篇微統升)和 F_d s完全佐.igma Chemical c〇)以等量混合且乳化。將各〇 %毫升 的礼液她肖_發地接種顺子胸朗八健。於_雜接種之後， 以-星期之間隔進行加強注射，免疫化所用抗原係使用加仙心不完全佐 劑(Sigma所製者)予以乳化且使用與原發性接種相同的方式於u個星期之 期間接種該乳液。 <1_3>蛋黃抗艘(IgY)之離析 以-星期之間隔從耳靜脈採集錢樣品並從樣品離析出血清且在用於各種 實驗測量之翁膝耽。血清中抗體特異性之評定顯示丨該抗體只與人 類原-致癌基因HCCR-1蛋白質特異地反應。 <實施例2>HCCR_1單株抗體之產生 <2-1>小鼠的免疫化 為了得到可以產生HCOM單株抗體的融合瘤細胞系所需的免疫化小鼠， 乃將實施例叫舛所製的HCCW重組蛋白，Freund，s完全佐劑⑶興 Chemical Co.所製)和F麵d，s不完全侧（Gibc〇所製)予以混合。將所得混 合物經由《岐_ 5_6錄紙的祕/e小鼠_，如麟該小鼠以 兩個星期f·她匕次。要細生之時，就在最後—次加強之 16 1290226 前，以ELISA法測量小鼠血清的抗體滴定價。只有具有大於陰性對照組別 5倍的抗體滴定度之小鼠材加強。於加強之三天後，進行細胞融合檢驗。 <2-2>細胞融合(融合瘤(hybridoma))檢驗 用為要融合的母細胞之小鼠血漿骨髓細胞瘤細胞(myeloma cells)係得自the American Type of Culture Collection (ATCC)，USA 的 SP_2 細胞系，且係在 融合檢驗的一星期前細胞展現出指數生長曲線之時才用於細胞融合。使該 細胞系置於含有10%胎牛血清的DMEM培養液内生長。 於最後一次免疫化三天之後，以活體組織檢查鉗從Balb/c小鼠切取出脾細 胞並將該脾細胞置於沒有血清的DMEM培養液内以製備脾細胞懸浮液。然 後，使所得溶液靜置於室溫下使結締組織沉著下來且隨後移除。將脾細胞 懸浮液以l，〇〇〇r.p.m·離心3分鐘，接著將脾細胞暴露於含有Tris 20.6克/ 升和NH4C1，8.3克/升的Tris_NH4Cl溶液以溶解紅血球細胞，接著用培養液 經由以1,000 rpm離心3分鐘於以洗滌3次，藉此將細胞數目到約1 X 1〇8 細胞/毫升。此外，從小鼠的眶靜脈叢採集1.5立方厘米的血液用為隨後實 驗中的陽性對照組。 將SP-2血漿骨髓細胞瘤細胞與脾細胞以1 : 1〇之比例混合，然後使用5〇% (w/v)聚乙二醇 1500 予以融合(Boerhinger Mannheim Co·，Germany)。為了 只篩選出融合瘤細胞，將細胞融合結果產生的細胞懸浮於包括15%胎牛血 清且含有50 μΜ次黃嘌呤(hypoxanthine)，0.4 μΜ胺基喋呤（aminopterin)和 16μΜ胸腺核苷溶液的HAT溶液之Waymouth培養液中，且分配於96-洞微 滴定板(Coming Co” USA所製）（100微升/洞）。將融合瘤細胞置於5% C02 保溫箱内在37°C胞核溼度條件下培養。 17 1290226 <2-3>產生單株抗艘的融合瘤細胞系之篩選 為了篩選融合瘤細胞，乃以間接酵素聯結免疫吸著檢定(ELISA)法篩選可與 HCCR-1蛋白質抗原特異地反應之細胞。換言之，係以ELISA讀取器測量 吸光度以篩選會產生可高度結合到經純化的HCCR-1蛋白質的抗體之融合 瘤細胞系，且經由限制性稀釋將融合瘤細胞稀釋以使篩選出的成為單株， 藉此建立由從一早細胞增生出的細胞所構成的細胞系。