JPH10506794A

JPH10506794A - アテローム性動脈硬化症の処置におけるスカベンジャー受容体の使用方法

Info

Publication number: JPH10506794A
Application number: JP8512576A
Authority: JP
Inventors: ビスゲイアー，チヤールズ・ラリー; コルニチエルリ，ジヨーゼフ・アンソニー; ヴエーレ，ザビーネ
Original assignee: ワーナー−ランバート・コンパニー
Priority date: 1994-10-06
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 1998-07-07
Also published as: MX9701660A; US20010018427A1; EP0784681A1; WO1996011268A1; CA2196991A1

Abstract

(57)【要約】スカベンジャー受容体遺伝子を哺乳動物の肝臓に導入し上記哺乳動物をアテローム性動脈硬化症に対する抵抗性を付与する方法、人工的なスカベンジャー受容体遺伝子ミニ遺伝子もしくは部分ミニ遺伝子、ならびにアポＢ含有リポ蛋白の低下、高密度リポ蛋白コレステロールの上昇、およびアテローム性動脈硬化症の予防のための哺乳動物肝臓におけるスカベンジャー受容体の異所性発現、さらにアテローム性動脈硬化症、高βリポ蛋白血症（すなわち、アポリポ蛋白Ｂ含有リポ蛋白の高レベル）、高コレステロール血症、高トリグリセライド血症、低αリポ蛋白血症（すなわち、高密度リポ蛋白の低レベル）、糖尿病の血管性合併症、移植、アテレクトミーおよび血管形成後再狭窄の患者を治療有効量のスカベンジャー受容体遺伝子の単独またはACATインヒビター、HMG CoAリダクターゼ、胆汁酸封鎖剤もしくは脂質レギュレーターとの併用で処置する方法、またこれらの薬剤を包含する医薬送達方法。

Description

【発明の詳細な説明】アテローム性動脈硬化症の処置におけるスカベンジャー受容体の使用方法発明の背景本発明は内科的処置方法に関する。とくに本発明は哺乳動物にアテローム性動脈硬化症への抵抗性を付与するためのスカベンジャー受容体遺伝子（SR）の使用、それらの製造方法、これらの遺伝子を包含する医薬送達方法(pharmaceutical delivery methods)、および医薬的処置方法に関する。とくに、この新規なSR遺伝子は、高βリポ蛋白血症［すなわちアポリポ蛋白（アポ）Ｂ含有リポ蛋白の高レベル］、高コレステロール血症、高トリグリセライド血症、低αリポ蛋白血症（すなわち、高密度リポ蛋白コレステロールの低レベル）、糖尿病の血管性合併症、移植、アテレクトミーおよび血管形成後再狭窄の処置に有用である。さらに詳しくは、この新規なSR遺伝子の単独、またはアテローム性動脈硬化症の処置用の他剤たとえば、ACATインヒビター、HMG-CoAリダクターゼインヒビター、脂質レギュレーター、胆汁酸封鎖剤等との併用は、アテローム性動脈硬化症の処置に有用である。マクロファージはアテローム性動脈硬化症の病態形成に重要な役割を果たすと考えられる［Brown M.S.，Goldstein J.L.，Krieger M.，Ho Y.K.，Anderson R. G.W.，J ．Cell Biol. 82: 597-613(1979); Goldstein J.L.，Ho Y.K.，Basu S.K .，BrownM.S.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 76: 333-337(1979);Brown M.S.，G oldstein J.L.，Ann ．Review Biochem. 52: 223-261(1983); Steinberg D.，Par thasarathyS.，Carew T.E.，Khoo J.C.，Witztum J.L.，N.Engl. J ．Med. 320: 915-924(1989); Carew T．E.，Am ．J．Cardiol. 64: 18G-22G(198 9); Brown M.S.，Goldstein J.L.，Nature 343: 508-509(1990); Kurihara Y.A. ，Matsumoto A.，Itakura H.，Kodama T.，Current Opinion in Lipidology 2: 295-300(1991); Krieger M.，TIBS，17: 141-146(1992)］。SRはマクロファージ上に存在し、修飾アポＢ含有リポ蛋白を含む広範囲のリガンドの結合ならびにインターナリゼーションを仲介する[Brown M.S.，Goldstein J.L.，Krieger M.，H o Y.K.，Anderson R.G.W.，前出，1979; Goldstein J.L.，Ho Y.K.，Basu S.K. ，Brown M.S.，前出，1979; Brown M.S.，Goldstein J.L.，前出，1983; Steinb erg D.，Parthasarathy S.，Carew T.E.，Khoo J.C.，Witztum J.L.，前出，198 9; Carew T.E．前出，1989; Brown M．S.，Goldstein J．L．前出，1990; Kurih ara Y．A.，Matsumoto A.，Itakura H.，Kodama T.，前出，1991; Krieger M.，前出，1992; Fogelman A.M.，Shechter I.，Seager J.，Hokom M.，Child J.S. ，Edwards P.A.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，77:2214-2218(1980); Haberlan d M.E.，Fogelman A.M.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 82: 2693-2697(1985); H oriuchi S.，Murakami M.，TakataK.，Morino Y.，J.Biol.Chem. 261: 4962-496 6(1986); Dresel H.A.，FriedrichE.，Via D.P.，Sinn H.，Ziegler R.，Schett ler G．EMBO Journal，6: 319-326(1987); Quinn M.T.，Parthasarathy S.，Fon g L.G.，Steinberg D.，Proc ．Natl．Acad．Sci. USA，84: 2995-2998(1987); T akata K.，Horiuchi S.，Araki N.，Shiga M.，Saitoh M.，Morino Y.，J ．Biol ．Chem ．263: 14819-14825(1988); Wright T.L.，Roll F.J.，Jones A.L.，Weis iger R.A.，Gastroenterology 94: 442-452 (1989); Takata K.，Horiuchi S.，Morino Y.，Biochim. Biophys. Acta 984: 2 73-280(1989); Eskild W.，Kindberg G.M.，Smedsrod B.，Blomhoff R.，Norum K.R.，Berg T.，Biochem ．J.，258: 511-520(1989); Steinbrecher U.P.，Lough eed M.，Kwan W.-C.，Dirks M.，J ．Biol．Chem.，264: 15216-15223(1989); Ha mpton R.Y.，Golenbock D.T.，Penman M.，Krieger M.，Raetz C.R.H.，Nature 352 : 342-344(1991); StehleG.，Friedrich E.A.，Sinn H.ら，J ．Clin．Invest ．90: 2110-2116(1992); Tokuda H.，Masuda S.，Takakura Y.，Sezaki H.，Has hida M.，Biochem ．Biophys．Res．Commun.，196:1 8-24(1993); de Vries H.E ．Kuiper J.，de Boer A.G.，van Berkel T.J.C.，Breimer D.D.，J ．Neurochem .，61: 1813-1821(1993); PearsonA．M.，Rich A.，Krieger M.，J ．Biol．Chem .，268: 3546-3554(1993); Zhang H.，Yang Y.，Steinbrecher U.P.，J.Biol ．C hem .，268: 5535-5542(1993); Dunne D.W.，Resnich D.，Greenberg J.，Kriege r M.，Joiner K．A.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，91: 1863-1867(1994); Fre eman M.W.，Current Opinion in Lipidology，5: 143-148(1994)]。SRはまた特殊な環境下には平滑筋および内皮細胞上にも存在する[Bickel P．E.，Freeman M .W.，J ．Clin．Invest.，90: 1450-1457(1992)]。SRは、低密度リポ蛋白(LDL)受容体とは異なり、コレステロールによる負のフィードバック調節を欠き、修飾リポ蛋白の持続的取り込みならびにマクロファージの泡沫細胞へのトランスフォーメーションを可能にする（Brown M.S.，Goldstein J.L.，Krieger M．Ho Y.K.， Anderson R.G.W.，前出，1979; Goldstein J.L.，Ho Y.K.，Basu S.K.，Brown M .S.，前出，1979; Brown M.S.，Goldstein J.L.，前出，1983）。マクロファージ由来の泡沫細胞は、ヒトを含めて様々な動物種における初期のアテローム性動脈硬化病変に特徴的であって、その形成の加速はコレステロール強化食餌を給餌された各種動物モデルにおいて模倣することができる［Mahley R.W.，Athero.Rev.，5: 1-34(1979); Clarkson T.B.，Shively C.A.