JP2003524755A - スクリーニングにおけるレセプターのrev−erbファミリーの使用 - Google Patents
スクリーニングにおけるレセプターのrev−erbファミリーの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、特にアポリポ蛋白質C-III関連脂質代謝機能障害の治療において有用である物質をスクリーニングするための、Rev-erbファミリーのレセプターの使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、これら障害の治療に有用な物質を選抜するためのスクリーニング方法に関する。結局、本発明は、従って、アポリポ蛋白質C-III関連脂質代謝機能障害の治療に有用な治療用組成物の製剤を同定する物質の使用に関する。本発明の主題はまた、Rev-erbレセプターおよび/またはそれらの応答エレメントを用いて、抗アテローム性動脈硬化の特性を備えた物質の活性メカニズム、並びにアポC-IIIへの効果をキャラクタライズし、正当化し、主張するためのスクリーニングテストの使用である。
Description
【0001】
本発明は、特にアポリポ蛋白質(apolipoprotein)C-III関連脂質代謝機能障
害の治療において有用である物質をスクリーニングするための、Rev-erbファミ
リーのレセプターの使用に関する。より詳しくは、本発明は、これら機能障害の
治療に有用である物質を選抜するためのスクリーニング方法に関する。さらに本
発明は、例えば、アテローム性動脈硬化などのアポリポ蛋白質C-III関連脂質代
謝機能障害の治療に有用である治療用組成物の製剤のために同定される物質の使
用に関する。Rev-erbレセプターおよび/またはそれらの応答エレメント(respon
se elements)を用いて、抗アテローム性動脈硬化の特性を備えた物質の活性メカ
ニズム、並びにRev-erbレセプターのアポC-IIIへの効果をキャラクタライズし(
characterization)、正当化し(justification)、主張する(claim)ためのス
クリーニングテストの使用もまた本発明の主題である。
害の治療において有用である物質をスクリーニングするための、Rev-erbファミ
リーのレセプターの使用に関する。より詳しくは、本発明は、これら機能障害の
治療に有用である物質を選抜するためのスクリーニング方法に関する。さらに本
発明は、例えば、アテローム性動脈硬化などのアポリポ蛋白質C-III関連脂質代
謝機能障害の治療に有用である治療用組成物の製剤のために同定される物質の使
用に関する。Rev-erbレセプターおよび/またはそれらの応答エレメント(respon
se elements)を用いて、抗アテローム性動脈硬化の特性を備えた物質の活性メカ
ニズム、並びにRev-erbレセプターのアポC-IIIへの効果をキャラクタライズし(
characterization)、正当化し(justification)、主張する(claim)ためのス
クリーニングテストの使用もまた本発明の主題である。
【0002】
アポリポ蛋白質C-III(以下、アポC-IIIという)は、肝臓において、より少な
い程度では腸において、合成される79アミノ酸のグリコプロテインである。それ
は血漿トリグリセリドの代謝において重要な役割を担っている。実際、アポC-II
Iの血漿濃度は、正常の集団において、および高トリグリセリド血症の患者にお
いての両方で、トリグリセリドの血漿レベルと正の相関がある(1〜4)。さら
に、リポ蛋白質の他のクラスに関して、アポC−IIIの相対的な分類は大きいよう
に思われる。アポB(アポC−III-LpB)を含有する粒子におけるアポC−IIIの濃
度の増加は、心臓病または冠状動脈疾患の危険性の高まりと関連している(5)
。いくつかの一連の証拠がアポC−IIIと血漿トリグリセリドの異化作用とを関連
付ける。 アポC−IIIの欠損は、超低密度リポ蛋白質(VLDL)の異化作用において、増加
によって反映されるが、アポC−IIIの合成での増加は、高トリグリセリド血症患
者において現れる(6、7)。
い程度では腸において、合成される79アミノ酸のグリコプロテインである。それ
は血漿トリグリセリドの代謝において重要な役割を担っている。実際、アポC-II
Iの血漿濃度は、正常の集団において、および高トリグリセリド血症の患者にお
いての両方で、トリグリセリドの血漿レベルと正の相関がある(1〜4)。さら
に、リポ蛋白質の他のクラスに関して、アポC−IIIの相対的な分類は大きいよう
に思われる。アポB(アポC−III-LpB)を含有する粒子におけるアポC−IIIの濃
度の増加は、心臓病または冠状動脈疾患の危険性の高まりと関連している(5)
。いくつかの一連の証拠がアポC−IIIと血漿トリグリセリドの異化作用とを関連
付ける。 アポC−IIIの欠損は、超低密度リポ蛋白質(VLDL)の異化作用において、増加
によって反映されるが、アポC−IIIの合成での増加は、高トリグリセリド血症患
者において現れる(6、7)。
【0003】
さらに、遺伝学的研究によって、アポC−III遺伝子のある多型と、血漿中のト
リグリセリドおよびアポC−IIIの高濃度との間の関係が存在することが明らかに
なっている(8、9)。 最後に、形質転換動物におけるヒトアポC-IIIの過剰発現は、高トリグリセリ
ド血症の発生により起こされるが、マウスでの相同組換による外因性アポC-III
遺伝子の欠失によって、アポC-IIIの血漿濃度の増加および食後に起きる高トリ
グリセリド血症に対する動物の保護をもたらされる(10、11)。
リグリセリドおよびアポC−IIIの高濃度との間の関係が存在することが明らかに
なっている(8、9)。 最後に、形質転換動物におけるヒトアポC-IIIの過剰発現は、高トリグリセリ
ド血症の発生により起こされるが、マウスでの相同組換による外因性アポC-III
遺伝子の欠失によって、アポC-IIIの血漿濃度の増加および食後に起きる高トリ
グリセリド血症に対する動物の保護をもたらされる(10、11)。
【0004】
インビボおよびインビトロで行われた研究の結果は、アポC-IIIが、主にトリ
グリセリドリッチな粒子の異化作用の遅延によって、内皮の表面へのそれらの結
合および続くリパーゼリポ蛋白質による脂肪分解の抑制によって、またはアポE
レセプターによって確保される残りの粒子(残余物)のクリアランスの妨害によ
って、作用することを示している(12〜16)。
グリセリドリッチな粒子の異化作用の遅延によって、内皮の表面へのそれらの結
合および続くリパーゼリポ蛋白質による脂肪分解の抑制によって、またはアポE
レセプターによって確保される残りの粒子(残余物)のクリアランスの妨害によ
って、作用することを示している(12〜16)。
【0005】
さらに、リポ蛋白質の代謝においてアポC-IIIの重要性もまた、低密度粒子(L
DL)レセプター遺伝子を相同組換によって除いたマウスとヒトアポC-III遺伝子
を過剰発現するマウスとの間の交配系の子孫における複合家族性高脂質血症のい
くつかの特性(大量のVLDLおよび初期の心臓病および冠状動脈性心臓病に関連す
るLDL)の観察によって示唆される(17)。
DL)レセプター遺伝子を相同組換によって除いたマウスとヒトアポC-III遺伝子
を過剰発現するマウスとの間の交配系の子孫における複合家族性高脂質血症のい
くつかの特性(大量のVLDLおよび初期の心臓病および冠状動脈性心臓病に関連す
るLDL)の観察によって示唆される(17)。
【0006】
Rev-erb核レセプターは、天然のリガンドが一般に知られていない、少なくと
も3つの異なる遺伝子、Rev-erbα(ear1)、Rev-erbβ(BD73、ear4、RVR)お
よびHZF-2(Rev-erbγ)、にコードされるオーファン(orphan)核レセプターの
サブファミリーを形成する。Rev-erb核レセプターをコードするmRNAが多く
の組織、特に筋肉、褐色脂肪組織および脳で発現する(26)。この発現もまた
サーカディアンリズムにしたがうように思われる(55)。2つの遺伝子、Rev-
erbβおよびRev-erbγは、特に脳において発現する(22、25)。Rev-erbα
およびRev-erbβは、5塩基対のA/Tリッチの領域(A/T-A-A/T-N-T-
A/G-G-G-T-C-A)に先行されるハーフサイト(half-site)PuGGTC
Aに単量体として結合することができる(28、21)。2つの塩基対で分離さ
れ、かつA/Tリッチ領域に先行される2つのAGGTCAハーフサイトの指向
性反復でのRev-erbαの二量体の結合もまた、インビトロで記載されている(2
9)。2つのAGGTCAハーフサイトの指向性反復をともなうRev-erbαのD
NA結合ドメインを形成する、形成された複合体の結晶学的構造は記載されてい
る(54)。最初に記載されたこと(28)と比べて、Rev-erbサブファミリー
の核レセプターが転写を抑制するように思われる(29,20)。これまでRev-
erbαのいくつかの生理学的標的は同定されてきた:がん遺伝子N-myc(30)、
ラットアポA-I遺伝子(27)、ヒトhRev-erbα核レセプター自体(31)およ
び転写因子myoDおよびmyogenin(53)。
も3つの異なる遺伝子、Rev-erbα(ear1)、Rev-erbβ(BD73、ear4、RVR)お
よびHZF-2(Rev-erbγ)、にコードされるオーファン(orphan)核レセプターの
サブファミリーを形成する。Rev-erb核レセプターをコードするmRNAが多く
の組織、特に筋肉、褐色脂肪組織および脳で発現する(26)。この発現もまた
サーカディアンリズムにしたがうように思われる(55)。2つの遺伝子、Rev-
erbβおよびRev-erbγは、特に脳において発現する(22、25)。Rev-erbα
およびRev-erbβは、5塩基対のA/Tリッチの領域(A/T-A-A/T-N-T-
A/G-G-G-T-C-A)に先行されるハーフサイト(half-site)PuGGTC
Aに単量体として結合することができる(28、21)。2つの塩基対で分離さ
れ、かつA/Tリッチ領域に先行される2つのAGGTCAハーフサイトの指向
性反復でのRev-erbαの二量体の結合もまた、インビトロで記載されている(2
9)。2つのAGGTCAハーフサイトの指向性反復をともなうRev-erbαのD
NA結合ドメインを形成する、形成された複合体の結晶学的構造は記載されてい
る(54)。最初に記載されたこと(28)と比べて、Rev-erbサブファミリー
の核レセプターが転写を抑制するように思われる(29,20)。これまでRev-
erbαのいくつかの生理学的標的は同定されてきた:がん遺伝子N-myc(30)、
ラットアポA-I遺伝子(27)、ヒトhRev-erbα核レセプター自体(31)およ
び転写因子myoDおよびmyogenin(53)。
【0007】
本発明者らの研究は、Rev-erbレセプターが、アポC-III遺伝子の転写の負のレ
ギュレーターであることを示してきた。従って、これらレセプターは、高トリグ
リセリド血症および高脂質血症の発生に関連するアポC-III遺伝子の転写を抑制
することが可能である。 したがって本発明は、脂質代謝機能障害の治療に有用である物質のスクリーニ
ングするのためのRev-erbレセプターおよび/またはこれらレセプターまたはそ
れらと機能的に同等のものの応答エレメントの1つの使用に関する。さらに、本
発明は、Rev-erbレセプターおよび/またはそれらの応答エレメントを用いて、
抗アテローム性動脈硬化の特性を備えた物質の活性メカニズム、並びにアポC-II
Iへの効果をキャラクタライズし、正当化し、主張するためのスクリーニング方
法の使用に関する。
ギュレーターであることを示してきた。従って、これらレセプターは、高トリグ
リセリド血症および高脂質血症の発生に関連するアポC-III遺伝子の転写を抑制
することが可能である。 したがって本発明は、脂質代謝機能障害の治療に有用である物質のスクリーニ
ングするのためのRev-erbレセプターおよび/またはこれらレセプターまたはそ
れらと機能的に同等のものの応答エレメントの1つの使用に関する。さらに、本
発明は、Rev-erbレセプターおよび/またはそれらの応答エレメントを用いて、
抗アテローム性動脈硬化の特性を備えた物質の活性メカニズム、並びにアポC-II
Iへの効果をキャラクタライズし、正当化し、主張するためのスクリーニング方
法の使用に関する。
【0008】
本発明の目的のために、用語「Rev-erbレセプター」は、すべてのRev-erbファ
ミリーのα、βおよびγアイソフォームを示す。 「Rev-erbと機能的に同等のもの」という表現は、 − Rev-erbの所定のリガンドに対するRev-erbの選択性に匹敵する選択性を有す
るリガンド結合サイト、 および、 − 類似の核酸配列をもつRev-erbまたは応答エレメントと同じ応答エレメント
を認識するDNA結合サイト、 の両方を備えている任意の蛋白質を意味する。
ミリーのα、βおよびγアイソフォームを示す。 「Rev-erbと機能的に同等のもの」という表現は、 − Rev-erbの所定のリガンドに対するRev-erbの選択性に匹敵する選択性を有す
るリガンド結合サイト、 および、 − 類似の核酸配列をもつRev-erbまたは応答エレメントと同じ応答エレメント
を認識するDNA結合サイト、 の両方を備えている任意の蛋白質を意味する。
【0009】
「Rev-erbと機能的に同等のもの」という表現は、また、
− Rev-erbの所定のリガンドに対するRev-erbの選択性に匹敵する選択性を有す
るリガンド結合サイト、 および、 − レポーター遺伝子の応答エレメント、またはキメラの敏速な精製および例え
ばマルトース結合蛋白質(MBP)またはグルタチオン−S−トランスフェラー
ゼ(GST)などの定義されたマトリックスへの特異的な結合を可能にする蛋白
質ドメインを認識するDNA結合サイト、 を備えたキメラの蛋白質を意味する。キメラの後者のタイプは、しばしば用いら
れている(53)。アフィニティーカラムを用いた一工程で蛋白質の精製を可能
にする利点、または当業者によく知られている簡易な手段(ビーズまたは樹脂へ
のカップリング、マルトースまたはグルタチオンとの溶出など)によって、この
蛋白質の特異的な分離することの利点がある。
るリガンド結合サイト、 および、 − レポーター遺伝子の応答エレメント、またはキメラの敏速な精製および例え
