TWI224108B - Interleukin-18-receptor proteins - Google Patents

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1224108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印黎 五、發明説明（1 ) 本發明的背景 1 ·本範圍的背景 本發明關於一種新穎的可識別一種特殊細胞素的受體 蛋白質，特別是，關於一種構成間白素一 1 8受體（以下 簡寫爲、、IL— 18R〃 ）的蛋白質或1 L—18R蛋白 質，及關於一種特定於1 L— 1 8R蛋白質的單株抗體。 2 ·先前技藝的說明 間白素1 8 (以下簡寫爲I L 一 1 8 )爲一種可促成 免疫系統中的訊號轉導的細胞素或物質。如日本專利公開 公報 27，189/96 及 193 ’ 098/96 號中所 揭示的及由哈魯奇。歐卡馬魯等人所著，載於 ''自然〃第 378 冊，第 6552 號，88 — 91 頁（1995)中 所說的，I L - 1 8在它被發現之後暫時被訂名爲”干擾 素- r的誘發因子〃：此項訂名稍後根據由辛白優西歐等 人所著，載於 ''免疫學期刊〃，1 5 6冊，4 2 7 4〜 4279頁（1 9 9 6)中所提出的內容而更名爲'' IL— 18〃 °IL— 18在自然型態中是由157個胺 基酸所組成的並具有誘發免疫活性細胞製造干擾素- r ( 以下簡寫爲I F N — r )的性質，此種干擾素一 r被認爲 是一種有用的生物活性蛋白質，並可誘發和加強殺傷細胞 的產生及其細胞毒性。對於I L 一 1 8在藥品中的不同用 途（如：做爲抗病毒，抗微生物，抗腫瘤及抗-免疫病變 的作用劑）目前正積極的發展和硏究，由於I L 一 1 8具 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

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-4- 1224108 A7 _____ _B7 五、發明説明（2 ) 有以上追些性資’所以含有含匕的藥品具有很大的前瞻性 〇 如上述中，在自然情況下，免疫系統中，包括I L 一 1 8在內的細胞素的分泌和製造是用來做爲訊號轉導的物 質。因此，當哺乳動物體內製造或給予哺乳動物過量的細 胞素時，會干擾免疫系統的平衡。一般哺乳類細胞的表面 可能會帶有一些負責辨識細胞素的部位或受體，而細胞素 必須連接至受體後才能轉導訊號。在正常免疫系統中，各 個細胞素和它們的受體間必須絕對保持平衡。因此，在本 領域中，除了釐淸I L — 1 8的生理學活性外，對於發展 並發現I L - 1 8在藥品方面的用途，以促進大量生產線 的成立並定出I L - 1 8受體的特徵一直期望甚殷。 本發明的總論 從前述觀點中，本發明的第1個目的是提供一種辨識 I L — 1 8的受體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 本發明的第2個目的是提供該受體做爲藥品的用途。 本發明的第3個目的是提供一種與該受體反應的單株 抗體。 本發明的第4個目的是提供一種可製造單株抗體的雜 交瘤。 本發明的第5個目的是提供一種用來製備單株抗體的 方法。 本發明的第6個目的是提供一種方法以利用單株抗體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） _ 5 - 1224108 A7 B7 五、發明説明（3 ) 來純化該可識別I L 一 1 8之受體的方法。 本發明的第7個目的是提供一種利用單株抗體來偵測 可識別I L — 1 8之受體的方法。 本發明的第8個目的是提供一種利用單株抗體 可識別I L 一 1 8之受體的作用劑。 本發明的第9個目的是提供一種利用單株抗體 I L 一 1 8的作用劑。 本發明的第1 0個目的是提供一種利用單株抗體來抑 來偵測 來抑制 制I L 一 1 8的方法。 本發明的第1 1個目的是提供一種利用可識別 1 8之受體所做成的作用劑來中和1 L 一 1 8 ° 本發明的第1 2個目的是提供一種利用可識別 1 8之受體來中和I L 一 1 8的方法。 我們很努力並大量地過濾許多可能達到 法，最後發現了 一種可識別出I L 一 1 8存 細胞的物質（L 4 2 8細胞爲一種 的類淋巴母細胞）。我們分離此物 它的本質類似蛋白質，且即使是在 請 先 閲 讀 背 ιέ 之 注 意 事 項 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

有很好的識別和連接 現由此鑑識出的I L L — 1 8 的 1 8 R蛋白 度免疫反應（如：自體免疫疾病） 有效，這是因爲在包括人類在內的 R蛋白質可辨識並中和IL一18 免疫系統。還有，我們以I L 一 1 衍生自何 質並辨識 被分離出 能力。同 質在治療 所導致的 哺乳類中 ，而I L 8 R蛋白

這些目 在於L 杰金氏 其特徵 來的型 時，我 和預防 許多疾 ，I L L - L — 的的方 4 2 8 病病人 ，發現 態中也 們也發 由於過 病上很 -18 一 1 8可活化 質做爲抗原， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -6 1224108 A7 _____ B7 五、發明説明（4 ) 可建立一種可製造單株抗體的雜交瘤，此種單株抗體爲一 種特定於I L - 1 8R蛋白質的單株抗體，且所製造出的 單株抗體在用來純化和偵測I L - 1 8 R蛋白質上確實有 用，在抑制I L - 1 8的生理學功能上也確實有用。由此 ’我們完成了本發明。

更特別的是，本發明的第一個目的可藉I L 一 1 8 R 蛋白質來達到 第二個目的可藉著一種含有I L 一 1 8R蛋 白質爲其有效成分的作用劑來達成。 本發明的第三個目的可藉著一種特定於I L — 1 8R 蛋白質的單株抗體而達成。 本發明的第四個目的可藉著一種可製造單株抗體的雜 交瘤來達成。 本發明的第五個目的可藉著一種製造單株抗體的方法 來達成，此方法包括下列步驟： 在體內或玻管內培養一種雜交瘤，此種雜交瘤可以製 造特定於I L 一 1 8 R蛋白質的單株抗體；及 自所產生的培養或體液中收集該單株抗體。 本發明的第六個目的可藉著一種純化IL一18R蛋 白質的方法達成，此方法包括下列步驟； 將特定於I L 一 1 8 R蛋白質的單株抗體與一種由 I L - 1 8 R蛋白質與污染物質所組成的混合物接觸，以 將IL一18R蛋白質吸附在單株抗體上；及 自單株抗體上脫去並收集該I L 一 1 8 R蛋白質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 夯 Ϊ 事 項 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

1 -JT 1224108 A7 B7 五、發明説明（ 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 本發明的第七個目的可以藉著一種偵測I L 一 1 8 R 蛋白質的方法來達成，此方法包括下列步驟： 使特定於I L - 1 8R蛋白質的單株抗體與樣本接觸 :及 經由發生的免疫反應來偵測I L 一 1 8 R蛋白質。 本發明的第八個目的可藉著一種偵測I L 一 1 8 R蛋 白質的作用劑來達成，此作用劑含有一種特定於I L -18R蛋白質的單株抗體。 本發明的第九個目的可藉著一種抑制I L 一 1 8的作 用劑來達成，此作用劑中含有特定於I L 一 1 8 R蛋白質 的單株抗體爲其有效成分。 本發明的第十個目的可藉著一種抑制I L 一 1 8的方 法來達成，此方法的特性是使一種特定於I L 一 1 8 R蛋 白質的單株抗體作用於IL一18R蛋白質上。 本發明的第十一個目的可藉著一種中和I L 一 1 8的 作用劑來達成，此作用劑中含有I L 一 1 8 R蛋白質爲其 有效成分。 本發明的第十二個目的可藉著一種中和I L 一 1 8的 方法來達成，此方法的特性是使I L 一 1 8 R蛋白質作用 於

L 1 8上。 在本發明中所使用的L 4 2 8細胞，已自1 12月24曰起在、、FERM BP5777〃 ，存放於日本工業科學和技藝處，生物科學和人 會之專利微生物存放所中。地址爲：1〜3海高 9 9 6年 添加號下 類技藝協 希1可米 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -8- 1224108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（6 ) ’蘇古巴一希，伊包拉奇肯，305日本。 附圖的簡單說明 第1圖顯示出單株抗體MAb # 1 1 7- 1 0 C在與 1 L 一 1 8競爭時會連結至L 4 2 8細胞和I L 一 1 8 R 蛋白質上。 弟2圖爲展不的中間產物色調影像。此影像所顯不的 爲凝膠電泳上的I L — 1 8 R，它是利用單株抗體M A b # 1 1 7 - 1 〇 C進行反應後再藉著西方點墨法來具像。 第3圖顯示的爲單株抗體MAb # 1 1 7 - 1 0 C對 I L 一 1 8活性的抑制作用。 第4圖爲使用單株抗體MAb# 1 17— 10C，將 I L - 1 8 R進行免疫親和層析法後所得的層析圖。 第5圖爲IL 一 18R的肽圖型。 第6圖顯示的爲重組DNA ''pCDM/1 1 7 — V L — V Η π 構造。 〔符號的說明〕 符號''1 17— VL — VH cDNA 〃是指在單株 抗體MAb # 1 1 7— 1 0 C中，負責編碼重鏈和輕鏈上 之可變區的cDNA。 符號'' P c m v 〃意指巨細胞病毒的啓動基因。 本發明的詳細說明 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公釐） -9 - 1224108 A7 B7 五、發明説明（8 ) 有：包括：淋巴球在內的已建立好的造血細胞’特別是 J M細胞、H D L Μ — 2細胞、Μ 0 L T - 1 6細胞及 PEER細胞（描述於、'癌症回顧〃第1〇冊，1 一 18 頁中，由、、米諾瓦達〃所著述），及類淋巴母細胞，（如 L428 細胞，FERMBP — 5777) ，KG— 1 細 胞（ATCC CCL — 246)及 U— 937 細胞（ A T C C CRL — 1593.2)，這是由於它們可以 迅速增生並產生所需要量的I L 一 1 8 R蛋白質。爲了自 細胞中收集I L 一 1 8 R蛋白質，可在培養後先以一種步 驟（如：超音波震盪）打碎細胞，然後，自細胞裂片中， 收集含有可辨設I L - 1 8的蛋白質部分。在培養細胞時 ，可在培養液中加入能誘發上述細胞中，IL — 18R蛋 白質的表現的物質，以使I L - 1 8 R蛋白質的產量顯著 增加，特別是，可藉著加入I L 一 1 2或I L 一 1 8來增

