TW533079B

TW533079B - Adjuvant compositions comprising ionic saccharides and saponins, and uses thereof

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Publication number: TW533079B
Application number: TW088123010A
Authority: TW
Inventors: John Walker
Original assignee: Csl Ltd
Priority date: 1999-01-08
Filing date: 1999-12-27
Publication date: 2003-05-21
Also published as: US20120251566A1; WO2000041720A8; CA2660344A1; US9579379B1; CA2359111C; NZ512011A; ES2317708T3; AUPP807399A0; JP2002534480A; DE69939706D1; DK1140165T3; CY1108693T1; WO2000041720A1; ATE410183T1; EP1140165A1; EP1946773A3; JP4949555B2; PT1140165E; EP1140165A4; US9149520B2

Description

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/ ) 發明領域本發明是廣泛地關於一種具有高佐劑性質及低反應原性（reactogenicity)的佐劑組成物。本發明之佐劑組成物是有效用的’當反應原性的發展在施用一免疫原的組成物是不可接受的之後’例如’但並非限制於，施用一促黃體生成激素釋放激素（LHRH)組成物作爲預防劑及/或治療劑，以用於消費性的家庭寵物或家畜之繁殖及行爲模式的改質。發明背景作者在本說明書中所提及的公開文獻之參考書目細節，收集在本說明的最後。佐劑是用以納入到或加到疫苗及其他免疫產生性調製物中，以增加免疫反應，並且在一些例子中，用以引導免疫反應（參見 Gupta ’ 1998 ; Cox 及 Coulter，1992 ; Azuma，1992以及Aguado等人，1999的回雇頁）。將可理解的是，一些佐劑（例如，油於水及水於油的乳化劑）被廣泛地視爲是強烈的佐劑，如同它們可刺激高度的抗體表現，但是這樣的佐劑之反應原性，會妨礙它們在許多動物或人類中一般性的使用。此不可接受的反應原性已在許多動物中顯示，伴隨著傳統的弗氏（Freunds’）油於水乳化劑，以致於在一些國家中已禁止或防止將這樣的佐劑使用於動物內，甚至是用於實驗的目的。在牛中使用結合的油於水/乙二胺乙基（DEAE )-葡聚糖（dextran )佐劑 (Hodgkinson等人，1990)，導致在30%接種疫苗的動物 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 533079 A7 _____ B7 五、發明説明（2 ) 中產生顯著及不想要的反應。在人類及動物中，最廣泛使用的佐劑是以不溶性銘鹽爲基底，特別是氫氧化物及磷酸鹽的形式，通常並整個稱爲明礬”。Aguado等人（1999 )最近的回顧強調，在人類及動物兩者中，對於更強大佐劑以用於更有效的疫苗之發展，是有持續的需求。例如’關於一廣泛範圍的可溶性抗原，對於單獨傳遞這樣的抗原之免疫反應是非常弱的，並且在許多的例子中’甚至在兩次疫苗接種之後仍是無法偵測的。這樣的抗原需要使用佐劑以刺激一致性的免疫反應。將可體會的是，已知的佐劑提供一系列可刺激免疫反應的能力，最常見的定義是對於免疫性的抗原所引起的抗體反應方面。廣泛了解的是，對於連接到載體蛋白質上的半抗原 (haptens)而言，其需要一強有力的佐劑。例如，下視丘胜肽激素-促黃體生成激素釋放激素(LHRH)，是一 10個胺基酸的胜肽，其本身爲非免疫原性的。將促黃體生成激素釋放激素連接到載體蛋白質，例如白喉類毒素或白蛋白，可提供必要的T-細胞，幫助對於促黃體生成激素釋放激素半抗原的免疫反應。對於其他大分子量及複雜的抗原而言，T-細胞的幫助通常是藉由在分子本身內部的T-細胞抗原決定部位（epitopes)而提供。使用乙二胺乙基-葡聚糖作爲佐劑，已充分說明於科學文獻中。Wittman等人（1975 )，使用乙二胺乙基-葡聚糖作爲豬口蹄疫病毒（FMDV)疫苗的佐劑，並且顯示其誘一 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 A7 B7 五、發明説明（s ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 導非常高的免疫反應。Houston等人（1976)，以1-5毫克 /公斤體重的比例之劑量使用此佐劑，與一馬科病毒接種猴子’並且顯示其誘導高的抗體效價。Beh及Lascelles (1985 )也使用此佐劑，與白蛋白一起使綿羊免疫，並且顯示其誘導比其他可溶性的佐劑更高的抗體效價。這些硏究都沒有考慮乙二胺乙基-葡聚糖的部位反應性，但他們的確說明了乙二胺乙基_葡聚糖在這些動物中，顯著的佐劑效應。乙二胺乙基-葡聚糖已使用在有關鑰匙孔帽貝血藍蛋白 (KLH)的抗原中（Hibma及Griffin，1992)。在這個硏究中，乙二胺乙基-葡聚糖比起弗氏佐劑或白蛋白，對KLH 誘導更大的免疫球蛋白IgG反應。長久以來已知道，植物皂素（asPonin)的佐劑性質，其具有對免疫原增加抗體效價的能力。如同此處所使用的，名詞“植物皂素”是指一群源自植物之表面活性的糖苦（glycosides)，其由類固醇或類三結（triterpenoid)結構的親水性區域（通常是數個糖鏈）與疏水性區域所組成。雖然植物皂素可從許多不同的來源中獲得，但具有有效用的佐劑活性之植物皂素，已衍生自南美洲的經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (Molina)樹種。使用從這個來源而得的植物官素，以分離一種稱爲“ Quil A ”之“同源的”部份 (Dalsgaard，1974 )。對於獸醫及人類，在疫苗製劑中Quil A的使用，最重要的是劑量-部位的反應性。一種避免Quil A毒性的方法，是使用免疫刺激的複合物（已知如Iscoms™，一種免 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（屮）疫刺激複合物的縮寫）°追主要是因爲當併入免疫刺激白勺複合物時，Quil A具有較少的反應性’因爲其在複合物中聯合膽固醇，降低了在細胞膜中與膽固醇結合的能力，並因此降低其細胞溶解的效應。此外’需要較少量的Quil a 以產生相似的佐劑效應之程度。

Quil A植物皂素的免疫調節性質，以及當它們倂入一免疫刺激的複合物中時’欲衍生自這些植物皂素的其他優點，已在各種的公開文獻中說明，例如，cox及coulter， 1992 ; Dalsgaard，1974 ; Morein等人，澳洲專利說明書第 558258、589915、590904 以及 632067 號。自從1970年代早期，接種下視丘激素促黃體生成激素釋放激素（此處稱爲“ LHRH ” ，也已知稱爲 “GnRH”），已顯示作爲一種控制生殖的免疫學方法 (Fraser，1975 ; Jeffcoate 等人，1982)。誘導對於 LHRH 的免疫反應，避免荷爾蒙促黃體生成激素（LH)以及促卵泡激素（FSH)，從腦下垂體前葉釋放，這些荷爾蒙對於性腺（雄性的睪九及以及雌性的卵巢）的發育及維持是需要的。因此，促黃體生成激素以及促卵泡激素的降低，導致生殖功能的喪失。在獸醫醫學及家畜動物經營中，無性（或閹割）手術是最廣泛實施的外科手術。顯著比例的兩種性別之家畜及伴侶動物（companion animals)，被例行性的手術去除性別’以避免許多不需要之伴隨性成熟的特徵。這些特徵包括打鬥、遊蕩、性行爲、健康狀態的損失、生殖器官的腫一 _ 6

