TW577984B

TW577984B - Use of receptors of the Rev-erb family to screen substances which are useful in the treatment of lipid metabolism dysfunctions associated with apolipoprotein C-III

Info

Publication number: TW577984B
Application number: TW088110571A
Authority: TW
Inventors: Eric Raspe; Yves Bonhomme
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2004-03-01
Also published as: ATE354087T1; ES2283118T3; US7691628B1; EP1090292A1; NZ507935A; EP1090292B1; WO1999067637A1; AU4515599A; FR2780512B1; JP2003524755A; CA2336009A1; CA2336009C; FR2780512A1

Description

577984 五、發明說明（1) 本發明係關於Rev-erb家族受體作為筛特別是衍脂蛋白C—ΠΙ相關脂代謝失常物質之^治療與明更特別係關於選擇有用於治療該等失常之物本發法。最後，本發明係關於利用藉此所鑑別出之物=== 備有用於治療與衍脂蛋白C-11 I相關脂代謝失常（兴:^ ‘ 諸如動脈粥狀硬化）之醫藥組合物。本發明之目的+亦在利用Rev-erb受體及/或其反應元件，以及其對作用的筛選·試驗來定性，評審以及宣告彼等具有抗動脈1 狀硬化性質物質之作用機制。衍脂蛋白c-III (此後文中稱為apo c—Η n係由肝臟以及少部分由腸道所合成具有79個胺基酸之一種醣蛋白。其在血衆三甘油S旨之代謝扮演主要的角色。事實上自裝中a p 〇 C - I I I的濃度，不論是正常人或是與高三甘油酯血症病人之族群中，都與血漿中三甘油酯的濃度成正比（1—4)。甚者，與其他類型之脂蛋白相比該ap〇 c- I I I之相對分布顯得極大：在含有apo B(apo C-III-LpB)的顆粒中如果ap〇 C - I I I之濃度增加則罹患心臟或冠狀疾病之風險增加（5 )。已有數條證據指出a p 〇 C - I I I與血漿三甘油§旨之分解代謝有關連。缺乏apo C-III在體内反應為非常低密度顆粒（VLDL)之， h解代δ射增加，而在高三甘油g旨血症的病人則為& p 〇 C-III之合成增加（6，7)。甚者，遺傳研究指出特定apo C-I I I基因的多樣性與血漿中高濃度之三甘油酯以及apo C-III有關連（8， 9)。

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最後，在轉基因動物中過度表現人ap〇 C - I I i的、纟士果為出現高三甘油酯血症，而在小白鼠身上利用同源重組 ' (homologous r e comb i na t i on)另等其内因 j生之 ap〇 c - Πι 因排除則導致血漿中apo C- I I I濃度降低並且保護動物基於發生餐後高三甘油S旨血症（1 〇， 1 1 )。經由體内及體外之研究結果顯示該apo C-I Π主要是正緩富含三甘油脂顆粒之分解代謝，其作用機制為經由抑其與内皮細胞之表面結合以及接下來以脂酶脂蛋白質』^ 分解，或是經由干擾殘渣顆粒（殘餘remnants)之廊清作用係經由apo E受體進行（12-1 6)。〃最後’ a ρ 〇 C - I I I在脂蛋白代謝之重要性可以經由將低祖度顆粒（L D L )受體基因以同源重組方式移除之小白鼠鱼過度表高三甘油酯血症現人apo C-I I I基因之小白鼠交^ 後在其後代中觀察得到併發家族性高三甘油酯灰症之數個特徵（大量VLDL及LDL伴隨著早期之心臟及冠狀疾病）而看出端倪（1 7 )。該Rev-erb核受體形成一種由至少三個不同基因 (Rev-erb a ( ear 1)，Rev - erb/3(BD73，ear4, RVR)及 HZF-2(Rev-erb 7 ) (18-25))所編碼之孤兒核受體（orphan nuclear r ec ep t or s )亞家族，其天然配位子（na t ur a 1 ligands)目前仍然未知。編碼為Rev-erba核受體之mRNA 在許多組織（特別是肌肉，棕色脂肪組織及腦）中表現 (26)。在脂肪細胞（26)及肌細胞（53)分化以及肝臟在經由纖維慢性處理（59)後會誘發Rev-erb α基因的表現。其表

第6頁 577984 五、發明說明（3) 現似乎遵循一天的律動進行（55)。另兩個基因，Rev — erb 万及Rev-erb r則特定於腦中表現（22，25)。Rev一erb召及 Rev-erb r可以單體的形式與一個含有PuGGTCA半部位之反應tl件結合’在該半部位之前則接著一段富含Α/τ的5個鹼基對區域（A/丁-A-A/T-N-T-A/G-G-G-T-C-A)(28， 21)。在體外試驗中亦W有報告Rev 一 erb α雙體形成（dimeric)與一個以兩個驗基對分開之兩段直接重複之AGGTCA半部位結合’該直接重複之AGGTCA半部位前端亦接著一段富含a/τ 區域（29)。已有報告描述由Rev-erba2DNA結合部位與兩段直接重複之AGGTCA半部位所形成複合物之結晶結構 (54)。與先前曾描述過之報告相反者為該亞家族核之受體似乎壓制轉錄進行（29，20)。數種Rev-erb α 之生理標靶目前已被鏗識：致癌基因N-myc(3〇)，大白鼠 apo A-I 基因（27)，人 hRev-erb α 核受體自身（3 1 )及my〇D 及肌生素（myogenin)之轉錄因子（53)。本發明人之研究顯示該等Rev —erb受體為ap〇 c_III基因之負面调控子。因此該等受體可以用來壓制與發展出高三甘油酯血症及高血脂症有關之a p 〇 C - I I I基因之表現。本發明因此係關於利用Rev-erb受體及/或該等受體之一種反應元件或其功能性相當物來篩選可用於治療脂肪代謝失常之物質。此外，本發明亦關於利用Rev —erb受體及/或其反應兀件來定性，評審以及宣告彼等具有抗動脈粥狀硬化性吳物夤之作用機制的篩選方法，以及其對a p 〇 c 一 111 之作用。 ^

