TWI225518B

TWI225518B - Recombinant plasminogen activating protein, its nucleotide sequence and use

Info

Publication number: TWI225518B
Application number: TW087110021A
Authority: TW
Inventors: Everett Lee Rosey; Robert John Yancey Jr; James Andrew Leigh
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1997-06-23
Filing date: 1998-06-22
Publication date: 2004-12-21
Also published as: AR015393A1; HK1018479A1; CA2235471A1; CN1209455A; BR9802198A; CN1155708C; JP3577219B2; NZ330767A; EP0887410A3; AU7310098A; US6485904B1; JP2004073180A; JPH11103869A; AU741724B2; EP0887410A2; ZA985414B; CA2235471C; MX9805158A; CN1552856A

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（1 ) 1、發明範晴本發明之技術範疇在於動物健康，且針對疫苗組成物與疾病診斷劑。詳言之，本發明係關於拮抗哺乳動物乳房炎之疫苗、具有編碼血纖維蛋白溶酶原活化蛋白質之核苷酸序列的多核苷酸分子，其可用於製造該疫苗。 2 ·發明背景牛乳房炎造成乳牛之乳產量顯著減少，造成乳產業之嚴重經濟衝擊。乳房炎，可由一種或多種細菌病原造成。鏈球菌感染是鑑知造成約3 0 %之牛乳房炎臨床病例。尤其是乳房鏈球菌感染，其造成約2 0%之牛乳房炎臨床病例。預防及治療動物乳房炎的已知方法中，包括使用衛生榨乳技術及施用化學抗生素。但使用抗生素受限於下列事實，即含有抗生物殘留的乳品通常對人類消化視爲不安全，故必須丟棄。治療或預防動物乳房炎之特別硏究包括頒給Stoll氏等人之美國專利第5，198，214號，其說明多價抗乳房炎疫苗之用途，該疫苗含有由感染動物乳汁培養而得之減活乳房炎致病原。再者，頒給Sordillo氏等人之美國專利5，2 3 4，6 8 4揭示治療或預防牛乳房炎的方法，包括對動物施用牛r -干擾素。鏈球菌菌株感染泌乳乳腺之能力、取決於該細菌於分泌物中的生長能力及避免被牛嗜中性白血球吞噬之能力（ Leigh et al.，1990,Res.Vet.Sci.49:85-87)。牛乳中大多數的氮 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

-il·/ MmKm§M9 V. —V 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) /\4規桔（210X 297公漦） _4 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（2 ) 係呈現蛋白質形式（Aston，1 975，Austrol.J.Dairy Tech.30:55-5 9 )，無蛋白質水解時，乳中鏈球菌之生長受限於缺乏自由胺基酸。這點對依賴細胞外之乳淸水解蛋白酶而生長乳中的乳鏈球菌尤其重要（Mills and Thomas，1981，N.Zeal · J.Dairy Sci.Tech 1 5:43-55 )。此外，細菌在乳中生長的能力在乳淸水解酶，血纖維蛋白溶酶存在下受到促進，該酶將乳蛋白質分成自由胺基酸。牛乳含有血纖維蛋白溶酶原，其一般無蛋白質水解活性，但經血纖維蛋白溶酶原活化子作用，其可轉化爲具有蛋白質水解活性。引起乳房炎之鏈球菌菌株，例如乳房鏈球菌，業已證實其可生產將牛血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶的血纖維蛋白溶酶活化子。血纖維蛋白溶酶原活化子之活性造成乳蛋白質的崩解，進而釋出自由胺基酸，接著提供了乳腺內細菌的生長。由此觀察可知，先前已預期以免疫，爲主要反應的方法，例如生產中和抗體，藉以拮抗鏈球菌之血纖維蛋白溶酶活化子，此方法可用來保護動物抵抗乳房炎。國際專利公開案W〇9 3 / 1 4 2 0 9倂入本文作爲參考，其證實自乳房炎鏈球菌培養物之濾液中純化血纖維蛋白溶酶原活化子（該案中稱爲鏈激酶，Streptokinase )的方法’其更進一步教示根據這類鏈球菌之血纖維蛋白溶酶原活化子的抗乳房炎疫苗組成物。分離具有編碼血纖維蛋白溶酶原活化子（例如源自鏈球菌者）之核苷酸序列的多核苷酸分子，將十分有助於製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) /\4規格(210Χ 297ϋΤ~TrZ ——^ (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 1225518 五、發明説明@ ) 備抗乳房炎疫苗。 3 .發明簡要說明本發明提供經分離的多核苷酸分子，其包括一核脊酸序列，其編碼生物學上活化之血纖維蛋白溶酶原活化子蛋白質（本文稱爲、PauA蛋白質〃，先前技藝命名爲、、 P A 〃或、鏈激酶〃）。較佳實施體系中，P a u a蛋白質係由細菌分離，例如鏈球菌，該菌造成或促進多種哺乳動物之乳房炎。更佳之實施體系中，此鏈球菌菌株是乳房鏈球菌或乏乳鏈球菌（S.dusgalactiae)。於較佳實施體系中，本發明之經分離的多核苷酸分子含有一核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO : 2或 S E Q ID N〇：4約第2 6位胺基酸（lie )至約第 2 8 6位胺基酸（Pro )之相同胺基酸序列。非限定實施體系中，這類多核苷酸分子分別含有SEQ ID N〇： 1約第1 9 5位核苷酸至約第9 7 7位核苷酸的核苷酸分子，或者含有SEQ ID NO: 3第196位核苷酸至約第9 7 8位核苷酸之核苷酸序列。更佳實施體系中，本發明分離之多核苷酸分子含有一核苷酸序列，其編碼含有SEQ ID N〇：2或 SEQ ID N〇：4約第1位胺基酸（Met )至約第 2 8 6位胺基酸（pro )之胺基酸序列。非限定實施體系中，這類多核苷酸分子含有SEQ ID Ν〇·· 1約第 1 2 0位核苷酸至約第9 8 0位核苷酸之核苷酸序列’或本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公漦）-6 - (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印袋 1225518 五、發明説明0 ) 含有約S E Q ID N〇：3第1 2 1位核苷酸至約第 9 8 1位核苷酸之核苷酸序列。另一種非限定實施體系中，本發明之多核苷酸分子含有SEQ ID N〇：1之核苷酸序列，或S E Q ID N〇：3之核苷酸序列。本發明另提供一種多核苷酸分子，其實質上同質於編碼P a u A蛋白質之本發明多核苷酸分子。本發明又提供一種多核苷酸分子，其含有編碼一多肽之核苷酸序列，該多肽實質上同質於本發明多核苷酸分子所編碼之PauA蛋白質。本發明另提供一種多核苷酸分子，其係由編碼 P a uA蛋白質之肽片段或實質上同質於本發明多肽的核苷酸序列所組成。特別考量之非限定實施體系中，本發明提供一種多核苷酸分子，其係由編碼肽片段之核苷酸序列所組成，該肽片段由SEQ ID NO: 2或SEQ ID N〇：4之部份胺基酸序列所組成，其係選自約第 2 8位至約第2 8 6位，約第1 0 4位至約第2 8 6位，約第1 7 2位至約2 8 6位，約第2 8位至約第1 7 0位，約第1 0 4位至約第1 7 0位，約第1 0 4位至約第 2 0 8位，約第1 7 2位至約第2 0 8位，約第2 8位至約第1 0 3位，約第2 8位至約2 0 8位，及約第1 4 9 位至約第2 8 6位胺基酸。本發明另提供一種多核苷酸分子，其包含編碼融合蛋白質之核苷酸序列，該融合蛋白質包括融合在載劑或融合相伴物之本發明P a u A蛋白質，實質上同質的多肽及肽 (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） .7 - 1225518 A"' 一—— __________________ ____ nn 五、發明説明（5 ) 片段。本發明另提供一種寡核酸分子，其可用來作爲擴大技術中所用的引子及不同疾病診斷所用的診斷探針。非限定具體實例中，本發明之寡核苷酸分子係由選自s E Q ID N 0 : 1 3 - 2 7及其互補序列之核苷酸序列所組成。另一種非限定實施體系中，本發明之寡核苷酸分子包括選自SEQ ID NO: 13 — 27及其互補序列之核苷酸序列。本發明另提供用於重組表現本發明多核苷酸分子之組成物與方法，包括含有該多核苷酸分子之重組選殖載體與重組表現載體，及被該載體轉形之宿主細胞株。本發明另提供一種由本發明多核苷酸分子編碼而重組表現之P a uA蛋白質，其實質上同質之多肽、肽片段或融合蛋白質。本發明另提供本發明P a u A蛋白質之同系物及衍生物，其實質上同質之多肽、肽片段或融合蛋白質。經濟部中央標準局員工消費合作社印製本發明另提供保護多種哺乳動物拮抗乳房炎的疫苗，其含有免疫有效量之本發明P a u A蛋白質、其實質上同質之多肽、肽片段、融合蛋白質、同系物、衍生物或多核苷酸分子，上述物質能夠誘生哺乳動物體內拮抗乳房炎之保護性反應，以及含有獸醫學上可接受之載劑。該疫苗，可選擇地含有佐劑或其它免疫調節組份。非限定實施體系中，本發明疫苗是一種組合疫苗，其用於保護多種哺乳動物拮抗乳房炎，且選擇地拮抗侵害哺本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X291公鰲）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（6 ) 乳動物之一種以上其它疾病或病況，該組合疫苗含有免疫有效第一組份，其包括能夠誘生哺乳動物體內保護反應之本發明P a uA蛋白質、其實質上同質之多肽、肽片段、融合蛋白質、同系物衍生物或多核苷酸分子；以及免疫有效量之第二組份，其包括能夠誘生保護反應拮抗侵害哺乳動物之疾病或病況的抗原；以及獸醫學上可接受之載劑。本發明另提供保護多種哺乳動物拮抗乳房炎之疫苗的製法’包括將本能夠誘生哺乳動物內拮抗乳房炎之保護反應的本發明P a uA蛋白質，其實質上同質之多肽、肽片葬又、㈣合蛋白質、冋系物、衍生物或多核脊酸分子，與獸醫學上可接受之載劑混合。本發明另提供一種免疫多種哺乳動物拮抗乳房炎之方法，包括對哺乳動物接種本發明之疫苗。本發明另提供抗體，其可特異地結合本發明之 P a uA蛋白質，其實質上同質之多肽、肽片段、融合蛋白質、同系物或衍生物。本發明另提供疫苗套組與診斷套組。 4 .圖式簡要說明圖1根據源自乳房炎鏈球菌c 2 1 6株之P a uA蛋白質的肽片段所設計的寡核苷酸探針（S E Q ID N〇： 13-25)。位於較低盒內的核替酸係與基因體DNA 序列不吻合者。圖2大腸桿菌DH 5 α菌株之分離物，該菌株被乳房

本紙張用中國國家標準（cnsT7\4規格（IgT (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印t 1225518 五、發明説明0 ) 鏈球菌9 5 - 1 4 0菌株之P a uA基因轉形，且其培養在額外含有牛血纖維蛋白溶酶原之含脫脂乳之瓊脂糖培養盤。淸徹區域是由血纖維蛋白溶酶原活化而變爲血纖維蛋白溶酶原，並接著分解乳蛋白質所致的結果。圖3PER318與PER319，其示出插入 He xA基因與He xB基因之間的經選殖P a uA嵌入子。圖4乳房炎鏈球菌c 2 1 6菌株之雙向終端子序列，其鄰接P a u A基因之開放譯讀架構（〇R F )，位於 SEQ ID N〇：l之第978至1088位核苷酸。P a u A 0 R F之終止密碼係劃底線者。圖5誘生前及誘生後之全細胞團塊溶解物樣品，其係於SDS - PAGE上分離並以苦馬率（Coomassie )亮藍染色。第1行二分子量標記（RAINBOW Kaleidoscope染色前標準物，BioRad Laboratories );第2行二誘生前之P z 326菌株（含有質體PER326，具有訊號序列）; 第3行二誘生后之P z 3 2 6菌株；第4行二誘生前P z 328菌株（含有質體PER328，無訊號序列）;第 5行二誘生后之P z 3 2 8 ;第6行二誘生前的P z 330菌株（含有質體PER330，具有訊號序列）；第7行二誘生後的Pz330;第8行二誘生前之Pz 332菌株（含有質體PER332，無訊號序列）；第 9行二誘生後的P z 3 3 2菌株；第1 〇行二自乳房鏈球菌9 5 — 1 4純化之P a uA蛋白質。讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. ^__U.T- 、-口本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公f ) . 1〇 - 1225518 五、發明説明衫) 圖6誘生前與誘生後之全細胞團塊溶解物樣品），其係於S D S - PAGE上分離並以西方轉漬法分析。各行樣品與圖5相同，例外處爲第1 〇行二乳房鏈球菌9 5 -1 4 0菌株之全細胞溶解物樣品。第一抗體是鼠單株抗體 EC - 3，第二抗體是共軛在BC I P上的山羊抗鼠抗體〇 •發明之詳細說明 [_· 1編碼血纖維蛋白溶酶原活化蛋白質之多核苷酸分子本發明提供一種經分離之多核苷酸分子，其含有編碼具生物活性之血纖維蛋白溶酶原活化蛋白質（命名爲、、 PauA蛋白質〃，先前命名爲、PA 〃或 ''鏈激酶（ streptokinase )〃）的核苷酸序列。本文所用 ''具生物活性 "乙詞表示將哺乳動物血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶之能力。本發明多核苷酸分子編碼之P a u A蛋白質可爲生產P a u A蛋白質之任何生物體衍生物的 P a u A蛋白質，但較好衍自造成或促成多種哺乳動物乳房炎之細菌。較佳實施體系中，此細菌爲鏈球菌屬者，更好是乳房炎鏈球菌或乏乳鏈球菌1且該P a u A蛋白質能將牛血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶。本文所用 ''多核苷酸分子〃、、、編碼序列〃、 > 多核苷酸序列〃、、、開放譯讀架構（0 R F ) 〃等詞表示單股或雙股D N A及R N A，當其置於適當調節元件控制下’ 可於適當宿主細胞表現系統中轉錄與轉譯（D N A )或轉讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· .—r- - - - —I〆 ^^ "口經濟部中央標準局員工消費合作社印製本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) ΑΦ規桔（210X297公f . 11 . 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（9 ) 譯（RNA)爲對應之PauA蛋白質、或與PauA蛋白質實質上同質的多肽、或上述P a u A蛋白質或其實上同質之多肽的肽片段、或其融合蛋白質或同系物。編碼序列之範圍通常由5 /(胺基）終端之起始密碼與3 —(羧基）終端之轉譯終止密碼決定。編碼序列可包括，但不限制在，原核序列、c D N A序列、基因體D N A序列、及化學合成之DNA與RNA序列。本文所用''ORF 〃乙詞表示編碼本發明P a u A蛋白質、其實質上同質之多肽、肽片段、融合蛋白質或同系物所需之最短核苷酸序列，其無任何序列中的終止密碼. 源自乳房鏈球菌c 2 1 6及9 5 - 1 40之天然 P a u A蛋白質的推衍胺基酸序列，分別示於S E Q ID N〇：2 及 SEQ ID N〇：4°SEQ ID NO :2及SEQ ID NO :4所示之推衍胺基酸序列的前2 5個胺基酸分別代表由個別P a u A基因所編碼之訊號序列，該訊號序列在細胞處理過程中被除去而產生分泌型（成熟）P a uA蛋白質。因此，較佳具體實例中，本發明之經分離多核苷酸分子包括編碼含有 SEQ ID N〇：2 或 SEQ ID N〇：4 中約第2 6位胺基酸（lie )至約第2 8 6位胺基酸（P r ο ) 之胺基酸序列的核苷酸序列。兩個不同的多核苷酸（D N A )分子之核苷酸編碼序列，即編碼乳房鏈球菌c 2 1 6菌株之P a u A蛋白質的序列及編碼乳房鍵球菌9 5 - 1 4 0囷株之P a u A的弟 (謂先閱讀背面之注意事項再填寫本頁裝·