本度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐T (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明u) 瘤以及懷孕。在伴侶動物（例如，狗、貓、和馬）以及家畜（特別是雄性的豬以及雄性和雌性的牛）中，藉由以LHRH-連接的疫苗接種而控制交配行爲，已被視爲與控制繁殖力同等重要的目的。相似地，在人類及動物中，性腺及其他生殖器官的疾病（例如，睪九癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺腫大或子宮內膜組織異位形成）之控制及治療，也是重要的。國際專利申請案第PCT/AU98/00532號，其內容倂入此處作爲參考文獻，揭露了當LHRH與白喉類毒素及一離子性多醣（例如乙二胺乙基-葡聚糖）連接而施用時，接種 LHRH的功效有明顯的改善。然而，雖然功效有改善，但這個配製物仍然誘發了反應原性（例如，看得見的腫脹），其在施用的部位可以是長期維持的。在一些情況中，例如，當此調製物使用於接種家庭寵物（例如狗）或消費性的家畜，在接種使用此調製物之LHRH之後’這樣的反應原性之發生是不可接受的。因此，有需要發展一種 LHRH疫苗，其同時具有功效以及低的反應原性。在本發明的一方面，已確定的是，當一部份的離子性多醣成份以植物皂素成份取代時，特別地是免疫刺激的複合物，可降低連接到白喉類毒素及一離子性多醣的LHRH 之反應原性。發明總論 7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 在整個說明書以及其後的申請專利範圍中，除非內容上的需要，否則單字“包括（comprise) ”以及其語尾變化 (例如，comprises及comprising)，應了解成爲含有包括所指稱的整體或步驟或整體群或步驟群，但不排除任何其他的整體或步驟或整體群或步驟群的含意。在說明書中所指的核苷酸及胺基酸序列之序列辨識編號（SEQ ID NOS.)，在參考書目之後定義。序列辨識編號的摘述在實施例之後提供。本發明的一方面是有關於一種佐劑組成物，其包括一離子性大分子成份以及一植物皂素成份，特別地是有關於一種免疫刺激的複合物成份。這樣的佐劑組成物已發現具有高的佐劑活性以及低的反應原性。此結合的佐劑勝過其他已知的佐劑之優點在於，其具有獨特性質的組合，包括： (a) 對於一系列的抗原，具有可誘發非常強大的免疫反應之能力，並且 (b) 同時具有非常低的反應原性或反應力， (c) 此反應原性是低於在組合物中更具有反應原成份的反應原性，以及 (d) 此佐劑的效應或免疫刺激的效應是大於只有佐劑的任一成份所產生的效應。本發明的另一方面是提供一種佐劑組成物，其包括一離子性多醣成份以及一植物皂素成份，特別是一免疫刺激的複合物成份。 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（) 本發明另一方面是提供一種佐劑組成物，其包括一離子性多醣成份以及一植物皂素成份，特別是無蛋白質 (protein-free)之免疫刺激的複合物成份。本發明更進一步方面是提供一種免疫原的組成物，其包括一免疫原以及一佐劑組成物，其中，佐劑組成物包括一離子性大分子成份以及一植物皂素成份，特別是一免疫刺激的複合物成份。本發明另一更進一步方面是提供一種免疫原的組成物，其包括一免疫原以及一佐劑組成物，其中，佐劑組成物包括一離子性多醣成份以及一植物皂素成份，特別是一免疫刺激的複合物成份。本發明之另一更進一步方面是提供一種免疫原的組成物，其包括一免疫原以及一佐劑組成物，其中，佐劑組成物包括一離子性多醣成份以及一植物皂素成份，特別是無蛋白質之免疫刺激的複合物成份。本發明另一更進一步的形態是提供一種醫藥組成物，其包括如以上廣泛說明之免疫原組成物，以及一種或多種藥學上可接受的載體及/或稀釋劑。本發明的另一方面是有關於一種在動物體中，誘發一有效的免疫反應之方法，該方法包括將一有效量之如以上廣泛說明的免疫原組成物施用至該動物。在另一方面中，本發明提供如以上廣泛說明的免疫原組成物作爲製造用以在動物體中誘發一有效免疫反應之組成物之用途。 ___ 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（》）發明詳述本發明部份係基於以下的測定結果，即當包括共軛到白喉類毒素LHRH疫苗的離子性多醣成份（如國際專利申請案第PCT/AU98/00532號中所揭露）與一免疫刺激的複合物結合時，此免疫原組成物之反應原性降低，但功效上並沒有顯著的降低。因此，本發明之較佳方面是有關於一免疫原的組成物，使用於對LHRH誘發一有效的免疫反應，該組成物包括LHRH-白喉類毒素的結合，以及佐劑組成物，其中，佐劑組成物包括一離子性多醣或其他離子性大分子成份以及一植物皂素成份，特別是一免疫刺激的複合物成份。對於一免疫原的製劑，反應原性的發展（例如，在疫苗施用的部位），通常是藉由參考許多症狀的發展而評估’這些症狀包括發炎的症狀，例如腫脹，其可藉由觸診而偵測，或者，如果更嚴重的話，可藉由眼睛、發紅以及膿瘍的形成而偵測。反應原性的程度通常是藉由參考任何一種或多種的這些症狀之發生、持續期間以及嚴重性而決定°例如，導致看得見的膿瘍形成之反應原性，是較只有涉及腫脹之反應原性更嚴重。此外，眼睛看得見的腫脹，較只靠觸診才可偵測到的腫脹，是更爲嚴重之反應原性的形式。根據本發明，提及“低的，，反應原性，應當了解爲會產生無法偵測的症狀，或是眼睛看不見的症狀之反應原性。例如，只靠觸診才可偵測到的腫脹，是低的反應原性的一個實例。本發明應更廣泛地了解成完全沒有任何的反 ______10 本1^度適用中準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（7 ) 應原性。在本發明的上下文中，低的反應原性也可容忍包括只有短暫持續期間之看得見的腫脹。提及“離子性大分子”或“離子性多醣”，應了解成是關於任何正電荷或負電荷的多醣或其他的大分子，或其衍生物或化學等效物。提及“衍生物”或“化學等效物”，應當了解成是具有相同於以下槪述的意義。多醣或其他的大分子可予化學修飾，以導入帶電荷的基團，使其成爲高度帶有電荷者。在固體形式中或是當在溶液中時，帶電荷的基團與一抗衡離子（counter ion)配對，使得全部的淨電荷爲零或接近零。多醣可選擇自許多這樣的分子中的任何一種，較佳地是可溶性的分子以有助於滅菌（例如，藉由過濾而滅菌），但此多醣並不限定於可溶性的多醣，如同不溶性的物質可藉由輻射、溼熱或乾熱或其他的方法滅菌，而不須依賴溶解性。較佳地，多醣是連結α 1-6之葡萄糖的聚合物’以形成可溶性的葡聚糖’ 但也可使用連結α 1-3之不溶形式的葡聚糖。可修飾多醣或其他的大分子，以在PH値介於5.0及 8.0之間，得到強大的正（+ve)電荷基團。修飾的基團可選擇自許多+Ve電荷基團中的任何一種，較佳地是乙二胺乙基（DEAE)。另外的+ve電荷之多醣是QAE-葡聚糖。修飾的葡聚糖已知如乙二胺乙基-葡聚糖，可具有50,000 道耳吞到5 X 1〇6道耳呑範圍的分子大小，較佳地，分子量是從500,000到1·5 X 1〇ό道耳吞的範圍。已知如葡聚糖這樣大的大分子，在大小上是異質性的，典型地，95%的物 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 533079 A7 __B7 五、發明説明（p ) 質是在大約4倍大小的範圍之內。高的修飾程度，使得平均每3個葡萄糖殘基是以1個DEAE基團取代。這樣的物質可商業上購自葡聚糖或由葡聚糖製造。另外，葡聚糖或其他的多醣可以是帶負電荷的，例如，以硫酸鹽基團修飾。較佳地，本發明之佐劑組成物的離子性多醣成份是乙二胺乙基-葡聚糖成份。植物皂素成份可例如是Quil A或其他純化的或半純化的植物皂素製劑（包括植物皂素部份的混合物）。較佳地，植物皂素成份是以一免疫刺激複合物的形式而提供。免疫刺激的複合物（或IscomsTM)，其根據本發明倂入佐劑組成物中，可藉由熟悉於此技藝者所熟知的技術而製備，並且詳細地說明於Cox及Coulter的公開文獻， 1992，以及Morein等人，澳洲專利說明書第558258、 589915、590904以及632067號，其揭露的內容倂入此處作爲參考文獻。簡言之，免疫刺激的複合物典型地是，但並非限定於，直徑30-40毫微米（nm)之小籠狀結構。具有最適蛋白質量的免疫刺激複合物之最後的調製物，其Quil A、膽固醇、磷脂醯膽鹼以及蛋白質的莫耳比例是5 ·· 1 : 1 ·· 1。免疫刺激的複合物可包括，例如，5到1〇%重量百分比的 Quil A，1到5%重量百分比的膽固醇和磷脂質以及其他的蛋白質。將蛋白質倂入至免疫刺激的複合物之後，可將胜肽直接地或藉由化學連接到一載體蛋白質（例如，白喉類毒素或流行性感冒病毒外套膜蛋白質），而倂入至免疫刺 12 ^*張尺度適用中國國家標準（<^^)八4規格（210'乂297公釐） ''~' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 533079 A7 ____B7 五、發明説明（（！）激的複合物中。提及“免疫刺激的複合物”應了解成包括提及其衍生物、化學等效物以及類似物。例如，提及免疫刺激複合物的衍生物，包括提及一免疫刺激複合物，其中，一種或多種的Quil A、膽固醇、磷脂醯膽鹼或蛋白質，例如，是缺失的，或是除了 Quil A、膽固醇、磷脂醯膽鹼以及蛋白質之外的成份，添加到複合物中。免疫刺激複合物之功能性的等效物，可以是一免疫刺激複合物，其中，一種或多種的這四個成份是以一功能性的等效物取代。在本發明的一較佳具體實施例中，免疫刺激複合物的蛋白質成份是缺失的。這種類型的免疫刺激複合物，在此處稱爲“無蛋白質之免疫刺激的複合物”（或 Iscomatrix™) ° 在本發明之佐劑組成物中的免疫刺激複合物，應與離子性多醣成份帶相反的電荷。因此，在一較佳帶正電荷的乙二胺乙基-葡聚糖組合中，免疫刺激的複合物是帶負電荷的。這個所想要的特性，可藉由將帶電荷的植物皂素倂入此結構中而達成。藉由將一免疫刺激的複合物與帶負電荷的多醣成份結合之有效的佐劑組成物之形成，將需要此免疫刺激的複合物是帶正電荷的。在另一種形式中，帶正電荷的免疫刺激複合物，將與一帶負電荷的離子性多醣成份結合。廣泛範圍的抗原或其他的免疫原，可與本發明之新穎的佐劑組成物結合，包括可溶性的蛋白質抗原、連接到一載體蛋白質的胜肽半抗原，以及作爲抗原的完整病毒。此 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 A7 ____ B7 _ 五、發明説明（μ ) 外，對於佐劑以及其活性、其他的抗原，例如，重組蛋白質、抗原性的多醣、抗原性的脂質、胜肽以及其他的微顆粒抗原之先前知識，也可以適用於此佐劑組成物。最終的調製物是要用於提高對所選擇的抗原之免疫反應。覆載抗原的免疫刺激複合物以及無蛋白質之免疫刺激的複合物，都可用於形成此佐劑組成物。