為了從實施例<2_2> 所製備的融合瘤細胞組中篩選出只與人類原-致癌基因HCCR_1重組蛋白抗 原特異地反應之融合瘤細胞，乃於細胞融合之後的第10天，只從具有增生 細胞的洞中取出培養液上澄液且針對從實施例^-^製備的大腸桿菌轉形 體所離析和純化出的HCCR-1重組蛋白抗原施以ELISA。 詳細說來，為了壓制非特異性免疫反應，乃對96-洞板(Falc〇n c〇·，USA)施 加1%脫之牛乳-PBS且使彼靜置於室溫下丨小時，再將培養好的Hcc細胞 (ATCC，USA)以2 X 1〇5細胞/洞的量加到每一洞内。於每一洞中加入別微 升的融合瘤細胞培養液上澄液之後，在4〇c下誘發進行抗原抗體結合反應2 小時，使用PBS溶液洗務三次，且與作為繼發性抗體，用含有2% (w卵sa 的PBS緩衝液稀釋1/1〇,000過之山羊抗兔子职⑼興c〇，脱所製)在* °C下反應(100微升/洞）1小時。 其後’將100微升經由將10毫升ai M碟酸鹽緩衝棒樣酸碑5 〇)，i毫克 3.3,，5.5，-四賈基聯苯胺(tmb) (Sigma c〇_，說所製)和2〇微升的娜過氧 化氫混合所得受質溶液加到每一洞内以誘發酵素反應。在室溫下維持該酵 素反應15分鐘，然後加入相同量的2 N破酸溶液以停止酵素反應。於· 不米下麟顏色顯絲度。單株抗體係經連續產生且制，個高度活化 18 1290226 的融口瘤細胞。於產SHCCRd蛋白質特異性抗體的融合瘤細胞中，只有 具有以ELISA測里時，比陰性對照組更大1〇倍的抗體滴定度之細胞才接受 進-步篩選’ _0_分析所篩選出的細胞所具特性。 之後’首絲騎產續HCCW纽蛋自抗料有高㈣雛結合活性 篩選出的細 的抗體之融合瘤細胞，且經由重複地實施相_程序數次對所 胞進-步騎，耻得财高齡HCCW纽蛋城紅與其特異 地反應之進-步篩選過的融合瘤細胞組。在使时髓細胞瘤細胞培養液作

為陰性對照組之時，_顯示比陰_驗更大5倍的抗_定度的洞 中所含細胞。__的細胞_卜25 (Coming Co·，USA)以進行增生 。於此程序中，實施抗體滴定度測量3次以 上以在維持實質_的抗體滴定度之下選義中所含細胞，且將某些所選 殖的、、田胞貝τ存在_13〇C下。此外，於產生抗體的融合瘤細胞中，透過三次選 殖只師選出於維持高抗體滴定度之下仍然積極地增生之融合瘤細胞並予 以坧養以增生，且於其後用於單株抗體的生產中。

圖2閣示出為了篩選根據本發明的產生HCCIM單株抗體之融合瘤細胞系 而使用HCCR-1重組蛋白作為抗原所實施的咖八之結果。 k殖係以限制稀縣冑㈣。要選殖的齡瘤細胞之數目經調整使得在a 毫升培養液中包括有230個融合瘤細胞。其後，於96-洞板的36洞((U毫 升/洞)中各分配入5個細胞。將殘留的培養液(1毫升）與4毫升培養液混 合，且於剩餘的36洞(〇」毫升/洞)中分別配入i個細胞。將最後繼的培 養液（1.4毫升)與相同量的培養液混合且於24洞中分別配入〇 $個細胞(〇 ι ▲同）於14天之後於選殖株充足地生長之時，再度從培養液上澄液 19 1290226 鑑定出所產生的抗體之存在。將6陽性殖株轉移到一 24-洞板並予以谇養， 且最後鑑定所產生的抗體之存在。然後，只將陽性殖株轉移到一 25_毫升讲 養瓶中且料培養進行大規模生產。將某些陽性殖株貯存到維持在 液氮桶内。 <2-4>單株抗體的大量生產 為了使用實施例<2-2>所建立的融合瘤細胞系產生大量的對抗HccRq蛋白 · 質之單株抗體，乃於將融合瘤細胞經腹膜内注射到Balb/c小鼠體内的大約 · 10天之前，將0.5毫升的pristine (Sigma Co” USA所製)經由腹膜内投到每鲁 一小鼠體内，藉此增強產生腹膜内腫瘤的機率。隨後，將約1 X 1〇7融合瘤 細胞經由腹膜内注射以誘導腹水液之產生，且於其後，從每一小鼠的腹部 肥大處採集腹水液。如此產生的腹水液包括以高濃度生長的融合瘤細胞。 因此，將採集到的腹水液以10,000r.p.m·離心使融合瘤細胞沉著下來，藉 而只回收上澄液。於用來純化抗體蛋白質之前，將該上澄液貯存在_7〇〇c。 為了從腹水液純化抗體，乃進行蛋白質-A/G瓊脂糖管柱層析術(Pierce c〇.， USA所製)與辛酸純化’藉此離析出免疫球蛋白(immun〇gi〇buiin)。最後產鲁 物，亦即，免疫球蛋白的濃度係經由使用Bio_Rad蛋白質微檢定套組(Bi〇_Rad Lab·，USA所製)以Bradford法予以測量。單株抗體免疫球蛋白的同型

(Isotypes)係利用一同型定型套組(Serotec Co.，England)使用血液吸著反應 (hemadsorbent reaction)予以測定。其結果，將單株抗體所離析出的同型鑑 定為IgG2b 〇 <實施例3>經由在HCCR-1單株抗體中經由免疫組織化學法染著以鑑定 HC 20 1290226 c組織 原-致癌基因HCCR-1的特異性，乃使 為了根據本發明確證單株抗體對人類 用該單株抗魏由免雜織化學轉縣蚊Hcc組織。 詳細言之，使職HCCR_1單株抗體以抗生物素蛋白_生物素·過氧化酶複合 物(avidin_bi〇tin-P觀idase c卿㈣（舰)法^ 常肝組織和HCC _。於操作處理過財賴要翁免疫_化學染著 的新鮮腫雜織’並將___置於液氮中快稍結，猶存於 下。 將從HCC患者切下的組織切成5微米厚度，於挪丙嗣中固定，且使其置 於0.5%過氧化氳/甲醇溶液内％分鐘以移除内源過氧化酶活性，接著用 TBS洗滌。此外，為了壓辦特異性免疫反應，將組織切片暴露於正常馬 血清(Vector Lab·，USA所製)3〇分鐘，並將作為第一抗體的稀釋單株抗體以 不同的濃度加到其中，隨後使其在代靜置24小時，接著用挪洗條。於 所得產物中加入生物素化馬抗-兔子IgG溶液(VectorLab.，USA所製)作為第 二抗體，在使其靜置約1小時。將所得產物再用TBS洗滌，並加入抗生物 素蛋白-生物素-過氧化酶複合物(Vector Lab·，USA所製)作為第三抗體，再使 其靜置40分鐘，接著充分地洗滌。將所得產物暴露於含有過氧化氳和 ΤΒΤ(3,3·二胺基聯苯胺·四鹽酸鹽)的受質溶液並以顯微鏡觀察顏色顯現。然 後’為了鑑疋可與HCC組織樣品内的抗體反應之細胞的發生率盘分布乃 用蘇木素(hematoxylin)免疫逆染著(counter-stained)組織切片且用光學顯' 鏡予以觀察。 其結果，經確定在HCC組織中含有比正常肝組織和HCC的原型之肝硬化 21 1290226 組織中遠較為大量的HCCR-丨蛋白質抗原(圖3)。 <實施例4>使用HCCR-1單株抗體進行的elisa 使用HCCR-1單株抗體按下述方式以eusa診斷肝癌。首先，用從融合瘤 細胞離析和純化所得HCCr]特異性抗體塗覆犯认板。第二步，用塗覆 在板洞上的抗體處理_檢體樣品並與之反應。第三步，傭在該檢體樣品 中的HCCR-1抗原_抗體結合之存在。 <4-1> HCCR-1單株抗禮塗覆 將HCCR-1蛋白質特異性單株抗體放置在％洞EUSA平底板中，用蓋子 蓋好且靜置於4°C下16至18小時使其塗覆。將經純化的單株抗體在〇·5 M 碳酸鹽緩衝液(pH 9·6)中稀制5微克/冑升之濃度且將1〇〇微升稀釋溶液 加到每-湖。作鱗敵者，係將沒減染蛋自f的正常小鼠 血π在石反酸鹽緩衝液中稀釋5〇〇_倍且分配到每一洞内（1〇〇微升/洞）。 然後’用洗滌緩衝液，亦即，含有〇 〇5% Tween 2〇的pBS⑽7 4成該板 的洞4次。其後’為了阻斷非特異性蛋白質結合部位，於每一洞中分配入 含有2% BSA阻斷溶液的PBS緩衝溶液&Η 7·4) (3〇〇微升/洞)且使其淨置 於37 C下2小時。接著’移除阻斷溶液並真空包裝以貯存於代下。 <4-2>於洞上所塗覆的抗艘舆檢艘樣品之間的反應 使用HCC和肝炎肝血清，非母體和母浙血清及正常肝血清作為檢體樣 。口°為了得雌止侧量賴的鮮鱗，乃經由將HCCR]重組蛋白以 刀別為G cfe微克/¾升(ng/ )，2G毫微克/毫升，4()毫微克/毫升，⑽毫微克 /¾升’ 16〇宅微克/毫升，32〇毫微克/毫升與_毫微克/毫升的不同濃度稀 釋而製備標準抗原浴液八、6'(]；'〇、£、卩和0。 22 1290226 將刀別為100的個別檢體樣品分配到實施例<4-1>所準備的有塗覆著 HCCR-1單株抗體的每_洞中並在抓下反應4小時，接著用洗務緩衝液 洗;條4 -人。此處’係·上面所製備的鮮抗原溶刻^陽㈣照組且使 用正常小鼠血清作為陰性對照組。 <4-3>抗原-抗體結合之偵檢 將100微升辣根過氧化酶標記山羊抗·兔子IgG繼發性抗體的1〇,〇〇〇_倍稀釋 液加到每―;时，並使該板靜置於3rc下卜j、時，接著用洗雜衝液洗務 4次。隨後，將1毫克作為受質的33，，5·5，_四甲基聯苯胺(TMB)(sigmaC〇·， USA所製)溶解在10毫升檸檬酸鹽緩衝液碑5 〇)巾且於其中加入：微升的 35%過乳化氫，藉而製備出一受質溶液。將·微升所製備的受質溶液分配 到每-納且在室溫沒有暴朗光之下反應15分鐘。其後，加人⑽微升2 ΝΗΘ〇4溶液以停止反應且測量4〇5奈米吸光度。 對每-檢體樣品，HCCR_1抗原的吸光度係經由將塗覆著正常小鼠血清作 為陽f生對照組與塗覆著pBS作為陰性對照組的洞之總吸光度從塗覆著單株 抗體洞所得吸光度鱗的餘數。以_的方式，制鮮溶㈣吸光度值。 將鮮抗原溶液A和F所具吸献之_平均值定為截止值以供後面用來

判疋檢體為陽性或陰性檢體。亦即，當一檢體的吸光度大於鮮抗原溶液F 的吸光度之時，將雜體稀釋且制量其吸光度。將具有高於截止值的吸 光度之檢體鑑疋為陽性，且將具有低於截止值的吸光度之檢體鑑定為。 此處&準抗原浴液A的平均吸光度必須大於或等於議G且小於或等於 0·2〇0。標準抗原溶液F的平均吸光度必須大於或等於i•且小於或等於 3.000。 23 1290226 截止值經從個HCCR_1鮮抗聽_備的鮮鱗败為ω微克/毫 升。根據此截止值，比較_檢體的吸光度值以欺鮮為陽性或陰性。 肝癌組，肝炎患者組，母體組和正常組的比較結果都顯示於圖如至扣之中。 <實施例5>使用HCCR-1單株抗體以ELISA確定HCC診斷效率 為了確定使用HCCR-1單株抗體的ELISA診斷套組和方法的肝癌診斷效 率，乃使用實施例4中所述HCCR-1特異性抗體進行ELISA測量及使用傳 統α -胎蛋白(AFP)檢驗進行測量以供比較。