TW586934B

TW586934B - Immunopotentiating composition

Info

Publication number: TW586934B
Application number: TW087107484A
Authority: TW
Inventors: Keiji Fujioka; Akihiko Sano; Shunji Nagahara; Andrew Donald Nash; Malcolm Roy Brandon
Original assignee: Sumitomo Pharma; Univ Melbourne; Koken Kk
Priority date: 1997-05-19
Filing date: 1998-05-14
Publication date: 2004-05-11
Also published as: KR100574216B1; CN1150033C; CA2290696A1; AU7238598A; NZ500967A; CA2290696C; EP0983088A1; US20110217366A1; ATE343396T1; KR20010012769A; BR9809656A; AU740133B2; DE69836268D1; CN1263470A; EP0983088B1; DE69836268T2; WO1998052605A1

Description

586934 A7 --— ___ ΙΠ 五、發明説明（1 ) 一發明領域本盔明係有關免疫增強組合物，供有效地增加自抗原衍生之免疫反應。根據本發明之免疫增強組合物主用爲疫苗製劑於人類醫學或獸醫領域供預防或治療人類、除人類外 (哺乳類，及鳥類之疾病之目的。另外，根據本發明之免疫增強组合物用於將動物免疫供抗體製造之目的。背景技藝目前一般使用之那些疫苗可大約分類成2類，減弱（活的）疫苗及失活（被殺死）疫苗。減弱疫苗之好處在於一般可得良好之免疫反應，但缺乏在於自安全性之觀點，有擔憂因子如母性丨灰復及與彼等有關之不利作用。失活疫苗，當與減弱疫苗比較時較爲安全但缺乏在於其單一投予難以產生充分之豕疫作用。事實上，以失活之疫苗之預防疫苗中，以2至3週之間隔投予‘、2或3次，以致可得滿意之作用。經濟部中央標準局員工消费合作社印裝同時，最近於分子生物學之方法論上之進步，使可鑑別用於預防或治療疾病之疾病特異性抗原，及製造模擬藉使用化學或重組體D N A技術學鑑別之抗原之合成抗原（組份疫苗）。如此合成之抗原，於純度、穩定性、特異性及安全性上優於習用之疫苗抗原。然自實用觀點，其於抗原性方面一般爲低的，而此爲待解決之最大問題。有效地製造對具低抗原性之抗原之抗體之方法，因此自人類與獸醫之立場爲熱切希望的。另外，當使用失活疫苗或组份疫苗時，爲達到產生之抗體足以有效地預防或治療疾病之程度，必須以2至3週，較 -4- i紙張尺度適用中準（CNS ) Λ4規輅（210X 297公势) ~ ' 586934 Λ7 _ Η 7 五、發明説明（2 ) 好4週或更長之間隔投予2或3次。因此，單一投予（單一注射疫苗）後能產生有充分作用之疫苗於人類及獸醫上爲熱切期望的。於獸醫之領域，其主要之好處包括i)減少時間， 2 )降低費用及3 )順從性之改善。於人類醫學，上述之3種好處亦爲重要的，且於其中，於幾乎不可能看到間隔地多次投藥之開發中國家中，順從性之改善特別重要。失活疫苗及組份疫苗之弱抗原性之問題，於實驗層次，可籍使用佐劑而解決。然實用上，此解決具各種問題，如不利之作用。使用人造物質之佐劑技術學，包括2種方法。一種包括將抗原分散於油或脂質粒子表面，另_種包括使抗原吸附於沉澱物上。有時已使用免油供獸醫疫苗或軍隊流感疫苗用，然而引起嚴重之出血性損傷或拖延之肉芽腫。自從那時起，其之一般之用於人類用疫苗，未曾由有關方面核准。過去四十年弗維口彳心心全佐劑及不芫全佐劑最廣用於動物實驗。雖，彼等誘發抗體之產生至滿意之程度，然而，彼等促進 2牙腫形成及附著於浸潤部位、發熱及其他毒性作用，於是其已避免用於人類或獸醫。經濟部中央標準局員工消費合作社印製明礬、氫氧化鋁或磷酸鋁，爲目前核准供投予人類之唯一佐劑，且廣泛使用。，然*，其於接種部位造成肉芽腫形成―此外，其不利之影響廣泛地隨各種情形而異。例如，氨氧化銘與細菌類毒素產生充分之佐劑作用，但與對抗B 型肝炎祸毒或流感病毒之疫苗，則未得良好之結果。除了上述使用人造物質之佐劑技術外.，有使^原本於活 -5- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) 八4坭栘（210x 297公赴） 586934 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製五、發明説明（3 ) 體中產生之細胞素作爲佐劑之方法。事實上，據報告或揭示，反應於抗原產生抗體藉使用具免疫活化活性之細胞素 (例如 IL-l，IL-2，IFN-r，IFN -沒，GM-CSF，IL-12 等）而增進。此等發現由R0ng Lin等综論（Clinical Infection Diseases，21, 1439-1449, 1995 )。然而，當細胞素以溶解狀態用爲佐劑時，必須多次投予以達滿意之產生抗體作用，雖然當與上述之人造佐劑比較時，其不利之作用很少且較不嚴重。假定當生物以溶解狀態之抗原及細胞素接種時，彼等於接種後立可擴散於生物中，因此無法活化對抗原特異性之免疫機制。另外，對於以細胞素系統性免疫活化，須大量之細胞素，且於那種情形，可能引發嚴重之不利之作用。因此，須要有效地使用細胞素作爲佐劑而無引起不利之作用之方法。作爲解決失活疫苗及組份疫苗所具有之弱抗原性之問題之另外之處理方法，可提自載劑持續釋放抗原之技術。持續之抗原釋放之想法源自以明礬所得之佐劑作用歸因於抗原之非特異性吸附於明礬上及其自明礬持續的釋放之考量。迄今已嘗試使用各種載劑（例如B〇ngkee Sah等，； Pharm. Pharmac〇l.，48, 32-36, 1996)但並盔致成實用。，抗體投予至抗體產生之時間，自疾病之二治療之觀點，亦很重要。然而迄並未嘗試縮短抗體產生所須之此時間。鑑於前述，下面爲本發明之較佳目的： (υ提供免疫增強組合物，以其將抗原或抗原及具免疫活 _ -6- W t IS m ( CNS ) T~2\0 x 297^>JtjT) ----— (請先閱讀背而之注意事項一^寫本頁) •裝· 訂線 586934 Μ 1Π 五、發明説明 4 二匕：免疫剌激或免疫調節活性之物質自載劑(

表之物質）持續釋放·· 可才I (2) 提供免硬增強組合物，以其將謗發抗原之發抗原之物質及且笋浐、、舌仆貝’或詞物質m 剌激以疫調節活性泛、自载釗（包括生物可相容之物質）持續釋放. (3) 提供增進自抗原衍生之免疫反應之方法，使上面目的⑴或⑺所提供之組合物，：達成用； …、W起不利之作 (4) 提供減少自抗原衍生抗體產生所須期藉達成上面目的⑴或⑺所提供之組合物；万法’使用 ⑺提供延長自抗原衍生免疫之期間之方法，使上面目的⑴或(2)所提供之組合物； S達成 ⑷提供達到免疫增強之方法，使用藉達成上面目部::)所如供:组合物’以該組合物之周園作爲免疫反應之 ^ )，提 Γ用供^使用及供用於人類以外之哺乳類及鳥類之厂又田使用精達成上面目的⑴或⑺所提供之組合物. „。（8)提供供人類使用及供用於人類以外之哺乳類及鳥類之經濟部中央標準局員工消f合作社印製早一注射疫苗，使用葬、去+ 人从更用猎達成上面目的⑴或⑺所提供之組合物。解決問題之方法本發明者等更深人研究以嘗試得到容許抗原自生物可相容之物質持續釋放，結果，出乎意料地發現當將含生物可相容之物質與載於其上之抗原之免疫增強組合物性 ____ . ·7鑛本紙張尺度剌t酬幻轉（cNs) 五、發明説明（5 ) 物時’增進自抗原衍生之免疫反應。 A另外，本發明者等發現將含具免疫活化、免疫刺激或免疫凋節活性之物質（F文集合地稱爲”免疫調節物質，，），爲與抗原同時載於載劑（包括生物可相容之物質）上，之免疫 i曰強組合物投予活體，致產生早期且進一步增進免疫反應。基於此等發現，已完成本發明。下面再詳細説明本發明。 1 )本發明原理之解釋曲於典型之體液之免疫反應中，以抗體第二次剌激後之抗體產生，當與第1次以抗原刺激時比較，較早發生至較高机體效價，其維持較長之一段時間。抗體產生所須期間之差井，大約歸因於當第一次抗原刺激按著一系列步驟，亦即（1)藉由抗原提供細胞提供抗原至T細胞並活化τ細胞， (^)藉活化Τ細胞，活化Β細胞，（3)藉樹狀突細胞輸送抗原土淋巴即及（4 )Β細胞於淋巴節中增殖及其分化成抗體形成細胞時’於第2次剌激之時，|已有充分數目之抗體形成細胞巧利用。抗體效價及高抗體之期間係歸因於使用習用 ♦成形式（免疫學剌激中，投予供第〗次免疫學刺激之抗原，擴散於整個身體，降解、代謝及消除。當製備抗體形成細胞供抗體產生時，抗原已大部分自身體消失；因此並無藉由抗原再度刺激抗體形成細胞。爲了達到較長期間之較，抗體效價（其對預防或治療疾病爲重要的），因此反應於吊一次抗原剌激產生之抗體形成細胞再度藉由抗原被刺激爲必要的。 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標举（ 586934 經濟部中央標率局負工消费合作社印製 Λ7 ----s____ B7 五、發明説明（6 ) 另一方面，於預防或治療疾病中，較早產生抗體亦爲重要的。爲了較早產生抗體，#由第i次抗原剌激造成有效的產生抗體形成細胞爲重要的。A 了此有效之抗體形成細胞 < 產生，必須（】）增加抗原與抗原提供細胞接觸之機备 (造成抗原提供細胞聚積於投予抗原之部位）及（2)促進胞之活化及其於淋巴節中分化成抗體形成細胞。一有鑑於這些點，本發明認清較長期間之較高抗體效價，藉由致使抗原穩$地負載於包括生物可相容之物質之載劑上，並自其持續釋放，因此維持身體中之抗原量，造成抗體再刺激產生抗體形成細胞。特定言之，只要可容易地評估於投予免疫增餘合物之部位及其附近，抗原濃度被維持於南濃度，局部高抗原濃度狀態促進抗原與抗體形成細胞間之反應（其爲平衡反應），且同時造成免疫活性細胞聚積於投予部位或其附近。因此，維持局部抗原濃度於高濃度，可説是本發明之最重要之·凉則。另外，本發明認清較早且更有效之抗體產生，藉由造成抗原及免疫調節物質（例如細胞素）同時地負生物可相容之物質)且持續地自其釋放，因：⑴= 活性細胞局部聚積於投予抗原之部位及其附近及隨後活化抗原提供至τ細胞及（2)促進B細胞之活化及其經由細胞素選擇性及連續的流入該淋巴節而於負責免疫增強組合物之投予部位之淋巴節（樹狀細胞輸送抗原至此淋巴節及二體形成細胞於其中產生）中分化成抗體形成細胞。因此，根據本發明之免疫增強组合物之特性在於，不像系統性免疫活化 _ _9_ 张尺度適用中國準（CNS ) Λ4規格（210X297公筇） (誚先閱讀背而之注意事項本頁) •裝- -線 586934 經濟部中央標準局員工消费合作社印製五、發明説明（ 7 Λ7 1Π 機制藉由投予抗原或抗原及細胞素(以溶液形式而是在組合物周圍形成^増強之場，經由持放^ 或抗原及細胞素。。釋玫抗原鑑於前述，本發明之較佳特性可概要如下： ⑴抗原或誘發抗原物質(下文集合地稱爲性及免疫調節物質（若存在）可持續釋放。物貝）⑺抗原性物質，及免疫調節物質(若存在)之濃度可於投予部位維持於高含量。 & 奴此等特性之提供可藉由於活的生物中，穩定地維持抗原性物質或杬原性物質與免疫調節物質，其爲負載或支撑於構成免疫增強組合物之載劑上，並令該物質^該生物中持續釋放。H疫增強組合物投予活的生物，當然須要載劑愿烏亡艮好生物相容性之物質。因此，當使用能滿足上面自醫樂觀點所課以之要求之生物可相容之物質作爲載劑時，使用所得之免疫增強組合物可產生免疫增強或免疫促進作用，使用何種生物可相容之物質不拘，而不與本發明之原理抵觸。、另卜本&明之此等基本特性可謂不只有關於體液之免疫’且亦有關於黏膜免疫及細胞媒介之免疫，因爲，於各情形，由於連續之抗原性剌激免疫活性細胞及正面的促進 T細胞與B細胞活化而活化免疫。 i i)本發明之作用由本發明產生之作用敘述於下。 a)持續釋放抗原或抗原及細胞素 -10- 本紙張纽刺巾 (請先閱讀背而之注意事項本頁)

