565453 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 發明領域 本發明係_於抗凝血酶-II之製法，其純化方法及含有 其之製劑。特別係關於一種生產及純化抗凝血酶-I之方 法，抗凝血酶-I可用於治療例如因體內抗凝血酶-Μ之利 用率下降引起的多種疾病，及含有如此生產及純化之抗凝 血酶-I之製劑。 發明背景 抗凝血酶-瓜（後文稱為”AT- m ”）為屬於α 2球蛋白質之 糖蛋白，存在於血漿。ΑΤ-Ι之分子量為6 5,0 00至68,000 及具有蛋白酶抑制活性。AT- Μ可強力抑制凝血酶之凝血 活性ϋ 又，AT- I不僅對凝血酶具有抑制活性，同時也對其它 凝血因子例如活化因子X及活化因子I X具有抑制活性。因 此曾報告AT- m對纖維蛋白酶及胰蛋白酶具有抑制活性。 此等抑制活性通常於肝素共存下作用更為快速。 具有此種活性之AT- 111 ，曾用於治療凝血能力過高之異 常狀態，特別瀰漫性血管內凝血（D I C )及多種其它由於A T -1Π之利用率下降引發的疾病。 此外，AT- I對肝素具有親和力，曾報告多種純化方法 ，其中基於親和性質使用制動肝素（例如JP-A-6 3 -2 3 89 6 ; 此處使用” J P - A"表示日本特許公開案）。 此外，因AT- I為存在於血漿的蛋白，故用作治療製劑 時，需要使可能含於血漿的病毒失活化。 此等疾毒灰活化處理中，已知於6 0°C液態加熱處理1 0分 (讀先閱讀背面之注意事項 巧本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 4 565453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（2 ) 鐘為一個特例。但據報告，AT-I於pH6至8穩定，但於56 °C加熱處理6小時時，8 0 %活性喪失（J . B i ο 1 . C h e m .，2 46 ; 3 6 9 4 ( 1 9 7 1 ))。它方面，許多報告陳述當A T - I於6 0 °C於 1 4 . 7 w / v %檸檬酸鈉存在下，接受液態加熱處理1 0小時時， 可穩定維持 ΑΤ-Ι 活性（Thrombosis Research, 22:233 (1981)及 J· Biol* Chem·, 256:12140(1981))。但當 AT-I於液態加熱時，即使於0 . 3 5至K 5 Μ (1 0, 2 9至4 4 , 1 2 v/ / v % 檸懞酸鈉存在下加熱，由免疫電泳分析也可觀察得AT- m 變性（Vox Sang,48:325(1985))。 因此種病毒失活化處理也產生變性蛋白質例如前述失活 化AT- II ，聚合蛋白質等，故曾報告去除此等雜質之方法 ，例如再度進行自動肝素處理（JP-A-6 3 -23 8 9 6 )或進行疏 水層析處理（JP-A- 1 -2 7 56 0 0 )。但制動肝素處理即使單次 處理也導致活性回收產率低，疏水層析處理可能留下污染 物蛋白質，如白蛋白原，轉鐵素，I g G等，故須再度進行 純化步驟來去除此等蛋白質，結果使活性回收產率下降。 發明概逑 本發明之目的係提供一種生產適合用於醫藥治療之AT-M之方法，當AT- Μ於液態加熱時，可穩定維持AT- I活性 及減少A T - m變性（形態學改變，例如二聚合、聚合等）。 此外，本發明之目的係提供一種呈單一步驟去除污染物蛋 白質如失活化AT- I等同時維持AT- Μ活性之方法。 換言之本發明係關於AT- I製法，AT- I純化方法及含有 A T - I之製劑。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項^^寫本頁) —5 - 565453 A7 B7 五、發明説明（3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 特別本發明之此等及其它目的可經由一種由含AT- I水 溶液生產AT- I之方法達成，該方法包括下列步驟（a)及 (b )之至少一者： (a )於安定劑存在下加熱含抗凝血酶-I水溶液，使其維 持8 5纟或K上加熱前之抗凝血酶-Μ活性，及加熱後抗凝血 酶-I單體比維持於9 5 %或以上；及 (b)使用金屬螯合物樹脂處理含抗凝血酶-Β[水溶液及回 收經純化的抗凝血酶-瓜◊ 此外，本發明之此等及其它目的可藉一種醫藥組成物達 成，該醫藥組成物包括，根據前述方法生產之AT- I或其 醫藥可接受性鹽作為活性成分，選擇性組合醫藥可接受性 載劑。 圖式之簡單說明 圖1為顯示由銅離子結合螯合物樹脂溶離AT- Μ之圖樣簡 圖。 圖2為顯示鹽濃度對AT- I由銅離子結合螯合物樹脂溶離 圖樣之影響之簡圖。 圖3為顯示A T - E[藉銅離子結合螯合物樹脂純化前及後之 Η P L C - G P C圖樣簡圖。 圖4為顯示於AT- I由銅離子結合螯合物樹脂純化前及後 ，藉鳥得隆尼（Ouchter lony)方法分析雜質結果之簡圖。 