IT 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4ML格（210X 297公# ) - 12 - 1225518 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（1〇 ) 二序列，分別表示爲SEQ ID N〇：1及SEQ ID N〇：3°SEQ ID N〇：l之核苷酸序列具有核苷酸120至980之〇RF。SEQ ID N〇：3之核苷酸序列具有核苷酸1 2 1至9 8 1之〇R F。將移除肽訊號序列納入考慮，在非限定具體實例中，本發明之多核苷酸分子包括SEQ ID NO : 1 ;中約第1 9 5位至約第9 7 7位核苷酸之核苷酸序列’ 或S E Q ID N〇·· 3中約第1 9 6位至約第9 7 8 位核苷酸之核苷酸序列。較佳實施體系中，本發明之多核苷酸分子包括編碼 SEQ ID N〇：2 或 SEQ ID N〇：4 中約第1位胺基酸（Met )至約第2 8 6位胺基酸（Pro )之胺基酸序列的核苷酸序列。另一個非限定實施體系中，本發明之多核苷酸分子包括SEQ ID N〇：l中約第 1 2 0位核苷酸至約第9 8 0位核苷酸之核苷酸序列，或 S E Q ID N〇：3中約第1 2 1位核苷酸至約第 9 8 1位核苷酸的核苷酸序列。另一非限定實施體系中，本發明之多核苷酸分子包括SEQ id NO:1之核苷酸序列，或S E Q ID N 0 : 3之核苷酸序列。本發明之多核苷酸分子更可包括本文所示S E Q ID N〇：l或SEQ ID N〇：3中臨接〇RF 的核苷酸序列。本發明另提供經分離之多核苷酸分子，其實質上同質於編碼P a u A蛋白質之本發明多核苷酸分子。本文用來請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 -裝· -5Θ # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公楚） -13- =25518 五、發明説明（11 ) 表示多核苷酸分子之、、實質上同質〃乙詞，表示包括下列核苷酸序列之多核苷酸分子：（a )編碼相同P a u A蛋白質者，其爲包括SEQ ID NO :1中第195位核苷酸至第977位核苷酸。或SEQ ID NO: 3 中第1 9 6位核苷酸至第9 7 8位核苷酸之核苷酸序列的多核苷酸分子，且此實質上同質之多核苷酸分子包括一個或多個對上述核苷酸序列不顯著的改變，此改變係由於遺傳密碼之簡倂性所致；及/或（b )其至少約7 0 %，較好至少約8 0 %，且最好至少約9 0 %與S E Q ID N〇：1中第1 9 5位核苷酸至第9 7 7位核苷酸之核苷酸序列相同，或與SEQ ID NO: 3中第196位核苷酸至第9 7 8位核苷酸之核苷酸序列相同，且其可用於實施本發明；及/或（c )在中度嚴格條件下’與 DNA分子雜交者，該DNA分子包括SEQ ID N〇：1中第195位核苷酸至第977位核苷酸，或 SEQ ID N〇：3中第196位核苷酸至第978 位核苷酸之核苷酸序列的互補核苷酸序列，該雜交條件爲，鍵結在濾紙上的D N A係於0 · 5 Μ N a Η Ρ〇4，7 %十二烷基硫酸鈉（SDS) ，ImM EDTA，於 65°C進行雜交反應，於0 · 2XSSC/0 · 1% S D S 中以 4 2 °C 洗滌（參見 Ausubel，et al_(eds_)，1989， Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1，Green Publishing Associates , I nc.,and John Wiley & Sοns, I nc. ，New York,at p.2.10.3)，且其可用於實施本發明。較佳本纸張尺度適用中國國家標準（CNS )六4规格（2】〇X297公潴）-14- (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 .裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（12 ) 實施體系中，此實質上同質的多核苷酸分子在高度嚴格之條件下與一 DNA分子雜交，該DNA分子包括S EQ ID NO : 1中第195位核苷酸至第977位核苷酸，或SEQ ID NO:3中第196位核苷酸至第 9 7 8位核苷酸之核苷酸序列的互補核苷酸序列，該雜交條件爲，鍵結在濾總上的D N A係於0 . 5 Μ NaHP〇4，7%SDS ，ImM EDTA，以 65°C 進行雜交反應，並以0 . lxSSC/0 . 1%SDS於 6 8 °C洗滌（參見Ausubel等人，1989)，且其可用於實施本發明。經濟部中央標準局員工消費合作社印製本文所用表示多核苷酸分子 > 可用於實施本發明〃乙詞表示，該多核苷酸分子是：（a )編碼可將哺乳動物血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶之生物活性多肽者 ;或（b )編碼能夠在接種多種哺乳動物時，誘生保護反應以拮抗乳房炎之免疫生成性多肽者；或（c )編碼能夠在施加至多種動物時，誘導生產P a u A蛋白質之特異抗體的多肽；或（d )可用來作爲診斷試劑以測定乳房炎病原（例如乳房鏈球菌）所造成的哺乳動物感染症，其係藉由測定感染動物體取得之組織或液體檢品中對病原特異的多核苷酸分子。本發明另提供多核苷酸分子，其包括編碼多肽之核苷酸序列’該多肽實質上同質於本發明多核苷酸分子編碼之 P a u A蛋白質。本文用於表示多肽之、、實質上同質〃乙詞，表示包括本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（13 ) 下列胺基酸序列之多肽：（a )其至少約5 0 %，較好至少約7 0 %，且最好約8 0 %之胺基酸序列與p a u A蛋白質相同，PauA蛋白質含有SEQ ID NO: 2 或SEQ ID NO :4中第26位胺基酸至第286 位胺基酸之胺基酸序列，且其可用於實施本發明；及/或 (b)其與含有SEQ ID N〇：2或SEQ ID N〇：4中約第2 6位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列的P a u A蛋白質相同，但其序列中，一個或多個胺基酸殘基保留地被不同胺基酸殘基取代，且其可用於實施本發明；及/或（c)其與含有SEQ ID N 0 :2或SEQ ID NO:4中約第26位至約第 2 8 6位胺基酸之胺基酸序列的p a u a蛋白質相同，但其序列中，一個或多個胺基酸殘基非保留地被不同胺基酸殘基取代，這類非保留式取代形成了可用於實施本發明之多肽。保留式胺基酸取代法乃該技藝中已知的。例如，本發明之天然P a u A蛋白質中，一個或多個胺基酸可被具有類似電荷、大小或極性的胺基酸殘基予以保留式取代，所生成的多肽仍可用於實施本發明。製造這類取代的規則如 Dayhof,M.D.,1978,Nat.Biomed.Res.Found.,Washington D.C.，Vol. 5 .Sup 3記載者。詳言之，保留式胺基酸取代法通常發生在側鏈有關連之一族胺基酸。遺傳工程編碼之胺基酸通常分成四類；（1 )酸性二天門冬胺酸、麩胺酸； (2 )鹼性二離胺酸、精胺酸、組織胺酸；（c )非極性 (讀先閱讀背面之注意事項再镇寫本頁 -裝· -" 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _ 16 - 1225518 五、發明説明（14 ) 二丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯胺基丙酸、甲硫胺酸、色胺酸；及（4 )不帶電、極性二甘胺酸、天門冬醯胺、麩胺酸醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、息寧胺酸、酪胺酸。任何特別基團之一個或多個的替換，例如以異白胺酸或纈胺酸酸替代白胺酸，或以麩胺酸代替天門冬胺酸，或以絲胺酸替代息寧胺酸，或以結構上相關之胺基酸代替任何基它胺基酸殘基，所生成的多肽在功能上通常無明顯影響。 :第6、7節中表1之簡要整理，比較乳房鏈球菌c 216 株（SEQ ID N〇：2)及 95 — 140 株 (S E Q ID N〇：4 )推知之胺基酸序列，可得數種特別的非保留式胺基酸取代之範例。例如，乳房鏈球菌 c 2 1 6株之P a u A的第7 3位胺基酸是天門冬胺酸（酸性），而乳房鏈球菌9 5 - 1 4 0株卻是天門冬醯胺（中性、極性）。此外，乳房鏈球菌c 2 1 6株之 P a u A的第1 1 5位與第1 2 4位胺基酸是麩胺酸醯胺 (中性、極性），而乳房鏈球菌9 5 - 1 4 0株卻是精胺酸（鹼性）。再者，乳房鏈球菌c 2 1 6株之P a u A的第2 1 1位胺基酸是白胺酸（非極性）’但乳房鏈球菌 9 5 - 1 4 0株是精胺酸（鹼性）。乳房鏈球菌c 2 1 6 株之P a u A的第2 4 0位胺基酸是麩胺酸醯胺（中性、極性）、但乳房鏈球菌9 5 - 1 4 0株是脯胺酸（非極性 )。乳房鏈球菌〇2 16株之？31^厶的第2 4 2位胺基酸是組織胺酸（鹼性），但乳房鏈球菌9 5 - 1 4 〇株疋本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公發）-17 - 請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁 :裝· 、\呑經濟部中央標率局員工消費合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（15 ) 天門冬胺酸（酸性）。本發明用於表示多肽、、可用於實施本發明〃，表示該多肽是：（a )具生物活性，即能夠將哺乳動物血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶原；（b )具免疫生成性 ’即施用於多種哺乳動物時，能夠誘生拮抗乳房炎之保護性反應；（c )施用於多種哺乳動物時，能夠誘使抗一 P a u A蛋白質之特異抗體的生產，該抗體可用來作爲診斷試劑；或（d )可用來作爲診斷試劑，藉以測定血液或血淸樣品中有無抗- P a uA蛋白質之特異抗體，作爲造成乳房炎之病原（例如乳房鏈球菌）感染之結果，或作爲本發明疫苗接種後之結果。本發明另提供一種多核脊酸分子，其由編碼P a u A 蛋白質之肽片段或本發明實質上同質之多肽的核苷酸序列組成。本發明所用〜肽片段〃乙詞表示由P a u A蛋白質或本發明實質上同質之多肽之胺基酸序列的亞序列組成，該亞序列的長度比全長之P a u A蛋白質或實質上同質之多肽短，可用於實施本發明，其用途如上述界定多肽者。因此，當全長之P a u A蛋白質或實質上同質之多肽以具有η 〃個胺基酸殘基表示時，則肽片段是比全長之 P a u Α蛋白質或實質上同質之多肽還小的任何多肽，包括具有η - 1個胺基酸殘基的多肽，且該肽片段可用於實施本發明。本發明肽片段之長度較好至少具有約7至1 〇個胺基酸。較佳具體實例中，肽片段包括代表p a u Α蛋白質之抗原決定位的胺基酸序列。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0X297公i ) . - (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明Ο6 ) 特定但非限定性之具體實例中’本發明提供編碼肽片段之核苷酸序列所組成的多核苷酸分子’該肽片段由 SEQ ID N〇：2_SEQ ID Ν〇··4 之胺基酸亞序列組成，其係選自約第2 8位至約第2 8 6位胺基酸，約第1 0 4位至約第2 8 6位胺基酸，約第1 7 2 位至約第2 8 6位胺基酸，約第2 8位至約第1 7 0位胺基酸，約第1 0 4位至約第1 7 0位胺基酸，約第1 〇 4 位至約第2 0 8位胺基酸，約第1 7 2位至約第2 0 8位胺基酸，約第2 8位至約第1 0 3位胺基酸，約第2 8位至約第2 0 8位胺基酸，及約第1 4 9位至約第2 8 6位胺基酸。當編碼後的肽片段含有P a u Α蛋白質或其實質上同質之多肽的不止一個亞序列時，編碼該肽片段之多核苷酸分子可修飾爲，數個亞序列可合倂在一起而在肽片段內爲彼此接連，而此亞序列原先在天然P a u A蛋白質或其實質上同質之多肽中是不連續的。與全長P a u A蛋白質或本發明實質上同質的多肽比較，具有刪除一個或多個內部胺基酸殘基之多肽視爲肽片段，且涵括在本發明範圍內。編碼本發明肽片段之多核苷酸分子可予修飾爲，其所編碼之肽片段的亞序列與天然蛋白質或實質上同質的多肽比較，各亞序列間的排列有不同之相關順序。較佳實施體系中，此多核苷酸分子編碼P a u A蛋白質或本發明實質上同質的多肽之一個或多個亞序列，該亞序列代表P a u A蛋白質或實質上同質之多肽的一個或多個抗原決定位區域， (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁裝· 1T- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（21〇Χ 297公f ) - 19 · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（17 ) 此區域可誘使多種哺乳動物產生拮抗彼之中和抗體。本發明亦涵括編碼全長（n ) P a uA蛋白質或其實質上同質之多肽的多核苷酸分子，胺基酸序列之亞序列彼此相對重新排列。本發明另提供一種多核苷酸分子，其含有一核苷酸序列’其編碼融合至多肽載體或融合成員之P a u A蛋白質、實質上同質之多肽、或本發明肽片段，藉以形成融合蛋白質。本發明多核苷酸分子編碼之融合蛋白質的非限定實例’包括Θ -半乳糖酶融合體、t rpE融合體、麥芽糖結合蛋白質融合體、榖恍甘肽一 S -轉移酶（GST)融合體、與多組織胺酸融合體（載體區域）。特別之非限定實例中，本發明提供編碼融合在本發明肽片段之G S T融合體的多核苷酸分子，該肽片段由SEQ ID N 0 ： 2或S E Q ID N 0 ·· 4之胺基酸亞序列組成，其選自約第2 8位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸，約第1 0 4 位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸，約第1 7 2位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸，約第2 8位胺基酸至約第1 7 0位胺基酸，約第1 0 4位胺基酸至約第1 7 0位胺基酸，約第1 0 4位胺基酸至約第2 0 8位胺基酸，約第1 7 2位胺基酸至約第2 0 8位胺基酸，約第2 8位胺基酸至約第 1 0 3位胺基酸，約第2 8位胺基酸至約第2 0 8位胺基酸，及約第1 4 9位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸。該技藝之已知方法可用於構築多核苷酸分子，其具有編碼上述融合蛋白質與其他融合蛋白質之核苷酸序列。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -20 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- -訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（18 ) 下文中，除非特別指明，、、p a u A多肽〃包括本發明之上述P a u A蛋白質、實質上同質之多狀、肽片段與融合蛋白質。本發明另提供寡核苷酸分子，其與本發明之上述任一多核每酸分子雜父’或與具有上述任一'本發明多核脊酸分子之互補核苷酸序列的多核苷酸分子雜交。這類寡核苷酸分子之長度較好至少約1 〇至1 5個核苷酸，但可延伸長度爲SEQ ID N〇：l或SEQ ID N〇：3 的任何亞序列，且可在中度或極嚴苛條件下與一個或多個上述多核苷酸分子雜交。以較短之寡核苷酸分子爲例，極嚴苛條件之範例包括，對約1 4個鹼基的寡核苷酸於約 3 7 °C，對約2 0個鹼基的寡核苷酸於約5 5 t：，且對約 2 3個鹼基的寡核苷酸於約6 0°〇的6又3 3(：/0.5 %焦磷酸納中洗滌。以較長之寡核苷酸分子爲例（約大於 1 0 0個核苷酸），中度與極嚴苛條件之範例如實質上同質之多肽分子所記載者。雜交條件可根據使用的特定寡核苷酸分子予以適當校正，此係技藝已知的。較佳具體實例，本發明寡核苷酸分子在極嚴格的條件下，與 SEQ id N〇：l 或 SEQ ID N Ο ： 3之核苷酸序列所組成的多核苷酸分子雜交，或與s E Q ID NO :i或SEQ ID NO :3之互補核苷酸序列所組成的多核苷酸分子雜交。非限定具體實例中，本發明之寡核苷酸分子係由選自 SEQ ID NOS : 13 — 27及其互補序列的核苷本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規掊（210X 297公漦）-21 - 讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :裝· 、-口經濟部中央標率局員工消f合作社印裝 1225518 五、發明説明（19 ) 酸序列組成。另一個非限定較佳具體實例中，本發明寡核苷酸包括選自SEQ ID NOS:13—27及其互補序列的核苷酸序列。本發明之寡核苷酸分子可用於多種目的，包括作爲編碼P a u A蛋白質之多核苷酸分子之擴大反應的引子，例如用以鑑別疾病之診斷法，或用於編碼或作爲基因調節所用的反意義（antisense)分子。放大反應可用於偵測得自感染動物之組織或液體樣品（例如哺乳動物之乳汁）中編碼 P a u A蛋白質之多核苷酸分子的存在情形。特定擴大產物的產生，表示有細菌感染，而無擴大產物，表示沒有感染。進行擴大反應，係使用標準技術，例如聚合酶鏈鎖反應（PCR)，適當設計之寡核苷酸分子，雖然該技藝已知的其他擴大技術，例如接合酶鏈鎖反應，也可使用。以 P C R爲例，根據標準步驟製備與處理含有經適當設計之引子、包括將予以擴大之核苷酸序列的模板、適當P C R 酶與緩衝液的混合液，藉以擴大模板中之特定P a u A有關多核苷酸序列。本發明多核苷酸分子與寡核苷酸分子的生產與修飾在該技術領域已知範圍內，可根據下列文獻描述的重組技術完成，包括〔原p 1 2 ..............a〕，這些文獻皆倂入本發明作爲參考。進行P C R的方法記載於〔原p 1 2… -一-b〕等等，其皆倂入本發明作爲參考。 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝· 、-口本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公# ) - 22 - 1225518 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

A 五、發明説明（20 ) 5 · 2重組表現系統 5.2.1表現載體本發明fe供包含本發明多核脊酸分子的重組選殖載體與重組表現載體。表現載體較好構築成，多核苷酸分子的編碼序列（命名爲、P a u A編碼序列〃）係操作性連接著一個或多個調節元件，此元件乃生產多肽時轉錄與轉譯 P a u A編碼序列必須的。〜調節元件〃乙詞包括但不限定在下列核苷酸序列：此核苷酸序列編碼提供引導及/或調節多核苷酸編碼序列表現反應的啓動子、促進子、調節子及該技藝已知之其他元件。本文所用P a u A編碼序列係、操作性連接〃一個或多個調節元件，如斯調節元件可有效調節並完成 P a u A編碼序列的轉錄或其m R N A的轉譯，或兩者。有多種表現載體是已知的且可用於表現P a u A編碼序列，此載體較好含有主導P a u A編碼序列複製、轉錄、與轉譯的必要調節元件。表現載體包括含有P a u A編碼序列之重組噬菌體D N A、質體D N A及粘接質體 D N A表現載體，其係用於轉形細菌或酵母菌；含有 P a u A編碼序列之重組病毒表現載體，例如竿狀病毒（ baculovirus )，起係用於轉感昆蟲細胞；以及含有 P a u A編碼序列之重組病毒表現載體’例如腺病毒或牛痘病毒，其係用於轉感動物細胞。可構築成含有本發明P a u A編碼序列的典型原核表現載體質體包括 PUC8、pUC9、PBR322、及 pBR329 (Biorad (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) :裝· r,T-、1 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297.公漦） -23 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（21 )