第7頁 577984 五、發明說明（4) 為本發明之目的，術語n Rev-erb受體"係指所有Rev-erb 家族之α，yS及r異構型。所述之n Rev-erb之功能性相當物”係指任何具有下述二 ' 條件之蛋白質： ★ 一其配位子結合部位之選擇性與彼等Rev_erb及其配位子之關係相當者，及 · 一可以辨識如同Rev-erb之相同反應元件或是具有相同核，酸序列之反應元件之一個D N A結合部位。所述之’’ Rev-erb之功能性相當物”亦指任何具有不述二條件之嵌合蛋白質： _ -其配位子結合部位之選擇性與彼等Rev — erb及其配位子之關係相當者，及 - -可以辨識一種受體基因反應元件之一個j) N a結合部位，或是一段可以用來方便的純化該種嵌合體以及其可專一地結合至特定介質之蛋白質區域，舉例來說，例如麥芽糖結合蛋白質（MBP)或穀胱甘肽-S-移轉酶（GST)。最後這型嵌合體最常被使用（5 3 )。該等嵌合體之優點為可以經由親和性官柱一布純化該蛋白質，或是藉由彼等精於此技人士所熟悉之簡單步驟（偶合至小珠或是樹脂上，再以麥芽糖或被胱甘狀等等溶離）專一地將該等蛋白質分離。所述之n Rev-erb受體反應元件之功能性相當物”係指 Rev-e^b受體可以與其結合之任何核酸序列以及，更特言之’係一段衍自r e v - e r b受體反應元件之序列。在執行本發明k，更特別佳者為受體， 577984 五、發明說明（5) hRev-erb α訊息RNA及hRev-erb α受體反應元件。因此在本發明之一個目的為篩選用來治療脂肪代謝失^ 物質之第一型方法，該方法包含將測試物質與_種常

Rev-erb家族之受體及/或一個Rev-erb受體反廡开处 ^ 什，及/ 或一種可以功能性的將R e v - e r b偶合至R N A聚合酶複人物核因子，或是其功能相當物接觸，然後再以任何適者之法測量：每纥方 -該物質Rev-erb受體及/或其功能相當物之結合，或由該物質與Rev-erb受體所形成之複合物與其反應元件及/ 可以功能性的將Rev —erb偶合至RNA聚合酶複合物之核因^ 之結合， Λ 卞及/或一將一段基因置於一個包含有該反應元件之啟動子控制下之调控轉錄活性。制 + ϋ ΐ ί物質與以^erb受體及/或其功能相當物之社人， =亥物質與…體所形成之複合物反之岸Y件 Φ 核因子之結合可以的 =rerb偶合至RNA聚合酶複合物之間接方法進行此技人士所熟悉之直接或法。 =利用一種叉體基因，結合試驗等等方相同的，測量將一段基 ― 啟動子控制下之1 k絲直於1U乙3有該反應兀件之所熟悉之直接或。方；=可以籍由任何精於此技人士為了月不该測試物f在治療脂肪代謝失常之用途，本發

第9頁 577984 五、發明說明（6) 明之方法包含一個額物質對apo C-ΙΙ ί表if的步驟Λ任何適當之方法來測量該現之效果以藉由任何之效果。測量該物質對聊C-IU表法進行，諸如一種=於此技人士所熟悉之直接或間接方内或體外之模式中测^ 或體外之一種mRNA分析及在體根據本發明篩選方 (a)將一種宿主細去之第種實例包含下列步驟：當物之DNA斷片轉感^以一段編螞為Rev_erb受體其功能相

Cl)件將及步至驟U)之宿主以一種包含有該1^"1^受體之反應70件及至少一插如l a β ^ (C)在該測試物質存° *^之建構物共轉感染，基因之表現。、子在下以任何適當之方法測量報告物子之反應元件可以包含例如該ap0 C-111啟動 ::量核受體對於包含其反應元件序列活告者基因均可以用於根據本發明之篩選方法。在其中可以提及者有例如氣黴素乙醯移轉酶（CAT)基因，源自發光醇 (lUC1〇le，LUC)或瑞尼拉（ReniUa，Ren)之發光酶基因，分泌之鹼性磷酸酶（SAP)基因或半乳糖苷酶（万^^^基因。由該等基因所編碼之蛋白質活性可以經由習用之方^ 測定，藉此可以經由測量所產生蛋白質之量或其酵素活性而知悉核受體對於基因表現的效果。由本發明人所報告之R e v - e r b受體（以及更特別之 hRev-erba受體）對於apo C —Π][基因之作用，當然使其在

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彳1J 用 apo C — IIIlui 於二 + 口作為本發明構築物之報告者基因以3 利用它們之篩選方法變成可能。 u以及在^七日月之啼選方法+，該術語"宿主"係指任，只f::用於表現前述基因者，特別是例如哺乳動Ξ: 體須適用於被感染之細胞類型；可提及體病毋或是人工染色體。貝根據本發明之第-型篩選方法之另-個實例包括下列步驟： a) 產生一個包含數個可被1^¥_^1：)辨識之反應元件複之質體，該等元件舉例來說有諸如一Rev—erb α啟動子之 RevDR2部位（31)，由Μ·拉札（Μ· Lazar)所放述之一致部位· ^consensus site)(28，29)，或在ap〇 c—ΙΠ 啟動子所鑑定出之Rev-erb反應元件。該等反應元件之複本係選殖在一種異源強啟動子諸如單一療病毒胸腺咬咬激酶啟動子，或是同源強啟動子諸如ap〇 C-I I I啟動子之上游。該啟動子本身即可控制報告者基因之表現諸如發光酶， CAT，鹼性磷酸酶或厶-半乳糖苷酶。 b) 將由步驟（a )所產生之建構物轉感染入可以天然或是人工表現Rev-erb的細胞内’意集，經過瞬間共轉威染一種表現載體或是創造一個表現R e v - e r b之安定細胞系，及 c )將步驟（b)所得之宿主在測試物質存在下培育， - d)以任何適當之方法測量受體基因之活性。、