經濟部中央標準局員工消費合作社印I 加產量，其劑量約爲每1 X 1 〇 6個細胞中，加入〇 · 〇 1 pg至l//g (以lpg至l〇〇ng爲佳）。造血細胞 對這種物質的反應特別顯著，例如：在對I L - 1 2的反 應中，某些造血細胞可以產生二倍或更多的I L— 1 8R 蛋白質。在收集I L 一 1 8R蛋白質時，需將所培養的產 品以一般傳統常用於純化生物活性蛋白質的方法加以純化 ，這些方法有，如··鹽析法、透析法、過濾法、濃縮法、 分段沈澱法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、吸附層 析法、等電點聚集層析法、離水層析法、逆相層析法、親 和層析法、凝膠電泳法及等電點聚集凝膠電泳法，如需要 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X^97公釐）_ -11 - 1224108 A7 B7 五、發明説明（9 ) 時，可合倂使用。在免疫親和層析法中，使用特定於I L 一18R蛋白質的IL一18或本發明的單株抗體確實可 用最低的花費和人力來產生高純度的I L - 1 8R蛋白質 本發明的I L 一 1 8R蛋白質在治療和預 疫反應所 哺乳動物 質可識別 情況中， 會由於它 哺乳動物 移植時， 化T 一細 引起的不同 (包括人類 並連接在可 用來防禦身 的此種性質 接受器官（ 對同種異族 胞，而導致 種抗原入侵 過敏原。在 身物質的物 主接受異 身物質的 認爲是自 白質在治療和預防由 有效，因爲此I L — 疾病上有 )體中， 活化免疫 體不受有 而引起生 如：皮膚 抗原產生 發炎和淋 時也可發 自體免疫 質所引發 此種免疫 1 8 R蛋 顯著的 本發明 系統I 害物質 物體內 、腎臟 的排斥 巴球增 現，例 疾病中 。本發 反應所 白質在 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 括人類）後，可抑制或調節此種免疫 明中，感受性疾病一詞是指所有由增 的疾病，而這些疾病可利用I L 一 1 間接作用來治療及/或預防：特殊的 :與上述之器官移植相關的排斥反應 的自體免疫及過敏反應：惡性貧血、 效果，這 的I L — L - 1 8 侵犯的免 不受歡迎 、肝、心 和免疫反 生。類似 如：並不 ，過敏反 明的I L 引起的不 給予至哺 反應。因 加的免疫 8 R蛋白 感受性疾 及包括下 萎縮性胃 防由過度免 是因爲，在 1 8 R蛋白 上。在自然 疫系統可能 的結果。當 臟及骨髓） 應可能會活 的現象在宿 被δ忍爲是自 應必須由被 —1 8 R 蛋 同疾病上很 乳動物（包 此，在本發 反應所引起 質之直接或 病有，例如 列疾病在內 炎、胰島素 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 寫 本 頁 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） •12- 1224108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（10 ) 一抵 抗 型 糖尿病 韋 格納 氏 肉 芽 腫 病 > 盤 狀 紅 斑 性 狼 瘡 > 潰瘍 性 結 腸炎、； 令; 疑 氧素相關之疾病、 古巴斯德氏（ Good pasture ，s) 症候群， 原發性膽汁性 :硬 ί變， 交 感 神 經 系 的 眼 炎 、甲 狀 腺 機能過 多 症 、幼 年 型 糖 尿 病 謝 格 連 氏 症 候 群 自體 免 疫 肝炎、 白 體 πϋ 免疫 溶 血 性 貧 血 重 症 肌 4γγτ 無 力 系 統 性硬 皮 症 、系統 性 紅 斑狼 瘡 多 次 發 作 的 冷 血 色 素 尿 多 肌炎 、 結 節性動 脈 外 層炎 % 多 發 性 硬 化 症 阿 狄 孫 氏 病 出血 性 紫 斑、巴 塞 杜 氏病 X 貝 塞 特 氏 病 白 血 球 減 少 症 早期 經 絕 、類風 濕 性 關節 炎 風 濕 病 甲 狀 腺 炎 、 何 杰 金 氏病 、 Η I V — 感 染 症、 氣 喘 異 位 性 皮 膚 炎 過 敏 性 鼻 炎、 花 粉 病及蜂 毒 過 敏。 另 外 本 發 明 之 I L — 1 8 R 蛋 白質 在 治 療和預 防 由 於過 度 製 造 或 過 里 給 予 I F Ν — r 所 引起 的 敗 血性休克. 上〜 浪有效 〇 因 此 ，含本 發 明 之I L — 1 8 R 蛋 白 質 爲 其 有 效 成 分 以用 來 感 受性疾 病 的 作用 劑 有 下 列 多 種 不 同 的 用 途 ； 可 做 爲抗 — 白 體免疫 疾 病 作用 劑 > 抗 過 敏 劑 抗 炎 劑 免 疫 抑 制劑、 造 血劑、 白 血 球生 成 劑 血 小 板 生 成 劑 、 止 痛 劑 解熱 劑 而這些 用 途 可以 用 來 預 防 及 / 或 治 療 上 述 之 感 受 性疾 病 〇 根據本 發 明 之作 用 劑 通 常 是 製 成 液 體 懸 浮 液 膏狀 物 及 固體型 式 其中 所 含 有 I L — 1 8 R 蛋 白 質 _SL 里 爲 0 · 0 0 0 0 1 1 0 0 ' /1 Ν % ，以0 · C )0 丨0 1 2 0 W / w %較 佳 ， 其用 量 是 由 作 用 劑 的 型 式 和 感 受 性 疾 病的 類 型 和症狀 來決 定。 根 據 本發明 之 用 於感 受 性 疾 病 的 作 用 劑 包 括 那 些 僅 包 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13- 1224108 五、發明説明（11 ) 含I L 成物型 上可接 需要時 如血淸 蔗糖、 芽糖醇 。在組 ，糖類 白消安 氮雜鳥 一 1 8 式中， 受的載 ，其它 白蛋白 乳糖、 及乳糖 合中有 皮質激 、苯吡 嘌呤、 R蛋白質者及那 除作用劑外，還 體、賦形劑、稀 生物上的活性物 和明膠類的蛋白 麥芽糖、海藻糖 醇；③主要含有 用的生物活性物 A7 B7 些做成 含有， 釋劑、 質：穩 質；② 、山梨 磷酸鹽 質的實 胺芥、瘤可寧、硫唑嘌 8 -氮雜鳥嘌呤、5 - 組成物型 如：一或 佐劑、穩 定劑的實 糖類，如 糖醇、甘 或琥珀酸 施例有： 三乙撐硫 玲、疏基 氟基尿嘧 式者，在組 多種生理學 定劑及，如 施例有：① :葡萄糖、 露糖醇、麥 鹽的緩衝液 F K 5 0 6 代磷醯胺、 嘌呤、6 -啶、阿糖胞 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 苷、甲氨喋呤、白血寧、絲裂黴素C、柔紅黴素氫氯酸鹽 、放線菌素D、色黴素A3、博萊黴素氫氯酸鹽、阿黴素氫 氯酸鹽、環孢黴素A、天門冬醯胺酶、長春新鹼、長舂花 鹼、羥基脲、鹽酸甲基苇肼氫氯酸鹽、腎上腺皮質素及耳 膠；對除了 I L 一 1 8外之其他細胞素的受體拮抗劑有， 例如：分別對抗下列各物質的各抗體：間白素一 1受體蛋 白質，間白素一 2受體蛋白質，間白素一5受體蛋白質， 間白素一 6受體蛋白質，間白素一 8受體蛋白質及間白素 - 1 2受體蛋白質；及分別對抗下列各物質的拮抗劑：T NF — α受體，TNF — /3受體，間白素一 1受體’間白 素一 5受體及間白素一 8受體。 如本發明之用於感受性疾病的作用劑包括於最低劑量 單位的藥物：、、於最低劑量單位的藥物〃一詞表示那些製 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1224108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______ B7 _____五、發明説明（12 ) 備成五理單位型式的藥物，這種型式適合用於處方且其中 含有的I L 一 1 8R蛋白質量與其單一劑量或其倍數（至 多4倍）或其除數（至多1 / 4 0 )相符：此類型式之實 施例有：針劑、液體、粉末、顆粒、錠片、膠束、舌下含 片、眼藥水、鼻藥水及栓劑。如本發明之用於感受器疾病 的作用劑可以經由口服及腸胃道外等途徑給予，以在治療 或預防感受性疾病上展現出顯著的效果。更特別的是，本 I L 一 1 8 R蛋白質經由口服或腸胃道外途徑（如：皮內 的皮下的、肌肉內的或血管內的途徑）所給予的劑量約爲 1微克/次/成人至1克/次/成人，以劑量爲1 0微克 /次/成人至1 0 0毫克/次/成人者爲佳，給予次數爲 1〜4次/天或1〜5次/週，給予期限爲1天至1年。 本發明也關於一種特定於I L 一 1 8R蛋白質的單株 抗體。本發明的單株抗體可以利用I L — 1 8 R蛋白質或 其抗原片段來做爲抗原而製得此單株抗體，更特別的是， 可以藉著下列步驟來製備此單株抗體：首先，利用源自哺 乳類之可無限增生的細胞及源自哺乳類的以此種抗原免疫 過的抗體製造細胞來製備雜交瘤細胞；自雜交瘤中選出可 以製造本發明之單株抗體的克隆；再於玻管中或體中培養 該克隆。I L 一 1 8R蛋白質通常在做爲抗原前會先進行 部分或完全純化，且上述之步驟可用來製得此種I L -1 8 R蛋白質。爲了取得抗原片段，部分或完全純化的 I L 一 1 8R蛋白質需先進行化學的或酶的降解作用，或 者，進行肽的合成。只要細胞能表現I L — 1 8 R蛋白質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 項再填· 裝·

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θ -15- 1224108 經濟部中央標準局負工消費合作社印家

A7 _____B7五、發明説明（13 ) ’它們如何全部做爲抗原。 動物的免疫作用可用傳統方法進行： 述的抗原單獨注射或與一種適合的輔助劑 動物體內，注射途徑爲經血管內、肌肉內 的途徑並且餵食動物一段指定的時間。關 無限制，因此，任何動物不論牠們的種類 只要可以從牠們身上得到所需要的製造抗 這些動物都可以使用。齧齒類，如：大老 腮鼠都常使用，而當考慮到牠們與所使用 的相容性時，再從這些動物中選出最符合 原的劑量一般設定爲每隻動物全部約爲5 此劑量再分成2至2 0份，並以約1至二 別接種，其用量是根據所使用之哺乳動物 決定。在最後一次接種的三至五天後，將 萃取、打散，以得到製造抗體的細胞。 由此方法得到的製造抗體細胞再與一 物之無限增生細胞融合，可得到一種含有 胞融合產物。本發明中常用的無限增殖細 自老鼠骨髓瘤的細胞株，如：P 3 / N S 例如， 共同注 、皮下 於動物 、大小 體的細 鼠、小 之無限 需要的 至5 0 週的時 的種類 脾臟取 將一種上 射入哺乳 或腹膜內 的種類並 和性別， 胞，那麼 老鼠、及 增生細胞 種類。抗 0 β g， 間間隔分 和大小來 出並加以 種源自哺乳類動 目標雜交瘤的細 胞的實施例爲源 I / 1 - A g 4 一 1(ATCC TIB— 18) ，P3x63Ag8 細 胞（ATCC TIB — 9) ，SP2/0— Agl4 細 胞（ATCC CRL— 1581)及其 合可以用下列傳統方法來進行··①使用電 接合加速因子（如：聚乙二醇及仙臺病毒 突變種。細胞融 脈動器或②使用 )，例如：將抗 請 先. 閱 讀 背、 之 注 意