結合的佐劑可與抗原形成，此抗原是先倂入到免疫刺激的複合物中。在另一種形式中，在佐劑調製之後，可將抗原添加至結合的佐劑中。這在疫苗的製造中具有許多的優點，在實驗上以及商業上，如同佐劑的一種形式可使用於廣泛範圍的抗原。乙二胺乙基-葡聚糖是在此技藝中已知非常強大的佐劑，但是通常具有不可接受的反應原性。免疫刺激的複合物是已知可獨立地作爲可接受的佐劑，但相較於乙二胺乙基-葡聚糖，其具有極差程度的免疫刺激活性。更特別地，此新的佐劑是一種小心控制之乙二胺乙基-葡聚糖以及免疫刺激複合物的組合物，控制的比例是其維持兩種成份的佐劑活性，特別是更強有力的佐劑乙二胺乙基-葡聚糖，同時也是免疫刺激的複合物，但此組合是使得不想要的乙二胺乙基-葡聚糖之反應原性被中和掉。在此技藝中期待的是，佐劑的組合物將比個別的成份更具反應原性。這樣的例子是乙二胺乙基-葡聚糖與油類乳化劑的結合（Hodgkinson等人，1990) 〇在一系列動物中的延伸實驗已顯示，離子性多醣（例如，乙二胺乙基-葡聚糖）的質量，對免疫刺激複合物的質 14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（丨））量之比例，對於得到低反應原性的組合佐劑是具有關鍵性的。降低乙二胺乙基-葡聚糖10倍的濃度，將導致弱的活性之組合佐劑，同時也是低的反應原性。如同在實施例中所顯示的，使用較高濃度的乙二胺乙基-葡聚糖與低比例的免疫刺激複合物，例如，質量比例208，導致稍微低的免疫刺激活性，但具有不可接受之高反應原性的組合佐劑。此處所指的質量比例是有關於較佳的佐劑組成物，包括乙二胺乙基-葡聚糖，其中，大約每3個葡萄糖殘基是以葡聚糖取代，以及具有5 : 1 : 1比例之Quil A :膽固醇：磷脂質的無蛋白質之免疫刺激的複合物。具有質量比例在50到300範圍內的調製物，已發現是有效的，較佳是在100到140的範圍。一較佳的調製物是乙二胺乙基-葡聚糖對免疫刺激複合物，具有質量比例 125的調製物。這是以含有大約10毫克乙二胺乙基-葡聚糖以及大約80微克免疫刺激複合物的疫苗爲例子，使用於較小的或較敏感的動物中（例如，狗或人類），或相似地，大約100毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及大約800微克的免疫刺激複合物，或大約150毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及大約500微克的免疫刺激複合物，使用於較大的動物中（例如，馬、牛、羊及豬）。提及“有效的”免疫反應，應了解成是提及直接或非直接導致所需之預防或治療效果的免疫反應。在例子中，免疫原包括LHRH-白喉類毒素的結合，這樣的反應包括使測試的動物產生至少90%，較佳地至少95%生殖功能的降 15 本ϋ尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（沖）低或完全的限制（也就是，降低或預防任何一種或多種生殖器官的活性之功能性的發育，或調節動物的荷爾蒙濃度，使得任何一種或多種形態的繁殖或生殖活性降低）。應了解的是，功效是一種功能性的測量，並且不是只藉由抗LHRH抗體的效價而定義，因爲單獨循環的抗體之出現，並不是該循環的抗體可限制生殖功能之必要的指標。名詞“生殖器官”應以其最廣泛的意義來了解，是有關於雄性及雌性的性腺以及輔助的性器官。“輔助的性器官” 也應以其最廣泛的意義來了解，並且包括，例如，前列腺、乳房、精囊以及子宮。在此之後所提到的“LHRH”應了解成包括關於所有形式的促黃體生成激素釋放激素以及其衍生物、等效物以及類似物。提及“衍生物、等效物以及類似物”應了解成包括關於片段、局部、部份、化學等效物、突變體’從天然、合成或重組來源（包括融合蛋白質）之同源物、類似物。例如，關於LHRH，該LHRH包括胜肽，其包括一實質上如序列辨識編號：1或序列辨識編號：2或序列辨識編號：3 或序列辨識編號：4所提出之胺基酸的序列’或是具有其至少50%的相似度。在序列辨識編號：1 ' 2及3中定義的分子是源自於人類，並且在所有哺乳動物中是保留的。序列辨識編號：4是序列辨識編號：2的衍生物’其中間隔已導入於胺基端。LHRH的化學等效物可扮演LHRH之功能性的類似物。化學等效物不需要衍生自LHRH ’但可共孚 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 五、發明説明（is ) 特定的相似度。另外，化學等效物对專一性地設計成爲模擬LHRH之特定的生理化學性質。化學等效物可化學地合成，或例如，在天然產物的篩選之後的缺失。此處所考慮之LHRH的同源物包括，但並非限定於，衍生自不同門 (phyla)的LHRH，包括鳥類、魚類、爬蟲類以及無脊椎動物。 “衍生物”也可以衍生自胺基酸的插入、缺失或取代。胺基酸插入的衍生物包括胺基端及/或羧基端的融合，以及單一或多個胺基酸之序列內的插入。插入的胺基酸序列變異體，是將一種或多種胺基酸或非天然的胺基酸殘基’導入至蛋白質中預定的位置之胺基酸序列，但隨機的插入也是可能的，只要對所得到的產物做適當的篩選。缺失的變異體，其特徵在於序列中一種或多種的胺基酸之移除。取代的胺基酸變異體，是在序列中移除至少一種殘基’並且在此位置插入不同天然的或非天然的殘基之胺基酸序列。典型的取代是根據表1而完成。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 17 个、，、氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 533079 A7 B7 五、發明説明（4 ) 表1 用於胺基酸取代之適當的殘基原始殘某示範的取代物丙胺酸絲胺酸 *精胺酸離胺酸天門冬醯胺麩胺酸醯胺；組胺酸天門冬胺酸麩胺酸半胱胺酸絲胺酸麩胺醯胺天門冬醯胺 *麩胺酸丙胺酸 *甘胺酸脯胺酸 *組胺酸天門冬醯胺；麩胺醯胺異白胺酸白胺酸；纈胺酸 *白胺酸異白胺酸；纈胺酸離胺酸精胺酸；麩胺醯胺；麩胺酸甲硫胺酸白胺酸；異白胺酸苯丙胺酸甲硫胺酸；白胺酸；酪胺酸 *絲胺酸纈胺酸纈胺酸絲胺酸 *色胺酸酪胺酸 *酪胺酸色胺酸；苯丙胺酸纈胺酸異白胺酸；白胺酸註：以星號標示的胺基酸殘基，代表存在於哺乳動物LHRH序列中勺殘基。 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（q) 非天然的胺基酸之實例包括，但並非限定於該胺基酸的D型-異構物。“添加到”胺基酸序列，包括與其他的胜肽、多胜肽或蛋白質融合。提到的白喉類毒素，應了解成是關於所有形式的白喉類毒素及其衍生物。名詞“衍生物”具有如之前所定義之相同的意義。衍生物可包括，例如，包括白喉類毒素T-細胞抗原決定部位或分離之該T-細胞抗原決定部位的分子。較佳地，該LHRH包括一 LHRH羧基端片段之至少5 個胺基酸。更佳地，該LHRH是全長的LHRH或“LHRH 1-1〇形式”，其實質上地包括如序列辨識編號：1所提出之胺基酸序列。還要更佳地，該LHRH實質上地包括如序列辨識編號：2所提出之胺基酸序列，並且其中該胺基酸序列的羧基端是醯胺化的（amidated)。該較佳的LHRH，在此處稱爲“LHRH 2-10形式”。因此，在一較佳具體實施例中，提供一種用於對 LHRH誘發一有效的免疫反應之組成物，其包括LHRH 2-10形式-白喉類毒素的連結，以及一佐劑組成物，其中，佐劑組成物包括一離子性多醣成份（較佳地是乙二胺乙基-葡聚糖成份）以及一植物皂素成份，特別地是免疫刺激的複合物成份。在另一具體實施例中，提供一種用於對LHRH誘發一有效的免疫反應之組成物，其包括LHRH 2-10形式-白喉類毒素的連結，以及一佐劑組成物，其中，佐劑組成物包括一離子性多醣成份（較佳地是乙二胺乙基葡聚糖成份） 19 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 533079 A7 B7 五、發明説明（ff) 以及一植物皂素成份，特別地是無蛋白質之免疫刺激的複合物成份。並非要以任何一種方法來限制本發明的具體實施例， LHRH胜肽可藉由Fmoc化學而合成，並且所得的胜肽共軛到載體蛋白質白喉類毒素。該連接可如同Ladd等人 (1990)或Bonneau等人（1994)的說明而實施，並且所得的胜肽及載體蛋白質之共軛物（此處稱爲“胜肽共軛物”），其處理成不含未結合的胜肽以及共軛物的副產物。這樣的處理過程可藉由習知的透析或藉由超過濾 (ultrafiltration)而達成。所得到的胜肽共軛物吸附至離子性多醣佐劑。仍然無法以任何一種作用的理論或模式來限制本發明，相較於在先前技藝中所說明的LHRH-載體-佐劑組成物’施用一有效量之本發明的LHRH製劑，可誘導一對於 LHRH更明顯有效的免疫反應。當免疫原的LHRH組成物特定地包括載體白喉類毒素以及一離子性多醣佐劑時，可觀察到該改善的功效。藉由以免疫刺激的複合物成份來取代離子性多醣成份的一部份，可降低LHRH連接的製劑之反應原性，但同時維持其功效。根據本發明，適合使用之LHRH連接的製劑，較佳地在5-500毫克的離子性多醣（例如，乙二胺乙基_葡聚糠） /40-4000微克免疫刺激的複合物（例如，Isc〇matrixTM)之中’包括5-500微克的LHRH-白喉類毒素共軛物。根據本發明之醫藥組成物，可藉由目前在疫苗學技藝 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（J ) 中所知之任何途徑的注射而施用，例如，藉由皮下、肌肉內、皮內的注射，或藉由口服，或藉由塗抹至黏膜，不論是以溶液或凝膠或其他適合的調製物而直接塗抹，或是藉由氣溶膠（aerosol)而施用至鼻腔或呼吸道的表面。較佳地，此調製物是藉由皮下或肌肉內的注射而施用。此調製物可藉由冷凍乾燥或凍結乾燥，或藉由噴灑乾燥或其他的乾燥形式，而儲存成一固體、冷凍的或乾燥的調製物。適合於注射使用的醫藥形式，包括無菌的水溶液（水溶性的）或分散液，以及用於無菌注射溶液或分散液之速成製劑的無菌粉末。它在製造及儲存的條件下必須是穩定的，並且必須保存而免於微生物（例如，細菌及真菌）的污染作用。載體可以是溶劑或分散的介質，其含有例如，水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇以及液體狀的乙二醇，以及其類似物）、其適合的混合物以及蔬菜油。可維持合適的流動性，例如，藉由包膜（例如磷脂醯膽鹼）的使用，藉由在分散液中所需粒徑的維持，以及藉由表面活性劑的使用而達成。微生物作用的預防，大約可藉由各種的抗細菌劑及抗真菌劑而引起，例如，仲班酸 (parabens )、氯化丁醇、苯酚、山梨酸、三梅若索 (thimerosal)及其類似物。在許多例子中，較佳地是包括等張作用劑，例如糖或鹽類（例如氯化鈉）。可注射的組成物之延長的吸收或延遲的釋放，可大約藉由在組成物中所使用的作用劑延遲吸收而引起，例如，單硬脂酸鋁以及 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

