TWI240000B - Monascus prupureus mutant and its use in preparing yellow pigment - Google Patents

Description

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五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明係提供一種紅麴菌之突變株，及其於製備黃色 素之用途。 、 、，、來紅麴菌屬已為中國及其它亞洲國家所廣泛用 於製k各種食品。美國專利第4,442,2〇9號及第5,45入⑽9號案 中均提出利用紅麴菌會產生紅、黃及橘色等三種色素之能 力，可用作天然色素之重要來源。由於紅麴色素中紅及黃 、例夕為1 . 1 ’且其色調均呈紅色，故目前主要用於紅 色素I生產’例如美國專利第5,429,943。紅麴菌屬用以製 備、’工肩男色素之相關前業尚包括：美國專利第5,〇13,564號 术係Ik由還原加工處理紅麴色素，日本專利第55〇88696號 及81053589號案則經由控制培養環境，例如阳值或培養 基，以達到製備紅麴黃色素之目的。

Blanc 等人於 1995 年（International joumai of Food Micr〇bi〇1〇gy; 27, (1"5)，2〇l-2l3)發現紅麴菌會產生一種真菌毒素，桔黴素 (dtrinin)，而使紅麴色素之安全性受到重視。日本專利第 7274978號案利用突變方法降低桔黴素之產生（低於lppm)， 惟所產生之色素以紅色素為主，需經後續加工處理方可獲 得黃色素。 紅黴菌屬雖已廣泛用於製造紅色素，然而迄今仍未發現 能產生高比例黃色素，且其產物含較低量之桔黴素之紅黴 菌株。 發明概要 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1240000 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（2 ) 本發明係提供一種紅麴菌㈣奶α5之突變株’命 名為紅麴菌Μ011，或其突變株，其可於無須加工處理之條 件下，以價格低廉之天然原料，以固體或液體方式培養， 直接生產黃色素，且其產品之桔黴素含量甚低。 本發明並提供利用本發明新穎突變株或其突變株製備黃 色素之方法。 本發明另提供利用本發明新穎突變株製得之黃色素組合 物，其含低量之桔黴素。 本發明之詳細說明 本發明提供一種紅麴菌之突變株，其係由紅麴菌（从⑽ 户rwpi/re⑽）CCRC 31499，亦即紫紅麴（滅删⑽⑽洲㈣ATCC 16360, CBS 283.34, IFO ΦΠ8, KFCC 11^2)突變衍生篩選而得，命名為之 紅麴菌M011。 紅麴菌CCRC 31499可獲自台灣，新竹之食品工業發展研究 所。本發明同時包含本發明紅麴菌M011之突變株，其可利 用習知相關突變技術，例如：化學或物理性突變劑之處理 (如：UV光、X_射線、r -射線），及化學物質（如：N_甲 基-Ν’ -硝基-N -亞硝基胍）製得其突變株。 本發明紅麴菌Μ011株已於89年9月18日寄存於食品工業 發展研究所，登錄編號為CCRC 930045。 根據本發明，利用紅麴菌Μ011或其突變株製備黃色素之 方法，可於固體或液體培養基中醱酵進行。 根據本發明，其中上述培養基中之碳源及氮源可為任意 之習知原料。其較佳為天然原料，其中碳源包括但不限定 一 5 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------—--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1240000