ばマルトース結合蛋白質(MBP)またはグルタチオン−S−トランスフェラー
ゼ(GST)などの定義されたマトリックスへの特異的な結合を可能にする蛋白
質ドメインを認識するDNA結合サイト、 を備えたキメラの蛋白質を意味する。キメラの後者のタイプは、しばしば用いら
れている(53)。アフィニティーカラムを用いた一工程で蛋白質の精製を可能
にする利点、または当業者によく知られている簡易な手段(ビーズまたは樹脂へ
のカップリング、マルトースまたはグルタチオンとの溶出など)によって、この
蛋白質の特異的な分離することの利点がある。
【0010】
「Rev-erbレセプター応答エレメントと機能的に同等のもの」という表現は、R
ev-erbレセプター結合し得る任意の核酸配列、特にRev-erbレセプター応答エレ
メントに由来するシークエンスを意味する。 hRev-erbαレセプター、hRev-erbαメッセンジャーRNAおよびhRev-erbαレ
セプター応答エレメントは、本発明の実施において、特に好ましい。
ev-erbレセプター結合し得る任意の核酸配列、特にRev-erbレセプター応答エレ
メントに由来するシークエンスを意味する。 hRev-erbαレセプター、hRev-erbαメッセンジャーRNAおよびhRev-erbαレ
セプター応答エレメントは、本発明の実施において、特に好ましい。
【0011】
従って、本発明の主題は、脂質代謝機能障害の治療に有用な物質のスクリーニ
ング方法の第一のタイプであって、それはRev-erbファミリーのレセプターおよ
び/またはRev-erbレセプター応答エレメント、および/または機能的にRev-erb
をRNAポリメラーゼ複合体に結合し得る核因子、またはそれらと機能的に同等
のものと接触して試験物質を置き、次いで、次のような任意の適当な手段: ― Rev-erbレセプターおよび/またはそれと機能的に同等のものへの前記物質
の結合、または前記物質と、応答エレメントおよび/または機能的にRev-erbを
RNAポリメラーゼ複合体に結合し得る核因子に対するRev-erbレセプターとの
結合、 および/または、 ― 前記応答エレメントを含むプロモーターの制御下に配置される遺伝子の転写
活性の調節、 で測定することからなる。
ング方法の第一のタイプであって、それはRev-erbファミリーのレセプターおよ
び/またはRev-erbレセプター応答エレメント、および/または機能的にRev-erb
をRNAポリメラーゼ複合体に結合し得る核因子、またはそれらと機能的に同等
のものと接触して試験物質を置き、次いで、次のような任意の適当な手段: ― Rev-erbレセプターおよび/またはそれと機能的に同等のものへの前記物質
の結合、または前記物質と、応答エレメントおよび/または機能的にRev-erbを
RNAポリメラーゼ複合体に結合し得る核因子に対するRev-erbレセプターとの
結合、 および/または、 ― 前記応答エレメントを含むプロモーターの制御下に配置される遺伝子の転写
活性の調節、 で測定することからなる。
【0012】
物質のRev-erbレセプターおよび/またはそれと機能的に同等のものに対する
結合、または前記物質およびRev-erbレセプターから形成される複合体のその応
答エレメントに対する結合の測定は、レポーター遺伝子を用いる方法や結合試験
などの当業者に知られた任意の直接的または間接的方法によって行うことができ
る。 同様に、Rev-erb応答エレメントを含むプロモーターの制御下に配置される遺
伝子の転写活性の調節の測定は、当業者に知られた任意の直接的または間接的方
法によって行うことができる。
結合、または前記物質およびRev-erbレセプターから形成される複合体のその応
答エレメントに対する結合の測定は、レポーター遺伝子を用いる方法や結合試験
などの当業者に知られた任意の直接的または間接的方法によって行うことができ
る。 同様に、Rev-erb応答エレメントを含むプロモーターの制御下に配置される遺
伝子の転写活性の調節の測定は、当業者に知られた任意の直接的または間接的方
法によって行うことができる。
【0013】
脂質代謝機能障害の治療における試験物質の有用性を明確にするために、本発
明の方法は、任意の適切な手段による、アポC-IIIの発現での前記物質の効果を
測定することにかかる、さらなる工程を含む。アポC-IIIの発現での試験物質の
効果の測定は、インビトロでの、およびインビトロおよびインビボにおけるモデ
ルでの、トランスフェクションまたはmRNA分析などの当業者に知られた任意
の直接的または間接的方法によって行うことができる。
明の方法は、任意の適切な手段による、アポC-IIIの発現での前記物質の効果を
測定することにかかる、さらなる工程を含む。アポC-IIIの発現での試験物質の
効果の測定は、インビトロでの、およびインビトロおよびインビボにおけるモデ
ルでの、トランスフェクションまたはmRNA分析などの当業者に知られた任意
の直接的または間接的方法によって行うことができる。
【0014】
本発明のスクリーニング方法の第一の例は、以下の工程を含む:
a)宿主細胞を、Rev-erbレセプターまたはそれと機能的に同等のものをコード
するDNA断片でトランスフェクションする、 b)工程(a)からの宿主を、前記Rev-erbレセプターの応答エレメントを含む
構築物と少なくとも1つのレポーター遺伝子とをコトランスフェクションする、
c)試験物質の存在下でレポーター遺伝子の発現を、任意の適切な手段によって
測定する。 工程(b)で用いる応答エレメントは、例えば、アポC-IIIプロモーターの隣
接する断片からなっていてもよい。
するDNA断片でトランスフェクションする、 b)工程(a)からの宿主を、前記Rev-erbレセプターの応答エレメントを含む
構築物と少なくとも1つのレポーター遺伝子とをコトランスフェクションする、
c)試験物質の存在下でレポーター遺伝子の発現を、任意の適切な手段によって
測定する。 工程(b)で用いる応答エレメントは、例えば、アポC-IIIプロモーターの隣
接する断片からなっていてもよい。
【0015】
応答エレメントを含む配列の核レセプターの活性の測定が可能ないかなるレポ
ーター遺伝子も、本発明によるスクリーニング方法に用いることができる。これ
らの中で、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT
)遺伝子、ホタル(luciole)由来のルシフェラーゼ遺伝子(Luc)、ウミシ
イタケ(Renilla)由来のルシフェラーゼ遺伝子(Ren)、分泌アルカリホス
ファターゼ(SAP)遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ(β−Gal)遺伝子
などをあげることができる。これら遺伝子にコードされる蛋白質の活性もまた、
従来の方法で容易に測定でき、産生した蛋白質の量またはそれらの酵素活性を測
定することで、遺伝子の発現での核レセプターの効果を知ることができる。
ーター遺伝子も、本発明によるスクリーニング方法に用いることができる。これ
らの中で、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT
)遺伝子、ホタル(luciole)由来のルシフェラーゼ遺伝子(Luc)、ウミシ
イタケ(Renilla)由来のルシフェラーゼ遺伝子(Ren)、分泌アルカリホス
ファターゼ(SAP)遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ(β−Gal)遺伝子
などをあげることができる。これら遺伝子にコードされる蛋白質の活性もまた、
従来の方法で容易に測定でき、産生した蛋白質の量またはそれらの酵素活性を測
定することで、遺伝子の発現での核レセプターの効果を知ることができる。
【0016】
Rev-erbレセプターの、そしてより詳細には、本発明者らが報告したアポC-III
遺伝子でのhRev-erbαレセプターの作用によって、もちろん、本発明の構築物お
よびそれらを用いるスクリーニング方法におけるレポーター遺伝子として、アポ
C-III遺伝子を用いることが可能になる。
遺伝子でのhRev-erbαレセプターの作用によって、もちろん、本発明の構築物お
よびそれらを用いるスクリーニング方法におけるレポーター遺伝子として、アポ
C-III遺伝子を用いることが可能になる。
【0017】
本発明のスクリーニング方法において、用語「宿主細胞」は、特に、哺乳動物
細胞、細菌または酵母、または代用し得る昆虫細胞などの、前記遺伝子の発現に
適合する任意の細胞型を意味する。言うまでもなく、用いるベクターは、トラン
スフェクションする細胞型に適合して用いられ、プラスミド、ウイルスまたは人
工染色体でつくられてもよい。
細胞、細菌または酵母、または代用し得る昆虫細胞などの、前記遺伝子の発現に
適合する任意の細胞型を意味する。言うまでもなく、用いるベクターは、トラン
スフェクションする細胞型に適合して用いられ、プラスミド、ウイルスまたは人
工染色体でつくられてもよい。
【0018】
本発明によるスクリーニング方法の第一のタイプのほかの例は、以下の工程を
含む: a)例えば、Rev-erbαプロモーターのサイトRevDR2(31)などのRev-erbに認
識される応答エレメントのいくつかのコピー、エム・ラザー(M. Lazar)に記載
のコンセンサスサイト、またはアポC-IIIプロモーターに同定されるRev-erb応答
エレメントを含むプラスミドを創り出す。応答エレメントのこれらのコピーは、
単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターなどの異種の強力なプロ
モーターまたはアポC-IIIプロモーターなどの同種の強力なプロモーターの上流
にクローニングされる。このプロモーターはそれ自体、ルシフェラーゼ、CAT
、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子
の発現を制御するために工夫されている、 b)工程(a)からの構築物を、自然にまたは人工的にRev-erbを発現する細胞
へ、すなわち、発現ベクターの一過性のコトランスフェクションまたはRev-erb
を発現する安定した系統の作製の後に、トランスフェクションする、および c)工程(b)からの宿主を試験物質の存在下でインキュベートする、 d)任意の適切な手段でレポーター遺伝子の活性を測定する。 RebDR2サイトは、レセプターが二量体として結合し、下流に配置される遺伝子
の転写活性を調節するRev-erb応答エレメントである。これらのサイトは、Rev-e
rbに対して異種プロモーターを増感するために用いることが可能である。
含む: a)例えば、Rev-erbαプロモーターのサイトRevDR2(31)などのRev-erbに認
識される応答エレメントのいくつかのコピー、エム・ラザー(M. Lazar)に記載
のコンセンサスサイト、またはアポC-IIIプロモーターに同定されるRev-erb応答
エレメントを含むプラスミドを創り出す。応答エレメントのこれらのコピーは、
単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターなどの異種の強力なプロ
モーターまたはアポC-IIIプロモーターなどの同種の強力なプロモーターの上流
にクローニングされる。このプロモーターはそれ自体、ルシフェラーゼ、CAT
、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子
の発現を制御するために工夫されている、 b)工程(a)からの構築物を、自然にまたは人工的にRev-erbを発現する細胞
へ、すなわち、発現ベクターの一過性のコトランスフェクションまたはRev-erb
を発現する安定した系統の作製の後に、トランスフェクションする、および c)工程(b)からの宿主を試験物質の存在下でインキュベートする、 d)任意の適切な手段でレポーター遺伝子の活性を測定する。 RebDR2サイトは、レセプターが二量体として結合し、下流に配置される遺伝子
の転写活性を調節するRev-erb応答エレメントである。これらのサイトは、Rev-e
rbに対して異種プロモーターを増感するために用いることが可能である。
【0019】
この方法の第一のタイプのさらなる例は、以下の工程を含む:
a)例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(48)などの毒性のプロドラ
ッグのアクチベーターなどの自殺選択遺伝子(suicide selection gene)の発現
を制御する強力なプロモーターの上流にクローニングされる、Rev-erbに認識さ
れる応答エレメントのいくつかのコピーを含むプラスミドを創り出す、 b)工程(a)からの構築物を宿主細胞にトランスフェクションする、 c)工程(b)からの宿主を、Rev-erbを発現するベクターを用いてコトランス
フェクションする、および、 d)工程(c)からの宿主を試験物質の存在下でインキュベートする、 e)毒性のプロドラッグの存在下での生存細胞を任意の適切な手段で測定する。 毒性のプロドラッグは、例えば、ガンシクロビルであってもよい。
ッグのアクチベーターなどの自殺選択遺伝子(suicide selection gene)の発現
を制御する強力なプロモーターの上流にクローニングされる、Rev-erbに認識さ
れる応答エレメントのいくつかのコピーを含むプラスミドを創り出す、 b)工程(a)からの構築物を宿主細胞にトランスフェクションする、 c)工程(b)からの宿主を、Rev-erbを発現するベクターを用いてコトランス
フェクションする、および、 d)工程(c)からの宿主を試験物質の存在下でインキュベートする、 e)毒性のプロドラッグの存在下での生存細胞を任意の適切な手段で測定する。 毒性のプロドラッグは、例えば、ガンシクロビルであってもよい。
【0020】
また、この方法の第一のタイプのほかの例は、以下の工程を含む:
a)ルシフェラーゼ、CAT、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
、成長ホルモンなどのレセプター遺伝子の活性を制御する、単純ヘルペスウイル
スのチミジンキナーゼプロモーターなどの強力なプロモーターの上流にクローニ
ングされた、酵母核因子Gal4に認識される応答エレメントのいくつかのコピーを
含むプラスミドを創り出す、 b)リガンドの結合するRev-erbドメインであるGal4のDNA結合ドメイン(1