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 1224108 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A7 B7五、發明説明（14 ) 體製造細胞及源自哺乳類的無限增生細胞懸浮於含有加速 因子的細胞接合液中，二種細胞以比例約爲1 : 1至1 : 1 0混合，並於3 0至4 0 °c中培養約1至5分鐘。雖然 傳統介質如最低必須介質（Μ E Μ ) ，R Ρ Μ I - 1 6 4 0介質，及Μ尹斯可夫〃 （Iscove、）修正的杜貝可 (Dulbecco’s)介質都可做爲細胞接合液，但需在使用前， 先將其中之血淸（如：牛血淸）移走。 爲了選出目標雜交瘤，如上述方法所得之細胞接合產 物先轉入一種適當的篩選用溶液（如：H A T介質）中， 且在約3 0至4 0°C下培養3星期，直至除了雜交瘤外的 細胞均死掉。將雜交瘤細胞用平常方法加以培養，如此可 以在培養液中測試所分泌的抗體和I L - 1 8 R蛋白質間 的結合能力。這些測試可以用一般常用來測試抗體的傳統 方法進行，如：酵素免疫分析，放射免疫分析及生物分析 ，這些在''單株抗體實驗手冊〃中都有詳述，本書是由'' 沙古吉•多雅的〃及''泰米•安杜〃所著，於日本東京（ 1 9 9 1年）由古達夏科學公司所出版。此種能製造特定 於I L - 1 8 R蛋白質之單株抗體的雜交瘤立刻用限制稀 釋法加以克隆化，由此，可得到一種根據本發明之單株化 的雜交瘤。 本發明的單株抗體可藉著在玻管內或體內培養此種雜 交瘤來取得。培養雜交瘤則可利用一般培養哺乳類細胞的 傳統方法來進行，特別是，當培養是在玻管內的培養® i 進行時，單株抗體可自培養產品中收集到，而當此雜交瘤 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 項再填、 裝· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -17 - 4 1224108 Α7 Β7 五、發明説明（15 ) 是移植於非人類的溫血動物中或在體內培養時， 物的腹水及/或血液中收集該單株抗體。下述之 1 1 7 - 1 0 C具有下列優點：①對本發明的單 很高的生產力，②不論在玻管內或體內部都可以 培養。爲了自培養產品、腹水及血液中收集單株 使用一般常用來純化抗體的傳統方法··特殊方法 :鹽析法、透析法、過濾法、濃縮法、分段沈澱 交換法、凝膠過濾層析法、吸附層析法、等電點 法、離水層析法、逆相層析法、親和層析法、凝 及等電點聚焦凝膠電泳法，當需要時，這些方法 使用。純化後的單株抗體再經過濃縮和脫水法處 或固體以符合最終用途的需要。 則可自動 雜交瘤# 株抗體有 很容易地 抗體，可 有，例如 法、離子 聚集層析 膠電泳法 可以合倂 理成液體 請 先 閱 讀 背 之 注 意 項 再 填 寫 本 頁 間白素一 6 (以下簡寫成I L 一 6 )爲 它在製備如本發明的單株抗體上 使用抗原來免疫哺乳類時，若同 物I L — 6的話 L 一 6可明 有，若在抗體-製造細胞和無限 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

的接合液中加入I L 的話 -陽性比例，這樣可促進雜交瘤 生單株化的雜交瘤的培養液中加 的增生，且很顯著地增加雜交瘤 抗體產量明顯增加。不論是天然 樣有用，只要它們的來源是來自 所使用的無限增生哺乳類細胞。 很有用 時或在 顯地增 增生細 可增加 細胞的 AIL 的純度 的或重 相同的 本發明 。更特 接種後 加抗體 胞進行 細胞融 克隆化 可 種細胞素， 別的是，當 給予哺乳動 的效價。還 雜交時所用 合中的抗體 。在用來增 加速雜交瘤 而使本發明的單株 組的I 動物種 的單株 L 一 6均同 類且相同於 抗體也包括 -18- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1224108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______ B7五、發明説明（16 ) ''人類化的抗體〃，此種抗體通常以蛋白質工程法加以製 備，例如：m R N A是自上述之源自哺乳動物的雜交瘤中 收集到，並在逆轉錄酶的作用下得到c D N A，比 c DNA以P CR的方法放大並克隆化，由此，可決定本 發明之單株抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸順序，以及，那些 在重鏈和輕鏈上之可變區域的核苷酸順序。接著，再建構 一段嵌合性基因，此基因負責編碼由人類抗體中所發現的 恆定區域和可變區域所組成的I L - 1 8蛋白質。此種嵌 合性基因可製造一種單株抗體，此抗體的結合特性類似於 起始單株抗體的結合特性，但當它在適當的宿主中表現出 來時，其對人類的抗原性會明顯降低。 還有，帶有人類抗體中恆定區及常有之構造組織且帶 有在哺乳動物中必須有的互補決定區域（C D R s )的人 類化抗體可藉著下列步驟來製得：首先，先決定C D R s 的胺基酸順序，此胺基酸順序構成在重鏈和輕鏈上的抗原 結合區域；然後，將這些胺基酸順序（如需要時，與許多 落在C D R s附近的胺基酸一起）移植入人類抗體中（此 種抗體是帶有類似於起始單株抗體之三級結構的抗體）。 由下述之本發明的雜交瘤# 1 1 7 - 1 0 C所製造的單株 抗體MAb # 1 1 7 - 1 0 C在重鏈和輕鏈之可變區域中 所含有的胺基酸順序分別爲S E Q ID N 0 s ： 1 1 和1 2，而在雜交瘤# 1 1 7 - 1 0 C中，胺基酸順序 S E Q ID N〇s : 1 1和1 2分別由核苷酸順序 SEQ ID NOs : 19和20所編碼。在單株抗體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) 7Z " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 項再填. 裝· 訂

1224108 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印家 五、發明説明（17 ) #117— 10C 中，SEQ ID N〇s:13 — 1 5之胺基酸順序分別對應到重鏈上的三種C D R s ，即 :CDR1，CDR2 及 CDR3 而 SEQ I 〇 N〇s : 1 6 — 1 8之胺基酸順序則是對應在輕鏈上的三 種 CDRs ，即：CDR1 ，CDR2 及 CDR3 。一般 用來將哺乳類抗體人類化的方法是本領域中所知而與下列 參考資料相關的技術：例如：分子生物學的方法，第5 i 冊，由S ·保羅所著，胡馬那出版社所發出（紐澤西州， 多吐瓦，1995)。 本發明的單株抗體在用來純化I L - 1 8 R蛋白質的 免疫親和層析法中特別有用。用來純化I L 一 1 8 R蛋白 質的方法包含下列步驟：①使用本發明的單株抗體與由 I L - 1 8 R蛋白質和污染物所組成的混合物接觸，以將 I L — 1 8 R蛋白質吸附在單株抗體上，②自單株抗體上 釋出並收集I L — 1 8 R蛋白質；以上二個步驟通常在水 溶液狀態中進行。本發明的單株抗體經固定在塡充於分析 柱中之凝膠（由不溶於水的載體所做成的）後才可使用。 例如：細胞培養產物或它們的部分純化混合物先送入此種 分析柱中進行作用後，I L - 1 8R蛋白質便可大體上選 擇性地吸附在此種載體上的單株抗體上。吸附在單株抗體 上的I L - 1 8 R蛋白質可以經由改變單株抗體周圍的氫 離子濃度很容易地被釋放出來。例如：當使用的單株抗體 是屬於免疫球蛋白G ( I gG)時，用來洗堤I L 一 1 8 R蛋白質的釋出作用通常是在酸性環境下進行，以p Η 2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) d •項再填、 裝·

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -20- >1 1224108 A7 ______ B7 五、發明説明（20 ) 請 A 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 以抑制它們可能有的免疫反應。然後，將一種自何杰金氏 病人體中衍生出的類淋巴母細胞一 L 4 2 8細胞〃（ FERMBP — 5777)，以5xl05細胞/動物的量 ，以皮下注射的方式打入老鼠的背部，並且以平常的方式 餵食老鼠三星期。將在皮下長出的腫瘤塊（每一個約1 〇 克重）萃取出，打散後，用一般方法在不含血淸的 R Ρ Μ I — 1 6 4 0培養液（p Η 7 · 4 )中情況，由此 可得增生的細胞。 將一含 0 · 83W/V%NH4C 1 和 170mM T r i s - H C 1緩衝液（ρ Η 7 · 7 )的混合溶液（體 積比9 : 1 )以1 0倍於溼細胞重量的份量加入該增生的 細胞中，攪拌後，在2，0 0 0 r p m下離心1 0分鐘以 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 收集該細胞。將細胞懸浮於適當量的磷酸緩衝生理食鹽水 (以下縮寫爲'' P B S 〃 ）中，攬拌後，在2，0 0 0 r p m下離心後收集該細胞並再次懸浮於含1 m Μ MgCl2 的 10mM Tr i s— HC1 緩衝液（pH 7 . 2 )中，使細胞濃度約爲1 x 1 0 8細胞/毫升，緩衝 液中並且含有''P〇LYTRON〃 ，此爲一種由 ''金內 邁提卡AG公司〃（立陶/盧森，瑞士）所生產的細胞破 裂劑，可將細胞加以分割。將含1 m Μ M g C 1 2和1 Μ 蔗糖的lOmM Tris— HC1緩衝液（ρΗ7·2 )加入產物中，使蔗糖的最後濃度爲Ο · 2 Μ，然後再於 1 〇 0 0 r p m下離心以收集上淸液而收集到的上淸液再 於2 5 0 0 0 r p m下離心6 0分鐘，然後收集該沈澱物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

W7 IN 23 1224108 A7 B7 -*—-------_____ 五、發明説明（21 )

。在沈殿物中加入正確量的下列物質：1 2mM 3 —〔 (3 -膽醯胺基丙基）二甲氨基〕一 1 一丙烷磺酸（以下 簡寫爲、、CHAPS 〃 ），ImM苯甲基硫醯氟及10 m Μ乙二胺四醋酸（以下簡寫爲'' E D T A 〃 ），在4 °C 下’將混合物攪拌1 6小時後，在2 5，0 0 0 r p m下 離心6 0分鐘，再收集其上淸液。 將上淸液打入一分析柱中，其中塡有'' WHEAT GERM LECTIN SEPHAROSE 6B 〃，此爲一種用於親和性層析法 的凝膠產品，由、、法摩西爾.L K B生物技術A B 〃 （優 普塞拉，瑞典）公司生產。首先，此分析柱先在p B S中 以1 2 m M C H A P S達到平衡，然後再以含1 2 m Μ C H A P S的P B S沖洗之，接著，一邊注入以含有 0 · 5MN —乙醯基—D —葡糖胺和1 2mM CHAPS的PBS，一邊測量在波長280nm處的紫 外線吸收，來測定洗出液中的蛋白質含量。收集吸收爲 〇 · 1 6〜0 · 2 0的分液，由此可得約2 5公升的水溶 液，而蛋白質含量約爲lmg/m«，每1 〇12起始細胞。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ί屮 採取一小部分的溶液樣本，加入以1 2 5 I標示的人類 IL-184ng (標示方法是依照一般常用的方法來進 行），在4 °C下溫育1小時後，加入適當量的、、 POLYETHYLENE GLYCOL 6000 "(止匕爲一種平均分子量爲 6，0 0 0道耳吞的聚乙二醇製品，由德國包斯特費克的 E ·默克公司生產），並在冰冷的環境中置放3 0分鐘以 進行結合反應。將反應物在6，0 0 0 r p m下離心5分 本紙張尺度適用中酬家標準（CNS ) A4規格（2Κ)χ297公釐)ΖΤ 1224108 A7 B7 五、發明説明（22 鐘並將所產生的沈澱物收集起來以決定其放射程度。同時 ，另外準備控制組，其中含有3 // g未經標示的人類 L 一 1 8以及以 標示的人類I L 一 1 8 —起使用