， Weingand K.W.，Comp ．Anim．Nutr.，6: 56-82(1988)］。ウシSRの２つの形態、Ｉ型およびII型はウシ肺ライブラリーからクローン化されている[Kodama T.，Feeman M.，Rohrer L.，Zabrecky J.，Matsudaira P.，Kr eiger M.，Nature 343: 531-535(1990); Rohrer L.，Freeman M.，Kodama T.，P enman M.，Kreiger M.，Nature 343: 570-572(1990)]。これらのトリマー構造的に類似の受容体は単一遺伝子産物の可変スプライシングに由来し、カルボキシ末端のシステインに富むドメイン含有（Ｉ型）または欠損（II型）SRを生じる[Fre eman M.，Ashkenas J.，Rees D.J.G.ら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，87: 881 0-8814(1990)]。システインに富むドメイン（すなわち、Ｉ型ドメインVI）は種間で高度に保存されているが、その機能的意義は不明である。Actonらの突然変異誘発実験［Acton S.，Resnick D.，Freeman M.，Ekkel Y.，Ashkenas J.，Kri eger M.，J.Biol.Chem.，268; 3530-3537(1993)］はＩ型およびII型SRの両者に存在するコラーゲン様ドメイン（ドメインＶ）にはポリアニオン性リガンドの認識に必要な配列を含有することが示唆されている。Penmanらによる構造研究［Pe nman M.，Lux A.，Freedman N.J.ら，J ．Biol．Chem.，266: 23985-23993(1991) ］は、SRのトリマーへの組み立てには、スペーサードメイン（すなわちドメイン III）ジスルフィド連結ダイマーのモノマーとの非共有結合による会合が関与することを示唆している。トリマーのSR構造は、しかしながら、モノマーがリガンドを結合する十分な能力を有することから、機能的結合に必須とは考えられない［Via D.P.，Kempner E.S.，Pons L.ら，Proc ．Natl．Acad．S ci. USA，89: 6780-6784(1992)］。圧倒的な状況証拠が修飾されたLDLのインビボにおける存在を示唆しているものの（Carew T.E.，前出，1989）、これらの粒子が血漿から単離されていないことから、それらの存在には懐疑的見解がある。それらの内皮下における限局化された形成および常在性マクロファージによる迅速な取り込みが血漿中への蓄積を防止しているように思われる。しかしながら、インビトロおよびインビボにおいてマクロファージSRは化学的に修飾されたLDLに強く結合し、インターナライズし、分解する。動脈壁での平滑筋細胞およびマクロファージＳＲの発現は障害形成にある役割を担うが、肝臓におけるそれらの存在は保護的役割を予告するともいえる（Brown M.S.，Goldstein J.L.，前出，1990）。実際、クッパー細胞および内皮細胞を包含する非実質肝細胞（nonparerchymal liver cells）には、アセチル化および酸化LDLの結合能および分解能がある[Dresel H.A.，Friedrich E. ，Via D.P.，Sinn H.，Ziegler R.，Schettler G.，前出，1987; van Berkel T. J.C.，Nagelkerke J.F.，Kruijt J.K.，FEBS Letters，132: 61-66(1981); Dres el H.A.，Friedrich E.，Via D.P.，Schettler G.，Sinn H.，EMBO Journal，4: 1157-1162(1985); de Rijke Y.B.，van Berkel T.J.C.，J.Biol ．Chem.，269: 824-827(1994)]。さらに、静脈内注入したアセチル化LDLは主に肝洞様と内皮細胞に、またより少量がクッパー細胞に蓄積する [Dresel H.A.，Friedrich E.，Via D.P.，Sinn H.，Ziegler R.，Schettler G．前出，1987; Dresel H.A.，Friedrich E.，Via D.P.，Schettler G.，Sinn H．前出，1985; Nagelkerke J.F.，Barto K.P.，van Berkel T.J.C.，J ．Biol．Che m. ，258: 12221-12227(1983); Pitas R.E.，Boyles J.，Mahley R.W.，Montgome ry B.D.，J ．Cell Biol. 100: 103-117(1985); HoriuchiS.，Takata K.，Maeda H.，Morino Y.，J ．Biol．Chem. 259: 53-56(1985); van Berkel T.J.C.，de Ri jke Y.B.，Kruijt J.K.，J ．Biol．Chem.，266: 2282-2289(1991)]。これに反して、酸化LDLを用いた研究では主としてクッパー細胞とより少量の内皮細胞へのリガンドの蓄積が証明されている[Esbach S.，Pieters M.N.，Van der Boom J．ら，Hepatology，18: 537-545(1993)]。肝実質によるアセチル化されたLDLの取り込みはほとんど無視できる割合でしか起こらない(Nagelkerke J.F.，Barto K. P.，van Berkel T.J.C．前出，1983)。全体としてこれらの研究は、肝非実質細胞が、アテローム性病変の原因となる可能性のあるリポ蛋白を除去する能力をもつことを示唆している。すなわち、本発明の目的は、哺乳動物細胞におけるSRの異所性発現、とくに通常はそれを発現しない肝細胞におけるSRの発現である。驚くべきことに、また予期せずして、肝細胞におけるSRの発現はアポＢ含有リポ蛋白の低下および高密度リポ蛋白(HLD)の上昇ならびにアポＢ含有リポ蛋白コレステロールとHDLコレステロールの比の好ましい変化を生じることが見出されたのである。さらに、予想もされなかったことには、これらの異所性に発現したSRを含有する肝臓は、コレステロールの蓄積から保護され、過剰の脂質を蓄えないことが見出された。発明の概要したがって、本発明は、SR遺伝子を哺乳動物の肝臓に導入し、上記哺乳動物にアテローム性動脈硬化症に対する抵抗性を付与する方法において、 (a) リン酸カルシウム共沈の利用、 (b) 陽イオン性リポソームの複合体内、 (c) エレクトロポレーション、 (d) 受容体誘導エンドサイトーシス、 (e) 裸のDNA、 (f) ウイルスベクターによる形質導入、 (g) 粒子誘導遺伝子導入、および (h) 合成ペプチドからなる群より選択される送達方法によってDNAを哺乳動物に導入することからなる方法を意図するものである。本発明の第一の態様の好ましい実施態様においては哺乳動物はヒトである。第二の態様においては、本発明はSR遺伝子を哺乳動物に導入し上記哺乳動物にアテローム性動脈硬化症に対する抵抗性を付与する方法において、上記SR遺伝子をベクター中に挿入し、そのSRを上記哺乳動物の肝臓で発現させることからなる方法を意図する。本発明の第二の態様の好ましい実施態様においては哺乳動物はヒトである。第三の態様においては、本発明は、 (a) 肝臓特異的プロモーターまたは肝臓特異的プロモーターの不存在、 (b) 5′非翻訳領域またはその5′非翻訳領域の不存在、 (c) コード配列、 (d) 3′非翻訳領域またはその3′非翻訳領域の不存在、および (e) ポリアデニル化シグナルまたはそのポリアデニル化シグナルの不存在からなる人工SRミニ遺伝子または部分ミニ遺伝子を意図するものである。本発明の第三の態様の好ましい実施態様では、5′非翻訳領域は、天然（異種または同種）ヌクレオチドを含有する5′非翻訳領域、合成ヌクレオチドを含有する5′非翻訳領域、ならびに天然（異種または同種）および合成ヌクレオチドを含有する5′非翻訳領域からなる群より選択される。本発明の第三の態様のさらに好ましい実施態様においては、5′非翻訳領域はプロモーターとSRコード領域の翻訳開始部位の間の5′非翻訳領域、およびプロモーターとSRコード領域の翻訳開始部位の間の5′非翻訳領域を除く5′非翻訳領域からなる群より選択される。本発明の第三の態様の最も好ましい実施態様においては、プロモーターとSRコード領域の間の5′非翻訳領域はSRの5′非翻訳領域の５bpである。本発明の第三の態様の好ましい実施態様においては、3′非翻訳領域は、SRコード配列の3′末端と天然（異種または同種）ヌクレオチドからなるポリ‐Ａ尾部を含有する配列の3′末端の間の領域、SRコード配列の3′末端と合成ヌクレオチドからなるポリ‐Ａ尾部を含有する配列の3′末端の間の領域、ならびにSRコード配列の3′末端と天然（異種または同種）および合成ヌクレオチドの組み合わせからなるポリ‐Ａ尾部を含有する配列の3′末端の間の領域からなる群より選択される。本発明の第三の態様のさらに好ましい実施態様においては、3′非翻訳領域はS Rコード配列の3′末端とポリ‐Ａ尾部を含有する配列の5′末端の間の領域、およびSRコード配列の3′末端とポリ‐Ａ尾部を含有する配列の5′末端の間を除いた領域からなる群より選択される。本発明の第三の態様の最も好ましい実施態様においては、3′非翻訳領域は、特異的な制限部位において酵素Asp 700またはAsp 700の他の任意のイソキゾマーを用いてトランケートされる。本発明の第三の態様の好ましい実施態様においては、ポリアデニル化シグナルは、天然（異種または同種）ヌクレオチドを含有するポリアデニル化シグナル、合成ヌクレオチドを含有するポリアデニル化シグナル、ならびに天然（異種または同種）および合成ヌクレオチドの組み合わせを含有するポリアデニル化シグナルからなる群より選択される。本発明の第三の態様のさらに好ましい実施態様においては、ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化シグナルをまたぐヒト成長ホルモン配列である。本発明の第三の態様の最も好ましい実施態様においては、ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化シグナルをまたぐヒト成長ホルモン配列の650bp配列である。