Laboratories,Richmond，申請專利範圍），以及 pPL 與 pKK223 (Pharmacia，Piscataway，NJ)等等。構築表現載體的方法係該技藝熟知的，該載體含有與適當調節元件操作性連接的特定編碼序列，且可用於實施本發明。這些方法包括試管內重組技術、合成技術、以及活體內基因重組法。參見上述Maniatis等人，1989; Ausubel 等人，1 989 ;以及Sumbrook等人所記載的技術。這些載體的調節元件在其強度與專一性上可有不同。根據所用的宿主/載體系統，可用任一適當的轉錄與轉譯元件。例如，當選殖哺乳動物細胞系統時，可使用自哺乳動物細胞之基因體分離的啓動子，例如鼠金屬硫肽啓動子，或由在這些細胞生長的病毒所分離的啓動子，例如牛痘病毒7.5K啓動子或Moloney鼠惡性肉瘤病毒長終端重複序列。也可使用重組DNA方法或合成方法製得的啓動子，藉以提供嵌入序列之轉錄作用。此外，由特定啓動子主導的表現作用可在特定誘發物存在下而升高，例如誘發金屬硫肽啓動子的鋅離子與鎘離子。轉錄調節區或啓動子的非限定實例包括，用於細菌的冷一 ga 1啓動子、T7啓動子、TAC啓動子、λ左與右啓動子、t r ρ啓動子與1 a c啓動子、t r ρ — 1 a c融合啓動子等；用於酵母菌的醣解酵素啓動子、例如ADH— I與ADH— I I啓動子、GPK啓動子、 P G I啓動子、T R P啓動子等；用於哺乳動物細胞的 S V 4 0早期與晚期啓動子、腺病毒主要晚期啓動子等等 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. -J_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公漦） -24- 1225518 五、發明説明（22 ) 〇特定的開啓訊號對嵌入P a u A編碼序列的充分轉譯作用也有需要。這些訊號通常包括A T G開始密碼及相鄰序列。當完整P a u A基因，包括其自身的開始密碼與相鄰序列，嵌入適當表現載體時，不需要額外的轉譯控制訊號。但是只有編碼序列的一部份嵌入時，就需要外來的轉譯控制訊號’包括A T G開始密碼。這些外來的轉譯控制密碼與開始密碼可由多種天然或合成來源獲得。再者，開始密碼必須與P a u A編碼序列的譯讀架構同向，如此才可確保轉譯整個嵌入物。融合蛋白質表現載體可用於表現融合蛋白質，此蛋白質包括融合在載劑或融合成員上的P a u A蛋白質、實質上同質之多肽，或肽片段。純化的融合蛋白質，舉例而言，可用於升高作爲診斷試劑之掊抗P a u A蛋白質的抗血淸，或硏究P a u A蛋白質之生物活性，構築具有改變之生物活性的P a u A融合蛋白質，或幫助鑑定或純化經表現的P a u A蛋白質。可能的融合蛋白質表現載體包括但不限定在下列載體，即該載體中倂入Θ -半乳糖苷酶與 t r p E融合體、麥芽糖結合蛋白質融合體、榖恍甘肽-S 一轉移酶（G s T )融合體與多組織胺酸融合體（載劑區）的編碼序列。G S T -肽片段融合體的特別範例說明於上文5 · 1節中，本發明提供表現載體，其包括具有這些融合體之編碼核苷酸序列的多核苷酸分子。該技藝已知的方法可用於構築編碼這類P a u A融合蛋白質之表現載本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公费） -25- 謂1閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :裝· '訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（23 ) 體。 P a u Α融合蛋白質可構築成包括可用於純化的區域者。例如’ P a u A -麥芽糖結合蛋白質融合體可用直鏈澱粉樹脂純化；P a u A - G S T融合蛋白質可用榖恍甘肽-瓊脂珠子純化；而P a u A -多組織胺酸融合體可用二價鎳樹脂純化。或者，拮抗載劑蛋白質或肽的抗體可用於此融合蛋白質的親和性層析純化法。例如，單株抗體之標的抗原決定位的編碼核苷酸序列可構築在表現載體中，該序列與調節元件操作性連接，且所在位置可令經表現的抗原決定位與融合蛋白質的P a u A成員融合。例如，編碼F L A G τ M抗原決定位標鑛(International Biotechnologies廠，一種親水性標記肽）之核苷酸序列，可藉由標準技術嵌入表現載體對應P a u A成員之胺基或羧基終端處。然後經表現的P a u A - F L A G τ M抗原決定位融合產物可使用市售之抗F L A G τ M抗體予以測定及親和性純化。表現載體也可構築成含有多連接子序列者，該序列編碼特定的蛋白酶切割位置，故經表現的P a u A成員藉由特定蛋白酶處理，可由載劑區或融合成員釋放出來。例如，融合蛋白質載體可包括編碼凝血酶或X a因子切割位置的D N A序列。在P a u A編碼序列上游且在相同譯讀架構中的訊號序列，可藉由已知方法構築在表現載體內，如此可主導經表現蛋白質的運送與分泌。訊號序列的非限定實例包括得本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公摄） -26 - 讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· -訂 1225518 五、發明説明θ ) 自α —因子、免疫球蛋白、外膜蛋白質、青黴素酶、T細胞接受器、以及天然P a u Α蛋白質本身的訊號序列。爲了方便篩選經本發明表現載體轉形或轉感的宿主細胞，可構築表現載體爲額外包括通訊（reporter)基因產物或其他可篩選標誌的編碼序列者。這類編碼序列較好與上述調節元件編碼序列操作性連接在一起。可用於實施本發明之通訊基因是該技藝已知的，包括編碼氯黴素乙醯基轉移酶（CAT)、綠螢光蛋白質、飛火蟲螢光素酶、及人生長基素等基因。編碼可篩選標誌的核苷酸序列是該技藝已知的，包括編碼基因產物的核苷酸序列，該基因產物賦予抗生素抗性或抗代謝物，或提供營養缺乏之需求的核苷酸序列。這類序列的範例包括編碼胸腺核苷激酶活性者、或對胺甲碟呤、胺苄青黴素、康黴素、氯黴素、或若辛（ zeocin)提供抗性者等。 5 . 2 . 2 .宿主細胞之轉形作用經濟部中央標準局員工消費合作社印製本發明提供經本發明重組選殖載體或表現載體轉形之宿主細胞，及其衍生的細胞株。用於實施本發明的宿主細胞可爲原核細胞或真核細胞。這類轉形宿主細胞包括但不限定在下列微生物，例如經重組噬菌體D N A、質體 D N A或粘接質體D N A表現載體轉形的細菌；或經重組表現載體轉形的酵母菌；或經重組病毒表現載體（例如竿狀病毒）轉感的動物細胞（例如昆蟲細胞）；或經重組病毒表現載體（例如腺病毒或牛痘病毒）轉感的哺乳動物細本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -27- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明砰）胞。通常較好以細菌細胞作爲宿主細胞。傳統上使用大腸桿菌菌株，例如D Η 5 α菌株，其係得自美國菌種保存中心（A T C C )，Rockville，M D，U S Α (編號 31343)或得自商業來源（Stratagene廠），或T A P 56或LW14菌株（Pfizer廠保存的大腸桿菌菌株）。較佳的真核宿主細胞包括酵母菌細胞，雖然哺乳動物細胞例如源自小白鼠、倉鼠、牛、猴的哺乳動物細胞、人類纖維母細胞株也可有效利用。可用來表現本發明重組P a u A 多肽的真核宿主細胞的範例包括中國倉鼠卵巢（C Η〇）細胞（例如A T C C編號C C L 6 1 )，及N I H瑞士鼠胚胎細胞N I H / 3 T 3 (例如A T C C編號C R L 1 6 5 8 )。本發明重組載體較好轉形或轉感至一種或多種宿主細胞，其爲實質上同質之細胞培養物。載體通常利用已知方法導入宿主細胞中，例如磷酸鈣沉澱法、氯化鈣處理法、 •微注射法、電穿孔法、接觸重組病毒之轉感法、脂肪微粒調節的轉感法、D E A E -樹脂轉感法、轉導法、接合法、或小噴射轟炸法（bombardment )。篩選轉形體可用標準方法完成，例如篩選表現可選擇標誌的細胞，該標誌例如與重組載體有關的抗生素抗性。一旦本發明重組載體導入宿主細胞，P a u A編碼序列嵌入或維持在宿主細胞基因組或排出細胞可由標準方法確認，例如南方雜交分析法、限制酶分析法、P C R分析 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公漦~] 7〇8^ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明哗) 法、包括逆轉錄酶p c R ( r t - P c R )法、或藉由測定預期多肽產物的免疫分析法。含有及/或表現重組P a u A編碼序列的宿主細胞，可由該技藝熟知之至少四種常用方法中任一種方法鑑定；該方法包括：（i)DNA — DNA，DNA — RNA，或R N A -反意義R N A雜交法；（i i )測定''標誌" 基因功能的存在；（i i i )得知轉錄程度，係藉由測定 P a u A特異的m R N A轉錄產物在宿主細胞的表現情形 ;及（i v )測定成熟P a u A多肽產物的存在，其係藉由諸如免疫分析法測定或測定P a u A生物活性的有無（即將適當哺乳動物血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶的作用）。非限定實例中，經重組表現之P a u A多肽的生物活性可藉由測定牛血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶的作用予以檢測，此可利用如國際專利公開案W〇9 3 / 1 4 2 0 9中記載的瓊脂/脫脂乳覆蓋分析法等等。簡言之，將欲測知P a u A生物活性的製劑稀釋至適當濃度，例如每毫升磷酸鹽緩衝鹽水（P B S，p Η 7 · 4 )中含有1微克蛋白質，將其加入瓊脂板中（l%w/v， P B S中）切出的孔洞，該瓊脂含有〇X 〇 i d τ M脫脂乳 (1 % w / v ； UnipathLtd.,Hampshire,England )，及牛血纖維蛋白溶酶原（1 〇—3units/ml)(Sigma廠）。測定生物活性P a u A多肽的存在，係觀察到脫脂乳層中形成淸澈區，這表示牛血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公f ) - 29 - ~ 讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) -裝· JT· -" 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明θ ) 再將乳蛋白質分解。或者，也可採用如下7 . 3節所述的色原分析法。 5 . 2 . 3重組多肽的表現趄定件一旦P a u A編碼序列穩定的導入適當宿主細胞後，轉形後的宿主細胞係以純系增殖，所生成的細胞在 P a u A多肽可達最高產量的條件下生長。這類條件通常包括令細胞生長至高密度。當表現載體含有可誘發的啓動子，需要使用適當誘發條件以誘生表現作用，該條件例如轉換溫度、耗盡營養品、添加安慰誘導物〔例如碳水化合物之類似物，諸如異丙基- Θ - D -硫代半乳糖苷（ I P T G )〕、聚積大量代謝副產品等等。當經表現的P a u A多肽駐留宿主細胞內時，收集細胞並溶解之，爲了將蛋白質降解減至最低，可在技藝已知的萃取條件下分離與純化產物，例如於4 °c，或在蛋白酶抑制劑存在下，或兩者。當經表現的P a u A多肽係由細胞分泌時，可簡單的收集耗盡的營養培養基並由其中分離產物。可用標準方法將經表現的P a u A多肽自細胞溶解物或培養基實質上純化或分離出來，該方法包括但不限定下列方法的任一種組合：硫酸銨沉澱法、分子大小分級分離法、離子交換層析法、Η P L C、密度離心法、與親和性層析法。當經表現的P a u Α多肽具有生物活性，即活化血纖維蛋白溶酶原的能力，製劑逐漸增加的純度可在純化本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ^7~^ΐ~ϊ ;30 ~ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :裝- -訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明鉍）過程的每一個步驟予以檢測，例如利用上述的脂乳覆蓋分析法’或7 · 3結所述的色原分析法，或其他測定血纖維蛋白溶酶原活化作用的相關方法。若經表現的多肽無生物活性’其可根據分子大小、與P a u A多肽之特異抗體的反應性，或融合標籤的存在與否而測知。因此’本發明提供製備P a u A多狀的方法，包括在可生產P a u A多肽的條件下，培養經重組表現載體轉形的宿主細胞，該重組表現載體含有一多核苷酸分子，其包括編碼下列的多核苷酸序列：（a ) P a u A蛋白質，其含有SEQ ID N〇：2或SEQ ID N〇：4 約第2 6位至約第2 8 6位胺基酸的胺基酸序列；或（b )實質上同質於P a u A蛋白質的多肽；或（c ) P a uA蛋白質的肽片段或實質上同質的多肽；或（d) 融合蛋白質，其包括P a u A蛋白質、實質上同質的多肽、或融合在融合成員的肽片段，此多核苷酸序列係與控制多肽分子在宿主細胞中表現的一個或多個調節元件操作性連接在一起，並且由細胞培養物回收P a u A多肽。一旦獲得足夠純度的P a u A多肽，可用標準方法定性，包括使用S D S - P A G E，分子大小排阻層析法、胺基酸定序法、血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶之生物活性等。P a u A多肽的胺基酸序列可用標準肽定序法測知。P a u A多肽可進一步用親水性分析法（參見 Hopp 與 Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci · U S A 7 8 : 3 8 2 4 )，或類似的電腦軟體算法鑑定，藉以鑑定本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ίΟ'Χ 297公漦）-31 - ί j_裝—，讀先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 1- 丁、-=tl 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 !Γ· 五、發明説明的） P a u A多肽的厭水性與親水性區域。可進行結構分析，藉以鑑知預測有特殊二級結構的P a u A多肽區域。生物物理方法例如X —射線結晶圖學（Engstrom，1 974，Biochem. Exp. Biol 11:7-13)，電腦模型（Fletterick 與 Zoller(eds)知 1 9 8 6, in:Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)，及核磁共振（N M R )可用於繪圖與硏究P a u A多肽與其受質之間的交互作用位置。這些硏究所得的資料可用來設計更有效的疫苗組成物，篩選只含有P a u A多肽特定部分的疫苗，設計或篩選治療或醫療化合物，其可阻斷天然 P a u A蛋白質對血纖維蛋白溶酶原的活化作用。可用於實施本發明的P a u A多肽爲具有下列特徵者 :(a )具生物活性，即可將血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶；或（b )具免疫生成性，即施加至多種哺乳動物時，能夠誘生對抗乳房炎的保護性反應；或（c ) 施加至多種哺乳動物時，能夠誘使抗P a u A蛋白質特異抗體的生產，該抗體可用來作爲診斷試劑；或（d )可用來作爲診斷試劑，以測定得自哺乳動物之血液或血淸樣品中是否有抗P a u A蛋白質特異抗體存在，該哺乳動物感染乳房炎致病病原例如乳房鏈球菌，或接種本發明疫苗。這類多肽製成後，最好用該技藝已知的慣用篩選方法鑑定。例如，將哺乳動物血纖維蛋白溶酶原轉化爲血纖維蛋白溶酶的能力可用上述任一種生物分析法鑑定。鑑定誘生對抗乳房炎之保護性免疫反應的能力，可將P a u A多肽施本紙張尺度適用中國國家標準（€阳）/\4規格（210:>< 297公漦） _ 32 _ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 ______„ ίΓ 五、發明説明00 ) 加至對諸如乳房鏈球菌之鏈球菌菌株造成的乳房炎有感受的多種哺乳動物，並測試P a u A中和抗體的存在與否，或測試經免疫動物對抗乳房炎致病病原之後續攻擊的能力。鑑定誘使P a u A蛋白質特異抗體生產的能力，可將 P a u A多肽施加至示範動物，例如小白鼠、豬、綿羊、山羊、馬、牛等，並使用標準方法測定動物之血淸轉化情形。測定P a u A多肽作爲診斷試劑的能力，可將該 P a u A多肽與動物之血液或血淸樣品接觸，該動物事先被乳房炎致病病原諸如乳房鏈球菌感染，或是先接種本發明疫苗，並利用標準方法例如E L I S A分析法測定 P a u A多肽與樣品中P a u A蛋白質特異抗體的結合情形。用於實施本發明之P a u A多肽的特定但非限定範例包括，含有SEQ ID N〇：2或SEQ ID N〇：4約第2 6位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸，或 SEQ I D N〇：2 或 SEQ ID Ν〇··4 約第 1位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列的蛋白質〇用於實施本發明之P a u Α多肽的特定但非限定範例包括由 SEQ ID N〇：2 或 SEQ ID Ν Ο ： 4之胺基酸亞序列所組成的P a u A肽片段，其係選自約第2 8位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸、約第1 0 4位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸、約第1 7 2位胺基酸至約第 2 8 6位胺基酸、約第2 8位胺基酸至約第1 7 0位胺基本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x1^^ 733^ — —™ 請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 JT" -呑經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明θ ) 酸、約第1 0 4位胺基酸至約第1 7 0位胺基酸、約第 1 0 4位胺基酸至約第2 0 8位胺基酸、約第1 7 2位胺基酸至約第2 0 8位胺基酸、約第2 8位胺基酸至約第 1 0 3位胺基酸、約第2 8位胺基酸至約第2 0 8位胺基酸、及約第1 4 9位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸。用於實施本發明之融合蛋白質的特定但非限定範例包括GST融合蛋白質，其含有GST融合至SEQ ID N〇·· 2或S E Q ID N〇：4之胺基酸亞序列所組成的肽片段，其係選自約第2 8位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸、約第1 0 4位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸、約第1 7 2位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸、約第2 8位胺基酸至約第1 7 0位胺基酸、約第1 0 4位胺基酸至約第 1 7 0位胺基酸、約第1 0 4位胺基酸至約第2 0 8位胺基酸、約第1 7 2位胺基酸至約第2 0 8位胺基酸、約第 2 8位胺基酸至約第1 0 3位胺基酸、約第2 8位胺基酸至約第2 0 8位胺基酸、及約第1 4 9位胺基酸至約第 2 8 6位胺基酸。故本發明提供實質上純化或分離的P a u A蛋白質，其實質上同質的多肽，該P a u A蛋白質的肽片段及其實質上同質的多肽，包含該P a uA蛋白質之融合蛋白質、其實質上同質的多肽或肽片段（本說明書中統一稱爲a P a u A 多肽〃）。 5 · 3 P a u A之同系物與衍生物 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 規格（210X 297公f ) - 34 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（32 ) 本發明令提供上述P a u A多肽之同系物與衍生物，這些同系物與衍生物如同上述界定的多肽，可有效實施本發明。造成同系物產生之操作步驟可發生在基因階段或蛋白質階段或兩者。於基因階段，舉例而言，編碼P a u A多肽之經選殖的D N A分子可藉由一'種或多種以之策略，在試管內將該D N A分子修飾成爲編碼P a u A蛋白質同系物者。這類修飾方法包括但不限定在核酸內切酶水解法、產生或破壞轉譯、開始及/或終止序列，或在編碼序列中產生變異之突變作用，或其任一組合。參見上述之 Maniatis，etal.之 1 989;Ausubel，etal.，1 989;及 Sambrook ， etal·，1 989。該技藝已知之任何突變技術皆可使用，包括但不限定在與突變劑接觸處理，該突變劑例如放射線或化學突變劑，或是試管內之定位突變法（參見Hutchinson，etal. 之 1978, J.Biol.Chem.253 :655 1)。 P a u A多肽的操作也可在蛋白質階段完成。利用已知技術可完成該蛋白質之一種或多種化學修飾，其包括但不限定在下列技術：以對應的D -胺基酸、胺基酸同系物、或胺基酸模仿物取代天然蛋白質之一個或多個L -胺基酸，藉以產生卡巴酸鹽（carbazate)或三級中心；或者特殊化學修飾法，例如使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜酵素或V 8蛋白酶進行蛋白質水解；與N a BH4或溴化氰反應 ;或乙醯化反應、甲醯化反應、氧化或還原作用等等。 P a uA多狀可由共範一個或多個化學基團予以衍生本紙張尺度適财關^轉（GNS ) Λ4祕^ ~ ' (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明03 ) ’包括但不限定下列基團：乙醯基、硫橋基、葡醣基、脂肪與磷酸鹽，及/或另一個P a u A多肽，或其他蛋白質 ’例如血淸白蛋白、鑛孔碱血藍質、或商品化的活性 B S A、或多胺基酸（例如多離胺酸），或多醣類（例如 sepharose、瓊脂糖、經修飾或不經修飾的硝化纖維素）等等。這類共軛反應較好共軛鍵結在胺基酸側鏈及/或多肽的N終端或C終端。進行這類共軛反應的方法是蛋白質化學領域熟知的。可用於實施本發明的衍生物也包括水溶性聚合物，例如聚乙二醇，共轭至P a u A多肽或其同系物或衍生物者 ’如此提供另一種所欲特性，即至少保留該多肽免疫生成性之一部份。這些額外的所欲特性包括，舉例而言，增加在水溶液中之溶解度、增加保存安定性、增加蛋白質水解性降解作用的抗性、及增加活體內的半衰期。適合共軛至 P a U A多肽的水溶性聚合物包括但不限定在聚乙二醇單體聚合物、聚丙二醇單體聚合物、乙二醇與丙二醇組成的共聚物，其中該單體聚合物與共聚物無取代或在彼之一端被烷基、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣類、聚乙烯基乙基醜、及α，聚〔2 —經乙基〕一DL —天冬門醯胺取代。聚乙二醇尤其佳。製造這類蛋白質之水溶性聚合物共軛物的方法是該技藝已知的，記載於下列專利文獻 :美國專利3,788,948;美國專利3,960,830;美國專利 4,002,5 3 1;美國專利4,05 5,635;美國專利4，1 79,3 37;美國專利 4,261，973;美國專利4,4 1 2,989;美國專利4,414，147;美國專利本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ 297公漦）-36 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明04 ) 4,4 1 5,665;美國專利4,609,546;美國專利4,732,863;美國專利 4,745，180;歐洲專利（EP) 1 52,847;EP98，110;及曰本專利 (JP)5,792,435等等，這些專利倂入本案作爲參考。鑑定實施本發明之同系物與共軛物，可利用上述鑑定 PauA多肽的方法。 5 · 4抗乳房炎疫苗本發明另提供用於保護多種哺乳動物對抗乳房炎的疫苗，其期包括免疫有效量的：（a)pauA蛋白質，其含有 SEQ ID N〇：2 或 SEQ ID NO :4 約第2 6位至約第2 8 6位胺基酸所組成的胺基酸序列；或（b)實質上同質於p a ua蛋白質之多肽；或（c) 由P a u A蛋白質或其實質上同質之多肽的亞序列所組成的肽片段；或（d )融合蛋白質，其包括P a u A蛋白質，實質上同質的多肽，或肽片段融合至融合成員；或（e )PauA蛋白質，實質上同質之多肽，肽片段，或融合蛋白質之问系物或衍生物，（f )多核杳酸分子，包括 P a u A蛋白質，實質上同質之多肽，肽片段，融合蛋白質或同系物之編碼核苷酸序列，該蛋白質，實質上同質之多肽，肽片段，融合蛋白質，同系物，衍生物或多核苷酸分子係能夠在哺乳動物體內誘生對抗乳房炎之保護性反應者；以及獸醫學上可接受的載劑。非限定具體實例中，本發明疫苗包括經轉形的宿主細胞，其包括本發明之表現載體或多核苷酸分子，該表現載本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297^>H 37 - ~ ~ (，讀先閱讀背而之泣意事項真填寫本貢') __裴· '訂經濟部中央標率局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明缸）體或多核苷酸分子係於宿主細胞內表現而生產能夠在哺乳動物體內誘生對抗乳房炎之保護性反應的本發明P a u A 蛋白質，實質上同質之多肽，肽片段，融合蛋白質或同系物。此宿主細胞可以是任何可令本發明之表現載體或多核苷酸分子表現者，且該細胞可於疫苗內施加至多種哺乳動物。這類宿主細胞是大腸桿菌宿主細胞。本文所用''免疫有效量〃乙詞，表示免疫原施加至哺乳動物時能夠誘生對抗乳房炎之保護性反應的劑量，該免疫原是本發明之P a uA蛋白質，實質上同質之多肽，肽片段，融合蛋白質，同系物，衍生物，或多核苷酸分子。本文廣泛使用之 > 能夠誘生保護性反應〃乙詞包括哺乳動物對免疫接種之免疫爲主之反應的誘生或增加，此反應包括抗體或細胞調節的免疫反應，或兩者，其係用於保護經免疫的哺乳動物對抗乳房炎。本文所用''保護性反應〃或 > 保護〃之用語並不限定在絕對保護乳房炎或絕對保護乳房炎致病病原引起的感染症，其包括該病原所致的感染症在程度或速度上有減低的任何情形，或該病原所致感染症之疾病嚴重性、症狀或病況有減低的任何情形，此情形包括，與無免疫但被感染的哺乳動物比較，有可測得之乳產量增加，或可測得的保護作用或可測得之減緩乳產量降低情形。本文所用 ''多種哺乳動物〃與 ''哺乳動物〃之用語表示使用本發明疫苗可被保護而對抗乳房炎的任何哺乳動物，包括多種品種的牛（乳牛與肉牛），以及綿羊、豬、山本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公漦） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 up 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（36 ) 羊、馬、狗與猫。本發明之疫苗組成物可根據業界接受的習知方法予以調配，其係使用標準緩衝液、載劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、及/或助溶劑，也可調配爲利於控釋者。稀釋劑可包括水、食鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。維持等張的添加劑包括氯化納、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇、及乳糖等。安定劑包括白蛋白等。佐劑可選擇地用於疫苗，佐劑之非限定範例包括 R I B I佐劑系統（R I B I廠），鋁、氫氧化鋁膠、水包油乳劑例如水包鯊烯，油包水乳劑例如Freund’s完全或不完全佐劑，Block 共聚物（CytRx 廠，AtlantaGA)，SAF-M(Chiron 廠，EmeryvilleCA)，AMPHIGEN®佐劑，皂素，其他純化或半純化的皂素餾份例如QuilA(Superfos廠）或QS-21(Cambridge Biotech 廠，CambridgeMA)，單磷醯基脂肪 A，及 Avridin脂肪-胺佐劑。疫苗可進一步包括一種或多種其他免疫調節劑，例如間白素、干擾素、或其他已知細胞激素。獸醫學上可接受的適當疫苗賦形劑、載劑、與添加劑是該技藝之士已知或顯而易知的；例如參見Remington’s PharmaceuticalScience,第 1 8版，1 990，Mack 出版社，其係倂入本發明作爲參考。疫苗可保存於溶液，或者以冷凍乾燥形式保存，而利於施用前與滅菌之稀釋溶液重組。本發明另提供用於控釋免疫原的疫苗配方。這類控釋配方的範例包括免疫原與生物可相容的聚合物組合，此聚合物例如聚乳酸、（乳酸與甘醇酸）共聚物、甲基纖維素讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·裝· 、-t 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公蝥 -39- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 !Γ — 五、發明説明07 ) 、聚玻璃糖醛酸、膠原蛋白等等。藥物輸送賦形劑中可降解聚合物的結構、選擇與用途在多份公開文獻中早有揭露，包括 A.Domb 等人，1992，Polymersfor Advanced Technologies 3 : 2 7 9 — 2 9 2，其係倂入本發明作爲參考。藥學配方中篩選與使用聚合物的其他指引可參見 M.Chasin 與 R.Langer 等，1 9 9 0 ， Biodegradable

Polymersas Drug Delivery Systems ” ，Drugsandthe

Pharmaceutical Sciences 篇，第 45冊，M.Dekker，NY，其也倂入本發明作爲參考。或者，本發明疫苗中的P a uA多肽、同系物、衍生物、或多核苷酸可包於微膠粒以利於施藥及增加藥效。將抗原包在微膠粒的方法是該技術領域已知的，包括下列揭示的技術，例如美國專利第3,1 37,63 1號，美國專利第3,959,457號，美國專利第4,205,060號，美國專利第4,606,940 號，美國專利第4,744,933號，美國專利第5，132，117號，以及國際專利公開案W095/28227,其皆倂入本發明作爲參考。脂微粒也可用於提供控釋本發明P a u A多肽、同系物、衍生物、或多核苷酸任一者。如何製造與使用脂微粒配方的詳細資料可見於美國專利第4,0 16,100號，美國專利第 4,452,747號，美國專利第4,921，706號，美國專利第4,927,637號，美國專利第4,944,948號，美國專利第5,008,050號，以及美國專利第5,009,956，其皆倂入本發明作爲參考。非限定較佳具體實例中，本發明疫苗可爲組合疫苗，用於保護哺乳動物對抗乳房炎，且選擇地對抗一種或多種侵害哺乳動物的其他疾病或病況，該組合疫苗包括免疫有 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公犮） -40- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明細）效量之第一組份，其包括：（a ) P a u A蛋白質，含有 S E Q 1 D 1^〇：2或3£<3 ID N〇：4 中約第2 6位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列；（ b)實質上同質於pauA蛋白質之多肽；（c)肽片段，具有Pa uA蛋白質或實質上同質多肽之亞序列；（d )融合蛋白質’包括融合在融合成員上的P a u A蛋白質、實質上同質多肽或肽片段；（e)PauA蛋白質、實質上同質多肽、肽片段或融合蛋白質之同系物或衍生物； (ί )多核苷酸分子，包括編碼P a uA蛋白質、實質上同質多肽、肽片段、融合蛋白質、或同系物的核苷酸序列 ’該蛋白質、實質上同質多肽、肽片段、融合蛋白質、同系物、衍生物或多核苷酸分子能夠誘生哺乳動物產生拮抗乳房炎之保護性反應；免疫有效量之第二組份，包括一抗原，其能夠誘生保護性反應以拮抗侵害哺乳動物之疾病或病況；以及獸醫學上可接受的載劑。選擇組合疫苗中第二組份的抗原，係根據其誘生保護性反應以拮抗乳房炎或其他侵害哺乳動物之疾病或病況的能力，或拮抗該技藝已知可感染哺乳動物之病原的能力。用於特定哺乳動物之疫苗組成物的任何已知免疫原性組成物皆可用於該組合疫苗中的第二組份中。這類免疫原性組成物包括下列，但不限於此：對抗牛泡疹病毒（又稱爲感染性牛鼻支氣管炎）提供保護的組成物，牛呼吸道合胞病毒、牛病毒性下痢病毒、副流行性感冒病毒第I 、I I 、或I I I型，鉤端螺旋體屬、彎曲桿菌屬、葡萄球菌屬（紙張尺度適用中國國家標準（CNS)八4規^7210^297公漦) -41 - (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明的）例如金黃葡萄球菌）、鏈球菌屬（例如無乳鏈球菌、停乳鏈球菌）、黴漿菌屬、克雷伯氏菌屬（Klebsiellaspp.)、沙門氏桿菌屬，輪狀病毒、冠狀病毒、狂犬病病毒、巴斯德氏菌屬（溶血巴斯德氏菌或多殺巴斯德氏菌）、梭菌屬、破傷風毒素、大腸桿菌、新孢子菌屬（Neosporaspp.)，以及其他真核寄生蟲等。包括第二組份的抗原可隨意共價鍵結至第一組份之 P a uA多肽、之同系物或衍生物，藉以產生嵌合分子或融合蛋白質。非限定具體實例中，第二組份之抗原包括半抗原，其免疫生成力可藉由共軛至第一組份之P a u A多肽、同系物或衍生物而明顯增加。嵌合分子包括由該組合疫苗之第一與第二組份共軛鍵結的抗原，其可利用該技藝已知之一種或多種技術合成。例如，嵌合分子可使用市售之肽合成儀，藉標準化學合成法予以合成（參見 Merdfield，1 985，Science 2 3 2 : 3 4 1 一 3 4 7等）。或者，可分別合成個別組份，再利用該技藝已知的化學鍵結基團將其鍵結在一起。又或者，嵌合分子可使用重組D N A技術予以製造，例如將個別多核苷酸分子在相同編碼架構下接合在一起，該多核苷酸分子包含編碼該嵌合分子之不同抗原的核苷酸序列，並於適當轉形宿主細胞中表現，然後分離該嵌合分子。當本發明疫苗含有多核苷酸分子而不是多肽時，該疫苗組合物中可使用經接合的多核苷酸分子。進行這類重組技術的充分導引可見於上述 Maniatis,etal，1989·;上述 Ausubeletal.，1989;上述本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公蝥）_ 42 _ (謂先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局^;工消費合作社印繁 1225518 五、發明説明㈤）