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（3) 為再來米粉、玉米澱粉、米澱粉、小麥澱粉、葡萄糖、麥 芽糖、蔗糖及甘油，或其組合；而氮源包括但不限定為大 •^知、男且蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、玉米浸潰液、 麩胺酸、氯化銨及硝酸鉀所，或其組合。 根據本發明製備方法之一較佳具體實施例，其中該培養 基之pH值係介於2至8。 根據本發明，其醱酵製備之黃色素產物中桔黴素之含量 低於lppm ’較佳小於03ppm，更佳為小於〇2ppm。 根據本發明，所製得之黃色素醱酵液可直接作為食品添 加劑。酵液中之黃色素可藉由各種習知技術予以純化， 例如：日本專利第07216248號所示之離子交換法，日本專 利第61281158號所教示以溶劑及pH值控制法，以及日本專 利第54〇33535、530698δ7及52〇34985號案中所利用之乙醇純化 法。此外，如欲由菌體中萃取黃色素亦可依習知技術得 之’例如曰本專利第03254686號案教示之方法。根據本發 明所製備之黃色素醱酵液可進一步純化後，可作為添加 劑，例如添加於如食品、化妝品及醫藥品中。 下述實施例僅係用於例示本發明，而非用以限定本發 明。 實例1 : 一般分析方法 ⑴黃色素與紅色素之分析 係將菌株醱酵液作適當稀釋後，利用分光光度計分別測 f其ODz^o及OD5⑻之吸光值，再計算此二值之比例，比值越 而則代表黃色素之比例越高。 一 6 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .—--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1240000 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（4) ⑵桔黴素含量分析 係將菌株醱酵液以HPLC予以測定。其步騾包括先將7毫 升醱酵液之pH值調整至3.5，待反應1小時後，再加入3毫 升乙酸乙酿’ 30分鐘後收集該乙酸乙酯層，並重覆此添加 乙酸乙酯及收集之步騾兩次。將此收集液乾燥。 以1亳升之甲醇溶解此乾燥之收集樣品後，將此甲醇溶 液以0.2微米孔徑之濾膜過濾後，取1〇微升進行HPLC分 析。其分析之條件如下： 管柱· pBondapak Cis ( 10 微米，Waters，來源地） 流速： 每分鐘1.0毫升 偵測儀· UV 债測儀（Waters photodiary assay 996，分析 波長225 - 345毫微米） 移動相（梯度）：0.8%磷酸：乙腈：2 丙醇為60 : 35 : 5至 25 ： 70 ： 5 進行時間： 20分鐘 滯留時間： 11分鐘 經測得之數值與桔黴素標準品（Sigma)比較後，計算其濃 度。 實例2 :本發明突變株之誘發及餘撰 取紅麴菌CCRC 31499接種於PDA (融合形馬鈴薯20%，葡萄 糖（Bacto Dextrose) 2% ’壤脂2%)斜面上，於3〇。〇下培養7天 後，以無菌水將孢子洗下。將每亳升含有1〇7以上孢子之收 集液，以UV光照射2分鐘，經連續稀釋後塗抹於pDA平板 上。經於3(TC下培養2至3天後，挑選菌落呈橘黃色者。並 -7 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1240000 A7 B7 五、發明說明（5) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將所挑選出之菌落，於培養基（其每升中含有再來米粉60 克’大旦务30克及MgS〇4 · 7H2〇 5克）上進行該所得突變株之 穩定性測試。 將穩定之突變株挑選出接種於PDA斜面上，於3(rc下培 養7天後，以無菌水將孢子洗下。將此孢子接種（5 X 1〇5個 孢子）於含有50毫升上述培養基之三角搖瓶中，於3yc、 150 rpm下震盪培養5至7天後收集其醱酵液，並測量此酸酵 液之OD4〇〇及OD5〇0值，選出比值較高者。最得分離選出一穩 定之突變株，命名為紅麴菌M011，測其醱酵液之〇〇4⑻及 OD500值分別為6.1及1.9。其於培養基中之特徵如下： CYA培養基（母公升中含有蔑糖3〇克，3克，ΚθΗΡ〇4 Μ克，MsS04』」5克，KC1 0.5奈，FAOz 0.01奈‘酵蚤萃甲物1 敲 培養7天後，菌落呈淺橘色，大小為25至26毫米，氣生 菌絲呈白色； 培養10天後’菌落呈淺橘黃色，大小為30至32毫米， 氣生菌絲呈白色； 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 分生孢子柄長短不一，分支亦不規則，並維持無色； 分生孢子呈梨形，單一或2個成串，大小為7-11(_16)χ 8 - I2 (-17)彳政米’主現$午多特大分生抱子，然於〇γΑ培 養基中僅發現分生孢子，而未發現子囊果。