本発明の第三の態様の好ましい実施態様においては、肝特異的プロモーターはマウストランスフェリンプロモーターである。本発明の第三の態様のさらに好ましい実施態様においては、コード配列は完全コード配列、コード配列のトランケート型、ならびに挿入、欠失および反復を包含する完全コード配列のフラグメントからなる群より選択される。第四の態様においては、本発明はアポＢ含有リポ蛋白の低下、高密度リポ蛋白コレステロールの上昇およびアテローム性動脈硬化症の予防のために、哺乳動物の肝臓におけるSRの異所性発現を意図する。本発明の第四の態様の好ましい実施態様においては哺乳動物はヒトである。本発明の第四の態様のさらに好ましい実施態様においては、発現は肝臓における一過性発現である。本発明の第四の態様の最も好ましい実施態様においては、発現は肝臓における安定的発現である。第五の態様においては、本発明は患者のアテローム性動脈硬化症、高βリポ蛋白血症、高コレステロール血症、高トリグリセライド血症、低αリポ蛋白血症、糖尿病の血管性合併症、移植、アテレクトミーならびに血管形成後再狭窄［Grov es P.H.，Lewis M．J.，Cheadle H.A.，Penny W.J.，Circulation，87: 590-597 (1993); More R.S.，Rutty G.，Underwood M.J.，Gershlick A.H.，J.Pathol．1 72 : 287-292(1994)］の処置方法において、治療的有効量のSR遺伝子を上記患者の肝臓に投与することからなる方法を意図する。第六の態様においては、本発明は患者におけるアテローム性動脈硬化症、高β リポ蛋白血症、高コレステロール血症、高トリグリセライド血症、低αリポ蛋白血症、糖尿病の血管性合併症、移植、アテレクトミー、ならびに血管形成後再狭窄の処置方法において、治療有効量のSR遺伝子を、 (a) ACATインヒビター、 (b) HMG CoＡリダクターゼ、 (c) 脂質レギュレーター、および (d) 胆汁酸封鎖剤からなる群より選択される１種または２種以上の薬剤と併用して上記患者の肝臓に投与することからなる方法を意図する。第七の態様においては，本発明は、アテローム性動脈硬化症、高βリポ蛋白血症、高コレステロール血症、高トリグリセライド血症、低αリポ蛋白血症、糖尿病の血管性合併症、移植、アテレクトミーおよび血管形成後再狭窄の処置のため、患者に有効量の薬剤を肝内投与するのに適応させた医薬送達方法において、SR 遺伝子と適当なウイルスまたは非ウイルス送達系からなる医薬送達方法を意図する。本発明の第七の態様の好ましい実施態様においては、医薬送達方法はエクスビボまたはインビボ送達に適応される。本発明の第七の態様の最も好ましい実施態様においては、医薬送達方法は治療的または予防的投与を意図する。図面の簡単な説明本発明は以下の非制限的実施例によってさらに詳細に説明するが、そこで参照される添付の図１〜10を簡単に説明する。図１Ｉ型ウシSRミニ遺伝子5.2kb構築体。ウシSR全長cDNA（黒色バー）を3′非翻訳領域中の単一の制限部位Asp 700で切断（truncated）した。約1.6kb のフラグメントをついで、SamＩと5Asp 700の融合部位を用いてヒト成長ホルモン遺伝子のポリＡシグナル配列を含む0.65kb（白色バー）にライゲートした。この5′末端に、BamHＩを用いてマウストランスフェリンプロモーターの３kb DNA フラグメント（点を付したボックス）を結合させた。このミニ遺伝子を、5′末端のEcoRＩおよび3′末端のNotＩを用いてpGem11Zf(−)に挿入した。マウストランスフェリンプロモーターの3′末端におけるBamHＩ部位とSR cDNAの第一のATG コドンの間の領域はウシSRの非翻訳領域の５塩基対（5′-gaagt-3′）を含有し、第一のATGを翻訳開始に至適状態に配置することを可能にした［Kozak M.，Cel l ，47: 481-483(1986); Kozak M.，J ．Cell Biol.，108: 229-241(1989)］。図２ (A)対照およびTgSR＋／−マウスからの肝RNAの逆転写酵素‐ポリメラーゼチェーン反応によりウシSR mRNAの１kb増幅領域の存在を示す。基準DNAサイズ標準が示されている（１kbマーカー）。(B)ウシＩ型SR発現マウスのノーザンブロット解析。各組織サンプルにつき10μgの総RNAをホルムアルデヒド‐１％アガロースゲル上で電気泳動により分画し、Zetaprobe膜上に移し、図１に示したウシＩ型S R特異的cDNAプローブにハイブリダイズさせた。このプローブは同一条件下で、対照マウス組織から単離されたRNAにはハイブリダイズしなかった(図には示していない)。ブロットを洗浄して、X-OmatARフィルムに一夜−80℃で露出した。図３ TgSR＋／−および対照マウスの肝臓メンブレンプレパレーションのウエスタンブロット解析。非還元メンブレン蛋白(22.5μg／レーン)を7.5％SD Sポリアクリルアミドゲルに負荷し、ニトロセルロース膜に移し、例５に記載のようにしてウシSRを定量した。ウシSRのモノマーと多分モノマーの前駆体、ダイマー、およびトリマー型が明白である。図４対照およびTgSR＋／−マウスにおけるDiI‐アセチル化ヒトLDL注入後の肝蛍光組織化学。マウスにDiI‐アセチル化ヒトLDLを静脈内注入し、10分後に屠殺した。肝臓小片をO.C.T.中に包埋し、３〜５μMの切片を調製して、ローダミンフィルターセットを用いて蛍光顕微鏡によって観察した。上段のパネルは対照マウスの肝切片であり、非実質細胞によるDiIの取り込みが洞様構造を取り囲む細長い細胞に限局された蛍光によって明らかである。下段のパネルはTgSR＋／−マウスからの切片を示す。非実質細胞によるDiIの取り込みに加え、核周辺の染色により証明されるように多面体形状の実質細胞（ドーナツ型細胞）に広範な色素の取り込みが生じた。洞様細胞、矢印；実質細胞核、Ｎ。図５対照およびTgSR＋／−マウスにおける¹²⁵I‐アセチル化‐hLDLのクリアランス。５匹のTgSR＋／−マウス（●）および５匹の対照マウス（○）に尾静脈から¹² ⁵ I-ac-hLDLを注射した。血液サンプルを８分まで定期的に採取して血漿放射能のクリアランスを測定した。スカベンジャー受容体によらない¹²⁵I-ac-hLDLのクリアランスをコントロールするため、３匹のTgSR＋／−（■）および３匹の対照（ □）マウスに0.1mLの¹²⁵I-ac-hLDLと0.1mLのFucoidanを一緒に注射した。放射能データは最初の20分秒間時点の百分率で表示する。各データの点は５匹(¹²⁵I-ac-hLDL単独)または３匹(¹²⁵I-ac-hLDLとFucoidan)のマウスからの平均データを示す。図６３週まで固形飼料またはHFHC飼料に維持された非トランスジェニック対照（FV B×C57BL／6J）、TgSR＋／−、およびTgSR＋／＋マウスからの血漿リポ蛋白コレステロールの分析。これらのマウスからの血漿10μLの高速ゲルろ過クロマトグラフィーリポ蛋白プロファイル分析を例11に記載のようにして毎週測定した。固形飼料を給餌したTgSR＋／＋マウス242の血液サンプルは得られなかった。また、対照マウス148は麻酔薬の過量投与のため２週目に死亡した。図には示されていないが、ピーク高（Ｙ‐軸）＝OD 490であり、表示した各12群と同一のスケールである。図７３週まで固形飼料またはHFHC飼料に維持された非トランスジェニック対照（● ，ｎ＝４または５）、TgSR＋／−（▲，ｎ＝５）、およびTgSR＋／＋（■，ｎ＝３または４）マウスにおけるアポＢ含有リポ蛋白中血漿コレステロール（上段パネル）、HDL（中段パネル）およびアポＢ含有リポ蛋白とHDLコレステロールの比（下段パネル）。総血漿コレステロール（表Ｉ）および図６に示したデータからのリポ蛋白プロファイルを測定のために用いた。データの点は平均±SEMを表す。図８ TgSR＋／−マウスにおける肝脂質分析。上段パネルは、固形飼料に維持された対照およびTgSR＋／−マウスからの代表的な肝臓であり、脂肪の蓄積の証拠は認められなかった。HFHC飼料を給餌された対照マウスの肝臓は常に白色で脂肪肝を指示したが、HFHC飼料を給餌されをたTgSR＋／−マウスからの肝臓はわずかに脱色したのみであった。下段パネルは高脂肪高コレステロール飼料を３週間給餌されたのちの４匹の対照および５匹のTgSR＋／−マウス（すなわち、表Ｉ、図６および７で試験された動物）からの肝脂質分析を示す。データは平均±SEMを表す。平均値の有意差は対のないデータのStudentのｔ検定によって決定した。図９例13に記載したように、３週の間に固形飼料ついでHFHC飼料を給餌された５匹の対照（□）および５匹のTgSR＋／−（■）マウスについて糞中総胆汁酸を毎週測定した。データは平均±SEMを表す。図10 ２匹の対照および２匹のヘテロ接合SRトランスジェニックマウスに高脂肪高コレステロール飼料を３週間給餌した。例３に記載したようにして、肝総RNA（10 μg／レーン）を二重にゲル上を流してブロットし、マウス７α‐ヒドロキシラーゼまたはマウスアクチンについてプローブした。７α‐ヒドロキシラーゼとアクチンの比はSRトランスジェニックマウスでは２倍に上昇していた。データは各群２匹のマウスの平均を示す。発明の詳述「一過性発現」の語は一時的な、通常、数日から数週しか持続しないトランスフェクトされた遺伝子の発現を意味する。「安定的発現」の語は発現が持続するトランスフェクトされた遺伝子の発現を意味する。「哺乳動物」の語にはヒトが包含される。「肝臓特異的プロモーター」の語は、天然に存在するかまたは合成を含めて人工的に作成された同種または異種いずれかのプロモーターエレメントから構築されたプロモーターを意味する。「部分ミニ遺伝子」の語は、コード配列以外の１または２以上のエレメント、たとえばプロモーター、5′非翻訳領域、3′非翻訳領域、ポリアデニル化シグナル等を欠くミニ遺伝子を意味する。肝SRが防御的な抗アテローム性動脈硬化の役割を果たすか否かを直接測定するため、肝ウシＩ型SRを過剰発現するトランスジェニックマウスを、FVBマウスにアテローム性動脈硬化易発症C57BL/J6マウスを交配した遺伝背景で作成した。ヘテロ接合体（TgSR＋／−）およびホモ接合体（TgSR＋／＋）マウスの両者を作成した。これらの動物の肝における修飾リポ蛋白の取り込みは著しく上昇した。さらに、コレステルール強化飼料を給餌した場合、これらのマウスではアポＢ含有リポ蛋白および肝コレステロールエステルの顕著な低下、ならびに肝７α‐ヒドロキシラーゼmRNAレベルおよび糞中総胆汁酸の上昇が認められる。