4)およびRev-erbのDEFドメインを含むキメラのプラスミドを創り出す、 c)工程(a)および(b)で得られたプラスミドを宿主細胞にコトランスフェ
クションする、および、 d)工程(c)の宿主を試験物質の存在下でインキュベートする、 e)レポーター遺伝子の活性を、任意の適切な方法で測定する。
、成長ホルモンなどのレセプター遺伝子の活性を制御する、単純ヘルペスウイル
スのチミジンキナーゼプロモーターなどの強力なプロモーターの上流にクローニ
ングされた、酵母核因子Gal4に認識される応答エレメントのいくつかのコピーを
含むプラスミドを創り出す、 b)リガンドの結合するRev-erbドメインであるGal4のDNA結合ドメイン(1
4)およびRev-erbのDEFドメインを含むキメラのプラスミドを創り出す、 c)工程(a)および(b)で得られたプラスミドを宿主細胞にコトランスフェ
クションする、および、 d)工程(c)の宿主を試験物質の存在下でインキュベートする、 e)レポーター遺伝子の活性を、任意の適切な方法で測定する。
【0021】
核レセプターのDEFドメインは、このファミリーの種々のメンバーの間で分か
れる。それらは、転写物のトランスアクチベーション、およびリガンドおよびコ
ファクターの結合を伴う配列を含む。Rev-erbのDEFドメインは、Gal4の始めの1
47アミノ酸を含むGal4断片と組み合わさり、Gal4応答エレメントと結合するキ
メラGal4-Rev-erbDEFを創り出し、その転写活性は、Rev-erbのリガンドおよび/
またはコファクターに依存する(29)。 キメラの基礎的な活性は、蛋白質VP16の全てまたは部分をコードするDNA断
片を挿入することによって増加し得る(50)。
れる。それらは、転写物のトランスアクチベーション、およびリガンドおよびコ
ファクターの結合を伴う配列を含む。Rev-erbのDEFドメインは、Gal4の始めの1
47アミノ酸を含むGal4断片と組み合わさり、Gal4応答エレメントと結合するキ
メラGal4-Rev-erbDEFを創り出し、その転写活性は、Rev-erbのリガンドおよび/
またはコファクターに依存する(29)。 キメラの基礎的な活性は、蛋白質VP16の全てまたは部分をコードするDNA断
片を挿入することによって増加し得る(50)。
【0022】
スクリーニング方法の第一のタイプは、また、以下の方法で実行することができ
る: a)先に説明したように、自殺選択遺伝子の発現を制御する強力なプロモーター
の上流にクローニングされた、酵母核因子Gal4に認識される応答エレメントのい
くつかのコピーを含むプラスミドを創り出す、 b)Gal4のDNA結合ドメインおよびRev-erbのDEFドメインを含むキメラを創り
出す、 c)工程(a)および(b)で得られたプラスミドを宿主細胞にコトランスフェ
クションする、および、 d)工程(c)からの宿主を試験物質の存在下でインキュベートする、 e)毒性のプロドラッグの存在下での生存細胞を任意の適切な手段で測定する。
る: a)先に説明したように、自殺選択遺伝子の発現を制御する強力なプロモーター
の上流にクローニングされた、酵母核因子Gal4に認識される応答エレメントのい
くつかのコピーを含むプラスミドを創り出す、 b)Gal4のDNA結合ドメインおよびRev-erbのDEFドメインを含むキメラを創り
出す、 c)工程(a)および(b)で得られたプラスミドを宿主細胞にコトランスフェ
クションする、および、 d)工程(c)からの宿主を試験物質の存在下でインキュベートする、 e)毒性のプロドラッグの存在下での生存細胞を任意の適切な手段で測定する。
【0023】
このスクリーニング方法の第一のタイプのさらなる例は、Rev-erbを転写機構
、そして特にRNAポリメラーゼ複合体に結合するコファクターおよびコファク
ターの対応する断片(例えば、RIP13d1(51)、N-COR(52)または随意にSM
RTおよびP300/CBP)と相互作用するRev-erb断片を含む酵母または他の細胞にお
ける「二重ハイブリッド(double hybrid)」タイプの系での試験化合物の効果
の量的評価からなる。
、そして特にRNAポリメラーゼ複合体に結合するコファクターおよびコファク
ターの対応する断片(例えば、RIP13d1(51)、N-COR(52)または随意にSM
RTおよびP300/CBP)と相互作用するRev-erb断片を含む酵母または他の細胞にお
ける「二重ハイブリッド(double hybrid)」タイプの系での試験化合物の効果
の量的評価からなる。
【0024】
本発明によるスクリーニング方法の第一のタイプのほかの例は、完全なhRev-e
rbα蛋白質またはいくつかのその断片と、コファクターまたはその断片との間の
相互作用のインビトロでのキャパシティーでの試験化合物の効果を、従来知られ
た任意の技術で(例えば、PPARリガンドスクリーニングのために開発されたCARL
Aアプローチ(45)、共振(resonance)蛍光エネルギー転写の測定によって)
、量的評価をすることからなる。
rbα蛋白質またはいくつかのその断片と、コファクターまたはその断片との間の
相互作用のインビトロでのキャパシティーでの試験化合物の効果を、従来知られ
た任意の技術で(例えば、PPARリガンドスクリーニングのために開発されたCARL
Aアプローチ(45)、共振(resonance)蛍光エネルギー転写の測定によって)
、量的評価をすることからなる。
【0025】
本発明によるスクリーニング方法の第一のタイプの最後の例は、Rev-erbレセ
プターまたはそれらと機能的に同等のものおよび/またはRev-erbレセプター応
答エレメントをコードする遺伝子を備えた構築物で、前記した宿主細胞を形質転
換すること、および次いで、前記宿主細胞またはその抽出物を、コールドのリガ
ンドと標識したリガンドとの間の競合的置換に基づく「結合」試験で用いること
からなる。
プターまたはそれらと機能的に同等のものおよび/またはRev-erbレセプター応
答エレメントをコードする遺伝子を備えた構築物で、前記した宿主細胞を形質転
換すること、および次いで、前記宿主細胞またはその抽出物を、コールドのリガ
ンドと標識したリガンドとの間の競合的置換に基づく「結合」試験で用いること
からなる。
【0026】
本発明の主題はまた、Rev-erbの発現の調節での試験物質の効果を測定するこ
とからなる、脂質代謝機能障害の治療に有用な物質をスクリーニングするための
方法の第二のタイプでもある。
とからなる、脂質代謝機能障害の治療に有用な物質をスクリーニングするための
方法の第二のタイプでもある。
【0027】
Rev-erbの発現の調節を測定することに基づくスクリーニング方法の1つの例
は、インサイチュハイブリダイゼーション(アマシャムテクニック)、RPA、定
量的または判定量的なRT-PCRによって、Rev-erbをコードするmRNAの細胞集
積において、化合物の効果を直接評価することからなる。 Rev-erbの発現の調節の決定の第二の例は、免疫細胞化学、ELISAまたはウェス
タンブロッティングによって、Rev-erb蛋白質の細胞発現での試験物質の効果の
測定からなる。
は、インサイチュハイブリダイゼーション(アマシャムテクニック)、RPA、定
量的または判定量的なRT-PCRによって、Rev-erbをコードするmRNAの細胞集
積において、化合物の効果を直接評価することからなる。 Rev-erbの発現の調節の決定の第二の例は、免疫細胞化学、ELISAまたはウェス
タンブロッティングによって、Rev-erb蛋白質の細胞発現での試験物質の効果の
測定からなる。
【0028】
第二の方法のタイプのさらなる例は、Rev-erb遺伝子プロモーターの活性を間
接的に評価することからなる。この方法は、以下の工程を含む: a)ルシフェラーゼ、CAT、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
成長ホルモンなどの遺伝子などのレポーター遺伝子、または抗生物質に対して、
または非代謝性前駆体の転換酵素(conversion enzyme)に対しての抵抗性遺伝
子などの選択遺伝子の上流にクローニングされたRev-erb遺伝子プロモーター(
31)を含むプラスミドを創り出す、 b)宿主細胞をトランスフェクションする、 c)試験物質を導入する、 d)レポーター遺伝子の活性または生存細胞を、任意の適切な手段で測定する。 Rev-erbプロモーターは、Rev-erb遺伝子の発現を制御し、特に該遺伝子の転写
の自己阻害に応答し得るRev-erb応答エレメントを含む。このプロモーターの断
片を含む構築物は、この遺伝子の発現の調節を含む因子のキャラクタライゼーシ
ョンに利用し得る。
接的に評価することからなる。この方法は、以下の工程を含む: a)ルシフェラーゼ、CAT、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
成長ホルモンなどの遺伝子などのレポーター遺伝子、または抗生物質に対して、
または非代謝性前駆体の転換酵素(conversion enzyme)に対しての抵抗性遺伝
子などの選択遺伝子の上流にクローニングされたRev-erb遺伝子プロモーター(
31)を含むプラスミドを創り出す、 b)宿主細胞をトランスフェクションする、 c)試験物質を導入する、 d)レポーター遺伝子の活性または生存細胞を、任意の適切な手段で測定する。 Rev-erbプロモーターは、Rev-erb遺伝子の発現を制御し、特に該遺伝子の転写
の自己阻害に応答し得るRev-erb応答エレメントを含む。このプロモーターの断
片を含む構築物は、この遺伝子の発現の調節を含む因子のキャラクタライゼーシ
ョンに利用し得る。
【0029】
Rev-erb発現の調節を測定する方法のさらなる例は、Rev-erb遺伝子の内因性プ
ロモーターの活性の測定からなる。この方法は、以下の工程を含む: a)ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼなどのプロドラッグのアクチベーター
などの自殺選択遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を制御する強力なプロモー
ターの上流にクローニングされる、Rev-erbに認識される応答エレメントのいく
つかのコピーを含むプラスミドを創り出す、 b)工程(a)で得られた構築物を宿主細胞へトランスフェクトする、 c)この構築物を発現し、かつhRev-erbαを発現する安定な細胞系統を確立する
、 d)工程(b)または(c)からの宿主を試験物質の存在下でインキュベートす
る、 e)毒性のプロドラッグの存在下での生存細胞またはレポーター遺伝子の活性を
、任意の適切な手段で測定する。
ロモーターの活性の測定からなる。この方法は、以下の工程を含む: a)ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼなどのプロドラッグのアクチベーター
などの自殺選択遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を制御する強力なプロモー
ターの上流にクローニングされる、Rev-erbに認識される応答エレメントのいく
つかのコピーを含むプラスミドを創り出す、 b)工程(a)で得られた構築物を宿主細胞へトランスフェクトする、 c)この構築物を発現し、かつhRev-erbαを発現する安定な細胞系統を確立する
、 d)工程(b)または(c)からの宿主を試験物質の存在下でインキュベートす
る、 e)毒性のプロドラッグの存在下での生存細胞またはレポーター遺伝子の活性を
、任意の適切な手段で測定する。
【0030】
本発明の主題はまた、アポC-IIIの発現を抑制する、したがってヒトまたは動
物の脂質代謝機能障害の治療を目的とする組成物、特に医薬組成物の製剤のため
の物質の使用と同様に、本発明によるスクリーニング方法で選択される物質にあ
る。このような性質を備えた化合物は、アポC-IIIの発現を抑制するそのキャパ
シティーに基づいて選択され、そしてRev-erbまたはRev-erb類似体のリガンドに
なることができ、その性質は、アポC-IIIの発現レベルから直接示されるか、レ
ポーター遺伝子の発現によって、またはRev-erbレセプターと複合体を形成する
それらのキャパシティーで代替的に示される。
物の脂質代謝機能障害の治療を目的とする組成物、特に医薬組成物の製剤のため
の物質の使用と同様に、本発明によるスクリーニング方法で選択される物質にあ
る。このような性質を備えた化合物は、アポC-IIIの発現を抑制するそのキャパ
シティーに基づいて選択され、そしてRev-erbまたはRev-erb類似体のリガンドに
なることができ、その性質は、アポC-IIIの発現レベルから直接示されるか、レ
ポーター遺伝子の発現によって、またはRev-erbレセプターと複合体を形成する
それらのキャパシティーで代替的に示される。
【0031】
したがって、本発明は、さらに一般的に、ヒトまたは動物のアポリポ蛋白質C-
IIIに関連する脂質代謝機能障害の治療および/または予防に有用な組成物、特
に医薬組成物の製剤のためのアポC-IIIの発現を調節し得る物質の使用に関する
。 さらに詳しくは、本発明は、ヒトまたは動物の脂質代謝機能障害の治療および
/または予防に有用な医薬組成物の製剤のための、Rev-erbレセプターまたはそ
の応答エレメントに結合し得る物質の使用に関する。 本発明は、また、ヒトまたは動物のアポリポ蛋白質C-IIIに関連する脂質代謝
機能障害の治療および/または予防に有用な組成物、特に医薬組成物の製剤のた
めRev-erbレセプターをコードする遺伝子の発現を調節し得る物質の使用に関す
る。 ヒトまたは動物のアポリポ蛋白質C-IIIに関連する脂質代謝機能障害として、
高脂血症、糖尿病に関連する合併症、肥満、X症候群、またはインシュリン耐性
および心臓病および冠状動脈性心臓病があげられる。
IIIに関連する脂質代謝機能障害の治療および/または予防に有用な組成物、特
に医薬組成物の製剤のためのアポC-IIIの発現を調節し得る物質の使用に関する
。 さらに詳しくは、本発明は、ヒトまたは動物の脂質代謝機能障害の治療および
/または予防に有用な医薬組成物の製剤のための、Rev-erbレセプターまたはそ
の応答エレメントに結合し得る物質の使用に関する。 本発明は、また、ヒトまたは動物のアポリポ蛋白質C-IIIに関連する脂質代謝