___ 21 533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（γ) 動物明膠（gelatin)。無菌注射的溶液可藉由將在適當溶劑中，含有所需數量的活性化合物，與以上所列舉之各種的其他成份合倂而製備，如果需要的話，接著過濾滅菌。一般而言，分散液是藉由將各種滅菌的活性成份，倂入到一無菌的載體中，其包含基本的分散介質，以及以上所列舉之其他所需成份。在使用於無菌注射溶液的製備之無菌粉末的例子中，較佳的製備方法是真空乾燥、冷凍乾燥技術以及噴灑乾燥技術，其產生活性成份的粉末，加上從其先前無菌過濾的溶液中之任何其他所需之成份。當活性成份被適當地保護時，它們可藉由口服施用，例如，以一惰性的稀釋劑保護或以一可吸收之吞食載體保護，或者它們可包含在硬殻或軟殻的動物明膠膠囊內，或壓縮成片劑，或直接倂入餐飮的食物中。對於口服施用，活性化合物可與賦形劑合倂，並且以可攝取的片劑、口頰片劑、碇劑、膠囊、配劑、懸浮液、糖漿、薄片劑及其類似物之形式而使用。組成物及製劑的百分比可當然地做變化，並且習知地是介於大約5到80%單位的重量百分比之間。在這樣的有效用之組成物中，活性化合物的量是使得適當的劑量可藉此獲得。片劑、碇劑、九劑、膠囊及其類似物，也可包含如以下所列的成份：黏合劑，例如樹膠、阿拉伯膠、玉米澱粉或動物明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩散劑，例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、藻朊酸及其類似物；以及潤化劑’例 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（y丨）如硬脂酸鎂。當劑量單位形式是膠囊時，除了上述類型的材料之外，其尙可包含一液體載體。其他的各種材料，可如包膜般的存在，或者修飾劑量單位的物理形式。糖漿或配劑可包含活性化合物、仲班酸甲基酯及仲班酸丙基酯作爲防腐劑，以及染料。當然，任何使用於製備任何劑量單位形式的材料，在所使用的量之內，必須是獸醫學上的純度以及實質上是非毒性的。此外，活性化合物可倂入至持續釋放的製劑及調製物中。藥學上可接受的載體及/或稀釋劑，包括任何及所有的溶劑、分散介質、包膜、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收遲延劑以及其類似物。對於獸醫學上的活性物質，使用這樣的介質及作用劑，是在此技藝中所熟知的。除了在這個範圍中，與此活性成份不相容之任何習知的介質或作用劑之外，其使用於治療性的組成物是列入考慮的。也可將補充的活性成份倂入到組成物中。以易於施用以及劑量均等的劑量單位形式，而調製非腸胃道施用的組成物是特別具有優點的。對於施用至家畜，使用一連接至重複的疫苗接種槍之多劑量容器，是特別具有優點的。如同此處所使用的劑量單位形式，是指物理性分離的單位，其適合作爲對於要治療的病患之單位的劑量；每一個單位是包含一預定量的活性物質，其經計算，與藥學上的載體一起，可產生所需要的治療效果。對於本發明之新穎的劑量單位形式之規格，可藉由並根據以下的條件而指定：（a)活性物質之獨特的特徵及要達到之 23 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533079 A7 五、發明説明（ >工） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 特別的治療效果；以及（b)對於在具有疾病狀況的活體病患內之疾病的治療，在調和這樣的活性物質之技藝中所固有的限制，其中身體的健康是如同此處所詳細揭露的受到損害。主要的活性成份是對於方便性及有效的施用，以有效的量與一適合的藥學上可接受的載體，以如之前所揭露的劑量單位形式而調和。劑量單位形式可例如，以範圍從0.5 微克到大約2000微克的量，包含主要的活性化合物。以比例表示，活性化合物一般是存在於從大約0.5微克到大約 2000微克/毫升的載體。在含有補充的活性成份之組成物的例子中，劑量是藉由關於該成份的通常劑量以及施用的方式而決定。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製提及“動物”，應了解成是關於所有的動物，包括靈長類（例如，人類、猴子）、家畜動物（例如，綿羊、牛、馬、驢、山羊、豬）、實驗室試驗動物（例如，大白鼠、天竺鼠、兔子、倉鼠）、伴侶動物（例如，狗、貓）、圏養的野生動物（例如，食火雞、袋鼠、鹿、狐狸）、鳥類（例如，雞、鴨、矮腳雞、雉雞、食火雞、鴕鳥）、爬蟲類（例如，蜥蜴、蛇、青蛙）以及魚類（例如，鱒魚、鮭魚、鮪魚）。該動物可以是雄性或雌性的。本發明進一步的特徵，將於以下的實施例中更完整地說明。然而，應了解的是，此詳細的說明僅是舉例說明本發明之目的。而不應以任何的方式了解成，將本發明之廣泛的說明限制在以上之陳述。一 _ 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533079 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（θ)實施例1 LHRH_共軛物製劑之製備 LHRH-共軛物是以一合成的2-10形式之促黃體生成激素釋放激素（LHRH)胜肽共軛至一載體蛋白質爲基礎。此胜肽本身因爲太小，以致於不具抗原性，並且需要共軛至一載體蛋白質，使得此胜肽可扮演半抗原的角色，並且誘發對LHRH的免疫性。此載體蛋白質是白喉類毒素。此胜肽藉由Fmoc化學而合成，並且所產生的2-10形式的LHRH胜肽連結至白喉類毒素。此連結可如同Ladd 等人（1990)或Bonneau等人（195>4)的說明而實施，並且所得的胜肽及白喉類毒素之共軛物’其處理成不含未結合的胜肽以及共軛物的其他副產物。這樣的處理過程可藉由習知的透析或藉由超過濾而達成。所產生的LHRH-載體蛋白質製劑’可藉由與一佐劑或在佐劑中調製，而製備一用於施用的組成物。活性成份及佐劑的濃度是部份地取決於標的物種，並且選擇此活性成份及佐劑的濃度，以達到所需的免疫反應之程度及持續期間，並且部份地是取決於免疫反應的缺乏（也就是’組織相容性）。實施例2 A.無蛋白質之免疫刺激的複合物（Iscomatrix™)之製備在 20%Mega 10 淸潔劑中的 Quil A (Superfos，丹 25 本尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（麥）溶液（無菌的）以及二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC) / 膽固醇溶液，以優良製造程序（GMP)的條件，在一滅菌溫度控制的反應容器中，定量計算而無菌地結合，導致對於Quil A ·· DPPC :膽固醇是5 : 1 : 1的起始比例（重量比）。反應之後，超過濾此製劑以移除爲倂入的起始材料以及游離的Mega 10淸潔劑。此製劑（已知如 IscomatrixTM)本質上是一完成的佐劑，其係由無蛋白質之免疫刺激的複合物顆粒所組成。 B·包括乙二胺乙基·葡聚糖以及ISC0matrixTM的組合佐劑之製備乙二胺乙基-葡聚糖（Pharmacia，分子量範圍500,0〇〇到1，500,000 )是藉由一開始溶解在水中而簡單地製備成 20% (w/v)溶液，pH以氫氧化鈉調整至7.5，調整體積以得到所需要的濃度，接著藉由過濾而滅菌。然後以適當的比例，混合Iscomatrix™以及乙二胺乙基-葡聚糖加上抗原，接著添加稀釋劑調整最終體積，以達到此疫苗之所有成份的正確濃度。首先將適當體積的乙二胺乙基-葡聚糖，加到一含有適當攪拌裝置之滅菌的混合容器中。對於小於2公升的體積’磁攪拌子是適當的。然後加入適當體積的IscomatrixTM (約2毫克/毫升），接著加入適當體積的抗原以及稀釋劑’使得此材料達到正確的體積。