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、1T -線_ • 1 I I -I · 586934 A 7 Η 7 五、發明説明（經濟部中央標準局員工消费合作社印製如圖1所示，本發明之免疫增強組合物於7天、間持續内釋放抗原（抗生蛋白質）及細胞素長又時 b )抗體產生之增進 ^ ) ° 本發明之免疫增強組合物之抗體產生增進羊之免疫學剌激實驗中確立。因此，以各種劑型二，蛋白質至小鼠，藉由ELISA技術，於投予後7、丁几生 3 5及83天測定血中抗·抗生蛋白質抗體效價(圖2)。將2)二用方式，亦即抗生蛋白質於磷酸鹽緩衝液中之溶 ^習投予100微克之抗生蛋白質予小鼠之情形，投予帶有j ， ΐ t抗生蛋白質之免疫增強組合物（於實例7中比車目同形，及同時投予帶相同量之抗生蛋白質之免疫增強H = (於貫例8中製備）與IL_ly5之情形互相比較。投藥^物天，投予帶抗生蛋白質之免疫增強组合物之小鼠血液、35 抗體效價’當與投予抗生蛋白質溶液之小鼠所得之抗體：價比較，約高25倍。此結果指示使用以根據本發明之增強組合物形式之抗原，致使抗體增加對應於抗原^現生。另外，於投予帶有抗生蛋白質及IL_ i卢之免疫增强2 合物之小鼠，抗體效價爲投予抗生蛋白質溶液後可達到= 抗體效價之約450倍之高。此結果指示反應於抗原之抗= 產生可另外藉使用同時含抗原及具免疫活化活性之細胞素之本發明之免疫增強組合物增進。同時帶有抗原及免疫活化細胞素之免疫增強組合物之抗體產生作用，於羊之免疫剌激實驗中更顯著地觀察到（圖 3 )。將抗生蛋白質以變化之劑型投予羊，於投藥後7， -11 - 本紙张尺度過用中國國象標隼（CNS ) /\4规梠（2l()x 297公郑 f-T.*f先閱讀背而之注意事¾寫本頁) ί 裝 • 丁、--° 線----Ί 586934 A 7 Η 7 一丨 —— 五、發明説明（9 ) 1 4 ’ 2 1及j 5天籍由E LIS A技術測定血中抗·抗生蛋白質抗體效價。當抗生蛋白質以習用溶液形式投藥時，即使於 100微克之劑量，無法確認抗-抗生蛋白質抗體產生。此小机與羊之間之彳/L體產生差異’假定係歸因於體重之差異。此指π 100微克之抗生蛋白質無充分之抗原性以造來羊中之產生抗fa。對知、地，當投予同時帶有抗生蛋白質及IL _ 1 /5之免疫增強組合物（於實例8中製備）時，於投藥後i 4 天，確立高含量之抗體產生。此結果明白地指示本發明之免疫增強組合物對於反應於只具不足以引起抗體產生之抗原性之抗原之抗體產生，具增進作用。對照地，當以習用之溶液形式，同時投予抗= 蛋白質及IL - 1卢時，無檢出抗體產生。此結果指示由免疫增強組合物產生之抗體產生增進作用，依抗原及細胞素之持續釋放而定。上述之發現指示對照於須多次投藥以達充分之抗體效價之習用之投藥方法，本發明之免疫增強組合物於只投藥一次後，可提供充分之抗體效價。 C)至產生抗體所須時間之縮短經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 (¾先閱讀背面之注意事項寫本頁j 線· 至產生抗體所須時間之縮短，其爲本發明之免疫增強組合物之重要作用之-，於使用小鼠之免疫刺激實驗中直接確定:其中即使以習用方式投予抗原溶液後，觀察到某種程度之抗體產生，而於使用羊之免疫剌激實驗中，其中以習用万式投予抗原溶液，纟法導致抗體產生。如同由圖2 之圖示，顯然地當以習用方式，以溶液形式投予抗生蛋白質時’投藥後’抗-抗生蛋白質抗體效價自第丨4天增加， -------- -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) 五、發明説明（ 10 \Ί Β7 而當投予免疫增強組人私^+ ^ 、口物（帶有單獨抗生蛋白質或抗生蛋白貝加I L - 1 /3 )時，於指、奴樂後，柷體量自第7天顯示快速增加。藉此至抗體產生. • 心時間縮短約1週。於投予以溶液形式之抗生蛋白質之小☆ 以’其抗體效價於投予後達到與投予只帶有抗生蛋白質之务庶广私/人丁兄ϋ冒強組合物後，第1 4天所得之相同抗體效價，須8 3夭。、/^碰。天。於投予帶有抗生蛋白質與IL-ly5之免疫增強組合物後U天所大所仔 < 抗體效彳貝，以抗生蛋白質溶液即使於投藥後第8 3夭t盔、土〜u — 天吓典法仔到。有關於此，可謂免疫增強經合物縮短抗體產生所須期間至少69天。 d)於投予兄疫增強組合物之部位附近之免疫反應士已（万、本各明原理之説明，，一節中，於投予部位附近局：發生之免疫反應，似乎於以本發明之免疫增強組合物可仔4作用中，擔任重要任務。此自用於免疫剌激實驗之羊之投藥部位之組織學圖片（圖4，5)可容易地證實。組織顯微相片顯示於免疫增強組合物周目之免疫活性細胞之浸潤。本文中所謂免疫活性細胞包括嗜中性細胞、cd_4陽性 τ細胞，r dTCR-陽性τ細胞，MHCII_陽性細胞，巨噬細胞等。經濟部中央標準局員工消费合作社印製當抗生蛋白質及/或！ L-1/5以溶液形式投藥時，並無觀祭到此免疫活性細胞之聚積。此假定歸因於接種以溶液形式4柷生蛋白質與I L - 1 /3後，立刻於體内擴散，造成無法引導免疫活性細胞至接種部位。免疫活性細胞之聚積，以帶有I L - 1 /?之免疫增強組合物更爲顯著。此等發現支持了由於自免疫增強組合物持續釋放之結果，於該組合物附 -13- 本纸张尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4規梠（210X 297公犮） 586934 Λ7 B7 五、發明説明 11 經濟部中央標準局員工消费合作社印製近，發生高抗原或抗原及細胞素濃度之狀態，造成該組合物附近，經由免疫活性細胞之聚積，增進抗體產生之觀念。另一方面，免疫活性細胞之聚積，爲一種發炎反應。然而，引起之發炎反應並無伴隨水腫之類而本身會停止。 i i i)免疫增強組合物當本文使用用詞”免疫增強組合物，，原則上意指含生物可相容之載劑，抗原或引發抗原物質（負载於該載劑上），若須要另含如下述之免疫調節物質，及/或一種以上之醫藥添加物之組合物或製劑。待藉本發明之免疫增強組合物增強之”免疫反應，，爲對含於該組合物中之抗原或藉由含於其中之誘發劑謗發之抗原爲特異性之免疫反應。待活化之免疫反應可爲體液免疫性、黏膜免疫性或細胞免疫性或其混合。用詞’’抗原”並無限於任何特別物種，只要其可誘發自抗原衍生I抗原-抗體反應。一般，其選自那些可產生有效於預防及/或治療人類或除了人類以外之哺乳類或鳥類之疾病之抗體之抗原。因此，其包括，但不限於那些類毒素、疫苗及活疫苗本身述於例如”疫苗手册，，（由National Institute of Health Alumni Association 編輯，由 Maruzen 出版公司）’ ”免疫劑’，（於 Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 14 版，1990, Mack Publishing 公司，75 節， 1426-1441頁，或由美國食品及藥物投予（United States Food and Drug Administration,第 4 6 版，208-209 頁，1992 ) 請先閱讀背面 i 事項裝訂線 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) /\4坭枱（210X 297公势） Η 7 五、發明説明（15) N A，或Ν Ρ蛋白質，c型肝炎敝毒Ε 2或N s i蛋白質，Β型肝炎病毒Η B S抗原蛋白質，A型肝炎病毒衣殼蛋白質vp i 或VP3，類衣殼蛋白質、登革病毒Egp蛋白質，RS病毒F 或G蛋白質，狂犬病病毒G或N結構蛋白質，疱疹病毒gD 蛋白質，日本腦炎病毒E丨或前M蛋白質，輪狀病毒外被蛋白質VP7或外被蛋白質VP4，人類免疫缺失病毒即12〇或 SP160蛋白質，Leishmania主要表面抗原蛋白質，瘧疾周圍子孢子主要表面抗原蛋白質，T〇x〇plasma 541^或cs蛋白貝，引起獻齒之鏈球菌突變系，此腫瘤退化抗原如]VIAGE-1，MAGE - 3及BAGE，此組織特異性抗原如酪胺酸酶，，gpi〇〇及 gp75，編碼 pl5，Mucl，CEA，HPV， E6，£7，HPR2/neu等之核酸，及述於”以DNA免疫，，；

Journal of Immunological Methods, vol. 176, 1994, 145. 1 5 2頁之那些核酸。此等核酸待插入之質體或病毒不限於任何特別之物種，若彼等爲無病原性即可。因此，作爲病毒可提那些一般用於基因治療作爲載體，例如腺病毒、與腺有關之病毒、牛痘病毒、倒逆病毒、HIV病毒及疱疹病毒。經濟部中央標準局員工消f合作社印製抗原性物質可藉使用化學、重組體D N A、細胞培養物或發酵技術學而得。於本發明實務，製備該物質之方法並不限於任何特別一種。然而，因本發明組合物具上述作用，藉由重組體DN A技術學製得之那些抗原，特別適宜使用，且因此抗原性低及一般在以習用方法（例如以溶液或懸浮液狀態腸外投藥）投藥後，難以有效之方式製造。 -18 - 本紙张尺度適用中國國家橾隼（CNS ) Λ4規輅（210X 297公势） 586934 Λ7 B7 16 五、發明説明誘發特異免疫性之抗原性妨哲物中，無任何修飾，供2:;:::: = = 穩定性，其可例如⑴共價或非共價結合於具高於抗子里（蛋白質，例如半乳糖苷酶或核心蛋白質，以通當糖（碳水化合物）鏈補充，（3)包含於脂質體中，（㈠包含於病毒-脂質體膜融合型脂質體，或（5)含於藉使用 B〇0MDP[6-O-(2 -十四基十六醯基）_N_乙醯基胞壁醯基_ L-丙胺醯基-D-異麩胺醯胺]所得之病毒核蛋白顆粒。、•’免疫調節物質（具免疫活化，免疫刺激或免疫調節活性足物質）”不限於任何特別物種而另外包括細胞素、化學激素生長因子、佐劑肽及D N A序列、明礬、弗羅因德氏完全佐劑，弗羅因德氏不完全佐劑、伊斯康（isc〇m)、皂苷、十六胺、溴化二甲基二十八基銨、阿布利啶（Abridin)細胞壁骨架組份、霍亂毒素、脂多糖内毒素、脂質體包括含細胞素之脂質體及Walter Reed脂質體，1,2 5 -二巍基維生素 D 3及得自羧乙烯基聚合物之凝膠化產物，精胺酸及 NaCl。”細胞素，，不限於任何特別物種，若其具免疫活化活性即可，因此，另外包含IFN_汉、iFN«y?、lFN-r、IL_ 經濟部中央標導局員工消費合作社印製 1 沒、I L _ 1 /5、I L - 2、I L 3、IL - 4、I L _ 5、I L _ 6、I L _ 7、iL-8、IL-12、TNF 麵汉、TNF-y5 及 GM-CSF。例如當在投予免疫增強組合物之部位附近，免疫活性細胞聚集及後續之增進抗體產生爲所須時，以I L - 1 /?及I L - 2特佳。有關之特殊佐劑包括而不限於一種以上之選自Adju-Phos，AJgai 葡聚糖、Algammulin，Alhydrogel、抗原調配 -19- 本紙张尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4規枱（2丨0X 297公兑） 586934 A 7 B7 -- I - ----- ----------- 五、發明説明（17) 物、Avridine、BayRl〇〇5、Calcitriol、石粦酸#5 凝膠、霍亂全毒素（CT)、霍亂B毒素亞單位（CTB)、CRL1005、 DDA、DHEA、DMPC、DMPG、DOC / 明礬錯合物、r 月夷島素、Gerbu 佐劑、GMDP、Imiquimod、ImmTher、r -干擾素、ISCOM(s)、Iscopcep 7.0.3、Loxoribine、LT-OA 或 LT 口月艮佐劑、MF59、MONTANIDE ISA51 、 MONTANIDE ISA 720 、MPL 、 MTP-PE 月旨質體、 Murametide、Murapalmitine(胞壁棕櫚酸甘油酯）、D-Murapalmitine、NAGO、非離子界面活性劑泡、pieuran、 PLGA、PGA 及 PLA，Pluronic L121、PMMA、PODDS、 Poly Ra : Poly· r U、Polyphosphazene、聚山梨糖醇酯 80、蛋白質 Cochleates、QS-21、Quil A, Rehydragel HPA、Rehydragel LV、S-28463、SAF«1、Sclavo肽、仙台（Sendai)蛋白質脂質體，含仙台脂質基質、Span 85、 Specol、角鯊烷、角裟烯、硬脂基酪胺酸、Theramide、蘇胺醯基_MDP，Ty粒。誘發免疫性之抗原性物質之量，及含於本發明免疫增強組合物中之免疫調節物質之量，可依含於組合物中之生物經濟部中央標準局員工消费合作社印製可相容物質與添加物之混合比例，及組合物之形式或大小任意調整。藉由本發明組合物投予之抗原性物質之劑量，可大約與供習用之投藥方法（例如以溶液或懸浮液形式腸外投藥）所用者相同。然而，因本發明之組合物如上述具極佳之免疫增強作用，當與習用投藥法比較時，可以較低劑量充分㈣發$ .................................. .... -20- 本紙张尺/lit削，丨·準（CNS) 渴^34 A7 B7 18 五、發明説明（疫丨生-且剑里叮依抗原性物質，本發明組合物之劑型及/ L------ J--「—^—1 (請先閱讀背面之注意事項 ^^寫本頁) 或诗同時與柷原性物質投予之免疫調整物質及其量而適宜调整。本發明I免疫增強組合物之形式或形狀可爲例如使組合物爲溶液狀、ϋ浮液狀、凝膠狀、薄膜狀、海綿狀、棒狀或粒狀。彳選擇適宜形式致使可更有效地謗發免疫反應。以棒狀形狀爲佳。如述於Ερ 65Μ〇6之塗佈或覆蓋之棒調配物尤其更佳。例如棒狀形式可於延長之一段時間料抗原性物質，且當存在時可釋放免疫調節物質，而粒狀組合物可容易地進行猎由免疫活性細胞如巨嗟細胞之㈣作用。於粒狀或細 '、辛之h开/，其直徑希望但不限於〇 1微米至1 〇〇微米，更佳地0.5微米至5 〇微米。根據本以明之生物可相答之载劑可爲致使抗原性物質分 :中或其中°生物可相容载劑可爲使能提供抗原性物質延遲及/或持續釋放者。線物叮相奋〈載劑可自任何適宜之生物可相容物質形成。經濟部中央標準局員工消f合作社印製作爲”生物可相同物質，，較佳爲具良好生物相容性及可保田=原性物質或抗原性物質與免疫調節物質穩定且持續地 ^體内釋放之那些物質。因此，作爲生物可相容物質，可提例如膠原蛋白、明膠、血纖維蛋白、白蛋白、透明質 :ί、：素、硫酸軟骨素、幾丁質、脱乙醮幾丁質、褐藻故、果膠、瓊脂糖、阿拉伯膠、乙醇酸、乳酸或胺基酸之 21 -