機能障害の治療および/または予防に有用な組成物、特に医薬組成物の製剤のた
めRev-erbレセプターをコードする遺伝子の発現を調節し得る物質の使用に関す
る。 ヒトまたは動物のアポリポ蛋白質C-IIIに関連する脂質代謝機能障害として、
高脂血症、糖尿病に関連する合併症、肥満、X症候群、またはインシュリン耐性
および心臓病および冠状動脈性心臓病があげられる。
【0032】
本発明の主題はまた、Rev-erbレセプターおよび/またはそれらの応答エレメ
ントを用いて抗アテローム性動脈硬化の特性を備えた物質の活性メカニズム、並
びにアポC-IIIへの効果をキャラクタライズし、正当化し、主張するための、本
発明の出願で先に記載したスクリーニング方法の使用に関する。 本発明の他の利点および特性は、hRev-erbαレセプターによるヒトアポC-IIIの
発現の調節を記載した、つづく例で明らかになるだろう。
ントを用いて抗アテローム性動脈硬化の特性を備えた物質の活性メカニズム、並
びにアポC-IIIへの効果をキャラクタライズし、正当化し、主張するための、本
発明の出願で先に記載したスクリーニング方法の使用に関する。 本発明の他の利点および特性は、hRev-erbαレセプターによるヒトアポC-IIIの
発現の調節を記載した、つづく例で明らかになるだろう。
【0033】
I.方法
1.細胞培養
HepG2系統(ヒト肝臓癌)は、E.C.A.C.C.(ポートン ダウン、サ
リスベリー、イギリス)からで、一方、RK13(ウサギ腎臓)細胞は、C.L
agros(シュテーリン(Stehelin)博士の研究室)によって提供された。こ
れらの系統は、標準的な培養条件(10%ウシ胎仔血清添加ダルベッコ改変イー
グル基本培地、5%CO2/95%空気の湿潤雰囲気下、37℃でインキュベー
ト)のもとで維持された。培地は、2日ごとに取り替える。
リスベリー、イギリス)からで、一方、RK13(ウサギ腎臓)細胞は、C.L
agros(シュテーリン(Stehelin)博士の研究室)によって提供された。こ
れらの系統は、標準的な培養条件(10%ウシ胎仔血清添加ダルベッコ改変イー
グル基本培地、5%CO2/95%空気の湿潤雰囲気下、37℃でインキュベー
ト)のもとで維持された。培地は、2日ごとに取り替える。
【0034】
2.組換えプラスミドの構築
アポC-III遺伝子のためのプロモーター活性は、レポーター遺伝子を用いた分
野の標準的な手法にしたがって研究された。CATレポーター遺伝子の上流にクロ
ーニングされたヒトアポC-III遺伝子のためのプロモーターの断片を含む構築物-
1415/+24WT-CATおよび−198/+24WT-CATは、すでに記載されている(56)。こ
れら構築物のCATレポーター遺伝子とLuc+レポーター遺伝子とを交換するために
、レポーターベクターpGL3(プロメガ社(Promega))のルシフェラーゼのレポ
ーター遺伝子Luc+を酵素Sac IおよびBamH Iで切り出し、ベクターpBKCMV(スト
ラタジーン社(Stratagene))の対応するサイトにサブクローニングし、ベクタ
ーpBKCMV-Luc+を形成した。構築物-1415/+24WT-CATのCATレポーター遺伝子は、
酵素Kpn IおよびBamH Iで切り出した。次に、それを酵素Bgl IIおよびKpn Iによ
るプラスミドpBKCMV-Luc+の消化によって得られたLuc+レポーター遺伝子で置き
換えて、プラスミド-1415/+24WT-Luc+を作り出した。これを酵素Pst Iで消化し
、再びセルフライゲーションして、-198/+24WT-Luc+を構築した。プラスミド-14
15/+24WT-Luc+は、アポC-IIIプロモーターを切り出すためにHind IIIで消化した
。次いで、得られたDNA断片をプラスミドpGL3(プロメガ社(Promega))お
よびpSL301(ファルマシア社(Pharmacia))のHind IIIサイトへ挿入して、構
築物-1415/+24WTpGL3および-1415/+24WTpSL301を作り出した。インサートの方
向は、シークエンスを決めることにより明確にした。構築物-198/+24WTpGL3は
、構築物-1415/+24WTpGL3をPst Iで消化し、再びライゲーションすることによ
って得られた。構築物-1415/+24WTpSL301を酵素Eco O109Iで部分消化し、再び
セルフライゲーションをして、構築物-108/+24WTpSL301を作り出した。アポC-I
IIプロモーターの断片-108/+24は、この構築物から酵素Xma IおよびHind IIIで
切り出され、ベクターpGL3の対応するサイトにクローニングして、構築物-108/
+24WTpGL3を作り出した。ヒトアポC-IIIプロモーターの断片-82/+24は、プライ
マーhCIIIF33および512を使い、構築物-1415/+24pGL3を基質として用いたPC
Rによって増幅した。得られた産物は、酵素Sac IおよびHind IIIで消化し、プ
ラスミドpGL3の対応するサイトにクローニングし、構築物-82/+24WTpGL3を得
た。構築物-64/+24WTpGL3を製造するために、構築物-1415/+24pGL3を酵素BstX
Iで完全に消化し、DNAポリメラーゼのクレノー断片処理により平滑化し、酵
素Sma Iで消化し、再びセルフライゲーションした。構築物-62/+24WTpGL3を作
り出すために、構築物-1415/+24WTpSL301を酵素Eco O109Iで完全に消化し、D
NAポリメラーゼのクレノー断片処理により平滑化し、再びセルフライゲーショ
ンした。次いで、アポC-IIIプロモーターの断片-62/+24をこの構築物から酵素Xm
a IおよびHind IIIで切り出し、ベクターpGL3の対応するサイトにクローニング
した。アポC-IIIプロモーターの点変異体-1415/+24TaTaKOpGL3、-198/+24TaTaK
OpGL3および-82/+24TaTaKOpGL3は、オリゴヌクレオチドhCIIIF29/hCIIIR29お
よび対応する野生型の構築物を気質として用いて、製造者の説明にしたがって、
「クイック チェンジ サイト ディレクテッド ミュータジェネシス キット
(quick change site directed mutagenesis kit)」(ストラタジーン社(Stra
tagene))を用いて得た。 表1に用いたオリゴヌクレオチドの配列を対照する。
野の標準的な手法にしたがって研究された。CATレポーター遺伝子の上流にクロ
ーニングされたヒトアポC-III遺伝子のためのプロモーターの断片を含む構築物-
1415/+24WT-CATおよび−198/+24WT-CATは、すでに記載されている(56)。こ
れら構築物のCATレポーター遺伝子とLuc+レポーター遺伝子とを交換するために
、レポーターベクターpGL3(プロメガ社(Promega))のルシフェラーゼのレポ
ーター遺伝子Luc+を酵素Sac IおよびBamH Iで切り出し、ベクターpBKCMV(スト
ラタジーン社(Stratagene))の対応するサイトにサブクローニングし、ベクタ
ーpBKCMV-Luc+を形成した。構築物-1415/+24WT-CATのCATレポーター遺伝子は、
酵素Kpn IおよびBamH Iで切り出した。次に、それを酵素Bgl IIおよびKpn Iによ
るプラスミドpBKCMV-Luc+の消化によって得られたLuc+レポーター遺伝子で置き
換えて、プラスミド-1415/+24WT-Luc+を作り出した。これを酵素Pst Iで消化し
、再びセルフライゲーションして、-198/+24WT-Luc+を構築した。プラスミド-14
15/+24WT-Luc+は、アポC-IIIプロモーターを切り出すためにHind IIIで消化した
。次いで、得られたDNA断片をプラスミドpGL3(プロメガ社(Promega))お
よびpSL301(ファルマシア社(Pharmacia))のHind IIIサイトへ挿入して、構
築物-1415/+24WTpGL3および-1415/+24WTpSL301を作り出した。インサートの方
向は、シークエンスを決めることにより明確にした。構築物-198/+24WTpGL3は
、構築物-1415/+24WTpGL3をPst Iで消化し、再びライゲーションすることによ
って得られた。構築物-1415/+24WTpSL301を酵素Eco O109Iで部分消化し、再び
セルフライゲーションをして、構築物-108/+24WTpSL301を作り出した。アポC-I
IIプロモーターの断片-108/+24は、この構築物から酵素Xma IおよびHind IIIで
切り出され、ベクターpGL3の対応するサイトにクローニングして、構築物-108/
+24WTpGL3を作り出した。ヒトアポC-IIIプロモーターの断片-82/+24は、プライ
マーhCIIIF33および512を使い、構築物-1415/+24pGL3を基質として用いたPC
Rによって増幅した。得られた産物は、酵素Sac IおよびHind IIIで消化し、プ
ラスミドpGL3の対応するサイトにクローニングし、構築物-82/+24WTpGL3を得
た。構築物-64/+24WTpGL3を製造するために、構築物-1415/+24pGL3を酵素BstX
Iで完全に消化し、DNAポリメラーゼのクレノー断片処理により平滑化し、酵
素Sma Iで消化し、再びセルフライゲーションした。構築物-62/+24WTpGL3を作
り出すために、構築物-1415/+24WTpSL301を酵素Eco O109Iで完全に消化し、D
NAポリメラーゼのクレノー断片処理により平滑化し、再びセルフライゲーショ
ンした。次いで、アポC-IIIプロモーターの断片-62/+24をこの構築物から酵素Xm
a IおよびHind IIIで切り出し、ベクターpGL3の対応するサイトにクローニング
した。アポC-IIIプロモーターの点変異体-1415/+24TaTaKOpGL3、-198/+24TaTaK
OpGL3および-82/+24TaTaKOpGL3は、オリゴヌクレオチドhCIIIF29/hCIIIR29お
よび対応する野生型の構築物を気質として用いて、製造者の説明にしたがって、
「クイック チェンジ サイト ディレクテッド ミュータジェネシス キット
(quick change site directed mutagenesis kit)」(ストラタジーン社(Stra
tagene))を用いて得た。 表1に用いたオリゴヌクレオチドの配列を対照する。
【0035】
【表1】
【0036】
【表2】
【0037】
【表3】
【0038】
プラスミドTk-Luc+は、プラスミドpBKCMV-Luc+を酵素Bgl IIおよびKpn Iで消
化して得られたLuc+レポーター遺伝子を、Bgl IIおよびKpn Iで開裂したベクタ
ーpBLCAT4(32)に、CATレポーター遺伝子に置き換えて、挿入することによ
って構築した。構築物(RevDR2)3XTkLuc+(図12bにおいて、RevDR2TkLuc+
として示されている)は、対応する構築物のCATレポーター遺伝子とLuc+レポー
ター遺伝子(Bgl II/EcoR I消化)とを交換することによって得た。対応するCAT
構築物は、オリゴヌクレオチド1129および1142(表1)を用いて、先に記載され
たストラテジー(57)により得た。プラスミドpTkpGL3は、プライマー514お
よび510(表1)を用いて、プラスミドpBLCAT4に存在する単純ヘルペスウイル
スのチミジンキナーゼプロモーター断片のPCR増幅によって構築した。次いで
、得られたPCR断片は、酵素Bgl IIおよびHind IIIで消化し、ベクターpGL3
の対応するサイトへ挿入した。構築物(-58/-27)8XTkpGL3および(-47/-79)
1XTkpGL3は、それぞれオリゴヌクレオチドhCIIIF15/hCIIIR15およびhCIIIF17
/hCIIIR17を用いて、先に記載されたストラテジー(57)にしたがって得た。
ベクターpic20Hの中間の構築物を酵素Sal IおよびXho Iで消化した。次いで、
インサートはベクターTkpGL3のXho Iサイトへクローニングされ、その方向はシ
ークエンスを決めることにより明確にした。先に記載されたストラテジー(57
)にしたがって、研究された核のレセプターに対する応答エレメント(elements
of response)を含むであろうDNA断片のいくつかの確認されたコピーを一段
階で挿入するために、構築物pTkpGL3を酵素BamH Iで消化し、DNAポリメラ
ーゼのクレノー断片処理で平滑化し、再びセルフライゲーションした(ベクター
TkpGL3BKO)。構築物(-33/-16)3XTkpGL3、(-33/-16TaTaKO)3XTkpGL3
、(-109/-62)1XTkpGL3、(-100/-80)3XTkpGL3、(-87/-67)3XTkpG
L3および(-87/-67C3P3’KO)3XTkpGL3は、それぞれオリゴヌクレオチドhCII
IF34とhCIIIR34、hCIIIF35とhCIIIR35、hCIIIF21とhCIIIR21、hCIIIF38とhCIIIR
38、hCIIIF36とhCIIIR36、hCIIIF37とhCIIIR37を用いて、先に記載されたストラ
テジー(57)にしたがって、ベクターTkpGL3BKOへクローニングすることによ
って得られた。プラスミドpG5TkpGL3は、酵母の転写因子Gal4(サイト17 m)
(49)の応答エレメントの5コピーをプラスミドTkpGL3のTkプロモーター上
流へ挿入することによって得た。
化して得られたLuc+レポーター遺伝子を、Bgl IIおよびKpn Iで開裂したベクタ
ーpBLCAT4(32)に、CATレポーター遺伝子に置き換えて、挿入することによ
って構築した。構築物(RevDR2)3XTkLuc+(図12bにおいて、RevDR2TkLuc+
として示されている)は、対応する構築物のCATレポーター遺伝子とLuc+レポー
ター遺伝子(Bgl II/EcoR I消化)とを交換することによって得た。対応するCAT
構築物は、オリゴヌクレオチド1129および1142(表1)を用いて、先に記載され
たストラテジー(57)により得た。プラスミドpTkpGL3は、プライマー514お
よび510(表1)を用いて、プラスミドpBLCAT4に存在する単純ヘルペスウイル
スのチミジンキナーゼプロモーター断片のPCR増幅によって構築した。次いで
、得られたPCR断片は、酵素Bgl IIおよびHind IIIで消化し、ベクターpGL3