Sambrooketal.，1 989;上述 Innis，etal，1 995;及上述 Erlich，1992 〇如上所述，本發明疫苗可包括轉形宿主細胞，此宿主細胞包括本發明表現載體或多核苷酸分子，而該表現載體或多核昔酸分子係於宿主細胞內表現，藉以產生能夠在哺乳動物誘生對抗乳房炎之保護反應的本發明P a u A蛋白質、實質上同質多肽、肽片段、融合蛋白質、或同系物。非限定具體實例中，本發明之組合疫苗包括一宿主細胞，其係作爲乳房鍵球囷引起之乳房炎以外之任何侵害哺乳動物之·疾病或病症的相關病原，此宿主細胞可進一步包括本發明表現載體或多核苷酸分子，該表現載體或多核苷酸分子係於宿主細胞內表現，藉以產生能夠誘生哺乳動物對抗乳房炎之保護反應的本發明P a u A蛋白質、實質上同質多肽、肽片段、融合蛋白質、或同系物，且該疫苗中的這類宿主細胞係用於誘生保護性免疫反應，以對抗除了乳房鏈球菌所引起之乳房炎以外的疾病或病況。非限定具體實例中，這類宿主細胞係選自鉤端螺旋體屬、彎曲桿菌屬、葡萄球菌屬（例如金黃葡萄球菌）、鏈球菌屬（例如無乳鏈球菌、停乳鏈球菌）、黴漿菌屬、克雷伯氏菌屬（ Klebsiellaspp.)、沙門氏桿菌屬，巴斯德氏菌屬（溶血巴斯德氏菌或多殺巴斯德氏菌）、梭菌屬、大腸桿菌、新孢子菌屬 (Neosporaspp ·)，以及其他真核寄生蟲等。本發明也提供保護哺乳動物對抗乳房炎之疫苗的製備方法，包括將免疫有效量的下列物質與獸醫學上可接受的 (謂先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公f ) . 43 - 1225518 五、發明説明⑷）載體混合：（a)PauA蛋白質，含有SEQ ID 1^〇：2或3£〇 ID NO: 4中約第26位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列；（b )實質上同質於PauA蛋白質之多狀，（c)狀片段，具有PauA 蛋白質或實質上同質多肽之亞序列；（d)融合蛋白質，包括融合在融合成員上的P a u A蛋白質、實質上同質多肽或肽片段；（e) PauA蛋白質、實質上同質多肽、肽片段或融合蛋白質之同系物或衍生物；（f )多核苷酸分子，包括編碼P a uA蛋白質、實質上同質多肽、肽片段、融合蛋白質、衍生物或同系物的核苷酸序列，該蛋白質、實質上同質多肽、肽片段、融合蛋白質、同系物、衍生物或多核苷酸分子能夠誘生哺乳動物產生拮抗乳房炎之保護性反應。本發明另提供哺乳動物對抗乳房炎之免疫接種方法，包括對哺乳動物施用免疫有效量之本發明疫苗。施用至哺乳動物之免疫有效量係根據被接種動物之品種、年齡、體重、健康與生理特徵等因素，以及予以施用的特定免疫原組成物及疫苗組成物。對每一個參數測定最佳劑量，可採用傳統目視方法，例如經驗硏究法。詳言之，對牛施加本發明疫苗中的P a u A多肽，施加量較好是約0 · 0 1 // g至約1 0 〇 m g，更好是約〇 · 1 // g至約1 0 m g，最好是約1 · 〇 # g至約1 m g之多肽。對牛施加本發明疫苗中的多核苷酸分子，施加量較好是約 0 · 〇 5 // g至約5 0 0 m g ，更好是約〇 · 5 // g至約讀先間讀背面之注意事項再填寫本頁 I- 丁 -5·口經濟部中央標準局員工消費合作社印裂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210/2.97公#. -44 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（42 ) 5 0 m g，最好是約5 · 0 // g至約5 m g之多核脊酸。此外，疫苗之典型劑量爲每隻動物每劑約5 0 // g至約 5 0 m g。疫苗療程也可根據上述因素予以選擇。動物可在任何適當的時間接種，包括斷乳齢或更小，或剛好在配種之前或當時，或產犢時，或無乳時，或在一群動物中有一隻或多隻動物首先初期呈現乳房炎感染時。爲了達到完全保護，可能需要補強接種，或再接種。測定是否達到適當免疫保護效果的方法，例如測定血淸轉換情形或使用中和分析法，其皆爲該技藝熟知的方法。本發明疫苗可由任何適當途徑施用，例如經口、經鼻、肌肉內、乳房內、淋巴結內、腹膜內、靜脈內、動脈內、皮下、經直腸或陰道用藥，或經組合途徑熟悉該技藝之士當能輕易根據選出的用藥途徑來調配疫苗組成物。本發明另提供疫苗套組，其係用於接種哺乳動物以對抗乳房炎，該套組包括第一容器，其中含有免疫有效量的下列物質：（a)PauA蛋白質，含有SEQ ID N〇：2_SEQ ID NO:4中約第26位胺基酸至約第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列；（b )實質上同質於PauA蛋白質之多肽；（c)肽片段，具有PauA 蛋白質或實質上同質多肽之亞序列；（d)融合蛋白質’ 包括融合在融合成員上的P a u A蛋白質、實質上同質多肽或肽片段；（e) PauA蛋白質、實質上同質多肽、肽片段或融合蛋白質之同系物或衍生物；（ί )多核苷酸 (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )六4規格（210X29?公釐） .45 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（43 ) 分子’包括編碼P a u A蛋白質、實質上同質多肽、肽片段、融合蛋白質、衍生物或同系物的核苷酸序列，該蛋白質、實質上同質多肽、肽片段、融合蛋白質、同系物、衍生物或多核苷酸分子能夠誘生哺乳動物產生拮抗乳房炎之保護性反應；以及第二容器，其包括獸醫學上可接受的載劑或稀釋劑。 5 . 5抗一Pa uA抗體的牛產本發明提供與本發明P a u A多肽、同系物或衍生物結合的多株或單株抗體。這類抗體可用來作爲親合試劑，藉此純化天然或重組P a u A多肽；或測定由被感染之哺乳動物得到之組織切片、細胞、組織或液體樣品中的 P a u A存在情形，例如藉由E L I S A或西方墨點分析法；或在治療上中和感染動物體內的天然p a u A蛋白質活性。抗體可予以誘生來掊抗本發明之任一 p a u A多肽、同系物或衍生物。根據習知方法，可使用多種宿主動物，包括牛、馬、兔、山羊、綿羊、與小白鼠，但不限於此，來製造抗P a u A蛋白質之特異抗體。多種佐劑，例如上述第5 · 4章中列出者，可用於促進抗體的生成。多株抗體可由經免疫的動物製得，並使用標準技術測試其抗P a uA多肽之特異性。或者，製備抗p a UA多肽之單株抗體，可使用提供由連續細胞株之培養而生產抗體分子的任何技術。這些方法包括一般由Kohler與Milstein 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公優"7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1225518 五、發明説明（44 ) 揭示的融合瘤技術（Nature, 1975，256:495-497);人類B細胞融合瘤技術（Kosbor, et al.1983，Immunology Today, 4:72 ; Cote, et al., 1 98 3, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80:2026-2030) ;以及 EBV-融合瘤技術（Cole, et al.，1 985，Monoclonal antibody and Cancer therapy, Alan R. Liss，Inc.,, pp 77-96) ’ 但不限於此。本發明也包含抗體片段，其含有針對本發明P a u A 多肽、同系物或衍生物之特異結合位置，且此抗體片段可用習知技術生產。這類片段包括可由胰蛋白酶水解完整抗體分子而生成的F ( a b’）2片段、以及可藉由還原 F ( a b ’）2片段之雙硫鍵橋而生成的F a b片段，但不限於此。或者，可構築F a b表現庫（huse，etal.，，1 989， Science 246 : 1275 — 1281)，如此可快速鑑定具有拮抗P a u A肽、同系物或衍生物之所欲特異性的 F a b片段。經濟部中央標準局員工消費合作社印製讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 生產單株抗體與抗體片段之技術是該技藝熟知的，可由下列文獻等再加以說明，例如Harlow and Lane, 1 98 8， Antibodies: A Laboratory Manual,C old Spring Harbor Laboratory;以及 J.W.Goding，1 986,Monoclonal Antibodies : Principleand Practice,Academic Press,London.上述所有文獻皆倂入本發明作爲參考。 5.6.反意義寡核苷酸與核糖酶本發明範圍也涵括寡核苷酸序列，包括反意義寡核苷本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X29?公势）-47 _ 經濟部中央標準局—工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（45 ) 酸、磷酸硫醇鹽與核糖酶，其功能上係結合至P a u A R N A並降解及/或抑制其轉譯作用。反意義寡核苷酸包括反意義R N A分子與反意義 DNA分子，其係藉由與標的mRNA結合並防止蛋白質轉譯，而直接阻斷m R N A之轉譯作用。舉例而言，藉由已知之磷酸二酯技術，可合成至少約1 5個鹼基且互補於編碼P a u A多肽之DNA序列之獨特區域的反意義寡核苷酸。核酸酶是具有酶功用的R N A分子，其能夠催化對 R N A之特定切割作用。核糖酶之作用機制涉及核糖酶分子對互補標的R N A之序列特異雜交反應、以及後續的核酸內切割作用。遺傳工程構築之榔頭區核酸酶分子，能特異且有效率的催化p a u A m R N A序列的核酸內切作用，也涵括在本發明範圍內。任何有潛力的R N A標的之特異核酸酶切割位置，首先係藉由篩選標係分子之核酸酶切割位置，包括下列序列，GUA、GUU、與GUC。一旦確定後，對應標的基因區中含有切割位置之約1 5及2 0個核糖核苷酸之短 R N A序列，可予以評估預測的結構特性，例如可令該寡核苷酸序列不適合的二級結構。候選標的之合適性也可藉由測試其是否容易與互補寡核苷酸雜交而予以評估，例如使用核糖核酸酶保護分析法。本發明之反意義寡核苷酸與核糖酶皆可利用習知方法製備。這些方法包括化學合成技術，例如固相胺基磷酸酯本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-48 - (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明辦） (phosphoamite)化學合成法。或者，可活體內或活體外轉錄編碼該RNA分子的Dna序列，藉此生成反意義RNA 分子。這些]DNA序列可遷入多種載體，該載體倂入適當的RNA聚合酶啓動子，例如τ 7或S P 6聚合酶啓動子〇可進行本發明寡核苷酸之多種改良，藉以增加細胞內安定性與半衰期。可能的改良包括在該分子的5 /端或 3 /端增加核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸外側序列，或者在該寡核苷酸骨架中使用磷酸硫醇酯或2—一〇一甲基切割，而非磷酸二酯酶切割，但不限定於此。 5.7.診斷套組本發明另提供診斷套組。非限定具體實例中，診斷套組包括第一容器，其中含有本發明之P a u A蛋白質、實質上同質多肽、肽片段、融合蛋白質、同系物、或衍生物，其皆能與拮抗天然P a u A蛋白質之抗體特異結合；以及第二容器，其中含有拮抗該抗一 P a uA蛋白質特異抗體之第二抗體。第二抗體較好含有可測定之標幟。這類診斷套組可用於偵測目前或先前早已感染產生P a u A之生物體（例如乳房鏈球菌）的哺乳動物，或者偵測經過本發明疫苗免疫接種之後有血淸轉換的哺乳動物。非限定具體實例中，本發明之診斷套組包括第一容器，其中含有本發明抗體（第一抗體），其可與天然本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X29?公漦〉-49- (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1225518 五、發明説明（47 ) P a uA蛋白質特異結合；以及第二容器，其中含有第二抗體，其可與P a u A蛋白質上的不同抗原決定位特異結合’或與第一抗體特異結合。該第二抗體較好含有可測定之標幟。另一個非限定具體實例中，診斷套組含有一容器 ’其中包括本發明之多核苷酸分子或寡核苷酸分子，其可用於專一地擴大病原（例如乳房鏈球菌）之編碼P a u A 蛋白質的多核苷酸分子。後兩種診斷套組可用於偵測目前被乳房鏈球菌等產生P a u A之生物體所感染的動物。下列實施例僅用於說明，非限定本發明範圍。 6 ·實施例：鑑定與選殖編碼P a uA之DNA分子 6 . 1胺基酸序列分析利用國際專利公開案W〇9 3 / 1 4 2 0 9所述方法，自乳房鏈球菌c 2 1 6株（批號0 5 3 1 9 6 W )純化 P a u A蛋白質，即對無細胞之培養物濾液進行硫酸銨沈澱法，再進行分子大小排阻層析法、然後在1 6 % S D S —P A G E凝膠（Novex，San Diego.GA )分離，及電轉漬至 ProBlott(Applied Biosystems，Foster City，CA)以進行 N 終端艾德曼定序法。切出轉漬膜上對應P a u A帶（估算3 5 KDa)的區域並令其置入ABI 494蛋白質定序儀 (A p p 1 i e d B i 〇 s y s t e m s廠）以進行胺基酸序列分析。爲得知內部序列，如上所述將純化之P a u A於1 6 % S D S -P A G E上分離，並以改良式銀染色法染色（Shevchenko • et al.，1996，Ana.Chem.68:850-858 )。切出 P a u A 帶， c讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) /\4規枱（210X2,97公f ) - 5〇 - 1225518 五、發明説明（48 ) 凝膠切片係以D T T還原，以丙醯胺烷化，再於5 〇 %乙腈/ N Η 4 H C〇3中洗滌並真空乾燥。凝膠切片與5 〇 <體積之0 · 1 V g經修飾胰蛋白酶（Promega ，

Madison，WI)反應，37 °C共置反應一夜。由胰蛋白酶切割而得的肽係於1 5 0 /z z之6 0 %乙腈/

NH4HCO3中，以超音波震蘯萃取兩次，再以Rp 一 HPLC 於 1x250mm Vydac C 1 8 管柱上分離（ West Group,Inc.Sonthboro,MA )。回收 2 2 0 n m 吸光度最高的肽，令其在ABI 494蛋白質定序儀上分析。所得胺基酸序列示於S E Q ID N〇S : 5 — 1 2。N 終端定序後，得到P e p — 1 ( S E Q ID N〇：5 )及 P e ρ —’2 (SEQ ID N 0 ： 6 )，而 Pep -3 至 Pep-8(SEQ ID N〇：7— 12)係得自純化P a u A之胰蛋白酶的酵素處理。

6 · 2自乳房鏈球菌分離染色體D N A 令乳房鏈球菌c 2 1 5株與9 5 - 1 4 0株分別於 3 7 °C之1 0 0毫升靜態腦心灌流培養液（BHI，Difco，〇6^(^，“1)中培養24小時，然後回收（7，7 0 0 \忌， 2 0分鐘）。令濕細胞團塊保存於一 2 0 °C直到使用。洗滌細胞係令濕細胞團塊於5 m < T r i s - H C 1 ( 10mM)/EDTA (ImM) (TE)中再次懸浮，回收（2，0 0 〇 x g，1 5分鐘），再次懸浮於2 m《 Τ Ε。經洗滌之細胞於6 5 °C加熱處理2 0分鐘，於讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標隼局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )以規格（210Χ297公炱） -51 - 1225518 A7 B7 五、發明説明（49 ) 一 2 Ot：冷凍一夜，再添加2 5 0單位木泰溶素（ mutanolysin ) (Sigma廠）溶解之，並於3 7 °C培養1 0 5分鐘。添加雀白酶K(500//g) ( Sigma )，繼續培養3 小時，然後添加S D S至終濃度爲2 % ( w / v )而完成溶解作用。溶解后的細胞於3 7 t培養3 0分鐘，以 T r i s飽和之酚萃取一次，再以酚/氯仿/異戊醇（ 25 : 24 : 1)萃取兩次。沈澱染色體DNA係添加 2 · 5倍體積的無水乙醇與〇 · 1倍體積的3 Μ N a A c，ρ Η 5 · 2，於一 2 0 °C培養2 4小時，離心而成團（15，OOOxg，15分鐘，4°C)。以 7 0 %乙醇沖洗D N A，乾燥，於T E中再次懸浮，以 26Onm吸光度予以定量。 6 · 3自乳房鏈球菌部份潠殖P a u A基因根據純化之乳房鏈球菌P a u A的胺基酸序列，設計其簡倂寡核苷酸（第1圖）。設計寡核苷酸R A 9 ( S E Q ID NO： 14)，藉以雜交至PauA基因中編碼P e ρ — 1第1 1——1 8位胺基酸（SEQ ID N〇：5 )之區域。設計寡核苷酸E R 3 5 (

S E Q ID N〇：15)與 ER36(SEQ ID N〇：16)，藉以雜交至PauA基因中編碼至5位胺基酸之區域，其簡倂程度上有所不同。

Pa uA基因片段進行PCR擴大法，單獨使用寡核苷酸RA9(SEQ ID N〇：14)或與ER35 -52- (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i纸張尺度读川中K國家標噑（rNS ) Λ4規格（210X297公釐） 1225518 A7 _ — B7 五、發明説明（5〇 ) (SEQ ID N〇：15)ER36(SEQ ID N〇：1 6 )合倂使用，其係於5 0 <反應物中進行， (謂先閱讀背而之注意事項再填寫本頁} 反應物含有1 X P c 2緩衝液（Ab Peptides廠，St.Louis ，M〇），2 0 0 // Μ之各類去氧核糖核苷酸，1 〇〇 ρ Μ ◦ 1 各種引子，7 · 5 單位 Klen Taql(Ab Peptides 廠），及 0 · 1 5 單位經選殖 P f u ( Stratagene 廠，LaJolla，CA )熱安定之聚合酶。DNA模板是500ng，其係由乳房鏈球菌c 2 1 6株或9 5 - 1 40株之染色DNA純化而得。擴大反應進行如下：變性反應（9 4 °C，歷5分鐘 );3 0次循環之變性（9 5 °C，歷3 0秒），接合反應 (60 1，歷1分鐘），及聚合反應（72 °C，歷2分鐘 );最後再於7 2 °C延長7分鐘。擴大產物係於2 % ( w / v ) NuSieve GTG瓊脂凝膠（

F M C Bioproducts 廠 Rockland ME)分離而看到。僅使用 RA 9 ( S E Q I D N〇：14)及乳房鏈球菌c216 株所得之D N A作爲模板的反應，得到特定6 4 〇 b ρ產物的擴大。當RA9(SEQ ID N〇：14)與寡核苷酸ER35(SEQ ID N〇：35)或ER 36 (SEQ id N〇：16)合倂用於PCR反應，且用乳房鏈球菌c 2 1 6株或9 5 - 1 40株之染色體 DNA作爲模數’擴大了 6 40 b ρ及5 6 0 b ρ之兩種 _物。此數據建議簡倂的寡核苷酸r A 9 ( S E Q ID

N〇：1 4 )能與p a u a區結合，其結合位置趨近 pep-5 (SEQ id N〇：9)的C終端，ER 度请州中國國家標碑（^T^iT210X 297公f 了~~^~一 1225518 A7 B7 部消 ί: 合 fi 可1 印五、發明説明（51 ) 3 5 ( S E Q ID N〇：15)及 ER36(SEQ ID N〇：1 6 )的標的結合區。自使1用乳房鏈球菌c 2 1 6株及R A 9 ( S E Q ID NO： 14) (64〇bp)或 RA9 (SEQ ID N〇：14)加上ER35(SEQ ID NO :1 5) (640與56〇bp)的DNA之反應所製得的P C R產物予以進一步分析。藉使用引子對 RA9/ER35 (640與56〇bp)擴大乳房鏈球菌9 5 - 1 4 0株之DNA所製得的p c R反應產物’也進一步分析以測知這些菌株的P a u A區域是否類似。乳房鏈球菌c216株之640bp與560bp產物’以及乳房鏈球菌9 5 — 1 4 0株之6 4 0 b p產物在使用適當限制核酸內切酶（Κρη I (RA9)或Κρη I加上 BamHI (RA9/ER35))水解 PCR 產物之後，分別殖入p U C 1 9。所得質體之序列分析確認R A 9 之第二結合位置（S E Q ID N〇：1 4 )係位於寡核苷酸ER35(SEQ ID NO:15)之結合位置的3 >端（其係位於內部P e p - 5的胺基酸1 3 - 5 (SEQ ID 1^〇：9))。由乳房鏈球菌〇216 株與9 5 — 1 40株擴大之640bp DNA片段，經比較其中之3 6 0核苷酸區域顯示，兩菌株之部份 P a u A基因之間，具有極高比例之相同核苷酸（ 99 · 2%)。序列分析顯示，Pa uA 〇RF中存在 E c o R I ，HindIII、及Sa 11之限制核酸內切酶位置，如本紙ί張尺度速用+國國家標f ( (，NS )八4規格（ ml ί-SI — I —>ϋν nn mu nm ϋ-i (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁)

1 T d -54- -55- 1225518 A7 B7 •…‘…♦明.一一《-· 一丨 ~ .».—.111 I.II..H .» ^Ι·—> .—I·»·»··.·.··· ____, ’丨 I ! I ... —— - - τ - I. — , ρ…一一-一麵，：一 X· 一―——- ^ 五、發明説明（52 ) 此排除使用這些酶來構築質體基因組庫，此基因組庫乃設計爲獲得由獨一無二之限制_水解）t段所定位的完整 P a u A區者。 6 . 4織链逛篩選質體基因組庫源自乳房鏈球菌0 2 1 6株與9 5- 1 4 0株之1 0 // g染色體D N A分別以限制核酸內切酶B g 1 I I水解，於3 7 °C歷8小時，以酚/氯仿（2 4 : 1 )萃取，保存於一 20°C。製備l#g質體載體DNA (pUC18 )，係以B a m Η I水解並使用小牛腸磷酸酶，依供應商建議方式去磷酸化（New Eng|and Biolabs，Beverly，MA ) 。將線形，經脫磷酸之載體（Ο · 5 # g )接合至5 // g 經B g 1 I I水解之染色體D N A ，依供應商（Gibco BRL, Gaithers burg, MD)之指示，使用此載體轉形大腸桿菌 D Η 5 α細胞（最大效力）。使用脫脂乳凝膠平板分析法來進行P a u Α活性的測定。爲了篩選大腸桿菌庫，也處理由BH I凝膠（Difco廠 )組成之平板分析材料，其中添加脫脂奶粉（1 % w / v ;〇xoidTM )、牛血纖維蛋白溶酶原（〇 · 〇i5U/ ml; Sigma產品編號P — 9 156)，及胺苄青黴素（ ( 1 0 0 // g / m 1 ； Sigma廠）。進行D N A庫篩選時，也可使用另外添加〇 · ImM I PTG之平板，藉此誘發P U C 1 8之乳糖啓動子。平板分析法可將非特異之蛋白酶活性與血纖維蛋白溶酶原依賴式p a u α活性區分開冰紙张尺度適用中國國家樣律（C，NS ) Λ4規格（ϋχ 297公釐） mu III— nn nil —ΙΒϋ ml —In ——ϋ n (¾先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) ».訂 4 1225518 Α7 Β7 五、發明説明（53 ) (讀先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 來，其係在對照平板中省略血纖維蛋白溶酶原。此種改變係用於確認對脫脂乳之血纖維蛋白溶酶原依賴式切割作用，藉此1自D N A庫篩選中獲得預測爲陽性的純系。選出在上述脫脂乳平板上產生淸澈區之經轉形大腸桿菌DH 5 α株的單離物，作進一步分析。第2圖顯示一個被乳房鏈球菌9 5 - 1 4 0株之D Ν Α轉形的這類單離物之範例。篩選並選殖純化出含有乳房鏈球菌c 2 1 6株 DNA之一個單離物，以及含有乳房鏈球菌9 5 — 1 4 0 株D Ν A之一個單離物，確認其表現出血纖維蛋白溶酶原依賴式P a u A活性的能力係根據個別菌落在無血纖維蛋白溶酶原之脫脂乳平板上生長后，卻無法產生淸澈區的情形。對血纖維蛋白溶酶原之依賴性的確認，係將每個單離物生長於含有胺苄氰黴素（1 〇〇#g/mZ )之Luria肉汁（Difco )，再將小份未過濾之培養懸浮液散滴在Todd-Hewitt 凝膠上（Becton-Dickinson and Co.，Cockeysoille，MD) ，該凝膠添加了脫脂奶料粉（1 % w / v )，有或無〇 · 0 1 5U/m <牛血纖維蛋白溶酶原。這些單離命名爲P z 3 1 8，其表現乳房鏈球菌c 2 1 6株之P a u A •，及命名爲Pz319 ，其表現乳房鏈球菌95 — 140 株之P a uA ;其代表性質體命名爲p ER3 1 8及 P E R 3 1 9。 6 · 5 H u A編碼區夕初步分析根據經P C R擴大之內部6 4 0 b p D Ν A片段所做本紙張尺1¾州+國_家標缚（rNS ) 規袼（210X 297公嫠)Γ56- 1225518 Α7 Β7 五、發明説明（54 的核脊酸序列分析’該D N A片段對應乳房鏈球菌 c 2 1 6株之編碼P a uA之基因的一部份，由DNA庫篩選所得士質體中的相同嵌入物，再藉由P CR確認。因此在PCR中使用PER318與pER319作爲模板，單獨使用pauA衍生之引子RA9 (SEQ ID NO* 14)，或者 RA9 與 ER37 (SEQ ID N〇：17)或 ER40(SEQ ID NO： 19) 組合使用。5 0# 1反應混合含有lxPC2緩衝液、 200#M各種dNTP，1〇〇ρΜο 1各種引子、 7·5單位K1enTaql聚合酶，以及·〇15單位之經選殖P f u聚合酶。合成方法進行如下：變性（9 4 °C，5分鐘）；3 0次循環之變性（9 5 °C，5秒）；接合（6 0 °C，1分鐘）·，與聚合（7 2 °C，2分鐘）·，最後在7 2 °C延長7分鐘。全部反應成功擴大了預期爲 64〇bp之產物（藉由RA9擴大）’500bp之產物（藉由RA9/ER37擴大）’及300bp之產物 (藉由RA9/ER40擴大）’這些DNA片段係由已知之p a u A基因的部分序列推測得知。此數據明顯指出 pER3 1 8與pER3 1 9中存在的嵌入物能夠編碼具有功能活性的P a u A。爲了更完整鑑知乳房鏈球菌c 2 1 6株與9 5 -1 4 0株p a u A區的結構，於明尼蘇達州聖保羅市之高階基因分析中心，令質體PER3 1 8與PER3 1 9分別進行自動D N A序列分析（A B I型號3 7 7，Applied — -- (許先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 訂 ··· 氏張尺度適川中國國家標石（CNS ) Λ4規格（210x297公釐） -57- 1225518 A7 一―——________________________________________—___________________ B7 五、發明説明（55 )