これらのデータは肝スカベンジャー受容体のインビボにおける抗‐アテローム性動脈硬化の役割の可能性を直接的に証明するものである。SR トランスジェニックマウスの作成ウシＩ型SRを肝臓で発現するマウスを作成するため、マウストランスフェリンプロモーターを含有するSRミニ遺伝子を構築した（図１）。Kozakらの研究（Koz ak M.，前出，1986; Kozak M.，前出，1989）に基づき、bSR cDNA配列（Idzerda R.L.，Behringer R.R.，Theisen M.，Huggenvik J.I.，McKnight G.S.，Brinst er R.L.，前出，1989）の非翻訳領域の 5 bp を、このエレメントの包含がSRの翻訳の正しい開始と高度な効率を促進することから、上記構築体に導入した。この点は、本発明者らの実験ではこれらの５bpを欠くミニ遺伝子は構築も試験もしなかったので、厳密には調べられていない。SRミニ遺伝子をFVBの雄と交配させたC57BL／6J雌からのハイブリッド受精卵に注入した。PCRおよびサザンブロッティングでは、トランスジェニックの可能性のある３匹のマウスが作成されたことを示した。これらのマウスをC57BL／6J×FVBに交配させ、これら交配による子孫から、創始個体の可能性がある３匹のうち２匹はキメラであり、１匹は生殖細胞系列に導入遺伝子がインテグレートされていることが指示された。サザンブロットの結果は１細胞あたり導入遺伝子約30コピーの存在を示唆した。一部の研究においては、Tg SR＋／−を交配しホモ接合マウス（TgSR＋／＋）を発生させた。トランスジェニックマウスにおけるウシSRの発現ウシSR mRNAの組織特異的発現をTgSR＋／−および非トランスジェニック対照( C57BL／6J×FVB)の組織から単離した総RNAのRT-PCRならびにノーザンブロット解析によって調べた。RT-PCRにより、TgSR＋／−においては１kb cDNAフラグメントが増幅されたが、対照マウスでは増幅されず（図２）、TgSR＋／−マウスの肝臓にウシSR mRNAの存在することが証明された。ウシSR mRNAは主として肝臓において発現し、腎臓でははるかに小量しか見出されなかった。微量のウシSRの発現は脳にも観察された（図２）。本発明者らはウシSRの肝mRNAレベルは内因性のマウスSRに比べて約20〜30倍高いとの評価を得ている（データは示していない）。 TgSR＋／−マウスからの界面活性剤で可溶化した非還元肝臓メンブレンプレパレーションでは、ウシSRのモノマーとおそらくはモノマー前駆体（約80kDaまで）、ダイマー(約160kDa)およびトリマー（約240kDa）型の存在がウエスタンブロッティングによって明らかにされた（図３）。ウシSRの肝実質および非実質での発現対照およびTgSR＋／−マウスに蛍光DiI‐アセチル化ヒトLDLを静脈内注入したのちの肝臓切片の組織学的検査では、非実質クッパー細胞および洞様細胞の両者に蛍光プローブの存在が示された（図４）。しかしながら、非トランスジェニックマウスとは異なり、TgSR＋／−マウス肝実質細胞には蛍光が認められ、これらの細胞が導入遺伝子を発現していることが示唆される（図４）。SR トランスジェニックマウスにおける¹²⁵I-ac-hLDLの異化分率５匹のTgSR＋／−および５匹の非トランスジェニック同胞仔において¹²⁵I-ac- hLDLの異化分率を測定した。マウスにプローブを尾静脈から注射し、10μLの洞眼窩血液を８分後まで周期的に採取した。¹²⁵I-ac-hLDLのクリアランスのt_1/2は、TgSR＋／−マウス（75秒）で対照マウス（186秒）よりも2.5倍速かった（図５）。３匹のTgSR＋／−および３匹の非トランスジェニック同胞仔に Fucoidan および¹²⁵I-ac-hLDLの両者を同時に注射するとプローブのSR誘発クリアランスは遮断された（図５）。血漿脂質およびリポ蛋白プロファイル最初は固形飼料ついでHFHC飼料に３週間維持された対照、TgSR＋／−およびTg SR＋／＋マウスの毎週の血漿トリグリセライドならびに総コレステロールを表Ｉに示す。すべてのマウスおよびすべての食餌条件下において血漿トリグリセライドは類似しており（表Ｉ）、固形飼料では、対照およびトランスジェニックマウスで基底コレステロールレベルは類似していた。高脂肪高コレステロール飼料を給餌した場合には、すべてのマウスにおいて血漿コレステロールは上昇した。しかしながら、３週目で、TgSR ＋／−およびTgSR＋／＋マウスの血漿コレステロールは、対照マウスに認められた値のそれぞれ59％および83％しか上昇しなかった。これらのマウスからの血漿の高速ゲルろ過クロマトグラフィーによるリポ蛋白プロファイルの分析（図６）を用いてリポ蛋白間のコレステロールの分布を決定した（図７）。固形飼料では、対照およびSRトランスジェニックマウスのリポ蛋白コレステロールプロファイルは類似し、これらの条件下ではHDLが大部分のコレステロールを含有した（図６および７）。HFHC飼料が給餌された場合、対照マウスではコレステロールはHD Lに比較してアポＢ含有リポ蛋白中で卓越した上昇を示した（図６および７）。T gSR＋／−およびTgSR＋／＋マウスの両者で、アポＢ含有リポ蛋白は対照マウスで認められた量の半分しか上昇しなかった(図６および７)。TgSR＋／−マウスでは、HDLは対照よりもより急速に上昇したが、HFHC飼料を給餌して３週間後にはコレステロールレベルは一定になった（図７）。これに対して、HFHC飼料を給餌されたTgSR＋／＋マウスでは、HDLコレステロールは上昇を続け、３週目にはそのレベルは対照マウスのレベルよりも有意に高くなった（図６および７）。リポ蛋白プロファイルにおけるこれらの著しい差はアポＢ含有リポ蛋白コレステロールとHDLコレステロールの比として評価できる（図７）。すなわち、TgSR＋／− およびTgSR＋／＋マウスではこの比はHFHC飼料で2.8倍上昇し、一方、対照マウスではこの比は6.6倍上昇した。コレステロールの吸収および食餌摂取量の検討トランスジェニックマウスにおける総血漿コレステロールの低下が食餌摂取量の低下またはコレステロール吸収の障害を反映する可能性も否定できない。そこで、HFHC食餌を給餌された５匹の対照および５匹のTgSR＋／−について食餌摂取量を３週間にわたって記録した。各群の平均体重は22ｇであった。週間食餌摂取量は群間で実質的に同一で、１週、２週および３週それぞれにおいて対照マウスは23.1、22.9および24.3ｇ／週を消費し、一方TgSR＋／−マウスは21.9、27.5および24.7ｇ／週を消費した。次に、３匹の対照および５匹のTgSR＋／−マウスについて、コレステロールの吸収を測定した。動物に、サンフラワー油注³H‐コレステロール／¹⁴C‐β‐シトステロールを経口的に強制投与し、HFHC飼料に維持し、４日間糞を採集した。経口摂取量および糞から抽出された中性脂質分画中の³H／¹⁴Cの比を用いて、コレステロールの吸収量を評価した。コレステロールの吸収百分率は、対照（56.8 ±3.4）とTgSR＋／−（56.6±4.4）マウスでほぼ同じであった。これらの研究全体から、SRトランスジェニックマウスに認められた血漿コレステロールレベルの低下は、食餌摂取量またはコレステロール吸収の低下によるものではないことが示唆される。肝臓の脂質固形飼料に維持された対照およびTgSR＋／−マウスの肝臓の肉眼的検査では、脂肪の蓄積の形跡を見られなかった。HFHC飼料を給餌された対照マウスの肝臓はかなりの脂肪の蓄積を示した。これに反して、HFHC飼料を給餌されたTgSR＋／− マウスの肝臓は、正常（図には示していない）のように見えるかまたはわずかな脱色（図に示してある）を示した（図８）。SRトランスジェニックマウスに肝脂質が蓄積するか否かを決定するため、高脂肪高コレステロール飼料を３週間給餌後、４匹の対照および５匹のTgSR＋／−マウス（すなわち表Ｉ、図６および７の試験動物）について脂質分析を実施した。TgSR＋／−マウスでは、肝コレステロールエステル、トリグリセライドおよび非エステル化コレステロールの蓄積はなく、むしろ逆にそれぞれ59 ％、61％および36％に有意な減少を示した（図８）。肝ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンのレベルはほぼ同じであった（図８）。糞中胆汁酸 SRトランスジェニックマウスにおいて胆汁酸の排出増加があるか否かを測定するため、固形飼料の１週給餌後、ついでHFHC飼料の３週給餌時に、５匹の対照および５匹のTgSR＋／−マウスについて総糞中胆汁酸を毎週測定した。固形飼料給餌時の糞中胆汁酸は、対照（1.51±0.20mg／週）およびTgSR＋／−（1.37±0.40 mg／週）マウスでほぼ同じであった。HFHC飼料の給餌時には対照マウスでは、糞中胆汁酸は１週目で5.4倍と著しく増加し(8.19±0.95mg／週)、試験期間を通じ一定に維持された（２週目：8.06±1.65mg／週；３週目：8.49±0.36mg／週）。同様に、HFHC飼料を給餌されたTgSR＋／−マウスの糞中胆汁酸も１週目には5.8 倍に増加した(7.91±1.54)。しかし、対照的に以後の２週も糞中胆汁酸は増加を続けた（２週目：9.23±1.17mg／週；３週目：10.83±0.33mg／週）(図９)。肝7α‐ヒドロキシラーゼmRNAレベル 7α‐ヒドロキシラーゼ（肝内胆汁酸合成の律速酵素）のメッセンジャーRNAレベルがTgSR＋／−マウスで著しく上昇していたか否かを測定するために、HFHC飼料に３週間維持された２匹の対照および２匹のTgSR＋／−マウスから肝総RNAを抽出した。ノーザンブロット解析により、TgSR＋／−においてはマウスアクチンmRNAに対する７α‐ヒドロキシラーゼmRNAレベルが対照マウスと比較して２倍に上昇していたことが明らかである（図10）。すなわち、TgSRマウスにアテローム性硬化を誘発する飼料を給餌した場合、食餌摂取量にもコレステロールの吸収にも差は認められなかった。しかしながら、それらの血漿リポ蛋白プロファイルは、アポＢ含有リポ蛋白コレステロールの蓄積の低下を示した。この効果は全く劇的であった。TgSR＋／−マウスはHFHC飼料を給餌して１週後、非トランスジェニックマウスと比較して、アポＢ含有リポ蛋白の上昇はほぼ半分に低下した。この応答の差は３週間の給餌期間を通して一定していた。これは、非トランスジェニックマウスとトランスジェニクマウスがほとんど同等のリポ蛋白プロファイルを維持した通常の固形飼料給食期間との著しい差であった。