所選擇的稀釋劑是具有低的離子強度，使得整個最終的調製物達到適當的等張性’並且因此避免因爲高張性或高於生理的滲透壓，而產 — ___ 26 本&張尺度適用中國國家系^( CNS ) A4規格（210X297公釐） ' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（>?) 生之注射的疼痛。這在疫苗調製技藝中是特別重要的，因爲導源於注射之嚴重的疼痛是非常不想要的，並將使得整個調製物是不適當的。發現適合用於狗的疫苗之稀釋劑是無菌的注射用水（WFI )，也就是無發熱原 (pyrogen free)的蒸態水。實施例3 A.用於狗試驗之疫苗的製備 (a) 單獨只有乙二胺乙基-葡聚糖佐劑需要在此試驗中測試的是1毫升劑量的調製物，在無菌的磷酸鹽緩衝溶液中，其含有50毫克的乙二胺乙基-葡聚糖、200微克LHRH-白喉類毒素的共軛物，並添加局部抗菌劑（thimerosal ; 0.01% )作爲防腐劑。用於此疫苗的佐劑是藉由將乙二胺乙基-葡聚糖溶解在蒸餾水中，並以氫氧化鈉調整pH至7.5而製備。乙二胺乙基-葡聚糖的最終濃度，是在pH調整之後，藉由添加蒸餾水而調整至20% (w/v)。此溶液接著經由過濾而滅菌。 LHRH胜肽（2-10 LHRH)如實施例1中所說明的連接至白喉類毒素。此共軛物經由過濾而滅菌，並且蛋白質濃度藉由標準的方法而測定，例如，藉由BCA蛋白質分析法。使用於此硏究之製劑是5.7毫克蛋白質/毫升。 (b) 單獨只有Iscomatrix™佐劑需要在此試驗中測試的是1毫升劑量的調製物，在無菌的磷酸鹽緩衝溶液中，其含有60微克的Iscomatrix™、 27 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533079 A7 五、發明説明（“） 200微克LHRH-白喉類毒素的共軛物，並添加局部抗菌劑 (thimerosal ; 0.01% )作爲防腐劑。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用於此疫苗的佐劑是如實施例2A所說明的，藉由使用Qiiil A作爲植物皂素衍生物，伴隨膽固醇、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC)以及Mega 10作爲淸潔劑。此步驟是在無菌的條件下實施，並且所有的成份在添加之前皆須滅菌。測定Quil A的濃度是2.24毫克/毫升。 LHRH胜肽（2-10 LHRH)如實施例1中所說明的連接至白喉類毒素。此共軛物經由過濾而滅菌，並且蛋白質濃度藉由標準的方法而測定，例如，藉由BCA蛋白質分析法。使用於此硏究之製劑是5.7毫克蛋白質/毫升。 (c) Iscomatrix™+乙一胺乙基-葡聚糖需要在此試驗中測試的是1毫升劑量的調製物，在無菌的磷酸鹽緩衝溶液中，其含有60微克的IscomatrixTM + 10毫克的乙二胺乙基-葡聚糖、200微克LHRH_白喉類毒素的共轭物，並添加局部抗菌劑（thimerosal ; 0·01% )作爲防腐劑。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製用於此疫苗的佐劑是一混合的佐劑’藉由結合適當比例的Iscomatrix™以及乙二胺乙基-葡聚糖而獲得。 Iscomatrix™是如實施例2A所說明的而製備，乙二胺乙基_ 葡聚糖則藉由上述之說明而製備。 LHRH胜肽（2-1〇 LHRH)如實施例1中所說明的連接至白喉類毒素。此共車尼物'經由過^濾而滅_ ’並且蛋白質濃度藉由標準的方法而測定，例如，藉由BCA蛋白質分析 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 533079 A7 _ B7_ 五、發明説明（4 ) 法。使用於此硏究之製劑是4.9毫克蛋白質/毫升。 B.狗的疫苗接種所有的試驗是以相同的方式進行。 6-12個月大以及混合性別的狗，圏養在室內的圍欄中，並具有可到戶外追逐的自由通道。餵食它們商業上可獲得的均衡飮食。 7個組別的狗，在第0週及第4週，以1毫升劑量的疫苗，在頸部的頸背內皮下接種。所有的疫苗都從安裝23 號針頭的2毫升針筒而施用。在固定的間隔將狗放血，以監測抗LHRH的抗體程度。疫苗的反應原性是在疫苗接種之後，藉由狗的密切檢視而測定。檢視是對於疫苗接種部位以及周圍區域，藉由視覺上的檢查並且藉由完全手工的觸診而實施。部位的反應性是藉由對於注射部位及周圍區域之密切的視覺檢查及身體的觸診而評分。反應性的評分如下：〇沒有視覺上或可偵測的反應性 1只有藉由觸診才可偵測的反應性 2不須觸診即可由視;1上偵測的反應性 3嚴重長膿瘍的反應性 _ 29 本紙^尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐_) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（ >》）部位的反應性分數疫苗調製物追加促進後1週追加促進後2週追加促進後4週分數 0 1 2 0 1 2 0 1 2 乙二胺乙基-葡聚糖 (50毫克） 3/7 2/7 2/7 3/7 4/7 - 7/7 - - Iscomatrix™ (60微克） 7/7 - - 7/7 - - 7/7 - - 乙二胺乙基-葡聚糖(1〇毫 ^}+Iscomatrix™ (60 5/7 1/7 1/7 7/7 - - 7/7 - - (註：追加促進後=p〇st_b〇〇st) 這些結果顯示乙二胺乙基-葡聚糖的調製物，是較 13〇〇11^1^1^調製物或Iscomatrix™ +乙二胺乙基-葡聚糖的調製物，更具有反應性。單獨只有乙二胺乙基-葡聚糖時，明顯的反應性（1分或更多）持續至少2週。關於 Iscomatrix™調製物，並沒有偵測到反應性，以及關於乙二胺乙基-葡聚糖+ IscomatHxTM的調製物，在2/7隻狗中，小量的反應僅持續1週。爲了提供更定量的反應原性之數據，當偵測時，部位反應性之大約體積是以寬度X長度X高度（單位：公分）而測量。對於上表之追加促進後1週及2週，結果如下所提供。沒有提供1^〇11^1：1^1^疫苗調製物組之部位反應性體積，因爲並沒有偵測到部位反應性。 30 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 533079 A7 B7 五 ί 、發明説明（d) 部位反應性體積疫苗調製物追加促進後1週之部位反應性體積（立方公分）追加促進後2週之部位反應性體積（立方公分） 0分 1分 2分 0分 1分 2分乙二胺乙基-葡聚糖 (5〇毫克） - 32， 4 40， 8 - 6.25, 1 0.5, 0.5 - IscomatrixTM (6〇微克）+ 乙二胺乙基-葡聚糖(10臺克） 1.1 6 - - - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製這些結果顯示在Iscomatrix™ +乙二胺乙基-葡聚糖的調製物中，是較單獨只有乙二胺乙基-葡聚糖的調製物，具有更少的反應原性程度，如同藉由反應性體積所顯示的結果。實施例4 以改變比例的乙二胺乙基-葡聚糖及Iscomatrix對狗之疫苗接種獵犬狐犬的雜交犬（8或13組），以2-10 LHRH連接到白喉類毒素調製物而疫苗接種。活性成份被調製於單獨的乙二胺乙基-葡聚糖中、單獨的Iscomatrix中，或是結合的佐劑乙二胺乙基-葡聚糖加上Iscomatrix中。 (A) 乙二胺乙基-葡聚糖疫苗··每一劑量包含在1毫升的體積中，調製成包含1〇毫克或5〇毫克的乙二胺乙基_ 葡聚糖，以及200微克的2-10 LHRH-白喉類毒素共軛物。 (B) Iscomatrix :每一劑量調製物在1毫升中，包含 60微克或150微克的Iscomatrix，以及200微克的2-10 LHRH-白喉類毒素共軛物。 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐）广请先閲讀背兩年沐意事項存填寫本買)