MEA培養基（每公升含有麥芽萃取物％ ♦，臉1 士，萌萄 糖20克，瑄脂15 D 培養7天後，菌落呈鮮橘色，大小為21至22亳米； 本紙張尺度適財目國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) 1240000

五、發明說明（6 ) 培養10天後，菌落呈橘色，大小為29至30毫米； 分生孢子及子囊果呈無色；一些類似分生孢子呈紅褐 色球形，子嚢果大小為40至50微米；子囊孢子呈橢圓 形（5 X 6 - 7微米）。 Q_25N培卷某Γ Κ2ΗΡ04 0·75克，Czapek濃縮物7.5臺升，醏丹 J溶物或萃取物3.7克，甘油250克，續脂12克，永750鲁 升） 培養7天後，出現大白色菌落（macrogrowth); 培養10天後，菌落呈橘色，大小為12至14毫米。 有關本發明紅麴菌M011突變株與其母株CCRC 31499之比 較顯示於下表1。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表1 母株 CCRC 31499 突變株M011 分生孢子大小a 8- 12x10- 13 毫米 7- 11χ8_ 12 毫米 子囊果大小a 37 - 45毫米 40 - 50毫米 子囊孢子大小a 4-5x5 -6 毫米 5x6-7毫米 〇〇40〇b 2.35 35.48 〇D5〇〇b 1.88 5.85 〇D4〇〇/OD5〇〇b 1.25/1 6/1 桔黴素b 1.1 ppm 0.24 ppm 〇D400b 5.74 10 〇〇50〇b 8.15 0.78 於CYA培養基中培養。 —9 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1240000 A7 B7 五、發明說明（7) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) b於培養基（每升中含有再來米粉60克，麵胺酸30克， MgS04 · 7H20 5 克，KC1 0.5 克，KH2P〇4 1 克，ZnS〇4 · 7H20 10 毫克，MnS04 · H20 10 毫克，及 FeS04 · 7H20 10 毫克） 30t：、150rpm下震盪培養5天後之結果。 e於培養基（每升中含有再來米粉60克，麩胺酸30克，及 MgS04 · 7H20 4.8 克，pH 6.25 ) 3(TC、150rpm 下震盪培養 5 天後之結果。 复例3 :生產音色色素之碳源 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 根據實例2所述之方法，將紅麴菌M011突變株孢子，以 三重覆分別接種至以再來米粉、玉米澱粉、米澱粉、小麥 澱粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖或甘油作為碳源之培養基 (每升中含有碳源60克，麩胺酸30克，MgS04 · 7H20 5克， KC1 0.5 克，KH2P〇4 1 克，ZnS04 · 7H20 10 毫克，MnS〇4 · H20 10 亳克，及FeS04 · 7H20 10毫克）中，於30°C、150rpm下震盪培 養5天後收集其醱酵液，並測量此鏺酵液之OD4G()、OD5G0值 及桔黴素之含量。結果顯示於表2中，紅麴菌M011突變株 於不同天然碳源下，所產生之黃色素比例皆非常高，且桔 黴素之含量非常低。 表2 OD400 OD· OD400/OD500 在來未粉 9.475 3.068 3:1 玉米澱粉 5.123 0.778 6:1 一 1〇 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1240000 A7 ______B7 五、發明說明（8 ) 米澱粉 8.948 2.333 4:1 小麥澱粉 6.823 0.828 7:1 葡萄糖 2.74 0.232 12:1 甘油 0.557 0.092 6:1 麥芽糖 1.718 0.173 10:1 蔗糖 1.76 0.227 8:1 桔黴素含量均低於檢測值015 ppm 實例4 :生,ϋ色+色素之氣源 根據實例3所述之方法，以再來米粉作為碳源，以三重 覆實驗，分別測定以大豆粉、黃豆蛋白、消化蛋白、酵母 萃取物、玉米浸潰液、麩胺酸、氯化銨或硝酸鉀作為氮源 時，測定鏺酵液之〇D4GG、〇D5G()值及桔黴素之含量。