afp水平係使用市面上得自as Bio International，France 的 ELSA2_AFP 套組予以測量的。 為了根據診斷結果判定檢體為陽性或陰性，將AFP的截止值設定為2〇毫微 克/毫升且將HCCR-1的截止值定為1〇微克/毫升，此係得自標準曲線者。 於每一 HCC組、肝炎組和正常母體組中在AFP陽性與HCCR-1陽性之間 的反應性差異都與使用McNemar檢驗所得數據相比較。對於肝癌組與正常 組’ HCCR-1敏感度，特異性，偽陽性/陰性比例都是在95%信任區間測量 的。 將肝癌組根據2厘米的腫瘤尺寸分成兩組。將每一個別組之間的HCCR-1 陽性反應性差異與用Fishery精確試驗(Fisherfs exact test)所測數據相比 較。將每一組的AFP陽性反應性與HCCR-1陽性反應性之間的差異與 McNemar試驗所測數據相比較。於所有統計分析中使用SAS變異值6.12 且使用 0.05 之有效水平(significance level) (SAS/STAT Software: Changes and

Enhancements through Release 6· 12. Cary，NC: SAS Institute，1997) o <5-l> AFP舆HCCR-1套組對於HCC患者組的診斷正確性 表1顯示出HCCR-1與AFP套組對於由97個肝癌患者所構成的HCC組的 24 1290226 診斷正確性之比較結果。該等結果顯示出根據Η··〗的診斷正確性為 94.9% ’其明顯地較高於根據AFP所得結果，7〇 1% (chi—ΜΛ2=19 2，步卜 P<0扁卜McNemar試驗）。特別者’ 29個肝癌患者之中經频為娜陰 性的27個（93.1%)經正確地診斷為Ηα：ΙΜ陽性，而68個肝癌患者中的3 個患者(4.4%)經診斷為AFP陽性，亦即經診斷為HccRq陰性。亦即， 診斷係不正確者。 表1 AF^ - 陽性 陰性 合計 HCCR-1 陽性 65 27 92 (94.9%) 陰性 3 一 2 5 ___ 合計 68(70.1%) 29 197(ϊδ〇%) 4-25 AFP與HCCR-1套組對於正常母艘組的診斷正碟性 從表2明顯可知，於由72個女人所構成的正常母體組中，根據jjccn and AFP兩套組的反應性結果都是陽性者。亦即，72的正常母體女人全部都是 陽性，而只有11個母體女人(15·3%)為HCCR-1陽性，導致明顯的差異 (cliiJV[A2=61，dfH，ρ<〇·00(π，McNemar 試驗）。因此，可以說 AFP 肝 癌診斷對於正常母體組係實質地無意義者。不過，可以確定者根據HCCR-1 的診斷可顯著地減少診斷錯誤率。 表2 AFP 陽性 陰性 合計 25 1290226 HCCR-1 陽性 11 0 11(15.3%) 陰性 61 0 61 合計 72(100%) 0 72(100%) <5-3>AFP與HCCR-1套組對於肝炎患者組的診斷正確性 表3顯示出AFP與HCCR-1套組對於由72個肝炎患者組所得診斷結果。 52個肝炎患者中有2個(3.9%)經根據HCCR-1而錯誤地診斷尨叶疬弟、去， 而52個肝炎患者中有11個(21.2%)經根棱HCCR-1而錯誤地診斷麁吁滤棗 ±(chi—MA2=7.3636，dfH，P=〇.〇〇67，McNemar 試驗）。特別者，u 個經 錯誤地診斷為肝癌患者中有1〇個(90.9%)經診斷為陽性。亦即，HCCR-1診 斷比AFP診斷遠較為準確。 