RevDR2部位係Rev-erb反應元件，在其上受體會與其結

第11頁 577984 五、發明說明（8) =成一個雙體（dimer)調控置於其下游之基因之轉錄活性笛該等部位可以用來感知一種Rev_erbi異源啟動子。苐一種方法之另一個實例包括下列步驟· 2產生一個包含數個可被Rev_erb辨識之反應元之質體，將其選瘦在-種強啟動子之上游，而該啟動子可 :控制表現一種自殺形選擇基因，舉例來說，W如一種毒性原樂之致活劑諸如疹病毒胸腺嘧啶激酶（48 )， b)將由步驟（a)所產生之建構物轉感染入一種宿主細胞，、轉c感)^步驟（b)所得之宿主利用一種表現Rev_erb之載體共 d)將步驟（c)所得之宿主在測試物質存在下培育，胞')以任何適當之方法測量在毒性原藥存在下之存活細二ί I t原樂可以為例如甘希克羅弗（ganciclovir)。法之另一個實例包括下列步驟：元件複本之質：1:;::母菌核因子Gal4辨識之反應強啟動子語4、一 4反應元件之複本選殖在一種異源啟動子本身g° 一疹病毒胸腺嘧啶激酶啟動子之上游，該二驗Λ控制報告者基.因之表現諸如發光酶， b)產生/酸酶或万—半乳糖苷酶，生長荷爾蒙等等，順區域之—Λ包體含 =al 4ΓΝΑ結合區域（49)及Rev—erb之結合之區域人，D體貝體，區域為配位子會與Rev — erb 577984 五、發明說明（9) c)將步驟（a)及（b)所得之質體共轉感染至一個宿主細胞，且 d )將步驟（c )所得之宿主在測試物質存在下培育， e )以任何適當之方法測量報告者基因之活性。核受體這個家族不同成員間之DEF區域都不相同。其中包含參與反式活化轉錄以及配位子與共因子結合之序列。 Rev-erb之DEF區域與含有頭147個胺基酸之Ga14斷 >;合併後形成一種Gal4-Rev-erbDEF嵌合體再結合至Gai4之靡、元件並且其轉錄活性端視R e v - e r b配位子及/或共因子而定 (29)。 ’、 ^ 該種鼓合體之基礎活性可以藉由嵌入一段編碼為蛋白質 VP16全部或部份之DNA斷片而增加（50)。第一型之篩選方法亦可以下列方式進行一 a)產生一個包含數個可被酵母菌核因子以14辨識之反應兀件複本之質體，將該等反應元件之複本選殖在一種控制自殺式筛選基因（解釋如前）啟動子之上游， b) 產生一個包含有Gal4iDNA結合區域（49)及Rev —erb之 DEF區域之嵌合體質體， c) 將步驟（a)及（b)所得之質體共轉感染至一個宿主細胞，且 d )將步驟（c )所得之宿主在測試物質存在下培育， =)以任何適當之方法測量毒性原藥存在下細胞之存活。垓種第一型篩選方法之其他實例包括定量地評估測試化。物在酵母菌或其他細胞型，，雙雜交d〇uble hybr id，，系統

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之效果’該雙雜交系統包含Rev一 erb斷片可與共因子及該等共因子之相關斷片（例如R J p i 3 a， R J p J 3d J (5 J )， N-C0R(52)或選擇性地smrt及P3 0 0/CBP)作用，再將

Rev-erb偶合至轉錄機制内，特別是偶合至RNA聚合酶複合物。〇

根據本發明第一種篩選方法之另一個實例包括利用前人文獻中所已知之技術（例如發展用來ppAR配位子篩選之 CARLA方案（45)，該方案係量測能量移轉之共振螢光）定量評估測試化合物在體外對於整體hRev_erb α蛋白質或其部伤斷片與共因子或其部份斷片交互作用能力之影響。根據本發明第一種筛選方法之最後一個實例包^將前述之細胞以一個具有編碼為Rev_erb受體或其相當物及/或一個Rererb受體反應元件之建構物轉形，然後再將該宿主細胞或其萃取物用在以冷配位子及經標記配位子之間競爭取代為基礎之π結合”試驗。本發明之目的亦為篩選可用來治療脂脂代謝失常物質之第二型方法，該方法在於測定受測試物質對於調控、 Rev-erb表現之效果。根據以測定對於調控Rev —erb表現為基礎之篩選方法之實例包括利用就地雜交（in situ hybFidizati()n

Amersham技術），RPA，定量或半定量RT_pCR，點墨潰或北方墨潰法直接評估化合物對於細胞累積編碼為Rev_erb之 niRNA之影響。測定調控R e v - e r b表現之第二種實例在於利用免疫細胞

577984 五、發明說明（11) 化學，EL I S A或西方墨潰法測定受測試物質對細胞表現 Rev-erb蛋白質之效果。該第二型筛選方法的另一個實例在於間接評估Rev_erb 基因啟動子之活性。該方法包括下列步驟： a) 產生一個質體’其中包含該Rev — erb基因啟動子（31) 選殖在一種報告者基因諸如發光酶，CAT，鹼性磷酸酶，生長荷爾蒙等基因，或一種篩選基因諸如對抗生素有抗性或對非可代謝前驅物轉化酶有抗性基因之上游， b) 轉感染宿主細胞， c )加入受測試物質， d)以任何適當方式測量報告者基因之活性或細胞存活率〇該Rev-erb啟動子控制Rev-erb基因之表現特別是其中含有自我抑制基因轉錄之Rev —erb反應元件者。包含該啟子斷片之建構物可以用以找出參與調控表現該‘因之因測里旧控R e v e r b表現方法之另一個實例在於測量 Reverb基因内因性啟動子之活性。該方法包括下列步二產t 一個質體，其中包含數個可以被“"叶辨識之· 反應7C件之稷本，該等複本係選殖在控制自殺性諸如原藥致活劑（如病痔病主睑睑、基因因之上游，犯厣病毋胸腺嘧啶激酶），或報告者基 577984 五、發明說明（12) 胞系，及 d )將步驟（b )及（c )之宿主細胞在測試物質存在下培育， e)以任何適當之方法測量細胞在毒性原藥存在下^二率或是報告者基因之活性。 ’：' 一個本發明之目的為根據本發明篩選方法所篩選之物質’以及利用纟亥荨物貝乂被一種組合物（特別是醫藥組人物），該組合物可以壓制apo C- I I I之表現因此欲用之以、八療在人或動物之脂肪代謝失常。具有該種特性之化合物3 根據其可以壓制apo C-I I I之表現，可以為Rev — erb ^ ^ R e v - e r b類似物之配位子而筛選出，該特性可以直接由& C - III之表現量。或經由表現受體基因，或是另外由其與Rev-erb受體形成複合物之能力而例示。因此本發明一般言之係關於利用一種可以調护:a p 〇 C - I I I表現之物質用來製備一種組合物（特別是醫藥組人物）’該組合物可以用來治療及/或預防在人或動物盥: 蛋白C- I I I有關之脂肪代謝失常。 /、曰更特言之，本發明係關於利用可與Rev —erb受體或反靡元件結合之物質用來製備一種可以用於治療及/或預防在人或動物之脂肪代謝失常。本發明亦關利用可調控編碼為R e v - e r b受體之基因表現之物質用來製備一種組合物（特別是醫藥組合物^該組 <合物可以用於治療及/或預防在人或動物與衍脂蛋白c__丨丨1 ^關之脂肪代謝失常。與人或動物衍生脂蛋白C- I I I有關之脂肪代謝失常中可

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二，ΐ ί:t ϋ ’與糖尿病有關之併發症，肥胖，x癥、t對胰島素有耐党性及心臟與冠狀疾病。方ΪΓ1之一個目的亦在於利用本發明申請案前述之筛選方1糟由Rev-erb受體及/或其反應元件，以及其對_ 硬化性質物質之作用機制審。以及旦告彼專具有抗動脈粥狀 ί ^明之其他優點與特性將可由下述描述藉由hRev-erb α又凋控人ap〇 C — π I表現之實例予以闡明。 I.方法 1 · jg_j^ 培卷細，系HepG2(人類肝細胞）係得自E· c· Α· c· c(伯通菪，❿ 撒力心伯 ^(Port〇n Down, Sal i sbury)， UK)，而 RK13 則- 拉格思（Lagros)所提供（史帖亥林（Stehelin)教授實驗室）。該等細胞系培養於標準條件（杜貝可改質之伊戈氏— 最低必扃"夤，補充1 〇 %胎牛血清，在一個5 % [ 〇2 / 9 5 %空氣之潮濕大氣下培養於3 7艺）。培養介質每兩天更換一次。 2. 1組質體之津爐 apo C- 111基因所用啟動子之活性係根據此技界之標準技術利用報告者基因來研究。先前曾經有報告（5 6)建構物

-1415/+24WT-CAT 及198/+24WT-CAT 含有人apo C-ΙΙΙ 基因《I 所用啟動子之斷片並且選殖在CAT報告者基因之上游。為了置換該等建構物之CAT報告者基因成Luc+報告者基因，將報告者載體pGL3(Promega)之發光酶報告者基因Luc+以 Sac I及BamH I酶切下再選殖入載體pBKCMV(Stratagenes)

第17頁 577984 五、發明說明（14) 之相關位置而形成載體pBKCMV-Luc+。建構物 -1415/+2 41丁-0人1[之0八了啟動子基因以酶1^111及88111111切下。然後取代以將質體pBKCMV-Luc+以酶Bg 1 I I及Κρη I消化所得之1^11〇+報告者基因而產生質體-1415/ + 24界丁-111(：+。此質體經酶P s t I消化再自我黏接後而形成建構物 - 1 98/ + 24WT-Luc+。將質體-1415/ + 24WT-Luc+經酶Hind I I I消化切下apo C-I I I啟動子。然後將所得之DΝΑ斷片嵌入質體pGL3(Promega)及pSL301(Pharmacia)之Hind III部位而得建構物-1415/ + 24WT pGL3 及-1415/ + 24WT pSL301。將嵌入物之方向經由定序方式定出。將建構物 -141 5/+24WT pGL3以酶Pst I消化再黏接後而形成建構物 -1 98/ + 24WT pGL3。將建構物-1415/ + 24WT pSL301 以酶

EcoOl 0 91部分消化再自我黏接後而形成建構物—1〇8/ + 24WT pSL301。將-108/ + 24之apo C-III啟動子斷片由此建構物以酶Xma I及Hind I I I切下後選殖入pGL3之相關部位而得建構物-1 08/+24WT pGL3。接著以-1415/ + 24WT pGL3 為介質11(：111?33及512為引子利用？〇1?將人之-1〇8/ + 2 4 30〇 C-I I I啟動子斷片放大。所得之產物酶3&(： I及Hind ][丨丨切下後選殖入質體pGL3之相關部位而得建構物-82/ + 24WT pGL3。將建構物-1415/ + 24WT pGL3以酶BstX I徹底消化後以Klenow DNA聚合酶處理作成鈍端，經酶sma I消化再自我黏接而產生建構物-64/ + 24WT pGL3。將建構物 -1415/+241了？81^301以酶£<:〇010 91徹底消化後以](1611(^ DNA聚合酶處理作成純端，再自我黏接而產生建構物

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一62/ + 24WT pGL3。將-62/ + 24之apo C-III 啟動子斷片由此建構物以酶Xma I及Hind 11 I切下後選殖入pGL3之相關部位。利用π快速交換指定部位突變套件”（Stratagene)根據製造商之指示以募核苷酸hC I I IF29/hCI I IR29及相關之野生株建構物為介質而得apo C-I I I啟動子之點突變株 -1415/+24TaTaK0pGL3 ， -198/+24TaTaK0pGL3 及 -82/+24TaTaK0pGL3 。表1彙集所用之寡核苷酸序列。

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第20頁 577984 00 to hCIIIR38 hCIIIF38 hCIIIR36 hCIIIF36 hCIIIR35 hCIIIF35 hCIIIR34 hCIIIF34 J hCIIIF33 名稱 LH LH αι U1 σι οι U1 Ln LH υι S s S S S S S s s 1 〇〇〇 O Q Q > n n o n o > ο 3 η > η η Ο Ο > Q Ο ο Ω Ο Ο n n > Q § > 〇 o o > o 9 > o > o o n n o Q ο ο t-0 Ω > 门 Ui Ω Ο Q g o o r\ O o > o o Ω Ω o > Ω > Ο η Ω U J Ω > n U J 闩 h > o Ω o o Ω 〇 !> η > Ω 'ο Q Ω Η Q > > H > o > Ω > H 〇门 Ω Ω ㈠彐 Q Q Ο η > > Ο 〇 Q s T o ? Ui S U J n h o > Ω > > Q ο ο V J Η Ο OJ U) «. Ul OJ o Ω 闩〇 1 1 υ J Ο ο Ω 1 > 0 Ω > 〇 1 u» 0J OJ LJ 4232 -100 1 CD Ο 1 νο ο 1 σ\ ^3 1 LH 1 U) U) 1 M tn 1 u» OJ -106 4282 1 CD 〇 -100 1 σ\ 1 ν〇 ο 1 OJ 1 Ln 1 u> 1 LH 1 00 M u> i 選殖選殖 _凝膠移行 mm ~凝觀行 mm 凝i移行凝織行選殖 _凝膠移行 mm 凝售晷行凝膠移行選殖凝膠移行選殖用途 PBLCAT4 + 碎 + + α阼 τ^ι 窃 +;部位 + Π办 c=q 窃 +部位 +部位 22, -2] -19,-] 突變/ +部位 22, -2： -19,-] 突變· + :商 D3 iQ h- Μ m Q) 彐 X 03 CQ Μ Η BamH W tQ l·-* BamH V «— 1- CD - tU 、 IQ 1 Μ NJ I- r- 00 - 〇3 έ 1 Sac : Μ Μ Μ Μ M Μ 、 Μ 、 Η 鬥 ! ill 第21頁 577984 五、發明說明（18)

1BBI 第22頁 577984 五、發明說明（19)

該質體Tk-Luc +係經由將質體pBKCMV-Luc+以酶Bgl I I及 Κρη I消化所得之Luc+報告者基因插入以Bgl II及Κρη I所裂斷之載體pBLC AT 4(32)中取代CAT報告者基因而建構。建構物（RevDR2)3XTkLuc+(在圖 12b 中以RevDR2TkLuc + 表示）則係以L u c +報告者基因（B g 1 I I / E c 〇 R I消化）取代相關之建構物中之CAT報告者基因而製得。質體pTkpGL3係將存在於質體PBLCAT4之單一疹病毒胸腺嘧啶激酶啟動子之斷片以引子5 1 4及5 1 0 (表1)利用P C R放大而建構。然後將所得之 PCR斷片以酶Bgl II及Hind III消化後再嵌入載體pGL3之相關部位内。建構物（-5 8/- 27 )8xTkpGL3 及（-47/- 79 )lx TkpGL3 ib ^ m ^ # S^hCIIIF15/hCIIIR15 A hCIIIF17/hCIIIR17利用先前描述之方法（57)而製得。在載體pi c2 OH中之中間體建構物再以酶Sal I及Xho I消化。然後將所得之嵌入物選殖入載體TkpGL3之Xho I部位並以 DN A定序界定出其方向。為了能在一個步驟中根據先前描述之方法（57)將數個方向可能含有與研究之核受體反應元件之DNA斷片複本嵌入，建構物TkpGL3係經酶BamH I消化後以DNA聚合酶之K 1 enow斷片處理成鈍端再使其自我黏接 ❿ (載體 TkpGL3BK0)。建構物（-33/16)3xTkpGL3， (-3 3/-16TaTaKO)3xTkpGL3，（- 1 0 9/62 )lxTkpGL3, (-1 0 0 /- 8 0 )3xTkpGL 3, (-8 7 /- 6 7 )3xTkpGL3 及 (-8 7/- 6 7C3P3’ KO)3xTkpGL3 係分別以募核甘酸hCI I IF34 與 hCIIIR34, hCIIIF35 與hCIIIR35, hCIIIF21 與hCIIIR21， hCIIIF38 與hCIIIR38， hCIIIF36 與hCIIIR36及hCIIIF37與

第23頁 577984 五、發明說明（20) hCIIIR37利用先前描述之方法（57)選殖入載體TkpGL3BKO 而製得。所得之載體pG5TkpGL3係將5個複本之酵母菌轉錄因子〇3 14(部位17111)(49)嵌入質體丁1^〇1^3之丁1^啟動子之上游。可以在外源表現相關核受體之質體PSG5-hHNF4， pSG5-hRev-erb α，pSG5-hRev-erb /3 及pCMX-hROR α 1 係依前述（2 5， 31，34， 35)而得。質體pGal4- 0係將存在於質體pBD-Gal4(Stratagene)之酵母菌轉錄因子Gal4之DNA結合區域次選殖入載體pCDNA3之Hind III與EcoR I部位而製付。為了產生質體pBDGal4-hRev-erb aDEF，將質體 pSG5-hRev-erba以酶Xho I及BamH I裂斷後再選殖入載體 pBKCMV之相關部位内。然後將因此所得之質體以酶讣〇 i 消化’以DNA聚合酶之K1 enow斷片處理成鈍端再以酶spe I 消化。所得之嵌入物再選殖入一個先經Ec〇R 鑑識酶消化並以DNA聚合酶之Klenow斷片處理成鈍端再以xba I消化之載體？0&14-(；6内而產生質體(；314咄1^¥ — 61^^1)£1?。所有之建構物均經定序而確認。 k酵間轉感染輿量測人a pn C-I I I啟動子之活性核受體之活性係以報告者基因/共轉感染之標準技術量測。DNA可以利用實驗室可用之一般技術（磷酸鈣，電穿孔’脂感染（lipofection)等等）送入欲研究之細胞内，載體PSG5，pCDNA3，及pCMX作為無活性對照組。在利用磷酸趟沉殿技術進行之實驗中，由6 〇麗培養皿所取出之細胞以 5 0-6 0%之質體混合物轉感染，該等質體混合物中一般包含

第24頁 577984 五、發明說明（21) 除了報告者質體CAT, Luc+或pGL3(0· 5 μ g/60mm培養皿）及表現載體pSG5-hRev-erb α，pCMX-hROR α 1 及 pSG5 - hHNF4(0.1-l Ag/GOmm 培養亚）之夕卜，尚包含0·1 eg/60mm 培養 m 之 pCMV- /S-gal 質體（36)(Clontech)作為轉感染效能之對照組。經過5至6小時之後，將細胞以清洗緩衝液（0·15 M NaCl，0.01M磷酸鈉，pH 7.2)洗兩次再以新鮮含有1 0 %胎牛血清之培養介質培育3 6小時。經過轉感染之後，細胞會分解，再依標準方法（3 7)量測發光酶及石 -半乳糖甘酶活性。利用脂感染進行之實驗中，細胞先在 2 4個小室之培養孤中養至每個小室有1 〇〇〇〇個細胞後，接著在進行轉感染之前再於3 7 °C培養1 6小時。然後再於3 7 利用陽離子性脂肪在不含血清之培養介質中轉感染兩小時。將質體（報告者載體：50ng/小室；表現載體：1 〇〇ng/小室，轉感染效能對照組載體：pSV- /5gal(Promega)(50 ng/ 小室）及DNA 共乘物（entrainer)(加入pBluescript (St rat age ne)使轉感染之DNA量達到5 0 0 ng/小室））溶在補充有NaCl(150mM)，碳酸氫鈉（50 mM)，及陽離子脂 (6nmol / // g DNA)之無血清DMEM中，離心後，在室溫下培養3 0分鐘再加到細胞内。經過兩小時培育之後，以前述之清喜緩衝液洗兩次再以新鮮含有1 〇 %胎牛血清之培養介質培育3 6小時。實驗之後，以清洗緩衝液清洗細胞再利用購自Promega之'1 Dual - Luci f eraseTM報告者檢測分析系統’’套件根據製造商之說明量測發光酶活性。所得萃取物之蛋白質含量再利用” Rio-Rad蛋白質檢測分析”套件（Bi〇-Rad)以

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Bradford技術進行檢測分析。 4.凝膠延滞在試管内种1購自promega之”TnT T7快速偶合轉錄/轉. 澤系統11套件以紅血球分解物技術由質體pSG5_hRev_e^b α 合成hRev-erba蛋白質。凝膠延滯試驗則係根據先前描述·· 之方法（43，44, 46)利用募核苷酸來合成雙股DNAs以作為- 探針，詳述於表2。名稱意義寡核苷酸反意義寡核苷酸 HCIII-TaTaWT hCIIIF 8 hCIIIR 8 HCIII-TaTaKO hCIIIF 12 hCIIIR 12 C3P-DR2 hCIIIF 6a hCIIIR 6a Rev-DR2 1129 1142 表2

該雙股募核百酸係經由將稀釋於雜交緩衝液（5 〇 mM 丁ris-HCl pH8，50 mM KC1，5mM MgCl2, 1〇 mM DTT)之 2.5或5 "g之意義與反意義寡核哲酸於1〇〇。〇培育分鐘再以6 5 °C培育1 0分鐘最後再緩緩冷卻至室溫而獲得。結合緩衝液之組成如下： 10 mM Hepes， 80 mM KC1, 5% 甘油，1〇 mM DTT， 0. 1 ^g/ // 1 polydldC, 5 Ong/ // 1 鯡魚精子DN A, 1 //g/ // 1 ψ 牛血清白蛋白，紅血球分組物：1 〇 %。 5.動物模式 R e v - e r b α基因經過同源重組方式摧毁之小白鼠 - (Rev-erba Κ0)係得自Bj6rn Vennstrdm所領導的團隊（發

第26頁 577984 五、發明說明（23) 育生物學實驗室 ’CMB， Karolinska Institute， Stockholm， Sweden) (SV 1 29 01 aHsd 背景與BalbC 背景交配）（Chomez, P·，Neveu，I·，Mans6n，A·，Keisler， E·，Larrson，L·， Vennstrbm， B·， Arenas，E.中請投稿發表中）。伯揚凡施童（B j n Venns trttm)提供我們餵食 Chow飲食之（-/-)或（ + /+)野生種Rev-erb αΚΟ基因移轉小白鼠之血液與肝臟樣本。血液及組織樣本在空腹4小時之後採集。血液由尾巴靜脈取出後在4 °C以每分鐘12000轉離心2 5分鐘以收取血清，儲存於4 °C並用以分析脂肪指標，脂蛋白及衍脂蛋白。經過C02麻醉之後，將小白鼠殺死以取出組織，以液態氮冷凍再儲存於—80 °C供RNA分析。 6.分析脂肪指標，脂蛋白及衍脂蛋白血清脂肪及衍脂蛋白係利用市售之試劑採用微量標定孤以酵素試驗測量。血清中ap〇 C - I I I的量係利用Fruchart 教授實驗室所製造之多株抗體以免疫混懸計檢法 (immunonephelemetry)測量。脂蛋白之三甘油酯及膽固醇之概況則由π快速蛋白質液相層析法”（FPLC )獲得。血清脂蛋白（200 //1匯集之平均血清代表）係以Superose 6HR 1 0 - 3 0管柱（P h a r m a c i a )經由恒定流速（〇 · 2 m 1 /分鐘之填酸鹽緩衝液（10 mM，pH 7·4)添加 0.01% EDTA 及〇·〇1% NaN3) 利用排除層析法（exclusion chromatography)分離。流出物之光學密度係在2 8 0 n m量測。收集之溶離分為〇 . 2 7 m 1，並測量在該等溶離分中膽固醇及脂蛋白之總量。由基因移轉小白鼠翠取肝臟RNA，準備及進行北方與點

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墨/貝（Northern and dot blots)之雜交以及測量apo C-I II mRNA的量係根據前述之方法（38)進行。純系36B4編碼為人P0酸性核糖體磷蛋白（39)，gapdh (4〇)， ^-actin (41 )或鼠apo c - I I I (38)之cDNAs則作為對照組。cDNA探針 f利用百靈佳曼翰所提供之套件以隨意引子進行μ p標記。每個渡膜則根據先前描述之方法（42)以丨· 5χ1〇6 cpm/ml之各個探針進行雜交。將膜以0· 5xSSC緩衝液及0· 1%SDS在室溫下洗1 0分鐘之後再以相同之緩衝液在6 5艺洗3 〇分鐘兩次然再進行自動放射性顯影（x—〇MAT —AR底片，柯達）。自動放射性顯影底片再以密度儀（Biorad GS6 70密度儀）分析。結果以所用之mRNAs對照組探針之量進行校正（42)。 II· 結果 1 · —C - I I I 啟動子在HapG2 及RK1 3 細腧之活性當HepG2細胞以含有在發光酶報告者基因上游之人叩〇 c-πι啟動子斷片（一1415/ + 24)之質體 (-1415/ + 241丁11(：1111^1^+)以及可以用來在外源表現

Rev erba核叉體之質體pSG5-hRev-erba共轉感染之後，可以發現報告者基因之活性降低5〇%(圖丨）。當^ 1 3(免子腎臟）細胞以該等相同之建構物共轉應感染之後亦得到相价同的結果（圖2，3)。在此模式中因其基因表現型較以“？細胞安定’所以較偏好用此細胞來測試hRev_erb “及其異構形之效果。此外，係與轉敢言之表現載體量有關（圖1， 3 ’及4)而與所用之轉感染方法（以磷酸鈣沉澱DNA(圖1至

第28頁 577984 五、發明說明（25) 圖3 )或是脂感染髮圖4及以後之圖））無關。因為以第二種方去之效能較南，使得所用之D N A量可以減少許多，因而在進行轉感染時可以存在過量之惰性搭配DNA，因此偏好使用後面的方法。最後，hRev-erba對於人ap〇 C-III啟動子之-141 5/ + 24斷片之效果亦可以經由其他報告者基因觀察（例如CAT)(數據並未呈現），利用骨幹不同之報告者質體（諸如ρΒΙΧΑΊ5，見圖1及3，或pGL3，見圖2，4及接下來後面的圖）或是利用其他諸如pCDN A3之表現載體（數據並未呈現）：hRev-erb α之效果係相關堅固。下文之研究偏好使用在此技界所廣為使用之載體pGL 3。經由遠專結果推斷在人叩〇 C-III啟動子中存在一種 hRev-erb α核受體之反應元件可以降低該啟動子之活性。 2·專一的hRev-erb α教罢圖2顯示缺乏啟動子之載體（pGL3)其報告者基因之活性並不受外源表現之h R e v - e r b α影響。甚者，兩個異源啟動子（單一疹病毒之胸腺嘧啶激酶啟動子（在圖2中標記為 TkpGL3)，或是SV40之主要後啟動子（在圖2中標記為 pGL3))之活性亦對hRev-erb α之作用無反應。因此該核受體對於人apo C-III基因啟動之效果為專一的。 3 ·顯著的hRev - erb α效杲對於hRev-erb α屬於辨識反應元件之核荷爾蒙受體超級豕族之數個成員’其對人apo C-III啟動子之量為專一的·

HNF4，PPAR/RXR 複合物，C0UPTF-I 及 C0UPTF-II 結合至 C3P 部位（_82/70)(47，60，61，62)並調控人叩0 c-ΠΙ啟動

第29頁 577984 五、發明說明（26) 之活性。此外吾人發現該核受體增加該啟動子之活性部分係經由C3P部位（-82/70)(未發表之數據，但是為另一篇申請中PCT專利案（PCTVEU9 9/ 0 2 0 0 1 )之主題）。為建立hR〇R α 對於其他核荷爾蒙受體作用之影響程度，將RK丨3細胞以固定ϊ之受體質體及可表現hHNF4或hRORa受體之質體，以及以增加量之可外源表現hRev-erba之質體共轉感染。無論所共轉感染之核受體為何，hRev-erba均降低該受體基因之活性：hRev-erb α之效果係顯著的（圖3、圖4)。

4·鑑定hRev-erb α作用之分子部位 a· ϋί人apo C - I I I啟動子之棑除突蠻块圖5顯示當選殖在報告者基因上游之ap〇 c-iii啟動子逐漸被截短之後報告者基因之活性亦逐漸降低。啟動子之活性當-1 08至-62位置被去除後會消失。這區域含有部位 C3P(-8 2/-70 )，其控制apo c-III啟動子活性之重要性係先别此技界所知悉（5 6， 6 0及6 2 )。在所呈現之實驗中， apo C-III啟動子之一；1415/ + 24斷片可放大質體PGL3之Luc +

報告者基因活性達1〇倍。當外源表現hRev —erb α後可以降低其活性幾乎至pGL3載體無啟動子之程度：hRev —erb α之效果係非常顯著。直到去除-1 〇 8 / + 2 4之前均可明確地觀察此效果。由建構物—6 2 / + 2 4所得之結果則很難解釋：報告者基因之活性通常趨近於所觀察報告者pGL3之活性，可能是因為缺少C3P部位。該等結果顯示在人ap〇 c-i I I啟動子包括介於-108至+ 24之間部位之區域至少存在有一個 hRev-erb α之作用部位。

第30頁 577984 五、發明說明（27) 為了將hRev-erb α反應元件在apo C-III啟動子區域中之位置定出，將重疊涵概該區域之斷片（位置- 3 3 / - 1 6， — 58 /- 24 ’ -76/-46，-87/67 及-100/-80)以一個或多個方 · 位之複本選殖入TK啟動子之上游。圖6顯示建構物 (-33/- 16)3X TkpGL3之活性可被hRev-erba降低。圖6中所述建構物（-1 0 0 /-8 0 )3X TkpGL3之微弱壓抑則在所有實驗中 · 均未觀察到。 . b.經由凝膠延滯分析啟動子為了鑑定出hRev-erb α結合在apo C-III啟動子之部位，重疊之雙股募核苷酸在ATP-r32P存在下磷酯化再與在作試管内合成之hRev-erb α蛋白質（利用質體PSG5-hRev-erb α在程式化之免子紅血球分解物或是利用未程式化之 -分解物）培育。然後將由此所得之DN Α/蛋白質複合物在聚丙稀酿fe;》是膠上解析（¾¾膠延滯法）。兩個專^一之hRev_erb α複合物經鑑別出位於作為參考之hRev-erb α受體至反應元（31 )。一個專一之hRev-erb α複合物經鑑別出位於人 apo C-III基因啟動子之-34/-10斷片而且在圖7中以箭頭標示。該複合物移行至分子量相當於hRev-erb α與 Rev-DR2反應元件形成單體複合物之位置。所觀察之 hRev-erb α/(-3 4/-10)複合物之強度較hRev —erb α ψ /(Rev-DR2)複合物觀察所得強度為弱，這顯示部位 (-34/- 10)對hRev-erb α之親和力較弱。分析一34/-1ϋ斷片· 之序列顯示有一個完美的AGGTCA半部位而且之前在 - -23/-1 8位置有一段富含Α/Τ區域。然而在相對於該半部位

第31頁 577984

五、發明說明（28)

—1位置之驗基為C，此與前人文獻所定義之共識不同。這點差異可以解釋與hRev-erb α結合部位之低親和力。相關之雙股募核苷酸其-23/-18部位序列經突變（AGGTCA半部位而且之前在-23/-18位置有一段富含Α/Τ區域。然而在相對於該半部位-1位置之驗基為C，此與前人文獻所定義之共識不同。這點差異可以解釋與hRev-erb α結合部位之低親和力。相關之雙股寡核甘酸其-2 3 / - 1 8部位序列經突變者 (AGGTCA—AGGCAG，hCII ITaTamut)並不與hRev-erb α 蛋白質形成複合物（數據未呈示）。最後吾人發現經標記之募核甘酸，其涵蓋人apo C-III基因啟動子中介於位置-198及 + 24之間部位其他斷片者（例如相關於ap〇 c-I I I基因啟動子斷片-1 04/-72 (’，匸3?-01?2”）之雙股募核苷酸（見圖7))，並未有明顯的凝膠延滯。結論為該凝膠延滯試驗鑑定出存在於人apo C_I I I啟動子中位置-23/-18之半部位八001^八可能為一個111^¥-61^61；反應元件。。·分析人aD〇 C- I I I基因啟動子之點突變為了確認經由去除突變及經由凝膠延滯技術所得之結果’將建構物-1415/ + 24WTpGL3及-8 2/ + 24WTpGL3以指定部位突變之方式對位於apo 〇 I I I基因TaTa盒下游之AGGTCA ❶ 半部位（-23/-18)進行突變。甚者，吾人尚將三個複本之人apo C- III基因啟動子之-33/- 16斷片（其AGGTCA部位依照建構物-14 15/+2 4界丁口01^3及-8 2 / + 2 4界丁？01^3之方式突變改 · 質）選瘦在Tk啟動子之上游。圖8A顯示位於人apo C-III啟

第32頁 577984 五、發明說明（29) 動子基因A GGTCA半部位（-23/-18)進行突變會降低整個啟動子對hRev-erb α之敏感度達50%。當建構物 82/ + 24WTpGL3經突變之後，hRev-erb α之效果完全消失。相同的，對建構物（—33/q 6WT)3x TkpGL3之-23/-1 8部位進行突變（可得建構物（_33/_16Κ0)3χ TkpGL3)亦壓抑其對hRev-erba之敏感度（圖8B)。 d ·結論至少一個參與hRev-erba作用在人apo C-III基因啟動子之部位已經明確鑑定出：位於ap〇 C-I I I啟動子-2 3/-18 位置之AGGTCA半部位。 5· ilRev-erb α異槿型之效旲令入對異的是由圖9顯示卢及7 Rev-erb異構型亦壓抑建構物- 1 98/ + 2 4WTLUC+之作用。 6·查壞Rev-erb K0小白氛之Rev —erb 〇；基因影響肝臟表現生Ρ0 C - j II以及血漿中ap〇 c-III與三甘油酯之量為了建立上述所作體外試驗觀察所得與生理上之關聯，經由以同源重組破壞在”丨以乂肫丨以小白鼠之“^^^^^:基因之效果係評估其血液參數（血漿三甘油酯及ap0 C — I I I 量’脂肪概況）以及在正常與基因移轉動物之肝臟中堆積編碼為apo C-III之訊息RNA。 a.血液參數與正常之小白鼠相較，觀察突變小白鼠血清中三甘油酯濃度明顯增加（Mann-Whitney試驗，ρ<〇·〇5，圖i〇A)。該 FPLC圖譜顯示在VLDL溶離分中三甘油酯大量增加（圖η)。

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b·表現ap〇 C-I I I基因當小白鼠其Rev-erb α基因被同源重組破壞之後編碼為 apo C- I I I之mRNA表現增加（圖1 0C)。該種表現增加係與'' 衆中 apo C - III 量之增加（Mann-Whitney 試驗，ρ<〇·〇5)^ 關（圖10Β)。 ·胥上述結果顯示改變hRev-erb之表現會影響小白鼠肝臟表現apo C-III以及血漿中apo C-In與三甘油酯之量：吾人又在體外之觀察係生理有關聯。 7 ·扭提篩選方法之關聯當外源表現之hRe v-erb α經由人為方式增加會壓抑選殖在人apo C-III基因啟動子下游之報告者基因表現（圖j至 5，8及9)係利用本方法鑑別可以用來調控hRev —erb α活性物質之關聯基礎。圖6及1 2係利用單離之部位選殖在Tk啟動子上游以及_ 種報告者基因之前以鑑別可以用來調控hRev —erb α活性物質之關聯基礎。已經鑑定出一個建構物其中包含有存在於人Rev-erb α基因啟動子之Rev-DR2部位之三個複本選殖在 Tk啟動子之前（圖12)。其對hRev-erb α之敏感度係增加。由此定位其對用來篩選可以用來調控天然hRev_erb α核受體活性物質之價值。最後’圖1 3係利用嵌合體鑑別可以用來調控hRev_erb 活性物質之關聯基礎，該種嵌合併有酵母菌轉錄因子G a i 4 之DNA結合區域及hRev-erb α配位子之結合區域以及一個報告者載體’兒該載體包含5個複本之Gal4反應元件。

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Claims

降本 __ I案號 88110571 六、申請專利範圍

關脂肪代謝失常 1 · 一種篩選用以治療衍脂蛋白c 一 111相之物質的方法，該方法之特徵為： -將該等測試物質與_種!^卜61^家族之Μ 種Rev-erb受體之反應元件接觸，如·及/或— -以任何適當之方法測量下列： -該物質與Rev-erb受體之結合，或由該物 R e v - e r b受體所形成複合物與其反應元件之結合，、一 -置於包含Rev-erb反應元件之啟動子控制下及/或轉錄活性之調控。之基因 2 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其特徵為該^ — 受體及Rev-erb受體反應元件係hRev-erb α受體及 er hRev-erba受體反應元件。 3 · —種篩選用以治療衍脂蛋白C - I I I相關脂肪代謝失常之物質的方法，其包括一細胞株， -表現Rev-erb受體 -含有rev-erb啟動子，其係控制Rev-erb受體或發光酶、CAT、鹼性磷酸酶或彡-半乳糖苷酶等報告者基因之表現 -一調控Rev-erb受體或報告者基因之表現的測試化合物，其係利用就地雜交、RT-PCR、北方墨潰法、點墨潰法或報告者基因活性測試予以測定。 4.根據申請專利範圍第1或3項之方法’其所選出物係用以製備醫藥組合物，該組合物可以用來治療人或動物與衍脂蛋白質C- I I I有關之脂肪代謝失常。

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