，並以類似上述方法處理之。與控制組的比較時，可以發 現來自樣本溶液的沈澱物中所含的放射性明顯較高。這表 示自上述得來的水溶液確實含有I L 一 1 8R蛋白質，且 此IL—18R蛋白質在與IL—18接觸時，可辨識並 連接至I L — 1 8上。 實施例2 雜交瘤# 1 1 7 — 1 〇 C的製備方法 將B A L B / C小老鼠以L 4 2 8細胞， F ERMBR — 5 7 7 7進行免疫，其注射方式爲在6個 月中，注射1 3次，每隻老鼠每次注射的劑量爲5 X 1 0 7 個細胞，施打途徑是經由腹腔內注射。在自老鼠體中萃取 脾臟的前6天和前3天，各經由腹腔內注射1 μ g的I L 一 18R蛋白質（來自實施例 在最後一次注射的 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 尝 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 天後，自老鼠體中取出脾臟並打散之以取得可製造抗體的 脾臟細胞。 將脾臟細胞和衍生自老鼠骨髓瘤之S P 2 / 0 - A g 1 4細胞，A T C C C R L — 1 5 8 1 ，一起懸浮於不 含血淸的RPMI — 1640介質（PH7 · 2，培養液 需事先暖至3 7 °C )中，細胞密度各爲3 x 1 0 4細胞/毫 升及1 X 1 0 4細胞/毫升。將懸浮液加以離心以收集沈澱 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -25- 1224108 A7 —_______ 五、發明説明（23 ) 物’再於沈澱物中一滴滴地加入1毫升之含有5 0 W/ V %聚乙二醇的無血淸RPM I - 1 6 4 0培養液（pH 7 · 2 )，加入時間超過1分鐘。接著，再將所產生的混 合物在3 7 °C下溫育1分鐘。然後，將無血淸prm I -1 6 4 0介質（p Η 7 · 2 )再繼續滴入混合物中，以使 最後體積爲5 0毫升，並加以離心以收集沈澱物。將沈澱 物懸浮於Η Α 丁介質中並分裝入9 6凹槽的培養盤中，每 一凹槽中的體積爲2 0 0 // 1 。將微量培養盤置於3 7 t 中溫育1星期，可以形成1 2 0 0種的雜交瘤。將來自雜 父瘤的上淸液以一種方法進行分析以硏究其結合力，其方 法說明於實施例3 - 2 ( a )中。經由此分析便可知道那 種雜交瘤所產生的上淸液能有效抑制I L - 1 8連結至 I L 一 1 8R蛋白質上，或是能抑制I L 一 1 8連接至 L 4 2 8細胞上，然後再將此種雜交瘤篩選出。將傳統的 限制稀釋法重覆應用於選出的雜交瘤上，並將可製造本發 明之單株抗體的雜交瘤# 1 1 7 - 1 0 C予以克隆化。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實施例3 單株抗體MA b # 1 1 7 - 1 0 C的製備方法和特徵描述 實施例3 — 1 單株抗體MAb#l 17 — 10C的製備方法 將由實施例2得到的雜交瘤# 1 1 7〜1 〇 C懸浮於 含1 0V/V%胎牛血淸的PRMI/6 40介質（pH 7 · 2 )中，使懸浮液在3 7 °C，5 V / V % c〇2的培養 本紙張尺度適用中國國家標準( CNS ) A4規格（210X 297公i") ^26 . 1224108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

V A7 -——^___B2__ 五、發明説明（24 ) 箱中進行溫育，並一邊測量細胞密度，使成爲1 X 1 0 6細 胞/毫升。當細胞密度達到所需要的程度後，將雜交瘤 # 1 1 7 - 1 0 C細胞經腹腔內打入B A L B / C小老鼠 中’每隻老鼠的量爲1 X 1 0 7個細胞。這些老鼠在注射細 胞前，事先經腹腔內注射以0 . 5 m 1的、、 PRISTANE"(爲一種由美國米爾瓦奇 ''西德利克 化學公司〃所販售的試劑，此試劑爲2，6，1 0，1 4 -四甲基五癸烷）。注射後的老鼠以平常方式餵食一星期 〇 自老鼠體中收集腹水並將硫酸銨加入其中，使成6 0 %飽和液再使反應液在4 °C下靜置5小時。將產生的反應 物加以離心以收集沈澱物，再使之溶於5 0 m Μ ΚΗ2Ρ〇4 (ΡΗ6 · 8)中並對新鮮製備之相同溶液進 行透析一整晚。將透析液注入含羥基磷灰石的分析柱中。 依序將 100mMKH2P〇4 (ρΗ6 · 8)及 300 mMKH2P〇4 (ρΗ6 · 8)灌注通過分析柱，而本發 明的單株抗體MA b # 1 1 7 - 1 0便會隨著3 0 0 mMKH2P〇4洗堤出來，每隻老鼠的產量約爲5mg。 以傳統方法加以分析後，證實單株抗體M A b # 1 1 7 -10C屬於I gG類型。 實施例3 - 2 單株抗體MAb # 1 1 7 - 1 0 C的特徵描述 實施例3 — 2 ( a ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 項再填- 裝-

、1T

1224108 A7 B7 ------ 五、發明説明（25 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 對I L 一 1 8 R蛋白質的結合能力 將L 4 2 8細胞（F E R Μ B P — 5 7 7 7 )懸浮於 含0·1V/V%牛血淸白蛋白和〇·lV/V%NaN3 的R Ρ Μ I — 1 6 4 0介質（p Η 7 · 4 )中，使細胞密 度成爲4 X 1 0 7細胞/毫升，而自實施例3 - 1中得到的 單株抗體NAb # 1 1 7 - 1 0 C則溶於另外製備的含 0.1界/又％牛血淸白蛋白的11?“1一1 6 40中， 以得到下列幾種不同濃度的抗體溶液：〇 . 〇 1 9 // g / ml，〇.209//g/ml，2.3//g/ml， 25 · 3//g/ml 及 139 · 5//g/ml。 將上述製得的細胞懸浮液以每小份5 0微升與各種不 同濃度之單株抗體溶液5 0 // 1混合，在4 °C下攪拌2小 時後，加入含有0 · 1V/V%牛血淸白蛋白及4ng之 以1 2 5 I標示的人類I L — 1 8的R Ρ Μ I — 1 6 4 0介 質5 0 // 1中，在相同溫度下，繼續攪拌3 0分鐘。接著 ，在每一組細胞懸浮液中加入含有二丁基酞酸酯和二辛基 酞酸酯的混合溶液（體積比1 : 1 ) 2 0 0 // 1 ，並於 10，000 r pm，20 °C下離心5分鐘，再收集所產 生之含有細胞的沈澱物。將這些細胞以、、Μ 0 D E L ARC—300〃 （由日本東京艾洛卡公司，所販售的丙 型射線計算器）測定其放射性。 同時，再準備二組不含單株抗體的控制組。在控制組 中，將4 n g之以 1 2 5 I標示的人類I L — 1 8，以類似 處理樣本的方法處理，且二組控制組分別含有未標示的人 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -28 - 请 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 存 t 1224108 A7 B7 五、發明説明（27 稱爲全部連接組 的放射程度列於 射性也一起列入 中〇 及非特定連接組）。將在這二部分中發現 式1中，還有，在樣品測試組中發現的放 ，以計算抑制百分比。結果顯示於第1圖 如第1圖中所見的，在使用L 4 2 8細胞和使用溶於 溶液中的I L 一 1 8 R蛋白質的二種情況中，當單株抗體 7 — 10C的濃度上升時，IL 一 18連 胞和連接至I L 一 1 8R蛋白質的作用會 。這表示單株抗體MAb #117— 0C會與I L 一 18競爭來連接至在L428細胞上的 白質，且由實施例1之方法所得的水溶液 MAb #11 接至L 4 2 8細 受到較大的抑制 I L — 1 8 R 蛋 中確實含有一種 ，含有該1乙一 #117-10 應。 能辨識I L 一 1 8的蛋白質或是水溶液中 18R蛋白質，且單株抗體MAb C會特定地與IL一18R蛋白質進行反 請 先 閱 讀 背 面 I 事 項 再 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實施例3 - 2 ( b ) 西方點墨法 先取一部分由實施例1之方法所得到的含有I L - 1 8 R蛋白質的水溶液，再於一含有2 · 5 w / v %十二 \ 烷基硫酸鈉和5 v / v %甘油的混合溶液中採取體積爲樣 水溶液之2 / 3的量加入上述之樣本溶液中。在3 7 °C下 溫育1小時後，在傳統之S D S — P A G E上藉著使用 1 0 - 2 0 %梯度凝膠’但不使用還原劑的情況下’將此 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -30- 1224108 A7 _____ __B7_ 五、發明説明（29 ) 3 〇 ’ 〇 〇 〇道耳吞），胰蛋白酶抑制劑（2 0，1 0 0 道耳吞）及α —乳白蛋白（1 4，0〇〇道耳吞）。結果 顯示於第2圖中。 在第2圖的凝膠電永中，第2道（含單株抗體）帶有 一道淸楚的帶子，此帶在第3道（不帶有單株抗體）中不 曾發現。 實施例3 - 2 ( c ) 對I L 一 1 8活性的抑制作用 將一種已建立好的細胞株K G - 1細胞（A T C C C c L 2 4 6 )(此細胞係衍生自急性骨髓性白血病的病 人）懸浮於含有1 0 v / v %胎牛血淸，1 〇 〇 # g /j 卡那黴素，及18 · 8mM Na2HP〇4的RPMI — 1640介質（pH7 · 2)中，使細胞密度爲lxlO7 細胞/毫升，然後，加入由實施例3 - 1的方法所得到的 單株抗體MAb #1 17 - 10C，使其濃度爲10 //g/m£，並於37X：下，溫育30分鐘。 經濟部中央標準局工消費合作社印製 將懸浮液中的K G - 1細胞分配在9 6凹槽的微量培 養盤中以使各凹槽中的含量爲5 0 V 1 。在每一凹槽中加 入5 0# 1之人類IL — 18，這些IL 一 18事先先溶 於新鮮製備的相同介質中，以製成下列各濃度：〇 n g / j，1 · 56ng/m£，3 · 12ng/m£，6 · 25 ng/m£，12 · 5ng/m£ 及 25ng/m£，。進一步 將溶於新鮮製備之上述介質中的脂多糖類濃度爲5 # g / 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐）-& 1224108 A7 — B7 五、發明説明（3〇 ) J)各取50# 1加入每一凹槽中，並於37 °C下，溫育 2 4小時培養完畢後，收集每一凹槽中的上淸液並以傳統 的酶免疫分析測量I F N - r的含量。同時，準備不含單 株抗體M A b # 1 1 7 - 1 0 C的控制組，各控制組中 含不同濃度的I L - 1 8，並以類似上述方法處理之。所 得結果顯示於第3圖中。在第3圖中的I F N — r成分可 以標準化之I FN — r製品Gg23 — 90 1 — 530爲 參考來做校準，標準化的I F N — r製品G g 2 3 -9 0 1 - 5 3 0可自美國國際健康組織取得，其結果以國 際單位（I U )來表示。