表3 AFP ------ 陽性 陰性 合計 HCCR-1 陽性 11 0 11(15.3%) —— 陰性 61 0 6Ϊ ·~— 合計 72(100%) 0 72(100%) ' <5_4>HCCR_1套組作為肝癌讀套組的利用性之肯定 如表4和5情示者，97個肝絲者和⑵個正常人接钱驗。本發明 HCCM套組得敏感度為94外且其特異性％篇，偽陽性和偽陰性分別為 ^和4.4%。而且，其整體診斷正確性為似，確定本發明配咖套組 非常可用為診斷工具。 26 1290226 表4

-------- 測量 —·~~~— ----— Value (%) —^ 〜....................................一 95%信任區間 敏感度 92/97=94.9 ^^^_ 90·5 〜99.3 特異性 ~~~~~~~_ 109/121=90.1 —^_ 84.8^95.4 偽陽性 S --- 12/104=11.5 ^^_ 5.4 〜17.6 偽陰性 —~~~--- 5/114=4.4 0.6 〜8.2 陽性預測水平 -------- 92/104=88.5 82.3 〜94.6 陰性預測水平 ~~~------- 109/114=95.6 91.8 〜99.4 正確性 -------- (92+109)/218=92.2 88.6 〜95.8 <5_5>依110^腫瘤尺寸的HCCR-1套組診斷正確性~ 〜-

表6顯示出對於85個具有不小於2厘米的腫瘤之肝癌患者與…固具有不 大於2厘米的軸之賴患麵實施的檢驗之賴正雜 〇 . 珂於具有不小 於2厘麵_尺寸之患者有約72.9%之AFP·增加率，㈣於且有不 大於__瘤尺寸之患者有約·之辦陽性增加率，可推測出^ 腫瘤尺爾蝴輯脚綱加# ^ hccri 21 為基底的為、、。果在所有腫叙寸上_示出超過·㈣性。不過， 27 1290226 HCCR-1和AFP兩種診斷套組在腫瘤尺寸上沒有顯示出明顯的差異。 於所有的腫瘤尺寸中，HCCR-1診斷套組顯示出比AFP套組明顯較高的陽 性反應性(Ρ=〇·〇25，ρ=〇·〇〇ι)。於不大於2厘米的腫瘤組織中，HCCR_1陽 性者比AFP陽性者較高41.7%。於不小於2厘米的腫瘤組織中，HCCR-1 陽性者比AFP陽性者較高22·4%。此意味著根據本發明的HCCR-1診斷套 組可以有利地用來診斷小尺寸的腫瘤。 表6 陽性反應性（％) 腫瘤尺寸§ AFP tlCCR-1 <2厘米 6/12=50.0 11/12=91.7* 22厘米 62/85=72.9 81/85=95.31 — §Ρ>0·05，依χ2檢定和Fisher，s精確試驗在ΑΡΡ與HCCR4之間根據腫瘤 尺寸的陽性反應性差異。 *Ρ=0·025，依McNemar試驗在AFP與HCCR-1之間根據不大於2厘米腫瘤 尺寸的陽性反應性差異。 28 1 Ρ=0·001，依McNemar試驗在AFP與HCCR-1之間根據不小於2厘米腫 瘤尺寸的陽性反應性差異。 工業應用性 如上文所述者，由於根據本發明的含有人類原_致癌基因HCCRq特異性抗 體的肝癌讀套組為使用患者血清的免疫診斷玉具，具有比傳統婚檢驗 工具較高的正雜和再離，因此其可有利地用於賴的早期診斷與小 HCC的診斷。

Claims (1)

1290226 5.根據申請專利範圍第1項之套組，其中該繼發性抗體拼合物的標記用物 質係選自辣根過氧化酶(HRP)鹼性磷酸酶，膠體金，螢光素，和染料所 構成的群組之中者。