Biosystems 廠）。寡核苷酸 ER40 (SEQ ID N 0 :19)與ER42(SEQ ID N〇：21)係衍生自事先^確認過的p a u A部分序列，該寡核苷酸係用於決定此6 4 0 b p區向外的序列。當與6 4 0 b p之部分基因序列組合時，此額外定序反應會決定完整pauAORF之最初序列，以及緊鄰經選殖p a u A基因的區域。此外，也使用對載體Ml 3特異的前進物與反向引子來決定選殖之乳房鏈球菌D N A區的終點。分析這些序列顯示， P ER3 1 8與p ER3 1 9的經選殖嵌入物中有基因，該基因係編碼與肺炎鏈球菌H e xA與H e X B蛋白質有高度相同性之蛋白質，如第3圖所示。分布多種原核與真核生物屬（包括人類）的He xA與He xB蛋白質，分別與Mu t S與Mu t L同系物高度保留。He xA與 H e X B蛋白質在肺炎鏈球菌之轉形與D ΝΑ複製過程中參與修補未配對D ΝΑ。有趣的是，當在大腸桿菌中過度表現時（prudhomme，etal.之 1991，J.Bacteriol.l73:7196-7 203)，HexA提供明顯負向的表現型，如此導致自動突變率的增加。 6 · 6乳房鏈球菌P a u A基因之特異P C R擴大反應利用質體pER318與pER319進行經PCR 擴大，P a uA的6 4 0 b p區及該區向外序列之初步定序結果，可用於設計出寡核苷酸引子，藉以專一地擴大直接得自乳房鏈球菌染色體DNA之完整P a u A基因。此 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度诚用中國國家標嗜（（、NS ) Λ4規格（210X 297公犛） -58- 1225518 A7 _ B7 五、發明説明（56 ) (部先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 計劃較好是根據需要而排除定序錯誤，此錯誤係因爲在大腸桿菌中選殖完整P a u A時可能產生之突變作用。此種特別顧慮4系鑑於其它完整鏈激酶（Streptokinases )於大腸桿菌之已知毒性，如文獻所載（Estrada，et al.，1992 ，Biotechnol 10 :1 1 3 8 — 1 1 4 2 )，且鑑於報導過的 H e X A於大腸桿菌之不明顯表現（Prudhomme，et al.，1991 ，如上）。故使用鄰接完整P a u A基因兩側之寡核苷酸E R 4 5 ( S E Q ID N〇：24)及 ER46(SEQ ID NO:25)專一地擴大乳房鏈球菌c216株及 95 — 140株之編碼PauA的1 · 18Kb區。對每菌株進行三次P C R擴大反應。於1 〇〇 //<樣品體積反應混合液含有20〇ng純化之染色體DNA， 1XPC 2 緩衝液，200//M 之各種 dNTP，ΙΟΟρΜο 1 引子ER45(SEQ ID N〇：24)，l〇〇 pMol 引子 ER46(SEQ ID NO： 25)，及7 . 5 U Klen Taq 1與0 · 1 5U選殖之P f u熱安定聚合酶。擴大反應之進行如下：變性（9 4 °C，5分鐘 );3 0次循環之變性（9 5 °C，3 0秒），接合（5〇 °C ’ 1分鐘），及聚合反應（7 2 ，2分鐘）·，最後延長7分鐘於7 2 °C，藉此令標的完整P a uA基因區之擴大反應完全。擴大反應後，由三次重複樣品分別取得之等份（70//< ，2 · 8// g)匯集在一起，以瓊脂凝膠電

泳純化1 · 1 8 K b產物並以玻璃乳基質（Gene CleanTM

本纸张尺ϋ用中國國家標碑(C'NS ) A4C# ( 2)0X 297^1 ) ^〇T 1225518 A7 B7 五、發明説明（57 ) ，Biolol，La Jolla，CA )予以萃取’然後直接定序分析’其係於A B I廠之自動DNA定序儀（Lark Technologies 1门0.屮01^61丁\)上進行〇71 2 3〇6(^乂終止反應。合成寡核脊酸引子 API (SEQ ID N〇：13)、 ER37 (SEQ ID NO： 17). E R 3 9 (SEQ ID N 〇：18) 、ER4〇（SEQ ID N〇： 19)、ER41(SEQ ID N〇：20)、ER 4 2 (SEQ ID N〇：21)、E R 4 3 (SEQ ID N〇：22)、ER45(SEQ ID N〇： 24)及 ER46(SEQ ID N 0 ： 2 5 )(第 1 圖）係用於分析乳房鏈球菌c 2 1 6株與9 5 — 1 4 0株擴大產物之兩股D N A的序列。乳房鏈球菌c 2 1 6株之 1.18Kb區的核苷酸序列示於SEQ ID N 0 ： 1。乳房鏈球菌9 5 - 1 4 0株之1 · 1 8 K b區的核昏酸序列示於S E Q ID N〇：3。 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁擎裝--- • nm-、 nm mV eilB 、vxi 1 · 7 P a uAORF之分子分析 2 乳房鏈球菌c 2 1 6株之P a uA〇RF係由SEQ ID N〇：1之第1 2 0位核苷酸延伸至第9 8 0位核苷酸，其係編碼如S E q id N 0 ·· 2所示之具有2 3

6個推衍胺基酸之蛋白質，此蛋白質具理論分子量約爲 33 ’ 419道耳吞。乳房鏈球菌95 — 140株之 PauAORF係由SEQ ID N〇：3之第121 位核苷酸延伸至第9 8 1位核苷酸，其編碼如S E Q 本紙张尺度诚用中®國家標磾（（，NS ) Λ4規格（2] 0X 297公釐） 1225518 A7 B7 ----- * I,--.................... . - _ 五、發明説明（58 ) ID N 〇 : 4所示之具有不同之2 8 6個推衍胺基酸的蛋白質。根據Ν -端序列分析，兩個胺基酸序列之第1 -2 5位胺1基酸皆顯示會在天然P a u Α成熟之過程中被除去。與此一致的發現是，此2 5個胺基酸的肽（ 2 · 7 6 7 D a )是厭水性，帶正價，具有訊號序列之特徵(VonHeizn,1 985，J.Mol.Biol.1 84:99-1 05 )。推測之雙向轉錄終止子（第4圖）係位於c 2 1 6株序列（S E Q ID N〇：1)中第978 — 1〇88位核苷酸處， PauAORF與相對的H e X A 〇R F之間預測具內轉對稱性之區域會形成第1 0 1 5至1 0 3 2位核苷酸及第 1 0 5 4至1 0 7 1位核苷酸之莖一套環結構的鹼基。此外，一個幾乎完全相同之推測的雙向轉錄終止子係位於 95 — 140株序列（SEQ ID N〇：3)中第 979 — 1089位核苷酸處，PauAORF與相對的 HexAORF之間。預測具內轉對測性之區域會形成第 1016至1033位核苷酸及第1055至1072位核苷酸之莖一套環結構的鹼基。這些莖一套環結構在對應 m R Ν A中推測出之關連自由能約爲一 1 9 Kcal(Tinoc〇，et al.，1 973，Nature New Biol，246:40-41 )·。序列分析顯示，乳房鏈球菌c 2 1 6株與9 5 -1 4 0株之間的1 · 1 8 K b片段區域中有高度相同的核苷酸。此區域內核苷酸與其編碼胺基酸之間的差異示於如下表1。 _______________________________^ ，冢中國( (、NS ) Λ4規格（2】0 X 297公嫠） _ 6彳_ (謂先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 一裝. 1225518 五、發明説明（If) 表1 DNA鹼基菌株蛋白質胺菌株對編號 c216 95-140 基酸編號 c216 95-140 120 a T b _ • 336 G A 73 D N 463 A G 115 Q R 490 A G 124· Q R 751 T G 211 L R 838 A C 240 Q P 843 C G 242 H D 896 A G _ 982 G T _ _ 一 1043 C A • . 1090 G A 嫌 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •I鬚· a單一鹼基插入/刪除反應，係出現在P a u A A T G開始密碼的緊縮上游。 b推測之〇R F中，核苷酸變化不明顯或不存在。 1«· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -L a, 1225518 Α7 Β7 五、發明説明（60 ) 7 ·實施例：重組P a u A於大腸桿菌中表琚 7 · 1耩築表現質體 (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁設計寡核苷酸引子E R 4 3 ( S E Q ID N〇： 22)及 ER45(SEQ ID N Ο ： 2 4 )(第 1 圖），藉以專一地擴大編碼大腸桿菌9 5 - 1 4 0菌株 P a u A全長蛋白質之完整核苷酸序列。此序列也包括上述第6、7節所描述之天然的推測之轉錄終止子區，以及 Hex A基因之3/小部份（SEQ ID N 0 ： 3 ，第121—1 ，181位核苷酸）。再者，引子ER4 4 ( S E Q ID 1^〇：23)與丑尺45(3£(3 ID NO:24)係用於專一地擴大PauA基因之 5 /截斷部份，其缺少預期之編碼訊號序列（胺基酸1 -25)。此截斷之DNA片段含有一般3/區，爲第 4 好滴部中头桴卑局Μ Η消於合仍私印來 1 9 6至1 1 8 1位核苷酸，但預測其可編碼在大腸桿菌中表現之後，會停留在細胞質之P a u A蛋白質。重複進行三次PCR擴大反應，每100#彡反應中使用200 n g之純化染色體DNA，該DNA係得自乳房鏈球菌 9 5 — 1 4 0株。樣品也含有1 X P C 2緩衝液、2 0 0 //M之各種dNTP、ΙΟΟρΜοΙ之各種引子、 7 · 5 U KlenTaql聚合酶及〇 · 1 5 U經選殖之P f u聚合酶。擴大反應之條件如下：變性（9 4 °C，5分鐘）； 3 〇次循環之變性（9 5 t：，3 0秒），接合（5 0 °C， 1分鐘）、及聚合反應（728，2分鐘），最後於72 °C延長7分鐘。 ·$紙浓尺度遶川中國國家標碑（公釐了 7β3- 1225518 A7 B7 五、發明説明（61 以ER43 (SEQ ID N〇：22)加上ER 4 5 ( S E Q ID 1^〇：24)，或丑尺44(

SEQ !ID N〇：23)M1ER45(SEQ ID N〇：2 4 )進行擴大反應之後，分別匯合此三次重複之樣品，其係將每份反應混合液各取7 混合，達終體積爲2 1 # <。合成之DNA片段係於l%iw/v )瓊脂上分離，純化1，0 0 1 b p產物（ ER44/ER45)與 1 · 073bp 產物（ER43 / E R 4 5 ) ( JetSorb™,Geno Med,Research Triangle

Park，NC)。以Kpnl與Xbal水解經純化之D N A後，將約 Ο · 3#g之片段接合至Ο · 5//g經Kpnl加上

Xb a 1切割且去磷酸化之PEA1 8 1載體DNA。根據 Hanahan 法（ 1 983，J.Mol.Biol.l 66:557)，將重組質體轉形至勝任之大腸桿菌T A P 5 6株細胞中（Phizer公司持有

之菌株）。令細胞生長於lml S〇C培養基（Gibco BRL 廠），於3 0 °C歷7 5分鐘。轉形體係於S 3 0 °C生長與維持，爲了防止因爲對溫度敏感之c 1 8 5 7抑制子失去活性而致誘發P !啓動子。以此方式分離的兩菌株予以保留，爲了要表現重組P a u A。P z 3 3 0菌株含有質體 PER330，其表現全長PauA基因，該基因是由引 . ；子ER4 3/ ER4 5擴大染色體DNA所得者。Pz 332菌株含有質體PER332，其表現截斷型（訊號肽被刪除）P a u A基因，此基因是以引子 ER44/ER4 5進行擴大反應所得者。讀先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) tm ml nm —ϋ nn m 訂本紙張尺度4州中國國家標蹲（（、NS ) Λ4規格（210X297公嫠） -64- IM5518 对Μ部中次掠卑肩負JT-消费含竹私印$ Α7 五、發明説明（62 ) 另一種範例中，使用引子ER43/E R45或ER 44/E45進行乳房鏈球菌9 5 - 1 40株染色體 DNA擴大反應所得的PCR產物，，與pUC19至 lac Ζ α肽以同架構方式殖入。製得質體，分別命名爲PER326與pER328，其分別編碼全長與截斷型（訊號肽被刪除）P a u A，且此質體導入大腸桿菌 DH5a株，分別製得菌株Pz 326與Pz 328。 7 · 2重組PauA (rPauA) 之表現測試7 · 1節所述四菌株表現全長重組P a u A蛋白質（r P a u A )即具有訊號序列者）（P ζ 3 2 6、 Pz330)或刪除訊號序列之rPauA(Pz328 、P ζ 3 3 2 )的能力。夜間起動裝置培養各菌株，其係生長於含有胺苄青黴素（1 0 〇mg/L)或康黴素（ 5 0 m g / L )之Luna肉汁的震盪燒瓶中，然後1 : 1〇稀釋至新鮮生長培養基中。4 - 6小時後，添加0 · 5 mMIPIG(Pz326、Pz328)或將溫度由 30°C 升高至 42°C(Pz330、Pz332)，藉以誘發培養物。回收全細胞團塊，懸浮於Laemmli溶解緩衝液，以S D S — P A G E與西方轉漬法分析溶解物。比照製備乳房鏈球菌9 5 - 1 4 0菌株之細胞團，其係於Β Η I 肉汁培養物中生長2 2小時且以西方轉漬法分析以作爲比較。於14%聚丙烯醯胺凝膠上分離誘發前及誘發後之全 m am— m^i m Maw mu —am nm MMmMmmmKf —am m· ml K·——· 一 . V flm ml aum 1 I (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度诚州中國國家標缚（（:NS ) Λ4規格（210X 297公釐） -65- 1225518 A7 B7 五、發明説明（63 ) 細胞團樣品，以考馬斯亮藍染色（第5圖），或者以對抗乳房鏈球菌c 2 1 6株之天然P a u A所誘生之鼠單株抗 (讀先閲讀背而之注意事項再瑣寫本頁) 體EC —丨3進行西方轉漬法（第6圖）（參見W 0 9 3/ 1 4 2 0 9以得知有關M a b E C — 3之細節）。雖然所示實例並非最佳之表現狀態，在4 2 °C誘發下，使用經轉形之大腸桿菌菌株Pz 330及Pz 332，皆令明顯生產全長r P a uA與訊號序列被刪除之r P a uA。取一小部分經處理之r P a u A，於菌株P z 3 3 0中測定（第6圖、第7行），結果顯示乳房鏈球菌P a u A之異源訊號序列可被大腸桿菌之分泌胞器辨認且處理。但在P z 3 3 0中誘發重組蛋白質表現會有害細胞生長，顯示過度表現全長r P a u A會干擾異源大腸桿菌宿主內的正常向外輸送過程。 7.3 r P a u A之酵素活性測定I* P a u A活性係使用色原分析法，其測定牛組織纖維蛋白溶酶原的活化情形，詳述如下。分析由上述大腸桿菌培養物（Pz326、 Pz328、 Pz330、 P z 3 3 2 )所得之全細胞團塊等份與來自乳房鏈球菌 9 5 - 1 4 0菌株之全細胞團塊等份。異源宿主所表現之重組蛋白質的活性與相對量一致。菌株P z 3 3 2之最高力價（表2 ) ^紙張尺度適用中國國家標坪（(獨7八4規—格（210X 297公釐) :ϋ: 1225518 A7 B7 五、發明説明uw 表2 菌株 OD65〇a 力價b 乳房鏈球菌95- 1 40株 0.274 1.0 Pz326 0.811 23.3 Pz328 0.579 5.3 Pz330 0.240 1.0 Pz332 0.396 >128 樣品於E L I S A盤中初次稀釋下的光學密度力價之計算如教科書所載。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1225518 A7 B7 五、發明説明（65 ) 色原分析法進行如下：進行色原分析法之緩衝試劑係由 TT 緩衝液（〇 · 1% Tween 80,5 0mM Tns-HCl，pH8.0 ) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 與 NaT 緩衝液（1 · 77M，NaCl ，52mM， Tris-HCl，pH 7 · 0 )組成。這些緩衝液在室溫是安定的’ 故在使用前可予室溫保持高達一個月。尿激酶（Sigma產品編號U - 8 6 2 7 )之操作母液係以加水溶解而製得’並將其保存於- 7 0 °C。冰凍之操作母液的濃度是0 · 5 U / m < ，使用T T緩衝液以1 : 1 0稀釋爲0 · 0 5 1 U / m <之開始濃度。以Super Q水溶解牛組織纖維蛋白溶酶原（Sigma產生編號，P — 9 156)至濃度爲1 · 5 U/m<保存於—70°C。受質包括D— I 1 e_Phe 一 L y s對硝基醯替苯胺（Sigma產品編號I - 6 8 8 6 ) 及D — V a 1 — L e u — L y s對硝基醯替苯胺（Sigma產品編號 V — 0882 ; Fluka 產品編號 94680，Fluka

Chemical公司，Ronkonkoma，WY )。製備這些受質之操作母溶液係令其加水溶解爲1 m g / m <並保存於一 7 0 °C

Immulon 2 分析盤（Dynatech Laboratories Chantilly，VA) 之製備如下：將T T緩衝液（2 0 m < )與牛組織纖維蛋白溶酶原（2 0 m <)事先均分至Immulon 2分析盤。V 型底之分析盤中（Dynatech Laboratories廠），加入成排的B - Η。培養基對照組，正對照組，及樣品係加至A排。樣品、培養基對照組與正對照組皆以2個孔重複進行。適當孔中，加入1 0 0 對照或1 0 0 樣品，然後順著分析盤連續稀釋，最後一排取出5 0 丟棄。自V型底 i紙張尺岌遶用中國國家標準（（、奶）Λ4規格（2]0X 297公漦) .gg . ~~ 1225518 A7 B7 ------------ ----------- ------------...— ________________ …卜- —- 一厂——丁「— — ______________ 五、發明説明（66 ) 之分析盤的每個孔取出1 0 //<，將其轉移至對應之 Immulon 2分析盤，此盤含有事先等分之T T緩衝液與牛組織纖維蛋伯溶酶原。充分混合，於3 7 °C培養2小時，令牛組織纖維蛋白溶酶原活化。分析對照組爲經尿激酶調節之牛組織纖維蛋白溶酶原的活化作用。將受質（D — Va 1 - L e u - Ly s對硝基醯替苯胺或D- I 1 e — Ph e - Ly s對硝基醯替苯胺）加溫至室溫。製備分析受質，係使用N a T緩衝液將受質母液稀釋至400//g/m< (1 : 2 · 5倍稀釋），每孔並加入1 0 0 之該分析受質，分析盤加蓋並混合。令分析盤於3 7 °C靜置反應2分鐘。活性P a u A會催化組織纖維蛋白溶酶原轉化爲組織纖維蛋白溶酶，後者依序自對硝基醯替苯胺切割出三肽，再以A 4 0 5測定。判讀分析盤係使用E L I S A盤讀機（Moleaular Devices 廠，Palo Alto,CA )，其配有 Soft Max PRO 第 1.2.0版軟體（Molecular Devices廠）。混合分析盤樣品，測定4 0 5 n m波長之光譜吸光度。有效測試之指標爲正對照組有介於1 · 30及1 · 50〇· D之間的A405吸光度。爲了要評估力價（稀釋因子的相反物），繪出樣品稀釋連續性，其使用方格紙表示呈對數表示之稀釋度。根據 \ 樣品與正對照組截値交叉的點，計算出確實力價。測定截値係使用5 0 %正對照組（0 · 〇 5 1 U /m <之平均〇· D。例如，若樣品在〇 · 0 0 7與截線交叉，其稀釋因子將是1/1 42 · 86，則其力價將表示成 -69- (讀先閱讀背而之注意事項再瑣寫本頁) 本紙张尺度这川中國國家標噑(CNS ) Λ4規格（210?297公餐) 1225518 A7 B7 _____________ " ^一， —_·丨一— —~— …… 羽 <_ —__------------ — 五、發明説明（67 ) 1 4 2 · 8 6。若樣品於〇 · 〇 1 5與截線交叉，則其稀釋因子爲1/66 · 67且力價爲66 · 67。 8 ·實施例：P a u A肽片段之酵素學與觅疫學評定 8 · 1重組G S T - P a u A肽之表現設計寡核苷酸引子ER74(SEQ ID N Ο ： 26)及 ER75(SEQ ID N 0 ： 2 7 )，藉以專一地擴大P a uA基因，此基因包括被編碼之P a uA 第2 7 - 2 8 6位胺基酸的區域。此區域對應至成熟（分泌型）P a uA之第2 - 2 6 1位胺基酸。重複進行兩次 PCR合成，其每1〇〇μ <反應液中使用250ng經純化之乳房鏈球菌9 5 - 1 4 0株染色體D N A。樣品也包括1 X P C 2緩衝液，2 0 0 // Μ各種d N T P， ΙΟΟρΜο《各種引子，7 · 5單位K1 en T a q 1聚合酶及0 . 1 5單位經選殖之P f u聚合酶。擴大條件爲：變性（9 4 °C，5分鐘）；3 0次循環之變性（ 9 5 °C，3 0秒），接合（6 0 °C，3 0秒）及聚合（ 72°C，1分鐘）；最後於72 °C延長7分鐘。擴大反應後，匯合兩批樣品且純化8 1 5 b p片段（Qia QuickTM套組，Qiagen，Santa Cladta，CA )。以 Xhol 與 Notl 切割經純化之DNA後，將片段殖入p GEX5 X - 2或 pGEX5x — 3 載體 DNA ( Pharmacia Biotech 廠，Piscataway，NJ )。所生成的重組質體，PER354與 P E R 3 5 5，分別含有其編碼之乳房鏈球菌9 5 -_ — Ύ · _ -70- (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺i適州中國國家標率（rNS ) Λ4規枱（2】0Χ297公嫠） 1225518 A7 B7 五、發明説明（68 ) 140株之PauA(SEQ ID NO:4)第27 - 2 8 6位胺基酸之編碼區域，其置於表現載體編碼之麩胱甘肽S 1—轉移酶（G S T )的N端反向。修飾質體P E R 3 5 4以刪除成熟P a u A之 C〇Ο Η終端區域，但保留其與編碼G S T序列之載體融合處的架構。構築生產成熟P a uA或成熟P a uA之Ν 端片段（即刪除羧基端）的質體，係首先修復G S T -P a u Α融合點的架構，其係以X m a I與A g e I切割 PER354而得PER356。此質體表現26 KD a GST肽，其被轉譯而融合至被編碼之P a uA的第2 8 - 2 8 6位胺基酸，此產物表示完成熟P a uA。刪除成熟P a u A之羧基端，係以S p e I、N r u I、或Hi nd I I I進一步處理質體，再以No t I切割。適合產生鈍端之Klenow片段經過處理後，再次接合質體而分別產生質體PER363、 PER364及PER 365。這些質體表現26KDa GST肽，其分別融合至被編碼之PauA的第28 — 103位、第28 -1 7 0位及第2 8 - 2 0 8位胺基酸，如表3所示。進一步修飾質體PER3 5 5，藉以刪除P a uA$ NH2或C〇OH -終端區，但也保留其與被載體編碼之 G S T序列融合點的架構。刪除Ν Η 2 —終端，係僅以 Sa 1 I ，或 Sma 1 I 加上 Nrul ，切割 pER 3 5 5，再次接合後，修補了 G S T — P a u A融合接點。所生成的質體，PER358及PER359 ，表現分本紙张尺度適W中R國家標坪（rNS ) Λ4規格(]10Χ297公 -71 - (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) -裝· 、11 it 1225518 A7 B7 五、發明説明（69 ) 別融合至被編碼之p a uA的第1 〇 4 - 2 8 6位及第 1 7 2 — 2 8 6位胺基酸的GST肽。代表P a uA內部肽片段的1兩個質體係依序以N r u 1或H i n d I I I處理，再以N o t I切割，Klenow處理及再次接合而生成的。這些重組質體，PER366及PER367，分別表現融合至被編碼之P a uA第1 〇 4 - 1 7 0位及第 1 0 4 — 2 0 8位胺基酸的G S T肽。最後，以Hindi II力口上No t I切割pER3 5 9，再以Klenow處理及再次接合，生成一質體，其能夠表現融合至P a u A小片段（被編碼Pa uA第1 72 - 208位胺基酸）的GST。此質體命名爲PER3 6 8。被編碼的片段與P a uA特異肽之預估分子量示於表3，其中該P a u A特異肽係與 G S T融合之融合蛋白質。 -72- (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度递州中國國家標蟫（（'NS 721 ()X 297^f ) 1225518 A7 B7 五、發明説明（/。) 表3 質體或菌株a PauA肽片段b 胺基酸編號（Pa 估計之分子量^ uA) PER356 28-286 259 30.5 PER363 28-103 76 8.8 PER364 28-170 143 16.7 PER365 28-208 1·81 21.1 PER358 104-186 183 21.7 PER359 172-286 115 13.7 PER366 104-170 67 7.9 PER367 104-208 105 12.3 PER368 172-208 37 4.3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •I裝· 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 a菌株命名與質體相同，但在質體編號之前以P z代替 p E R。 b對應SEQ ID ^^〇：4所示被編碼？311人蛋白質之胺基酸編號。。表示融合蛋白質中P a uA部份的分子量，GST約2 6 K D a 。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -73 - 1225518 Α7 Β7 --------------------------------------------------------- ^ _____________________ ______ 五、發明説明（71 ) (¾先閱讀背ν£之注意事項再填寫本頁) 除了被P ER3 6 3編碼的，所有GST— P a uA 融合蛋白質係於大腸桿菌中表現，並根據廠商（ Pharmacia )建議，使用親和性層析法純化。由於表現 p E R 3 6 3所編碼的蛋白質會在大腸桿菌中形成包涵體，這些蛋白質凝集物係以溶菌酶將細胞溶解後，再予純化。添加 10 倍體積 2XRIPA/TET (5 : 4v/v )之前，令細胞靜置冰上1 0分鐘。2 X R I P A含有 2 0 m M Tris(pH7.4)，0.3M NaCl，2%脫氧膽酸鈉，及2%(v/v) Igepal CA-6 30 °TET 緩衝液含有〇 . 1 M Tr i s (pH 0.8) ，50mM EDTA，及 2%(v/v)