の対応するサイトへ挿入した。構築物(-58/-27)8XTkpGL3および(-47/-79)
1XTkpGL3は、それぞれオリゴヌクレオチドhCIIIF15/hCIIIR15およびhCIIIF17
/hCIIIR17を用いて、先に記載されたストラテジー(57)にしたがって得た。
ベクターpic20Hの中間の構築物を酵素Sal IおよびXho Iで消化した。次いで、
インサートはベクターTkpGL3のXho Iサイトへクローニングされ、その方向はシ
ークエンスを決めることにより明確にした。先に記載されたストラテジー(57
)にしたがって、研究された核のレセプターに対する応答エレメント(elements
of response)を含むであろうDNA断片のいくつかの確認されたコピーを一段
階で挿入するために、構築物pTkpGL3を酵素BamH Iで消化し、DNAポリメラ
ーゼのクレノー断片処理で平滑化し、再びセルフライゲーションした(ベクター
TkpGL3BKO)。構築物(-33/-16)3XTkpGL3、(-33/-16TaTaKO)3XTkpGL3
、(-109/-62)1XTkpGL3、(-100/-80)3XTkpGL3、(-87/-67)3XTkpG
L3および(-87/-67C3P3’KO)3XTkpGL3は、それぞれオリゴヌクレオチドhCII
IF34とhCIIIR34、hCIIIF35とhCIIIR35、hCIIIF21とhCIIIR21、hCIIIF38とhCIIIR
38、hCIIIF36とhCIIIR36、hCIIIF37とhCIIIR37を用いて、先に記載されたストラ
テジー(57)にしたがって、ベクターTkpGL3BKOへクローニングすることによ
って得られた。プラスミドpG5TkpGL3は、酵母の転写因子Gal4(サイト17 m)
(49)の応答エレメントの5コピーをプラスミドTkpGL3のTkプロモーター上
流へ挿入することによって得た。
【0039】
対応する核レセプターの外因性発現を可能にするプラスミドpSG5-hHNF4、p
SG5-hRev-erbα、pSG5-cRev-erbβおよびpCMX-hRORα1が、先に記載したよう
に得られた(25、31、34、35)。プラスミドpGal4-φは、プラスミド
pBD-Gal4(ストラタジーン社(Stratagene))にある酵母の転写因子Gal4のD
NA結合ドメインをベクターpCDNA3のHind IIIおよびEcoR Iサイトへサブクロ
ーニングすることで構築した。プラスミドpBDGal4-hRev-erbαDEFを生み出すた
めに、プラスミドpSG5-hRev-erbαを酵素Xho IおよびBamH Iで開裂し、ベクタ
ーpBKCMVの対応するサイトへクローニングした。したがって、得られたプラス
ミドを、次いで酵素Xho Iで消化し、DNAポリメラーゼのクレノー断片処理に
よって平滑化し、酵素Sep Iで消化した。次いで、このインサートを、事前にEco
R Iで制限酵素処理したベクターpGal4-φへクローニングし、DNAポリメラー
ゼのクレノー断片処理によって平滑化し、Xba Iで消化し、プラスミドpGal4-hR
ev-erbαDEFを作り出した。すべての構築物はシークエンスを決めることで確認
した。
SG5-hRev-erbα、pSG5-cRev-erbβおよびpCMX-hRORα1が、先に記載したよう
に得られた(25、31、34、35)。プラスミドpGal4-φは、プラスミド
pBD-Gal4(ストラタジーン社(Stratagene))にある酵母の転写因子Gal4のD
NA結合ドメインをベクターpCDNA3のHind IIIおよびEcoR Iサイトへサブクロ
ーニングすることで構築した。プラスミドpBDGal4-hRev-erbαDEFを生み出すた
めに、プラスミドpSG5-hRev-erbαを酵素Xho IおよびBamH Iで開裂し、ベクタ
ーpBKCMVの対応するサイトへクローニングした。したがって、得られたプラス
ミドを、次いで酵素Xho Iで消化し、DNAポリメラーゼのクレノー断片処理に
よって平滑化し、酵素Sep Iで消化した。次いで、このインサートを、事前にEco
R Iで制限酵素処理したベクターpGal4-φへクローニングし、DNAポリメラー
ゼのクレノー断片処理によって平滑化し、Xba Iで消化し、プラスミドpGal4-hR
ev-erbαDEFを作り出した。すべての構築物はシークエンスを決めることで確認
した。
【0040】
3.ヒトアポC-IIIプロモーターの一過性トランスフェクションおよび活性の測
定 核レセプターの活性は、レポーター遺伝子/コトランスフェクションの標準的
な手法によって測定した。DNAは、実験室で一般的に利用可能な手法(リン酸
カルシウム、エレクトロポレーション、リポフェクションなど)によって研究さ
れる細胞へ導入した。ネガティブコントロールとして、ベクターpSG5、pCDNA3
およびpCMXを用いた。リン酸カルシウム沈殿の手法を用いて行った実験におい
て、60mmの培養皿にプレートアウトされた(plated out)細胞を50〜60
%コンフルエンス(confluence)で、一般的にレポータープラスミドCAT、Luc+
またはpGL3(0.5μg/60mmディッシュ)ならびに発現ベクターpSG5-hR
ev-erbα、pCMX-hRORα1およびpSG5-hHNF4(0.1〜1μg/60mmディッ
シュ)に加えて、トランスフェクション効率のコントロールとして用いる0.1
μg/60mmディッシュのpCMV-β-galプラスミド(クロンテック社(Clonte
ch))を含むプラスミド混合物で、トランスフェクションした(36)。5から
6時間後、細胞を洗浄緩衝液(0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウ
ム、pH 7.2)で2回洗浄し、10%ウシ胎仔血清を含むフレッシュな培地で
36時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞を溶解し、ルシフ
ェラーゼ活性とβ-ガラクトシダーゼ活性を、標準的なプロトコール(37)に
したがい測定した。リポフェクションによって行った実験のために、細胞をウェ
ルあたり10,000細胞の割合で24-ウェルディッシュにプレートアウトし、
トランスフェクションの前に37℃で16時間インキュベートした。次いで、細
胞をカチオン性脂質を用いて、血清フリーの培地において、37℃で2時間トラ
ンスフェクションした。プラスミド(レポーターベクター:50ng/ウェル;
発現ベクター:100ng/ウェル、トランスフェクション効率コントロールベ
クター:pSV-βgal(プロメガ社(Promega))(50ng/ウェル)およびD
NAエントレイナー(entrainer)(トランスフェクションするDNA量を50
0ng/ウェルにするように加えたpBluescript(ストラタジーン社(Stratage
ne)))を、NaCl(150mM)、炭酸水素ナトリウム(50mM)および
カチオン性脂質(6nmol/μgDNA)を添加した血清フリーのDMEMに
溶解し、スピンダウンし、室温で30分間インキュベートし、細胞に加えた。2
時間のインキュベーションの後、細胞を前述の洗浄緩衝液でリンスし、10%の
ウシ胎仔血清を含んだフレッシュな培地で36時間インキュベートした。実験後
、細胞を洗浄緩衝液でリンスし、プロメガ社(Promega)の「デュアル-ルシフェ
ラーゼ(登録商標) レポーター アッセイ システム(Dual-LuciferaseTM Re
porter Assay System)」キットを用いて、製造者の説明にしたがいルシフェラ
ーゼ活性を測定した。得られた抽出物の蛋白質含量は、「バイオ-ラド プロテ
イン アッセイ(Bio-Rad Protein Assay)」キット(バイオ-ラド社(Bio-Rad
))を用いて、ブラッドフォード法で分析した。
定 核レセプターの活性は、レポーター遺伝子/コトランスフェクションの標準的
な手法によって測定した。DNAは、実験室で一般的に利用可能な手法(リン酸
カルシウム、エレクトロポレーション、リポフェクションなど)によって研究さ
れる細胞へ導入した。ネガティブコントロールとして、ベクターpSG5、pCDNA3
およびpCMXを用いた。リン酸カルシウム沈殿の手法を用いて行った実験におい
て、60mmの培養皿にプレートアウトされた(plated out)細胞を50〜60
%コンフルエンス(confluence)で、一般的にレポータープラスミドCAT、Luc+
またはpGL3(0.5μg/60mmディッシュ)ならびに発現ベクターpSG5-hR
ev-erbα、pCMX-hRORα1およびpSG5-hHNF4(0.1〜1μg/60mmディッ
シュ)に加えて、トランスフェクション効率のコントロールとして用いる0.1
μg/60mmディッシュのpCMV-β-galプラスミド(クロンテック社(Clonte
ch))を含むプラスミド混合物で、トランスフェクションした(36)。5から
6時間後、細胞を洗浄緩衝液(0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウ
ム、pH 7.2)で2回洗浄し、10%ウシ胎仔血清を含むフレッシュな培地で
36時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞を溶解し、ルシフ
ェラーゼ活性とβ-ガラクトシダーゼ活性を、標準的なプロトコール(37)に
したがい測定した。リポフェクションによって行った実験のために、細胞をウェ
ルあたり10,000細胞の割合で24-ウェルディッシュにプレートアウトし、
トランスフェクションの前に37℃で16時間インキュベートした。次いで、細
胞をカチオン性脂質を用いて、血清フリーの培地において、37℃で2時間トラ
ンスフェクションした。プラスミド(レポーターベクター:50ng/ウェル;
発現ベクター:100ng/ウェル、トランスフェクション効率コントロールベ
クター:pSV-βgal(プロメガ社(Promega))(50ng/ウェル)およびD
NAエントレイナー(entrainer)(トランスフェクションするDNA量を50
0ng/ウェルにするように加えたpBluescript(ストラタジーン社(Stratage
ne)))を、NaCl(150mM)、炭酸水素ナトリウム(50mM)および
カチオン性脂質(6nmol/μgDNA)を添加した血清フリーのDMEMに
溶解し、スピンダウンし、室温で30分間インキュベートし、細胞に加えた。2
時間のインキュベーションの後、細胞を前述の洗浄緩衝液でリンスし、10%の
ウシ胎仔血清を含んだフレッシュな培地で36時間インキュベートした。実験後
、細胞を洗浄緩衝液でリンスし、プロメガ社(Promega)の「デュアル-ルシフェ
ラーゼ(登録商標) レポーター アッセイ システム(Dual-LuciferaseTM Re
porter Assay System)」キットを用いて、製造者の説明にしたがいルシフェラ
ーゼ活性を測定した。得られた抽出物の蛋白質含量は、「バイオ-ラド プロテ
イン アッセイ(Bio-Rad Protein Assay)」キット(バイオ-ラド社(Bio-Rad
))を用いて、ブラッドフォード法で分析した。
【0041】
4.ゲル・リタデーション
プロメガ社(Promega)のキット「TnT T7 クイック カップルド トランス
クリプション/トランスレイション システム(TnT T7 quick coupled transcr
iption/translation system)」を用いて網状赤血球ライセート法により、プラ
スミドpsG5-hRev-erbαから、インビトロで蛋白質hRev-erbαを合成した。ゲル
・リタデーション(gel retardation)実験は、先に記載されたプロトコール(
43、44、46)にしたがって、表2に記載したプローブとして用いた2本鎖
DNAを合成するために用いたオリゴヌクレオチドを用いて行った。
クリプション/トランスレイション システム(TnT T7 quick coupled transcr
iption/translation system)」を用いて網状赤血球ライセート法により、プラ
スミドpsG5-hRev-erbαから、インビトロで蛋白質hRev-erbαを合成した。ゲル
・リタデーション(gel retardation)実験は、先に記載されたプロトコール(
43、44、46)にしたがって、表2に記載したプローブとして用いた2本鎖
DNAを合成するために用いたオリゴヌクレオチドを用いて行った。
【0042】
【表4】
【0043】
2本鎖のオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション緩衝液(50mM
トリス塩酸 pH8、50mM KCl、5mM MgCl2、10mM DTT)
に希釈した2.5または5μgのセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチ
ドを100℃で10分間、次いで65℃で10分間、そして混合物をゆっくりと
室温に冷まして、インキュベートすることによって得た。 バインディング緩衝液は次の組成: 10mM Hepes、80mM KCl、5%グリセロール、10mM DTT
、0.1μg/μl ポリdIdC、50ng/μl ニシン精子DNA、1μg
/μl ウシ血清アルブミン、網状赤血球ライセート:10% を有する。
トリス塩酸 pH8、50mM KCl、5mM MgCl2、10mM DTT)
に希釈した2.5または5μgのセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチ
ドを100℃で10分間、次いで65℃で10分間、そして混合物をゆっくりと
室温に冷まして、インキュベートすることによって得た。 バインディング緩衝液は次の組成: 10mM Hepes、80mM KCl、5%グリセロール、10mM DTT
、0.1μg/μl ポリdIdC、50ng/μl ニシン精子DNA、1μg
/μl ウシ血清アルブミン、網状赤血球ライセート:10% を有する。
【0044】
5.動物モデル
ブジョルン ベンストロン(Bjorn Vennstrom)の率いるチーム(発生生物学
研究室、CMB、カロリンスカ研究所(Karolinska Institute)、ストックホルム
、スウェーデン)によって、相同組換えによってRev-erbαが破壊されたマウス