さらに、TgSR＋／−マウスはHFHC飼料を給餌された場合、肝コレステロールの補償的な上昇は観察されず、実際、トランスジェニックマウスでは、肝臓のコレステロールおよびコレステリルエステルの両者が低下した。これらのデータは、胆汁酸としての胆汁コレステロールの分泌の上昇を示唆した。実際、肝7α‐ヒドロキシラーゼmRNAレベルおよび糞中総胆汁酸の両者ともトランスジェニックマウスでは上昇した。これらの研究全体から、肝臓SRの過剰発現がコレステロール分泌排出を増大させたことが示唆される。 TgSRマウスからの組織の本発明者らによるノーザンブロット実験にでは、SR mRNAの発現は、圧倒的に肝臓に限定されていた。DiI‐アセチル化‐ LDLを注射したTgSR＋／−マウスの肝臓の蛍光顕微鏡検査では、正常でもSRを発現する洞様内皮細胞（Dresel H.A.，Friedrech E.，Via D.P.，Sinn H.，Ziegle r R.，Schettler G.，前出，1987; van Berkel T.J.C.，Nagelkerke J.F.，Krui jt J.K.，前出，1981; Dresel H.A.，Friedrich E.，Via D.P.，Shettler G.，S inn H.，前出，1985; de Rijke Y.B.，van Berkel T.J.C.，前出，1994; Nagelk erke J.F.，Barto K.P.，van Berkel T.J.C.，前出，1983: Pitas R.E.，Boyles J.，Mahley R.W.，Montgomery B.D.，前出，1985; Horiuchi S.，Takata K.，M aeda H.，Morino Y.，前出，1985; van Berkel T.J.C.，de Rijke Y.B.，Kruijt J.K.，前出，1991; Esbach S.，Pieters M.N.，Van der Boom J.ら，前出，199 3）ならびに正常時はほとんどSRを検出できない肝細胞(Nagelkerke J.F.，Barto K.P.，van Berkel T.J.C.，前出，1983)においてSRの活動が証明された。さらに、トランスジェニックマウスではac-hLDLのクリアランス速度が2.5倍に上昇しているという本発明者らによる観察は、肝によって統括されるクリアランスがアテローム性動脈硬化症に対して防御効果を与えることを示唆している。 BrownおよびGoldsteinの研究室からの初期の研究（Brown M.S.，Goldstein M. S.，Goldstein J.L.，前出，1990）によって示唆されているように、SRは修飾リポ蛋白を除去することによってアテローム性動脈硬化の発症に保護的な役割を果たすと考えられてきた。実際、高コレステロール飼料を給餌されたウサギからのアポＢ含有リポ蛋白は対照のウサギから単離されたLDLよりインビトロでCu⁺²誘導性修飾を受けやすい［Nenseter M.S.，Gudmundsen O.，Malterud K.E.，Berg T.，Drevon C.，Biochem ．Biophys．Acta.，1213:207-214(1994)］。さらに、Pa linskiらの研究[Palinski W.，Rosenfeld 1372-1376(1989)]はLDL受容体欠損ウサギにおけるLDLのインビボでの酸化的修飾を証明するものである。さらに、Palinskiらによる研 1989; Palinski W.，Ord V.A.，Plump A.S.，Breslow J.L.，Steinberg D.，Wit ztum J.L.，Arterioscler ．Thromb.，14: 605-616(1994)］はLDL受容体欠損ウサギを用いて［Palinski W.，欠損マウスを用い[Palinski W.，Ord V.A.，Plump A.S.，Breslow J.L.，Steinb erg D.,Witztum J.L.，前出，1994; Plump A.S.，Smith J.D.，Hayek T.，Cell ，71: 343-353(1992)]、「修飾」リポ蛋白上に存在するエピトープであるマロンジアルデヒド‐リジンへの高力価の自己抗体の存在を証明することによりアポＢ含有リポ蛋白の酸化的修飾のインビボにおける証拠を提供している。HFHC飼料を給餌されたマウスにおいても有意な量の「修飾」アポＢ含有リポ蛋白が形成されると考えられることから、アポＢ含有リポ蛋白コレステロール量の低下を特徴とするそれらの減少は、SRの過剰発現によるものと思われる。これらの「修飾」リポ蛋白の高コレステロール血症の血漿中における蓄積を提示することはできないことから、上述の仮定的前提によれば、インビボにおいて発現したSRがリポ蛋白のわずかな修飾にも極めて敏感なことを示唆している。またさらに、「修飾」リポ蛋白が血漿中に認められないことから、それがSR の能力を超えることはないと考えられる。しかしながら、動脈内皮下SRと肝臓の SRとの間には競合が存在するものと思われる。したがって、肝臓のSRの発現が高い状態では「修飾」リポ蛋白が大動脈内皮下に存在するSRに結合する可能性は低いと考えられる。しかしながら、ある種の病態生理学的条件または処置によって誘発された条件（たとえば、アテレクトミー、血管形成術）においては、動脈内皮が解決に当たり、内皮下SRの相対的な数およびそれへの負担が増大する。このような状態がヒトを含めて哺乳動物に起こった場合、修飾リポ蛋白は動態学的に、内皮下の細胞によって発現されたSRへの結合を優先し、動脈への脂質沈着を招く可能性が生じる。アポＢ含有リポ蛋白の低下に関して、TgSR＋／−とTgSR＋／＋の間に遺伝子用量効果は認められなかった。多分、異型接合マウスにおいて形成されるすべての修飾リポ蛋白を効率的に除去するのに十分なSRがこれらの動物で産生しているものと思われる。HDLに生じた上昇は予期しないものであった。HDLがTgSR＋／＋マウスにおいて著しく、またTgSR＋／−およびTgSR＋／＋マウスにおいて早期に上昇するという観察は、HDL代謝における変化を示唆するものであった。この所見を全く明解に説明することはできていないが、いくつかの推測は可能である。これらのマウスでは多分、HDLの異化が低下しているものと思われる。これはアポＢ含有粒子によるアポＥの除去の増進によって生じ、それがおそらく、全HDL粒子のクリアランスに必要なアポＥプールを減少させる[Bisgaier C.L.，Siebenka s M.V.，Williams K.J.，J ．Biol．Chem.，264：862-866(1989)]可能性がある。別の考え方として、これらのマウスではHDLの産生が上昇している可能性がある。これはSRの発現の増大によって起こる。SRの量の増加により、増量した「修飾」VLDL残遺物がおそらく肝臓内に縁取りを形成していると思われる。捕捉された残遺物ならびに循環VLDL残遺物およびHDLのトリグリセライドおよびリン脂質は肝臓のリパーゼの基質である［J ackson R.L.，B ．P．New York，141-181(1983)］。他の種と異なりマウスにおける肝誘導肝臓リパーゼは、肝の膜グリコサミノグリカンに繋留されずに、自由に循環している[Peterson J.，Bengtsson-Olivercrona G.，Orivecrona T.，Bioch im ．Biophys．Acta ，878: 65-70(1986)]。したがって、この酵素レベルの上昇は、SR受容体に結合した「修飾」VLDL残遺物基質の増加により、その合成部位付近に限局されることが考えられる。肝臓リパーゼによるこれらの修飾「残遺物」の脂肪分解の亢進は過剰な表面リン脂質の発生を招き、これがHDLプールの産生を高める可能性がある［Tall A.R.，Small D.M.，N ．Engl.J．Med.，299: 1232-12 36(1978); Eisenberg S.，Patsch J.R.，Sparrow J.T.，Gotto A.M．Jr.，Olive crona T.，J ．Biol．Chem.，254:12603-12608(1979); Schaefer E.J.，Wetzel M .G.，Bengtsson G.，Scow R.O.，Brewer H.B．Jr.，Olivecrona T.，J ．Lipid Res. ，23: 1259-1273(1982); Tam S.P.，Breckenridge W.C.，J ．Lipid Res.，2 4: 1343-1357(1983)］。マウスはコレステロールエステル輸送蛋白を欠くことから［Agellon L.B.，Walsh A.，Hayek T.ら，J．Biol．Chem．260: 10796-10801( 1990)］、HDLトリグリセライドが、HDLコレステロールエステルとの交換により、VLDLおよびVLDL残遺物から効率的に誘導されることはなく[Tall A.R.，J ．Lip id Res .，34: 1255-1274(1993)]、したがって、粒子の非極性核の拡大は、主としてコレステロールエステルの蓄積によるものである。 HDLリン脂質の表面もまた肝リパーゼの基質であり、この酵素の大部分が結合した「修飾」粒子の増加によって肝臓内に限局されると、二次的効果として循環肝リパーゼのレベルが低下することになる。これによりHDL異化の変化が進展する可能性も考えられる。おそらく、これらの粒子のリン脂質表面は徹底的な脂質分解を受け難く、これがこれらのHDLをレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼのよりよい基質となることを可能にし、その結果、核コレステロールエステルの蓄積を生じることも考えられる。 SR遺伝子は、一時的にもしくは安定的にDNAを細胞内に導入するための既知の多くの方法のうちの任意の方法によって細胞内に導入することが可能である［"G ene Therapeutics" Methods and Applications of Direct Gene Transfer，Wolf f，J.A.編，Birk- L.L.，Raper，S.E.，Stradford-Perricaudet，L.D.，Wilson，J.M.，J ．Biol．C hem ．269: 13695-13702(1994); 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Kolodka，T.M.，Finegold，M.，Woo，S.L.