第3圖中的結果表示單株抗體MAb #117-1 0 C的存在可抑制免疫活性細胞K G - 1細胞中之I L —18誘發IFN - r。這也表示單株抗體MAb # 1 1 7 — 1 0C會與I L — 1 8競爭來阻擋在KG — 1 細胞表面上的I L 一 1 8 R蛋白質，由此，可防止I L 一 1 8將訊號轉導至K G - 1細胞。 實施例3 — 3 可變區域的胺基酸順序及互補決定區域的鑑定 實施例3 — 3 ( a ) 在重鏈上之可變區域的胺基酸順序 用一般方法將雜交瘤# 1 1 7 - 1 〇 C懸浮於含1 〇 V/V%胎牛血淸的R PM I — 1 6 4 0介質中，並於 3 7 °C下一邊進行溫育，一邊測量細胞密度。當細胞密度 請 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -33 - 1224108 A7 ________ B7 五、發明説明（31 ) 達指定程度時，收集增生的細胞並懸浮於含6 Μ異硫代氰 酸胍和〇 · 5 W / V % Ν -月桂基肌胺酸鈉的1 0 m Μ檸 檬酸鈉（ρ Η 7 · 0 )中，然後再用均勻器將其打散。將 含 5 . 7 M CsCl2 的 0· lMEDTA(pH7. 5) 一小份一小份注入3 5毫升離心管中，並將自上述得來的 細胞均勻液一小份一小份置於每一根管中溶液的上層，然 後’將準備好的離心管於2 0 °C，2 5，0 0 0 p P m下 超速離心2 0分鐘，再收集並集中該RNA分液。將 RNA分液分置於1 5毫升離心管中，加入等體積的氯仿 / 1 一丁醇（體積比4 : 1 )，攪拌5分鐘後，在4 °C ’ 1 〇 0 0 0 r p m下離心1 0分鐘以收集各水溶液層，然 後’再加入2 · 5倍體積的乙醇，於一 2 0 °C下，靜β 2 小時，使全部的R Ν Α沈澱下來。收集全部的R Ν Α後’ 以7 5 V / V %乙醇水溶液沖洗，再溶於〇 · 5毫升之無 菌蒸餾水中，由此可得一水溶液，其中含有來自雜交瘤# 117 - l〇C 的全部 RNA。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在由此獲得的水溶液中加入0 · 5毫升之1 〇 m Μ Tr i s— HC 1緩衝液（ρΗ7 · 5，其中含有lmM E D T A和〇 · 1 W / V % Ν —月桂基肌胺酸鈉），使全 部體積爲1毫升。在混合物溶液中加入1毫升的、、 OL I G〇TEXTM-dT30<SUPER>// (此爲 一種由日本東京日邦羅屈k · k ·公司販售的乳膠，它帶 有（d T ) 3 Q的寡核苷酸）。使混合物在6 5 t下，反應 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1224108 A7 _— _ B7 五、發明説明（32 ) N a C 1加入反應混合物中，在3 7 °C下，置於1 0分鐘 並於1 0 0 0 0 r p m離心1 〇分鐘，離心後，收集所產 生的沈澱物，將沈澱物懸浮於0 . 5毫升之無菌蒸餾水中 ，於6 5 °C下，置於5分鐘，以自乳膠中脫去R N A。將 適量的乙醇加入所得之水溶液中並收集所產生的沈澱物加 以冷凍乾燥，由此，可得一 m R N A的固體。 將下列各項物置於0 . 5毫升之反應管中：4 // 1的 2 5 m M MgCl2，2//l 的 100mM Tris — ^1<：1(?^18.3，內含50〇1111^ K C 1 ) 1 μ I 的25mM dNTP混合物，〇 · 1的40單位/ // 1核糖核酸酶抑制劑及1 // 1的2 0 0單位/// 1逆轉 錄酶。將由上述得到的mRNA 1 Ong與適當量的隨 意的六核苷酸加入該反應管中，並加入無菌蒸餾水使全部 體積成爲2 0 // 1 。將所產生的混合物先於4 2 °C下，溫 育2 0分鐘，再於9 9 °C下，溫育5分鐘，由此可得一種 含有第一股c D N A的混合物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在20// 1的反應混合物中加入1// 1的2 · 5單位 / # 1 '、CLONED PFU POLYMERASE "(此爲由美國力口州 史翠塔基因克隆系統〃公司所販售的一種D N A聚合酶） ，5 μ 1之反應緩衝液及1 V 1的1 0 m M d Ν Τ Ρ混 合物（此二種亦由史崔塔基因克隆寧系統公司所販售）。 還有，將正確量的寡核苷酸加入其中（此寡核苷酸是以核 苷酸順序爲、、5 GGGAATTCATGRAATG SASCTGGGTYWTYCTCTT — 3，夕者作爲 -35- 本紙張尺度適用中^國家標準（〇奶了六4規格（210'乂297公釐| 1224108 A7 —__________— B7 五、發明説明（33 )

感覺引物，以核苷酸順序、' 5 , - CCCAAGCTTA GAGGGGGAAGACAT 丁丁 GGGAA_3,,, 者作爲抗感覺引物’二者均是以P C R引物爲基礎經化學 方法合成，其合成方法於下列刊物中有所描述：凱柔伊諾 所著，載於 '、免疫學〃方法期刊，p p · 2 7 — 3 2中（ 1996))，再加入無菌蒸餾水使全部體積爲1〇〇 # 1 。並進行3 5次的下列循環··在9 4 c下溫育丨分鐘 ，在5 0°C下溫育2分鐘，然後7 下溫育2分鐘，以 進tjPCR反應，由此，可得一段含有seq ip No : 2 1的DNA片段。 實施例3 - 3 ( b ) 在輕鏈上可變區域的胺基酸順序

將自實施例3 - 3 ( a )之方法得來的反應產物（其 中含第一股c D N A )以類似於實施例3 — 3 ( a )的方 法處理，但感覺引物以核苷酸順序爲、、5， 一 A C T A G TCGACATGAGTGTGCTCACTCAGGt 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CCTGGSGTTG— 3〃者取代，抗感覺引物以'' 5’ - GGATCCCGGGTGGATGGTGGGa A G A T G — 3 ’ 〃取代，這二種引物均依照由s ·達倫 瓊斯所著之生物/技術第九冊，P · 8 8 - 8 9 ( 1 9 9 1 )中的方法，以P C R引物爲基礎經由化學方法 合成。由此，可得到另一段含S E Q IN N 0 ： 2 2 之核苷酸順序的D N A片段。 -36- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1224108 A7 ______B7 五、發明説明（34 ) 貫施例3 - 3 ( c ) 請 先 閱 ii 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 互補-決定區域的鑑定 在抗體中的輕鏈和重鏈上的可變區在結構上彼此相似 ，它們一般含有三個CDR s及4個經由CDR s連接的 構架組織。還有，一般而言，在同基因抗體的情況中，構 架組織的胺基酸順序保存得相當好，然而，在特殊抗體的 C D R的胺基酸順序中可發現一個很明顯的變化。因此， 我們將在實施例3 — 3 ( a )和3 - 3 ( b )中所決定的 胺基酸順序與那些在老鼠抗體中經證明的可變區的胺基酸 順序進行比較和對照，得到下列結論：在單株抗體M A b # 1 1 7 - 1 0C中，重鏈上的CDRs帶有胺基酸順序

SEQ ID N〇：13(屬於 CDR1 的），SEQ ID N〇：14(屬於 CDR2 的）及 SEQ ID N〇：15 (屬於CDR3)，而輕鏈上的CDRs帶有 胺基酸順序S E Q ID N〇：1 6 (屬於C D R 1 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ，SEQ ID 1^〇：17(屬於00尺2)，及 SEQ ID 1^〇：18(屬於〇0113)。 實施例3 - 3 ( d ) < 負責編碼可變區域之重組D N A的構造 在由實施例3 — 3 ( a )得到的D N A片段（此片段 負責重鏈上之可變區域的編碼）1 〇 n g中加入下列物質 ·· 1 // 1 之 2 · 5 單位 / // 1、、CLONED Pfu -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1224108 A7 __ B7 — ~ —— .......... —— " _··ι . 五、發明説明（35 ) POLYMERASE 〃 （由美國加州史崔塔基因克隆寧系統所販 售），1 〇 # 1之緩衝液（由美國加州史崔塔基因克隆寧 系統所販售），及1 // 1之2 5 m M d Ν Τ Ρ混合物， 再加入適當量之寡核苷酸（以核苷酸順順序a 5 ’ 一 T C ACTCGAGGCCACCATGAAATGCAGC TGGGTT— 3，爲感覺引物，以、、5， 一 GAGG ATCCTCCTCCTCCCGATCCTCCTCC ACCTGCAGAGACAGTGAC — 3，"爲抗感 覺引物），及無菌蒸餾水，使全部體積爲100// 1。將 混合物先進行3次循環（每一次循環依序爲：在9 4 °C下 ，溫育一分鐘，42 °C下，溫育2分鐘及72 °C下，溫育 3分鐘），再進行3 5次循環（每一循環依序爲在9 4 °C 下溫育1分鐘，60 °C下，溫育2分鐘及72 °C下，溫育 3分鐘），以進行P C R反應，由此，可得一段包含下列 各項的D Ν A片段：s E Q ID N 0 ·· 2 1的核苷酸 )順序，一個限制酶X h ο I的消化部位和一般（科札克 )kozak’s順序（此二者均連接在S E Q ID N〇·· 2 1的5 ’ 一端），及一個限制酶B a m Η I作用的消化 點，一個連接者之一部分的順序（此二者均接在S E Q I D Ν 〇·· 2 1 的 3 ’ 一端）。 另一方面，將由實施例3 — 3 ( b )的方法所得的 DNA片段（此片段是負責輕鏈上之可變區的編碼）1〇 n g，以類似上述方法處理，但是以核苷酸順序爲'' 5 ’