Triton x_ 100 〇震盪經懸浮之細胞混合液，靜置冰上5分鐘，再經超音波震盪直到懸浮液不再有黏性。回收包涵體係藉由離心（1 5，0 0 0 X g，2 0分鐘），以水再次懸浮，保存於—8 0 °C。 8 . 2藉蛋白水解切割法產生P a u A片段令純化自乳房鏈球菌9 5 — 1 4 0株約1 3 m <之天然 PauA (批號 9700710A)，以 0.55 mg/m之之濃度對50mM Tr i s ，pH8 · 8透析於4 °C。保留物利用Y Μ 1 0膜與攪拌磁棒濃縮至約 2 · 5m。最終蛋白質濃度是2 · 64mg/m< 。令此濃縮物於室溫下，以1 2 0單位凝血酶（Boehringer Ingelheim廠）處理3天，水解產物冰凍於一 2 0 °C。自水 ί、紙張尺度诚用中國國^^了(他)八4瓦格（210^297公釐) .74 - 1225518 A7 B7 五、發明説明（72 ) 解產物純化約161^〇3片段，係藉助3>^61^6乂75管柱 (16 /軟碟 6 0) ( Pharmacia 廠）完成，2m < 水解產物饋至該管柱。回收適當餾份，且根據S D S — PAGE分析而匯合。終蛋白質濃度是0 · 165 m g / m < ，於2 · 5 m <中。N —終端定序結果證實此 1 6 KD a代表P a uA竣基端之一半區。所得序列（ KRVEEPITHP ) ( S E Q ID N〇：28)係由乳房鏈球菌9 5 — 1 40菌株所編碼的P a uA之第1 49位離胺酸開始的。因此，此蛋白水解所衍生的肽以 PauA149 — 286 表示。 8 . 3 P a u A肽片段之酵素活性表3所示之9種GST - P a uA融合蛋白質及上述 8 · 2節中描述之蛋白水解的P a uA片段（經潢部中戎標缚局员-X消贽合竹私印來 (讀先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) P a u A 1 4 9 — 2 8 6 )與天然P a u A比較酵素活性，其係利用基本上如上述7 · 3節說明的色厚分析法。純化之 03丁一卩3 1!八28-286融合蛋白質（力價=3 448 )之酵素活性與天然P a u A之酵素活性（力價=

3 2 5 6 )近似，但其它1 P a u A肽片段無酵素活性。 P a u A特異活性之計算，係將力價除以經純化蛋白質製劑中之P a u A特異蛋白質的量。進行此校正，天然 PauA之特異活性是5 · 9色厚單位/ //g，而GST 一 P a u A 2 8 — 2 8 6之特異活性是1 · 4。此數據顯示，雖然重組製備之GST - P a uA比純化之天然p a UA 本紙張尺k埚用中國國家標垮（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -75- 76- 1225518 Λ7 ___________ B7 -----— — „ -； . —------…-·* -----------L— -------------— - I, 丨丨丨 _____ 五、發明説明（73 ) 有稍低的酵素活性，其確實具有顯著的酵素活性。 8 . 4鼠;之免疫反應的鑑定 8.4.1以P a u A肽片段免疫鼠利用鼠類的免疫模式，評估上述製備之P a u A肽片段的免疫原性。簡言之，各爲10隻Ba lb/c母鼠（ 1 6 - 1 8克體重）所組成的實驗組在第0、2 1、及 42天接受免疫接種。在實驗後第0、21、35、及 5 6天取得血液樣品。根據實驗組別將這些樣品的血淸匯集，以E L I S A分析法評估其對固相上之天然純化 P a u A的反應性且以血淸中和法評估其對天然純化 P a u A產生色原之活性。天然P a u A與多種肽片段組成的配方係爲水包鯊烯之乳載劑型式，其中含有QuilA(Superfos廠）作爲免疫刺激劑，其含量對鼠無毒性。蛋白質調配成100// 1劑量含3-5// g 蛋白質且用於皮下注射。對照用之無抗原疫苗係由 Dulbecco’s PBS(DPBS ;Gibco-BRL )組成，其含有載劑 / 免疫刺激劑，但無抗原組份。 8.4.2 P a u A肽片段之免疫原性分析上述免疫實驗所得之多種鼠血淸，得知P a u A 特異抗體是否生成且確認所生成抗體的特性。使用 P a u A特異igGELISA測定血淸特異性。在經過蛋白水解之P a uA蛋白質片段（P a uA149 — 286)及各種

孓紙張尺k.这川中國國家標擎(規格（210X 297公釐"T -------^_41^ 裝— 讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 訂 1225518 A7 ___ B7 五、發明説明（74 ) GST— P a uA融合蛋白質之免疫接種後，使用 P a u A特異IgGELISA測定血淸特異性。Immulon II分析盤（Dyndtech廠）每個孔中加入1 〇〇 // <純化之天然 PauA(描述於國際專利公開案W093/14209 ，本文中稱爲 ''鏈激酶〃）（1 · 8 m g / m < ，於 PBS中），於4 °C靜置反應一夜。倒空分析盤內容物，令盤吸乾。每孔加入2 50// <含有1%聚乙烯醇（87 —8 9 % 含水量；Aldrich Chemical Company，Inc.，Milwaukee ，WI)之 PBS(1%PVA/PBS)，將盤阻斷，於 3 7 °C靜置反應1小時。再次倒空分析盤並吸乾之。實驗血淸係以1:100稀釋於1%PVA/PBS ，再以三倍連續稀釋，留1 0 0 於樣品孔中。正對照組是PauA特異單株抗體，EC - 3，此抗體係使用固定化之蛋白質G予以親和性純化。將此抗體稀釋成2 //g/m〆，於 1%PVA/PBS 中，再加入 100

該抗體至適當孔。負對照組由匯集之事先免疫過的鼠血淸組成，該血淸稀釋1 : 100於1%PVA/PBS 。將1 0 0 負對照血淸加至適當孔。加入實驗樣品與對照樣品後，將分析盤大致黏封以進行混合，再置於3 7 t：歷1小時。以0 · 0 5 % Tween 2 0 / P B S淸洗樣品孔5次，其係利用血動微孔盤洗滌器（機型 EL403 ; B I〇一TEK Instruments 廠，

Winooski，VT )。測定鍵結其上的抗體係將1 0 0 <經共軛的抗—鼠—I gG (H&L 鏈，1 · 〇mg/m< ， u議— - ]-—-Πη Ί in-i-m— 1——-.. | -- |, ........... --------- (¾先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) -訂本纸張尺度適用中國國家標嘩（CNS ) Λ4規桔（210X 297公釐） -77- 1225518 A7 一 ___ B7 五、發明説明（75 )

Kirkegaard &Perry Laboratories,Gaithersburg，MD)力口入，該 IgG 以 1 : 10，000 稀釋 1%PVA/PBS 中。大致黏封吩析盤以利混合，置於3 7 t歷1小時，如上述予以洗滌。將 1 0 0 < A B T S ( Kirkegaard &Perry 廠）加入分析盤，然後在室溫顯色1 5分鐘。在 4 0 5 / 4 9 0 n m判讀分析盤，其使用Thermo Max盤判讀機（Molecular Devices 廠）以及 Soft Max P R 〇 1 · 2 版程式（Molecular Devices廠）。計算IgGELISA力價，其爲提供5 0%正對照組DD 4 0 5/4 9 0値時之稀釋度的倒數。經潢部中次摞導扁貝+工消費合竹私印f (許先閱讀背而之注意事項再瑣寫本頁) 如表4所示，各以9種GST — P a uA融合蛋白質中的一種免疫的鼠會產生P a U A特異免疫球蛋白G。以 GST— PauA28-286、GST-PauA104 — 286 或GST— P a uA28 — 17Q免疫者所誘生的IgGELISA力價，與天然P a uA誘生者相同或更高。由蛋白水解衍生的肽，P a u A 1 4 9 — 2 8 6，通常比重組P a u A肽片段的力價稍低。第三次免疫接種後，此肽段會誘生將近爲其最近似比較肽，即GST — PauA172 — 286，之PauA 特異力價的1 0分之一的P a uA特異力價。雖然此特定肽（P a u A 1 4 9 — 2 8 6 )誘生的IgG反應低，但預期天然 P a u A之其它片段能夠誘生如重組肽所示之可資比較的免疫反應。 8.4.3血淸中和活性本纸張尺度用中國國家標峰（) Λ4規格（21〇Χ 297公釐） -78 - 1225518 A7 B7 五、發明説明（76 ) 將上述免疫接種所得血淸進一步分析以確定其是否含有能夠阻斷P a u A將牛組織纖維蛋白溶酶原轉化爲組織纖維蛋白酶的抗體。進行血淸中和分析法係將血淸樣品以1 : 5 0稀釋於TEA緩衝液’TEA中含有10%胎牛血淸（T E A / F B S ; Novatech Inc.,Grand Island,NE )。1公升TEA緩衝液係由3 · 3 4g TrisBase， 3 · 5 4 g Tris HC1，5.8gNaCl，l.lg EDTA (四鈉氫化物），42 · 2g (L)—甘胺酸鹽酸鹽，及1 · 0 m < Tween 8 0。緩衝液P Η校正爲 8 · 0，保存於室溫下直到予以使用。進行中和分析法前，才將FBS加入TEA。然後將TEA/FBS中的血淸樣品連續兩倍稀釋於含有T E A / F B S之V型底分析血（Dynatech廠）。將2 5 # Z測試樣品轉移至Immulon II盤 (Dynatech)。將乳房鏈球菌分離而得的經純化天然P a u A (批號9 7 0 0 7 1 0 A )稀釋T E A緩衝液至濃度爲 7 6//g/m< ，然後含有事先等分血淸之每一孔各加入 2 5 m <上述P a u A。令此盤大致黏貼以利混合，置於 3 7 °C歷1小時。正對照組是由血淸陽性反應的牛得到的經凍乾I g G餾份。此I g G餾份溶於水而爲3 · 8 m g ，1 : 50稀釋於TEA/FBS，轉移至 Immulon II盤。將各爲25// <正對照與25/z < FBS (其經1:50稀釋於TEA/FBS)分至適當孔。測定對P a u A之中和活性係將受質加入。製備受質係將組織纖維蛋白溶酶原（1 U / m < ; P — 9 1 5 6，本紙張尺度读/1] ΐ國國家標埤（rNS y A4規格（210X 297公釐）~ 79 - ~ ' (誚先閱讀背而之注意事項再瑣寫本頁) 【裝- -訂 1225518 A7 _______________ — _ — B7 五、發明説明（77 ) ~~~

Sigma 廠），Chromozym(l m g / m < ; Boeringer

Mannheim 廠，Indianapolis，IN)與 T E A 緩衝液以 2 : 3 : (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 1之比例頃合。將1 5 0 //彡之上述受質加入每個樣品孔，大致黏封此分析盤以利混合，再置於3 7 °C歷9 0分鐘。以4 0 5 / 4 9 0 n m判讀分析盤，其係利用Thermo M a X盤判讀機及S 〇 f t M a X Ρ R〇1 · 2版電腦程式。計算力價爲負對照5 0 %時之稀釋度倒數。中和分析法顯示，多種肽片段能夠產生針對天然 P a uA之中和反應。以重組蛋白質GST —

Pa uA28-286，GST— Pa uA104 — 286，GST —P a uA28 — 17° 或 GST — P a uA28 一 2〇8 注射鼠所得的血淸具有類似天然P a u A注射鼠所得血淸的中和力價。因此，這些肽片段注射鼠，會誘生能夠干擾經純化天然P a u A之酵素活性的抗體。本紙張尺度遶用中國园家標石（rNS )八4規格（2】0Χ 297公釐） -80 - 1225518 A7 B7 五、發明説明（78 )

IgGE LISA 中和夕讨斤法組3 第0天第21天第35天第56天第0天第21天第35天 ---— 第56天實驗-1 1 GST-PauA28'286 <100 135 18519 43478 <50 <50 243 357 GST-PauAi〇4-286 <100 <100 3333 25000 <50 <50 <50 77 GST-PauA172·286 <100 <100 465 3226 <50 <50 <50 <50 GST-PauA28*170 <100 <100 11236 20833 <50 <50 58 200 GST-PauA104'170 <100 <100 <100 571 <50 <50 <50 <50 GST-PauA104'208 <100 <100 625 2083 <50 <50 <50 <50 GST-PauA172*208 <100 <100 250 1053 <50 <50 <50 <50 天然PauA <100 <100 9091 23810 <50 <50 77 244 實驗-2 GST-PauA28103 <100 <100 345 1724 <50 <50 <50 <50 GST-PauA28'208 <100 <100 10870 9091 <50 <50 91 294 天然PauA <100 <100 12500 26667 <50 <50 67 500 實驗-3 Proteolized PauA149'286 <100 <100 <100 303 <50 <50 <50 <50 天然PauA <100 <100 20000 20833 <50 <50 <50 115 GST對照組 <100 <100 <100 <100 <50 <50 <50 <50 DPBS (佐劑對照組） <100 <100 <100 <100 <50 <50 <50 <50 a數據係由三組不同實驗整理而得的，且分組係根據各實驗。兩組對照（G S T與D P B S )包含在各實驗中且列於表的最後。 --. ..... — ...「. Hi-. ......- Hi ii— »1 ........、| ^ I - - 8. ....... i i I -: (誦先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) ½¾部中次枵绛局兑工消贽合竹私印f 本紙張尺度ilffl中國围家標缚（（、NS ) Λ4規格（2】ΟΧ 297公f ) - 81 - 鐘淖部中次樣4局W.T消费告作私印，來

1225518 A7 B7 --------- —-———- · «- — ——.-— - ι 五、發明説明（79 ) 上述所有專利，專利申請案與文獻皆入本文作爲參考〇本發明之範圍不受限於上述之特定具體實例，此實例僅意圖作爲本發明各別表象之單一個說明例。功能均等組成物與方法也在本發明範圍之內。序列表 (1) 一般資料 ⑴申請人：R〇SEY，EVERETTL. YANCEYJr.,ROBERTJ. LEIGH,JAMESA. (ii) 發明名稱：編碼血纖維蛋白溶酶原活化蛋白胃t

D N A (iii) 序列數目：2 8 (iv) 通訊住址： (A) 收信人：PFIZERINC. (B) 街：東42街，235號 (C) 市：紐約 (D) 州：紐約 (E) 國：美國 \ (F) Z I P ·· 1 〇〇 1 7 (v )電腦可讀型式： (A) 介質型式：套裝軟體 (B) 電腦：I Β Μ P C相容者本紙張尺度適用中）Λ4規格（2丨0X 297公釐） -82 - -------—Φ —-------tr------0 (¾先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 1225518 A7 B7 五、發明説明（8〇 )

(C) 操作系統：PC — D〇S/MS — D〇S (D) 軟體：PatentlnRelease# 1 · Ο，第 # 1 · 2 5 版 (vi)目前申請資料： (A) 申請案號：將指定 (B) 申請曰： (C) 分類 (viii) 法律事務代理人資料： (A) 名稱：KOLLER,ALANL. (B) 註冊號：3 7，3 7 1 (C) 參考/索引號：PC9836 (ix) 電傳資料： (a) 電話：212 — 573 - 2118 (b) 傳真：212 — 309 — 4801 (2) S E Q ID N〇：1之資料： ⑴序列特性： (A) 序列長度：1 1 8 0個鹼基對 (B) 序列類型：核酸 (C) 股數：單股 (D) 拓撲學：線形 (η)分子型式：DNA (基因組） ( (IX)特色：

(Α)名稱/索引：C D S (Β)位置：1 2 0 ...... 9 8 0 (xi)序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 -------t--------- '訂| ----------0 (¾先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適州中國國家標净（(^8)八4規格（210/ 297公漦） -83 - 1225518 A7 B7 五、發明説明（81 ) 經滅部中央椋卑局另Η消贽合作私印f GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATATCTACTT CAATTTGTTC TAAAATGAAA 60 TTATATTCAC TGCTGTTACA TAACTTTGTG ATTATTTAGG ATAAAATAAG GGAGATTTT 119 ATG AAA AAA TGG ΤΤΤ ΤΤΑ ΑΤΑ TTA ATG CTT TTG GGA ΑΤΑ TTT GGT TGT 167 Met Lys Lys Trp Phe Leu lie Leu Met Leu Leu Gly lie Phe Gly Cys 15 10 15 GCT ACT CAA CCA TCA AAG GTT GCA GCA ATA ACC GGT TAT GAT TCC GAC 215 Ala Thr Gin Pro Ser Lys Val Ala Ala lie Thr Gly Tyr Asp Ser Asp 20 25 30 TAC TAC GCT AGA TAT ATT GAT CCC GAT GAA AAT AAA ATA ACA TTT GCC 263 Tyr Tyr Ala Arg Tyr lie Asp Pro Asp Glu Asn Lys lie Thr Phe Ala 35 40 45 ATA AAT GTT GAT GGT TTT GTC GAA GGT AGT AAT CAA GAA ATC CTT ATT 311 lie Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gin Glu lie Leu lie 50 55 60 AGA GGA ATT CAT CAT GTT TTA ACA GAT CAA AAC CAA AAG ATT GTT ACA 359 Arg Gly lie His His Val Leu Thr Asp Gin Asn Gin Lys lie Val Thr 65 70 75 80 AAG GCC GAG TTG TTA GAC GCT ATT AGA CAT CAA ATG GTT CTT CTA CAA 407 Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala 工le Arg His Gin Met Val Leu Leu Gin 85 90 95 TTG GAT TAT TCC TAT GAA CTA GTC GAC TTT GCG CCT GAT GCA CAA TTA 455 Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gin Leu 100 105 110 TTA ACA CAA GAT CGA CGG CTT TTA TTT GCC AAT CAA AAT TTT GAG GAA 503 Leu Thr Gin Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gin Asn Phe Glu Glu 115 120 125 TCC GTA TCA CTT GAA GAT ACT ATT CAA GAA TAC CTT TTA AAA GGG CAT 551 Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr lie Gin Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His 130 135 140 GTT ATT CTC AGA AAA CGG GTT GAA GAA CCT ATC ACT CAT CCT ACT GAG 599 Val lie Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro lie Thr His Pro Thr Glu 145 150 155 160 ACT GCT AAT ATT GAG TAT AAA GTT CAA TTC GCG ACT AAA GAT GGG GAA 647 Thr Ala Asn lie Glu Tyr Lys Val Gin Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu 165 170 175 TTC CAC CCA CTA CCT ATT TTT GTA GAC TAC GGA GAA AAA CAT ATT GGA 695 Phe His Pro Leu Pro lie Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His lie Gly 180 185 190 (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁 '訂賴家標缚（rNS )八4規招（210>< 297公髮）-84- 1225518 A7 _____ _ ___ B7 五、發明説明（82 ) GAA AAA TTA ACC TCT GAC GAG TTT CGA AAA ATT GCA GAA GAA AAG CTT 743

Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys lie Ala Glu Glu Lys Leu 195 200 205 TTG CAA CTC TAC CCT GAC TAT ATG ATT GAT CAA AAA GAA TAT ACT ATC 791

Leu Gin Leu Tyr Pro Asp Tyr Met lie Asp Gin Lys Glu Tyr Thr lie 210 215 220 ATT AAA CAC AAT TCT CTT GGT CAA CTT CCA AGA TAT TAT TCT TAT CAA 83 9 lie Lys His Asn Ser Leu Gly Gin Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Gin 225 230 235 240 GAT CAT TTC AGC TAC GAA ATT CAA GAT AGG CAA CGT ATC ATG GCT AAG 88 7