，Somatic Cell and Molocular Genetics 19: 491-497(1993)］。DNAを細胞内に導入する方法には、リン酸カルシウム共沈降、陽イオン性リポソーム、エレクトロポレーション、受容体誘発エンドサイトシス、粒子誘導遺伝子導入、合成ペプチドへの結合、またある種の細胞型については裸のDNAを使用することができる。SR遺伝子はまた、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびヘルペスウイルスを包含するよく知られた任意のウイルスベクターによっても導入することができる。すなわち、本発明のSR遺伝子は本技術分野の熟練者には既知の慣用の遺伝子導入技術によって細胞内に導入することができる。高コレステロール血症およびその病理学的続発症の軽減のための遺伝子治療の形態でのSRの使用は、次のように進められる。SRミニ遺伝子構築体はウイルス性または非ウイルス性いずれかの送達法を用いて調製する。製剤には、たとえば、スカベンジャー受容体を発現するベクター10μg〜10mgを送達する陽イオンリポソーム[Philip B.ら，J ．Biol．Chem.，268: 16087-16090(1993)]を使用できる。インビボ投与のためには、肝臓への組織‐特異的遺伝子発現に向けられたベクターを用いるのが通常好ましい。得られた製剤はボランティアに静脈内注入し、処置の有効性は患者の血漿コレステロールおよびそのリポ蛋白中分布を測定してモニタリングする。別法として、エクスビボで処置を行うこともできる。患者の肝臓の一部分を外科的に採取する。肝実質細胞を標準的な技術によって単離し、組織培養液中に置く。肝臓細胞をついで標準的技術によってSR遺伝子でトランスフェクトし、数日間培養液中に置き、SRの細胞表面発現について試験する。得られた細胞プレパレーションをついで患者に再注入し、その肝臓細胞を肝臓に定着させてSRを発現させる。処置の有効性は血漿総コレステロールの測定およびリポ蛋白中のその分布によってモニタリングされる。SR遺伝子治療を受ける患者の至適処置には多くの場合、ACATインヒビター、HMG-CoAリダクターゼインヒビター、胆汁酸封鎖剤または脂質レギュレーターの共投与が包含されることになろう。 ACATインヒビターの例としては、英国特許第1,123,004号およびJapan ．J．Pha rmacol. 42: 517-523(1986)に開示されているDL‐メリナミド；米国特許第4,716 ,175号に開示された2,2‐ジメチル‐Ｎ‐（2,4,6‐トリメトキシフェニル）ドデカンアミド；米国特許第5,015,644号に開示されたＮ‐［2,6‐ビス（１‐メチルエチル）フェニル］‐N'‐[[１‐（４‐ジメチルアミノフェニル）シクロペンチル]メチル]尿素；1994年４月13日出願の係属中の米国特許第出願一連番号08／23 3,932号に開示されている2,6‐ビス（１‐メチル‐エチル）フェニル[[2,4,6‐ トリス（１‐メチルエチル）フェニル]アセチル]スルファメート等が包含される。米国特許第4,716,175号と第5,015,644号および米国特許出願一連番号08／233,932号、ならびに英国特許第1,123,004号およびJapan ．J．Pharmacol. 42: 517-523(1986)は引用により本明細書に加入される。 HMG-CoAリダクターゼインヒビターの例は、米国特許第4,231,938号に開示されたロバスタチン；米国特許第4,346,227号に開示されたプラバスタチン；米国特許第4,444,784号に開示されたシンバスタチン；米国特許第4,739,073号に開示されたフルバスタチン；米国特許第4,681,893号および第5,273,995に開示されたアトロバスタチン等がである。米国特許第4,231,938号、第4,346,227号、第4,444, 784号、第4,681,893号、第5,273,995および第4,739,073号は引用により本明細書に加入される。胆汁酸封鎖剤の例には、米国特許第3,692,895号および第3,803,237号に開示さているコレスチポール：米国特許第3,383,281号、ならびにR．Casdorph，Lipid Pharmacology 2: 222-256,Paoletti C & Glueck J．編，Academic Press，New Y ork，1976に開示されたコレスチラミンなどがある。米国特許第3,692,895号、第 3,803,237号および第3,383,281号ならびにR.Casdorph，前出は引用により本明細書に加入される。脂質レギュレーターの例には、米国特許第3,674,836号に記載されたゲムフィブロジル；米国特許第3,781,328号に開示されているベザフィブレート；米国特許第3,262,850号に開示されたクロフィブレート；米国特許第4,058,552号に開示されたフェノフィブレート；McElvainら，Org ．Syn.，4: 49(1925)に開示されているナイアシン等が包含される。米国特許第3,674,836号、第3,781,328号、第3, 262,850号、第4,058,552号ならびにMcElvainら，Org ．Syn.，4： 49(1925)は引用により本明細書に加入される。以下の非限定的実施例は本発明のSR遺伝子を調製するために発明者によって選択された方法である。例１ウシSRミニ遺伝子プレパレーション部分Ｉ型SRのcDNAクローンを、ウシ肺のλgt10 cDNAライブラリー(Clontech L aboratories，Inc，Palo Alto，California)から、公開れされている配列［Koda ma T.，Freeman M.，Rohrer L.，Zabrecky J.，Matsudaira P.，Kreiger M.，Na ture ，343: 531-535(1990)］基づいて選択された３つのオリゴヌクレオチドを用いて単離した。このcDNAフラグメント、長さ1.8kbをpGEM 3Zf(−)（Promega Cor p，Madison，Wisconsin）にサブクローニングした。部分cDNAクローンの失われた0.3kbの5′末端を逆転写酵素とポリメラーゼチェーン反応(PCR)をカップリングし[Mullis K.B.，Faloona F.A.，Methods in Enzymology，155: 335-350(1987 ); Saiki R．K.，Gelfand D.H.，Stoffel S.，Science，239: 487-491(1988)]、鋳型としてウシ肺のmRNA（Clontech Laboratories，Inc）、ならびに特異的5′( 5′-GGGCGTCCGGATTTGGAGATATATCTGCA-3′)および3′(5′-GCGGATCCGAAGTATGGCAC GTGGGATGACTTTCC-3′)プライマーを用いて合成した。このcDNA発生フラグメントをついで、そのプラスミドのポリリンカー部位中のBamHＩと、SR配列内部のAccI II制限部位の間に1.8kbウシSRを含有するpGEM 3Zf(−)クローン（Promega Corp ，Madison，Wilconsin）中にライゲートした。完全長ウシSR cDNAは、ジデオキシチェーンターミネーション法を用いるヌクレオチド配列決定［Sanger F.，Nic klen S.，Coulson A.R.，Proc ．Natl．Acad． Sci ．USA ，74: 5463-5467(1977)］によって確認された（Kodama T.，Freeman M. ，Rohrer L.，Zabrecky J.，Matsudaira P.，Kreiger M.，前出，1990）。ウシ SRミニ遺伝子の構築には約３kbのマウストランスフェリンプロモーター［Idzerd a R.L.，Behringer R.R.，Theisen M.，Huggenvik J.I.，McKnight G.S.，Brins ter R.L.，Mol ．Cell．Biol.，9：5154-5162(1989)］をウシSR cDNAの5′‐末端にライゲートした。マウストランスフェリンプロモーターには3′‐末端に人工的に導入されたBamHＩ制限部位があって(Idzerda R.L.，Behringer R.R.，Theis en M.，Huggenvik J.I.，McKnight G.S.，Brinster R.L.，前出，1989)、これがウシSRクローンへのライゲーションに便利であった。得られた構築体は、５bpのウシSR5′‐非翻訳領域をATG開始コドンの上流に含有した。構築体中にこの短い５bp非翻訳領域を含むことは、効率的な翻訳に必要であるように思われた（すなわち、「最初のAUG規則」）(Kozak M.，前出，1986; Kozak M.，前出，1989)。プロモーター-ウシSR構築体の3′‐末端には停止シグナルを含む0.65kbヒト成長ホルモンの遺伝子配列を、Asp 700／SamＩ融合部位にライゲートした（図１）。ミニ遺伝子構築体の総サイズは5.2kbであり、EcoRＩ(5′‐末端)およびNotＩ(3 ′‐末端)にて切断して単離し、Qiaex（Qiagen Inc，Chatsworth，California）で精製し、トランスジェニックマウスの作成に使用した。例２ウシSRトランスジェニックマウスの作成受精‐細胞胚を過排卵C57BL／6Ｊ×FVBマウス（Jackson Laboratories）から単離した。トランスジェニックマウスの作成には、約1000個の受精胚の雄性前核に、上述の精製5.2kbミニ遺伝子構築体をDNA濃度３ ng／μlでマイクロインジェクションし[Brinster R.L.，Palmiter R.D.，The Ha rvey Lectures ，Series 80: 1-38(1980); Hogan B.，Costantini F.，Lacy E.， Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1986]、ICR偽妊娠マウスに移植した。可能性のある45の創始動物をサザンブロッティングおよびPCRでスクリーングした（下記参照）。これらの中で３匹のマウスが陽性で、したがってC57BL／6 Ｊとの交配により繁殖させた。３例の創始動物中１匹の雌性マウス（マウス1876 ）のみで導入遺伝子が生殖細胞系に導入されていて、それは子孫に伝えられた。他の２例の創始動物はキメラであった。マウス1876を、非トランスジェニックC5 7BL／6Ｊマウスと交配してヘテロ接合体系（TgSR＋／−）が樹立された。