本紙張尺度顧巾家標_ ( CNS ) 格（210X2^iT 观934 A7 B7 五、發明説明（19 ) 經濟部中央標準局員工消f合作社印製聚合物及此等之2個以上之共聚物：羥基磷灰石、聚丙缔酸甲酯)、聚二甲基矽氧烷、聚四氟乙晞、聚丙烯、二乙烯及2個以上之此等生物可相容物質之混合物。選擇生物可相容物質以致符合應不會使抗原性物質或抗原性物質與免疫調節物質於製備免疫增強組合物之過程中受質及/ 或失活之條件。依所須之作用而定，其可爲生物可降體内可降解）或非生物可降解。 W 特佳之生物可降解及生物可相容物質，可提者爲膠原蛋白，吓希f可將膠原蛋白肖一種以上之生物可相容物質併用。任何膠原蛋白皆可用，只要其適宜本發明之目的即可。因此，可使用動物_或植物衍生之酸可溶性膠原蛋白、鹽可溶之膠原蛋白及鹼可溶性膠原蛋白，此等之衍生物如粥樣膠原蛋白、側鏈修飾之膠原蛋白及交聯膠原蛋白及基因工程之膠原蛋白，較好爲動脈膠原蛋白、側鏈修飾之膠原蛋白及父聯膠原蛋白。作爲側鏈修飾之膠原蛋白，可提例如琥珀醯基化、甲基化或肉豆蔻基化膠原蛋白。作爲交聯膠原蛋白可提例如戊二醛、六亞甲基二異氰酸酯_或聚環氧基化合物處理之膠原蛋白（Fragranee J〇urnal，1989(12)， 104-109 :日本專利公告（K〇k〇ku)〇7_59522)。聚二甲矽氧烷可被提爲特佳之非生物可降解之生物可相容物質’且亦希望上述之一種以上之生物可相同之物質與此聚一甲矽氧烷混合使用。該聚二甲矽氧烷不限於任何特別物種，但自塑造性之容易及其他觀點，如Silastic (註册商I)瘡藥級E T R彈性體Q 7 - 4 7 5 0及D 〇 w C 〇 r n i ng (註册商標） -22- M氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公棼） (請先間讀背面之注意事

項P .寫本頁) .裝- 586934 A? B7 五、發明説明（20 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 M D X - 4 - 42 1 0醫樂級彈性體之珍酮特佳。爲了抗原〖生物貝或抗原性物質與免疫調節物質之穩定化及/或控制其釋放，可加1#以上之醫藥添加物。醫藥添加物包括而不限於白蛋白、甘胺酸、除甘胺酸外之胺基 §义水版基酉义、明膠、發l酸款骨素、Nac卜甘露聚糖、葡糖甘露聚糖、單寧酸、檸檬酸鈉、甘露醇等。 7'使用1種以上〈生物可相容物質或添加物與膠原蛋白混合之情形，建議膠原蛋白之比例不少於10咖百分比，較佳地於不少於30 w/w百分比之範目，更佳地於少於70 :/w百分比之範圍。於使用一種以上之其他生物可相容物貝或'泰加物與聚二曱石夕氧燒混合使用之情形，聚二甲石夕氧 …例建議不少於1〇 w/w百分比，較佳地於不少於5〇 ▲百分比之範圍，更佳地於不少於70 w/w百分比之範園。作爲生物可相容之載劑，基於碎酮或基於膠原蛋白之生物可相谷載劑之混合以棒狀，較好覆蓋之棒狀形式，愈活性劑或免疫調節劑混合爲佳。〃疫較佳方面’提供以固體單位劑型之免物或基於膠原蛋白之生物可相容物質形成之生抗原性物質，及負載於其中之免疫調節物質。軚佳地’生物可相容載劑係以棒狀形式，更佳地爲覆蓋本紙張尺度制巾1¾ ®^iiTcNS ) 23 (210X297公楚） (請先閱讀背面之注事項！||寫本百〇 -裝·

-1T 線 586934 Λ7 Β7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製五、發明説明（21 ) 之棒狀物品。更佳地，棒狀生物可相容之載劑，係自基於珍酮之物質形成。本發明者等已發現，以此形式，抗原性物質於室溫下可爲％定的，且因此不須冷藏。另外，免疫調節劑可直接引入免疫增強組合物中：亦即，不須溶媒。投予本發明免疫增強組合物之方法，無特別限定，而包括腸外投藥、口服、投予鼻腔及/或肺内，使用加壓空氣射出，存留或包埋於切口部位。根據免疫增強組合物之形式，可以致使更有效誘發免疫反應之方式，選擇所須之投藥法。於棒狀組合物之情形。腸外投藥或於切口部位之存留爲所須，而於粒子之情形，彼等可如此直接應用於切口部位供存留，或可以藉將彼等懸浮於溶媒中製備懸浮液形式供注射用之腸外投藥，如曰本專利公告〇3_72〇46所述，或另外，可以射出投藥，藉由加壓空氣使用Hen〇s Gene Gun System (Bio-Rad)或例如述於Proc· Natl· Acad· Sci. USA，93, 6291-6296 (1996)之粉末槍。雖然注射用溶媒應依生物可相容之物質、抗原性物質及免疫凋節物質之性質而定，加以選擇，用詞”注射用溶媒” 不限於任何特別物種，若丨）粒子可分散於溶媒，2 )當粒子刀政於溶媒時，粒子可維持其形式，3 )當粒子分散於溶媒時’抗原性物質及免疫調節物質可保持於粒中，4 )溶媒爲無毒性，5 )粒子分散於其中之溶媒爲無毒性。例如，注射用落媒，當本文所指，包括而不限於蒸餾水、生理食鹽 __—^ ___ - 24 · _ 本紙張尺度 it if] ( CNS ) Λ4^ ( 210X 297^^ ) ' " (讀先閲讀背面之注意事項寫· 門本頁) •裝·