一 TCGGATCCGGAGGAGGAGGATCGG 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1224108 A7 __________ B7 ________ 五、發明説明（36 ) ACATCCAGATGACTCAG— 3’ "者爲感覺 引物，以、、5’ 一 GAAGCGGCCGCATCATT AGTGATGGTGATGGTGATGCCGTTT TATTTCCAG— 3’ 〃爲抗感覺引物。由此，可得 一段包含下列各項的D N A片段：S E Q ID NO: 2 0的核苷酸順序，限制酶B a m Η I的消化作用點，及 一個連接者之一部分的順序（以上二者都連接在S E Q ID N〇：2 0的5 ’ 一端），一個限制酶N 〇 t I的 消化作用點在（H i S ) 6中之t a g的順序（以上二者均 連接在SEQ ID N〇：20的3> —端）。 由此得到的二種D N A片段以限制酶B a m Η I處理 ，並以Xha I或No t I處理，再加入l〇ng之、、 p C D Μ 8 後，利用 ' LIGATION KIT VERSION 2在 1 6 t：下進行反應2小時。其中p C D Μ 8 〃爲〜種由 美國聖地牙哥 ''因維特洛基因公司〃所販售的質體媒體， 此質體媒體需先以限制酶X h ο I和Ν 〇 t I消化，而、、 KIT VERSION 2 〃是一種由日本西嘉州歐蘇市的達卡羅蘇 柔公司所販售的接合試劑組。反應後，可將二種D Μ A片 段嵌入質體媒體中。然後，用一般方法，利用質體D N A 將'、MCl〇6 1/ P3〃 （爲一種大腸菌種，由美國聖 地牙哥 > 因維特洛基因公司〃所販售的）加以轉化。在觀 察所產生的轉化株C D Μ / 1 1 7 - V L - V Η 〃時， 可發現：在嵌入轉化株、'CDM/1 17 — VL — vH2 "的 cDNA 、'117— VL — VH cDNAy/ 中，有 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210X297公酱1 ~ - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

0 1ί\. 1224108 A7 _______B7 五、發明説明（3了） 一段負責編碼單株抗體MAb # 1 1 7 - 1 〇中之輕鏈和 重鏈上可變區域的cDNA 、、pCDM/l 1 7 - VL — V Η 〃是連接在巨細胞病毒啓動基因'' p c m v 〃的下流 (顯示於第6圖中）。 實施例3 — 3 ( e ) 轉化株的製備方法及D N A的表現 將由實施例3 — 3 ( d )中所得的轉化株、、c D Μ / 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 1 7 — VL — VH 〃種在含2 0//2//|^氨干:青黴素和 l〇//g/m£四環黴素的LB介質（pH7 · 5)中，於 3 7 °C下’培養1 8小時，然後，自培養中收集該細胞並 以一般方法處理以得到質體D N A。另外，將衍生自非洲 綠猴子胃臟的纖維母細胞株C〇S - 1細胞（A T C C C R L - 1 6 5 0 )以一般方法加以增生。同時，將上述 得到的質體D N A 2 0 // g以傳統電穿孔法將其引入1 X 1 0 7個增生的C〇S — 1細胞中，以得到轉化株細胞。 將、ASF 104〃 （一種由日本東京艾吉諾馬多公司 販售的不含血淸的培養液）分裝於平底培養瓶中，種入轉 化的C〇S — 1細胞使每一瓶中的細胞密度爲1 X 1 〇 5細 胞/毫升，並以一般方法，在37 °C下， 5V/V% C〇2培養箱中培養4天，以表現出具有胺基酸順序S E Q ID NO:23的IL—18蛋白質。自培養中收集 上淸液，並將之塡入'' N i — N T A 〃分析柱中（N i -N T A 〃爲一種用於親和層析法中的凝膠，由德國希爾 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X 297公釐） 1224108 A7 ____ _ ___ B7 五、發明説明（38 ) 請 先 閱 ή 背 & 意 事 項 再 填 寫 本 頁 登，QIAGEN GmbH公司所販售）。然後，先以含2 0 m Μ 咪唑的P B S灌入分析柱中，以移去未被吸附的成分，然 後，邊注入含2 5 OmM咪唑的PB S，一邊將洗出液進 行分餾直至達指定量。 將 L 4 2 8 細胞（F E R Μ Β Ρ — 5 7 7 7 )懸浮 於含0·1V/V%牛血淸白蛋白和〇.1W/V% NaN3的RPMI—1640介質中，使細胞濃度爲lx 1 0 8細胞/毫升。在每小份5 0 // 1的細胞懸浮液中加入 自上述得到的分餾液5 0 // 1 ，並在4 °C下攪拌1小時。 然後，在每一混合物中加入4 n g之以1 2 5 I標示的人類 I L 一 1 8 (此I L 一 1 8是溶於與上述溶液相同之新鮮 製備的RPM I - 1 6 4 0介質中）使最後的體積成爲 1 5 0 // 1 ，再於4 X：下，繼續攪拌3 0分鐘。將此混合 溶液置於2 0 0 # 1之二丁基酞酸酯/二辛基酞酸酯（體 積比1 : 1 )混合液的上層，並於2 0 t： 1 0 0 0 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 r P m下離心5分鐘。離心後，收集所產生的沈澱物，並 利用、、MODEL ARC — 300（此爲一種由日本 東京艾洛卡公司販售的r -光計算器）來測量其放射性的 程度。結果發現：自含有I L 一 1 8蛋白質之分餾液中所 產生的沈澱物，其放射活性明顯低於別種分餾液之沈澱物 的放射活性。此結果確定了，S E Q ID N 0 s ： 1 1和1 2分別爲單株抗體MAb# 1 1 7 - 1 0C中之 重鏈和輕鏈上可變區的胺基酸順序。 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）_ 41 _ .-Γι\ 1224108 A7 B7 五、發明説明（39 ) 實施例4 1 L 一丨8 R蛋白質的純化和部分胺基酸順序 實施例4 一 1 I L〜1 8 R蛋白質的純化 將由實施例3 — 1之方法得到的單株抗體M A b # 1 1 7 - 1 0 C 7 8mg溶於適量的蒸觀水並中將此溶 液對含0 . 5 Μ N a C 1的硼酸鹽緩衝液（ρ Η 8 · 5 )在4 °C下進行透析1 6小時。然後，用一般方法，在此 透析溶液中力口入適量的、、CNBr-ACTIVATED SEPHAROSE 4 B 〃 （此爲一種由瑞典優普莎拉之法馬西亞L K B生物科技 公司所販售的C N B r —活化的凝膠），並在4 °C下，一 邊攪拌一邊進行反應以固定在凝膠上之單株抗體MA b #

7 - 1 0 C 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將凝膠塡入在塑膠圓柱內的分析柱，以2 m Μ C H A P S平衡之並注入由實施例1得來之I L 一 1 8R蛋白質的水溶液，再使用含1 2mM CHAPS 的P B S來移走未被吸附的成分。一邊將含2mM CHAPS (pHl · 8)的 35mM 乙胺（ ρ Η 1 0 · 8 )注入分析柱中，一邊收集該洗出液，以每 8毫升之分餾液爲一收集單位再檢查此分餾液中是否含有 I L 一 1 8 R蛋白質，檢查方法是使用1 2 5 I標示的人類 I L 一 1 8，利用實施1中的方法進行。由此操作得到的 層析圖顯不於第4圖。 如第4圖中所見，在免疫親和層析法中，並將單株抗 -42 請 先 閲 讀 背 ιέ 意 事 項 再 填 寫 本 頁 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 1224108 A7 B7 五、發明説明（4〇 體# 7 — 1 0 C加至由I L 一 1 8 R蛋白質和污染雜 質（如··實施例1中之I L 一 1 8 R蛋白質的水溶液）所 組成的混合物時 L 一 1 8R蛋白質是在一個單一尖峰 處被洗提出。收集此單一尖峰處所對應的分餾液，加以集 中並將之冷凍乾燥，由此，可得一固體狀的經純化的I L —1 8 R蛋白質。然後，採取一部分純化的I L 一 1 8 R 蛋白質，於100 °C下，在PBS中溫育5分鐘，並以實 施例3 - 2 ( a )的方法檢查其剩下的活性。結果並沒有 發現任何與I L 一 1 8連接的跡象，此結果證實了 I L 一 1 8 R蛋白質會受熱影響而失去活性。這結果支持本受體 的本質爲類似蛋白質的假設。 還有，將一部分由上述得到的經純化的I L 一 1 8 R 蛋白質溶於適量的P B S中，在周圍溫度下，對P B S透 析一整晚，再加入適量之由實施例1中所製備得到的以

標示的人類I L 一 1 8及1 m Μ '' B S (此爲一 請 先 閱 讀 背 5 ί 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印« 種由美國洛克福之皮爾斯公司所販售的聚合作用劑），並 在0 °C下置放2小時以形成一個由I L 一 1 8 R蛋白質和 以1 2 5 I標示的人類I L 一 1 8所組成的共軛物。將 T r i s —緩衝液（P Η 7 · 5 )加入反應混合物中，使 之在0 °C下繼續置放1小時’以懸浮該共軛的反應混合物 。接著，在SD S — PAGE上’利用一組分分子量記號 並以二硫代蘇糖醇做爲還原劑將此共軛混合物分成相對的 類蛋白質成分’並進行自動放射照像° 由人類I L 一 1 8 R蛋白質和以125 I標不的人類 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐）_ 43 _ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ίτ^} ιά 1224108 A7 _ B7 五、發明説明（41 ) 1 L〜1 8所組成的共軛物約爲5 0 0 0 0至 2000000道耳吞。既然IL— 18的分子量爲 2 〇 0 〇 〇道耳吞，當假設I L 一 1 8R蛋白質會與一個 人類I L — 1 8分子結合時，I L 一 1 8 R蛋白質約可估 爲 30，〇〇〇 一 180，000 道耳吞。 實施例4 一 2 IL—18R蛋白質的肽圖型 由實施例4 一 1的方法所得之純化的I L 一 1 8 R蛋 白質可以利用7 · 5 w / v %凝膠，以2 w / v %二硫代 蘇糖醇做爲還原劑在SD S - PAGE上進行電泳，並且 將此凝膠在一種由4 0 v / v %甲醇水溶液和1 v / v % 醋酸所組成的混合溶液中浸泡，以 '、庫馬席〃 （C ο 〇 m a s s i e )亮藍做爲顯影劑。然後，再於不含 ''庫馬席〃亮藍之相 同的溶液中浸泡2小時以進行退染。浸泡完畢後，將在凝 膠中的染色部分（分子量爲80000 - 1 10000道 耳吞）減去，再將含〇 · 2M(NH4) 2C〇3的5〇v / v %乙腈水溶液加入其中且在周圍溫度下重覆攬拌。接 著，將凝膠切片加以冷凍乾燥後，加入〇 . 2 Μ (NH4)2C〇3(pH8.0)，並將之置放5分鐘使 它膨脹，然後加入適當量之0 · 2M (NH4) 2C〇3 ( pH8 · 9)及ImM鹽酸，此鹽酸並帶有〇 . l//g/ // 1 的、、SEQUENING GRADE MODIFIED TRYPSIN " ( itb 爲一種由美國麥迪生之普羅美嘉公司販售的胰蛋白酶作用 本紙張尺度適用ϋ國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-44- 1224108 A7 -------B7 五、發明説明（42 ) 劑）。使混合物在3 7 °C下反應一整晚。以1 〇 v / v % 醋酸水溶液懸浮該混合物後，將一種由〇 · 1 v / v %三 氟醋酸和6 0 v / v %乙腈水溶液所組成的混合溶液加入 其中並於周圍溫度下攪動再收集所產生的上淸液，將它於 真空器中濃縮後，離心並過濾之，由此可得一種含有肽片 段的濃縮物。

將濃縮物塡入''//RPC C2/C18 S C 2·1/1〇〃 （此爲一種由瑞典優普莎拉之法馬西雅 L K B生物科技公司所販售的用於高效液相色層分析法的 分析柱）中，此分析柱預先以〇 · 〇 6 5 v/v%三氟醋 酸平衡之，然後，用含8 0 v / v %乙腈，水溶液之 0 · 055v/v%三氟醋酸，以流速100# 1/分的 速度來灌注，在洗堤液灌入後，使乙腈之線性梯度在超過 1 6 0分鐘的範圍內由〇%增加至8 0%。當控制吸收在 波長2 4 0 n m處時，將洗堤液在注入後的第4 5 ，5 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印f ，55，58，62，72，75，77分鐘時分段收集 其洗出液，以分別收集其相對的肽片段。以一般方法，利 用& MODEL 47 3A 〃（此爲一種由美國諾瓦克之 ''帕金艾 瑪"公司所販售的蛋白質順序機）將肽片段（以下依序稱 爲 ''肽片段1 〃 ， ''肽片段2 〃 ， ''肽片段3 〃 ，、、肽片 段4 〃 ， ''肽片段5 〃 ， ''肽片段6 〃 ， ''肽片段7 〃及 ''肽片段8 〃）進行胺基酸順序的分析。結果可知：肽片 段1至8帶有相對於SEQ ID N〇s:3 — 10的 胺基酸順序。由此操作，可得到顯示於第五圖的肽圖譜。 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1224108 A7 B7 五、發明説明（43 ) 請 先 閲 讀 背 面 意 事 項 再 填 寫 本 頁 實施例5 液態試劑 將由實施例4之方法所得的純化之I L 一 1 8 R蛋白 質溶於含有lw/v%、、TREHALOSE 〃 （爲一種 由曰本歐卡雅馬（Okayama )海雅希巴拉（Hayashibara ) 公司所販售的扮狀結晶形海藻糖）爲其穩定劑的生理食鹽 水中。所產生的混合物以無菌過濾膜，用一般方法加以過 濾，可得一種液體試劑。 此產品的穩定度很好，在做爲注射藥眼藥水及灌鼻藥 以用來治療或預防包括自體免疫性疾病在內的感受性疾病 上很有用。 實施例6 乾式注射劑 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將由實施例4之方法得到的純化之I L 一 1 8 R蛋白 質1 0 Omg溶於含lw/v%蔗糖（做爲穩定劑）的生 理食鹽水中。將所產生的溶液以過濾膜過濾成無菌溶液， 再以每小份1毫升分裝於小瓶中，然後加以冷凍乾燥並密 封，以得到一種粉狀試劑。 此種產品的穩定度很好，在做爲乾式注射劑，以用來 治療及預防包括自體免疫性疾病在內的感受性疾病上很有 用。 46 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） V f\.. 1224108 A7 _ ___B7_ 五、發明説明（44 ) 實施例7 油膏 將一種羧乙烯基聚合物、'Η I - B I S— WAK〇〃 (此爲一種由日本東京和光純化學物質公司所販售的試劑 )與、、TREHA〇SE〃 （此爲一種由日本歐卡雅馬之 海雅希巴拉公司所販售的粉末狀結晶型海藻糖）溶於無菌 蒸餾水中，以製成濃度分別爲1 · 4 w /w %和2 · 0 w /w %的溶液，並將由實施例1之方法得到的I L 一 1 8 R蛋白質與所產生的溶液混合均勻，將p Η値調整爲 ρ Η 7 . 2，以得到一種約含1 m g / g之本發明的I L 一 1 8 R蛋白質的糊狀作用劑。 本產品具有良好的可塗開性和穩定性’在做爲油膏以 治療及預防包括自體免疫疾病在內的感受性疾病上很有用 實施例8 錠片 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 將一種由日本歐卡雅馬之海雅希巴拉公司所販售的粉 狀無水結晶型^ 一麥芽糖F I N E T 0 S E 〃分別與由 實施例4得來的純化的I L 一 1 8 R蛋白質’以及做爲細 胞活化劑用的、、L υ Μ 1 Ν 〃 ，和〔雙一 4 — ( 1 一乙基 口奎琳）〕〔τ 一 4 一（ 1 一乙基卩奎琳）〕五蛋肢酸化青混 合均勻。然後，將所產生的混合物以一般方法製成約每個 2 0 0毫克的錠片，其中本發明的1 L— 1 8Rg白質的 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS) A4規格（210x 297公釐）-47 - 經濟部中央標準局工消費合作社印製 1224108 A7 _ B7 _ 五、發明説明（45 ) 含量約爲lmg /片，''LUMIN 〃含量也是lmg/ 片。 本產品具有良好的可吞嚥性及穩定性’並具有活化細 胞的性質，在做爲錠片，以治療和預防包括自體免疫疾病 在內的感受性疾病上很有用。 實驗 急性毒性測試 用一般方法，將由實施例5至8之方法所得的數種作 用劑經由皮膚或口服給予，或經腹腔注射至8週大的老鼠 體內。結果顯示：無論給予的途徑爲何，每種樣本的 LD5q數値，若以I L 一 18R蛋白質的量來計算’約較 每隻老鼠的體重多1毫克或更高。此劑量證實將本發明的 I L - 1 8 R蛋白質倂入藥品中並直接使用在包括人類在 內的哺乳動物體中是很安全的。 如上述所解釋的，本發明是以一種能辨識I L 一 1 8 之新穎受體蛋白質的發現爲根據。本發明的IL一18R 蛋白質在緩解與器官移植有關的排斥反應上具有顯著的效 果，並且在治療和預防由於過度的免疫反應所引起的不同 疾病上很有用，這是因爲I L 一 1 8 R具有抑制和調節包 括人類在內之哺乳動物的免疫反應的性質。還有，本發明 的I L 一 1 8 R蛋白質在闡明I L 一 1 8的生理學活性’ 以及建立能製造特定於I L - 1 8 R蛋白質的單株抗體的 雜交瘤細胞等方面也很有用。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) .48 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1224108 經濟部中央標準局工消費合作社印袋 內 圍 範 請 串 利 專 的 A7 B7 五、發明説明（46 ) 本發明之特定地與I L 一 1 8 R蛋白質作用的單株抗 體在用來純化和偵測I L - 1 8蛋白質上特別有用。使用 單株抗體的免疫親和層析法確實可用最少的人工和花費自 由I L - 1 8 R蛋白質和其它污染物所組成的混合物中得 到高純度的I L 一 1 8 R蛋白質製品。使用該單株抗體的 偵測方法可正確迅速地偵測出微量的I L - 1 8 R蛋白質 。使用單株抗體的抑制方法可有效抑制I L - 1 8的生物 功能，在治療由於過度製造或過度給予I L - 1 8所引起 的疾病上有顯著的效果。此具有優越用途的單株抗體可以 利用如本發明的方法製得所需要的量。另外，I L 一 1 8 R蛋白質，單株抗體及它們的片段在篩檢I L - 1 8的激 動劑和拮抗劑上也很有用。 具有這些顯著優點的本發明產物在本領域中很突出並 且很有貢獻。 雖然本文中對於被認爲是本發明目前較合適的體系已有所 說明，但需了解的是在這些體系中可以做些不同的改良’ 只要這些改良仍在本發明的真正精神和範圍內並包含在附 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-49 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1224108 經濟部中央標準局員工消費合作社印掣 A7 B7 五、發明説明（47 ) 序列列表 (1 ) S E Q ID N〇：1的資料： (i)順序特徵： (A )長度：1 5 7 (B)類型：胺基酸 (D)拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (X i )順序說明：S E Q ID N 0 ： 1

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val 工le Arg Asn Leu Asn 15 10 15

Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30

Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr 工le Phe lie 35 40 45 lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60

Ser Val Lys Cys Glu Lys 工le Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 工le Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95

Ser Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110

Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125

Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140

Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145 150 155 (2 ) S E Q ID NO :2 的資料： (i )順序特徵： (A )長度：1 5 7 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (x i )順序說明：S E Q ID N 0 ： 2 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 50 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1224108 A7 B7 五、發明説明（48 )

Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val lie Arg Asn 工le Asn 15 10 15 Asp Gin Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gin Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp lie Asp Gin Ser Ala Ser Glu Pro Gin Thr Arg Leu lie lie 35 40 45 Tyr Met: Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys lie lie 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn lie Asp Asp 工le Gin Ser 85 90 95 Asp Leu lie Phe Phe Gin Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gin Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gin Ser 145 150 155 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 經濟部中央榡準局員Η消費合作衽印製

(3 ) S E Q ID 1^〇：3的資料： (i )順序特徵： (A )長度：5個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N 0 : 3 : T r p His Ala Ser Lys 1 5 (4 ) S E Q ID NO :4 的資料： (i )順序特徵： (A)長度：7個胺基酸 (B )類型：胺基酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -51 - 訂

1224108 A7 B7 五、發明説明（49 ) (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N〇：4: lie Met Thr Pro Glu Gly Lys 1 5 (5 ) S E Q ID N 〇·· 5 的資料·· (i )順序特徵： (A )長度：1 3個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N 0 ： 5 ·

Ser Ser Gly Ser Gin Glu His Val Glu Leu Asn Pro Arg 1 5 10 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ (6 ) S E Q ID N 〇·· 6 的資料·· (i )順序特徵： (A )長度：4個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _ 52 _ 1224108 A7 B7 五、發明説明（50 ) (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N〇：6 : Ser Trp T y r L y s (7 ) S E Q I D N〇：7的資料： (i )順序特徵： (A )長度：1 0個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i)分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N 0 ： 7 ： Leu Asn His Val Ala Val Glu Leu Gly Lys 1 5 10 (8 ) S E Q ID N 〇·· 8 的資料： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (i )順序特徵： (A )長度：6個胺基酸 (B )類型：胺基酸 i (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明·· S E Q ID N 〇：8 ·· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _ 53 _ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1224108 A7 B7 五、發明説明（51 )

Ser Phe lie Leu Val Arg 1 5 (9 ) S E Q ID NO :9 的資料： (i )順序特徵： (A )長度：1 5個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N 0 ： 9 · 貼文 (l〇)SEQ ID NO :1〇 的資料： (i )順序特徵： (A )長度：1 1個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N 〇·· 1 0 :

Ser Asn lie Val Pro Val Leu Leu Gly Pro Lys 1 5 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _ 54 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1224108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（52 ) (ll)SEQ ID N〇：ll 的資料： (i)順序特徵： (A)長度：1 1 9個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N〇：1 1 :

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp lie 20 25 30

Tyr lie Tyr Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg 工le Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly Pro Asn Phe 50 55 60

Gin Asp Lys Ala Thr 工le Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 (12) S E Q ID N〇：12 的資料： (i )順序特徵： (A )長度·· 1 〇 8個胺基酸 (B )類型··胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明·· S E Q ID NO· 1 2 : 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 55 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1224108 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（53 )

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 * 15

Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn 工le His Asn Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Gin Gly Lys Ser Pro Gin lie Leu Val 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Asn lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 工le Lys Arg 100 105 (13) s E Q ID N〇：13 的資料： (i )順序特徵： (A)長度：10個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N〇：1 3 :

Gly Phe Asn lie Lys Asp lie Tyr He Tyr 1 5 10 (14) SEQ ID N〇：14 的資料·· (i )順序特徵： (A )長度·· 1 8個胺基酸 (B )類型··胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-56 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1224108 A7 ______________^ 五、發明説明（54 ) (X i )順序說明：S E Q ID NO： 14：

Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly Pro Asn Phe Gin 15 10 15

Asp Lys (15) S E Q ID N〇：15 的資料： (i )順序特徵： (A )長度：1 〇個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID NO： 15：

Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Tyr 1 5 10 (16) S E Q ID 1^〇：16的資料： (i )順序特徵： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (A )長度：1 1個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 、 (X i )順序說明：S E Q ID NO： 16：

Arg Ala Ser Gly Asn lie His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印掣 1224108 A7 B7 五、發明説明（55 ) (17) S E Q ID N 〇·· 1 7 的資料·· (i )順序特徵： (A )長度：7個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i)分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明：S E Q ID N〇：1 7 :

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 (18) S E Q ID N〇：18 的資料： (i )順序特徵： (A )長度：9個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i )分子類型：肽 (v )片段類型：內片段 (X i )順序說明·· S E Q ID N 〇：1 8 :

Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 (19) S E Q ID N 〇：1 9 的資料·· (i )順序特徵： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

ύ 1224108 A7 B7 五、發明説明（56 ) (A)長度：357個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：雙股 (D )拓樸學：線形

(i i )分子類型· CDNA (i x )特徵： (A)名字/關鍵：mat肽 (B)座落處：1 ..357

(C )鑑定方法：E (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ·»裝· 經濟部中央標準局員工消費合作祍印絮 (X i )順序說明·· S E Q ID N 〇·· 1 9 ·· GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG' AAG CCA GGG GCC Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15 TCA GTC AAA TTG TCC TGC ACA ACT TCT GGC TTC AAC ATC AAA GAC ATA Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp lie 20 25 30 TAT ATC TAC TGG GTG AAA CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG GTT Tyr lie Tyr Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT GAT ACT AAA TAT GGC CCG AAT TTC Gly Arg 工le Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly Pro Asn Phe 50 55 60 CAG GAC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC Gin Asp Lys Ala Thr 工le Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 CTG CAG CTT CGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT Leu Gin Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCT AGA CGG GGT AAC TAC GGG GCG GGG TTT GGT TAC TGG GGC CAA GGG Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 ' (20) s E Q ID N〇：20 的資料： (i )順序特徵’· (A)長度·· 324個鹼基對 (B )類型··核苷酸 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 59 1224108 A7 __________B7 五、發明説明（57 ) (C )股型：雙股 (D )拓樸學：線形 (ii)分子類型：cDNA (i X )特徵： (A) 名字/關鍵：mat肽

(B) 座落處·· 1..324 (C )鑑定方法：E (X i )順序說明：S E Q ID N〇：2 0 :

GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT GCA TCT GTG GGA

Asp 工le Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GGG AAT ATT CAC AAT TAT

Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn lie His Asn Tyr 20 25 30

TTA GCA TGG TAT CAG CAG AGA CAG GGA AAA TCT CCT CAG ATC CTG GTC

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Gin Gly Lys Ser Pro Gin lie Leu Val 35 40 45

TAT AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGT GTG TCA TCA AGG TTC AGT GGC

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

AGT GGA TCA GGA ACA CAA TAC TCT CTC AAT ATC AAC AGC CTG CAG CCT

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Asn 工le Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

GAA GAT TTT GGG ACT TAT TTC TGT CAA CAT TTT TGG AGT ACT CCG TAC

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (21) s E Q ID N 〇·· 2 1 的資料： (i )順序特徵： (A )長度：4 1 4個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：雙股 (D )拓樸學：線形 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 6〇 _ 1224108 A7 B7 五、發明説明（58 ) (ii)分子類型：cDNA (i X )特徵： (A )名字/關鍵：s i g肽 (B)座落處·· 1··57 (C )鑑定方法：Ε (Α)名字/關鍵：nia t肽 (B)座落處：58·· 414

(C)鑑定方法：E 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ( x i )順序說明 :S E Q ID N 0 '2 1 ATG AAA TGC AGC TGG GTT TTT CTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA GGG Met Lys Cys Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly -15 -10 -5 GTC AAT TCA GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG Val Asn Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 1 5 10 CCA GGG GCC TCA GTC AAA TTG TCC TGC ACA ACT TCT GGC TTC AAC ATC Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn lie 15 20 25 AAA GAC ATA TAT ATC TAC TGG GTG AAA CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG Lys Asp lie Tyr lie Tyr Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG GTT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT GAT ACT AAA TAT GGC Glu Trp Val Gly Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly 50 55 60 CCG AAT TTC CAG GAC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC Pro Asn Phe Gin Asp Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 65 70 75 ACA GCC TAC CTG CAG CTT CGT AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC Thr Ala Tyr Leu Gin Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCT AGA CGG GGT AAC TAC GGG GCG GGG TTT GGT TAC TGG Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Tyr Trp 95 100 105 GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115 ( 2 2 )S E Q ID N〇 :2 2的資料： ( i ) 順序特徵： ( A ) 長度： 3 8 4個鹼基對 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --^裝·

、1T

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）_ 61 - 1224108 A7 B7 五、發明説明（59 ) (B) 類型：核苷酸 (C )股型：雙股 (D)拓樸學：線形 (i i )分子類型：c D N A (i X )特徵： (A )名字/關鍵：s i g肽 (B )座落處：1 ..6 0

(C) 鑑定方法：E (A)名子/關鍵· ma t月太 (B)座落處：61..384 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 j ( ( C ) x i 鑑定方法： )順序說明 E ·· S E Q ID N〇 :2 2 : ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GCG TTG CTG CTG CTG TGG CTT ACA Met -20 Ser Val Leu Thr Gin -15 Val Leu Ala Leu Leu -10 Leu Leu Trp Leu Thr -5 GGT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTT TCT Gly Ala Arg Cys Asp 1 lie Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ala Ser 10 Leu Ser GCA TCT GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GGG AAT Ala Ser Val 15 Gly Glu Thr Val Thr 20 lie Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gly Asn ATT CAC AAT TAT TTA GCA TGG TAT CAG CAG AGA CAG GGA AAA TCT CCT lie His 30 Asn Tyr Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Arg Gin 40 Gly Lys Ser Pro CAG ATC CTG GTC TAT AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGT GTG TCA TCA Gin 45 lie Leu Val Tyr Asn 50 Ala Lys Thr Leu Ala 55 Asp Gly Val Ser Ser 60 AGG TTG AGT GGC AGT GGA TCA GGA ACA CAA TAC TCT CTC AAT ATC AAC Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Gin 70 Tyr Ser Leu Asn lie 75 Asn AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GGG ACT TAT TTC TGT CAA CAT TTT TGG Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Gly Thr 85 Tyr Phe Cys Gin His 90 Phe Trp AGT ACT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG Ser Thr Pro 95 Tyr Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 lie Lys Arg (2 3 )s E Q ID N 〇 :2 3的資料： (i)順序特徵： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-62-

、1T

1224108 A7 B7 五、發明説明（60 ) (A)長度：248 (B )類型：胺基酸 (D )拓樸學：線形 (i i)分子類型：肽 (X i )順序說明：S E Q ID N 0 ： 2 3 ：

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp lie 20 25 30

Tyr lie Tyr Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly Pro Asn Phe 50 55 60

Gin Asp Lys Ala Thr 工le Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Gly Asn Tyr Gly Ala Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser 130 135 140

Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr 工le Thr Cys Arg Ala Ser 145 150 155 160

Gly Asn lie His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Gin Gly Lys 165 170 175

Ser Pro Gin lie Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val 180 185 190

Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Asn 195 200 205 工le Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gin His 210 215 220 經 濟 部 中 k h 準 請 先 閱 讀 背 意 事 項 再 填 寫 本 頁

Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 225 230 235 240

Lys Arg His His His His His His 245 消 費 合 作 社 印 製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -63-

Claims (1)

1224108 A8 B8 C8 D8 公告本 六、申請專利範圍 第861 1 9699號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國93年7月9日修正 1 · 一種用於結合間白素一 1 8之藥學組成物，其包 含充作有效成份之間白素一 1 8受體蛋白質，其中該間白 素一18受體蛋白質之分子量經十二烷基硫酸鈉一聚丙燒 醯胺凝膠電泳分析顯示爲3 0，0 0 0至1 8 ◦，0 〇 〇 道耳吞，且包含SEQ ID NOs:3至10之胺基 酸序列，且其中該間白素一18包含SEQ ID N 〇 :1或2之胺基酸序列，其中SEQ ID N〇：1之 胺基酸序列中符號爲“ X a a ”之胺基酸表示異白胺酸或 蘇胺酸，且S E Q ID N〇·· 2之胺基酸序列中符號 爲'' X a a 〃之胺基酸表示蛋胺酸或蘇胺酸。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1224108 A8 B8 C8 D8

六、申請專利範圍 SEQ ID ΝΟ:1： 丁yr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 lie Ser Met Tyr Lys .Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60 Ser Vsl Lys Cys Glu Lys lie Ser Xbb Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 7〇 75 8〇 lie Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 一一 85 90 95 Ser Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140* Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr VbI .Gin Asn Glu Asp 145 150 155 SEQ ID NO: 2: Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val lie Arg Asn lie Asn 1 5 10 15 Asp Gin Vsl Leu Phe Val Asp Lys Arg Gin Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 3〇 Thr Asp lie Asp Gin Ser Ala Ser Glu Pro Gin Thr Arg Leu lie lie 35 40 45 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu A1b Val Thr Leu Ser 50 55 60 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、張 一紙 J本 A \—'/ s N c 一準 標 I家 國 國I中 用 適 X o 2 1224108 A8 B8 C8 D8

六、申請專利範圍 Val Lys Asp Ser Lys Xae Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys lie lie 65 75 BO Ser Phe Glv Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn lie Asp Asp lie Gin Ser 85 90 95 Asp Leu lie Phe Phe Gin Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tvr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gin Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Lys Asp Qlu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gin Ser" 145 150 155 SEQ ID NO:3： Trp His Ala Ser Lys 1 5 SEQ ID NO：4: lie Met Thr Pro Glu Gly Lys 1 5 SEQ ID NO:5: Ser Ser Gly Ser Gin Glu His Val Glu Leu Asn Pro Arg 1 5 10 SEQ ID NO:6: Ser Trp Tyr Lys 1 SEQ ID NO:7: Leu Asn His Val Ala Val Glu Leu Gly Lys 1 5 10 SEQ ID NO:8: Ser Phe lie Leu Val Arg 1 5 SEQ ID NO:9: Thr Val Lys Pro Gly Arg Asp Glu Pro Glu Val Leu Pro Val Leu 1 5 * 10 15 SEQ ID NO:10: . Ser Asn lie Val Pro Val Leu Leu Gly Pro Lys 1 5 10 第 日〆 圍， 範白 利蛋 專白 請淸 申血 如之 •劑 2 定 安 作 充 有 含 其 物 成 組 學 藥 之 項 膠 液 jjSTgJ 緩 或 \ 及 類 糖 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 請素 串白 如間 .該 3 對 製 產 第 圍受 範8 利 專 TX 物 成 組 學 藥 之 項 專 具 質 白 蛋 mm 用目 之 性 於 用 。 係體 其抗 ，株 單 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（2】〇X297公釐）