ホモ接合体マウス（TgSR＋／＋）はTgSR＋／−の交雑によって得られた。いずれのTgSR ＋／−も健康で、少なくとも２年間丈夫に育っている。TgSR＋／＋はそれらの創造以来健康である（約0.5年）。創始動物および子孫世代におけるウシSRミニ遺伝子の伝達はサザンブロット分析[Southern E.M.，J ．Mol．Biol.，98: 503-517(1975)]およびPCRの両者によって確認された。サザンブロット分析では、ゲノムDNA（10μg）を制限酵素EcoRＩおよびBamHＩまたはBamHＩ単独で消化した。サンプルを１％アガロースゲル中電気泳動に付し、Zetaprobe膜（Bio-Rad，Laboratories，Hercules，California）にブロットした。ブロットを42℃において５〜６時間プレインキュベートし、次に³²P-dCTP（Amersham Corp．Arlington Heights，Illinois）を用い、ランダムプライマー（Behringer Mannheim，Indianapolis，Indiana）によって得た0.7kb フラグメント(図１参照)に一夜ハイブリダイズさせた。PCR分析では、ウシ特異的プライマー、5′-CCTCCATCCAGGAACATGAG-3′および5′-CCTTTTCTGTGGATAAAATTC-3′を用いて、１kb cDNAフラグメントをトランスジェニックマウスから増幅できたが、非トランスジェニックマウスからは増幅されなかった。導入遺伝子のコピー数の評価にはサザンブロット分析を用いた。TgSR＋／−ゲノムDNAハイブリダイゼーション強度を、ウシSRミニ遺伝子DNAを多様な量含む対照マウスゲノムDNAからなる標準と比較した。例３RNA 分析ウシSR、マウス７α‐ヒドロキシラーゼおよびマウスアクチン（Ambion，Inc, Austin，TX）mRNAの組織特異的発現はノーザンブロット分析で測定した。総RNA は対照およびトランスジェニックマウスの肝臓、脾臓、肺臓、脳、心臓、腎臓、小腸、大腸、卵巣、脂肪組織および筋肉から、RNAzol（Biotecx Laboratories， Inc，Houston，Texas）により、この試薬とともに供給された説明書に従って単離した。総RNAの定量的および定性的評価はそれぞれ、分光分析的におよび１％アガール上での分析によって行った。ノーザンブロット分析の実施前に、TgSR＋／−および非トランスジェニック同腹仔からの総肝臓RNA（５μg）に上流特異的ウシSRプライマー(5′-CCTTTTCTGTG GATAAAATTC-3′)、ならびに第一鎖cDNA合成キット（Superscript，BRL）を使用して、逆転写反応を行った。逆転者酵素（Seikagaku America，Inc）を加えない対照反応も実施した。反応は37℃で15分間、ついで42℃でさらに30分間行った。逆転写酵素産物を下流プライマー（5′-CCTCCATCCAGGAACATGAG-3′）、ならびにPC R増幅キット（Perkin-Elmer）の存在下にPCR増幅に付した。生成物は１％アガロースゲル上で分析した。ノーザン分析では、サンプル（総RNA 10μg）を負荷緩衝液(DEPC水、１×MOPS ，6.6％ホルムアルデヒド、50％ホルムアミド、５％グリセロール、ブロモフェノールブルー)中70℃で10分間加熱し、ついで6.3％ホルムアミド‐１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。RNAを10×SSC緩衝液中でZetaprobe膜に移し、ランダムプライマー処理で得られた上述の0.7kbの³²P‐ウシSR cDNAプローブ( 図１)に65℃でハイブリダイズさせた。ブロットは最初、0.1×SSC／0.1％SDSによって室温で10分間、ついで50℃でさらに10分間洗浄した。ブロットはX-Omat A Rフィルム（Eastman Kodak，Rochester，New York）に露出した。別のノーザンブロット実験で、³²P‐ウシSR cDNAプローブは内因性マウスSRを認識しないことが明らかにされた。同様に、0.2kb ³²P‐マウスSR cDNAプローブもマウスSRに特異的であることが示された。内因性マウスSR mRNAに対する肝臓ウシSRの存在比を評価するためには、対照およびTgSR＋／−マウスからの肝臓mRNAの二重ノーザンブロットをマウスまたはウシ特異的SR cDNAプローブにハイブリダイズさせ、上述の場合と同様に処理した。ノーザンブロット分析は、HFHC飼料を給餌された対照およびTgSR＋／−マウスにおける内因性肝臓７α‐ヒドロキシラーゼおよびアクチンのmRNAレベルの定量に際しても使用した。総肝臓RNA（10μg／レーン）をホルムアルデヒドゲル上電気泳動に付し、ついで20×SSC緩衝液中でニトロセルロース膜（Schleicher & Sc huell，Inc， Keene，New Hampshire）に移した。膜を1.5時間80℃で乾熱処理し、プレハイブリダイズし、ついでホルムアミド条件を用いて62℃でハイブリダイズさせた。0. 3kbマウス7α‐ヒドロキシラーゼおよびマウスアクチンリボプローブはいずれも、ランオフキット（Riboprobe Gemini II Core System，Promega）および³²P-CT P(Amersham)を用いて発生させた。膜は10分間、２×SSC／0.2％ SDSにより、最初は40℃、ついで50℃、そして次に62℃(7α‐ヒドロキシラーゼ)または50℃(アクチン)で３回洗浄した。７α‐ヒドロキシラーゼの場合はさらに２回、0.1×SS C／0.2％ SDS中 65℃で10分ついで20分の洗浄を継続した。アクチンの場合には続けてさらに１回、0.1×SSC／0.2％ SDS中50℃で10分の洗浄を実施した。イメージ分析ならびにノーザンバンドの定量はMolecular Dynamics 400E Phosphoima ger（Molecular Dynamics，Sunnyvale，California）で実施した。例４蛋白質の定量これらの研究における各種蛋白質についてBCA蛋白アッセイ試薬(PIERCE，Rock ford，Illinois)、Bradford法[Bradford M.M.，Anal ．Biochem.，72: 248-254(1 976)]、もしくはLowry法［Lowry O.H.，Rosebrough N.J.，Farr A.C.，RandallR ．J.，J. Biol. Chem.，193，265-275(1951)］のいずれかによって定量した。すべての場合、ウシ血清アルブミンを標準として用いた。例５ウエスタンブロット分析肝臓のメンブレンは、Viaらの方法［Via D.P.，Dresel H.A.，Gotto A.M．Jr. ，Methods in Enzymology，129: 216-226(1986)］に従って、対照およびTgSR＋／−マウスから単離した。略述すれば、肝臓を、50 mMトリス塩酸塩、150mM NaCl、１mM EDTA、0.5mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）および10Ｕ／mlのアプロチニン、pH 8.0（４ml／ｇ組織）中でホモジナイズし、４℃で10分間1500ｇにおいて遠心分離して細胞屑を除去した。上清を４℃で１時間100,000ｇ（Beckman Ti60ローターにより40,000rpm）で遠心分離し、メンブレンペレットを、50mMトリス塩酸塩、150mM NaCl、１mM EDTA 、0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）および10Ｕ／mlのアプロチニン、pH 8.0中40mMオクチルβ‐グルコピラノシドの氷冷液に懸濁した。非還元メンブレン蛋白質を7.5％SDSポリアクリルアミドゲル上電気泳動に付し、電気泳動的に（室温で1.5時間、100Ｖ）ニトロセルロース膜に移した。膜は、50mM トリス塩酸塩、150mM NaCl、pH 8.0中５％脱脂粉乳(blotto)でブロックし、ついでモルモット抗‐ウシSR IgG(DeJager S.，Mietus-Synder M.，Pitas R.E.，Art erioscler.Thromb .，13：371-378(1993); Pitas R.E.，Friera A.，MuGuire J. ，DeJager S.，Arterioscler.Thromb.，12: 1235-1244(1992))とインキュベートした。アルカリホスファターゼに接合したヤギ抗‐ウサギIgG(モルモットIgGと交差反応する)とインキュベートすると、ウシSR‐抗体複合体がECL検出系（Amer sham）で可視化された。例６LDL の単離および修飾ヒトLDL(hLDL)は、密度間隔1.019〜1.050ｇ／mlで連続超遠心によって分離した［Havel R.J.，Eder H.A.，Bragdon J.H.，J．Clin．Invest.，34：1345-1353 (1955)］。hLDLを無水酢酸でアセチル化して(ac-hLDL)（Goldstein J.L.，Ho Y.K.，Basu S.K.，Brown M.S.，前出，1979 ）、蛍光試験（下記参照）に使用した。ac-hLDLをMacFarlaneの一塩化ヨウ素法により［MacFarlane A.S.，Nature，182: 53(1958)］¹²⁵Ｉで放射標識して、動態研究（下記参照）に使用した。例７蛍光組織化学 ac-hLDLをDiI（1,1′‐ジオクタデシル‐3,3,3′,3′‐テトラメチルインドカルボシアニン過クロール酸塩）によりVoytaらの方法[Voyta J.C.，Via D.P.，Bu tterfield C.E.，Zetter B.R.，J.Cell Biol.，99: 2034-2040(1984)]に従って標識した。対照ならびにTgSR＋／−マウスの尾静脈にDiIac-hLDL(1.6μg／μl) を注射した。10分後、マウスを屠殺し、肝臓組織をPBSで濯ぎ、小片に切断してドライアイス上OCT（Baxer）に包埋した。クリオスタット切片（３〜５μm）をポリリジンでコーティングしたスライド上に載せ、ローダミンフィルターセットを用いて蛍光顕微鏡により分析した。例８アセチル化LDLのインビボクリアランス ¹²⁵I-ac-hLDLクリアランスの動態は５匹のTgSR＋／−マウスおよび５匹の対照マウスで測定した。マウスに¹²⁵I-ac-hLDL(1.6mg蛋白質、0.2 ml)を尾静脈から注射した。