、1T

533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7____ 五、發明説明（》。） (C )結合的佐劑：每一劑量包含在1毫升的體積中，以如下所示的比例，調製成包含乙二胺乙基葡聚糖和 Iscomatrix，以及200微克的2-10 LHRH-白喉類毒素共軛物。結合的佐劑包含下列之一： (1) 10毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及60微克的 Iscomatrix -稱爲 10/60 疫苗。 (2) 12.5毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及60微克的 Iscomatrix -稱爲 12.5/60 疫苗。 (3) 10毫克的乙二胺乙基·葡聚糖以及80微克的 Iscomatrix -稱爲 10/80 疫苗。疫苗接種的程序：將這些調製物，在第〇週及第4週’藉由皮下注射而施用至狗。在第二次疫苗接種之後的兩週，採樣血液樣品並且分析抗LHRH的抗體。部位反應性是藉由每週對注射部位及周圍組織細心的觸診而測定。所呈現的部位反應性數據是在追加促進疫苗接種之後。在特定的環境中，對疫苗接種的反應性，可能會隨著持續的疫苗接種而增加，並且因此，在追加促進之後的反應原性，被視爲是較初次疫苗接種之後，更爲嚴格的測試。部位的反應性分數部位的反應性是藉由密切的檢查及觸診而評分，反應性的評分如下： 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 533079 A7 B7 五、發明説明（；丨）〇沒有視覺上或可偵測的反應性 1只有藉由觸診才可偵測的反應性 2不須觸診即可由視覺上偵測的反應性 3嚴重長膿瘍的反應性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 疫苗調製物追加> 促進後1週追加/ 促進後2週追加，促進後4週分數 0 1 2 0 1 2 0 1 2 乙二胺乙基-葡聚糖 (10毫克） 1/8 2/8 4/8 4/8 2/8 1/8 7/8 0/8 0/8 乙二胺乙基-葡聚糖+ IscomatrixTM 12.5/60 疫苗 5/8 1/8 2/8 5/8 1/8 2/8 7/8 1/8 0/8 乙二胺乙基-葡聚糖+ IscomatrixTM 10/80 疫苗 11/13 2/13 0/13 10/13 3/13 0/13 12/13 1/13 0/13 部位反應性體積體積是從局部反應性之測量到的大小而計算（其藉由觸診而測定），並且體積是以毫升爲單位而表示。這個測量對部位反應性之嚴重程度，提供一較佳的指示。

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 33 武張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533079 A7 B7 五、發明説明（0 ) 疫苗調製物追加促進後1週追加促進後2週追加促進後4 分數 0 1 2 0 1 2 0 1 2 乙二胺乙基·葡聚糖 - 0.12 24, - 0.25 1.7 - - - (10毫克） 5 12, 0.75 9， 3 乙二胺乙基-葡聚糖+ - - 32.2 0 1.5 1.8, - 0.03 - Iscomatrix™ 12.5/60 3 疫苗乙二胺乙基·葡聚糖+ - 0.25 - 0 0.06 - - - - IscomatrixTM 10/80 疫苗 0.5 2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製摘述：這些在狗中與2-10 LHRH白喉類毒素共軛物的數據顯示，以改變比例的乙二胺乙基-葡聚糖與Iscomatrix之結合的佐劑，具有不同的反應原性之程度。各種調製物的部位反應原性之比較顯示，相較於葡聚糖，以12.5毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及60微克的Iscomatrix之比例而調製之結合的佐劑是具有反應原性的，如果不是較相同劑量之單獨的乙二胺乙基-葡聚糖更具有反應原性的的話。此爲208 的質量比例。相較之下，含有1〇毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及80 微克的Iscomatrix之調製物，較單獨的乙二胺乙基-葡聚糖或12.5/60的調製物，具有明顯較少的反應性。此調製物在注射之後的任何時間都不會產生看得見的反應性，並且反應性體積的比較顯示，在注射之後的所有時間，10/80 34 氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一一 533079 A7 B7___ 五、發明説明（Β ) 的調製物具有非常少的反應，並且發生那些較少的反應，是13隻狗中的3隻，在更可接受之後的2週以及具有較短的持續期間。此爲125的質量比例。佐劑的免疫刺激之有效度，可藉由誘發之抗體反應的強度及持續期間而判斷。對於乙二胺乙基-葡聚糖及結合的佐劑，在追加促進後8週的抗體效價顯示如下。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對LHRH之抗體效價（追加1 E進後8週）疫苗調製物幾何平均效價範圍 Iscomatrix™ (150 微克/劑量） 12244 3761-58097 Iscomatrix™ ( 60 微克/劑量） 3965 3322-7343 乙二胺乙基-葡聚糖（50毫克/劑量） 38913 23166-50377 乙二胺乙基-葡聚糖（10毫克/劑量） 6917 2007-24477 乙二胺乙基-葡聚糖+ Iscomatrix™ 10/60疫苗 11686 4149-35112 乙二胺乙基-葡聚糖+ Iscomatrix™ 12.5/60疫苗 9670 4191-54737 乙二胺乙基-葡聚糖+ Iscomatrix™ 10/80疫苗 19456 9730-50644 _I本經濟部智慧財產局員工消費合作社印製摘述：上表中的效價顯示，10/80疫苗（質量比例125)，較結合的佐劑12.5/60疫苗（質量比例208)或10毫克單獨的乙二胺乙基-葡聚糖佐劑疫苗，是一較強的免疫刺激物。特別注意的是，10/80疫苗的有效度，於增加最低反應的狗之最低效價。疫苗的功效在許多的例子中，是藉由在小部份的測試族群之無效的反應而降低，並且通常不是藉由在測試族群中之最大及有效反應的部份而決定。 35_ 「尺度適用中國國家標準（〇灿）八4規格（210、乂297公釐) 533079 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（0) 兩個結合的佐劑疫苗，是更有效於單獨的乙二胺乙基_ 葡聚糖調製物或以Iscomatrix爲基底的疫苗。結合的佐劑之反應是大於附加的效應，並且因此這兩種成份可判斷具有協同地作用。125的質量比例是更有效於增加較低反應的狗。實施例5 以在結合的佐劑中之牛病毒性腹瀉病毒（BVDV)接種綿羊 1.牛病毒性腹瀉病毒（BVDV)之生長及失去活性：病毒抗原的牛長= 使用兩種品系的牛病毒性腹瀉病毒，Trangie以及 Bega，其分離自澳洲感染的牛隻。所使用的生長培養基是 Eagles最低營養要求必須培養基，其含有單一濃度之非必須胺基酸，以及3%的重碳酸鹽、2%的N-2-羥乙基呃嗪-N’-2’-乙基磺酸（HEPES)和2%的成熟的牛血淸。 1 X 1700平方公分之滾瓶（roller bottle)，以0·1的感染多重性（ΜΟΙ)之Trangie (AJ050 )接種。將滾瓶在 37°C下滾動培養5天，然後冷凍。1 X 1700平方公分之滾瓶，以1.0的感染多重性（MOI)之Bega ( WVS p3)接種，並且在37°C下滾動培養5天，然後冷凍。解凍滾瓶，並藉由抗原專一性的酵素連結免疫吸附分析法（ELISA) 而測定抗原含量。使用於此疫苗調製物的製備之特性如下： 36 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533079 A7 五、發明説明（U )