Asp His Phe Ser Tyr Glu lie Gin Asp Arg Gin Arg lie Met Ala Lys 245 250 255 GAC CCA AAA TCC GGA AAA GAA CTC GGT GAA ACT CAA AGT ATT GAT AAT 93 5

Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gin Ser lie Asp Asn 260 265 270 GTT TTT GAG AAA TAC CTT ATT ACC AAA AAA AGT TAT AAA CCT TAAAGGAAGT 987

Val Phe Glu Lys Tyr Leu lie Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro 275 280 285 ATCCATTAAA TTTTTCTGCA TCACTAAAAA AACACGAGCA TCACTTTCAA AGGGACGGCC 1047 TTCGTTAGTA ACGCTAGTGT TTTTATTTTA TTTTTTTCTT TAGATCAAAC AAAACAGTCA 1107 TAGCTTCCAT TGGAGTCATA TTCATGACAT CTACTTCTTT AAGTCTATTA ATGATATCTA 1167 GAGAGGAATC TCA 1180 (2) S E Q ID N〇：2之資料：經淨部中吹摞準局舅h消贺含作私印來 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ⑴序列特性： (A) 序列長度：2 8 6個胺基酸 (B) 序列類型：胺基酸 (C) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：蛋白質 (xi)序列說明·· S E Q ID N〇：2 I紙张尺度ii川中國國CNS ) Λ4規格（210X 297公f ) . Q5 - 1225518 A7 _______ — _ — B7 五、發明説明（83 )

Arg Gly lie His His Val Leu Thr Asp Gin Asn Gin Lys 工le Val Thr '65_ 70 75 80

Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala lie Arg His Gin *Met Val Leu Leu Gin 85 90 95

Leu Asp Tyr Ser Tyr.Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gin Leu 100 105 110

Leu Thr Gin Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gin Asn Phe Glu Glu 115 120 125

Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr lie Gin Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His 130 135 140 、

Val lie Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro lie Thr His Pro Thr Glu 145 150 155 160

Thr Ala Asn lie Glu Tyr Lys Val Gin Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu 165 170 175

Phe His Pro Leu Pro lie Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His lie Gly 180 185 190

Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys lie Ala Glu Glu Lys Leu 195 200 205

Leu Gin Leu Tyr Pro Asp Tyr Met lie Asp Gin Lys Glu Tyr Thr lie 210 215 220 lie Lys His Asn Ser Leu Gly Gin Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Gin 225 230 235 240

Asp His Phe Ser Tyr Glu lie Gin Asp Arg Gin Arg lie Met Ala Lys 245 250 255

Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gin Ser lie Asp Asn 260 265 270

Val Phe Glu Lys Tyr Leu lie Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro 275 280 285 本紙張尺度適用中國國家標噑（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -86 - -------Ίφ^-------IT------0 (謂先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 朽濟部中欢樣率局貞工消贽合作ii印繁· 1225518 kl B7 五、發明説明（84 ) (2) S E Q ID NO: 3 之資料： ⑴序列特性： U)序列長度：1 1 8 1個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：D N A (基因組） (ix)特色：

U)名稱/索引：C D S (b)位置·· 1 2 1 ...... 9 8 1 (1)序列說明：S E Q ID N 0 ： 3 GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATATCTACTT CAATTTGTTC TAAAATGAAA 60 TTATATTCAC TGCTGTTACA TAACTTTGTG ATTATTTAGG ATAAAATAAG GGAGATTTTT 120 ATG AAA AAA TGG TTT TTA ΑΤΑ TTA ATG CTT TTG GGA ΑΤΑ TTT GGT TGT 168

Met Lys Lys Trp Phe Leu lie Leu Met Leu Leu Gly lie Phe Gly Cys 15 10 15 GCT ACT CAA CCA TCA AAG GTT GCA GCA ATA ACC GGT TAT GAT TCC GAC 216

Ala Thr Gin Pro Ser Lys Val Ala Ala lie Thr Gly Tyr Asp Ser Asp 20 25 30 TAC TAC GCT AGA TAT ATT GAT CCC GAT GAA AAT AAA ATA ACA TTT GCC 264

Tyr Tyr Ala Arg Tyr 工le Asp Pro Asp Glu Asn Lys lie Thr Phe Ala 35 40 45 ATA AAT GTT GAT GGT TTT GTC GAA GGT AGT AAT CAA GAA ATC CTT ATT 312 lie Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gin Glu lie Leu lie 50 55 60 AGA GGA ATT CAT CAT GTT TTA ACA AAT CAA AAC CAA AAG ATT GTT ACA 360

Arg Gly lie His His Val Leu Thr Asn Gin Asn Gin Lys lie Val Thr 65 70 75 80 AAG GCC GAG TTG TTA GAC GCT ATT AGA CAT CAA ATG GTT CTT CTA CAA 408

Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala lie Arg His Gin Met Val Leu Leu Gin 85 90 95 TTG GAT TAT TCC TAT GAA CTA GTC GAC TTT GCG CCT GAT GCA CAA TTA 456

Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gin Leu 100 105 110 TTA ACA CGA GAT CGA CGG CTT TTA TTT GCC AAT CGA AAT TTT GAG GAA 504

Leu Thr Arg Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Arg Asn Phe Glu .Glu 115 120 125 ' rr-trrrj. _ 一的―狀齡―丨丨纖丨丨丨丨一· _- - , . __ 本紙張尺度读用中國國家標净（CNS ) Λ4規桔（210>< 297公釐） , -------IT-------0 (詢先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) -87- 1225518 A7 B7 發明説明（85 TCC GTA TCA CTT GAA GAT ACT ATT CAA GAA TAC CTT TTA AAA GGG CAT Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr lie Gin Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His 130 135 140 GTT ATT CTC AGA AAA CGG GTT GAA GAA CCT ATC ACT CAT CCT ACT GAG Val He Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro lie Thr His Pro Thr Glu 145 150 155 160 ACT GCT AAT ATT GAG TAT AAA GTT CAA TTC GCG ACT AAA GAT GGG GAA Thr Ala Asn lie Glu Tyr Lys Val Gin Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu 165 170 175 TTC CAC CCA CTA CCT ATT TTT GTA GAC TAC GGA GAA AAA CAT ATT GGA Phe His Pro Leu Pro lie Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His lie Gly 180 185 190 552 600 648 696 GAA AAA TTA ACC TCT GAC GAG TTT CGA AAA ATT Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys lie 195 200 TTG CAA CGC TAC CCT GAC TAT ATG ATT GAT CAA Leu Gin Arg Tyr Pro Asp Tyr Met lie Asp Gin 210 215 ATT AAA CAC AAT TCT CTT GGT CAA CTT CCA AGA lie Lys His Asn Ser Leu Gly Gin Leu Pro Arg 225 230 235 GAT GAT TTC AGC TAC GAA ATT CAA GAT AGG CAA Asp Asp Phe Ser Tyr Glu lie Gin Asp Arg Gin 245 250 GAC CCA AAG TCC GGA AAA GAA CTC GGT GAA ACT Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr 260 265 GTT TTT GAG AAA TAC CTT ATT ACC AAA AAA AGT Val Phe Glu Lys Tyr Leu lie Thr Lys Lys Ser 275 280 GCA GAA GAA AAG CTT Ala Glu Glu Lys Leu 205 AAA GAA TAT ACT ATC Lys Glu Tyr Thr lie 220 TAT TAT TCT TAT CCA Tyr Tyr Ser Tyr Pro 240 CGT ATC ATG GCT AAG Arg lie Met Ala Lys 255 CAA AGT ATT GAT AAT Gin Ser lie Asp Asn 270 TAT AAA .CCT TAAATGAAGT Tyr Lys Pro 285 744 792 840 888 936 988 ATCCATTAAA TTTTTCTGCA TCACTAAAAA AACACGAGCA TCACTTTCAA AGGGAAGGCC 1048 TTCGTTAGTA ACGCTAGTGT TTTTATTTTA TTTTTTTCTT TAAATCAAAC AAAACAGTCA 1108 TAGCTTCCAT TGGAGTCATA TTCATGACAT CTACTTCTTT AAGTCTATTA ATGATATCTA 1168 GAGAGGAATC TCA 1181 (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) >裝· '訂經濟部屮决標準局負-I消合作社印賞本纸張尺度適用中國國家標净（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -88- 1225518 A7 B7 五、發明説明（明） (2) S E Q ID N〇：4之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：2 8 6個fl女基酸 (b) 序列類型：胺基酸 (d)拓撲學：線形 (ii)分子型式：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID N〇· 4

Met Lys Lys Trp Phe Leu lie Leu Met Leu Leu Gly lie Phe Gly Cys 1 5 10 15

Ala Thr Gin Pro Ser Lys Val Ala Ala lie Thr Gly Tyr Asp Ser Asp 20 25 30

Tyr Tyr Ala Arg Tyr lie Asp Pro Asp Glu Asn Lys lie Thr Phe Ala 35 40 45 lie A巧 Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gin Glu lie Leu lie 50 55 60

Arq Gly lie His His Val Leu Thr Asn Gin Asn Gin Lys lie Val Thr >5 70 75 80

Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala lie Arg His Gin· Met Val Leu Leu Gin 85 90 95

Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gin Leu 100 105 110

Leu Thr Arg Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Arg Asn Phe Glu Glu 115 120 125

Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr lie Gin Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His 130 135 140

Val lie Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro lie Thr His Pro Thr Glu 145 150 155 160

Thr Ala Asn 工le Glu Tyr Lys Val Gin Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu 165 170 175

Phe His Pro Leu Pro lie Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His lie Gly 180 185 190

Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys lie Ala Glu Glu Lys Leu 195 200 205

Leu Gin Arg Tyr Pro Asp Tyr Met lie Asp Gin Lys Glu Tyr Thr lie 210 215 220 lie Lys His Asn Ser Leu Gly Gin Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Pro 225 230 235 240 n^i— HI— «ϋ^— m·· m-ϋ m·— ml HI—— nn ·1_11-i ml nisi ml m n·—· (謂先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度璉用中國國家標缚（CNS ) Λ4規格（2IOX297公嫠） -89- 1225518

A B 五、發明説明（87 )

Asp Asp Phe Ser Tyr Glu lie Gin Asp Arg Gin Arg lie Met Ala Lys 245 250 255

Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gin Ser lie Asp Asn 260 265 270

Val Phe Glu Lys Tyr Leu lie Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro 275 280 285 (2) S E Q ID N〇：5之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：1 8個胺基酸 (b) 序列類型：胺基酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：肽 (V)片段型式：中間片段 (ix)特色： (a) 名稱/索引：肽 (b) 位置：1 ...... 18 (c) 其他資料：/label=Xaa /note = 、、Xaa=Pro 或 Glyy/ (1) 序列說明：S E Q ID N 0 ： 5 lie Thr Xaa Tyr Asp Ser Asp Tyr Tyr Ala Arg Tyr lie Asp Pro Asp 1 5 10 15

Glu Asn (2) S E Q ID N〇：6之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度·· 3 1個胺基酸 (b) 序列類型：胺基酸 (c) 股數：單股 I— I n I m ' 、訂 I..::, (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度遶用中國國家標净（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） -90- 1225518 Α7 Β7五、發明説明（88 ) (d)拓撲學：線形 (ii)分子型式：肽 (V)片段型式：中間片段 Ui)序列說明·· s E Q ID N〇：6

Tyr lie Asp Pro Asp Glu Asn Lys He Thr Phe Ala He Asn Val Asp 1 5 10 15

Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gin Glu lie Leu He Arg Gly He 20 25 30 (2) S E Q ID N〇：7之資料： ⑴序列特性： (a)序列長度：1 2個胺基酸 (bB)序列類型：胺基酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：肽 (V)片段型式：中間片段

Ui)序列說明：s E Q ID N 0 ： 7 工le Val Thr Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala lie Arg ! 5 l〇 (2) S E Q ID N〇：8之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：1 6個胺基酸 (b) 序列類型：胺基酸 ( (c)股數：單股孓紙張尺廋ί用-中國國家標率fcNS )ϋ格（210X297公# ) (¾先閲讀背面之注意事項再瑣寫本頁

II -91 - 1225518 A7 B7 一-一— 一》一..…-一•'一♦.、一一.· _.. ... ._.. - .. . - 一丁··^ - ________ _ _ 五、發明説明（⑽） (d)拓撲學：線形 (ii)分子型式：肽 (V)片段型式：中間片段 (ix)特色： (a) 名稱/索引：月太 (b) 位置：1 ...... 16 (c) 其他資料：/label=Xaa /no t e = 、、Xa a =未知" (1) 序列說明：S E Q ID N 0 ： 8

Asp Gly Glu Phe His Pro Leu Pro lie Phe Val Xaa Tyr Xaa Glu Lys 1 5 l〇 15 (2) S E Q ID N〇：9之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：1 3個胺基酸 (b) 序列類型：胺基酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (π)分子型式：肽 (v)片段型式：中間片段 (XI)序列說明：S E Q ID N 0 ： 9

Leu Leu Gin Leu Tyr Pro Asp Tyr Met lie Asp Gin Lys 15 l〇 (2) S E Q ID N〇：l〇之資料： (i)序列特性：本紙張尺度適用中國國家標缚（（、NS ) M規格（210X 297公釐) Γο^Ι n. . . In .. I ....... ......... 和衣1-- j —- 11— .-1- - » li-iI Hi I......... !! 1-一-一 -. (讀先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 1225518 A7 B7 五、發明説明自〇 ) (a) 序列長度：1 9個胺基酸 (b) 序列類型：胺基酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：肽 (v)片段型式：中間片段 (xi)序列說明：S E Q ID NO； 10 Leu Leu Gin Leu Tyr Pro Asn Tvr· tt , 1 P yr Met He Asp Gin Lys Glu Tyr Thr 10 15 lie lie Lys (2) S E Q ID N 〇：1 1 之資料·· ⑴序列特性： (a) 序列長度：1 5個胺基酸 (b) 序列類型：胺基酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：肽 (v)片段型式：中間片段經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (xi)序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 1

Tyr Tyr Ser Tyr Gin Asp His Phe Ser Tyr Glu lie Gin Asp Arg 1 5 10 15 (2) S E Q ID NO :12 之資料： ⑴序列特性： (a)序列長度：5個胺基酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-93 - 1225518 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明0 ) (b) 序列類型：胺基酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：肽 (V)片段型式：中間片段 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 1 2 Tyr Leu lie Thr Lys 1 5 (2) SEQ ID N0:13 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：2 0個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：DNA (基因組） (xi)序列說明：S E Q ID Ν Ο ： 1 3 ATCATATAGT CAGGGTAGAG (2) S E Q ID Ν 〇：1 4 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：3 0個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：DNA (基因組）本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-94 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _«τ^ '訂 1225518 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明自2 ) (xi)序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 4 CGGGTACCGW TATATTGATC CWGATGARAA (2) S E Q ID N 〇：1 5 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：3 4個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (π)分子型式：DNA (基因組） (xi)序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 5 GGGGATCCTT TTGATCAATW GGATAATCWG GATA (2) S E Q ID NO :16 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：3 4個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：D N A (基因組） (xi)序列說明：SEQ ID NO :16 GGGGATCCTT YTGRTCRATW GGRTARTCWG GRTA (2) S E Q ID N 〇：1 7 之資料： ⑴序列特性： (a)序列長度：2 4個鹼基對本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 95 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 1225518 A7 B7 五、發明説明幻） (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：DNA (基因組） (XI)序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 7

GTTACAAAGG CCGAGTTGTT AGAC (2) S E Q ID NO: 18 之資料： (1) 序列特性： (a) 序列長度：2 5個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：D N A (基因組） (xi)序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 8

GATTGGCAAA TAAAAGCCGT CGATC (2) S E Q ID NO :19 之資料： ⑴序列特性： U)序列長度：2 2個鹼基對經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：D N A (基因組） (xi)序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 9

CTTCAAGTGA TACGGATTCC TC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-96 - 1225518 A7 B7 五、發明説明知） (2) S E Q ID N〇：20 之資料： ⑴序列特性： U)序列長度：2 0個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (Π)分子型式：DNA (基因組）

Ui)序列說明：SEQ ID NO： 20

GGGGAATTCC ACCCACTACC (2) SEQ ID NO :21 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：2 5個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：DNA (基因組）

Ui)序列說明：S E Q ID Ν Ο ： 2 1

GACGAGTTTC GAAAAATTGC AGAAG 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2) SEQ ID NO :22 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：4 8個驗基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-97 _ 1225518 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明的） (ii)分子型式：D N A (基因組） (XI)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 2 GGGCTGCAGT CATATGAAAA AATGGTTTTT AATATTAATG CTTTTGGG (2) SEQ ID N〇：23 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：4 4個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：D N A (基因組） (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 3 GGGCTGCAGT CATATGATAA CCGGTTATGA TTCCGACTAC TACG (2) SEQ ID NO :24 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：2 1個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：D N A (基因組） (xi)序列說明：SEQ ID NO :24 GAGATTCCTC TCTAGATATC A (2) SEQ ID N〇：25 之資料： ⑴序列特性： (a)序列長度：3 4個驗基對本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-98 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1225518 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明自6 ) (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：DNA (基因組） (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 5 GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATAT (2)S E Q ID N 〇·· 2 6 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：3 1個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：DNA (基因組） (iH)假設序列：無 (iv) 反意義序列：無 (v) 原始來源： (a)生物：乳房鏈球菌 (XI)序列說明：S E Q ID N 0 ： 2 6 GCGGCTCGAG ACCGGTTATG ATTCCGACTA C (2) S E Q ID N 〇：2 7 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：3 3個鹼基對 (b) 序列類型：核酸 (c) 股數：單股 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

IT 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 99 - 1225518 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（97 ) (d)拓撲學：線形 (ii)分子型式：DNA (基因組） (Hi)假設序列：無 (iv) 反意義序列：無 (v) 原始來源： (a)生物：乳房鏈球菌 (XI)序列說明：S E Q ID NO： 27 GTTGCGGCCG CGGATACTTC ATTTAAGGTT TAT (2)S E Q ID NO :28 之資料： ⑴序列特性： (a) 序列長度：1 〇個胺基酸 (b) 序列類型：胺基酸 (c) 股數：單股 (d) 拓撲學：線形 (ii)分子型式：肽 (in)假設序列：無 (iv)反意義序列：無 (V)片段型式：中間片段 (Vi)原始來源： (a)生物：乳房鏈球菌 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 8 Lys Arg Val Glu Glu Pro He Thr His Pro n 5 10 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-1〇〇 -

Claims

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I22551& 六、申請專利範圍附件二A ··第87110021號修正後無劃線之 ; 中文申請專利範圍替換本民國％年9月14日呈 1 · 一種經分離多核苷酸分子，其係由編碼源自乳房鏈球菌（Streptococcus uberis )之PauA蛋白質的核苔酸序列所構成’其中該PauA蛋白質係由SEQ ID N〇· 2或S E Q ID N〇：4之胺基酸序列所構成。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 規格（21 OX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1225518 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍 SEQ ID NO: 2: Met Lvs Lys Trp Phe Leu lie ： Leu ] Met ； Leu Leu Gly lie Phe Gly Cys 1 5 10 15 Ala Thr Gin Pro Ser Lys Val ‘ Ala , Ala lie Thr Gly Tyr Asp Ser Asp 20 25 30 Tvr Tyr Ala Arg Tyr lie Asp Pro Asp Glu Asn Lys lie Thr Phe Ala 35 40 45 lie Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gin Glu lie Leu lie 50 55 60 Arg Gly lie His His Val Leu Thr Asp Gin Asn Gin Lys lie Val Thr 65 70 75 80 Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala lie Arg His Gin Met Val Leu Leu Gin 85 90 95 Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gin Leu 100 105 110 Leu Thr Gin Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gin Asn Phe Glu Glu 115 120 125 Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr lie Gin Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His 130 135 140 Val lie Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro lie Thr His Pro Thr Glu 145 150 155 160 Thr Ala Asn lie Glu Tyr Lys Val Gin Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu 165 170 175 Fhe His Pro Leu Pro lie Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His lie Gly 180 185 190 Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys lie Ala Glu Glu Lys Leu 195 200 205 Leu Gin Leu Tyr Pro Asp Tyr Met lie Asp Gin Lys Glu Tyr Thr lie 210 215 220 lie Lys His Asn Ser Leu Gly Gin Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Gin 225 230 235 240 Asp His Phe Ser Tyr Glu lie Gin Asp Arg Gin Arg lie Met Ala Lys 245 250 255 Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gin Ser lie Asp Asn 260 265 27 0 Val Phe Glu Lys Tyr Leu lie Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro 275 280 285 本紙張尺度適用中國國家禕準（CNS ) A4規格（2】OX 297公釐）一2 - 1225518 ABCD