(Rev-erbα KO)が得られた(BalbCのバックグランドで交配されたSV1290laHsd
のバックグラウンド)(Chomez, P., Neveu, I., Mansen, A., Keisler, E., La
rsson, L., Vennstrom, B., Arenas, E., 刊行のために提出した)。ブジョルン
ベンストロンが、本発明者らに、チャウダイエット(Chow diet)を与えてい
る(-/-)または野生型(+/+)Rev-erbα KO形質転換マウスからの血液試料およ
び肝臓試料を提供した。血液および組織は4時間の断食の後に採取した。血液は
尾の血管から採り、血清は4℃、25分間、12,000回転/分の遠心分離の
後、回収し、4℃で保存し、脂質パラメーター、リポ蛋白質およびアポリポ蛋白
質の分析に用いた。CO2による麻酔の後、マウスは屠殺され、組織試料が採ら
れ、液体窒素で凍結され、RNA分析のために−80℃で保存された。
研究室、CMB、カロリンスカ研究所(Karolinska Institute)、ストックホルム
、スウェーデン)によって、相同組換えによってRev-erbαが破壊されたマウス
(Rev-erbα KO)が得られた(BalbCのバックグランドで交配されたSV1290laHsd
のバックグラウンド)(Chomez, P., Neveu, I., Mansen, A., Keisler, E., La
rsson, L., Vennstrom, B., Arenas, E., 刊行のために提出した)。ブジョルン
ベンストロンが、本発明者らに、チャウダイエット(Chow diet)を与えてい
る(-/-)または野生型(+/+)Rev-erbα KO形質転換マウスからの血液試料およ
び肝臓試料を提供した。血液および組織は4時間の断食の後に採取した。血液は
尾の血管から採り、血清は4℃、25分間、12,000回転/分の遠心分離の
後、回収し、4℃で保存し、脂質パラメーター、リポ蛋白質およびアポリポ蛋白
質の分析に用いた。CO2による麻酔の後、マウスは屠殺され、組織試料が採ら
れ、液体窒素で凍結され、RNA分析のために−80℃で保存された。
【0045】
6.脂質パラメーター、リポ蛋白質およびアポリポ蛋白質の分析
血清脂質およびアポリポ蛋白質は、商業的に利用できる試薬を用いて、マイク
ロタイトレーションプレートを適合した酵素テストによって測定された。フルチ
ャート博士(Prof. Fruchart)の研究室で作製したポリクローナル抗体を用いて
、免疫比濁法(immunonephelemetry)により血清中のアポC-IIIのレベルを測った
。リポ蛋白質のコレステロールおよびトリグリセリドのプロファイルは、「高速
蛋白質液体クロマトグラフィー(Fast Protein Liquid Chromatography)」(F
PLC)により得られた。一定の流速(0.01%EDTAおよび0.01%Na
N3を添加したリン酸緩衝液(10mM、pH 7.4)の0.2ml/分)で、S
uperose 6HR 10/30 カラム(ファルマシア社(Pharmacia))を用いて、排除ク
ロマトグラフィー(exclusion chromatography)により、血清リポ蛋白質(血清
の典型の平均の200μlプール)を分離した。溶出液の光学密度は、280n
mで測定した。0.27mlのフラクションを採取し、これらフラクションに存
在するコレステロールおよびトリグリセリドの全量を測定した。
ロタイトレーションプレートを適合した酵素テストによって測定された。フルチ
ャート博士(Prof. Fruchart)の研究室で作製したポリクローナル抗体を用いて
、免疫比濁法(immunonephelemetry)により血清中のアポC-IIIのレベルを測った
。リポ蛋白質のコレステロールおよびトリグリセリドのプロファイルは、「高速
蛋白質液体クロマトグラフィー(Fast Protein Liquid Chromatography)」(F
PLC)により得られた。一定の流速(0.01%EDTAおよび0.01%Na
N3を添加したリン酸緩衝液(10mM、pH 7.4)の0.2ml/分)で、S
uperose 6HR 10/30 カラム(ファルマシア社(Pharmacia))を用いて、排除ク
ロマトグラフィー(exclusion chromatography)により、血清リポ蛋白質(血清
の典型の平均の200μlプール)を分離した。溶出液の光学密度は、280n
mで測定した。0.27mlのフラクションを採取し、これらフラクションに存
在するコレステロールおよびトリグリセリドの全量を測定した。
【0046】
形質転換マウスの肝臓のRNAの抽出、ノーザンおよびドットブロットの調製
およびハイブリダイゼーションおよびアポC-IIIのmRNAレベルの測定は、先
に記載されたプロトコール(38)にしたがって行った。ヒトPO酸性リボソーム
リン蛋白質(39)、GAPDH(40)、β-アクチン(41)、またはラットアポ
C−III(38)をコードするクローン36B4のcDNAを対照として用いた。cD
NAプローブはベーリンガーマンハイム社(Boehringer Mannheim)が供給する
ランダムプライマーを用いて32Pでラベルした。メンブレンは、先に記載され
たプロトコール(42)にしたがって、それぞれのプローブ1.5×106cm
p/mlでハイブリダイゼーションした。それらを0.5×SSC緩衝液と0.1
%SDSで、室温で10分間、1度洗浄し、同じ緩衝液で、65℃で30分間、
2度洗浄し、次いで、オートラジオグラフィーを行った(X-OMAT-ARフィルム、
コダック社(Kodak))。オートラジオグラフは、デンシトメーター(Biorad GS
670 デンシトメーター)で分析した。結果は、用いた対照のプローブのmRNA
のレベルに対して標準化した(42)。
およびハイブリダイゼーションおよびアポC-IIIのmRNAレベルの測定は、先
に記載されたプロトコール(38)にしたがって行った。ヒトPO酸性リボソーム
リン蛋白質(39)、GAPDH(40)、β-アクチン(41)、またはラットアポ
C−III(38)をコードするクローン36B4のcDNAを対照として用いた。cD
NAプローブはベーリンガーマンハイム社(Boehringer Mannheim)が供給する
ランダムプライマーを用いて32Pでラベルした。メンブレンは、先に記載され
たプロトコール(42)にしたがって、それぞれのプローブ1.5×106cm
p/mlでハイブリダイゼーションした。それらを0.5×SSC緩衝液と0.1
%SDSで、室温で10分間、1度洗浄し、同じ緩衝液で、65℃で30分間、
2度洗浄し、次いで、オートラジオグラフィーを行った(X-OMAT-ARフィルム、
コダック社(Kodak))。オートラジオグラフは、デンシトメーター(Biorad GS
670 デンシトメーター)で分析した。結果は、用いた対照のプローブのmRNA
のレベルに対して標準化した(42)。
【0047】
II.結果
1.hRev-erbαが、HepG2およびRK13細胞のヒトアポC-IIIプロモーターの活性を 抑制する。
HepG2細胞を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子(-1415/+24WThCIIILuc+)の
ヒトアポC−IIIプロモーター上流断片(-1415/+24)を含むプラスミドと、Rev-e
rbα核レセプターの外因性の発現を可能にするプラスミドpSG5-hRev-erbαとを
コトランスフェクションした場合、レポーター遺伝子活性において、50%の減
少が観察される(図1)。RK13(ウサギ腎臓)細胞を、これら同じ構築物でコト
ランスフェクションした場合、同様の結果が観察される(図2、3)。表現型が
HepG2細胞の表現型に比べて、より安定しているこのモデルは、hRev-erbαおよ
びそのアイソフォームの効果のキャラクタライゼーションのために好ましいだろ
う。加えて、hRev-erbαの効果は、トランスフェクションされた発現ベクターの
量に依存しており(図1、3および4)、そして用いたトランスフェクションの
プロトコールに依存しない(リン酸カルシウムによるDNAの沈殿(図1から3
)またはリポフェクション(図4と続きの図))。2番目の方法によるトランス
フェクション効率が高いこと、用いたDNA量をずっと少なくすることができる
こと、およびトランスフェクションがDNAに乗る過剰なインサートの存在下で
行うことができることから、後者の方法が好ましい。結局、ヒトアポC-IIIプロ
モーターの断片-1414/+24の活性でのhRev-erbαの効果もまた、他のレポーター
遺伝子(例えば、CAT)(データ示さず)とともに、例えば、pBLCAT5(図1お
よび3)またはpGL3(図2、4と続きの図)などの骨格の異なるレポータープ
ラスミドとともに、またはpCDNA3(データ示さず)などの他の発現ベクターと
ともに観察される。hRev-erbαの効果は強い。当該分野で広く用いられるベクタ
ーpGL3は以下の研究のために好ましい。 これらの結果は、ヒトアポC-IIIプロモーターの活性を減ずることが可能な、
このプロモーターでのhRev-erbα核レセプターに対する応答エレメントの存在を
示唆している。
ヒトアポC−IIIプロモーター上流断片(-1415/+24)を含むプラスミドと、Rev-e
rbα核レセプターの外因性の発現を可能にするプラスミドpSG5-hRev-erbαとを
コトランスフェクションした場合、レポーター遺伝子活性において、50%の減
少が観察される(図1)。RK13(ウサギ腎臓)細胞を、これら同じ構築物でコト
ランスフェクションした場合、同様の結果が観察される(図2、3)。表現型が
HepG2細胞の表現型に比べて、より安定しているこのモデルは、hRev-erbαおよ
びそのアイソフォームの効果のキャラクタライゼーションのために好ましいだろ
う。加えて、hRev-erbαの効果は、トランスフェクションされた発現ベクターの
量に依存しており(図1、3および4)、そして用いたトランスフェクションの
プロトコールに依存しない(リン酸カルシウムによるDNAの沈殿(図1から3
)またはリポフェクション(図4と続きの図))。2番目の方法によるトランス
フェクション効率が高いこと、用いたDNA量をずっと少なくすることができる
こと、およびトランスフェクションがDNAに乗る過剰なインサートの存在下で
行うことができることから、後者の方法が好ましい。結局、ヒトアポC-IIIプロ
モーターの断片-1414/+24の活性でのhRev-erbαの効果もまた、他のレポーター
遺伝子(例えば、CAT)(データ示さず)とともに、例えば、pBLCAT5(図1お
よび3)またはpGL3(図2、4と続きの図)などの骨格の異なるレポータープ
ラスミドとともに、またはpCDNA3(データ示さず)などの他の発現ベクターと
ともに観察される。hRev-erbαの効果は強い。当該分野で広く用いられるベクタ
ーpGL3は以下の研究のために好ましい。 これらの結果は、ヒトアポC-IIIプロモーターの活性を減ずることが可能な、
このプロモーターでのhRev-erbα核レセプターに対する応答エレメントの存在を
示唆している。
【0048】
2.hRev-erbαの効果は特異的である。
図2は、プロモーターを欠くベクター(pGL3)に対するレポーター遺伝子の
活性がhRev-erbαの外因性の発現に影響されないことを示している。さらに、単
純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター(図2においてTk
pGL3と記す)、またはSV40ウイルスの主要後期プロモーター(図2においてpGL
3と記す)の2つの異種プロモーターの活性もまた、hRev-erbαの作用に対して
非感受性である。ヒトアポC-III遺伝子のプロモーターのこの核レセプターの効
果はこのように特異的である。
活性がhRev-erbαの外因性の発現に影響されないことを示している。さらに、単
純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター(図2においてTk
pGL3と記す)、またはSV40ウイルスの主要後期プロモーター(図2においてpGL
3と記す)の2つの異種プロモーターの活性もまた、hRev-erbαの作用に対して
非感受性である。ヒトアポC-III遺伝子のプロモーターのこの核レセプターの効
果はこのように特異的である。
【0049】
3.hRev-erbαの効果は優性である。
hRev-erbαの属する核ホルモンレセプターのスーパーファミリーのいくつかの
メンバーは、ヒトアポC−IIIプロモーターのレベルに特異的である応答エレメン
トを認識する:HNF4、複合体PPAR/RXR、COUPTF-IおよびCOUPTF-IIは、C3P(-82/
-70)に結合し(47、60、61、62)、ヒトアポC-IIIプロモーターの活性
をモジュレートする。加えて、本発明者らは、核レセプターhRORαが、サイトC3
P(-82/-70)を介してこのプロモーターの活性を部分的に高めることを観察して
いる(独立のPCT特許出願(PCT/EU99/02001)の主題を形成する未公開データ)
。hRev-erbαが他の核ホルモンレセプターの活性に影響を与える範囲を確かめる
ために、固定量のレポータープラスミドおよびhHNF4またはhRORαレセプターの
外因性発現を可能にするプラスミドと、および増加する量のhRev-erbαの外因性
の発現を可能にするプラスミドとをRK13細胞にコトランスフェクションした。コ
トランスフェクションされた核レセプターにもかかわらず、hRev-erbαはレポー
ター遺伝子の活性を減じた:hRev-erbαの効果は優性である(図3および4)。
メンバーは、ヒトアポC−IIIプロモーターのレベルに特異的である応答エレメン
トを認識する:HNF4、複合体PPAR/RXR、COUPTF-IおよびCOUPTF-IIは、C3P(-82/
-70)に結合し(47、60、61、62)、ヒトアポC-IIIプロモーターの活性
をモジュレートする。加えて、本発明者らは、核レセプターhRORαが、サイトC3
P(-82/-70)を介してこのプロモーターの活性を部分的に高めることを観察して
いる(独立のPCT特許出願(PCT/EU99/02001)の主題を形成する未公開データ)
。hRev-erbαが他の核ホルモンレセプターの活性に影響を与える範囲を確かめる
ために、固定量のレポータープラスミドおよびhHNF4またはhRORαレセプターの
外因性発現を可能にするプラスミドと、および増加する量のhRev-erbαの外因性
の発現を可能にするプラスミドとをRK13細胞にコトランスフェクションした。コ
トランスフェクションされた核レセプターにもかかわらず、hRev-erbαはレポー
ター遺伝子の活性を減じた:hRev-erbαの効果は優性である(図3および4)。
【0050】
4.hRev-erbαの作用の分子サイトの同定
a.ヒトアポC-IIIプロモーターの欠損変異体の分析
図5は、レポーター遺伝子の上流にクローニングされたアポC-IIIプロモータ
ーを徐々に切り詰めていった場合のレポーター遺伝子の活性の減少を示している
。プロモーターの活性は、位置-108と位置-62の間で失われる。この領域は、ア
ポC-IIIプロモーターの活性を制御することにおいての重要性が当該分野で知ら
れているサイトC3P(-82/-70)を含む(56、60および62)。示した実験に
おいて、アポC-IIIプロモーターの断片-1415/+24は、10の因子によってプラス
ミドpGL3のLuc+レポーター遺伝子の活性を増幅する。hRev-erbαの外因性の発
現が、この活性を、プロモーターが欠損しているpGL3ベクターの活性に近いレ
ベルに減らす:hRev-erbαの効果は強力である。それは欠失体-108/+24まではっ
きりと観察される。構築物-62/+24で得られた結果は、解釈が異なる:レポータ
ー遺伝子の活性が、おそらくC3Pサイトがないため、しばしばレポーターpGL3で
観察される活性に近い。これらの結果は、位置-108と位置+24の間を含むヒトア
ポC-IIIプロモーターの部分においてhRev-erbαの作用の少なくとも1つのサイ
トの存在を示す。アポC-IIIのこの領域に存在するhRev-erbα応答エレメントを
位置決めするために、この領域をオーバーラップする断片(位置-33/-16、-58/-
24、-76/-46、-87/-67および-100/-80)を、TKプロモーターの上流の1またはそ
れ以上の方向づけられたコピーへクローニングした。図6は、構築物(-33/-16
)3XTkpGL3の活性がhRev-erbαによって減ることを示す。図6に記載の構築
物(-100/-80)3XTkpGL3の弱い抑制は、すべての実験において観察されない
。
ーを徐々に切り詰めていった場合のレポーター遺伝子の活性の減少を示している
。プロモーターの活性は、位置-108と位置-62の間で失われる。この領域は、ア
ポC-IIIプロモーターの活性を制御することにおいての重要性が当該分野で知ら
れているサイトC3P(-82/-70)を含む(56、60および62)。示した実験に
おいて、アポC-IIIプロモーターの断片-1415/+24は、10の因子によってプラス
ミドpGL3のLuc+レポーター遺伝子の活性を増幅する。hRev-erbαの外因性の発
現が、この活性を、プロモーターが欠損しているpGL3ベクターの活性に近いレ
ベルに減らす:hRev-erbαの効果は強力である。それは欠失体-108/+24まではっ
きりと観察される。構築物-62/+24で得られた結果は、解釈が異なる:レポータ
ー遺伝子の活性が、おそらくC3Pサイトがないため、しばしばレポーターpGL3で
観察される活性に近い。これらの結果は、位置-108と位置+24の間を含むヒトア
ポC-IIIプロモーターの部分においてhRev-erbαの作用の少なくとも1つのサイ
トの存在を示す。アポC-IIIのこの領域に存在するhRev-erbα応答エレメントを
位置決めするために、この領域をオーバーラップする断片(位置-33/-16、-58/-
24、-76/-46、-87/-67および-100/-80)を、TKプロモーターの上流の1またはそ
れ以上の方向づけられたコピーへクローニングした。図6は、構築物(-33/-16
)3XTkpGL3の活性がhRev-erbαによって減ることを示す。図6に記載の構築
物(-100/-80)3XTkpGL3の弱い抑制は、すべての実験において観察されない
。
【0051】
b.ゲル・リタデーションによるプロモーターの分析
hRev-erbα蛋白質が結合するアポC-IIIプロモーターの部分を同定するために
、オーバーラップする二本鎖オリゴヌクレオチドをATP-γ32Pの存在下でリン
酸化して、そしてインビトロで(プラスミドpSG5-hRev-erbαを用いてプログラ
ムされたウサギ網状赤血球ライセートまたはプログラムされていないライセート
で)合成したhRev-erbα蛋白質とインキュベーションした。このように得られた
DNA/蛋白質複合体は、次いでポリアクリルアミドゲルで分析した(ゲル・リ
タデーション法)。2つの特異的なhRev-erbα複合体が、参照のように用いたhR
ev-erbα遺伝子のプロモーターに存在するRev-DR2応答エレメントと同定された
。これらの複合体は、応答エレメントに対する単量体または二量体としてのhRev
-erbαレセプターの結合に対応していた(31)。特異的なhRev-erbα複合体は
、ヒトアポC-III遺伝子のプロモーターの断片-34/-10で同定され、図7において
矢印でしるしている。この複合体は、Rev-DR2とhRev-erbαの単量体の複合体の
分子量と均等な分子量へ移る。hRev-erbα/(-34/-10)複合体の強度は、hRev-e
rbαに対するサイト(-34/-10)の低いアフィニティーを示すhRev-erbα/(Rev-
DR2)複合体の強度よりも弱い。断片-34/-10のシークエンスの解析によれば、位
置-23/-18におけるA/Tリッチ領域に先行される完全なAGGTCAハーフサイ
ト(half-site)の存在が示される。しかしながら、このハーフサイトに関する
位置-1に位置する塩基はCであり、当該分野で明らかにされるコンセンサスと異
なる。この差異によって、hRev-erbαに対する該サイトの低いアフィニティーを
説明し得る。-23/-18サイトのシークエンスが変異している(AGGTCA→A
GGCAG)対応する二本鎖のオリゴヌクレオチド(hCIIITaTamut)は、hRev-e
rbα蛋白質と複合体を形成しない(データを示さず)。結局、本発明者らは、有
意なゲル・リタデーションがないことを、ヒトアポC-III遺伝子のプロモーター
の位置-198および位置+24の間の部分の他の断片をカバーするラベルしたオリゴ
ヌクレオチド(例えば、アポC-IIIプロモーターの断片-104/-72(「C3P-DR2」)
に対応する二本鎖オリゴヌクレオチド)で観察した(図7)。 結論として、ゲル・リタデーション実験によって、ヒトアポC-IIIプロモータ
ーの位置-23/-18に存在するAGGTCAハーフサイトが、予想されるhRev-erb
α応答エレメントとして同定された。
、オーバーラップする二本鎖オリゴヌクレオチドをATP-γ32Pの存在下でリン
酸化して、そしてインビトロで(プラスミドpSG5-hRev-erbαを用いてプログラ
ムされたウサギ網状赤血球ライセートまたはプログラムされていないライセート
で)合成したhRev-erbα蛋白質とインキュベーションした。このように得られた
DNA/蛋白質複合体は、次いでポリアクリルアミドゲルで分析した(ゲル・リ
タデーション法)。2つの特異的なhRev-erbα複合体が、参照のように用いたhR
ev-erbα遺伝子のプロモーターに存在するRev-DR2応答エレメントと同定された
。これらの複合体は、応答エレメントに対する単量体または二量体としてのhRev
-erbαレセプターの結合に対応していた(31)。特異的なhRev-erbα複合体は
、ヒトアポC-III遺伝子のプロモーターの断片-34/-10で同定され、図7において
矢印でしるしている。この複合体は、Rev-DR2とhRev-erbαの単量体の複合体の
分子量と均等な分子量へ移る。hRev-erbα/(-34/-10)複合体の強度は、hRev-e
rbαに対するサイト(-34/-10)の低いアフィニティーを示すhRev-erbα/(Rev-
DR2)複合体の強度よりも弱い。断片-34/-10のシークエンスの解析によれば、位
置-23/-18におけるA/Tリッチ領域に先行される完全なAGGTCAハーフサイ
ト(half-site)の存在が示される。しかしながら、このハーフサイトに関する
位置-1に位置する塩基はCであり、当該分野で明らかにされるコンセンサスと異
なる。この差異によって、hRev-erbαに対する該サイトの低いアフィニティーを
説明し得る。-23/-18サイトのシークエンスが変異している(AGGTCA→A
GGCAG)対応する二本鎖のオリゴヌクレオチド(hCIIITaTamut)は、hRev-e
rbα蛋白質と複合体を形成しない(データを示さず)。結局、本発明者らは、有
意なゲル・リタデーションがないことを、ヒトアポC-III遺伝子のプロモーター
の位置-198および位置+24の間の部分の他の断片をカバーするラベルしたオリゴ
ヌクレオチド(例えば、アポC-IIIプロモーターの断片-104/-72(「C3P-DR2」)
に対応する二本鎖オリゴヌクレオチド)で観察した(図7)。 結論として、ゲル・リタデーション実験によって、ヒトアポC-IIIプロモータ
ーの位置-23/-18に存在するAGGTCAハーフサイトが、予想されるhRev-erb
α応答エレメントとして同定された。
【0052】
c.ヒトアポC-III遺伝子のプロモーターの点変異体の分析
欠損変異体およびゲル・リタデーション法で得られた結果を確かめるために、
構築物-1415/+24WTpGL3および-82/+24WTpGL3を指向性突然変異誘発(site-dir
ected mutagenesis)によってアポC-III遺伝子のTaTaボックスの下流に存在する
AGGTCAハーフサイトに変異をおこした。さらに、本発明者らは、Tkプロモ
ーターの上流に、AGGTCAサイトが構築物-1415/+24WTpGL3および-82/+24W
TpGL3の変異に従った改変をされているヒトアポC-IIIプロモーターの-33/-16断
片の3コピーをクローニングした。図8Aは、ヒトアポC-IIIプロモーターの位
置(-23/-18)に存在するAGGTCAハーフサイトの変異が、hRev-erbαに対
する完全なプロモーターの感受性を50%まで減らすことを示す。構築物-82/+2
4WTpGL3を変異した場合、hRev-erbαの効果は全く失われる。同様に、(構築物
(-33/-16KO)3XTkpGL3を得るために)構築物(-33/-16WT)3XTkpGL3の-2
3/-18の変異は、そのhRev-erbαに対する感受性を抑制する(図8B)。
構築物-1415/+24WTpGL3および-82/+24WTpGL3を指向性突然変異誘発(site-dir
ected mutagenesis)によってアポC-III遺伝子のTaTaボックスの下流に存在する
AGGTCAハーフサイトに変異をおこした。さらに、本発明者らは、Tkプロモ
ーターの上流に、AGGTCAサイトが構築物-1415/+24WTpGL3および-82/+24W
TpGL3の変異に従った改変をされているヒトアポC-IIIプロモーターの-33/-16断
片の3コピーをクローニングした。図8Aは、ヒトアポC-IIIプロモーターの位
置(-23/-18)に存在するAGGTCAハーフサイトの変異が、hRev-erbαに対
する完全なプロモーターの感受性を50%まで減らすことを示す。構築物-82/+2
4WTpGL3を変異した場合、hRev-erbαの効果は全く失われる。同様に、(構築物
(-33/-16KO)3XTkpGL3を得るために)構築物(-33/-16WT)3XTkpGL3の-2
3/-18の変異は、そのhRev-erbαに対する感受性を抑制する(図8B)。
【0053】
d.結果
ヒトアポC-III遺伝子のプロモーターのhRev-erbαの作用を含む少なくとも1
つのサイトが、明確に同定されている:アポC-IIIプロモーターの位置-23/-18に
位置するAGGTCAハーフサイト。
つのサイトが、明確に同定されている:アポC-IIIプロモーターの位置-23/-18に
位置するAGGTCAハーフサイト。
【0054】
5.hRev-erbαアイソフォームの効果
図9は、驚くべきことに、βおよびγRev-erbアイソフォームも構築物-198/+2
8WTLuc+の活性を抑えることを示す。
8WTLuc+の活性を抑えることを示す。
【0055】
6.Rev-erb KOマウスにおけるRev-erbα遺伝子の破壊が、アポC-IIIの肝臓での 発現およびアポC-IIIとトリグリセリドの血漿レベルに影響する。
前記のインビトロで行った観察の生理学的妥当性を確かめるために、SV129Xba
lbCマウスにおいて、Rev-erbα遺伝子の相同組換による破壊の効果は、血液のパ
ラメーター(トリグリセリドおよびアポC-IIIの血漿レベル、脂質プロファイル
)および正常動物および形質転換動物の肝臓におけるアポC-IIIをコードするメ
ッセンジャーRNAの蓄積で評価した。
lbCマウスにおいて、Rev-erbα遺伝子の相同組換による破壊の効果は、血液のパ
ラメーター(トリグリセリドおよびアポC-IIIの血漿レベル、脂質プロファイル
)および正常動物および形質転換動物の肝臓におけるアポC-IIIをコードするメ
ッセンジャーRNAの蓄積で評価した。
【0056】
a.血液のパラメーター
血清中のトリグリセリド濃度の有意な増加(マンホイットニー検定(Mann-Whi
tney test)、p<0.05)が、正常マウスと比較した変異マウスで観察され
た(図10A)。FPLCプロファイルはVLDL画分におけるトリグリセリドの大きな
増加を示している(図11)。 b.アポC-III遺伝子の発現 アポC-IIIをコードするmRNAの発現は、Rev-erbα遺伝子が相同組換によっ
て破壊されたマウスで増加している(図10C)。この増加した発現は、血漿中
のアポC-IIIのレベルの有意な増加(マンホイットニー検定、p<0.05)に
関連する(図10B)。 これらの結果は、Rev-erbの発現の改変が、マウスにおいて、アポC-IIIの肝臓
での発現および血漿中のトリグリセリドとアポC-IIIのレベルに影響することを
示す:本発明者らのインビトロで行った観察は、生理学的に妥当である。
tney test)、p<0.05)が、正常マウスと比較した変異マウスで観察され
た(図10A)。FPLCプロファイルはVLDL画分におけるトリグリセリドの大きな
増加を示している(図11)。 b.アポC-III遺伝子の発現 アポC-IIIをコードするmRNAの発現は、Rev-erbα遺伝子が相同組換によっ
て破壊されたマウスで増加している(図10C)。この増加した発現は、血漿中
のアポC-IIIのレベルの有意な増加(マンホイットニー検定、p<0.05)に
関連する(図10B)。 これらの結果は、Rev-erbの発現の改変が、マウスにおいて、アポC-IIIの肝臓
での発現および血漿中のトリグリセリドとアポC-IIIのレベルに影響することを
示す:本発明者らのインビトロで行った観察は、生理学的に妥当である。
【0057】
7.スクリーニング方法の妥当性が提案された。
hRev-erbαの外因性発現を人為的に増加させた場合のヒトアポC-III遺伝子の
プロモーターの下流にクローニングされたレポーター遺伝子の発現の抑制(図1
から5、8および9)は、hRev-erbαの活性をモジュレートしやすい物質を同定
するために、この方法を用いる妥当性の根拠となる。
プロモーターの下流にクローニングされたレポーター遺伝子の発現の抑制(図1
から5、8および9)は、hRev-erbαの活性をモジュレートしやすい物質を同定
するために、この方法を用いる妥当性の根拠となる。
【0058】
図6および12は、hRev-erbαの活性をモジュレートしやすい物質を同定する
ためにレポーター遺伝子の前のTkプロモーターの上流にクローニングされる単離
したサイトを用いる妥当性の根拠となる。Tkプロモーターの前にクローニングさ
れているヒトRev-erbαのプロモーターに存在するRev-DR2の3つのコピーを含む
構築物はキャラクタライズされた(図12)。そのhRev-erbαに対する感受性は
増加している。天然のhRev-erbα核レセプターの活性をモジュレートしやすい物
質のスクリーニングに対するその価値は、このことから正当化される。
ためにレポーター遺伝子の前のTkプロモーターの上流にクローニングされる単離
したサイトを用いる妥当性の根拠となる。Tkプロモーターの前にクローニングさ
れているヒトRev-erbαのプロモーターに存在するRev-DR2の3つのコピーを含む
構築物はキャラクタライズされた(図12)。そのhRev-erbαに対する感受性は
増加している。天然のhRev-erbα核レセプターの活性をモジュレートしやすい物
質のスクリーニングに対するその価値は、このことから正当化される。
【0059】
最後に、図13は、hRev-erbαの活性をモジュレートしやすい物質を同定する
ために、酵母の転写因子Gal4のDNA結合ドメインとhRev-erbαのリガンドの結
合ドメインおよびGal4応答エレメントの5コピーを含むレポーターベクターを組
み合わせたキメラを用いることの妥当性の根拠となる。
ために、酵母の転写因子Gal4のDNA結合ドメインとhRev-erbαのリガンドの結
合ドメインおよびGal4応答エレメントの5コピーを含むレポーターベクターを組
み合わせたキメラを用いることの妥当性の根拠となる。
【0060】
【外1】
【0061】
【外2】
【0062】
【外3】
【0063】
【外4】
【0064】
【外5】
【0065】
【外6】
【0066】
【外7】
【0067】
【外8】
【0068】
【外9】
【0069】
【外10】
【図1】 HepG2細胞を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子(-1415/+24WThC
IIILuc+)のヒトアポC−IIIプロモーター上流断片(-1415/+24)を含むプラスミ
ドと、Rev-erbα核レセプターの外因性の発現を可能にするプラスミドpSG5-hRe
v-erbαとをコトランスフェクションした場合の、レポーター遺伝子活性を示す
グラフである。
IIILuc+)のヒトアポC−IIIプロモーター上流断片(-1415/+24)を含むプラスミ
ドと、Rev-erbα核レセプターの外因性の発現を可能にするプラスミドpSG5-hRe
v-erbαとをコトランスフェクションした場合の、レポーター遺伝子活性を示す
グラフである。
【図2】 プロモーターを欠くベクター(pGL3)に対するレポーター遺伝
子の活性を示すグラフである。
子の活性を示すグラフである。
【図3】 hRev-erbαが他の核ホルモンレセプターの活性に影響を与える範
囲を確かめるために、固定量のレポータープラスミドおよびhHNF4またはhRORα
レセプターの外因性発現を可能にするプラスミドと、および増加する量のhRev-e
rbαの外因性の発現を可能にするプラスミドとをRK13細胞にコトランスフェクシ
ョンした場合のレポーター遺伝子の活性を示すグラフである。
囲を確かめるために、固定量のレポータープラスミドおよびhHNF4またはhRORα
レセプターの外因性発現を可能にするプラスミドと、および増加する量のhRev-e
rbαの外因性の発現を可能にするプラスミドとをRK13細胞にコトランスフェクシ
ョンした場合のレポーター遺伝子の活性を示すグラフである。
【図4】 hRev-erbαが他の核ホルモンレセプターの活性に影響を与える範
囲を確かめるために、固定量のレポータープラスミドおよびhHNF4またはhRORα
レセプターの外因性発現を可能にするプラスミドと、および増加する量のhRev-e
rbαの外因性の発現を可能にするプラスミドとをRK13細胞にコトランスフェクシ
ョンした場合のレポーター遺伝子の活性を示すグラフである。
囲を確かめるために、固定量のレポータープラスミドおよびhHNF4またはhRORα
レセプターの外因性発現を可能にするプラスミドと、および増加する量のhRev-e
rbαの外因性の発現を可能にするプラスミドとをRK13細胞にコトランスフェクシ
ョンした場合のレポーター遺伝子の活性を示すグラフである。
【図5】 レポーター遺伝子の上流にクローニングされたアポC-IIIプロモ
ーターを徐々に切り詰めていった場合のレポーター遺伝子の活性を示すグラフで
ある。
ーターを徐々に切り詰めていった場合のレポーター遺伝子の活性を示すグラフで
ある。
【図6】 構築物(-33/-16)3XTkpGL3などの活性に対する、hRev-erbα
の作用を示すグラフである。
の作用を示すグラフである。
【図7】 ヒトアポC-III遺伝子のプロモーターの断片-34/-10で同定された
、特異的なhRev-erbα複合体を示す結果である。
、特異的なhRev-erbα複合体を示す結果である。
【図8】 図8Aは、ヒトアポC-IIIプロモーターの位置(-23/-18)に存在
するAGGTCAハーフサイトの変異による、hRev-erbαに対する完全なプロモ
ーターの感受性の変化を示すグラフである。図8Bは、構築物(-33/-16WT)3
XTkpGL3の-23/-18の変異による、hRev-erbαに対する感受性の変化を示すグラ
フである。
するAGGTCAハーフサイトの変異による、hRev-erbαに対する完全なプロモ
ーターの感受性の変化を示すグラフである。図8Bは、構築物(-33/-16WT)3
XTkpGL3の-23/-18の変異による、hRev-erbαに対する感受性の変化を示すグラ
フである。
【図9】 構築物-198/+28WTLuc+の活性に対する、βおよびγRev-erbアイ
ソフォームの作用を示すグラフである。
ソフォームの作用を示すグラフである。
【図10】 図10Aは、正常マウスと変異マウスの血清中のトリグリセリ
ド濃度を比較したグラフである。図10Bは、正常マウスと変異マウスの血漿中
のアポC-IIIのレベルを比較したグラフである。図10Cは、Rev-erbα遺伝子が
相同組換によって破壊されたマウスでの、アポC-IIIをコードするmRNAの発
現を示す結果である。
ド濃度を比較したグラフである。図10Bは、正常マウスと変異マウスの血漿中
のアポC-IIIのレベルを比較したグラフである。図10Cは、Rev-erbα遺伝子が
相同組換によって破壊されたマウスでの、アポC-IIIをコードするmRNAの発
現を示す結果である。
【図11】 VLDL画分におけるトリグリセリドの増加を示すFPLCプロファイ
ルである。
ルである。
【図12】 Tkプロモーターの前にクローニングされているヒトRev-erbα
のプロモーターに存在するRev-DR2の3つのコピーを含む構築物のキャラクタラ
イズした結果を示す図である。
のプロモーターに存在するRev-DR2の3つのコピーを含む構築物のキャラクタラ
イズした結果を示す図である。
【図13】 酵母の転写因子Gal4のDNA結合ドメインとhRev-erbαのリガ
ンドの結合ドメインおよびGal4応答エレメントの5コピーを含むレポーターベク
ターを組み合わせたキメラを用いて、hRev-erbαの活性をモジュレートしやすい
物質を同定することに妥当性があることを示す図である。
ンドの結合ドメインおよびGal4応答エレメントの5コピーを含むレポーターベク
ターを組み合わせたキメラを用いて、hRev-erbαの活性をモジュレートしやすい
物質を同定することに妥当性があることを示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML,
MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K
E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E
A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ
,TM),AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB
,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ,
DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,GE,G
H,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP
,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,
LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,M
W,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD
,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,
TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZW
(71)出願人 Frankfurter Str. 250,
D−64293 Darmstadt,Fed
eral Republic of Ge
rmany
(72)発明者 ラスペ,エリック
ベルギー王国 ベー−77000 ムスクロン、
アブニュー デュ シャトー 142
(72)発明者 ボノム, イヴ
フランス国 エフ−69260 シャルボニエ
ール、アブニュー ド ラ ペ、ル ビュ
クレイ
Fターム(参考) 2G045 AA40 CA25 CA26 FA27 FA29
FB02 FB03 FB08 FB09
Claims (9)
- 【請求項1】 脂質代謝機能障害の治療に有用な物質をスクリーニングする
ためのRev-erbレセプターおよび/またはその応答エレメントまたはこれらレセ
プターと機能的に同等のものの使用。 - 【請求項2】 Rev-erbレセプターおよびRev-erbレセプター応答エレメント
が、hRev-erbαレセプターおよびhRev-erbαレセプター応答エレメントであるこ
とを特徴とする、請求項1に記載の使用。 - 【請求項3】 脂質代謝機能障害の治療に有用な物質のスクリーニング方法
であって、 試験物質が、Rev-erbファミリーのレセプターおよび/またはRev-erbレセプター
応答エレメント、および/またはRev-erbをRNAポリメラーゼ複合体へ機能的
に結合し得る核因子、またはそれらと機能的に同等のものと接触して置かれるこ
と、 以下のこと: 前記物質のRev-erbレセプターに対する結合または前記物質とRev-erbレセプター
から形成される複合体のその応答エレメントに対するおよび/またはRev-erbを
RNAポリメラーゼ複合体に機能的に結合する核因子に対する結合、および/ま
たは、 Rev-erb応答エレメントを含むプロモーターの制御下に配置される遺伝子の転写
活性の調節、 が任意の適当な手段で測定されること、 を特徴とする、前記方法。 - 【請求項4】 脂質代謝機能障害の治療に有用な物質のスクリーニング方法
であって、Rev-erbレセプターをコードする遺伝子の発現調節における試験物質
の効果を測定することからなる、前記方法。 - 【請求項5】 ヒトまたは動物におけるアポリポ蛋白質C-IIIに関連する脂
質代謝機能障害の治療に有用である組成物、とくに医薬組成物の製剤のための、
請求項3または請求項4に記載のスクリーニング方法で選択される物質の使用。 - 【請求項6】 ヒトまたは動物におけるアポリポ蛋白質C-IIIに関連する脂
質代謝機能障害の治療および/または予防に有用である医薬組成物の製剤のため
の、Rev-erbレセプターまたはその応答エレメントに結合し得る物質の使用。 - 【請求項7】 ヒトまたは動物におけるアポリポ蛋白質C-IIIに関連する脂
質代謝機能障害の治療および/または予防に有用である医薬組成物の製剤のため
の、Rev-erbレセプター応答エレメントを含むプロモーターの制御下に配置され
る遺伝子の転写活性を調節し得る物質の使用。 - 【請求項8】 ヒトまたは動物におけるアポリポ蛋白質C-IIIに関連する脂
質代謝機能障害の治療および/または予防に有用である組成物、とくに医薬組成
物の製剤のための、Rev-erbレセプターをコードする遺伝子の発現を調節し得る
物質の使用。 - 【請求項9】 Rev-erbレセプターおよび/またはそれらの応答エレメント
を用いて、抗アテローム性動脈硬化の特性を備えた物質の活性メカニズム、並び
にアポC-IIIへの効果をキャラクタライズし、正当化し、主張するための、請求
項3または請求項4に記載のスクリーニング方法の使用。
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