眼窩洞血液サンプル（10μl）を８分まで定期的にヘパリン化毛細管に採集した。放射能のデータは最初の20‐秒時点の百分率として表した。非スカベンジャー受容体誘導¹²⁵I-ac-hLDLクリアランスの対照として、３匹のTgSR＋／ − マウスおよび３匹の対照マウスに、0.1ml ¹²⁵I-ac-hLDLプレパレーションおよび 0.1ml Fucoidon(10mg／ml)を共注射した(Brown M.S.，Goldstein J.L.，Krieger M.，Ho Y.K.，Anderson R.G.W.，前出，1979)。例９飼料摂取量試験５匹のTgSR＋／−マウスおよび５匹の対照マウスを個別代謝ケージで３週間、高脂肪高コレステロール（HFHC）飼料（飼料Ｄ12336，Research Diets，Inc，Ne w Brunswick，New Jersey）に維持した。HFHC飼料はPaigenらにより用いられたアテローム性硬化誘発飼料［Paigen B.，Morrow A.，Bradon C.，Mitchell D.， Holmes P.，Atherosclerosis，57: 65-73(1985)］に類似し、1.25％コレステロール、16％脂肪(５％大豆油、7.5％ココア脂、および3.5％ココナツ油)および0. 5％コール酸を含有した。選択された動物は、平均体重22〜25ｇで、２カ月齢であった。各群、３匹の雄および２匹の雌とした。各動物の週間飼料摂取量は日７、14および21日に計算した。例10飼料試験固形飼料に維持された５匹のTgSR＋／−、４匹のTgSR＋／＋および５匹の対照マウスを７〜８時間絶食させたのちメトファン（Pro-Vet）麻酔下に尾から0.3ml の血液を採取した。マウスはついでHFHC飼料に３週間維持した。マウスは毎週、７〜８時間の絶食後に採血した。例11リポ蛋白および脂質の分析血漿サンプル10μl中のリポ蛋白総コレステロールの分布は、装置およびデータ処理に、それぞれRainin HPLCおよびDynamic Compare Software(RaininInstru ment Co，Inc，Woburn，Massachusetts)を用いたほかは、Kieft K.A.，Bocan T. M.A.，Krause B.R.，J ．Lipid Res.，32: 859-866(1991)および Aalto-Seyala K .，Bisgaier C.L.，Ho A.ら，J ．Clin．Invest.，93: 1776-1786(1994)の記載にほぼ従って、Superose 6（Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，New Jersey）高速ゲルろ過クロマトグラフィー後、ポストカラム溶出液からオンライオンで連続的に測定した。総血漿トリグリセライドは、市販のキット（Trigli-cinet 2 k it，Sclavo Inc，Wayne，New Jersey）により酵素的に測定した。総血漿コレステロールは、Allainらの方法［Allain C.C.，Poon L.S.，Chan C.S.G.，Richmon d W.，Fu P.C.，Clin ．Chem.，20: 470-475(1974)］により酵素的に測定した。例12肝脂質の分析主要肝脂質クラスは、25日間HFHC飼料に維持された５匹のTgSR＋／−マウスおよび４匹の対照マウスで測定した。肝臓(0.5ｇ）を総容量５mlのリン酸緩衝食塩溶液中でホモジナイズした。アリコートを蛋白質の定量（Lowry O.H.，Rosebrou gh N.J.，Farr A.C.，Randall R.J.，前出，1951）および肝脂質の抽出のために分離した。ホモジナイズされた肝臓（1.0ml）を、Slaybackの方法［Slayback J. R.B.，Cheung L.W.Y.，Geyer R．P.，Anal.Biochem.，83: 372- 384(1977)］に従い、テフロン張りのスクリューキャップ付き20-mlガラス試験管内で、0.01％ブチル化ヒドロキシトルエンおよび４‐ヒドロキシコレステロール（１mg）内部標準を含む酢酸エチル／アセトン(２／１：v/v)６mlによって抽出した。サンプルを10分間激しく混合し、抽出は一夜継続した。２mlの水を加え、５分間低速（500rpm）遠心分離したのち、極性および非極性脂質の両者を含む上相を採取し、窒素下に蒸発乾固した。残った溶媒は凍結乾燥によって除去した。乾燥した脂質を200μlのイソオクタン／テトラヒドロフラン（97／３：v/v）に可溶化し、その５μlをChristieの方法［Christie W.W.，J ．Lipid Res. 26：50 7-512(1985)］の改良法によりSpectra Physics HPLCを用い、予めイソオクタン／テトラヒドロフラン（97／３：v/v）で平衡化した 4.6×100mMシリカカラム上に注入した。ポストカラム溶出液を蒸発散乱光検出器（Varex，ELSDIIＡ型）で検出した。各種主要脂質クラスに対する検出器応答を検量するために標準脂質標品を使用した。例13糞中胆汁酸の定量５匹のTgSR＋／−マウスおよび５匹の対照マウスを、個別代謝ケージ内で１週間固形飼料に維持したのち高脂肪高コレステロール飼料を３週間給餌した。各マウスからのすべての糞を各週の末に収集し、−20℃で保存した。糞中総胆汁酸は Beherらの蛍光法[Beher W.T.，Strandnieks S.，Lin G.J.，SanfieldJ.，Stero ids ，38: 281-295(1981)]によって測定した。略述すれば、糞を３容の水でホモジナイズした。糞ホモジネートのアリコート（１ｇ）を７mlのエタノールと混合し、70℃に30分間加熱した。混合物を、ついでひだ付きろ紙で濾過し、６mlの予熱したエタノールで１回洗浄した。各サンプルからの４ml‐アリコートを窒素下に乾燥し、２mlの３ＭNaOHに溶解し100℃に２時間加熱した。サンプル(10μl)、2.4mlのトリス緩衝液（pH9.0）および試薬(19.1mg スクロース、0.1μgジチオスレイトール、7.5mg EDTA、および50mgのウシ血清アルブミンを含有する100mlの0.05Ｍ、pH7.4リン酸緩衝液中２mgレザズリン、100m g β‐NAD、6.4単位のヒドロキシステロイドオキシドリダクターゼおよび37単位のジアホラーゼ)の混合物を室温において1.5時間インキュベートした。サンプルを565nmで励起し、発光蛍光を蛍光分光光度計LS−３型(Perkin-Elmer，Oakbrook ，IL)により580nmで測定した。アッセイの検量にはコール酸標準を用いた。例14コレステロールの吸収コレステロールの吸収は、３匹のTgST＋／−マウスでコレステロールとβ‐シトステロールの鑑別吸収によって測定した。略述すれば、マウスを代謝ケージで個別に飼育し、固形飼料を自由に摂取させたのち、100μlのヒマワリ油中³H‐コレステロール(1.5μCi)および¹⁴C‐β‐シトステロール（0.1μCi）を胃内に１回投与した。以後４日間、マウスにはHFHC飼料を自由に摂取させた。経口摂取量および４日間にわたって集めた糞のホモジネートのアリコートを、肝脂質の抽出の場合と同様に、酢酸エチル／アセトン(２／１：v/v)で抽出し処理した。液相のアリコート内の放射能を液体シンチレーションカウンティングにより測定した。抽出液中の³Hと¹⁴Cの比を計算し、以下の式による％コレステロール吸収の評価に用いた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヴエーレ，ザビーネアメリカ合衆国ミシガン州 48105．アンアーバー．ビレツジグリーンブールバードナンバー208 435

Claims

【特許請求の範囲】１．スカベンジャー受容体遺伝子を哺乳動物の肝臓に導入して上記哺乳動物をアテローム性動脈硬化症に対して抵抗性にする方法において、 (a) リン酸カルシウム共沈の利用、 (b) 陽イオンリポソームの複合体中、 (c) エレクトロポレーション、 (d) 受容体-誘導エンドサイトーシス、 (e) 裸のDNA、 (f) ウイルス性ベクターによる形質導入、 (g) 粒子-誘導遺伝子導入、 (h) 合成ペプチドからなる群より選択される送達方法によってDNAを哺乳動物に導入することからなる方法。２．哺乳動物はヒトである請求項１記載の方法。３．スカベンジャー受容体遺伝子を哺乳動物の肝臓に導入して上記哺乳動物をアテローム性動脈硬化症に対して抵抗性にする方法において、上記スカベンジャー受容体をベクター中に挿入し、そのスカベンジャー受容体を上記哺乳動物の肝臓内で発現させる方法。４．哺乳動物はヒトである請求項３記載の方法。５．アポＢ含有リポ蛋白の低下、高密度リポ蛋白コレステロールの上昇、およびアテローム性動脈硬化症の予防のための哺乳動物肝臓におけるスカベンジャー受容体の異所性発現。６．哺乳動物はヒトである請求項５記載のスカベンジャー受容体の異所性発現。７．発現は肝臓内における一過性発現である請求項５記載のスカベンジャー受容体の異所性発現。８．発現は肝臓内における安定的発現である請求項５記載のスカベンジャー受容体の異所性発現。９．患者のアテローム性動脈硬化症、高βリポ蛋白血症、高コレステロール血症、高トリグリセライド血症、低α‐リポ蛋白血症、糖尿病の血管性合併症、移植、アテレクトミー、および血管形成後再狭窄の処置方法において、治療有効量のスカベンジャー受容体遺伝子を上記患者の肝臓に投与する方法。 10．患者のアテローム性動脈硬化症、高βリポ蛋白血症、高コレステロール血症、高トリグリセライド血症、低α‐リポ蛋白血症、糖尿病の血管性合併症、移植、アテレクトミー、および血管形成後再狭窄の処置方法において、治療有効量のスカベンジャー受容体遺伝子を、以下の群、 (a) ACATインヒビター、 (b) HMG CoAリダクターゼ、 (c) 脂質レギュレーター、および (d) 胆汁酸封鎖剤からなる群より選択される１種または２種以上の薬剤と併用して上記患者の肝臓に投与する方法。 11．アテローム性動脈硬化症、高βリポ蛋白血症、高コレステロール血症、高トリグリセライド血症、低αリポ蛋白血症、糖尿病の血管性合併症、移植、アテレクトミー、および血管形成後再狭窄の処置のために、薬剤の治療有効量の患者の肝臓への投与に適応される医薬送達方法において、スカベンジャー受容体遺伝子および適当なウイルスまたは非ウイルス送達系からなる医薬送達方法。 12．エキソビボまたはインビボ送達に適応される請求項11記載の医薬送達方法。 13．治療的または予防的投与である請求項11記載の医薬送達方法。