圍範；； Met Lys Lys Trp Phe Leu He Leu Met Leu Leu Gly lie Phe Gly Cys 1 5 10 15 Ala Thr Gin Pro Ser Lys Val Ala Ala He Thr Gly Tyr Asp Ser Asp 20 25 30 Tyr Tyr Ala Arg Tyr He Asp Pro Asp Glu Asn Lys lie Thr Phe Ala 35 40 45 lie Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gin Glu lie Leu lie 5〇 55 60 Arg Gly lie His His Val Leu Thr Asn Gin Asn Gin Lys lie Val Thr 65 7 0 7 5 80 Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala lie Arg His Gin Met Val Leu Leu Gin 85 90 95 Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gin Leu 100 105 110 Leu Thr Arg Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Arg Asn Phe Glu Glu 115 120 125 Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr lie Gin Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His 130 135 140 - Val lie Leu Arg Lys Ara Val Glu Glu Pro lie Thr His Pro Thr Glu 145 150 155 160 Thr Ala Asn lie Glu Tyr Lys Val Gin Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu 165 170 175 Phe His Pro Leu Pro lie Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His lie Gly 180 185 190 Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys lie Ala Glu Glu Lys Leu 195 200 205 Leu Gin Arc Tyr Pro Asp Tyr Met lie Asp Gin Lys Glu Tyr Thr lie 210 215 220 He Lys His Asn Ser Leu Gly Gin Leu Fro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Pro 225 220 235 " 240 Asp Asp Phe Ser Tyr Glu lie Gin Asp Arg Gin Arg lie Met: Ala Lys 245 250 255 Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gin Ser lie Asp Asn 260 265 270 Vel Phe Glu Lvs Tyr Leu lie Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro 275 - " 280 · " 285 2 .如申請專利範圍第l項之經分離多核苷酸分子，其係由SEQ ID N〇：l或SEQ ID N〇： 3之核苔酸序列所構成。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -3 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\寻經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225518 A8 B8 C8 _ D8 申請專利範圍 SEQ ID NO：1： GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATATCTACTT CAATTTGTTC TAAAATGAAA 60 TTATATTCAC TGCTGTTACA TAACTTTGTG ATTATTTAGG ATAAAATAAG GGAGATTTT 119 XTG AAA AAA TGG TTT TTA ΑΤΑ TTA ATG CTT TTG GGA ATA TTT* GGT TGT 167 Met Lys Lys Trp Phe Leu lie Leu Met Leu Leu Gly lie Phe Gly Cys 1 5 10 15 GCT ACT CAA CCA TCA AAG GTT GCA GCA ATA ACC GGT TAT GAT TCC GAC 215 Ala Thr Gin Pro Ser Lys Val Ala Ala lie Thr Gly Tyr Asp Ser Asp 20 25 30 TAC TAC GCT AGA TAT ATT GAT CCC GAT GAA AAT AAA ATA ACA TTT GCC 263 Tyr Tyr Ala Arg Tyr lie Asp Pro Asp Glu Asn Lys lie Thr Phe Ala 35 40 45 ΑΤΑ XAT GTT GAT GGT TTT GTC GAA GGT AGT AAT CAA GAA ATC CTT ATT 311 lie Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gin Glu lie Leu lie 50 55 60 AGA GGA ATT CAT CAT GTT TTA ACA GAT CXA AAC CAA AAG ATT GTT ACA 359 Arg Gly lie His His Val Leu Thr Asp Gin Asn Gin Lys Ile Val Thr 65 70 75 80 AAG GCC GAG TTG TTA GAC GCT ATT AGA CAT CAA ATG GTT CTT CTA CAA 4 07 Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala He Arg His Gin Met Val Leu Leu Gin B5 90 95 TTG GAT TAT TCC TAT GAA CTA GTC GAC TTT GCG CCT GAT GCA CAA TTA 455 Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gin Leu 100 105 110 TTA ACA CAA GAT CGA CGG CTT TTA TTT GCC AAT CAA AAT TTT GAG GAA 503 Leu Thr Gin Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gin Asn Phe Glu Glu 115 120 125 TCC GTA TCA CTT GAA GAT ACT ATT CAA GAA TAC CTT TTA AAA GGG CAT 551 Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr lie Gin Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His 120 135 140 GTT ATT CTC AGA ΑΚΆ CGG GTT GAA GAA CCT ATC ACT CAT CCT ACT GAG 599 Val lie Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro lie Thr His Pro Thr Glu 145 150 155 160 ACT GCT AAT ATT GAG TAT AAA GTT CAA TTC GCG ACT kAA GAT GGG GAA 64 7 Thr Ala Asn lie Glu Tyr Lys Val Gin Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu 165 170 175 TTC CAC CCA CTA CCT ATT TTT GTA GAC TAC GGA GAA AAA CAT ATT GGA 695 Phe His Pro Leu Pro lie Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His lie Gly 180 185 190 請先閱 ιδ 之注意事項再 I叫訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1225518 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 GAA AAA TTA ACC TCT GAC GAG ΤΓΓ CGA AAA· ATT GCA GAA GAA AAG CTT 743 Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys lie Ala Glu Glu Lys Leu l〇5 200 205 TTG CAA CTC TAC CCT GAC TAT ATG ATT GAT CAA AAA GAA TAT ACT ATC 791 Leu Gin Leu Tyr Pro Asp Tyr Met He Asp Gin Lys Glu Tyr Thr lie 210 215 220 ATT AAA CAC AAT TCT CTT GGT CAA CTT CCA AGA TAT TAT TCT TAT CAA 839 He Lys His Asn Ser Leu Gly Gin Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Gin 225 230 235 240 GAT CAT TTC AGC TAC GAA ATT CAA GAT AGG CAA CGT ATC ATG GCT AAG 687 Asp His Phe Ser Tyr Glu He Gin Asp Arg Gin Arg He Met Ala Lys 245 · 250 255 GAC CCA AAA TCC GGA ΑΑΛ GAA CTC GGT GAA ACT CAA AGT ATT GAT AAT 935 Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gin Ser lie Asp Asn 260 265 270 GTT TTT GAG AAA TAC CTT ATT ACC AAA λΑΑ AGT TAT AAA CCT TAAAGGAAGT 9 87 Va.l Phe Glu Lys Tyr Leu He Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro 275 280 2E5 ATCCATTAAA TTTTTCTGCA TCACTAAAAA AACACGAGCA TCACTTTCAA AGGGACGGCC 1047 TTCGTTAGTA ACGCTAGTGT TTTTATTTTA ΤΤΤΤΤΤχ0ΤΤ TAGATCAAAC AAAACAGTCA 1107 TAGCTTCCAT TGGAGTCATA TTCATGACAT CTACTTCTTT AAGTCTATTA ATGATATCTA 1167 GAGAGGAATC TCA 1180 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) |裝· SEQ ID MO:3: '訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATATCTACTT CAATTTGTTC TAAAATGAAA 60 TTATATTCAC TGCTGTTACA TAACTTTGTG ATTATTTAGG ATAAAATAAG GGAGATTTTT 120 ATG AAA AAA TGG TTT TTA ATA TTA ATG CTT TTG GGA ATA TTT GGT TGT 168 Met Lys Lys Trp Phe Leu lie Leu Met: Leu Leu Gly lie Phe Gly Cys 15 10 15 GCT ACT CAA CCA TCA AAG GTT GCA GCA ATA ACC GGT TAT GAT TCC GAC 216 Ala Thr Gin Pro Ser Lys VbI Ala Ala He Thr Gly Tyr Asp Ser Asp 20 25 30 TAC TAC GCT AGA TAT ATT GAT CCC GAT GAA AAT AAA ATA ACA TTT GCC 264 Tyr Tvr Ala Arg Tyr lie Asp Pro Asp Glu Asn Lys He Thr Phe Ala 35 40 45 ATA AAT GTT GAT GGT TTT GTC GAA GGT AGT AAT CAA GAA ATC CTT ATT 312 lie Asn Va! Asp Gly Phe VeI Glu Gly Ser Asn Gin Glu lie Leu lie • 50 55 60 AGA GGA ATT CAT CAT GTT TTA ACA AA.T CAA AAC CAA AAG ATT GTT ACA 3 60 Arg Gly lie His His Val Leu Thr Asn Gin Asn Gin Lys lie Val Thr 65 70 75 80 AAG GCC GAG TTG TTA GAC GCT ATT AGA CAT CAA ATG GTT CTT CTA CAA 408 Lvs Ala Glu Leu Leu Asp >.1e lie Arg His Gin Met Val Leu Leu Gin 65 90 95 ·? 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1225518 ABCD 六、申請專利範圍 TTG GAT TAT TCC TAT GAA CTA GTC GAC TTT GCG CCT GAT GCA CAA TTA 456 Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ale Gin Leu 100 105 110 TTA ACA CGA GAT CGA CGG CTT TTA TTT GCC λΑΤ CGA XAT TTT GAG GAA 504 Leu Thr Arg Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Arg Asn Phe Glu .Glu 115 120 125 TCC GTA TCA CTT GAA GAT ACT ATT CAA GAA TAC CTT TTA AAA GGG CAT 552 Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr lie Gin Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His 130 135 140 GTT ATT CTC AGA AAA CGG GTT GAA GAA CCT ATC ACT CAT CCT ACT GAG 600 Val lie Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro lie Thr His Pro Thr Glu 145 150 155 160 ACT GCT AAT ATT GAG TAT AAA GTT CAA TTC GCG ACT AAA GAT GGG GAA 648 Thr Ala Asn lie Glu Tyr Lys Val Gin Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu 165 170 175 TTC CAC CCA CTA CCT ATT TTT GTA GAC TAC GGA GAA AAA CAT ATT GGA 696 Phe His Pro Leu Pro lie Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His lie Gly 180 185 190 GAA AAA TTA ACC TCT GAC GAG TTT CGA AAA ATT GCA GAA GAA AAG CTT 744 Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys lie Ala Glu Glu Lys Leu 195 200 205 TTG CAA CGC TAC CCT GAC TAT ATG ATT GAT CAA AAA GAA TAT ACT ATC 792 Leu Gin Arg Tyr Pro Asp Tyr Met lie Asp Gin Lys Glu Tyr Thr lie 210 215 220 ATT AAA CAC AAT TCT CTT GGT CAA CTT CCA AGA TAT TAT TCT TAT CCA 840 lie Lys His Asn Ser Leu Gly Gin Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Pro 225 230 235 240 GAT GAT TTC AGC TAC GAA ATT CXA GAT AGG CAA CGT ATC ATG GCT AAG 888 Asp Asp Phe Ser Tyr Glu He Gin Asp Arg Gin Arg lie Met Ala Lys 245 250 255 GAC CCA kAG TCC GGA AAA GAA CTC GGT GAA ACT CAA AGT ATT GAT AAT S36 Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gin Ser He Asp Asn 260 265 270 GTT TTT GAG AAA TAC CTT ATT ACC ΛΑΑ AAA AGT TAT AAA CCT TAAATGAAGT 988 Val Phe Glu Lys Tyr Leu lie Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro 275 " 280 285 ATCCATTAAA TTTTTCTGCA TCACTAAAAA AACACGAGCA TCACTTTCAA AGGGAAGGCC 1048 TTCGTTAGTA ACGCTAGTGT TTTTATTTTA TTTTTTTCTT TAAATCAAAC AAAACAGTCA 1108 TAGCTTCCAT TGGAGTCATA TTCATGACAT CTACTTCTTT AAGTCTATTA ATGATATCTA 1168 GAGAGGAATC TCA 1181 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、言 __ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 ·如申請專利範圍第1項之經分離多核苷酸分子，其係由S E Q ID N〇：1中第1 2 0至9 8 〇位核苷酸之核苷酸序列，或S E Q ID N〇·· 3中第1 2 1至9 8 1位核苷酸之核苷酸序列所構成。適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225518 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 4 .如申請專利範圍第3項之經分離多核苷酸分子，其係由S E Q ID N〇：1中第1 9 5至9 7 7位核苷酸之核苷酸序列，或SEQ ID NO:3中第19 6至9 7 8位核苷酸之核苷酸序列所構成。 5 · —*種經分離多核醫酸分子，其具有編碼SEQ ID N〇·· 2胺基酸序列之肽片段或S E Q ID N〇：4胺基酸序列之肽片段的核苷酸序列，其中該肽片段具有SEQ ID N〇：2或SEQ ID N〇： 4之胺基酸亞序列，其係選自第2 8位胺基酸至第2 8 6 位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第 1 7 2位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 0 3 位胺基酸、第2 8位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、及第 1 4 9位胺基酸至第2 8 6位胺基酸。 6 . —種經分離多核苷酸分子，其係由編碼融合蛋白質之核苔酸序列所構成，該融合蛋白質包括融合至融合成員上之下列物質：（a ) PauA蛋白質，其係由SEQ ID N〇：2或SEQ ID N〇：4中第26位胺基酸至第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列所構成；或（b ) PauA蛋白質之肽片段，其中該肽片段具有SE(3 1 D N〇：2或SEQ ID N〇：4之胺基酸亞序列’其係選自第2 8位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 〇 4位本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇Χ297公董）.7 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1225518 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第 2 8 6位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 〇 3位胺基酸、第2 8位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、及第1 4 9位胺基酸至第 2 8 6位胺基酸，且其中該融合蛋白質係選自0 -半乳糖苷酶融合物、t r p E融合物、麥芽糖結合蛋白質融合物、榖恍苷肽一 S —轉換酶（G S T )融合物、及多組織胺酸融合物。 7 ·如申請專利範圍第6項之經分離多核苷酸分子，其中該融合蛋白質中SEQ ID 1^〇：2或3£〇 ID NO:4第26位胺基酸至第286位胺基酸之胺基酸序列，係分別由S E Q ID N〇：1中第1 9 5 位核苷酸至第9 7 7位核苷酸，或S E Q ID N 0 ： 3中第1 9 6位核苷酸至第9 7 8位核苷酸之核苷酸序列所編碼。 8 ·如申請專利範圍第6項之經分離多核苷酸分子，其中該融合成員是G S 丁。 9 · 一種寡核苷酸分子，其具有選自seQ ID N〇s · 1 3 — 2 7之核苷酸序列及其互補核苷酸序列。本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) Α4規格（210 X 297公釐）請先閱讀背之注意事項 I· 本經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ABICD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225518 々、申請專利範圍 SEQ ID NO：13: •ATCATATAGT CAGGGTAGAG SEQ ID NO：14: CGGGTACCGW TATATTGATC CWGATGAJ^AA SEQ ID NO:15: GGGGATCCTT TTGATCAATW GGATAATCWG GATA .SEQ ID NO： 16 : GGGGATCCTT YTGRTCRATV； GGRTAJ^TCWG C-RTA SEQ ID N〇：17 ·· GTTACAAAGG CCGAGTTGTT AGAC SEQ ID NO：18： GATTGGCAAA TAA^GCCGT CGATC _ SEQ ID NO：19： CTTCAAGTGA TACGGATTCC TC SEQ ID N0:20: GGGGAATTCC ACCCACTACC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）

ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225518 六、申請專利範圍 SEQ ID NO:21: GACGAGTTTC GAAAAATTGC AGAAG SEQ ID HO：22: GGGCTGCAGT CATATGAAAA AATGGTTTTT AATATTAATG CTTTTGGG SEQ ID NO：23: GGGCTGCAGT CATATGATAA CCGGTTATGA TTCCGACTAC TACG SEQ ID NO：24: GAGATTCCTC TCTAGATATC A SEQ ID NO:25: GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATAT SEQ ID NO： 26 : GCGGCTCGAG ACCGGTTATG ATTCCGACTA C SEQ ID NO：27: 1〇· 一種重組表現載體，其包括一多核苷酸分子，該多核苷酸分子係由編碼下列物質的核苷酸序列所構成： (a ) PauA蛋白質，其係由SEQ ID N〇：2或S E Q ID NO ·· 4中第26位胺基酸至第286位胺基酸之胺基酸序列所構成；或（b ) PauA蛋白質之肽片段 ;或（c )融合蛋白質，其包括融合在融合成員上的上述 (a ) PauA蛋白質或（b )肽片段，其中該（b )肽片段係由 S E Q ID N 〇：2 或 S E Q ID N 〇：4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）

-10- 1225518 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍之胺基酸亞序列所構成，該胺基酸亞序列係選自第2 8位胺基酸至第286位胺基酸、第104位胺基酸至第 2 8 6位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第2 8 位胺基酸至第1 0 3位胺基酸、第2.8位胺基酸至第 2〇8位胺基酸、及第1 4 9位胺基酸至第2 8 6位胺基酸；該多核苷酸分子係操作性連接在一個或多個調節元件，該調節元件係控制該多核苷酸分子於宿主細胞中的表現作用。 1 1 .如申請專利範圍第1 0項之重組表現載體，其中該PauA蛋白質中SEQ ID 1^〇：2或3£(3 ID N〇：4之第2 6位胺基酸至第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列係由多核苷酸分子所編碼，該多核苷酸分子係由SEQ ID N〇：l中第195位核苷酸至第 977位核苷酸或SEQ ID N〇：3中第196位核苷酸至第9 7 8位核苷酸之核苷酸序列所構成。 1 2 .如申請專利範圍第1 〇項之重組表現載體，其中該融合成員是G S T。 1 3 ·如申請專利範圍第1 〇項之重組表現載體，其進一步包括可選擇的標記物。 1 4 . 一種宿主細胞，其係經申請專利範圍第1 〇項之重組表現載體轉形。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4洗格（210 X 297公釐）請先閱讀背面之注意事項再

訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 11 1225518 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 1 5 . —種經分離多肽，其爲：（a ) PauA蛋白質，其係由SEQ ID N〇：2或SEQ ID N〇： 4中第2 6位胺基酸至第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列所構成；或（b )由PauA蛋白質之亞序列所構成的肽片段；或（c )融合蛋白質，其包括融合在融合成員上的上述（ a ) PauA蛋白質或（b )肽片段，其中該（b )狀片段係由 SEQ ID N〇：2 或 SEQ ID Ν〇··4 之胺基酸亞序列所構成，該胺基酸亞序列係選自第2 8位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 8 6 位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第 2 8位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 0 3位胺基酸、第2 8位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、及第1 4 9位胺基酸至第2 8 6位胺基酸。 1 6 ·如申請專利範圍第1 5項之多肽，其中該PauA 蛋白質係由SEQ ID NO:2或SEQ ID N〇：4中第1位胺基酸至第2 8 6位胺基酸的胺基酸序列所構成。 1 7 ·如申請專利範圍第1 5項之多肽，其中該融合成員是G S T。 1 8 . —種製備申請專利範圍第1 5項之多肽之方法，其包括在有助於藉由表現載體生產所編碼之多肽的條件下，培養經申請專利範圍第1 〇項之重組表現載體轉形的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） < 〇 1225518 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍宿主細胞，及自該細胞培養物回收該多肽。 1 9 · 一種保護哺乳動物對抗由乳房鏈球菌感染所引起之乳房炎之疫苗，其包括免疫有效量之（a ) PauA蛋白質，其係由SEQ ID N〇：2或SEQ ID N〇：4中第2 6位胺基酸至第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列所構成；或（b )肽片段，其係由pauA蛋白質之亞序列所構成；或（c )融合蛋白質，其包括融合在融合成員上的上述（a ) PauA蛋白質或（b )肽片段，其中該（b )肽片段係由S E Q ID N〇：2或S E Q ID N〇：4之胺基酸亞序列所構成，該胺基酸亞序列係選自第2 8位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第 2 0 8位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 0 3位胺基酸、第2 8位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、及第1 4 9位胺基酸至第2 8 6位胺基酸.；該PauA蛋白質、肽片段或融合蛋白質能夠誘生哺乳動物產生拮抗該乳房炎之保護性反應；以及獸醫學上可接受的載劑。 2 0 ·如申請專利$e圍第1 9項之疫苗，其進一步包括佐劑。 2 1 · —種組合疫苗，其係用於保護哺乳動物對抗由乳房鏈球菌感染所引起之乳房炎，及隨機保護一種或多種 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13- 1225518 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍侵害哺乳動物之其他疾病或病況，該組合疫苗包括免疫有效量之第一組成分，其包括（a ) PauA蛋白質，其係由 SEQ ID N〇：2 或 SEQ ID Ν〇··4 中第 2 6位胺基酸至第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列所構成；或（b )肽片段，其係由PauA蛋白質之亞序列所構成；或 (c )融合蛋白質，其包括融合在融合成員上的上述（a )PauA蛋白質或（b )肽片段，其中該（b )肽片段係由 SEQ ID N〇：2或SEQ ID NO:4之胺經濟部智慧財產局員工消費合作社印製基酸亞序列所構成，該胺基酸亞序列係選自第2 8位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第2 8 位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第 1 7 0位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 0 3位胺基酸、第2 8位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、及第1 4 9位胺基酸至第2 8 6位胺基酸；該蛋白質、肽片段或融合蛋白質能夠誘使哺乳動物產生拮抗該乳房炎之保護性反應；以及免疫有效量之第二組成分，其包括能夠誘生對抗侵害哺乳動物之疾病或病況之保護性反應的抗原；以及獸醫學上可接受的載劑。 2 2 ·如申請專利範圍第2 1項之組合疫苗，其中該組合疫苗之第二組成分中的抗原能夠係根據其誘生保護性反應以對抗選自下列之疾病、病況、或病原，包括乳房炎 '牛泡疹病毒、牛呼吸道合胞病毒、牛病毒性下痢病毒、本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210Χ29<7公釐） -14 - 1225518 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍請先閱讀背面之注意事項再副流行性感冒病毒第I 、I I 、或I I ;[型，鉤端螺旋體屬 '彎曲桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、黴漿菌屬、克雷伯氏菌屬（Klebsiella spp·)、沙門氏桿菌屬，輪狀病毒、冠狀病毒、狂犬病病毒 '巴斯德氏菌屬、梭菌屬、破傷風毒素、大腸桿囷、及新孢子菌屬（Neospora spp.)。 2 3 ·如申請專利範圍第2 1項之組合疫苗，其另包括佐劑。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 4 · —種製備保護哺乳動物對抗由乳房鏈球菌感染所引起之乳房炎之疫苗的方法，其包括將免疫有效量的下列物質與獸醫學上可接受的載劑混合，該物質是（a ) PauA蛋白質，其係由SEQ ID 1^〇：2或3£〇 ID N〇：4中第26位胺基酸至第286位胺基酸之胺基酸序列所構成；或（b )肽片段，其係由PauA蛋白質之亞序列所構成；或（c )融合蛋白質，其包括融合在融合成員上的上述（a ) PauA蛋白質或（b )肽片段，其中該（b)肽片段係由SEQ ID 1\了〇：2或3£〇 ID N〇：4之胺基酸亞序列所構成，該胺基酸序列係選自第2 8位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 8 6 位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第 1 0 4位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 0 3位胺基酸、第2 8位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、及第1 4 9位胺基酸至第本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2ι〇χ297公釐）· 15 - 1225518 ABICD 六、申請專利範圍 2 8 6位胺基酸；該蛋白質、肽片段或融合蛋白質能夠誘生哺乳動物產生拮抗該乳房炎之保護性反應。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 5 . —種用於免疫接種哺乳動物以對抗由乳房鏈球菌感染所引起之乳房炎的套組，其包括第一容器，其中含有免疫有效量的下列物質，該物質是：（a ) PauA蛋白質，其係由SEQ ID N〇：2或SEQ ID N〇 :4中第2 6位胺基酸至第2 8 6位胺基酸之胺基酸序列所構成；或（b )肽片段，其係由PauA蛋白質之亞序列所構成；或（c )融合蛋白質，其包括融合在融合成員上的上述（a ) PauA蛋白質或（b )肽片段，其中該（b )肽片段係由SEQ ID N〇：2或SEQ ID N〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 :4之胺基酸亞序列所構成，該胺基酸亞序列係選自第 2 8位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 〇 4位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 0 8 位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第 2 8位胺基酸至第1 0 3位胺基酸、第2 8位胺基酸至第 2 0 8位胺基酸、及第1 4 9位胺基酸至第2 8 6位胺基酸；該蛋白質、肽片段或融合蛋白質能夠誘使哺乳動物產生拮抗該乳房炎之保護性反應；以及第二容器，其中含有獸醫學上可接受的載劑。 2 6 · —種診斷套組，其包括第一容器，含有下列物質：（a ) PauA蛋白質，其係由SEQ ID N 0 ： 2 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225518 六、申請專利範圍或SEQ ID NO: 4中第26位胺基酸至第286 位胺基酸之胺基酸序列所構成；（b )肽片段’其係由 PauA蛋白質之亞序列所構成；（c )融合蛋白質’其包括融合在融合成員上的上述（a ) PauA蛋白質或（b )肽片段，其中該（b)肽片段係由SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO:4之胺基酸亞序列所構成，該胺基酸亞序列係選自第2 8位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第 1 0 4位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第2 8 6位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第1 7 0位胺基酸、第1 0 4位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、第1 7 2位胺基酸至第 2 0 8位胺基酸、第2 8位胺基酸至第1 0 3位胺基酸、第2 8位胺基酸至第2 0 8位胺基酸、及第1 4 9位胺基酸至第2 8 6位胺基酸PauA ;該PauA蛋白質、肽片段或融合蛋白質與拮抗天然PauA蛋白質之抗體專一性結合；以及第二容器，其中含有第二抗體，該第二抗體係拮抗抗-PauA蛋白質之特異抗體。 2 7 ·如申請專利範圍第2 6項之診斷套組，其中該第二抗體進一步包括可測定之標幟。 2 8 · —種診斷套組，其包括含有寡核苷酸分子的容器，該分子可用於專一地擴大乳房鏈球菌之編碼pauA蛋白質的多核苷酸分子，其中該寡核苷酸分子係由選自 S E Q ID N〇·· 1 3至2 7之核苷酸序列或該 S E Q ID N〇：1 3至2 7之互補序列所構成。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）