圖5為顯示AT- I藉銅離子結合螯合物樹脂+金屬-非結 合螯合物樹脂純化前及後之HPLC-GPC圖樣簡圖。 發明之詳细說明 請 閱 讀 背- 意·* 事 項 Ψ 裝 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 6 565453 A7 B7 五、發明説明（4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (I)起始物料 含AT- I水溶液（後文常稱為” AT- m水溶液”）範例包含血 漿蛋白混合物，例如由柯恩（Cohn)氏冷乙醇方法所得部分 Ε + I上清液及部分IV，Μ及由含檸檬酸鹽血漿回收凝血 因子V Μ所得殘餘部分；但起始物料非特別限於血漿來源 ，故例如藉基因工程等技術所得含AT- Μ溶液也可引進ΑΤ-BI純化方法ϋ 由血液或血漿獲得AT- I之特定純化方法，揭示於美國 專利 3 , 842 , 06 1 (JP-A-4 8-350 1 7 )，美國專利 4,340，589 ( JP-A- 5 4-9 5 7 1 5 )，EP-A - 33 99 1 9 ( JP-A - 1 -2 7 5 6 0 0 )&EP-A-5 5 1 0 8 4。例如使用一種方法，其中經由從血漿去除低溫沈 澱，獲得上清液之低溫乙醇部分I V -1，IV或E + EI進一步 經由例如肝素親和層析術純化。 此外，也可使用藉綑胞培養方法[例如E P - A - 5 3 1 6 5 ( J P -W - 5 7 - 5 0 0 7 6 8 )(此處使用” J P - W ”表示”日本國際特許公開案 ”）]，或基因 H：程技術[例如 EP-A-90505(JP -A- 58-162529)] 所得A T - I 。 (S )加熱處理 根據本發明之加熱處理，AT- H[水溶液於適當溫度接受 加熱處理一段適當時間，該時間足夠失活化其中可能含有 的污染物病毒。特別處理可於5 0 °C至7 0 °C ，較佳約6 0 °C進 行1 0分鐘至2 0小時，較佳約1 0小時。溶液之p Η為5至1 0， 較佳約6 , 5至9 . 0，更佳Κ適當緩衝液調整。AT- Β[水溶液 含有AT- I之比例為10至5 0 0單位/毫升，較佳1至200單位/ (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 7 565453 Μ Β7 五、發明説明（5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 毫升，及更佳25至100單位/毫升。根據本發明”1單位” AT-I表示相當於1毫升正常人血漿之AT- I含量之AT- I活性 。例如也可使用A 了 - I測量套件組使用合成酶基質（T e s t Team AT- I -2-kit，第一純化學品公司製造）測量AT- I活 性。 加熱處理之進行方式為加熱處理後AT- I總活性維持於 8 5¾或K上，較佳95¾或Μ上加熱處理前之總活性，及AT-®氺溶液全量中之A Τ - ΒΙ單體比維持於9 5 %或Μ上，較佳 9 9 %或Μ上。 A Τ - I單體比例如可藉高效液相層析（Η P L C )使用G 3，0 0 0 SW&柱（Tosoh公司生產），事先Μ 0 , 3Μ氯化納-(Κ 05Μ磷酸 鹽緩衝液（pH 7,0)平衡而測量。 欲滿足此種殘餘活性及單體比條件，加熱處理可於下述 安定劑存在下進行。 (Μ )安定劑 本發明之加熱處理用安定劑，較佳選自有機酸或其鹽， _類及氯化鈉。 本發明使用之有機酸為脂族或芳族飽和或未飽和一元酸 (一羧酸），二元酸（二羧酸）或三元酸（三羧酸）。較佳酸含 2至1 0個碳原子，更佳2至6個碳原子。一元酸範例包含一 元胺基酸（如甘胺酸，丙胺酸，纈胺酸，白胺酸，異白胺 酸）。二元酸範例包含飽和脂族二羧酸（例如草酸，丙二酸 ，丁二酸，戊二酸，己二酸），飽和脂族二狻酸（例如順丁 烯二酸，反丁烯二酸），芳族二狻酸（例如酞酸），二元胺 (請先閱讀背面之注意事項^^寫本頁) :紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 565453 A7 B7 五、發明説明（6 ) 基酸（例如天冬酸，麩胺酸），二元羥基酸ί例如蘋果酸， 酒石酸）。三元酸之範例包含三元羥基酸（例如檸檬酸）。 其中Κ蘋果酸，酒石酸，順丁烯二酸，天冬酸及檸檬酸為 佳，而Κ蘋果酸及擰檬酸為更佳。 此外，此種有機酸可圼鹽形式使用。有機酸鹽範例包含 鹼金屬鹽（例如鈉鹽、鉀鹽），鹼土金屬鹽（例如鈣鹽）及有 機鹽（例如銨鹽）。Κ鈉鹽及鈣鹽為佳。較佳用於本發明之 有機酸鹽為順丁烯二酸鈉及檸檬酸鈉，而Μ檸檬酸鈉為最 佳。 有機酸或鹽之添加料係於較佳3至，更佳3至10 w/U及最佳3至5w/U之範圍。若添加量小於3w/v%，則安 定效果下降。 主要使用有機酸或其鹽及釀。也可使用氯化鈉。添加醣 類或氯化鈉可減少有機酸添加量，並抑制造成AT- m活性 (請先閱讀背面之注意事項 --裝-- ^^寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 失活化的變性作用（AT- ffi二聚合及聚合） 單釀類，雙隨類，糖醇及胺基糖。單醣類 、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖及肌 範例包含蔗糖、乳糖及麥芽糖。糖醇類之 醇、山梨糖醇及木糖醇。胺基糖之範例包 乙醯基-D-葡萄糖胺，其為胺基糖衍生物 乳糖、山梨糖醇、肌糖醇、麥芽糖、N -乙 胺及甘露糖醇為佳。 醣類之添加量係於較佳10至60 w/以，更 及最佳2 0至3 0 w / v I之範例。若添加量小於 、醣類範例包含 範例包含葡萄糖 糖醇。雙醣類之 範例包含甘露糖 含葡萄糖胺及N ->其中Μ蔗糖、 醯基-D-葡萄糖 佳 2 0 至 5 0 w / ν %， 10w/vMU安定效 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） 9 565453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 ) 果減低；而若添加量大於60 w/vl則也不佳，原因為雖然獲 得安定性增高但污染物病毒也被安定化。 氯化鈉之添加量係於較佳0 + 5至3 . 0 Μ，更佳1 . 0至2 . 5 Μ， 及最佳1 . 5至2 , 0 Μ之範圍。若添加量小於0 . 5 Μ，則安定效 果下降；而若添加量大於3 . 0Μ也不佳，原因為雖然可獲得 安定效果增加，但AT- I[溶解度也下降。 然而根據本發明，安定劑之添加量並非特別限於前述範 圍，只要可滿足下述條件即可：加熱處理後，AT- Μ總活 性維持於加熱處理前總活性之8 5 5¾或K上，即加熱處理後 AT- III單體比維持於95%或以上。 (I V )純化 本發明之AT- I純化方法包括，於AT- 1E純化步驟使用金 屬螯合物樹脂處理AT- Μ 。特別該方法包括，於由含AT- BI 水溶液純化AT- II時，使AT- I水溶液與金屬螯合物樹脂接 觸及回收未被吸附部分。 AT- BI水溶液可具有蛋白質濃度約（K 1至5w/v%。又，較 佳使用已經純化至某種純度之AT-I水溶液，較佳預先使 用前述肝素制動載劑純化的AT- B[水溶液。此外，較佳藉 加熱處理（5 0至7 0 °C ，5至3 0小時）進行A T - EI水溶液之病毒 失活化處理，較佳藉前述加熱處理，隨後使溶液接受本發 明之金屬螯合物樹脂處理。 又，當AT- I水溶液含有螯合劑如檸檬酸等時，較佳於 藉滲析處理等去除螯合劑後，使用AT- BI水溶液以防金屬 離子由金屬螯合物樹脂溶離。 (請先閱讀背面之注意事項 :寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -10 565453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（8 ) 用於本發明之金屬螯合物樹脂，係經由螯合物鍵結金屬 離子至螯合物樹脂獲得，包含市售螯合锪樹脂（例如亞胺 基二乙酸類型）。特例包含螯合-西法羅斯（S e p h a r 〇 s e ) F*F* (Pharmacia製造）及 AF~螯合樹 Toyopearl 650M (Tosoh 公司製造）。 结合至螯合物樹脂之金屬離子並無特殊限制，但為可有 效分離AT- I之金屬離子。範例包含銅離子，鎳離子及鈷 離子，而K銅離子為特佳，鑑於其純化效率高之故。 本發明方法可經由使A T - I水溶液與金屬螯合物樹脂接 觸進行。此種接觸可藉柱式方法或分批方法達成；但鑑於 純化程度及純化效率，較佳採用柱式方法。 至於接觸條件，反應可於P Η 6至小於8，較佳6 . 5至7 . 7及 鹽濃度0至1 Μ，較佳0 . 0 5至0 , 5 Μ進行。較佳溶劑包含0 . 1 Μ 磷酸鹽緩衝液（ρ Η 7 . 0至7 . 5 )含0 . 0 5至0 . 5 Μ氯化鈉，但氯化 鈉並非必要。欲改良金屬螯合物樹脂與A Τ - 1Β之分離效果 ，可添加拮抗劑如甘胺酸，咪唑至緩衝液，且較佳拮抗劑 添加量為20mM或以下。 當本發明之純化方法係藉柱式方法進行時，調整至前述 條件之AT- I水溶液施用至，於栢同條件（相同緩衝液用作 展開溶液維持於2 之室溫）平衡的金屬螯合物樹脂柱，然 後回收未被吸附部分。金屬螯合物樹脂用量可依含AT- Μ 水溶液之雜質含量、AT- ffi含量等調整；但通常每4毫升 AT- 1J水溶液使用約1毫升金屬螯合物樹脂。由柱溶離速率 可依金屬螯合物樹脂之填塞量及柱尺寸等控制。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項\^寫本頁) .裝· 565453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（9 ) 當本發明之純化方法係藉分批方法進行時，任調整至前 述條件之A T - I水溶液，於相同條件下於2 °C之室溫與平衡 的金屬螯合物樹脂接觸，然後上清液藉離心回收。接觸時 間可依含AT- I水溶液之雜質含量、AT- I含量等調整，但 通常約1 0分鐘至1小時接觸時間即足。 又，某些情況下，金屬離子可能由金屬螯合物樹脂洩漏 ;但洩漏的金屬離子易去除，例如Μ未結合金屬離螯合 物樹脂或離子交換劑處理方法去除，或添加螯合劑如EDTA ，然後進行滲析之方法去除。 如此藉本發明之純化方法純化的AT- I ，大體不含雜質 蛋白質，變性AT-HI ，AT-I聚合物等，故可藉單一步驟獲 得高度純化AT- m 。 此外，如此藉本發明之純化方法純化的A T - IK ，進一步 可接受習知純化手段純化，例如陰離子交換劑處理或使用 含有疏水基作為配合基之不可溶載劑處理。 (V )處理後 如此藉本發明方法進行病毒失活化處理及/或純化之AT-II ，根據常用配方方法製成翳藥製劑。醫藥製劑範例包含 水溶液劑、懸浮液劑及凍乾製劑其可K選擇性混合醫藥可 接受性載劑及添加劑（例如稀釋劑、張力調節劑、界面活 性劑）製備。AT- EI製劑之投藥可根據AT- I注射劑或靜脈 輸注液之習知處方進行，例如採用緩慢靜脈注射或輸注液 體製劑。 本發明生產及/或純化之AT- I可用於治療因先天AT- I -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項^^寫本頁 565453 A7 B7 五、發明説明（1〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 缺 陷 及 瀰 漫 性 血 管 內 凝 血 癥 候 群 (D I C )，伴隨著體 內 AT- I 下 降 > 引 起 的 血 栓 形 成 傾 向 〇 通 常 AT -1之投藥比率為每日1 ,000至 3, 000單位 (或20至 60 單 位 /千克體重） > 但 依 年 齡 、 體重、癥 狀等情況可選擇 性 改 變 劑 量 〇 又 當 本 發 明 之 製 劑用作產 科或手術D 1C緊 急 處 理 時 較 佳 K 40 至 60 單 位 /千克體重， 每日一 次 之劑 量 投 藥 〇 較 佳 液 體 製 劑 之 滲 透 壓 係與人類 及動物生理情況 相 等 或 接 近 〇 本 發 明 效 果 當 AT - I於液態加熱 俾根據本發明失活化病毒 時 ，AT- I 活 性 可 維 持 穩 定 並 減 少 AT -11之變性（形 態學改變^ ►如二 聚 合 、 聚 合 等 )， •故由醫藥觀點看來，AT- II具有顯著高度 安 全 性 及 利 用 率 〇 此 外 ， 根 據 本 發 明 -V 純 化 方 法 ，A T - I水溶液所 含 雜質 蛋 白 質 及 藉 加 熱 處 理 生 成 的 變 性 A T -皿及聚合物可 被 有效 去 除 9 故 可 獲 得 具 有 高 度 安 全 性 的 A T — I : 、此夕卜， 因 純化 處 理 步 驟 簡 單 且 適 合 大 規 模 生 產 ，故顯然 可用作產業生產 方 法 〇 因 本 發 明 之 醫 藥 製 劑 含 有 藉 前 述方法純 化之AT - I ，故 可 提 供 具 有 佳 安 全 性 的 翳 藥 AT -I製劑( > 本 發 明 將 參 昭 下 列 實 例 進 一 步 說明细節 ，但絕非囿限本 發 明 〇 下 列 實 厶 m 使 用 -V 材 料 及 方 法如下。 材 料 及 方 法 : Π -)A T - -I 材 料 (請先閱讀背面之注意事項 本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -13 ~ 565453 A7 B7 五、發明説明（11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 此處使用之起始物料，可藉下述方法製備，濃縮衍生自 柯恩氏部分ϋ及I上清液或部分IV之溶液，該溶液已經使 用肝素制動柱純化，及將該溶液於6 0 °C於Ρ Η 7 . 8於5 :¾擰檬 酸納，2 Μ氯化鈉及3 0纟山梨糖醇存在下加熱1 0小時，進行 病毒失活化處理。 (2 )純化用層析載劑 螯合-西法羅斯（Sepharose)F.F· (Pharmacia製造）或 AF-螯合物T 〇 y 〇 p e a r丨6 5 0 Μ ( T o s o h公司製造）用作螯合物層析 載劑。 (3) AT- I活性之測量及殘餘比之計算 測量係藉使用S-2 23 8之合成酶基質方法進行。S-2 2 3 8及 所用反應終結溶液搭接至Test Team AT-I -2-套件組（第 一純化學品公司）。一小瓶（20毫克）S-223 8溶解於21毫升 水。綠十字公司生產的凝血酶溶液（1 . 2單位/毫升）及標準 AT- m溶液U單位/毫升）分成數分配送，並儲存於-40 °C有 待使用時解凍。一份50微升試驗樣品以含有40mMTrMs，60 mM EDTA，0.14M NaCl，0.2¾ HSA(人血清白蛋白）及 2*4 單 位/毫升肝素p Η 8 . 4調整至1至1 0毫單位/毫升，與1 0 0毫升 凝血酶溶液混合及於3 7 °C培育5分鐘。其次與1 0 0微升酶基 質溶液混合及恰培育5分鐘，然後藉加入1 0 0 0微升反應終 結溶液終止反應。溶液之吸光率係於405n m測量，樣品之 AT- II活性係由標準直線計算，標準直線係使用標準AT- II 溶液算出。 AT-I活性殘餘比係K熱處理後，各AT-I樣品之總AT - (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝一 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 14 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565453 A7 B7 五、發明説明（12 ) 里活性[單位/毫升X液體容積（毫升）]占加熱處理前AT-I 總活性之百分率計算*結果顯示於表1。 1_4) AT-H比活性 各試驗樣品之蛋白質含量，係藉測量於A2eQnro之吸光率 (後文稱為” A2B〇”）計算。各樣品之比活性（U/A28t3)係由如 上所得AT- Μ活性除Μ蛋白質數量獲得，結果示於表1。 (5) 凝膠過漶HPLC分析 此分析係藉System Gold(Beckman製造）進行，System Gold配備有 G 3000 StfU 7.8mm 30cro， Tosoh製造）柱，使 用含50πιΜ磷酸納及0.3M氯化納PH7.0溶液作為展開溶液。 流速為0.7毫升/分鐘，各例中進行於280ηιη吸光率之檢測。 藉HPLC分析所得AT - Μ單體比顯示於表1。又，AT-里變 性程度（形態變化例如二聚合、三聚合等）可由表1結果得 知。 (6) 鳥得隆尼（Ouchterlony)分析 此種分析係W尋常方式進行，選擇性將試驗樣品濃縮至 於280ηιη之吸光率為約30。使用的抗體如下（編號對應於圖 4編號抗人鋦藍胞質素（l)(H〇eChst N-抗血清鋦藍胞質 素）；抗人轉鐵素（2)(HoeChst N-抗血清轉鐵素）；抗人白 蛋白（3)(H〇eChst H-抗血清白蛋白）；抗人白蛋白原（4)( Hoechst Η-抗血清白蛋白質）；抗人半球蛋白（5UDAK0 Α030 );抗人α 2巨球蛋白（6)(DAK0 Α033);抗人a i抗胰 蛋白酶（7)(DAK0 A012);抗人 IgA(8)(DAK0 A02621);抗 人 IgG(9)(DAK0 A04231);抗人 IgM(10)(Hoechst抗-IgM( iu鏈）兔血清）；抗人凝血酶原（11)(DAK0 A325);及抗人 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 破· 565453 Α7 Β7 五、發明説明（13) 纖維蛋白原（12) (DAKO A080 )。 實例1 1份10千克得自柯恩氐低溫乙醇分餾方法之部分IV-1櫬 懸浮於100升生理鹽水，硫酸鋇添加至懸浮液至5w/v!l!濃度 ，混合物於室溫攪拌30分鐘，並由硫酸鋇吸附去除微量存 在的凝血酶原。如此所得上清液調整至PH6.5，混合13 w/vX聚乙二醇#4,000(平均分子量試驗2,600至3,800， Nippon Soda公司製造）及如此所得沈澱藉離心去除；然後 所得上清液再度混合30w/v»!聚乙二酵H4,000*如此生成的 沈澱藉離心回收。 如此回收的沈澱溶解於約20升冷生理鹽水，並施用至肝 素-西法羅斯（Pharmacia製造）柱，該柱事先使用生理鹽水 平衡而將AT-M吸附於柱上。如此準備妥之柱M0.4M氯化 納溶液洗滌，去除雜質蛋白質，然後2·0Μ氯化納溶液通過 柱而回收被溶離出的ΑΤ-Β部分。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如此所得AT-ΒΙ水溶液與表1顯示的安定劑混合，調整至 ρΗ7·8，然後於601加熱處理10小時。如此處理後之at-霣 水溶液與丁基類型聚乙烯載劑（Butyl Tosoh公司製造）接 觸，該載劑事先使用20mM含3M氯化納之擰檬酸納緩衝液 (ρΗ7·5)平衡，該鍰衝液用作展開溶液而回收未吸附部分 ，然後對〇·5ί!檸檬酸納緩衝液（ΡΗ7·5)滲析隔夜，獲得純 AT - Ε 〇 加熱處理後，各鈍化AT-Η樣品活性，經測量而求出其 對加熱處理前之AT- I活性殘餘比。也獲得各Ατ一里之樣品 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 565453 A7 B7 五、發明説明（ 14 之翬體比 表 安定劑 比活性 (ϋ/Α2θ〇) 殘餘 比⑴ HPLC (¾) 加熱處理前 8.8 100 99.7 19 w/v% Na-Cit, 2 M NaCl pH 7.8 6.9 78.4 78.9 5 w/v% Na-Cit 60 w/v% Sorb. pH 7.8 7.5 84.7 86.4 2 M NaCl 10 w/v% Sorb. pH 7.8 8.0 85.0 90.0 20 w/v% Sorb. pH 7.8 8.4 88.4 95.0 30 w/v% Sorb. pH 7·8 8.6 90.3 95.2 40 w/v% Sorb. pH 7.8 7.8 88.0 96.7 50 w/v% Sorb. pH 7.8 8.1 92.0 99.3 60 w/v% Sorb. pH 7.8 8.2 93.6 99.7 10 w/v% Na-Cit 40 w/v% Sorb. pH 7.8 7.6 85.7 97.7 50 w/v% Sorb. pH 7.8 7.7 87.7 91.9 60 w/v% Sorb. pH 7.8 8.1 91.4 98.9 2 M NaCl, 50 w/v% Sorb. pH 7.8 7.9 89.8 96.7 請 閱 讀 背 ιέ 之 注 意 事 項
貪 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 17 565453 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（i5) 殘餘比（¾):加熱處理後AT- I總活性占加熱處理前AT-皿 總活之百分率 HPLC分析U) : AT- I單體比 添加檸檬酸鈉及氯化鈉時，觀察得協同增效作用，故可 防止二聚合及聚合反應，及於低濃度擰檬酸納觀察得穩定 效果。上表中，N a - C i t表示檸檬酸納；而S 〇 r b ,表示山梨 糖醇。 實例2 使用螯合-西法羅斯F , F ,純化AT- Μ : 於1 , 5毫升柱（Φ 0 . 9 X 2 * 3厘米）螯合-西法羅斯F . F ,内加 入等床容積（1 , 5毫升）C u S 0 4 · 5 Η 2 0，其事先溶解於水至1 0 毫克/毫升濃度而結合金屬，然後柱Μ 2床容積（3毫升）水 洗滌。其次柱藉通過3床容積含0 . 1 Μ磷酸鈉及0 . 5 Μ氯化鈉 Ρ Η 8 , 0之溶液平衡。使用P D - 1 0柱（P h a r m a c ί a製造），3毫升 經加熱處理之AT-HI濃溶液（A28Q= 4,20)其已藉相同媛衝 液交換，添加至如此製妥之柱，K 1 . 5毫升/溶離分之比率 收集溶離部分。隨後含〇」Μ磷酸納及0 . 5M氯化鈉調整至 ρ Η 7 , 5，7 * 0及6 . 0之溶液，以3床容積（4 * 5毫升）加至柱， 溶離分Μ相同方式Ml.5毫升/溶離分收集。又，使用之螯 合物柱經由M2床容積50mM EDTA * 2Na去除結合金屬，然 後通過3床各積水再生c 结果示於圖1。由圖1顯然易知，大半蛋白質於p Η 8 . 0吸 附而於銅螯合物柱於ρ Η 7 . 5或以下溶離。 表2顯示得自銅螯合物柱之溶離分離行GPC-HPLC分析結 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210:< 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項^^寫本頁) •裝· *11 565453 A7 B7 五、發明説明（16 ) 果。如表2所示，未變性（完整）AT- I添加至銅螯合物柱前 純度為8 8，0 % ;但得自柱之溶離分純度於各試驗p Η值皆為 10 0¾。換言之，發現變性ΑΤ-Ι及雜質蛋白質經由將溶液 Μ低於8之p Η值，較佳p Η 7 , 5或K下通過柱可顯著有效去除 ，此等雜質於ρ Η 6 , 5可由柱保留。 (請先閱讀背面之注意事項\^寫本頁) -裝- 表 溶離分編號 1-5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 pH 完整AT- I 純度U) 8.0 7.5 100 7,0 100 6 . 5 100 添加至柱之樣品完整AT- I純度：88 , 0¾ 實施例3 鹽濃度之影響： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 欲檢視層析緩衝液之鹽濃度影響，經加熱處理及濃縮之 AT- Π[溶液之銅螯合物層析表琨，使用0 . 1 Μ磷酸鈉緩衝液 (Ρ Η 7 ♦ 5 )或藉加入0 · 1 Μ N a C丨或0 ♦ 5 Μ H a C丨至0 ♦ 1 Μ磷酸鈉製 備之緩衝溶液（Ρ Η 7 . 5 )檢視。換言之，經加熱處理及濃縮 的AT-瓜溶液與各媛衝溶液藉PD-10柱進行溶劑交換，其 A28Q值調整至約5’然後一份5毫升溶液施加至1毫升銅螯合 物柱（必0 . 8 X 2厘米），柱事先K相同緩衝液平衡。匯集最 初通過溶液3毫升，其餘則Μ每分1毫升收集。隨後柱以各 緩衝液洗滌，洗滌時之溶離分Κ每分1毫升收集。溶離圖 樣顯示於圖2。又，各溶離分之完整AT- ΒΙ純度進行GPC- Η P L C測量，結果顯示於表3。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 一 19 一 565453 A7 B7 五、發明説明（17 ) 表 溶離 編號 溶離分總容 積（毫升） 完整AT - II純度（1) NaC丨濃度（Μ) 0 0 . 1 0 . 5 1 3 100.0 10 0*0 100.0 2 4 100.0 100*0 100.0 3 5 100.0 100,0 100*0 4 6 100.0 100.0 100.0 5 7 100.0 100.0 100.0 添加至柱之樣品之完整A T - I純度：8 1 , 1 5 % (請先閱讀背面之注意事項\^寫本頁) 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如圖2所示，未含氯化納及含0 . 1 Μ或0 . 5 Μ氯化鈉之例之 溶離圖樣未見顯著差異。又如圖3所示，各例之溶離分中 完整A Τ - II之純度為1 0 0 , 0 %。結果顯示緩衝液之鹽濃度變 化幾乎未對層析表琨造成影響。 又，使用0 . 1 Μ磷酸鈉緩衝液（含0 , 1 M H a C 1 )調整至p Η 7 , 3，7 . 5或7，7檢視ρ Η變化對層析表琨的影響；但顯示ρ Η 於此範圍内改變幾乎未對層析表琨造成任何影響。又，使 用0 . 1 Μ磷酸鈉緩衝液（含0 . 1 Μ氯化納，Ρ Η 7 , 5 )檢視於4 °C及 室溫之層析表現；但顯示溫度於此範圍內變化幾乎未對層 析表琨造成任何影響。 實例3 於規模放大試驗中，純化程度之證實及純化產率之評估： 經加熱處理及濃縮的AT- ΠΙ溶液，使用含（K 1 Μ氯化鈉 ρ Η 7 , 5之0 . 1 Μ磷酸鈉藉P D - 1 0柱U 2 s 0 = 4 , 0 5 )進行緩衝液交換 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565453 A7 B7 五、發明説明（is 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ，然後一份2 5毫升溶液施加至5毫升銅螯合_ T 〇 y 〇 p e a r 1 6 5 0 M柱（Φ 1 . 5 x 2 , 8厘米），該柱事先K相同緩衝液平衡。 拋棄一份2 . 5毫升，相當於柱床容積半量，然後所得溶離 分同時施用樣品及組合2柱床當量之洗滌水及平衡緩衝液 ，並匯集（32. 5毫升）用作經純化的AT-Μ 。 Α 2 8。值及AT- I活性回收產率顯示於表4，層析前及後之 GPC-HPLC圖樣顯示於圖4。 如表4所示，獲得良好回收產率，亦即A2BQ為80.3¾及 /\丁-11[活性為89,6：1；。又如圖3所示，0?(：-1^1{：之柱溶離分 顯示單一完整AT- I峯而未含聚合物、變性AT- Μ及其它雜 質蛋白質。 此外，當前述樣品接受鳥得隆尼分析時，未測得任何可 能的雜質蛋白質（亦即銅藍胞質素，轉體素，白蛋白，白 蛋白陳，半球蛋白，α 2巨球蛋白，α I抗胰蛋白，I g A， I g G， I g M，凝血酶原及纖維蛋白原）（參見圖4 )。 如此顯示，雜質蛋白質、聚合物及變性AT- BI皆可藉銅 螯合物Toyopearl 650M層析於pH7.5去除Cf 表4 容積 A 2 8 0 AT-I活性 步驟 (毫升） A 2 B 0 X 產率 總活性 產率 A 2 8 0 vo 1 ⑴ U/毫升 U / A z 8 0 U) 添加至柱 25 4,05 101.3 80.3 29·9 748 7.38 89,6 通過柱 32.5 2.50 81.3 20.6 670 8,26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項\^寫本頁) 21 565453 A7 B7 五、發明説明（19 實例 由銅螯合物樹脂柱去除洩漏的銅 於銅螯合物柱式層析，已知結合至柱的銅通常隨著蛋白 質之吸附而小量洩漏。至於去除洩漏銅之方法，曾經推薦 一種技術，其中小的金屬未結合螯合物樹脂（亦即可結合 金屬但不含金屬之螯合物）柱連通至金屬螯合物樹脂柱。 結果，此種方法去除洩漏銅之作用檢視如下。一份20毫升 衍生自部分I及I上清液之經加熱處理且經濃縮的AT-瓜 溶液U 2 8 Q = 4 . 9 6 )溶解於0 . 1 Μ含氯化納之磷酸鈉緩衝液p Η 7 . 5，添加至銅螯合物To y ο ρ e a r 1柱U 5 X 2 . 8厘米，5毫 升），該柱係以相同緩衝液平衡，而匯集未吸附部分（2 7 . 5 毫升，A 2 8 a = 3 , 1 8 )。一份2 3 . 5毫升未吸附部分添加至金 屬未添加螯合物Toyopearl 650Μ柱（4 0.8Χ 2.0厘米，1毫 升），該柱事先Μ相同方式平衡，及匯集未吸附部分（2 5毫 請 閱 讀 背— 意- 事 項Ψ- 本 頁 裝 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 升 9 A 2 8 0 2 . 63)。 各步驟之銅含 量測量結果顯示於 表 5 步 驟 銅含量（P P b ) 添 加 至 銅 螯 合 物樹 脂柱 320 通 過 銅 螯 合 物 樹脂 柱 10,300 通 過 金 屬 未 結 合螯 合物樹脂柱 15 陰 性 對 昭 組 (C h r ο πι a t 〇緩衝液） 13 如表5所示，雖然1 0 , 3 0 0 ρ b洩漏銅出現於通過銅螯合物 柱部分，但發琨洩漏銅可藉將溶液通過金屬未結合螯合物 Toyopear 1 650M柱完全去除，原因為洩漏量降至15ppb， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -22 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565453 A7 B7 五、發明説明（2G) 該量接近對照含量（13ppb)。 起始物料及金羼未添加螯合物柱之溶離分之GPC-HPLC分 析圖樣顯示於圖5。由圖5所示，即使衍生自Ι+ϊ上清液 之材料可藉鋦螯合物柱純化，但除完整AT- Β除外未發琨 任何清晰峯。由峯面積求出純度為99*9»：。 實例6 經由銅螯合物及金靨未結合Toy op ear 1柱連結獲得鈍化產 率： 考盧曆析步驟之效率改良及自動化，對銅蝥合物及金羼 未添加螯合物之連接柱進行檢視。衍生自部分E+I上清 液或部分IV之AT-B經加熱處理及濃縮溶液，對含0.1M氛 化納之0.1 Μ磷酸鈉媛衝液pH7.5滲析1,600次，然後再對相 同媛衝液滲析1〇〇次（共滲析160,000次），滲析方式係使用 Centr*iprep-30(A«iiC〇n製造）進行濃縮及稀釋（部分IV: Α2β0=5.23，部分H+B上清液：Α2ΒΟ=5.50)。滲析峰因 Centriprep-30增加，原因為銅之洩漏率因殘餘擰檬酸而 變成滲析1,600倍。各一份20毫升溶液施加至串聯5奄升（ 彡1·5Χ 2.8厘米）鋦整合物Toyopearl及1毫升（Φ 0·8Χ 2*0 厘米）金屬-未结合螯合物Toyopearl柱，該柱事先Μ相同 媛衝液平衡。施加樣品時，溶離出之溶液中拋棄半量總柱 容量，隨後匯集溶離部分將其與10毫升洗出部分組合，後 者相當於2床容積銅螯合物柱。 由表6顯示純化產率顯然易知，衍生自部分Ι+1Ε上清液 及部分IV之材料顯示，活性回收率良好，皆為90¾或W上 。又，比活性約為1011/Α2β〇，相當於使用之醫藥製劑活性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝. 、11 23 565453 A7 B7 五、發明説明（21 表 液體量 A 2 8 0 材料來源 步 驟 (毫升） A 2 8 0 總量Η 2 8 0 產率（％ ) 2+1 添 加 柱 20 . 0 5*50 110 100 上清液 通 過 柱 27,0 3 . 22 86 , 9 79 , 0 IV 添 加 柱 2 0 ♦ 0 ,5.23 105 100 通 過 柱 26.0 2.92 75.9^ - 72.3 材料來源 步 驟 AT-I活性 U/毫升 總 活性 產率（％ ) 比活性 (ll/Azeo) H + I 添力0柱 49,0 981 100 8,9 上清液 通過柱 33.9 914 93,2 10.5 添力B柱 40*9 818 100 7,8 IV 通過柱 29.1 757 92 . 5 10.0 實例7 A T - Μ醫藥製劑之製備： 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 η 寫 經濟部中央標準局員工消費合作社印掣 實例5所得純AT - I經脫鹽，濃縮及通過BMM (Be mb erg微 孔膜）膜（旭化成公司製造）過濾。5 0單位/毫升如此製妥的 A T - I樣品與2 w / v %甘露糖醇，0 . 5 w / v %擰檬酸鈉及0 , 5 w / v % 氯化鈉混合及混合物Μ 1 H氫氧化鈉調整至p Η 7 . 2至p Η 7 . 5， 通過經滅菌的M i 1 1 i ρ 〇 r e過濾膜過濾滅菌，分配成每分5 0 0 單位然後冷凍乾燥，獲得凍乾醫藥製劑。 雖然已經參照特定具體例敘述本發明之細節，但業界人 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -24 - 565453 A7 B7 五、發明説明（22 ) 士顯然易知可未背離其精髓及範圍做出多種變化及修改。 本案係基於1 996年11月20日提出申請之日本申請案第和 8-309281號，及1997年6月4日提出申請之和9-163426(併 述於此K供參考）。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 25