、1T -線 A7 Η 7 五經濟部中央標準局員工消费合作社印製、發明説明（22 水、_酸鹽緩衝溶液、大豆油、芝麻油、花生油、棉子油、M C T (中等鏈脂肪酸三甘油酯）、橄欖油、玉米油、蓖麻油、石夕酮油、p E G (聚乙二醇）、P G (丙二醇）及脂肪酸’ 用於製備脂質體如DOTMA、DOPE、DOGS等。作爲製造以生物可降解溶液、懸浮液及水凝膠形式之免疫增強組合物之方法，可提例如： (1) 包括將抗原性物質或抗原性物質與免疫調節物質，以粉末、溶液、懸浮液或凝膠形式，與溶液或凝膠形式之載劑（若須要，含一種以上之添加物）混合之方法， (2) 包括令含抗原性物質，或抗原性物質與免疫調節物貝，之么液、懸洋液或凝膠添加至粉末形式载劑（若須要，含1種以上之添加物）之方法，、3)包含令含抗原性物質，或抗原性物質與免疫調節物質之溶液、懸浮液或凝膠，添加至海綿狀載劑（若須要，本1 1以上之添加劑），接著捏和之方法。然而，這些非製造以生物可降解之固體形式之免疫增強組合物、、法’包括而不限於Fujioka等人之方法（日衣鱼方十寻利公主 59522)。作爲其他方法，可提 ^ - (1 )包括將抗原性物質，或抗原性物質與免疫弋# 以粉末、溶液、懸浮液或凝膠形式，與溶液或^ :物質’ 載釗（若須要，含1種以上之添加劑）混合接著乾_形式之 (2 )包括將柷原性物質，或抗原性物質與免疫/ γ方去，以粉末、溶液、懸浮液或凝膠形式，與粉灰同即物質，，式栽劑⑷貝 25- 本紙張尺度適用中國囤家標準（CNS ) Λ4規枱（210Χ 297公处） 586934 A7 B7 五、發明説明 23 經濟部中央標準局員工消費合作社印製要，含1種以上之添加劑）混合，接著乾燥之方法， (3)包括令含抗原性物質，或抗原性物質與免疫調節物質 (落m㈣或凝膠添加至海綿狀載劑（若須要含】種以上之添加劑），接著乾燥之方法， ^4)包括令含抗原性物質，或抗原性物質與Μ調節性物貝《落液、懸洋液或凝膠添加至料狀載劑（若須要本】種以上I添加劑），接著直接或加水之類乾燥，乾燥之方法，可之H已括將方法（1)_(4)所得之固體碾磨，接著加壓模鑄 ⑷包括將抗原性物質’或抗原性物質及免疫調節物質， :讀末形式，與粉末形式載劑(若須要，含-種以上之添加劑）混合，接著加壓模鑄之方法。製造以生物可降解粒子形式之免疫增強組合物之方法，另外包括而不限於、 ⑴包括將含抗原性物質或抗原性物f與免疫調節物質及載劑之溶液’若須要與—種以上之添加劑—起噴霧乾燥之方法， (2 )包括將含柷原性物質或抗原性物質與免疫調節物質及載狀溶液，若須要與—種以上之添加劑一起冷;東乾燥，接者將所得之海綿狀冷凍乾燥劑碾磨之方法， =⑽加含抗原性物質或抗原性物質與免疫 ^载叙溶液，若須要與—種以上之添加劑L至載 m洛於其中之經攪拌溶液，並乾燥所得粒子之方法。， (請先閱讀背面之注意事項 ^^寫本頁) .裝_ 線 26- 本紙張尺度適；fi 巾 eNS} λ4Μ^ 586934 A7 ----------B7五、發明説明（24 ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製乾燥万法、乾燥步驟中之溫度及濕度，混合方法及混合步驟中，溫度及濕度，壓鑄方法及壓鑄步騍中之溫度、濕度及模~壓力，載劑溶液及活性物質之黏度，或抗原性物質及免疫調節物質溶液及載劑_抗原性物質混合溶液與抗原性物質-免疫調節物質混合溶液之黏度及]?^[可如同習用方法。製造以非生物可降解固體形式之免疫增強組合物之方法，包括而不限於， (1) 包括將抗原性物質，或抗原性物質與免疫調節物質，以粉末、溶液懸浮液或凝膠形式，與載劑單體與—種以上之添加劑（若須要加硬化劑）混合，於任意選擇之塑模中，藉由充填或擠壓模鑄再進行硬化之方法， (2) 包括將抗原性物質，或抗原性物質與免疫調節物質，以落液、懸浮液或凝膠形式，與粉末形式之載劑（若須要含 1種以上之添加劑）混合，...接著乾燥之方法， (3 )包括將抗原性物質，或抗原性物質及免疫調節物質，以粉末、溶液、懸浮液或凝膠形式，與粉末形式之載劑（若須要，含一種以上之添加劑）混合，及丨）將混合物充填於任意選擇之塑模，接著加壓模鑄，或2)用噴嘴擠出混合物之方法， (4)包括將抗原性物質，或抗原性物質與免疫調節物質，以落液、懸浮液或凝膠形式，與海綿狀載劑（若須要，本一種以上之添加劑）混合，接著乾燥之方法， (5 )包括將活性物質，或活性物質與免疫調節物質，以粉 _____ -27- 本紙张尺度適用中國國家標华（CNS ) Λ4規桔（210X 297公势） ---'一~· (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) -裝- 訂線 586934 A7 B7 五、發明説明（ 25 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製末、洛液、磕净液或凝膠形式，與海綿狀載劑（若須要含工種以上之添加劑）混合，及丨）將混合物充填於任意選擇之塑模中，接著壓麵或2 )用噴嘴擠出混合物之方法， (6)包括藉由方法（1)、（3)及（5)，形成含抗原性物質，或抗原性物質與免疫調節物質之棒狀内層，再以無抗原性物質及免疫調節物質之外層物質塗佈内層之方法，及、（7)包括同時藉由另外使用嘴嘴共同擠壓形成内層與外層之方法。乾燥方法，於乾燥步驟中之溫度及濕度，混合方法，混合步驟中之溫度與濕度，壓鑄之方法，壓鑄步驟中之溫度、濕度及模鑄壓力、載劑溶液及抗原性物質或抗原性物質與免疫調節物質溶液之黏度，及載劑-抗原性物質混合落欣及抗原性物質·免疫調節物質混合溶液之黏度及 p Η，可如同習用方法。使用本發明之免疫調節組合物之古身奶足万法，包括而不限於，例如（1 )用爲人類使用或除人類外之、、哺礼，員及鳥類用之疫苗表劑’供疾病預防或治療目的，、十久W )用馬投予動物供產生抗體之目的用之免疫製劑。於是，於本發明之較佳方面，提 ,....^ ^ , 捉彳，、頂防或治燎疾病或其他疾患4万法，其包括提供包含生物可相容載劑及負载並我，、上足心原性物物質與免疫調節物質之免疫增強組合物；及貝3执帛改將有效量之免疫增強組合物投予接受者。本發明之兔疫增強組合物之投丁位旣可依使用之目的加 -28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公你 (請先閱讀背面之注意事- 項 :寫本頁) •裝. 、11 線 586934 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 Λ7 -____上 7 一五、發明説明（26 ) 一 — 以選擇。於用爲晋通疫苗之情形’例如可將組合物皮下、肌肉内或藉類似途徑投予。因，如已在，，本發明原理之説明 ’’一節中所述，本發明之免疫增強組合物可特別地活化負貴投予部位或投予部位附近之淋巴節中之免疫反應，所以該組合物若須要可直接投予標的器官。因此，例如帶有腫瘤衍生之抗原及細胞素之免疫增強組合物可直接投予細胞部位或投予已外科切除腫瘤之部位，因此活化對腫瘤之免疫反應。另外，預期此種直接局部投予免疫增強組合物至腫瘤邵位，對於腫瘤細胞之轉移至全身性淋巴系統（經由負貴該腫瘤部位之淋巴節）之轉移，產生抑制作用。本發明接著參考附圖及實例，更詳細描述。然應了解的疋’ F面之説明只爲例示，無論如何不應解釋爲對上述之本發明之一般性之限制。附圖之簡要説明圖1 如於試驗實例】與試驗實例2可見，自免疫增強組合物漸增的釋放抗生物素蛋白及I L - 1卢之過程。圖2 小鼠中抗生物素蛋白抗體之效價之時間過程。圖3 羊中抗生物素蛋白抗體之效價之時間過程。圖4 投予於試驗實例7中製備之免疫增強組合物（c D 4 5， X 300 )之部位之組織學顯微相片。 _ -29-_ 本紙張尺度適用中國國家標孪（CNS ) Λ4規格（210X 297公始） (請先閱讀背面之注意事項1?^寫本頁) 裝· 訂 Λ7 一' ~ ____^ B7 五、發明説明（27 ) 〜經濟部中央標準局員工消费合作社印製圖5 投予於試驗兔/ , ^ ^ , @例8中製備之免痕增強組合物（CD45， χ300)之部位、織學顯微相片。圖6 如t 4驗貫例5中測定，自免疫增強組合物漸增的釋放抗生物素蛋白之時間過程。圖7 如於试驗實例6中測定，自免疫螬強組合物漸增的釋放抗生物素蛋白及Π 1 . 久1L _ 1々之時間過程0 圖8 · 如於试驗實例7中可見，於小鼠中之抗生物素蛋白抗體效價之時間過程。圖9 如試驗實例8中所見，於小鼠中之抗生物素蛋白抗體效價之時間過程。圖1 0 於試驗實例9中單獨投予矽酮後，羊之體溫及白血細胞計數之時間過程。圖1 1 於試驗實例9中投予含丨L - 1 Θ之基於矽酮之免疫增強組合物後，羊之體溫及白血細胞計數之時間過程。圖1 2 於試驗實例9中投予含I l - 1 Θ及抗生物素蛋白之基於石夕酮之免疫增強組合物後，羊之體溫及白血細胞計數之時間 -30-__ 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4規核（210X 297公犮） —~~ '一' (部先閱讀背面之注意事項^^寫本頁) •裝· 、11 線五、發明説明（ 28 A7 B7 過程。實例 (1)免疫增強組合物之製備實例1 將含5.0毫克/毫升抗生物素蛋白（Boehringer Mannheim GmbH，西德）之水溶液（1 0毫升）及含100毫克/毫升甘胺酸（Nakalai Tesque公司，日本）之水溶液3毫升，與134克粥樣膠原蛋白溶液（Koken公司，日本；粥樣膠原蛋白含量：2 %)混合，得溶液形式之免疫增強組合物。實例2 將含5.0毫克/毫升羊IL - 1之水溶液（1.7毫升）（藉A.E.

Andrews 等 Vaccine，12, 14-22，1994 中之方法製備），8.6 毫升之含5.0毫克/毫升抗生物素蛋白之水溶液及15毫升之含1 00毫克/觉升甘胺酸之水溶液；與142克2 %粥樣膠原蛋白溶液混合得溶液形式之免疫增強組合物。實例3 藉由將賞例1中製備之溶液形式免疫增強組合物冷凍乾燥，得海綿狀免疫增強組合物。經濟部中央標準局員工消费合作社印製實例4 藉將實例2中製備之溶液形式之免疫增強組合物冷凍乾餘’得海綿狀免疫增強組合物。實例5 藉加7克蒸餾水至實例3中製備之海綿狀免疫增強組合物7α物放過夜接著捏和，得凝膠形式免疫增強組合本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^L；fe 31 (210X297公赴） A? ____________H 7 五、發明説明（29 ) 〜〜〜物。實例6 藉力口 7克蒸餾水至實例4中土 η ί歹i 4中製備之海綿狀免疫增強組合物，令混合物放過夜，接荖者搜和，知凝膠形式免疫增強組合物。實例7 . 藉將實例5中製備夕盔狀犯a、、一爾之統恥形式又免疫增強組合物擠壓出，接著乾燥得棒狀免疫增強組合物。實例8 藉將實例6中製備之凝膠形式免疫增強组合物擠壓出，得棒狀之免疫增強組合物。實例9 將1毫克^毫升抗生物素蛋白水溶液（11.1克）及以2克之 81堂克/意升人類血清白蛋白(hsa)水溶液一起混合，將混合物冷;東乾燥。將冷;東乾燥物碾磨、過篩得具不超過2〇微米之粒徑之粉末。分開地，將G.7£silas叫註册商標， Dow Cornmg公司，USA)醫藥級ETR彈性體Q7_475〇a部分及0.7克之B部分一起混合。混合後，快速將混合物與〇6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製克Ui述粉末捏和。將捏和之混合物於加壓下擠出通過具 1.9毫米之直徑之孔，令放於室溫熟化。將棒切割得免疫增強組合物。 9 實例1 0 將1毫克/毫升抗生物素蛋白水溶液（111克）、61微升之 2 ^:克/愛升I L - 1 /5水溶液及1 2 2 ’克之8 1亳克/毫升人血 ____ -32-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210x297公H Ο〇^34 Λ7 B7 """— -—~— ----------- ' — —---.-—. ___ 五、發明説明（30 ) 清白蛋白（H S A )水溶液一起摻合，將混合物冷凍乾燥。將冷凍乾燥物碾磨及過篩得粒徑不超過2 0微米之粉末。分開地，將0.7 克 Silastic(註册商標，Dow Corning公司，USA) 醫藥級E T R彈性體Q 7 - 4750 A部分及0·7克之B部分一起摻合。摻合後，混合物快速與〇·6克之上述粉末捏和。捏和之混合物於加壓下擠壓通過具1 · 9毫米直徑之孔，令放於室溫熟化。切割此棒得免疫增強組合物。實例1 1 藉將實例9之熟化產物浸於10% Silastic(註册商標，dow Corning公司，USA)醫藥級ETR彈性體Q7-4750(A部分與 B邵分之1 : 1混合物）於甲苯中之分散液，接著乾燥，提供外層（厚度：0.2毫米）。切割此棒得免疫增強組合物。實例1 2 藉將貧例1 0之熟化產物浸於1 〇% Silastic(註册商標，

Dow Corning公司，USA)醫藥級ETR彈性體Q7-4750(A部分與B部分之1 : 1混合物）於甲苯中之分散液，接著乾燥，提供外層（厚度：0.2毫米）。切割此棒得免疫增強組合物。實例1 3 經濟部中央標準局員工消费合作社印製將1毫克/毫升抗生物素蛋白水溶液（11· 1克）及12.2克之 8 1毫克/毫升H S A水溶液一起混合並冷凍乾燥。將冷凍乾燥物碾磨、過篩得具粒徑不超過2 〇微米之粉末。分開地，將1.372克Shin-Etsu矽酮（註册商標，shin-Etsu化學公司，曰本）KE68(主物質）及28毫克Shin-Etsu矽酮（註册商標， Shin-Etsu化學公司，曰本）Cat-RC(熟化劑）一起混合。混 •___二 33 - 尺度適用中國國家標準（〇吣）/\4規格（210><297公^ ' 586934 經濟部中央#準局員工消费合作社印製 A7 _______Η 7五、發明説明（31 ) 合後，混合物快速與〇·6克之上述粉末揑和。捏和之混合物於加壓下擠壓通過具L9毫米直徑之孔，令放於室溫熟化。切割此棒得免疫增強組合物。實例1 4 將1耄克/愛升抗生物素蛋白水溶液（丨丨1克）、6 i毫升之 2¾克/¾升il·〗y?水溶液及122克之81毫克/毫升hsa 水落液一起混合，混合物冷凍乾燥。將冷凍乾燥物碾磨、過篩得粒徑不超過20微米之粉末。分開地，將1372克 Shin-Etsu矽酮K E 6 8 (主物質）及2 8毫克Shin_Etsu矽酮Cat_ RC (熟化劑）一起混合。混合後，混合物迅速與〇·6克上述粉末捏和。捏和混合物於加壓下經由19毫米直徑之孔擠出，令放於室溫熟化。切割此棒得免疫增強组合物。實例1 5 藉將實例1 3之熟化產物浸於1〇% Shi.Etsu矽酮（ΚΕ-68 與Cat-RC之98 : 2混合物）於甲苯中之分散液中接著乾燥提供外層（厚度：0.2毫米）。切割此棒得免疫增強組合物。實例1 6 藉私η例1 4之粗產物浸於1 〇 % shin-Etsu石夕酮（KE-68與 Cat-RCl98 : 2混合物）於甲苯中之分散液，接著乾燥提供外層（厚度· 0 · 2靟米）。切割此棒得免疫增強組合物。實例1 7 · 將含5笔克/堂升抗生物素蛋白之水溶液（〇 578克）、含 1〇〇毫克/毫升檸檬酸鈉之水溶液（13〇克）及含1〇〇毫克/ 毫升甘露醇之水溶液（13.C克）混合，冷凍乾燥。冷凍乾燥猶34· 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公及） (請先閱讀背面之注意事項 -本頁} .裴· 線 586934 Λ7 Η 7 經濟部中央標準局負工消费合作社印製五、發明説明（32 ) 產物於N2大氣下碾磨得粉末，分開地，將1.05克Silastic (註册商標，Dow Corning公司，US A)醫藥級ETR彈性體 Q 7 - 4750 A部分與1.05克B部分混合。混合後，混合物快速與0.90克上述粉末捏和。將揑和之混合物充填入注射器，於加壓下經由1.6毫米孔擠出，令放於2 5 °C 3天熟化。切割此棒得免疫增強組合物。實例1 8 將含5毫克/毫升抗生物素蛋白之水溶液（2.89克）、含 100毫克/毫升之檸檬酸鈉水溶液及含1 〇〇·毫克/毫升甘露醇之水溶液（6.42克）混合及冷凍乾燥。冷凍乾燥產物於n2 大氣下碾磨得粉末。分開地，將〇·93克Silastic (註册商標，Dow Corning公司，USA)醫藥級ETR彈性體Q7-4750A部分與0.93克B部分混合。混合後，混合物快速與 0·80克上述粉末捏和。捏和混合物充填入注射器，於加壓下經由1.6毫米孔擠出，令放於25。〇歷3天熟化。切割此棒得免疫增強組合物。實例1 9 和抗生物素蛋白、檸檬酸鈉、甘露醇及Silastic之捏和混合物以如同實例1 8方式充填於注射器内。分開地，將5 〇克 Silastic (注册商標，Dow Corning 公司，USA)醫藥級 ETR 彈性體Q7-4750A部分及50克B部分混合，充填入其他注射器。於加壓下將充填物經由同心排列之噴嘴（最外面直 fe : 1.9¾米）擠出，以致含藥物之以丨“以形成内部，及無藥物又Silastic形成外部。令模鑄物放於3 7。(：歷5天熟化， ____ -35 嶋本紙张尺/又通州个阁囤孓標準（CNS ) Λ4規輅（210X297公势 (請先閱讀背而之注意事項寫本瓦) •裝· 線 ^34 ^34 經滴部中央標準局員工消費合作社印製 _ __ 旧______________ 1、發明説明（33 ) 再切割得免疫增強組合物。實例2 0 將含5毫克/毫升抗生物素蛋白之水溶液（〇.30克）、含 iOO毫克/毫升檸檬酸鈉之水溶液（4.34克）及含100毫克/ 亳升甘露醇之水溶液（8.67克）混合並冷凍乾燥。冷凍乾燥產物於N2大氣下碾磨得粉末。分開地，將〇.93克Snastic (設册商標，Dow Corning公司，US A)醫藥級ETR彈性體 Q7-4750A部分與〇·93克B部分混合。混合後，混合物快速與0.80克上述粉末捏和。捏和混合物充填入注射器，於加壓下經由1.6毫米孔擠出，令放於2 5 歷3天熟化。切割模鑄物得免疫增強組合物。實例2 1 將抗生物素蛋白、檸檬酸鈉、甘露醇及Siiastic之捏和混合物以如同實例2 0之方式充填入注射器。分開地，將5 〇克 Silastic (註册商標，Dow c〇rning公司，USA)醫藥級 ETR 彈性體Q 7 - 4750 A部分與5 0克B部分混合，並充填入另外之注射器。充填物於加壓下經由同心排列之噴嘴擠出（外部之内側直徑：1.9毫米，内部之内側直徑·· ι·6毫米），以致含藥之Silastic形成内部及不含藥之silastic形成外部。令模鑄物放於3 7 °C歷5天熟化，再切割得免疫增強組合物。實例2 2 將含5 ^:克/亳升抗生物素蛋白之水溶液（〇 45克）、本2 靟克/ %升I L - 1 /5之水溶液（3 · 15克）、含25〇亳克/亳升檸檬酸鈉之水溶液（1 92克）及含15〇毫克/毫升甘露醇之水 _____ -36- 本紙张尺度適用中國囤家标率（CNS )八4坭枋（210X 297公兑） " --- (讀先閱讀背面之注意事填寫本頁) •裝·

、1T 線 586934 kl H7 五、發明説明 34 經濟部中央標準局貝工消f合作社印製溶液（6.19克）混合’冷凍乾燥。冷凍乾燥產物於n2大氣下碾磨得粉末。分開地，將1.05克Silastic (註册商標，Dow Coining公司，USA)醫藥級ETR彈性體Q7-4750A部分與 1 · 〇 5克B部分混合。混合後，混合物快速與〇 9 〇克上述粉末捏和。捏和混合物充填入注射器，於加壓下經由1.6毫米孔擠出，令放於2 5 r歷5天熟化。切割模鑄物得免疫增強組合物。實例2 3 抗生物素蛋白、IL - 1 /?、檸檬酸鈉、甘露醇及Silastici 捏和混合物如同實例2 2之方式充填於注射器内。分開地，將50克Silastic (註册商標，Dow Corning公司，USA)醫藥級E T R彈性體Q 7 - 4 7 5 0 A部分及5 0克B部分混合，充填於另外之注射器内。充填物於加壓下經由同心排列之噴嘴擠出（外部之内侧直徑：19毫米，内部之内侧直徑：16毫 “）禾1出以致含藥之Silastic形成内邵而無含藥之silastic /成外$。令模鑄物放於2 5 °C歷3天熟化，再切割得免疫增強組合物。 (2 )釋放試驗式驗貫例1 如只例7中製備之免疫增強組合物（1 0毫克）置於5毫升含〇·5%牛血清白蛋白及〇〇1%疊氮化鈉之磷酸鹽緩衝液（pH 、.4 )中’以酵素連接免疫吸附劑測定法（ELIS A)測定釋放 =抗生物素蛋白，及測定漸增之釋放。如此所得結果示於圖1免疫增強組合物於不少於7天内持續釋放抗生物素蛋 -37- 本’氏張尺度迻用f國國家縣（C A桃格（训X撕公 (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) 裝· 訂線 586934 A7 H7 五、發明説明（ 35 白。武驗貧例2 將實例8製備之免疫增強組合物（丨〇臺一兄）置A 5¾升本 0.5%牛血清白蛋白及0·01%疊氮化納之碑酸鹽緩衝。

7.4)中，以ELISA測定釋放之抗生物素蛋白及况]卢。lPH 得結果示於圖1。免疫增強組合物於不少趴所乂％ 7天内持續釋放抗生物素蛋白及IL-1/?。 (3 )抗體產生實驗試驗實例3 經濟部中央標率局員工消费合作社印製兩群各5隻雌Balb/C小鼠接受皮下投予實例7中製備之人 1〇〇微克抗生物素蛋白之免疫增強組合物，或實例8中製^ 之含〗00微克抗生物素蛋白及2 0微克I L - 1 之免疫増強組合物？於投予後第7、14、21、35及83天，自小鼠收集血液樣品。聚集得自各群之5隻小鼠之等量血清，以£1^8八分析抗-抗生物素蛋白特異性抗體。結果表示爲5 〇 %中點效價，而證明此組合物之免疫增強作用（圖2)。投予後第3 5 天’投予實例7製備之免疫增強組合物之小鼠之血中抗體效價，與對照組實例1所得之抗體效價比較時爲約高2 5 倍。另外，投予實例8製備之免疫增強組合物之小鼠血中之抗體效價，爲對照組實例1所得之抗體效價之高至約450 倍。對照實例1 5隻雌Balb/C小鼠接受皮下投予100微克可溶性抗生物素蛋白（於PBS中）。投藥後第7、14、21、35及83天，收集 • 38 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（210X297公处）發明説明（36 Λ7 in 經滴部中央標準局員工消f合作社印製得自小鼠之血液樣品。聚仿〜 ELISA測定抗-抗生物素：：：自5隻小藏之等量血清，以中點效價而證明此板：物特異性抗體。結果表示爲試驗實例4 心物〈免疫增強作用(圖2)。 5隻混合性別之麥利笔至 > 疮平接受皮下投予實例8中製造之疫增強組合物。投予後繁7 丫表1炙兑、、产掉。s, , ^ 丁佼弟7、Μ、21及35天，自羊收集血液也κ p 口。來集彳于自5隻羊乏笔曰、主又干足寺1血清，以ELIS A測定抗-抗生物素蛋白特異性抗體。姓+ 机、、、口果表不馬5 0 %中點效價而證明此組合物之免疫增强彳七m 乍用（圖3)。投藥後14天確立高含量之抗_抗生物素蛋白特異性抗體產生。對照實例2 5又此口〖生別之麥利諾羊接受皮下投予丨〇〇微克之可溶性抗生物素蛋白（於PBS中）。投藥後第7、14、21及35天，自早收集血液樣品。聚集得自5隻羊之等量血清，以EusA 測毛抗-抗生物素蛋白特異性抗體。結果表示爲5 〇 %中點效價而證明此組合物之免疫增強作用（圖3 )。投藥後3 5天無觀察到抗-抗生物素蛋白特異性抗體產生。對照實例3 5隻混合性別之麥利諾羊接受皮下投予1〇〇微克之可溶性抗生物素蛋白及2 0微克丨L _丨卢（於p b s中）。投予後第7、 1 4、2 1及3 5天，自羊收集血液樣品。聚集得自5隻羊之等量血清，以ELISA測定抗-抗生物素蛋白特異性抗體。結果表示爲5 0 %中點效價而證明此組合物之免疫增強作用（圖 3 )。投于後3 5天並觀察到抗-抗生物素蛋白特異性抗體產 -39- 本紙張尺度適用中國國家標华（CNS ) Λ4規枱（210X 297公及） (請先閱讀背而之注意事填寫本頁) •裝- ,11 線經濟部中央標隼局員工消#合作社印製 586934 Λ7 -______ H7 - _ 07 ---------*----------------- 五、發明説明（）生。 (4 )組織學分析羊接艾皮F投予實例7中製備之免疫增強組合物或實例8 中製備之兄疫增強組合物於左腰窩之3個不同部位中。將動物於投藥後7 2小時犧牲回收皮膚生體組織切片供分析。將生體組織切片包埋於〇CT供分析冷凍切片上之細胞表面 CD45表現。組織學顯微照片證明由免疫增強組合物誘發之白血球之浸潤（圖4及5 )。試驗實例5 將實例1 7中製備並切割成相當於抗生物素蛋白含量爲工〇微克之大小之免疫增強組合物，及實例1 8與丨9製備並各切成相當於抗生物素蛋白含量爲100微克之大小之免疫增強組合物’分別置於含〇 3%吐恩（Tween)2〇&〇〇1%疊氮化鈉之2毫升磷酸鹽緩衝液（pH 7.4 )，並令放置釋放之抗生物素蛋白以ELISA測定，並決定漸增之釋放。所得結果示於圖6。抗生物素蛋白之釋放動力學可由選擇組合物之形式而控制。因此，基質形式組合物（實例i 7及1 8)顯示約1次釋放型，而覆蓋之棒形式組合物（實例1 9 )顯示約〇次釋放型。此等組合物於至少3 〇天内持續釋放抗生物素蛋白。 $式驗貫例6 將實例2 0及2 1製備且各切成相當於抗生物素蛋白含量爲 5微克之大小之免疫增強組合物及貫例2 2與2 3中製備且各切成相當於抗生物素蛋白含量爲5微克及I L - 1 含量爲5微克之大小之免疫增強组合物，分別置於含0.3 %吐恩2 〇及 -40- ............. ~—… 一—_ .....— 本紙張尺度適用中國阀家標苹（CNS ) Λ4規枱（210X297公处） (請先閱讀背面之注事_填寫本頁} •裝- 訂 586934 Λ7 B7 五、發明説明（ 38 經濟部中央標嗥局員工消费合作社印製 0.01 %疊氮化鈉之2毫升碍酸鹽緩衝液（pH 7.4)中，令放置。以ELISA分析釋放之抗生物素蛋白及iL-ip，並決定漸增性釋放。所得結果示於圖7。如試驗實例5中，抗生物素蛋白及I L- 1 之釋放動力學可藉選擇組合物之形式控制。此等組合物於至少丨5天内持續釋放抗生物素蛋白及 IL- 1 /?。試驗實例7 3群·之Balb/C小鼠（每群6隻雄鼠）分別接受皮下投予實例 1 7中製備之免疫增強組合物（含丨〇微克抗生物素蛋白），實例1 8中製備之免疫增強組合物（含1〇〇微克抗生物素蛋白）及貫例1 9中製備之免疫增強組合物（含1〇〇微克抗生物素蛋白）。投藥後I4、28及42天，收集血液樣品，於各收集時間，私彳于自各群6隻小鼠之血清部分並以EUS a測定抗-抗生物素蛋白抗體效價。各抗體效價以5〇%中點效價表示。如此所得結果示於圖8。投予後丨4天，投予實例1 7中製備 =免疫増強組合物之小鼠之血液抗體效價達到高至控制組例4者足約180倍之含量，儘管事實上抗生物素蛋白之量 =爲對照組實例4組合物中之量之1/1〇。投藥後"天，投予賞例〗8與19中製備之免疫增強組合物之小鼠血液中之：髌政價，當與對照組實例4者比較時高約25〇及約倍。於投予實例17、18及19中製備之免疫增強組合物之小藏 ^血液抗體效價，於投予後6週比對照組實…者高。對照組貧例4 b/C小机（6隻雄鼠）皮F投予含⑽微克抗生物素蛋白 -裝-- (謂先閱背面之注事調填寫本頁) 、11 線 (210X297公势） Λ7 --________ H7 五、發明説明（39 ) 之PBS溶液。投予後"、28及42天，收集血液樣品。於各收‘時間，聚集得自6隻小鼠之血清部分並以elis A分析抗抗生物素蛋白抗體效價。各抗體效價以5 〇 %中點效價表示。所得結果示於圖8。試驗實例8 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 4群Balb/C小鼠（每群6隻雄鼠）接受皮下分別投予實例“ 中製備疋免疫增強組合物（含5微克抗生物素蛋白），實例 21中製備之免疫增強組合物（含5微克抗生物素蛋白），實 7 22中製備之免疫增強組合物（含5微克抗生物素蛋白及$ 微克I L 1 /5 )及貫例2 3中製備之免疫增強組合物（含5微克抗生物|蛋白及5微克丨L _丨々）。投予後丨42 8及4 2天收集〇液樣品。於各收集時間，聚集得自各群中6隻小鼠之血π 4刀，並以ELIS A測定抗_抗生物素蛋白抗體。各抗體 ::以5〇%中點效價表示。如此所得結果示於圖9。於投丁貧例20、21、22及23中製備之免疫增強組合物之小鼠中’自投予後14天於血中檢測抗-抗生物素蛋白抗體，而方、投了相同里之對照組貫例5中之抗生物素蛋白之小鼠中之抗體效價，於整個試驗期間低於檢測極限。於投予實例 ^ 2 2及2 3 I免疫增強組合物之小鼠中之血液抗體效伽，比對照貧例6者高直至投藥後28天，於投予實例U與 23之免疫增強組合物之小鼠中之血液抗體效價，於整個試驗期間，比對照實例5者高得多。對照實例5