Trangie : E2 (表面醣蛋白）程度= 1/8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) NS3 (非結構性蛋白）程度=1/8 Bega : E2 程度= 1/8 NS3 程度= 1/4 失丫舌 f生（inactivation ): 50毫升的每一種病毒分配至500毫升的瓶子中。加50毫升/公升的2.8%碳酸氫鈉=5毫升加20毫升/公升的1 M HEPES緩衝液=2·1毫升力口 1毫升/公升的沒-丙炔內酯（/5-ProPriolactone; BPL) = 107 微升將內容物轉移至一含有磁攪拌子之新的500毫升瓶子中，並且在2-8t攪拌21小時。失去活性的物質轉移至37 t，並且再攪拌3小時，以水解任何剩下的/3-丙炔內酯。 2.疫苗調製物：結合的佐劑：每一劑量包括2毫升失去活性的病毒以及1毫升結合的佐劑。大量疫苗之調製爲：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 30毫升失去活性的Bega及Trangie 15毫升結合的佐劑（111毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及880微克的Iscomatrix/毫升，等於125的質量比例） 45〇微升之局部抗菌劑（thimerosal)作爲防腐劑。 Iscom™佐劑：每一劑量包括兩種品系的病毒以及2 毫克的IscomTM，作爲Quil A等效物，再2毫升的總體積內。 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533079 A7 B7 五、發明説明（；Ο 在藉由震盪和翻轉而混合之後’將疫苗分配至一大的塑膠枕袋中，並儲存在2_8°C。疫苗接種的程序：兩種疫苗均以如下所述之方式施用：第0天：綿羊以3毫升之結合的佐劑疫苗中的每一個，或2毫升之IscomTM佐劑’在頸部皮下施用。第28天：每個動物都給予第二劑量的疫苗’如上述之方式施用。組別：10隻綿羊以1scomTM佐劑的疫苗接種。 4隻綿羊以結合的佐劑疫苗接種。部位反應性：結合的佐劑：綿羊在初次及第二次的疫苗接種之後’ 以7天的間隔檢視。在初次疫苗接種之後’ 4隻綿羊中的1 隻發展成1分的部位反應性（小的可觸診之腫脹’但看不見的）。此問題在疫苗接種之後2週解決。

IscomTM :綿羊在追加促進之後第6天檢視。10隻綿羊中的7隻在注射的部位處，具有大的反應性。摘述：結合的佐劑具有較小及較少頻率的部位反應性，顯示其誘發較低程度的反應原性。實施例6 以在結合的佐劑中之卵淸蛋白（ovalbumin)接種老鼠 38 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（W ) C57/Blk6老鼠（每組3隻）以雞蛋白蛋白 (ovalbumin ; OVA)，經皮下而接種，其係以下列成份調製： (1 ) 0.625毫克的乙二胺乙基-葡聚糖 (2) 5 微克的 Iscomatrix (3 ) 0.625毫克的乙二胺乙基-葡聚糖與5微克的 Iscomatrix。此爲含有U5之質量比例調製之較佳結合佐劑之疫苗。上述疫苗的每一劑量，在100微升的體積中，都含有 12.5微克的卵淸蛋白，成份的體積及濃度，是藉由無菌的注射用水而調整。老鼠以皮下接種（僅接種一次），並且在初次疫苗接種後的14天，以安樂死採取血液樣品。因此得到的血淸用於分析對卵淸蛋白反應的免疫球蛋白IgM及IgG。監測老鼠的健康以及全身的反應原性之症候。反應原性：在乙二胺乙基-葡聚糖及結合的佐劑組中的老鼠，在初次疫苗接種後的14天仍然保持良好。然而，以Iscomatrix接種的3隻老鼠中的2隻，在接種的第8天死亡。Iscoms™、植物皂素及Iscomatrix對老鼠的毒性是已知的。在結合的佐劑組中的老鼠仍然保持良好，顯示結合的佐劑是較少的全身性反應原性。抗體效價：在初次免疫之後的14天所得到的血淸，藉由酵素連結 39 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 A7 B7 五、發明説明（# ) 免疫吸附分析法而分析抗卵淸蛋白之免疫球蛋白及 IgG的抗體效價。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 老鼠對卵淸蛋白之1gM效價，在初次疫苗接種後的14天所有顯示的效價是1/200血淸稀釋的酵素連結免疫吸附分析之光學密度（〇D)。_^ 疫苗調製物乙二胺乙乙二胺乙乙二胺乙 Iscom- 結合的結合的結合的葡聚糖基葡聚糖麵聚糖 atrix™ 佐劑佐劑佐劑 ------ 1/200 稀釋的 OD 0.581 0.895 0.487 0.275 0.778 0.571 0.414 老鼠對卵淸蛋白之IgG效價’在初次疫苗接種後的14天所有顯示的效價是1/200血淸稀釋的酵素連結免疫吸附分析之光學密疫苗調製物乙二胺乙乙二胺乙乙二胺乙 Iscom- 結合的結合的結合的葡聚糖葡聚糖基葡聚糖 atrix™ 佐劑佐劑佐劑 1/200 稀釋的 OD 0.753 0.771 0.745 0.493 0.495 0.618 0.716 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製摘述：以上的數據顯示，以在所有測試佐劑中之可溶性抗原 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2⑴X 297公瘦） 533079 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（θ) 卵淸蛋白免疫之老鼠，在單一疫苗接種後的14天，可誘發 IgM及IgG抗原決定部位之抗體反應。結合的佐劑及乙二胺乙基-葡聚糖單獨的調製物’較 Iscomatrix佐劑的疫苗，誘發較局的抗體反應。對於熟悉於此技藝者，將期待的是，以存在有佐劑之可溶性抗原單一疫苗接種的老鼠，將顯著地引起IgM的免疫反應。在單一疫苗接種後的14天，以卵淸蛋白接種之老鼠，結合的佐劑可誘發一強大的IgG免疫反應。這個結果支持先前發表的結論（Houston等人，1976)，即乙二胺乙基-葡聚糖佐劑縮短從早期IgM轉換到IgG免疫反應的期間’ 並藉此增加對早期疫苗接種的IgG免疫反應。這也似乎是結合的佐劑的一種性質。實施例7 以在結合的佐劑中之2-10 LHRH-白喉類毒素接種牛疫苗以及接種程序= 未生過小牛的母牛（heifers)藉由皮下注射而施用，疫苗以200微克的2-10 LHRH共軛物及下列之一調製： 1. 乙二胺乙基-葡聚糖（ 200毫克/劑量）-50隻小母牛 2. 結合的佐劑（150毫克乙二胺乙基-葡聚糖與500微克的Iscomatrix，質量比例300) - 6隻小母牛所有的疫苗都調製成2毫升的劑量。 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 A7 B7 五、發明说明（仏。）疫苗在第〇週及第4週施給，並且在追加促進後的2 週（第6週）採取血液樣品。部位反應性在追加促進後的2週，於半定量表上，依〇到3分而評分。藉由頸靜脈或尾靜脈穿刺術，在追加促進後的2週 (第6週）採取血液樣品。從血液樣品中，藉由使其凝集並藉由離心分離而得到血淸。IgG抗原決定部位的血淸效價，是藉由酵素連結免疫吸附分析法對LHRH而分析。部位反應性：部位反應性的分數，其評分表如下： 0沒有視覺上或可偵測的反應性 1只有藉由觸診才可偵測的反應性 2不須觸診即可由視覺上偵測的反應性 3嚴重長膿瘍的反應性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製疫苗調製物追加促進後2週分數 0 1 2 3 乙二胺乙基-葡聚糖 50隻小母牛 32 7 8 3 乙二胺乙基-葡聚糖+ Iscomatrix™ 6隻小母牛_ 1 1 4 0 摘述· 使用乙二胺乙基-葡聚糖作爲佐劑，在接種牛隻中的3 42 本紙張尺度適用中國國家擦準（CNS ) A4規格（21〇'〆297公釐） 533079 A7 B7 五、發明説明（叫）隻，導致3分之嚴重的部位反應性（膿瘍）。結合的佐劑在任何牛隻中，均未誘發嚴重的反應性，沒有發生3分的損傷。抗體效價：在追加促進接種後2週，抗LHRH的血淸IgG效價，藉由酵素連結免疫吸附分析法而測定。疫苗組別組平均效價效價範圍乙二胺乙基-葡聚糖 4181 100-16836 乙二胺乙基·葡聚糖+ Iscomatrix™ 15869 1841-51920 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) J— ·