表3所 示結果顯示紅麴菌M011突變株於不同氮源下，所產生之黃 色素比例皆非常高，且桔黴素之含量皆非常低。 表3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 OD400 OD500 OD400/OD500 桔黴素 大豆粉 3.49 0.9 4:1 0.178 黃豆蛋白 2.19 0.42 5:1 0 消化蛋白 2.62 0.47 5:1 0 酵母萃取物 2.8 0.55 5:1 0 玉米浸潰液 2.56 0.43 5:1 0 麩胺酸 3.5 0.62 6:1 0.209 氯化銨 0.859 0.215 4:1 0 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1240000 A7 _____B7 _ 五、發明說明（9 ) 硝酸 __ 1.96_038^__5^1__〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ” 0 ’’表含量低於0.15 ppm 實例5 ·_生屋黃色色素之pH值 根據實例3所述之方法，以每升中含有再來米粉60克， 麩胺酸3〇克，MgS04 · 7H20 4.8克及KC1 0·5克之培養基培養， 以三重覆實驗，分別測定於不同pH值之條件下，酸酵液之 OD4⑻及0〇5〇()值。表4所示結果顯示紅麴菌M011突變株不論 於性或驗性條件下，皆能產生南比例之黃色素。 表4 起始 pH (滅菌後） 0D·_OP50Q ΟΡ4〇〇/ΟΡ,πη 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 pH 2.73 3.38 0.76 4.5:1 pH 3.87 3.19 0.62 5:1 pH 5.01 10.69 1.62 6:1 pH 5.86 35.47 5.91 6:1 pH 6.25 35.13 6.02 6:1 pH 6.9 28.83 2.83 10:1 pH 7.45 18.93 2.74 7:1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1240顿 專利中請案 A8 B8 申請專利範圍 94 R 〇7/ -i- D8 糾b 修正 年月曰彳= 補4 舍告本 • 種紅麴菌（施咖⑽户—卿⑽）突變株，命名為紅麴菌 M〇11 ’其中紅麴菌Μ 0 1 1於89年9月18曰寄存於台灣新竹 之良口口工業發展研究所，寄存編號為CCRC 930045。 2 · 一種製備黃色素之方法，其係在適當之條件下培養根據 申請專利範圍第1項之突變株。 3 ·根據申清專利範圍第2項之方法，其係利用固體或液體 立古養基培養根據申請專利範圍第1項之突變株。 4 ·根據申請專利範圍第3項之方法，其中該培養基係利用 天然原料作為碳源及氮源。 5 ·根據申凊專利範圍第4項之方法，其中之碳源係選自再 來米粉、玉米澱粉、米澱粉、小麥澱粉、葡萄糖、麥芽 糖、蔑糖及甘油所組成之群，或其組合。 6 ·根據申凊專利範圍第4項之方法，其中之氮源係選自大 昱粉、黃豆蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、玉米浸潰 夜 魏胺敗、氯化铵及硝酸卸所組成之之群，或其組 合。 …、 7 .根據申凊專利範圍第2項之方法，其中該培養基之讲值 係介於3至9。 根據申叫專利範圍第2項之方法，其可進一步包括純化 更色素之步騾，以得純化之黃色素。 9· 種更色素組成物，其包含申請專利範圍第1項之突變 株所生產之醱酵液，其中桔黴素含量小於1〇ppm。 10·根據申請專利範圍第9項之黃色素組成物，其係利用申 請專利範圍第1項之突變株生產之醱酵液，再進一步純 1240000 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 化而製得。 之黃色素組成物，其中桔黴素 η·根據申請專利範圍第9項 含量小於0.3 ppm。 之黃色素組成物，其中桔黴素 12.根據申請專利範圍第9項 含量小於〇.2ppm。 之黃色素組合物，可作為添加 13·根據申請專利範圍第9項 劑。 14·根據申叫專利範圍第i 3項之黃色素組合物，可用作食 品、化妝品或醫藥品之添知劑。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）