Balb/C小鼠（6隻雄鼠）皮下投予含5微克抗生物素蛋白之 ----- - 42 - 本紙張尺度賴㈣ 586934 A7 1Π 五、發明説明（4〇 ) P B S溶液。投藥後1 4、2 8及4 2天，收集血液樣品。於各收集時間，聚集得自6隻小鼠之血清部分，以ELISA測定抗 -抗生物素蛋白抗體效價。各抗體效價以5 0 %中點效價表示。所得結果示於圖9。對照組實例6 Balb/C小鼠（6隻雄鼠）皮下投予含5微克抗生物素蛋白及〇. 2 6 % (重量比）之明礬之P B S溶液。投藥後1 4、2 8及4 2 天，收集血液樣品。於各收集時間，聚集得自6隻小鼠之血清部分，以ELISA測定抗-抗生物素蛋白抗體效價。各抗體效價以5 0 %中點效價表示。所得結果示於圖9。下文將’’免疫增強組合物’’縮寫爲I C。試驗實例9 以類似上面實例2 0與2 2中所述之方式製備基於碎自同之 1C。基於矽酮之1C於下表中識別爲”基質，，。各組合物之含量示於下表1中。類似地，以類似於上面實例21與23中所述方式製備經塗膜之基於矽酮之1C。塗膜之基於矽酮之…於下表中識:爲蓋棒”。各組合物之含量示於下表1。 c先背面之"4^事填· .寫本頁) •裝· 線經滴部中央標準局員工消费合作社印裝 -43- 本紙張尺度適用中國阀家桴举（CNS ) Λ4規格（210x297公处 586934 Λ7 H7 發明説明（41 經濟部中央標準局負工消費合作社印製尺 I張纸 I本表1 於試驗實例9中供評估基於矽酮之ICS 之免疫增強作用之組成之含量 _組別組成（微克） ILA/3 抗生物素蛋白 1 基質 0 -----·~— 500 2 基質 0 100 3 基質 0 10 4 基質 20 500 5 基質 20 100 6 基質 20 10 7a 覆蓋棒 50 500 7b 基質 50 500 8 基質 _50_ 100 9 基質 50 - 10 10 500微克抗生物素蛋白(於PBS中X鱗酸鹽緩衝溶液) ~'500微克抗生物素蛋白+20微克IL-1 y5 (於PBS中) π 12 500微克抗生物素蛋白(於明裝中）於此試驗中，於第28天藉由皮下途徑將基於矽酮之免庐增強組合物或對照組組合物（第1〇、n、12組）引入， 1 00微克抗生物素蛋白（於p B S中）之第二期免疫作用。著基於矽酮之免疫增強組合物之效力 -44- t適用中酬家標準（CNS ) Λ4規#, ( 210X 297公 1Γ7 (邡先閲讀背面之注意事填寫本頁) 、=口線 ' m In · 586934 經濟部中央標準局員工消f合作社印製五、發明説明（42 ) 將羊分成1 2組，每組7隻。各接受皮下投予根據表1之組合物。於第2 8天發生以100 微克之第二期免疫作用。所得結果示於表2。表2 於試驗實例9中發現之羊之中之抗生物素蛋白抗體效價（50%中點效價J_ 組別組成(微克）第一期免疫作用後第二期免疫作用後 IL-1/3 抗生物素蛋白 14d 28d 14d 28d Μ 1 0 500 500 160 500 398 Μ .2 0 100 795 500 398 50 Μ 3 0 10 560 630 1260 1260 Μ 4 20 500 1585 1000 2510 1260 Μ 5 20 100 2000 1000 2000 1260 Μ 6 20 10 2000 1780 4467 3980 Μ 7b 50 500 2820 1585 6310 4467 Μ 8 50 100 560 560 5012 2512 Μ 9 50 10 6310 6310 10000 6310 CR 7a 50 500 7080 6310 19950 19950 S 9 0 500 200 <50 <50 <50 S .10 20 500 1000 316 6310 1585 A ii 0 500 1585 1585 5012 2512 Μ :基質 -45- 本紙張尺度適用中國國家標-準（CNS ) Λ4规格（210X 297公赴） (請先閱讀背面之注意事填寫本頁 •裝_ 線 586934 Λ7 ---------- B7 五、發明説明（43 ) ^ CR :覆蓋棒 S : P3S溶液 A :含明礬之p b S溶液釋放之抗-抗生物素蛋白特異性抗體藉eUSA測定，自得自各組之聚集之血清進行滴定。於典IL-1 /5佐劑存在下，基質矽酮IC優於以鹽水輸送之抗原（於所有測試之劑量），但比以明礬輸送之抗原較低效力。抗體反應t增強藉由加U—丨々於矽酮及鹽水組合物中爲佐劑。數種具IL - 1 之矽酮IC誘發之反應優於於明礬組合物中之抗生物素蛋白。對於基質碎S同I C ’有最低抗原劑量爲最有效於誘發高抗體反應之傾向。復盍棒I C優於基質丨c，基於抗體效價及反應期間。矽酮I C之生物相容性將羊分成8組，每組7隻。各接受皮下投予根據表3之矽酮IC。 (請先閲讀背面之注意事填寫本頁} 裴· 、^1 線經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 — --—— ______-46 - 本紙张尺度適用中國國家標华（CNS ) Λ4現祐（21〇 X 297公婷）五、發明説明（ 44 Λ7 Η 7 表3 供武驗賞例9中評估生物相容性用之基於石夕酮之I C s之含量

(讀先閲讀背面之注意事填寫本頁) •裝· 、-口母組兩隻羊供監測白細胞計數及體溫。於下列日數收集供组織學用之植入部位之活組織切片：植入後2天（2隻羊）植入後4週（2隻羊）植入後8週（2隻羊）植入後2天，於所有I c部位觀察到輕微水腫。此於具！ L _ 1 /5之I C中更明顯。於植入後4與8週，於I C部位周圍之組織顯現正常。i c未經包膠且未附著於組織，而可自由地移動。無觀察到不利之組織反應。系統性作用 47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規輅（210Χ 297公及） -線經濟部中央標準局員工消費合作社印製 586934 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A? - -s___ H7——_______ 五、發明説明（45 ) 一— —^ " 進行體溫及白血細胞計數。所得結果示於圖1 0 a及b爲單獨矽酮I C及圖1 1 a與b爲只併入IL-ly5之1C及於圖12a及b爲具抗生物素蛋白及iLq 冷之1C。無併入IL- 1 /5之所有類型之矽酮植入物，於溫度或白細胞計叙上，無引發任何不利之作用。當投予只併入I L - 1 /3之矽酮I c時，於羊中觀察到暫時增加體溫，其比注射於鹽水中之^“卢後所觀察之結果較不嚴重。於此等羊中之平均增加爲1 Ό，24小時觀察到正常溫度。另外，白細胞計數增至正常量之4倍，然而24小時後再觀察到正常量。杬生物素蛋白之存在於矽酮][c中造成嚴重性之降低及白血細胞計數（WBC)之繼續存在及與自IC釋放IL]々有關之溫度變化。此等結果證明矽酮ICs並不引發體溫與白細胞計數之長期不正常，及觀察到之暫時性浮動極少，及與iL_i/?之包含於ICs有關而非矽酮ICs本身之任何活性。。投予部位之#組鎩聲不同類型之矽酮ICs之結果相同，不同反應只歸因於汽」之存在或不存在於ICs。 1 .併入IL- 1 yS 之 ICs 第一 a毛接又$1L-1冷之1Cs之所有動物中，於投予部位及整個周圍组織有大量之細胞流入，大部分爲嗜中性細胞。 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格^210X 297公17 (誚先閲讀背面之注意事^^填寫本頁) -裝·

、1T 線 586934 經漪部中央標隼局員工消费合作社印製 A7 ___________ H7 --.- - ——一---.......... . 五、發明説明（46 ) 對於T與B細胞標記染色之細胞主於上皮中且只有少許散佈於皮膚之下層。里土里_於此等切片中觀察到之免疫細胞主爲嗜中性細胞。 MHC第1與第類陽性細胞之增加顯然地超過於第2天所觀察之程度。少許C D 4，C D 8，r j及C D !陽性細胞發生於I C周圍之層及散佈於組織之其餘部分。一些c D 4 5 R陽性細胞亦顯現散佈於整個皮膚。第8週細胞此時主爲I C周圍之一層，而組織具更正常之外觀。對於圍繞ICs之LC A細胞爲陽性，且以任何之淋巴球標記不染色之細胞層亦顯然的。可能此等細胞爲成纖維細胞。以Massons二巴染色之石概切片顯tf —薄層之濃密染色之膠原蛋白，指示1C開始包膠。MHC第1與第1 !類陽性細胞亦發生於I C周圍之L C A -陽性層中，但不像第4週遍佈組織。只有散佈之陽性之C D 4，較少之C D 8，r d，C D 1及 CD45R。 3 2 Ά.得自接受不含I L - 1 yS動物之活組織切片，所有皆具正常农膚外觀。無明顯之細胞流入或水腫。於表皮細胞中很少發生淋巴球表面標記染色。第4埋成纖維細胞明顯地繞著投予邵位，此外覆蓋棒型I c 顯示於I C之開口端爲I c A陽性細胞。此等細胞主爲Μ H C第 1類陽性及少數第1 1類與C D 4陽性。第8基有一些成纖維細胞圍繞I C，以任何淋巴球表面標記染色之細胞很少。 -49- 本紙ift尺度適闲中國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297:势) (請先閑讀背面之注意事3填寫本頁) 裝· 線 586934 A? B7 五、發明説明（ 47 此等結果指示在皮下投予羊内後，矽酮有很好耐受性，於投予後8週觀察到並無會限制其用途之不利之反應。試驗實例1 0 使用以類似於實例7與8中所述方式製備之基於膠原蛋白之I C，重複試驗實例9。I C之組合物示於下表4，所得結果於下表5。表4 供測足試驗實例1 〇中基於膠原蛋白之ICs之免疫增強作用 jt於抗細汽素冬之組成之含量經濟部中央標準局員工消费合作社印製

50- 本紙張尺度適用中國阄家標脊（CNS ) Λ4規輅（2丨〇'χ297公犮） (請先閱讀背面之注意事^^填寫本頁} 裝、-sa 線 586934 7 7 Λ Β 五、發明説明（48 ) *皮下途徑 * 1 00微克抗生物素蛋白（於P B S中）之第二期免疫作用表5 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製於試驗實例1 0中基於膠原蛋白之1C之免疫增強作用對於抗原及細胞素之量之依賴性（5 0 %中點效價）組別組成(微克）第一期免疫作用後第二期免疫作用後 IL-1 抗生物素蛋白 14d 28d 14d 28d 1 0 500 500 315 315 315 2 0 100 80 100 315 160 3 0 10 1000 630 630 630 4 2 500 2000 700 630 400 5 2 100 2000 795 630 250 6 2 10 1000 795 795 500 7 20 500 1580 795 795 795 8 20 100 2000 10000 1260 1000 9 20 10 1000 700 500 400 10 50 500 2000 1260 2000 1260 11 50 100 2500 2000 2000 1580 12 50 100 400 200 630 630 結果證實I L - 1 /?之包含於膠原蛋白I C中增進抗體對抗生物素蛋白之反應。 -51麵本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（210X297公# ) (讀先闊讀背面之注意事填寫本頁) 586934 A7 B7 五經濟部中央標準局員工消费合作社印裝發明説明（49 ) 無法令人滿意地確立I L - 1 之最佳劑量，然而當投予兩個最高劑量之I L -時，記錄了最高反應。將以膠原蛋白I C達到之結果與明礬及pb s比較（見表 6)。表6 供評估試驗實例〗〇中之基於膠原蛋白之組別組成（微多Λ IL-Ιβ 抗生物素蛋白 1 1C 0 500 2 1C 20 500 3 丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨...* - -— 於明礬中 0 500 4 於明礬中 20 500 5 於PBS中 0 500 6 1C 20 500 i.m. 7 於明礬中 20 500 i.m. m .:肌肉内投藥使用皮下途徑，除了另有指示及以1 〇〇微克抗生物素蛋白 (於P B S中）進行第一期投予。第二期免疫作用後2 8天，藉由皮内注射1微克抗生物素蛋白（於P B S中）至羊之内大腿無毛區，檢查到延遲型過敏性反應。注射後24與48小時，此部位檢查到水腫及紅斑。 -52- 、紙张尺度適用中國國家標攀（CNS ) Λ4坭枋（2丨〇X297公犮） 586934 五、發明説明（5Q ) 所得結果示於表7及8。表7 於試驗實例1 0中發現之羊中之抗-抗生物素蛋白抗體效價經濟部中央標率局負工消f合作社印製 (50%中點效價） _ 组別组成（微克）第一期免疫作用後 1二期免疫作用後 11^1/5 抗生物素蛋白 14d 28d 14d 28d 43d 53d 76d 1 0 500 200 126 126 100 100 100 80 1C 2 20 500 400 282 200 891 1631 251 80 1C 3 0 500 1000 1000 3163 251 251 158 126 於明礬中 4 20 500 5012 5012 8913 1778 1259 1000 80 於明礬中 5 0 500 159 50 159 159 159 159 794 於PBS中 6 20 500 2512 1000 631 251 251 158 126 IC, i.m. 7 20 500 5012 1995 1995 1259 794 794 126 於明礬中，i.m.- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) -裝· 、-口線 -53- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4規枱（210 X 297公兑） 586934 Λ7 B7 五、發明説明（51 ) 表8 經 iff 部中央標舉局 η X. 消費合社印製於試驗實例1 0中延遲型過敏性之計點組別組合物 # 24小時 48小時 E 0 E 0 1 500微克抗生物素蛋白膠原蛋白 1C G1 麵議麵 G2 麵齡一 G3 鐘麵 + _ G4 麵麵麵 G5 + _ 義麵 G6 謙 _ + 函 G7 + 一一 2 500微克抗生物素蛋白+20微克 IL^ly? 膠原蛋白 1C G8 顏麵麵 G9 麵 • 讎麵 G10 麵編嶋齡 G11 一 _ 麵麵 G12 瞻麵麵 G13 _ _ _ G14 麵細麵 + 3 500微克抗生物素蛋白於明礬中 G15 麵 _ G16 + 麵 _ 麵 G17 + 漏 + G18 ++ + ++ + G19 + + 麵 G20 + 麵 + + G21 +++ + ++ + -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210X2W公势） 586934 A7 H7 五、發明説明（52 經濟部中央標举局員工消费合作社印製組別組合物 # 24小時 48小時 E 0 E 0 4 500微克抗生物素蛋白+20微克 IL-1/3 於明礬中 G22 _ _ _ G23 + + G24 + 齡 + 麵 G25 + ++ 嶋議 G26 + 應 + 卿 G27 + 議 + 齡 G28 + - 5 500微克抗生物素蛋白於PBS中 G29 +++ + ++ G30 咖麵一麵 G31 + ㈣囊讓 G32 麵麵一雜 KJJJ + _ + G34 ++ + 麵 G35 讓麵麵麵 6 I.M 500微克抗生物素蛋白+20微克 IL-1/?膠原蛋白 1C G36 + 麵 + _ G37 讎麵晒 G38 + 晒讓麵 G39 麵麵鑛麵 G40 睡養瞒麵 G41 + + + _ G42 麵麵晒麵 I.M. G43 _ _ _ 一 G44 義麵麵請閱讀背面意事

-55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規輅（210X 297公笳） 586934 A 7 - —~__ Η 7 五、發明説明（53 ) ' ^a^*j 組合物 # 24小時 48小時 Ε 0 Ε 0 7 500微克抗生物素蛋白+20微克 IL·^ 於明礬中 G45 ------二 — 麵 G46 -------一...... + 麵 + - G47 ++ + + • G48 ++ + - G49 + - - E *紅斑〇 :水腫恥原蛋白ι c無引出任何強的延遲型過敏性反應。對於以液體組合物免疫之羊，記綠輕微〇1[11反應。於任何動物中無觀察到立刻之過敏性反應。試驗實例1 1 重複試驗實例9及1 0，評估單一注射免疫作用，使用特定於表9中之1C。所得結果示於表10及11。經濟部中央標準局員工消费合作社印^ 表9 供評估試驗實例1 1中以單一注射之免疫增強作用之組成之含量組別組成（微克） IL-1/S 抗生物素蛋白 1 明膠蛋白1C 0 500 2 明膠蛋白1C 50 100 ____：56- 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（21〇X 297公你） 586934 7 Λ 五、發明説明（54 ) 3 明膠蛋白1C 50 500 4 矽酮基質1C 0 500 5 矽酮基質1C 50 100 6 矽酮基質1C 50 ·: 500 7 於明礬中 0 500 8 於明礬中 50 100 9 於明礬中 50 500 10 於PBS中 0 500 11 矽酮覆蓋棒1C 0 500 12 矽酮覆蓋棒1C 50 500 *皮下途徑 (讀先閱讀背面之注意事項确填寫本頁) 表1 〇經濟部中央標隼局員工消費合作社印製於試驗實例1 1中發現之羊中之抗-抗生物素蛋白抗體效價 __( 5 0 %中點效價） __ 組別組成（微克）第一期免疫作用後第二期免疫作用後 IL-1 Avidin 14d 28d 42d 56d 69d 10d 〇〇 j CI 1 0 500 158 126 <50 <50 <50 <50 <50 CI 2 50 100 224 158 200 100 100 281 158 α 3 50 500 631 282 126 50 50 158 158 Μ 4 0 500 158 100 <50 <50 <50 <50 <50 Μ 5 50 100 1000 562 200 <50 <50 199 158 Μ 6 50 500 631 316 178 80 126 794 398 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（210X2W公及） 586934 A 7 B7 五、發明説明（ 55 A 7 0 500 891 501 251 158 158 794 630 A 8 50 100 1585 1259 562 251 251 1000 630 A 9 50 500 7943 2239 1000 398 398 1000 398 S 10 0 500 158 80 <50 <50 <50 158 <50 CR 11 0 500 251 126 <50 <50 <50 <50 <50 CR 12 50 500 7943 3162 1778 1259 1259 3162 1259 請先閲讀背面之注意事

C I :膠原蛋白I C Μ :基質I C A :含明礬之P B S溶液 S : PBS溶液 C R :覆蓋棒I C 表1 1 寫本頁經濟部中央標準局Μ工消f合作社印製試驗實例1 1中延遲型過敏性之計點組別組合物 # 24小時 48小時 E 0 E 0 1 500微克抗生物素蛋白膠原蛋白 1C Y1 麵晒麵 Y2 _ _ 讎㈣ Y3 隱麵酶麵 Y4 函麵麵 Y5 + _ + 讎 Y6 睡嶋 _ 睡 Y7 麵麵麵 Y3 麵讎顯 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公势) 586934 Λ7 B7 五、發明説明（56 ) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印t 組別组合物 # 24小時 48小時 E 0 E 0 2 100微克抗生物素蛋白+50微克 ILA/3 膠原蛋白 1C Y9 國麵麵 Y10 麵 _ _ _ Y11 麵 _ 讎 Y12 麵麵麵 _ ¥13 顯 _ _ _ Y14 +++ 麵 +++ 麵 3 500微克抗生物素蛋白+50微克 IL-1/3 膠原蛋白 1C Y15 _ 麵 _ Y16 一麵讓 ¥17 画鎌嶋麵 Y18 ++ ++ 細 Y19 編麵 _ 義 Y20 麵齡一 Y21 酿麵鑛麵 4 5⑽微克抗生物素蛋白矽酮基質1C Y22 麵 _ 画嶋 Y23 麵讎麵錄 Y24 麵謙麵麵 Y25 一麵麵 Y26 画 _ _ 麵 Y27 辑麵麵 Y28 一麵議麵 100微克抗生物素蛋白+50微克 Y29 嶋麵細 Y30 麵讓賺麵 Y31 義麵 _ _ -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210X 297公赴） 586934 五、發明説明（57 ) 經滴部中央標率局貝工消费合作社印製組別組合物 # 24小時 48小時 Ε 0 Ε 0 5 ΙΙΑβ 砍酮基質1C Υ32 睡麵賴 Υ33 一麵 _ _ Υ34 麵麵画一 Υ35 麵 - 麵賺 6 500微克抗生物素蛋白+50微克 IL-1/?矽酮基質1C Υ36 _ 漏 _ 謙 Υ37 細麵鑛 Υ38 讎麵麵細 Υ39 讎 _ 賴 Υ40 麵 Υ41 麵麵麵麵 Υ42 麵麵麵麵 7 500微克抗生物素蛋白於明礬中 Υ43 _ _ _ 麵 Υ44 細麵讓 Υ45 +++ ++ 一 +++ Υ46 + _ + _ Υ47 + + ++ + Υ48 + 讎麵賴 Υ49 + 一 + _ 8 100微克抗生物素蛋白+50微克 IL-1/5 Υ50 麵麵麵麵 Υ51 睡麵画麵 Υ52 麵麵画画 Υ53 ++ ++ +++ ++ Υ54 - 麵麵麵 (讀先閱讀背面之注意事項寫本頁) 議裝·

、1T 線 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ297公处） 586934 Λ7 B7 五、發明説明（58 經濟部中央標準局員工消費合作社印製組別組合物 # 24小時 48小時 E 0 E 0 於明礬中 Y55 ++ + ++ 麵 Y56 + + + + 9 500微克抗生物素蛋白+50微克 IL·!/? 於明礬中 Y57 +++ 議 ++ + Y58 麵議讎 Y59 麵 + 麵 Y60 + 麵 + 雌 Y61 鎌麵麵聽 Y62 ++ + ++ 麵 Y63 + 釀 + 一 10 500微克抗生物素蛋白於明礬中 ¥64 _ _ _ 讓 Y65 顯晒晒麵 Y66 臟 _ _ 麵 Y67 麵麵嶋 Y68 細睡議議 Y69 義麵麵麵 Y70 麵麵麵撕 11 500微克抗生物素蛋白珍酮覆蓋棒1C ¥71 + _ _ _ G63 瞧睡麵謙 G64 麵麵麵睡 G65 睡續變戀 G66 麵 _ _ _ G67 - - _ _ G68 麵麵歸麵 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4規枱（210X29·?公趁）請先閲讀背 \& 冬意事項會 ^^6934 Λ 7 _ B? 五、發明説明（59 ) 組合物 # 24小時 Γ—一 48小時 0 E 0 Ε 12 500微克抗生物素蛋白+50微克 IL-1/? 珍酮覆蓋棒1C G69 - 麵 G70 • - G71 + • - G72 + - - G73 .+ + G74 - + - (請先閲讀背面之注意事項再本頁) .裝· 膠原蛋白及矽酮I C無引出任何強的延遲型過敏性反應。對於以液體組合物免疫之羊記錄輕微之DTH反應。於任何動物無觀察到立刻之過敏性反應。覆蓋棒矽酮I C爲供單一劑量免疫作用用之最有效調配物’引發最高效價及最持久之反應。覆蓋棒IC供免疫作用之有效途徑依賴於IL - 1 之包含。覆蓋棒I c非固有地誘發延遲型過敏性反應。於接受併入I L - 1 /3之ICs之動物中謗發有效之記憶反應。此於第一期免疫作用之效價已下降後，於第6 9天予以第二期免疫作用後由反應指示。對此等血清樣品亦做同型之分析。結果指示於所有組中，於整個實驗過程中，存在高含量之18〇，而只於第i 4 天之時點，I g Μ可以低含量檢出。此指示於只單一投予抗原後，已有效地發生同型轉變。試驗實例1 2 __ ----—. _ - 62 -

本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公XT 訂線經濟部中央標準局負工消f合作社印製 586934 五、發明説明（6Q ) 使用可防止疾病感染之一組抗原代替模式抗生物素蛋白抗原，如特定於表1 2中者，重複試驗實例1 1。表12 供評估試驗實例1 2中以梭菌抗原之免疫增強作用之组成含量組別調配物 1 破傷風類毒素+50微克IL-ly5(於膠原蛋白1C中）. 2 破傷風類毒素+50微克IL-1卢(於覆蓋棒矽酮1C中） 3 破傷風類毒素+50微克IL-1 /5 (於明礬中） 4 破傷風類毒素(於明礬中） 5 諾維氏(Novyi)類毒素+50微克IL-1/?(於膠原蛋白1C中） 6 諾維氏(Novyi)類毒素+50微克IL-1々(於覆蓋棒矽酮1C中） 7 諾維氏(Novyi)類毒素+5〇微克IL-1 /5 (於明礬中） 8 諾維氏(Novyi)類毒素(於明礬中）經濟部中央標準局員工消f合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公笳） 586934 Λ7 B7 五、發明説明（61 表13 於試驗實例1 2中發現之羊中抗-梭菌抗原抗體效價 (5 0 %中點效價）組別第一期免疫作用後第二期免疫作用後 14d 28d 14d 27d 50d 562 251 1000 794 501 讀 £ 閱讀背冬意事項 1995 1000 7080 2511 1580 1584 891 2512 1259 631 寫本頁 4 891 631 1259 794 398 891 501 5623 1412 891 2512 1585 15849 5012 3163 891 282 2512 1259 891 1259 501 1412 631 355 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印製所得結果示於表1 3。覆蓋棒I C對於所測試之兩種抗原，明顯地優於習用之明礬疫苗及明礬/ I L - 1厶混合。膠原蛋白I C謗發之效價與明礬調配物並無顯著不同，然而於後面之時點，覆蓋棒IC與 C，諾維氏類毒素誘發比明礬調配物高2倍以上之效價。試驗實例13 使用基於矽酮之I C進行劑量反應分析。各I C之組成之結構示於下表1 4。基於隔週地做抗體效價，所得結果示於表 15。 -64 - 本紙張尺度適用中國國家標攀（〇奶）八4規輅（210';< 297公处） 586934 五、發明説明（62 ) 表14 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製供測定試驗實例1 3中基於矽酮之I C之免疫增強作用 .對抗原及細胞素之量之依賴性用之组成之含量組別組成（微克） IL-1 抗生物素蛋白 1 覆蓋棒 0 100 2 覆蓋棒 0 10 j 覆蓋棒 0 5 4 基質 0 5 5 覆蓋棒 50 100 6 覆蓋棒 50 10 7 覆蓋棒 25 5 8 基質 50 100 9 基質 50 10 10 基質 25 5 11 於PBS中 0 100 12 於PBS中 0 10 13 於PBS中 0 5 14 於PBS中 50 100 15 於PBS中 50 10 16 於PBS中 25 5 17 於明礬中 0 100 18 於明礬中 0 10 19 於明礬中 0 5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 -裝·

、1T 線 -65鐘本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210X2W公势） 586934 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（63 ) 表1 5 於試驗實例1 3中基於矽酮之ICs之免疫增強作用對抗原及細胞素之量之依賴性（5 0 %中點效價） _ 類型组別组成（微克）第一期免疫作用後 IL-1/5 抗生物素蛋白 14d 28d 42d 56d 70d CR 1 0 100 398 501 251 158 158 CR 2 0 10 <50 631 501 <50 <50 CR 3 0 5 126 1259 1778 <50 <50 Μ 4 0 5 794 1259 251 126 120 CR 5 50 100 3981 5623 2512 1995 1995 CR 6 50 10 3981 3981 794 1259 1259 CR 7 25 5 5012 5012 1778 794 794 Μ 8 50 100 501 794 196 158 158 Μ 9 50 10 251 501 316 158 158 Μ 10 25 5 158 316 316 126 80 S . 11 0 100 126 158 80 <50 <50 S 12 0 10 <50 126 <50 <50 <50 S 13 0 5 <50 251 <50 <50 50 S 14 50 100 398 196 251 126 126 S 15 50 10 196 251 196 <50 <50 S 16 25 5 58 251 <50 <50 <50 A 17 0 100 1995 1995 631 631 251 A 18 0 10 1259 1995 631 631 251 A 19 0 5 1000 631 316 316 251 (請先閱讀背面之注意事項再蛾寫本頁 .裝-

、1T 線本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（210X29?公赴） 586934 A7 ――_B7 _____ 五、發明説明（64 ) 一一 ~

C I :膠原蛋白1 C Μ :基質1C A :含明礬之P B S溶液 S : PBS溶液 C R :覆蓋棒I C 此等結果證明回應於覆蓋棒1C，發生高效價及持久之抗體。最持久之反應於最高劑量之IL - 1冷與抗原存在下引出。於第7 0天之時點，併入IL - 1 之覆蓋棒矽酮ics明顯地優於抗生物素蛋白之液體調配物（約5倍之效價）。膠原蛋白與矽酮IC可有效地作爲疫苗媒劑：保留抗原之免疫原性及保留細胞素佐劑之生物活性。膠原蛋白及矽酮基質I C顯示固有的佐劑活性。當將I L - 1 /5以適當含量併入I c時，抗體反應超過以明礬佐劑誘發之反應。併入I L - 1 /3作爲佐劑之覆蓋棒矽酮][c，謗發比任何其他測試之組合物（液體或I C )顯著較高之抗體反應。此外，抗體反應比其他組合物持續更久之期間。經濟部中央標攀局員工消费合作社印裝我觀¥到不利之系統性或組織學反應來排除使用IC s作爲安全之疫苗媒劑。最後，要了解的是，可做各種其他之修飾及/或改變，無偏離概要於本文之本發明之主旨。 __'67- 本紙張尺度適用中國國家標準（匚从$)六4規#(210/ 297公犮）

Claims

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第〇871〇7484號專利申請案發中文申請專利範圍替換本(93年2月）ci _________D8 六、申請專利範圍 1. 一種免疫增強組合物，其包括抗原或謗發抗原之物質，及包含膠原蛋白或聚二甲矽氧烷之載劑。 2. 根據申請專利範圍第1項之免疫增強組合物，其另包含至少1種醫藥添加物。 3·根據申請專利範圍第項之免疫增強組合物，其中抗. 原或謗發抗原之物質能謗發對包括病毒、抗原體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞之一員具特異性之免疫反應。 4·根據申請專利範圍第3項之免疫增強組合物，其中該抗原或謗發抗原之物質為藉使用化學技術學、重組體dna技術學、細胞培養技術學或發酵技術學所得之物質。 5·根據申請專利範圍第3項之免疫增強組合物，其中該抗原係自包，病毒、抗原體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞之一員藉由減毒、去毒作用或使無病原性而衍生。 6·根據申請專利範圍第3項之免疫增強組合物，其中該抗原或誘發抗原物質為得自包括病毒、黴漿體、細菌生蟲、毒素及腫瘤細胞之一員之物質。 7·根據申請專利範園第3項之免疫增強組合物，其中該謗發抗原物質為質體或病毒，具有編碼能謗發對包括病毒、黴漿體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞之一員具特異性之免疫反應之抗原之核酸（基因序列），當併入其中時’致使可以活體内產生該抗原。 8.根據申請專利範圍第丨或2項之免疫增強組合物，其中該組合物為溶液、懸浮液、凝膠、薄膜、海綿、棒或小本紙張尺度適財_家標準(CNS) A视格(210 X 297公釐) 586934 A8 B8

粒。 9· 一種免疫增強組合物，其包含抗原或謗發抗原物質，具免疫活性、免疫刺激或免疫調節活性之物質，及包含膠原蛋白或聚二甲矽氧烷之載劑。说根據申請專利範圍第9項之免疫增強組合物，其中該具免疫活化、免疫刺激或免疫調節活性之物質為細胞素。根據申請專利範圍第9或i 〇項之免疫增強組合物，其另包含至少一種醫藥添加物。根據申请專利範圍第9或丨〇項之免疫增強組合物，其中該抗原或謗發抗原物質為能謗發對包括病毒、黴漿體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞之一員具特異性免疫反應之物質。根據申請專利範圍第丨2項之免疫增強組合物，其中該抗原或謗發抗原物質為藉使用化學技術學、重組體〇!^八技術學、細胞培養技術學或發酵技術學而得之物質。 K根據申請專利範圍第丨2項之免疫增強組合物，其中該抗原係自包括病毒、黴漿體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞藉由減毒、去毒化作用或使無病原性而衍生。 15·根據申請專利範圍第丨2項之免疫增強組合物，其中該抗原或謗發抗原物質係得自包括病毒、黴漿體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞之一員之物質。 16.根據申請專利範圍第12項之免疫增強組合物，其中該謗發柷原物質為質體或病毒，具有編碼能謗發對包括病毒、黴漿體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞之_員具

586934 A8 B8 C8 D8

六、申請專利範園特異性之免疫性反應之抗原之核酸（基因序列），當併入其中時，致使可以活體内產生該抗原。田 17. 根據申請專利範圍第U項之免疫增強組合物，其中該抗原或誘發抗原物質為能謗發對包括病毒、黴滎體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞之一員具特異性免疫反應之物質。 ' 18. 根據申請專利範圍第1 7項之免疫增強組合物，其中該抗原或謗發抗原物質為藉使用化學技術學、重組體〇1^ A ^ 術學、細胞培養技術學或發酵技術學而得之物質。 19·根據申請專利範面第1 7項之免疫增強組合物，其中該抗原係自包括病毒、黴漿體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞藉由減毒、去毒化作用或使無病原性而衍生。 20·根據申請專利範圍第1 7項之免疫增強組合物，其中該才上原或誘發抗原物質係得自包括病毒、黴漿體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞之一員之物質。 21.根據申請專利範圍第1 7項之免疫增強組合物，其中該謗發抗原物質為質體或病毒，具有編碼能謗發對包括病毒、黴漿體、細菌、寄生蟲、毒素及腫瘤細胞之—員具特異性之免疫性反應之抗原之核酸（基因序列），當併入其中時，致使可以活體内產生該抗原。 22·根據申請專利範圍第9或1 〇項之免疫增強組合物，其中該組合物為溶液、懸浮液、凝膠、薄膜、海綿、棒或小粒。 23·根據申請專利範圍第1 1項之免疫增強組合物，其中該素且

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 586934

合物為溶液、懸浮液、凝膠、薄膜、海綿、棒或小粒。 24·根據申請專利範圍第1岑2 :¾由仅 , 、、岡矛i及2項中任一項之免疫增強組合物，其中該抗原為超抗原^ 25.根據申請專利範圍第…項之免疫增強組合物，其中該謗發抗原物質為質體或病毒，具編碼該超抗原之核酸（基因序歹j )胃併人其中時，致使可以活體内產生該超抗原。 2“艮據申請專利範圍第9或1〇項之免疫增強組合物，其中該抗原為超抗原。 27·根據申請專利範圍第9或1〇項之免疫增強組合物，其中該謗發抗原物質為質體或病毒，具有編碼該超抗原之核酸（基因序列），當併入其中時，致使可以活體内產生該超抗原。 28. 根據申請專利範圍第u項之免疫增強組合物，其中該抗原為超抗原。 29. 根據申請專利範圍第η項之免疫增強組合物，其中該謗發抗原物質為質體或病毒，具有編碼該超抗原之核酸（基因序列），當併入其中時，致使可以活體。 30. 根據申請專利範圍第！或9項之免疫增強組合物，其中該組合物為棒狀。 ' 31·根據申請專利範圍第30項之免疫增強組合物，其中該組合物為塗膜或覆蓋棒狀。 ~ 32.根據申請專利範圍第3丨項之免疫增強組合物，其中該生物可相容物質為聚二甲矽氧烷。 -4-

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33.根據申請專利範圍第3 〇項之免疫增強組合物，其使用時，顯現改良之釋放侧圖。 34_根據申請專利範圍第3 3項之免疫增強組合物，其使用時顯現持續釋放之侧圖。 35_根據申請專利範圍第9項之免疫增強組合物，其中該具免. 疫活化、免疫刺激或免疫調節活性之物質為佐劑選自包括細胞素、化學激素、生長因子、佐劑肽及DNΑ序列、明礬、弗羅因德氏完全佐劑、弗羅因德氏不完全佐劑、伊斯康（iscom)、4甞、十六胺、溴化二甲基二（十八基）銨、阿布利啶（Abridin)、細胞壁骨架組份、霍亂毒素、脂多糖内毒素及脂質體。 36·根據申請專利範圍第1 〇項之免疫增強組合物，其中該細胞素包含於無溶媒存在之組合物。 37· —種製造抗體之方法，其包括投予申請專利範圍第1至 3 6項中任一項之免疫增強組合物於人類，人類以外之哺乳類或鳥類，因此於該哺乳類或鳥類中調節免疫反應，再回收產生之抗體。