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製摘述：在所有接種的牛隻中，結合的佐劑誘發高的效價（超過15,000的組平均效價）。相較之下，單獨使用乙二胺乙基-葡聚糖作爲佐劑，導致較低的組平均效價（4181)，並且是更低的免疫反應範圍。熟悉於此技藝者將了解，可對本發明在此處的說明做更動及潤飾，而有別於特定說明的內容。應了解的是，本發明包括所有的這些更動及潤飾。本發明也包括在說明書中個別或整體所提及或指出的所有步驟、特徵、組成物以及化合物，以及任何兩種或多種該步驟或特徵之任何或所有的組合物。 43 訂

適度縣釐公 7 9 . 2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 533079 A7 B7 五、發明説明（0 ) 參考書目：

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Houston, W.E. et al, Infect. AndImmun. 13:1559-1562 (1976). 44 本&張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

533079 A7 ___B7_五、發明説明（叼） Jeffcoate, I.A., Lucas, J.M. and Crighton, D.B., Theriogenology 18:65-77 (1982). Ladd, A., Tsong, Y.Y. and Thau, R.B., American J. Reproductive Immunology 22:56-63 (1990). Meloen, et al, Vaccine 12:741-746 (1994). Potter, A.A. and Manns, J.G., International Patent Application No. PCT/CA97/00559 (1997). Robertson, I.S.? Fraser, H.M., Innes, G.M. and Jones, A.S. Vet. Record 111:529-531 (1982). Sad S.? Gupta H.? Talwar G.P. and Raghupathy R., Immunology 74:223-227 (1991). Wittman, et al, Arch. Virol. 47:225-235 (1975). Zee, A.? Noordefraaf, C.V., Bosch, H.? Gielen, J., Bergmans, H., Hoekstra, W. and Die, I. Vaccine 13:756-758 (1995). (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533079 A7 B7 五、發明説明（#+) 序列表 (1) 一般資訊： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

(0 申請人：CSL LIMITED (ii)發明名稱：改良的佐劑組成物及其相關方法

Ui)序列數目：4 (iv) 通訊地址：

(A) 收件人：DAVIES COLLISON CAVE

(B) 街道：1 LITTLE COLLINS STREET (C) 城市：墨爾本 (D) 州：維多立亞 (E) 國家：澳洲 (F) 郵遞區號：3000 (v) 電腦可閱讀之形式： (A) 介質類型：磁碟片 (B) 電腦：IBM PC相容

(C) 操作系統：PC-D0S/MS-D0S (D) 軟體：Patentln Release #1.0，1.25 版 (vi) 目前申請資料：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (A) 申請案號： (B) 申請曰： (C) 分類： (vii) 代理人資料：

(A)姓名：SLATTERY, JOHN Μ (Β)參考/檔案號碼：2246984/JMS 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 533079 A7 B7 五、發明説明（^ ) (b〇電信資料： (A) 電話：+61 3 9254 2777 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (B) 傳真：+61 3 9254 2770 (C) 電報：AA 31787 (2)序列辨識編號：1之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：10個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股式：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii) 分子類型：胜肽 (xi)序列說明：序列辨識編號z 1 p-Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 (2)序列辨識編號：2之資料： (i) 序列特徵：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (A) 長度：9個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股式：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii) 分子類型：胜肽 (xi)序列說明：序列辨識編號：2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 533079 A7 B7 五、發明説明（專t)

His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2)序列辨識編號：3之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：8個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股式：單股 (D) 拓樸學1 泉形 (ii) 分子類型：胜肽 (xi)序列說明：序列辨識編號=3 Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 (2)序列辨識編號：4之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：9個胺基酸 (B) 形式：胺基酸經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (C) 股式：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii) 分子類型：胜肽 (xi)序列說明：序列辨識編號：4

Gly Ser Gly Ser Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims

533079 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 10. 根據申請專利範圍第1項之組成物，包括大約150 毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及大約500微克的免疫刺激複合物。 11. 一種免疫原性組成物，包括免疫原以及佐劑組成物，其中該佐劑組成物是根據申請專利範圍第1至10項中任一項之組成物。 12. 根據申請專利範圍第11項之免疫原性組成物，其中該免疫原包括促黃體生成激素釋放激素（LHRH)。 13. 根據申請專利範圍第12項之免疫原性組成物，其中該免疫原包括LHRH-白喉類毒素之共軛物。 14. 根據申請專利範圍第13項之免疫原性組成物，包括在5-500毫克的離子性多醣以及40-4000微克的免疫刺激性複合物中之5-500微克的LHRH-白喉類毒素共軛物。 15. —種醫藥組成物，包括根據申請專利範圍第Π至 14項中任一項之免疫刺激性組成物，以及一種或多種藥學上可接受的載體及/或稀釋劑。 16. 根據申請專利範圍第1至10項中任一項之佐劑組成物，其係用於製造用以在一動物中誘發一有效免疫反應之組成物。度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 x 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 訂：線申請日面案號類別 (以上各欄由本局填註）

A4 C4 533079 翁蜃專利説明書發明一、新型名稱中文含有離子性多醣及植物皂素之佐劑組成物及其用途英文 ADJUVANT COMPOSITIONS COMPRISING IONIC SACCHARIDES AND SAPONINS，AND USES THEREOF —發明一、創作姓名國籍住、居所約翰渥克澳大利亞澳大利亞，鮑溫3103,克萊漢姆街26號三、申請人姓名 (名稱）國籍住、居所 (事務所）代表人姓名 CSL有限公司澳大利亞澳大利亞，維多利亞省3052,派維市,派樂路45號彼得特維 _ί----- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐）裝訂線 533079 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍十（^b 1·一種佐劑組成物，其包括離子性多醣成份以及植物皂素成份，其中 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 該植物皂素成份是免疫刺激性複合物，且離子性多醣成份與免疫刺激性複合物成份之質量比例在50至300的範圍內。 2·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該離子性多醣是離子性葡聚糖。 3·根據申請專利範圍第2項之組成物，其中該離子性葡聚糖是乙二胺乙基-葡聚糖。 4·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該免疫刺激性的複合物是無蛋白質之免疫刺激複合物。 5.根據申請專利範圍第1項之組成物，其中該免疫刺激性的複合物包括Quil A、膽固醇以及磷脂類。 6·根據申請專利範圍第1項之組成物，其中離子性多醣成份與免疫刺激性複合物成份之質量比例，是在100到 140的範圍內。 7·根據申請專利範圍第6項之組成物，其中質量比例是大約125。 8·根據申請專利範圍第1項之組成物，包括大約10毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及大約80微克的免疫刺激複合物。 9.根據申請專利範圍第1項之組成物，包括大約100 毫克的乙二胺乙基-葡聚糖以及大約800微克的免疫刺激複合物。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐）