TW492978B - Peptide derivatives and their pharmaceutical composition - Google Patents

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492978 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明係有關某些新穎胜肽衍生物，其具有藥學上有用 的性質以用來治療自體免疫疾病或醫學病況，例如風濕性 關節炎和其他第II類MHC依賴性T-細胞媒介疾病。本發明 也包括該等新穎化合物的醫藥組合物，其製造方法，及其 治療一或多種上述疾病或醫學病況之用途及其在製造用於 彼等醫療的新顏醫藥品上之用途。 ' 人類免疫反應的刺激係依賴T細胞對蛋白質抗原的辨識。 不過，T細胞不能單獨對抗原反應且只有在其與在抗原提 出細胞，例如B細胞，巨噬細胞或樹枝狀細胞表面上的主 要組織相合性複合物（MHC)分子複合時才能被抗原所觸 發。 第I類MHC分子會謗出τ-殺手細胞反應，導致載有抗原 的細胞被破壞。第Π類MHC分子會謗發丁_助手細胞反應， 其可控制經選出的B細胞之擴大和成熟（亦即抗原·特定性 抗體的產生）和巨嗤細胞的活化。 免疫系統的一項重要要求爲區別，，自身”和，，非自身、亦 即，外來）抗原的能力。爲了使免疫系統對入侵的外來病原 發動反應同時維持對自身蛋白質的耐受性且藉此防止對正 常組織的傷害有需要這種區別能力。當自耐受性崩潰致使 免疫系統對自體組織反應例如風濕性關節炎中的關節時即 導致自體免疫疾病。一般認爲耐受性的維持因而避免自體 免疫疾病係與Μ H C分子的功能有關鍵性的相關性。 許多種自體免疫病都與特別的MHc對偶基因乏遺傳有關 聯之觀察結果推測出MHC分子在自體免疫病的疾病產生之

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1%--- 訂 #τ IV— ϋϋ .I - - — - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 五、發明説明（： 關鍵角色。例如多發性硬化係關聯到HlA-DR2的遺傳， 姨島素依賴性糖尿病係關聯於HLA-DR3及/或HLA-DR4 且橋本氏甲狀腺炎係關聯於H L A - D R 5。特別者，在慢性 炎性關節病風濕性關節炎發展的素因與HLA-DR4Dw4& /或HLA-DR4wl4及/或HLA-DR1的遺傳之間有特別強 烈的聯帶關係存在著。據認爲與自體免疫病相關 子係結合到某種自身·抗原並將彼等呈給T細胞因而刺激自 體免疫反應。可以結合到自體免疫相關性MHC分子及/或 可遏止或取代已結合的自體抗原及/或可抑制T細胞活化 (特別是病原性T細胞（如τ h 1細胞）的活性）及/或可增加保 護性T細胞（如Th2細胞）的活性之其他胜肽，或經由另外的 作用機構與MHC分子交互作用以遏止或修改經由該^111(： 为子媒介成的自體免疫反應之刺激的胜肽，也可以特定地 壓抑自體免疫反應。 此類藥劑可提供對自體免疫病的治療同時避開免疫系統 的一般壓抑，因而限制住有害的副作用。此種型態較目前 對疾病如風濕性關節炎的治療具有明顯的優點。現時治療 風濕性關節炎的作法是先用徵候舒減劑例如N s Α χ D s來治療 風濕性關節炎，此舉對於疾病進展不具任何有益影響且常 伴隨不良的副作用。更嚴重疾病的治療有賴於使用所謂的 第二線劑。這些藥劑常爲具一般細胞毒性之化合物，具有 有限的效煎且可能引起嚴重的毒性問題。所以有合理基礎 的疾病改變劑，且無相關的非特定性細胞毒性者，可以在 風濕性關節炎的治療中提供顯著的益處。 -5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） HIA m ml In n m ' mm HI In ml ϋϋ lari i^n 11 Γ - - —4— ϋϋ 1 m 1 m (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 ) 可結合MHC分子且抑制T-細胞活化之胜肽揭示於國際專 利申請公報第 WO 92/02543，WO 93/05011 和 W0 95/07707 之中。 雖然有許多胜肽已經發現可經由結合到HLA-QR分子而 抑制經HL A-DR限制的T細胞活化，不過對於可結合到彼 等分子及/或可遏止結合或取代已結合的自體抗原及/或 抑制T -細胞活化及/或增加保護性T ·細胞活性，或可經由 另外的作用機構與MHC分子交互作用以遏止或修改引起上 述疾病或病況的自體免疫反應之刺激之取代性化合物仍有 持績的需求存在。 我們已發現本發明胜肽衍生物（下文提出者）令人訝異地 具有彼等藥學有用性質而爲本發明的基礎。 根據本發明一部份，提出式I (後文示出）胜肽衍生物 其中 Ρ爲疏水性殘基；R 1爲具有5個L -胺基酸的序列且R3爲單 一L-胺基酸；或反1爲具有胺基酸的序列且尺3爲具有 3個L _胺基酸的序列； R2爲式ιι(後文示出）或m(後文示出）基其中Ra和此獨立 地爲選自氫和（1-4C)烷基之中者且A爲亞曱基（CH2)或 氧；且 R4爲OH，NH2或NRcRd其中Rc爲選自（1-4C)燒基，2 -胺 甲醯基環戊基，2·吡啶基甲基，4 -胺甲醯基環己基，4_胺 甲醯基環己基甲基，3_胺甲醯基苯基，4-胺甲醯基苯基， 4-(胺甲醯基甲基）苯基，4_(羧甲基）苯基，4气甲氧羰甲基） ____ - 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •14^. 、τ 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 苯基，2 -嗎啉基乙基及S_Ai_Gi基其中Αι爲（3_7C)伸烷 基或 A 1係選自下列之中者： (1) 式·Α2-Β2-基其中A2爲對-伸苯基或伸環己基且 爲（1_4C)伸院基或A2爲亞甲基且B2爲對-伸苯基 環己基；及 (2) 式- A、B3-C3-基其中A3爲亞甲基，B3爲對-伸苯基或 1，4 -伸環己基且C 3爲（1 - 3 C )伸烷基；且 G1爲式- N = C[N(rp)2]2基其中各即獨立地爲選自氫，甲 基，乙基和丙基之中者； 或A1爲式-A4-B4基其中A4爲對伸苯基且B4爲- CKO· 且G1爲2 -嗎啉基乙基或4·[2-(2 -羥基乙氧基）乙基]六氫吡 呼-1 -基； 且 爲氫或（1-4C)烷基；或 R爲1·：^氫峨ρ井基’ 4·甲基-1-六氫ρ比ρ井基，4 -脉基·ι·六 氫吡畊基，4-(2-(2·羥基乙氧基）·乙基六氫吡畊基， 1 -六氫吡啶基或4 -經取代 1 -六氫吡啶基其中該4 _取代基 係選自羧基，胺甲醯基，Ν-(2 -胺基乙基）胺甲醯基和Ν_ (4-胺基丁基）胺甲醯基之中者；或 R4爲具有1至6個胺基酸或其醯胺之序列； 或其醫藥可接受的鹽。 要了解者，R4所含胺基酸可獨立地具有或L -立體化 學。再者，在R4經定義爲羥基（ΟΗ)之情況中，要了解者 具爲R3C -端胺基酸的#基。類似者當R4被定義爲νη2， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） ---^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ---ii..... 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 、發明説明（5 、 ”氯峨P井基’六氫吡啶基等之時，其意指R3 C -端 胺基酸的《被彼等基所置換。此外也要了解者爲在指胺 基酸時其意指I胺基酸。另外要了解者爲在指稱l-胺基 酸時，其亦包括Gly，2’2二乙基Gly，氮雜丙胺酸和氮 雜-甘胺酸諸等不具掌性碳原子的胺基酸。再者要了解者爲 l用術例如;^基"在碳數允許時係包括直鏈和支鏈兩種 變體形式。 技藝中熟知者’具有掌性中心的化合物可能以外消旋物 有個以上的掌性中心之非鏡向異構物的混合物）或 万疋光性鏡像異構物或非鏡像異構物。此外也是技藝中熟知 者，與外消旋或非鏡像異構物混合物相關聯的特殊生物活 =可能大部份或唯一地源自單一旋光性異構物，所以要了 解者爲本發明係有關具有前述醫藥上有用性質的任何形式 之式I胜肽衍生物。如何得到單一旋光性異構物係技藝中熟 知者，例如從含有該異構物的外消旋性或非鏡像異構物混 合物中使用傳統技術，例如層析術分離出，或經由用恰當 的旋光性起始物或中間體，如本文所例舉者予以掌性合成 而得。如何測定彼等外消旋性或非鏡像異構物混合物，及 個別旋光性異構物所具藥學性質也是技藝中熟知者，例如 使用本文所述檢定。因此，諳於此技者能夠容易地得到本 文所指具有有利的藥學性質之式！胜肽衍生物的特殊異構 物。 此外也要了解者本發明也包括具有本文所述有利藥學性 貝的式I胜肽衍生物之任何多型態形式，任何互變異構物或 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-8- 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 任何溶劑合物，或其任何混合物。 構成R 1和R3的適當α -胺基酸獨立値包括，例如爲遺傳 密碼所編碼的2 0個自然發生之胺基酸，特別是丙胺酸 (Ala)，穀胺酸（Glu)，甘胺酸（Gly)，組胺酸（His)，異 白胺酸（lie)，離胺酸（LyS)，天冬胺醯胺（Asn)，穀胺醯 胺（Gin)，精胺酸（Arg)，蘇胺酸（Thr)，纈胺酸（Val)和 脯胺酸（Pro)。此外也爲適當者爲例如肌胺酸（Sar)， 3，3,3_三氟丙胺酸，2,2-二乙基甘胺酸，2,3-二胺基丙酸 (Dap) ’ 2,4·二胺基丁酸（Dab)，2_胺基丁酸（Abu)，高 精胺故’咼木丙胺故，反_4_邊基脯胺酸（Hyp)，氮雜丙胺 酸[H2N-N(CH3)-C00H ; Azala]，氮雜甘胺酸旧…· NH-COOH ; Azgly]，1，2,3,4·四氫異喹啉羧酸 (Tic)，八氫啕哚羧酸（〇ic)，十氫異喹啉羧酸（〇卜） 等胺基酸。（其中Die意指兩個環接合同具r組態或同具8組 態之形式）。也可以使用對應的N2 -甲基化胺基酸，以及對 應的其自由鏈羧酸官能被酯化（例如（丨- 6C)烷基酯或爷基 醋）或自由侧鏈胺基被燒基化（例如，甲基化），醯基化或轉 化成胺甲酸酯（如胺甲酸烷酯（如甲酯或乙酯），苯酯或苄酯） 之胺基酸。其他適當的Ri*R3値包括，例如，八經取代甘 胺酸其中的2-取代基爲式（CH2)SNH2基，式中8爲夏至3， 或式- (CH2)pN(Re)3 + .X_基其中p爲2至4且χ-爲相對離子 (例如乙酸根，三氟乙酸根，氫氧根或氯離子），或爲式 -(CH2)qN(Re)2 基其中 q 爲 〇 至 4 或式·(CH2) & C[N(Re)2]2基式中r爲1至4其中在最後三種基中每—尺^獨 Σ ,---衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 A7 B7 五、發明説明（7 ) 立地爲選自氫和（1-4C)烷基（例如甲基或乙基）之中者。 當R 1爲具有5個胺基酸的序列時一種重要的値爲，例 如，其第5個胺基酸（自左至右）爲Val或Thr之序列及其第 4和第 5個胺基酸爲 Lys-Val，Arg-Val，Lys-Thr，Arg-Thr，Ala-Val 或 Ala-Thr 之序列。 當R 1爲具有5個胺基酸的序列時，其一特殊値包括，例 如，Ala-Ala-Ala-Lys-Val，Ala-Lys-Ala-Ala-Val， Ala-Ala-Ala-Arg-Val，Ala-Arg-Ala-Ala-Val，Ala-Ly s-Ala-Ly s-Val 9 Ala-Arg-Ala-Arg-Val 9 Ala-Arg-Ala-Lys-Val ? Ala-Lys-Ala-Arg-Val ? Ile-Ala-Ala-Arg-Thr，Arg-Ala-Ala-Ala-Val，Arg-Ala-Ala-Ala-Thr ， Ala-Ala· Ala-Arg-Thr ， Ala-Arg-Ala-Arg-Thr ， Ala-Ile-Ala-Arg-Val ， Ala-Arg-Ala-His-Val，Ala-Arg-Ala-Ala-Thr，Ala_Ala-Asn-Arg-Val 或 X-Ala-Ala-Ala-Thr 其中 X 爲-NH.CH[CH2NH ( = N^L)·NH2]·CO(後文稱之爲”Gap”）或-NH·CH(CH2N = C[N(CH3)2]2).CO-(後文稱之爲”GapMe4)，其中較佳者 爲 Ala-Ala-Ala-Lys-Val ，Arg-Ala-Ala-Ala-Val ， Arg-Ala-Ala-Ala-Thr，Ala-Ala-Ala-Arg-Thr，Ala-Arg-Ala-Arg-Thr，Gap-Ala-Ala-Ala-Thr和 GapMe4-Ala-Ala-Ala-Thr。特另1J 較佳者爲 Arg-Ala-Ala-Ala-Val 和 Arg_Ala-Ala-Ala-Thr 〇 當R 1爲具有3個胺基酸的序列時，一特別重要的R 1値包 括，例如，鄰接R2的胺基酸爲Ala之序列及其中第二和第 _-10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210;297公釐） I--^---*--ΓI-^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) 二個胺基酸（自左至右）爲Lys_Ala，Arg-Ala，Ile-Ala和 A1 a - A1 a之序列。 當R 1爲具有三個胺基酸的序列時，一特別重要的R l値包 括，例如 Ala-Lys-Ala，Ala-Arg_Ala，Arg_Ala_Ala，

Arg-Ile-Ala 和 Ile-Arg-Ala，特別是 Ala-Arg-Ala。 當R3爲具有三個胺基酸的序列時，一特別重要的値包 括，例如，其第一胺基酸（自左至右，亦即，鄰接R2者）爲 A1 a或L e u的序列。 當R3爲具有三個胺基酸的序列時，其一較佳値包括，例 如，Ala-Ala-Ala , Leu-Arg-Ala，且特別者 AU_Arg-Ala。 當R3爲單一胺基酸時，其一較佳値包括，例如，A1 a， Gly 和 Azgly，尤其是 Ala。 當R a和R b爲烷基時，其特殊値包括，例如，甲基，乙基 和丙基0 較佳的R a和R b値包括，例如，氫和甲基。 疏水性殘基p的適當値（據了解者其係接到Wn-端胺基酸 的胺基者）包括，例如，有機疏水性基例如疏水性脂族，芳 族，雜芳族或混合脂族/芳族或脂族/雜芳族基，其具有 5至20個碳原子（及對於含雜芳基者，i，2或3個選自氧， 硫和氮之雜原子），例如式，R.CO·，R s〇 _， R.O.CO-，R.NHCO-，R 〇 CS_，R.S.CO·， R.NHCS- ’ R.S.CS-和 R.CS_ 基，其中 R 包括，例如（5_ 10C)烷基，芳基，雜芳基，芳基（2_10c)烷基，雜芳基 _______- 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4兵^ ( 2i〇x297公襲) ------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

492978 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（9 (2-10C)-燒基，二芳基（2-8C)烷基，芳基（2-10C)晞 基，芳基環丙基，（5-10C)環烷基，（5-10C)環烷基（2_ 6C)烷基，3 -聯苯基，4 -聯苯基，4 -環己基苯基，2 -莕氧 基甲基，3 -莕氧甲基，苯氧苯基和四氫莕基；芳基或雜芳 基’其中R値可载有一或多個（1—4C)燒基，鹵素基，氰基 或（1 - 4 C )烷氧基取代基者。本發明一特殊實施例包括，例 如式I中P爲上文所定義的R.C0-之胜肽衍生物。本發明另 一特殊實施例包括，例如，式I中p爲具有5至2 〇個碳原子 的疏水性脂族，芳族或脂族/芳族有機基之胜肽衍生物。 當R爲（5-10C)烷基時，特殊的r値包括，例如：戊基， 異戊基，第三戊基，2_甲基戊基，己基，異己基，5-甲基 己基和辛基；當其爲芳基時，包括：苯基，莕基和茚基； 當其爲雜芳基時，包括：2-，3·，5 -或6 -吲哚基，2_， 3 -，5-或6-巧哚啉基，2_，3 -，5_或6-苯幷[b]硫苯基， 嘧吩基，2_，4 -或5 -苯幷嘍唑基，2_，4 -或5·苯幷噁唑 基，2-，4-或5-苯幷咪唑基，接在，八，6_或7_位置的 1,4 -本幷一氣陸圜基及2_，3_，5 -或6 -苯幷吱喃基；當其 爲芳基（2-10C)烷基時，包括：芳基（2_6C)烷基（其芳基 邵份包括，例如，上文所給芳基的任何特殊値且其（2_6c) 烷基部份包括，例如，亞甲基，伸乙基，三亞甲基，四亞 甲基和五亞甲基）例如2_苯基乙基，3·苯基丙基，4•苯基 丁基和5-苯基戊基；當其爲雜芳基（2_1〇c)烷基時，包 括：雜芳基（2 - 6 C )烷基（其中的雜芳基部份包括，例如， 上文所給雜芳基的任何特定値且其（2_6(：)烷基部份包括， -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） mmaiw ml —ϋ I —ϋ ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 A7 B7 五、發明説明（10 ) 例如’亞甲基，伸乙基，三亞甲基，四亞甲基和五亞甲基） 例如2-(2-氰基苯幷[b]苯硫_5_基）乙基；當其爲二芳基 (2-8C)燒基時，包括：二芳基（2-6C)烷基例如2,2-二苯 基乙基’ 3，3_二苯基丙基和4,4 -二苯基丁基；當其爲芳基 (2_10C)·烯基時，包括：芳基（2_6C)烯基例如苯乙烯 基，3·苯基丙.烯_2_基和4 -苯基丁烯_卜基；當其爲芳基環 丙基時’包括：苯基環丙基，卜莕基環丙基和2-莕基環丙 基；當其爲（5-10C)環烷基時，包括：環戊基，環己基和 1-金剛燒基；且當其爲（5-10C)環烷基（2_6C)烷基時，包 括：2-(環己基）乙基，環己基）丙基和4·(環己基）丁 基。R所具芳基上的特殊取代基値包括，例如，甲基，乙 基，氯基，溴基，碘基，甲氧基，乙氧基和氰基。 疏水性殘基P也包括，例如，疏水性L _胺基酸，例如苯 丙胺酸（Phe)和其氫化類似物例如環己胺（cha)，對氯 Phe ’ 3_(2-ττ塞吩基）丙胺酸，路胺酸（Tyr)，Tyr(〇甲 基）’色胺酸（Trp)，聯苯基丙胺酸，3-(1-莕基）丙胺酸， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 3 _ (2 -莕基）丙胺酸和其氳化類似物，3 _ (i _金剛烷基）丙胺 酸（Ada)，Glu(〇芊基），3-(苄氧基）Ala，3-(苄硫烷 基）Ala和9-第基Gly，其各視情況可在N-端載有如上文所 定義或例舉的疏水性脂族，芳基，雜芳族或混合脂族/芳 族或脂族/雜芳族有機基。另外，該疏水性胺基酸可視情 況載有，例如選自下文對R1和R3所定義的任何値中之具有 1至3個胺基酸的序列。例如p包括下列特殊序列a 1 a _

Cha ’ Ala-Ala-Cha，Tyr_Ala-Ala-Cha，Tyr-Ala· __—-13-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（11 )

Ala-Phe，Ala-Phe-Phe-Phe 和 Ala-Ala-Ala-Phe。彼 等具有1至3個胺基酸的其他序列之第一個胺基酸（自左至 右）可爲L-或D_胺基酸且可視情況載有一個上文所定義或 例舉的疏水性脂族，芳族，雜芳族或混合脂族/芳基或脂 族/雜芳族有機基。 P的其他特妹値包括，例如，3 -(芊氧羰基）丙醯基-Phe ’ 3-(苄氧羰基）丙酸基-Cha，4·(爷氧窥基）丁醯基_ Phe ’ 4-(卞乳談基）-丁醯基_Cha，（5 -氧基-峨p各淀-2-基） 羰基_Phe-Tyr，（5_氧基-吡咯啶_2·基）羰基-Glu(0苄 基）_Tyr ，乙醯基-Glu(0芊基）_Tyr，二苯基甲 基.CONH.CH2CH2.CO_Cha ，二苯基甲基.CONH.CH2CH2· CO-Tyr，二苯基甲基.CONH.CH2CH2CH2.CO_Cha，二苯基 甲基.CONH.CH2CH2CH2.CO-Tyr，二苯基甲基.NHCO. CH2CH2CH2.CO-Cha ，二 苯基曱 基·NHCO.CH2CH2CH2.CO-Tyr，苄基.NHCO.CH2CH2.CO- 〇1&，苄基^11(：0.(：112(：112.(：0-1>1：，？^乙醯基_4-氯基-冷 -羥基 Phe，4-苯氧苯基.NHCO·，苄基.NHCO.CH2CH2.CO (N-曱基 Phe)，苄基.NHCO.CH2CH2.CONH.CH (CHPh2).CO，苄基.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr，3,3-二苯 基丙醯基，反-肉桂醯基，5-苯基戊醯基和3-(2-氰基苯幷 [b ]苯硫-5 -基）丙酸基。 特別重要的P値包括，例如，Ph.(CH2)4.CO-(5-苯基戊 醯基（Phv))，Ph.(CH2)4.CS-和 3-(2-氰基苯并[b]苯硫- 5 -基）丙酿基。 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ Γ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 A7 ___ B7 五、發明説明（12 ) 疏水性殘基P的較佳値包括，例如，3 _( 2 -氰基苯幷[b ] 苯硫-5 -基）丙醯基和5 -苯基戊醯基（p h v )，特別是後者。 當Rc爲式_ A 1 - G 1基時，A 1爲伸烷基的特別値包括，例 如，亞甲基，伸乙基，伸丙基和伸丁基；B 2爲（1 _ 4 C )伸烷 基的特別値包括，例如，亞甲基，伸乙基和伸丙基；且c 3 爲（1 - 3 C )伸烷基的特別値包括，例如，亞甲基，伸乙基和 伸丙基。 -A G的特別値包括，例如，3 -胍基丙基，4 - ( 2 -胍基 乙基）苯基，4_(2·嗎啉基乙基.NH.CO.CH2)苯基和4-(4-[2-(2-羥基乙氧基）乙基]六氫吡畊-1_基（：〇.(：：1_12)苯基。 當R4爲具有1至6個胺基酸或其醯胺的序列時，其特別値 包括，例如，具有獨立地選自上文所定義的Ri和R3之任何 値中的L-胺基酸序列（例如Ala_Thr-Gly_OH)，或其D-類 似物，或含有D -和L -兩種胺基酸或其醯胺之序列，例如， 衍生自氨，（1-4C)烷胺（如甲胺）或二（1_4C)烷胺（如二甲 胺）之醯胺。特別的R4値組合包括，例如本文對R4所定義 者中R4不是具有1至6個胺基酸的序列之値。 較佳的R4値包括，例如4 ·胺甲醯基_ 1 _六氫吡啶基（六氫 吡啶-4-羧醯胺（Pip-NH2)之殘基），4·羧基-1-六氫吡啶 基（六氫峨淀-4-羧酸（Pip-〇H)之殘基），4-(胺甲醯基甲基) 苯胺基（4-胺基苯乙醯胺（papa_NH2)的殘基，4气羧甲基） 苯胺基（4-胺基苯乙酸（papa_〇H)的殘基）和4-(2_胍基乙 基）苯胺基（2-(4•胺基苯基）乙基胍（Pape_ NHC( = NH)NH2)的殘基。 _________ ___________ -15 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X]97公羞) * -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 A7 ________ B7 五、發明説明（13 ) 特別的R 4値組合包括，例如，p i p - N Η 2，P a P a _ N H 2， PaPe-NHC( = NH)NH2和NHRC其中Rc爲弘胍基丙基，八 嗎啉基乙基或4 - (2 - ( 2 -羥基乙氧基）乙基· i _六氫吡p井基。 較佳的R2値包括，例如，式:^基，特別者式IU基且更特 別者式lib基。

較佳的式I胜肽衍生物組合包括，例如，其中R 1爲5個L _ 胺基酸的序列且R3爲單一 L -胺基酸，該等R1和R3序列具 有上文所足義的任何値’包括特殊和較佳的R 1和R 3値。於 此組合内，一特別較佳胜肽衍生物亞組包括，例如其中R2 爲式II基，特別是式Ila基且更特別者式IIb基者。另一特 別較佳的胜肽衍生物亞組包括，例如，式中R4爲_ p i P OH，-Pip_NH2，-Papa_OH 或。一特別較 佳的化合物亞組包括，例如式中R3與R4 一起爲Ala_ Pip.NH2 或 Ala-Papa-NH2 者。 另一較佳的本發明胜肽衍生物組合包括，例如，式中R 1 爲表成ΑΑ1-ΑΑ2-ΑΑ3·ΑΑ4·ΑΑ5的五個胺基酸序列者其 中： ΑΑ1 係選自 Ala ’ lie ’ Tyr ’ Val，Glu，Lys，Arg，

Gly，Gap，GapMe4和3,3,3_三氟丙胺酸，特別是Aia， lie，Arg，Gap 和 GapMe4，尤其是 Ala，Arg 和 GapMe4 且更特別者Ala和Arg之中者； AA2 係選自 Ala，Lys，Glu，Sar，Val，Arg，Gly， Pro，lie，Tic，3,3,3_三氟丙胺酸和n6·二乙基Lys，特 別是 Ala，Arg，lie，Lys 和 Tic，尤其是 Ala，Arg， ____ -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X 297公釐） ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

492978 A7 ______B7 五、發明説明（14 )

Lys和lie且更特別者Ala和Arg之中者； AA3 係選自 Ala ’ His，Gin，Val，Thr，Glu , Gly , Asp，A sn 和 N3-二乙基Dap，特別是 Ala，His，Asp 和 Asn，尤其是Ala和Asn且更特別者Ala之中者； AA4 係選自 Ala，Lys，Asn，Arg，Thr，Glu , Sar， Gly，Pro，His 和 N6·二乙基 Lys，特別是 Ala，Arg， Lys和His ’尤其是Ala，Arg和His且更特別者Ala之中 者;且 AA5 係選自 Thr，Val，Ala，Gly，Dap，Dab，Pro， Hyp，Asn 和 N3·二乙基 Dap，特另U 是 Thr，Val 和 Dap 且 尤其是Thr和Val之中者；且 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) R3爲單一 L -胺基酸，其係選自Ala，Gly，Dap，氮雜丙 胺酸和氮雜甘胺酸，特別是A1 a，G1 y和氮雜甘胺酸，尤其 是Ala和Gly且更特別者Ala之中者；且其中p，R2和R4具 有上文所定義的任何値，包括特別値和較佳値。於此組合 中有一特別的化合物亞組，其包括，例如，該序列A A 1 -AA2-AA3-AA4-AA5係選自下列之中者：Ala-Ala_Ala· Lys-Val ’ lie·Ala_Ala_Arg-Thr，Arg-Ala·Ala·Ala· Val ， Arg-Ala-Ala-Ala-Thr ， Ala· Ala· Ala-Arg_

Val ， Ala-Arg· Ala_ Arg-Val ， Ala-Ile-Ala-Arg- V a 1 ， A1 a _ A r g A1 a - H i s - V a 1 ， Ala-Ala-Asn-Arg-

Val ， Ala-Arg-Ala· Ala-Thr ， Ala-Arg-Ala-Arg-

Thr ^ Gap-Ala-Ala-Ala-Thr 9 GapMe4-Ala-Ala-Ala-Thr 和 Ala-Ala-Ala_Arg-Thr。較佳者爲式中 R4 爲 Pip- _- 17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（15 ) NH2，Papa-NH2 和 Pape-NHC( = NH)NH2 之化合物。 另一較佳的本發明胜肽衍生物組合包括，例如，式中R 1 爲表成AA1-AA2-AA3的3L_胺基酸序列者其中： AA1 係選自 Ala，lie，Tyr，Val，Glu，Lys，Arg， Gly，Gap，GapMe4和3,3,3·三氟丙胺酸，特別是Ala， lie，Arg，Gap 和 GapMe4，尤其是 Ala，Arg 和 GapMe4 且更特別者Ala和Arg之中者； AA2 係選自 Ala，Lys，Glu，Sar，Val，Arg，Gly， Pro，lie，Tic，3,3,3-三氟丙胺酸和n6-二乙基LyS，特 別是 Ala，Arg，lie，Lys 和 Tic，尤其是 Ala，Arg， Lys和lie且更特別者Ala和Arg之中者； AA3 係選自 Ala，His，Gin，Val，Thr，Glu，Gly， Asp，Asn 和 N3-二乙基Dap，特別是 Ala，His，Asp 和

Asn，尤其是Ala和Asn且更特別者Ala之中者；及 R3爲表成AA6-AA7-AA8的3L·胺基酸序列者，其中： ΑΑ6 係選自 Gly，Leu，Lys，Ala，Pro，Glu，Sar，

His和Dap，特別是Ala，Leu和Pro且尤其是Ala之中 者； AA7 係選自 Pro，Ala，Lys，Arg，Glu，Sar，Gly，

Oic和Die ;尤其是Ala和Arg之中者；且 AA8係選自Ala，Gly，Dap，氮雜丙胺酸和氮雜甘胺酸， 特別是Ala，Gly和氮雜甘胺酸且尤其是Ala之中者；且 P，R2和R4具有上文所定義的任何値，包括特別値和較佳 値。於此組合中，特別的化合物亞組包括，例如其中 ___18_ 1"本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（公釐） — --- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（16 AA1-AA2-AA3 序列係選自 Ala-Lys-Ala 和 Ala_Arg-Ala之中且AA6-AA7-AA8序列係選自Ala_Ala-Ala和

Ala_Arg-Ala之中者。較佳的化合物爲式中r4爲pip_ NH2，Papa-NH2 和 Pape-NHC( = NH)NH2 者。 本發明一較佳邵份包括式I胜肽衍生物，其中r 2爲式11基 (且尤其是其中A爲亞曱基），且更特別者式Hb基，且P， R ’ R3和R4具有上文所定義的任何値，包括特別値和較 佳値。 本發明另一較佳部份包括式I胜肽衍生物其中含有精胺酸 殘基者，特別是其中R1爲5 L-胺基酸序列時的第一胺基酸 殘基（自左至右）爲精胺酸（例如Arg_Ala-Ala_Ala-Val* Arg_Ala_Ala_Ala_Thr)的化合物及其中汉1爲3L_胺基酸 序列時的第二胺基酸殘基爲精胺酸及/或反3爲3L_胺基酸 時的第二胺基酸殘基爲精胺酸（例如當Rl爲Arg-Ala_Ala 且尺2爲人1&-八1&_八1&時或當尺1和&2兩者皆爲八1心八1^ Ala時）之化合物。 本發明的另一邵份包括式I胜肽衍生物，其中r 2爲式I ^ I a 或Illb基且p，R1，R3和R4具有上文所定義的任何値，包 括特別値和較佳値。 特別重要的本發明化合物包括，例如，後文所附諸實施 例中提出的特殊實施例。其中，實施例5，16，19，23和 24爲特別重要者且這些化合物或其醫藥可接受的鹽皆提出 作爲本發明的其他特項。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

492978 A7 B7 五、發明説明（17

Phv-Arg-A.a-Ala-A.a-Va.-N'，，，..V" V^A.a-N^cONH, 實施例5

Me2Nx NMe. 〕hv—N Η

Ν C〇Ala-Ala_Ala-Thr-N'，，，. Η

Ala - g -ch2c〇nh2 實施例1 6

Phy-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-N''^

N

Gly 二

NH >-NK N L H 實施例1 9 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Phv-Ala-Arg-Ala-j^j、、，，·’ II 〇 j-Ala-Arg-Ala$(^-CH2CONH2 實施例2 3 -20 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、發明説明（18 A7 B7

C〇~Ala~Arg-Ala-N、、，， Η Υ Ν、 Ν - Ala-Arg-Ala-N-^"~"V-CH2CONH2 Η Η >—f 實施何2 4 I I 卜---.----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 邊藥可接雙的鹽包括，例如，對於足夠鹼性的胜肽衍生 =、’如具有自由胺基者而言，與形成生理可接受陰離子的 斤形成的鹽，例如與礦酸如鹵化氫（例如氯化氫和溴化 氫），磺酸和膦酸所形成的鹽，及與有機酸如乙酸，草酸， 酒石酸，扁桃酸，對甲苯磺酸，甲烷磺酸；三氟乙酸等所 =成的鹽，且對於足夠酸性的胜肽衍生物例如具有自由羧 =基者而吕，包括與形成生理可接受的陽離子所形成的 1 ’例如與鹼金屬（如鈉和鉀），鹼土金屬（如鎂和鈣），鋁 和銨所形成的鹽，以及與適當有機驗如乙醇胺，甲胺，二 乙胺’異丙胺，三甲胺等所形成的鹽。 如上文所述者，式1胜肽衍生物，或其醫藥可接受的鹽在 溫血動物（包括人）中對於一範圍的自體免疫疾病或醫學狀 況具有有益的藥學效應可治療徵候或作爲疾病改變劑或作 爲預防治療。彼等疾病包括，例如，風濕性關節炎，多發 21 - 表纸張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇X297公釐） —ρβ - IL·........ trf 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 A7 ------------ -- B7 五、發明説明（19 ) 性硬化，Goodpasture氏徵候群，自發性血小板減少性紫癜 病，少年風濕性關節炎，腹腔病，系統性紅斑狼瘡，關節 黏連性脊椎炎，謝格連氏徵候群，重症肌無力，第丨型（胰 島素依賴性）糖尿病，橋本氏病，Grave氏病，阿狄孫氏 病，硬皮病，多肌炎，皮肌炎，尋常天疱瘡，大天疱瘡， 自fa免疫性溶血性貧血，惡性貧血，血管球性腎炎，移植 排斥等’尤其是風濕性關節炎和多發性硬化。 式I胜肽衍生物或其醫藥可接受鹽的效用可用多種標準檢 驗和臨床研究予以評估，包括在國際專利申請公報第w〇 92/02543，W0 93/05011 和 W0 95/07707 中所述者（或其改 變方式1及下文所述者。式I胜肽衍生物在一或多種彼等檢 驗或研究中顯示出明顯的活性。 途驗A :純化H L A _ D R胜肽活體外（in vitro )結合檢定。（此 檢定可以用來展現出式I胜肽衍生物對疾病相關性第π類 MHC分子的結合）將3 0微升，800 ηΜ生物素-FHA3〇7_32〇 (FHA (307 - 320)肽，在Ν·端用長鏈生物素衍化過者，生 物素- Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala_Thr-Gly_OH)/攝酸鹽緩衝溶液（pbs)與 30微升濃度在0.5與5微克/毫升之間的經純化HLA-DR4Dw4置於V -洞微滴板（Nunc)中於有或無抑制劑胜肽 之下溫置4 8小時。於溫置期結束時將100微升溫置液轉移 到 Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay (ELISA)板 (Nunc)，該板經預先用濃度爲10微克/毫升的抗-MHC抗 體（L243-American Type Culture Collection (ATCC) HB_55_ ___-22-____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇X 297公釐1 ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

492978 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 如 Lampson and Levy (1980) J· Immunol· 125, 293-299 中所述 者）在室溫下塗被1小時後用l〇/〇牛血清白蛋白（BSA)/PBS 和0.05% Tween 20封阻1小時。於1小時後，洗掉未結合的 胜肽並在室溫下加入1 / 4,000稀釋倍數的鏈抗生物素蛋白 過氧化酶（Sigma) / PBS和0.01%適當清潔劑例如NP-4 0 ( Sigma )溶液2小時。經再洗條之後，於每一板中加入四 甲基聯苯胺（TMB)受質溶液（1 TMB錠（Sigma) / 1 〇毫升 0.1M檸檬酸/乙酸鹽緩衝液，pH 6.0，其中含36微升氫過 氧化月尿（UHPO) ( Fluka))。經由添加2M硫酸（10微升/洞） 停止反應並在450 nm讀其吸光率以測定結合胜肽的量。經 由將吸光率對濃度標繪而得胜肽的抑制活性。 經純化的H L A - D R 4 D w 4可依下述而得到：· (i) H L A - D R在巴氏病毒系統中的表现 重組蛋白質在昆蟲細胞内從巴氏病毒媒體的表現爲一種 已確立的得到高產率重組蛋白質之程序[Luek〇w, VA &

Summers’ MD，1988’ Biotechnology，t 47-551 ]。爲 了促成 雜二體物HLA-DR，例如HLA-DR4Dw4，從單一重組巴 氏病毒媒體（vector)的表現（相對於對“和冷鏈各具不同重 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 —•I U— n —0.1-- 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 組病毒後進行共感染者），乃構成同時載有從和卢兩鏈之雙 -重組巴氏病毒。 將編碼以多肽序列的cDNA選殖在轉移媒體pacYMi内 [Matsuura, Y; Possee, RD; Overton, HA & Bishop, DHL, 1987, J· Gen. Virol•，赵，1233 _ 1250]以將蛋白質的表現置 於多邊（polyheddn)啓動基因的控制之下。經由在％21昆蟲 -23- 492978 A7 B7 五、發明説明（21 ) 細胞内的同系重組將該單位插置到巴氏病毒基因組内造成 對α鏈的單一重組巴氏病毒。昆蟲細胞的培養和感染，同 系重組和重組病毒的偵檢/分離所用的技術係Summers， MDD & Smith GE (1987) [A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures; Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin No. 1555 ]所 完整地説明過者。構成重組媒體所用的分子遺傳技術同樣 地易於得自文獻且爲 Sambrook，J; Fritsch，EF & Maniatis T， (1989) [Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press]所最完整地説明過 者。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 要造成雙重組巴氏病毒時，係將編碼鏈的cDNA選殖 在轉移媒體pAcUWl [Weyer，U; Knight，S & Possee, RD， 1990, J. Gen. Virol.，71，1525-1534]之内以將蛋白質的表現 置於P 1 0啓動基因的控制之下。然後將該單位插置到載有 α鏈的單一重組巴氏病毒的基因組内。經由將用從轉染中 無規取出的病毒感染過的昆蟲細胞點置於膜上並使其與可 特定地辨識HLA-DR雜二體物的單株抗體，如L243反應。 使用可從文獻中易得之標準流動細胞計量技術偵檢該抗體 對Sf21昆蟲細胞之結合。將可表現HLA-DR的安定雙-重 組巴氏病毒斑點純化。

(ϋ) 從昆蟲細胞純化H L A · D R

所用方法爲 Gorga et al 1987 所述者（Gorga et al 1987, J· Biol.Chem.262，16087_16094)之修改法。將表現HLA __-24·_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇x 297公釐） 492978 A7 ___ B7 五、發明説明（22 ) D R的巴氏病毒/ S f 2 1細胞（1 〇 L約等於2 X 1 0 1 0細胞）經由 用鐵氟龍（teflon)玻璃勻化器勻化十次而溶解化在1〇〇毫升 的 5 nM EDTA(納鹽），50 mM Tris-HCl pH 8.5，2% NP40， 150 mM NaCl，1 mM 硪乙醯胺，1 mM PMSF 之中。以 100,000 g離心該勻化物1小時後，收集上澄液。將以50毫 克 L243 對 10¾ 升 Piotein A Sepharose fast flow (Pharmacia) 的比例共價偶合過且預先與10 mM Tris-HCl，pH 8.0， 0.1% NP-40溫置過的抗— HLA-DR單株抗體LB3. l(Gorga et al 1986，Cell Immunol· 103，160-172)與該上澄液一起溫 置隔夜。然後將該樹脂置於一管柱内並用l〇 mM Τιis-HC1，pH 8·0，0.1% NP-40(20 管柱體積）接著用 〇.15M NaC 卜 50 nM Na2HP04，pH 7.0 1%辛基葡萄糖甞（2 0 管 柱體積）洗過。用50mM二乙胺pH11.0，0.l5MNaCl， l°/〇辛基葡萄糖嘗洗提出HLA-DR。立即用1M Tris-HCl pH 8·0中和管柱洗提份並超離心通過centricon_ 10膜予以濃 縮。用BCA蛋白質檢定法（Pierce)測定蛋白質含量及用 SDA-PAGE電泳法測定其純度。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一般而言，上文所定義的式I胜肽衍生物在檢驗A中檢驗 時可在約10 A Μ或遠較爲低的濃度下顯示出明顯的抑制作 用。 本發明的另一較佳部份包括不結合到H L A - D R 3但結合 到 HLA-DR1 及 / 或 HLA-DR4Dw4 及 / 或 Hla_ DR4Dw14的式I胜肽衍生物或其醫藥可接受的鹽。hLA-DR3爲和風濕性關節炎不相關的共同HLA-DR對偶基因。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ' 4^2978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（23 ) 因此’對載有HLA-DR3作爲其對偶基因中的一個之風濕 性關節炎患者（約爲全部風濕性關節炎患者的三分之一）體 内，這種式I胜肽衍生物不會干擾HLA-DR3在宿主防衛功 能中的正常角色。因此，這種胜肽衍生物的使用對於治療 風濕性關節炎患者特別有利，其可以比非選擇性D R結合物 導致較低的免疫壓抑作用。 作爲檢驗A的變化形式者，本發明胜肽結合一或多種 HLA-DR分子的能力也可依下述予以評估： (i) 從細胞系純化H L A - D R型

所用方法爲 Gorga et al 1987, J. Biol. Chem. 262, 16087 -16094所述者之修改法。用免疫親和層析術從各種細胞系純 化出人類HLA-DR抗原。簡而言之，將選自Hom2 ( D R 1來 源），BBF(DR2 源），AVL-B (DR3 源），JAH (DR4Dw4 源），JHAF (DR4Dwl3 源）或 PE117 (DR4Dwl4 源） 的恰當細胞系之1 X 1 〇 9 - 5 X 1 〇 9經沉積細胞經由用鐵氟龍 玻璃勻化器在約4 C下勻化1 〇次而溶解化5 0毫升的5 mM EDTA(鈉鹽），50 mM Tris-HCL pH 7.4，2% NP40，150 mM NaC卜ImM碘乙醯胺，l mM PMSF之中。以l〇,〇〇〇 g 將勻化物離心1小時並收集上澄液。將經共價地偶合到 CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia)的抗-HLA-DR 單株抗體 LB3.1(Gorga et al 1986，Cell Immunol·，103，160-173)與 150 mM Na(H，50 mM Tris-HCL，pH 7·4，0.1% NP-40 預 平衡過並與該上澄液溫置整個晚上。然後將該樹脂填充在 管柱内並用 0.15 M NaCl，50 mM Tris-HCL，pH 7.4，1% -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 492978 A7 B7 五、發明説明（24 ) 辛基葡萄糖甞（20管柱體積）洗。用50 mM二乙胺pH 11.0， 〇·15Μ NaCl，1%辛基葡萄糖甞洗提出HLA-DR。立即用 〇·5 M HEPES NaOH pH 7.4中和管柱洗提份。以Biorad蛋白 鹽檢定劑測定蛋白質含量及用SDS-PAGE電泳法測定純 度。 (Π) 胜肽選擇性結合檢定 將200 nM生物素-FHA3〇7_32〇/磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS) 與純化的 HLA-DR1，DR2，DR4Dw4，DR4Dwl3 或 DR4Dwl4任一者（2-20微克/毫升）在V·洞微滴板（Nunc) 中於有或無抑制劑胜肽/檢定緩衝液（PBS，0.01% NP40 (Sigma))存在下溫浸。對於DR3抑制，係用400 nM的生物 素 _Ahx(D)Ala·Ala·Ala_CheIleAla·Ala-AlaThr LeU-LysAlaAla-(D)Ala-OH與純化 DR3(20微克/ 毫 升）溫浸在一起，並依上述溫浸。4 8小時後，依檢驗A中所 述處理溫浸物及測取吸收率讀値。使用Microcal Origin軟 體在PC上計算表爲IC 5G値的胜肽抑制活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 檢驗B :活體_外T細胞活化之抑制。（此檢定可以用來證明 式I胜肽衍生物抑制由或經由第11類Μ H C分子所促成的T細 胞免疫反應之能力）。 檢驗抑制劑胜肽所具對於會對F Η Α 3 〇 7 _ 3 2 〇胜肽（Η - P r 〇 -Lys_Tyr_Val_Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-ΟΗ)反應的B52.24鼠T細胞雜合瘤系被HLA-DR4Dw4分子所刺激之封阻能力。B52.24係經由用取自 經FHA307-320免疫化過的HLA-DR4Dw4轉入外來基因小 _ _-27-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 492978 A7 :______B7_ 五、發明説明（25 ) 鼠的淋巴節T細胞（國際專利申請公報第W0 95/0333 1號）與 BW5147 鼠 T 細胞淋巴瘤系（White et al (1989) J. Immun〇l· 143，1822)依 Woods et al (1994) J· Exp· Med. 180，173-181 中所概述者予以融合並接著用Current Protocols in Immunology，Volume 2，7.21中所給的產生τ細胞雜合瘤之 通用方法而產.生的。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將濃度介於100與0· 1 " Μ (或較低者）之間的抑制劑胜肽 與經由稀釋在RPM 1 - 1640培養基（Gibco)中所得濃度在100 至〇·1 之間或固定的ίο "μ濃度之抗原胜肽FHA3 0 7 _32() 一起在96·洞微滴板（Nunc)中混合，其最後體積爲1〇〇微 升’將表現H L A _ D R 4 D w 4的B細胞例如經JAH EBV轉型 的類淋巴母細胞細系（European Culture Collection ECACC 85 102909)或取自個別的和經Epsten Barr病毒根據Current Protocols in Immunology 7.22.1 所述方法轉型過的111^人-D R 4 D w 4同種接合子之B細胞經由以4 X 1 0 6細胞/毫升懸 浮在1 %戊二醛（Sigma)中3 0秒使其被戊二醛固定後，加入 等體積的200 mM離胺酸（Sigma)三分鐘。以300 g離子回收 細胞，在RPMI-1640中洗滌並以2 X 105細胞/洞之濃度加 到裝著抗原和抑制劑化合物之微滴板内。將微滴板溫浸於 3 7 °C和5 % C Ο 2下2小時。 然後經由以兩次的300 g離心和抽動在RPMI· 1640中洗該 微滴板，再加入濃度爲1 〇 5細胞/洞的B 5 2 · 2 4 T細胞雜合 瘤系/培養基（RPMI-1640，10%胎牛血清（Gibco)和2 mM 穀胺醯胺（Gibco))。之後將微滴板溫浸於3 7 °C和5 % C Ο 2下 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 492978 A7 B7 _ 五、發明説明（26 ) 兩天。之後將該板以300 g離心1 〇分鐘並從所有洞中取出 150微升上澄液，於-2 0°C下冷凍到生物檢定IL-2含量爲 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將要檢定的裝著上澄液之培養板置於室溫下解凍後，將 100毫升上澄液轉移到新的96圓底洞板中。用培養基 (RPMI-1640 (Gibco)，10% 胎牛血清（Advanced Protein Products)，100微克/毫升鏈黴素和100 U /毫升青黴素 (Gibco)，2 mM L -穀胺醯胺（Gibco)和50 // Μ 2 _氫硫基乙 醇（Sigma)進行IL-2的1 : 1系列稀釋以製成250單位/毫升 到最後0.04單位/毫升IL-2之標準曲線。收取IL-2依賴性 細胞系例如 CTLL-2 細胞（Nature (1977) 268 154-156)或 HT-2 細胞（J. Immunol. Methods (1987) 94· 104)並用培養基洗兩 次後’以5 X 1 〇 4細胞/毫升濃度再懸浮。於標準曲線和檢 驗樣品的每一洞中加入1 〇〇微升IL - 2依賴性細胞懸浮液。 將培養板溫浸在3 7 °C和5 % C Ο 2下7 2小時。其後，於每一 洞中加入20似：升（lmCi)的3H·胸腺核芬（Amersham International)並將板送回保溫箱再溫浸1 6小時。將每一板 的内容物收取在玻璃纖維濾片上並用卢板閃爍計數器測量 放射性。 一般而言，上文定義的式I胜肽衍生物在檢驗B中檢驗 時，於約1 0 # Μ或遠較爲低的濃度下顯示出明顯的抑制作 用。 檢驗C :在B ALB / c小鼠體内的經胜肽刺激之D Τ Η (延遲 型過敏性）。（此檢定可用來證明式I胜肽衍生物在動物模型 _ -29^_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4%^( 210X297^^)--- 492978 A7 ____B7_ 五、發明説明（27 ) 中的活體内活性）。將每組5隻的Balb/c雌小鼠（1 8 · 2 0乞） 經由用0.1毫升，以卵清蛋白（Sigma) (2毫克/毫升食鹽水 中）與完全Freunds氏佐劑（Sigma)l : l(v/v)混合成的乳液 在腰窩經皮下注射予·以免疫化。七天後用雙彎腳測微計測 定腳趾厚度，接著用3 0微升1 〇/〇熱凝集卵清蛋白/食鹽水 經足底下注射而在一後腳趾中刺激。在抗原刺激24小時 後，測量腳趾並將DTH反應計算成有注射的腳趾相對於其 對側腳趾對照的腳趾厚度增加百分比。用在抗原刺激24小 時前植入的3 -天滲透小型泵（Alzet)以10毫克/公斤/天至 〇· 1微克/公斤/天之劑量給入抑制劑。從給入媒液的對照 樣之腳趾腫脹値減去經抑制劑處理所得値所得差値除以對 照値再乘以10 0 %而計算出抑制度。 一般而言，上文所定義的式I胜肽衍生物在檢驗C中檢驗 時於約1毫克/公斤/天或遠較爲低的劑量下顯示出明顯 的抑制’而無任何顯然的毒性或其他不適當的藥學效應。 檢‘驗D :(此檢定可以用來證明式I胜肽衍生物在關節炎動 物模型中的活體内活性） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 用0.1毫升含有等體積的2亳克/毫升甲基化牛血清白蛋 白（met_BSA，Sigma)/食鹽水和增補2 5克/毫升分枝桿 菌(Mycobacterium tudercologic) (MTB, C，DT 和 PN 株， MAFF，Weybddge，Surrey)因而得到3 5毫克/毫升最後 MTB濃度的完全Freund氏佐劑（Sigma)之乳液皮下注射而 將Balb/c雌小鼠（19-21克，5_10隻/組）在第〇日免疫化 及在第7天予以加強。同時另外給予〇 1毫升丨.p注射1 〇 9百 -丨· " 1 —______- 30 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) ( 210^297^¾ ) ---- 492978 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（28 ) 曰咳博德特氏菌(Bordetella aertussis)生物體（Wellcome PmUSS1S疫田）。十四天之後，用1〇微升含有100微克met· BSA/食鹽水經由以3〇G注射針和哈彌爾頓注射筒關節内 /王射在動物一膝關節予以刺激。對側膝則用相似體積的食 鹽水注射並用爲對照樣。13天後經由使用雙彎曲測微計測 里兩膝的發炎/腫脹程度。其係經由用鈍端剪刀和鑷子剪 入膝4上方和F方約5毫米的皮膚内且沿著膝側繼續剪下 形成皮片，之後將其小心地切掉以暴露出下面的關節。對 膝在水平面中’維持在固定位置的彎曲肢上，跨越最寬的 部份進行測量。根據公式：[注射抗原的膝厚度_注射食鹽 水的膝厚度/注射食鹽水的膝厚度]χ 1〇〇計算注射抗原的 膝相對於對照樣的發炎增加百分率。對抗原刺激24小時前 用植入的14天滲透小型泵（Alzet)以1〇毫克/公斤/天至 〇 · 1彳政克/公斤/天的劑量給用抑制劑。從厚度測量經由自 、七入媒液的對照樣所得腫脹値減除經抑制劑處理組所得 値，除以對照値再乘以100而計算出發炎/腫脹百分抑制 率。其他的疾病評估包括i)在用蘇木素和曙紅染色過的固 足膝段進行發炎，滑膜炎和軟骨/骨腐損之組織學評估及 2 )在血清，血清殿粉狀蛋白p及/或結合球蛋白中的緊急 相反應物水平之測定。 上文所定義的式I胜肽衍生物在檢驗D中可於約i毫克/ 公斤/天或遠較爲低的劑量下顯示出明顯的抑制作用。 經由闡示特殊式Ϊ胜肽衍生物的藥學活性之下，實施例 5 ’ 1 6和2 3的化合物都在檢驗A中以<〇· 1微莫耳濃度的濃 31 - 本紙張尺度適用宁國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T IT. 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（29 ) 度顯示出對HLA-DR4Dw4的明顯結合，且在檢驗C中於 之0.1毫克/公斤/天的劑量下具有活性。這些化合物在 pH3和pH 7.6顯示出良好的水中安定性且在擠壓聚合物儲 存調配物形式中，顯示出極小的因擠壓降解所致損失及從 彼等儲存調配物釋出時的最小降解情形。於檢驗A的變化 形式中，實施例23化合物對HLA-DR1，HLA-DR2， HLA-DR4Dw4和HLA-DR4Dwl4顯示出明顯的結合但不 會明顯地結合到111^八-0113(1(：5〇>100微莫耳濃度）。 式I胜肽衍生物可以用能夠用於類似胜肽的合成且在胜肽 化學技藝中熟知的任何方法予以製備。 式I胜肽衍生物可以經由，例如類似下列所揭示的程序予 以製得："Solid Phase Peptide Synthesis : A practical approach” by Atherton and Sheppard (published by IRL press at Oxford University Press, 1989) o "Solid Phase Peptide Synthesis” by Stewart and Young (published by the Pierce Chemical Company，Illinois，1984)， ” Principles of Peptide

Synthesis”（ published by Springer-Verlag，Berlin，（ 1984)， 和一系列的書’’Amino Acids，Peptides and Proteins”（ volume 1-25 ; volume 25 係在 1994 年發行）（由 the Royal Society of Chemistry，Cambridge，UK 所發行）。 較佳者，式I胜肽衍生物係用固相逐次合成予以製備。使 用這種技術時，要將變成胜肽L端胺基酸的胺基酸所具以 胺基及必要時，其側鏈胺基保護住並偶合到一固體載體， 例如樹脂，如2 -氯三苯曱基氯化物樹脂或Merrifield樹脂 __-32-___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I I ,---Γ----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 492978 A7 _________B7_ 五、發明説明（3〇 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (氣甲基聚苯乙烯-二乙烯基苯）（若在切、斷後需要自由羧酸 時），或Rink Amide樹脂（4-(2，，4，·二甲氧基苯基-Fmoc·胺 基甲基）-苯氧基樹脂）或Rink Amide MBHA樹脂（N-(4-(2’，4、二甲氧基苯基-171110(：_胺基甲基）_苯氧基乙醯胺基_ 正白胺醯基）·4·甲基二苯甲胺樹脂）（皆可得自Calbiochem· Novabiochem).(若在切斷後需要羧醯胺時），之後，將從-胺 基上的保漢基脱除掉。要接到-端胺基酸上的胺基酸係在 泛-胺基上及必要時在側鏈胺基上保護後，偶合到保持接在 固體擔體上的C ·端胺基酸。重複“-胺基的去保護和偶合 劑到下一胺基酸之逐步程序而得接在固體擔體上的經保護 或不經保護之多肽。式Π或丨:^的化2基係經由使用經恰當保 護住的（3_胺基·2 -氧基-峨洛淀-1-基）燒酸（用於含有II中 Α=亞甲基的胜肽衍生物）或對應的依乙Med Chem ι993, 256-263中所示製得之氧雜類似物或與其類似者（用於含 有式II中A爲氧的胜肽衍生物）或（6_氧基-丨，7_二氮雜螺 [4 · 4 ]壬-7 ·基）烷酸（用於含π I的胜肽衍生物）取代經保護 的胺基酸而掺加到序列中。經由標準程序，例如使用三氟 乙酸，三乙基矽烷和水的混合物經保護或未經保護的多肽 k固fa擔體上釋出來。要了解者，側鍵保護基可在將胜肤 攸固粗擔體上釋出所用條件下切開，或可在肤從固體擔體 上釋出之前或之後以個別步驟方式切開。也可了解者組成 多肽的程序可以修改成在一特殊偶合步驟中使用兩個或更 多個經適當保護住的胺基酸序列。該合成可以使用人工技 術或採用例如，Applied Biosystems 43 1A或430A肽合成 __ _ 33 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " --- 492978 A7 一 —_ B7 ______ 五、發明説明（31 ) 器，Advanced Chemtech ACT 357肽合成器或類似的自動胜 肽合成器自動地進行，或者也可以使用兩種技術的組合。 於肽的組裝中，不參與反應的胺基酸官能基係用各種官 能基予以保護住。例如，N -端和側鏈胺基可用9 ·氟基-甲 氧羰基（Fmoc)，第三丁氧羰基（Boc)，聯苯基異丙氧羰基 (Bpoc)，2-[3.，5-二甲氧基苯基]丙基-2-氧羰基（Ddz)，金 鋼烷氧羰基（Adoc)，烯丙氧羰基（Aloe)，2,2,2-三氯乙氧 羰基（Troc)，苄氧羰基和各種經取代苄氧羰基予以保護。 於需要時，這些保護基可用標準技術切除（例如，酸或鹼處 理，催化性氫解和P d ( 0 )處理或鋅/乙酸處理）。 用來保護含精胺酸殘基的胜肽中所含側鏈胍基之適當保 護基包括硝基，金剛烷氧羰基，4 -甲氧基-2,3,6_三甲基 冬盛基（Mtr) ’ 2,2,5,758-五甲基咬-6_確酿基（卩111。）和 (特別者）2,2,4,6,7_五曱基二氫苯幷呋喃_5-磺醯基 (Pbf)。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 用來保護側鏈羥基的適當保護基包括第三丁基，苄基和 二表甲基（T r t)。用來保護含有組胺酸殘基的肤中所含侧鍵 咪唑基之適當保護基包括三苯甲基，苄基，甲苯續醯基， 一硝基苯基’ Adoc ’ B 〇 c或Fmoc基。 用來保護侧鏈羧基的適當保護基包括各種酯（如，甲酯， 乙酯，第三丁酯，苄酯，硝基苄酯，烯丙酯和9 _苐基甲 酯）。 保護基切除反應可在4 °C至4 0 °C範圍内的溫度下實施（較 佳者在或在約周溫下實施）且其時間爲1〇分至24小時。 ―― ____-34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（32 ) 將個別胺基酸偶合所用的適當偶合方法包括常用的疊氮 化物，對稱酐，混合酐和各種活性酯與碳化二醯亞胺。於 各種碳化二醯亞胺的情況中（例如，二環己基·或二異丙基_ 碳化一酿亞胺），也可以加入多種添加劑（如1 _經基苯幷二 峻（HOBT)和N-羥基丁二醯亞胺）。此外，也可以使用多種 其他的藥劑來達到胺基酸偶合’例如六氟瑪酸1 Η ·苯幷三 唑-1-基氧基三吡咯啶基鳞（PyBOP)，四氟硼酸（2_(1η_ 苯幷三唑·1·基）-1，1，3,3·四甲基脲鹽（TBTU)和四氟硼酸 (2-(111_苯幷三峻-1_基）-ΐ，ι,3,3·四甲基脲鹽（HBTU)。 偶合反應可在-20 t至40 °C範圍内的溫度下及10分鐘至24 小時範圍内的時間内進行。進行偶合反應所用的適當介質 包括，例如，N，N -二甲基甲醯胺（D M F )。一種特別適當 的方法包括使用HBTU，Η0ΒΤ和二異丙基乙胺在DMF中 進行。 這些和其他的胜肽合成方法皆在本文所引諸國際專利申 請案中例舉説明説。爲式R-，R CO·，R S〇2_， R.0.C0-，R.NHC0-，R.o.cs-，R.S.C0-， R.NHCS-，R.S.CS-和R.CS-基的疏水性殘基P(或在P爲 疏水性胺基酸或載有更多胺基酸的疏水性胺基酸時，成爲 在P末端胺基上的取代基之彼等基）可以經由，例如作爲最 後步驟以烷基化，醯基化或末端胺基的其他標準官能基改 質（例如在胜肽從擔體上釋出之前或之後）而掺入。在需要 C -端改質（以得到特殊的R4値）時，彼等可在肽合成後，經 由傳統官能基改質或恰當選用起始樹脂或最先偶合到樹脂 I—·---·----^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Γ.

492978 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（33 的經保護個體I進行（例如、經由使用式“-Η的適當保護 基）式1胜肽仿生物製備的典型例子在後文實施例中提 測里本發明胜肽衍生物所具安定性所用的典型程序如下 所述’其中’爲❹微生物污染和降解，用來製備胜肽溶 ^的所有設備都在熱壓器内滅菌過且所有的物質轉移都在 第II類層流櫥内進行。用無菌0.22微米過濾單元和2〇毫升 /王射筒將約2 0晕升含有〇 〇2 %疊氮化鈉的McIlvaine氏擰檬 酸_磷酸鹽緩衝溶液pH3或7·6過濾到5〇毫升瓶子内。將約 1.2¾克胜肽正確地稱取在一有蓋管瓶内。用無菌吸量管尖 和足里緩衝液加到管瓶内的胜肽以得到〇 1毫克/毫升的胜 肽濃度。將管瓶蓋好並搖盪以溶解該胜肽。用無菌吸量管 尖’將約1毫升胜肽溶液份液轉移到i 〇個Η P L C管瓶内 後’將管瓶蓋好。各5支管瓶分別貯存在_丨8和3 7 。在貯 存於-1 8和3 7 X：的初始和1，2，3與4星期後用恰當的標準 品以Η P L C測定溶液的胜肽尖峰面積，每一時間取用新管 瓶且雙重樣品注射。在3 7 貯存到每一時點後殘留胜肽的 百分比係從每一時點的胜肽尖峰面積對初始面積的比例來 測定的。本發明較佳胜肽衍生物在3 7°C，ρΗ3和7.6貯存後 具有大於90%，且較佳者大於95%的殘留胜肽。 式I胜肽衍生物通常是以如醫藥技術熟知的醫藥組合物形 式基於治療或預防目的給需要彼種治療的溫血動物（包括人) 服用。 根據本發明另一特項提出一種醫藥組合物，其包括式I胜 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ---.---*----罾衣 II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 厶y丨ο五、發明説明（34 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 肽衍生物 劑或載劑 物可馬通合口服的形式，例如錠劑，膠囊劑，水 性^由性落液，懸浮液或乳液；供鼻用之形式，例如 二藥丘鼻噴務劑或鼻滴劑；供陰道或直腸用之形式，如拴 藥’仪吸入給藥用之形式，例如細分粉或液體氣溶膠；供 舌下或頰使用之形 <，例如錠劑或膠囊劑；或供非經腸使 (匕括靜脈内’皮下’肌肉内，血管内或注輸），例如無 菌水性或油性溶液或懸浮液。該組合物可爲適合局部給藥 、>式例如乳霄，軟骨和凝膠。此外也包括皮膚貼片。 其肩配係概括地載於 c〇mprehensive Medicinal Chemistw me 5, Editor Hansch et al·，Pergamon Press 1990 的第 2 5 · 2章中。 一般而言，上述組合物可用慣用的賦形劑以習用方式製 備成。不過，於供口服給藥的組合物之情況中，可以方便 地讓組合物具有一塗層以保護多肽活性成份對抗胃中的酵 素作用。 本發明一較佳組合物爲以單位劑形適合供口服給藥者， 例如含有2.5至500毫克，且較佳者1 〇至1〇〇毫克多肽/單 位劑形之錠劑或膠囊劑，或爲每毫升溶液含有〇.5至10〇亳 克多肤’較佳者每宅升含1至1 〇毫克多肤，適合非經腸給藥者。 非經腸組合物較佳者爲在等張食鹽水或等張葡萄糖溶液 其必要時經緩衝到p Η 5至9中之溶液。另外，該非經腸組合 或其醫藥可接受鹽，組合著醫藥可接受的稀 37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} LT . -訂· 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（35 ) 物可爲經設計供緩慢釋出者，於此情況中，每單位劑量中 的多肽含量通常大於採用傳統可注射方劑時所需量。一種 較佳的缓慢釋出型調配物的連續釋出型調配物，例如，歐 洲專利申請第58481號中所述類型的調配物或，對於含有至 少一個鹼基的式I胜肽而言，爲國際專利申請公報第w〇 93/24150號中所述調配物，該等專利申請案皆併於本文作 爲參考。某些本發明胜肤具有使彼等特別適合用於緩慢釋 出型非經腸調配物，特別是含有生物可降解性聚醋如聚内 交酯之調配物的製造和加工，及用於製備具有有利的釋出 型之緩慢釋出型調配物之溶解特性。再者，含有一或多個 驗基，特別是精胺酸的本發明胜肽也可以與酸端聚g旨例如 聚内交@旨形成胜肤-聚合物鹽，彼等胜肤和胜肤-聚合物趟 亦構成本發明的另一部份。某些彼等鹽所具溶解特性使彼 等特別適合於緩慢釋出型非經腸調配物的製造和加工，例 如WO 93/24150中所載者，及適合於製備具有有益的釋出 型和貯存安定特性之緩慢釋出型調配物。較佳的緩慢釋出 型非經腸調配物含有1至100毫克（例如5至5 0毫克）的多肽 /單位劑。較佳的緩慢釋出非經腸調配物也爲設計供至少 5天期緩慢釋出者。 較佳的本發明胜肽包括以擠壓聚合物儲存調配物形式時 顯示出最小的因擠壓時降解所致損失者或顯示出從彼種儲 存调配物釋出時有最小降解者。測量本發明胜肤降解水平 的典型程序如下所述： 胜肽擠壓聚合物儲存調配物之製備 * 38 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 五、發明説明（36 ) 正確地稱取約20毫克的胜肽並加入足量的聚合物（5〇/ 5〇莫耳％聚（0，1^乳酸/乙醇酸）共聚物，其根據尺寸排斥 層析術相對於聚本乙晞標準品測定約具2〇 kD的重量平均分 子量和約1.7的聚分散度）以產生約20%w/w混合物。將二 混合物溶於無酸酐冰醋酸中以產生約1〇% w/v溶液。將哕 溶液冷凍乾燥並將所得冷凍乾燥物辟存在眞空下到使用爲 止。 、、、 取約100毫克冷凍乾燥物裝載到小型實驗室擠壓機的料桶 内並將柱塞推向下以使樣品堅實。將擠壓機加熱到90至95 C之間並保持在此溫度1 〇分鐘後，在壓力下將冷象乾燥物 擠壓而得直徑約1毫米的柱形擠壓物。 胜肽擠壓聚合物儲存調配物的胜肽含量分生 正確稱取兩粒5毫米長度的含胜肽擠壓聚合物儲存劑並分 別溶解在分別裝在25毫升-量瓶内的1毫升無酐冰醋酸中。 約1.5小時後，用蒸餾水將個別的體積補充到2 5亳升，使 聚合物沉澱。用0.5微米Millex PTFE濾器濾出固體及收集 溶液，A。 用濃度爲0.5亳克/毫升的胜肽/蒸鳝水儲液和濃度爲 2.5毫克/毫升的聚合物/無酐冰醋酸儲液製備—系列標準 溶液並隨後用蒸餾水將各溶液補充到1〇毫升。 39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

492978 A7 _____一________ B7 五、發明説明（37 ) 胜肽濃度(微克/毫升） 液體積(微升） 胜肽儲液體積(微升） 50 —__!〇〇〇 1000 40 —___1000 800 30 ___1000 600 20 一_ 1000 400 10 1000 200 5 1000 100 0 1000 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝_ 將每一標準品濾經5微米Millex PTFE濾器並將每一份濾 液與溶液A液份以HPLC用雙重樣品注射分析。用溶液八中 的胜肤;辰度冲算胜肤擠壓聚合物儲存調配物的胜肤含量， 其係經由比較溶液A的胜肽尖峰面積與標準液的胜肽尖峰 面積而測定的。本發明較佳胜肽顯示出最小的擠壓降解損 I# 失因而孩擠壓聚合物儲存調配物的胜肽含量接近於約 w/w理論値。 從擠壓襄全物存劑活體外釋出時的肿觖降鮮 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將含有0.02%疊氮化鈉，pH 7.6wMcIlvaine氏檸檬酸-磷 酸鹽缓衝液濾經〇·22微米濾器後貯存在4 。將各約i 〇毫 克含胜肽的擠壓聚合物儲存劑放置在兩個小管瓶内，加入 2毫升的緩衝液。然後將管瓶蓋好且貯存在3 7水浴中一 個月，於一個月内的適當時點，從各管瓶内取出三份各 毫升的釋放介質液份予以HPLC分析或置於HPLC管柱内 -40-

I- - - m 492978 A7 B7 五、發明説明（） 在-1 8 °C冷凍貯存到Η P L C分析爲止。於裝置儲存劑的各管 瓶内加入1.8毫升的緩衝液以補充各時點取出的釋放介質。 用HPLC以雙重樣品注射及比較釋放介質中的胜肽尖峰 面積與已知濃度的標卑胜肽緩衝液所得胜肽尖峰面積而定 出每一時點在釋放介質中所含完整胜肽之平均量。經由 Η P L C比較釋放介質所得出的新尖峰之面積與已知濃度的 標準胜肽緩衝液溶液所得胜肽尖峰面積並假設消光係數未 變而測定每一時點在釋放介質中所含胜肽降解產物的近似 平均量。從每一時點在釋放介質中的完整胜肽和胜肽降解 產物含量測定出完整胜肽和總胜肽（完整胜肽加胜肽降解產 物）的平均累積活體外釋出型。本發明較佳胜肽顯示出最小 的活體外釋出降解因而在一個月的3 7。(：下活體外釋出到pH 7·6 Mcllvaine氏緩衝液内之後顯示出低於ι〇〇/〇且較佳者低 於5%總胜肽之總胜肽降解產物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明組合物通常係給人服用使得，例如對於7 〇公斤患 者母曰劑量爲1 0微克至5000毫克，較佳者〇1至1〇〇毫克， 視需要分次給用。組合物的正確給用量和給藥途徑與形式 根據醫學技藝熟知的原則可能決定於要被治療者的體型， 年齡和性別及要治療的特殊疾病或醫學狀況及其嚴重性。 基於治療或預防目的，式I胜肤衍生物或其醫藥可接受鹽 也可以有利地與一或多種一般技藝中已知可用以治療或舒 減一或多種前文所指疾病或醫學狀況的徵候之藥劑（或疾病 改變劑），例如NSAID(如異丁苯丙酸或pir〇xicam)，止痛藥 (例如對乙醯胺基酚（paracetamol))，皮質類固醇，肌肉鬆 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7

弛劑，脂肪氧化酶抑制劑，氨甲蝶呤，硫唑嘌呤，D _青黴 素胺’ ％孢菌素A或單株抗體治療（如抗_CD4或抗-Tnf) 一起給用。對於糖尿病可以將胜肽衍生物與胰島素或用以 糖尿病或糖尿病併發症的其他治療法（例如醛糖還原酶抑制 劑）共給藥。要了解者，這種姐合治療術亦構成本發明的另 一部份。 根據本發明另-邵份提出治療第_ΜΗ(：相關性τ'細胞 媒介自體免疫或炎性疾病，例如—或多種本文所提疾病或 醤學狀況（方法，其包括給需要這種治療的溫血動物（包括 人）給用有效量的式I胜肽衍生物或其醫藥可接受的鹽。本 發明也提出式I胜肽衍生物或其醫藥可接受鹽在製造治療第 II類MHC相關性Τ-細胞媒介自體免疫或炎性疾病所用新顆 醫藥之用途。 除了前述在人類治療性醫藥品中的用途之外，式〗胜肽令 生物也可以用於會影響商業有價値的溫血動物例如狗; 貓，馬和牛等的類似病況之獸醫學治療中。對於彼等治邊 通常是以類似於上述給人類服用的量和方式給用式1胜=务 生物。式I胜肽衍生物也可在供第丨〗類MHC分子對實驗鸯 物如貓，狗，兔子，猴子，老鼠和小鼠的作用評估所用拍 驗系統的開發和標準財作爲藥學工4，作爲持續尋求奉 穎改良治療劑的部份，或作爲診斷劑。 至此本發明要用下列非限制性實施例予以闡述，中 非另外説明，否則·· 〃 ^ (i )濃縮和蒸發係用眞空旋轉蒸發進行的； -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X^97公釐) 492978 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) (ii)操作皆在室溫下進行，亦即在18_26。(：範圍内； (i i i)產率，於有給出時，係意欲只爲幫助讀者了解而不一 定是細心的方法開發所能得到的最大値； (i v )用到下列縮寫：

Phv = 5_苯基戊醯基；b〇c =第三丁氧羧基；tBu=第三丁 基；DMF = N，N-二甲基甲醯胺；h〇BT=1-羥基·苯幷三 峻；Met=甲硫胺酸；Fin〇c = 9-苐基甲氧羰基；Fmoc-Pip· ΟΗ = Ν-(9·第基甲氧羰基）六氫吡啶·4-羧酸；Fmoc-Papa-OH = N-(9-苐基甲氧羰基）胺基]苯乙酸；cbZ =苄氧羰基； Pmc = 2,2,5,7,8-ifS^_6_—-S;Pbf=2,2,4,6,7· 五甲基一鼠表并咬喃-5-續Si基；THF=四氫咬喃； DMSO=二甲亞砜；HBTU = 2_(1H-苯幷三唑-1-基）-1，1，3,3·四甲基脲、六氟磷酸鹽；〇ΙΡΕΑ=二異丙基乙 胺；TFA=三氟乙酸；su爲經由環氮原子連接的丁二醯亞 胺；HPLC=高壓液體層析術；及rp_hPLC二逆相高壓液體 層析術（其除非另外提及，否則是在Vydac C18管柱 218TP54，4.6 X 250毫米上進行的） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (v) 快速層析術和氧化矽上層析術都是在得自德國， Darmstadt，E. Merck 公司的 Merck Kieselgel 60 (Art No· 9385)上進行的； (vi) iHNMR 光譜係在 200 Mhz，CDCL3 或d6-二甲亞颯 (h-DMSO)中用四甲矽烷（TMS)作爲内標準而測定者且表 爲相對於T M S的份數每百萬份之化學偏移値（j )，並用傳 統主要譜峰稱呼之縮寫：s，單線；m，多線；t，三線； -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 41492978 A7 B7 五、發明説明（ br，寬胖；d，雙線； β (vi i)使用下列Fmoc -保護胺基酸來導入Ly s，Thr，Ar g或 His殘基； 用於 Lys : Fmoc-Lys(Boc)-〇H ;用於 Thr : Fmoc-Thr (OBu)-OH ;用於 Arg : Fmoc-Arg(Pmc)-OH 或 Fmoc-Arg(Pbf)-OH ;及用於 His: Fmoc - His(Trt)-OH ; (vii) 於實施例2中，在指稱式III時係意指式III中Rb爲甲基 者； (ix)於實施例1 7和3 1之中，在產品名稱中使用”嗎啉”一 ，詞時，其意爲該嗎啉基係經由環氮連接到鄰接的亞甲基 上；。 (X) 於實施例1 8和34之中，使用”N(CH2CH2)2N，，一項 於產品名稱中之時，其表一六氫ϊ?比ρ井環；及 (xi)在實施例30中，使用” _Lys( = C(NMe2)2)_，，一項於 產品名稱之中時，其表L·胺基酸殘基-HN-CH[CH2CH2CH2CH2N = C(NMe2)2]-CO_。 實施例 1 . Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-.nh2之製備 e 1·1 Boc-(D)-Met-(U」Ala-OMe 之合成 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

S 44- ---.1—：-11111---裝------訂--------ΦΓII.―^i------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（42 ) ^~ 將N_甲基嗎啉（5.6克），L··丙胺酸甲酯鹽酸鹽（3.9克）， HOBT(4.6克）和1·(3 -二甲胺基丙基）_3_乙基碳化二醯亞 胺（5.3克）加到Boc-(D)-甲硫胺酸（7克，0.028莫耳）/無 水D M F ( 5 0毫升）溶液中。將混合物攪拌整個晚上。蒸掉溶 劑後，剩餘物在二氯甲烷（1〇〇毫升）與5 〇/〇乙酸水溶液（5 〇 毫升）之間配分。於靜置之下，Η Ο Β Τ結晶，濾出後，分出 有機層並用碳酸氫鈉水溶液萃洗，脱水（MgS04)及蒸發。 剩餘物（8.5克）在燒結玻璃漏斗中用二氯甲烷/乙醚（〇 %至 100 %乙醚）混合物洗提進行.快速層析術純化。合併含產物 洗提份並蒸發而得 Boc-(D)-Met_(jL)·Ala-OMe(7.2 克） 、爲膠狀物，於靜置下結晶；NMR (CDC13)，·· 1.4 (d，3H)， 1·45 (s，9H)，1·95 (m，1H), 2·1 (s，3H)，2_1 (m，1H)，2.6 (m, 2H)，3.75 (s，3H)，4.3 (bs，1H)，4·6 (m，1H)，5·3 (m，1H)，6·9 (bs，1H) 〇 1·2. (2§_)-2-[(3K)-3_(K·[第三丁氧羰基]胺基）-2-氧基 -吡咯啶-1 ·基]丙酸甲酯之合成

〇 註：此序列必須在無水條件下用無水溶劑進行否則會發生 差向異構化。 於 Boc-(D)-Met-(lj-Ala-OMe(8 克）在 DMF(20 毫升） -45- 本紙張尺^適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公慶) -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 A7 ------------ 五、發明説明（广 ^^~ /二氯甲烷（20亳升）混合物中的溶液内加入甲基碘〇〇毫 升）並將所得混合物靜置16小時後蒸乾。加入更多份二氯 甲;fe(2 X 50毫升）並蒸發脱除殘留甲基破，再將剩餘物溶 万；DMF(300 ^升）/二氯甲烷（3〇〇毫升）混合物中。將混合 物冷卻到〜5°C後，將氫化鈉（〇 76克8〇%礦油中分散液）一 次加入並將混合物置於此溫度下攪摔2小時。加入飽和氯 化銨水溶液（50毫升）並將混合物蒸乾後，於水和乙醚之間 分配。醚萃取液經食鹽水萃洗後，脱水和蒸發而得一膠狀 物’其再燒結玻璃漏斗上快速層析純化（2 5 0/〇乙酸乙酯：己 声至1〇〇%乙酸乙酯）而得（2幻_2_[(3幻_3_(11_[第三丁氧 羰基]胺基）-2-氧基·吡咯啶· b基]丙酸甲酯爲膠狀物（4 2 克），其在靜置下結晶：NMR (CiDCl3) : 1.4 (s，9H)，1.4 (d, 3H)，1·8 (m，lH)，2·6 (m，、lH)，3·4 (m，2H)，3·7 (m，3H), 4.2 (m，1Η)，4.9 (q5 1Η), 5.2 (bs，1Η)。 1·3· (2S>2-[(3S>3-(K-[9 -苐基曱氧羰基]胺基）_2_ 氧 基-吡咯啶_ 1·基]丙酸（Fmoc-IIb-OH)之合成

將（2SJ-2[(3K)-3-αl-[第三丁氧羰基]胺基）-2-氧基· 吡咯啶-l-基]丙酸甲酯（4克）置於丙酮（60亳升），水（40毫 -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） I I 《 ------、訂 I ----- #[lr (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 44492978 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 升）和濃鹽酸（2 4毫升）的混合物中回流3小時後，將混合物 蒸乾。加水並重新蒸發。將剩餘物溶於水（丨5毫升）中並加 入超量的固體碳酸氫鈉。加入9-第基甲基丁二醯亞胺基-碳 酸酯（5.2克）/丙酮（3 0毫升）。將混合物攪;拌1 6小時後蒸 掉溶劑並將剩餘物置於水與乙醚之間分配。分出水層，用 鹽酸將其p Η調到〜3，再用二氯甲烷萃取。有機層經水萃 洗，脱水（MgS04)和蒸發而得白色泡沫物，其用乙醚研析 時結晶而得白色固體（2幻_ 2 - [ ( 3幻-3 - (H_- [ 9 -苐基甲氧羰 基]胺基）_2·氧基-吡咯啶-1-基]丙酸（4.2克），mp· 191-3°C (dec) ; NMR (CDC13) : 1.4 (d, 3H), 2.0 (m9 1H), 2.6 (m, 1H)，3.4 (m, 2H)，4.2 (t，1H)，4.4 (m，3H)，4.9 (m，1H)，5.8 (bs，1H)，7.4 (m，4H)，7.6 (d，2H)，7.7 (d，2H)。 1.4 Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val_IIb-Ala-Pip-NH2 之 合成 該肽是經由Fmoc固相合成法以Frnoc Rink Amide MBHA 樹脂（Novabiochem，0.50 克，0.25 毫莫耳）起始在 Bond Elut 管（Varian，15毫升，底部裝著濾器）内製備的。 (a) 用20%六氫吡啶/DMF溶液將樹脂去保護基（分別用5 毫升進行處理兩次，每次各1 〇分鐘）。於去保護基後，用 DMF充分洗樹脂（5 X 1〇毫升）。 (b) 添加 Fmoc-Pip-〇H(353 毫克，1 毫莫耳），DMF(1.5 毫 升），HOBT(165毫克，1毫莫耳）和二異丙基碳化二醯亞胺 (155微升，1毫莫耳）進行醯化。靜置偶合約30分鐘後，用 DMF洗（5 X 1 0毫升）並取小部份樹脂用Kaiser檢驗（E. -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂_ 45492978 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Kaiser et al·, (1970)，Anal. Biochem. M，595)檢查醯化的完全情況。 使用下列重複上述去保護基（a)和偶合循環（b): Fmoc-Ala-OH (311 毫克，1 毫莫耳）； Fmoc-IIb - OH ( 394 毫克，1 毫莫耳）； Fmoc-Val-OH (339 毫克Fmoc-Lys(Boc)-〇H (468毫克 Fmoc-Ala-OH (311 毫克 Fmoc-Ala-OH (311 毫克 Fmoc-Ala-OH (311 毫克5-苯基戊酸 （178毫克 於每一情況中偶合時間爲約3 〇分鐘並取出一小部份樹脂 用Kaiser檢驗檢查醯化完全情況。苯基戊酸需要雙重偶合 以得到Kaiser檢驗之正結果。 用三氟乙酸（7.9毫升）/三乙矽烷（0.395毫升）混合物從樹 脂上切下胜肽。2小時後，用二氯甲烷（約150毫升）洗樹脂 並將所得溶液蒸乾。所得固體於乙醚（25毫升）與水（2 5毫 升）之間分配後，用更多份水（2 X 25毫升）萃取乙醚。合併 水相並冷凍乾燥。 用製備型 RP-HPLC (Vydac 218TP1022 管柱，250 毫米 X 2 2笔米）純化粗產物，將該粗物質置於5毫升2 〇 〇/。乙腈/水 加200微升DMF之中裝載。用含〇」％ TFA的乙腈-水梯度 (15-3 5%乙腈）在8〇分鐘期間以1〇毫升/分流速進行洗 提。合併含產物的洗提液份並冷凍乾燥而得白色固體ph 1毫莫耳）； 1毫莫耳）； 1毫莫耳）1毫莫耳）1毫莫耳）1毫莫耳） 及 L V' (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 48 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇><297公釐） 492978 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 46 、 ---—- 五、發明説明（） Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH2(84 亳克； 3 5 %產率）。 對該產物用Η P L C，質譜測定法和胺基酸分析予以鐘 定。 用 RP-HPLC Vydac C18 管柱，218ΤΡ54，4·6 X 250 亳米， 以乙腈/水/0.1% TFA，在30分鐘期間10-50%乙腈，1〇 毫升/分的流速洗提顯示出100%純度，滯留時間18 56 分；質譜測定法，m/e(正電噴佈（Es + ))954.6 (MH+);胺 基酸分析（用含1%酚的6N HC1溶液在130°C下酸水解24小 時）得到（Ala + IIb)4.80 ’ Val 1.11，Lys 1.07。 Fmoc_Pip_OH 係以類似於 E. Atherton 和 R.C. Sheppard (，，Solid phase peptide synthesis a practical approach”，IRL press，1989，第51頁）中所述用於N-Fmoc-L-甲硫胺酸的方 法製得者： Fmoc-Pip-OH ： NMR (DMSO-d6)1.3 (m, 2H), 1.7 (m9 2H), 2:5 (m，2H)，2.9 (t，2H)，3.7 (m，1H)，4.2 (t，1H)，4.4 (d，2H)， 7.4 (m，4H)，7.7 (d，2H)，7.9 (d，2H);質譜測定法 m / e (ES+) 352.2 (MH+) 實施例 2 : Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip- N H 2和異構物分離 21 (RS)-2-晞丙基-N-(苄氧羰基）脯胺酸之合成 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝· -訂_ ΙΦ. 492978 A7 _____ B7五、發明説明（47 )

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於二異丙胺化鋰（27.5毫升，2M己烷/ THF溶液）/ THF(100毫升）中，在_78°C氮氣下.逐滴加入苄氧羰基脯 胺fe:甲醋（13克）/THF(20毫升）。將混合物授拌3〇分鐘 後，逐滴加入烯丙基碘（5.5毫升）並將混合物再攪拌3〇分 名里’再回到溫至周溫。接著將混合物加到氧化铵水溶液 ，（200毫升）中並用乙醚萃取（2 x2〇〇毫升）。將乙醚層蒸發 並將剩餘物置於氧化石夕凝膠上用己燒遞增到2 〇 %乙酸乙 酯：己燒之梯度進行層析術純〗匕。將適當的洗提份蒸乾得 到油狀（- 2 -烯丙基-N-(苄氧羰基）脯胺酸甲酯（9克）。 將8.5克此物質溶於甲醇（40毫升）中並加入氫氧化鈉（4 5 克）/水（2 0毫升），再將該混合物回流6 〇分鐘。用濃鹽酸 將混合物鈞ρ Η値調整到7後，蒸掉甲醇。杯混合物的ρ η値 調整到3並用乙醚萃取混合物（2 X 50毫升）。蒸乾合併乙醚 萃取液而得膠狀（Μ)-2-烯丙基(苄氧羰基）脯胺酸： NMR (d6-DMSO (373K)) ： 1.9 (m，2H)，2· 1 (m，2H)，2.6 (q, 1H)，2.9 (q，1H)，3.4 (m5 1H)，3.6 (m，1H)，5.0 (m，4H)，5.75 (m，1H)，7.3 (m，5H)。 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} •壯衣 訂- .p. 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 。，48 、 五、發明説明（） 2.2 [ ( RS ) - 2-晞丙基-Ν-(爷氧談基）丙基]丙胺酸甲 酯之合成

將ΗΟΒΤ(7·7克），N-曱基嗎淋（6.6克），L·丙胺酸甲酯鹽 酸鹽（4.5克）和1-(3-二甲胺基丙.基）-3·乙基-碳化二醯亞胺 (5.7克）加到（Ki)-2·烯丙基-Κ-(苄氧羰基）脯胺酸（6.5克） /DMF(30毫升）中並將混合物攪拌18小時後蒸發。將剩 餘物置於乙醚與水之間分配，濾掉HOBt並分出有機層。將 有機層蒸發並將剩餘物置於氧化石夕上用2 0 %乙酸乙@旨/己 烷遞增到50%乙酸乙酯/己烷之梯度進行層析術純化。合 併恰當的洗提份並蒸乾而得[(EJJ-2·烯丙基氧幾基） 丙基]_(S> 丙胺酸甲酯（7 克）；NMR (d6_DMS0 (373K)): 某些譜峰因非鏡像異構物混合物而雙線化，1.25 and j 3 (2d，3H)，1.75 (m，2H)，2.2 (m，2H)，2.65 (m，1H)，2 9 (m 1H)，3.4 (m，1H)，3.65 (2s，3H)，3.7 (m，1H)，4 3 (2q 1H)’

5.0 (m，4H)，5.7 (m，1H)，7.3 (m，5H)，7.4 and 7.5 (bs，in) Z 2.3 -苄氧羧基_6_氧基_1，7_二氮雜環[4 4]壬 基）丙酸甲酯（CbZ_III-OMe)之合成 — l· ---♦----"裝------訂------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -51 - 492978 A7 B7 五、發明説明（49 )

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將四氧化鐵（1.5毫升4%水溶液）加到[(KSJ-2-烯丙基-K苄氧羰基）丙基]-(S)-丙胺酸甲酯（1.45克）/甲醇（3〇毫 升）/水（20毫升）混合物中。將該混合物置於氬氣下攪拌 ,1 〇分鐘後，分數份加入過碘酸鈉（2.45克）。將該混合物攪 拌2小時後，加入水（1〇〇毫升）並用乙酸乙酯萃取（2x70毫 升）。將合併萃取液脱水後蒸發而得丨.4克膠狀物。將該膠 狀物溶解在二氣甲燒（3 0、毫升）中加入三乙碎燒（0.65克）， 然後逐滴加入三氟乙酸（4克）。將該混合物攪拌3小時後， 蒸發並將剩餘物置於碳酸氫鈉水溶液與乙醚之間分配。分 出醚萃取液並蒸乾。剩餘物在氧化矽上用25 0/〇乙酸乙酯/ 己烷遞增至100〇/〇乙酸乙酯的梯度進行層析術純化。合併恰 當的洗提份並蒸乾而得1·苄氧羰-氧基·丨，7-二氮雜環[4.4]壬-7-基）丙酸甲酯（0.8克）；NMR(d6_DMS〇 (373K)) ··某些譜峰因非鏡像異構物的混合物而雙線化， 1.25 and 1.35 (2d，3H)，1.95 (m，6H)，3.1-3.5 (m，4H)，3 6 and 3.65 (2s，3H), 4.5 and 4.65 (2q，1H)，5.05 (m，2H) 7 25 (m，5H)。 ^ 2.4 (i)-2_(6-氧基-1，7-二氮雜環[4·4]壬_7_基）丙酸

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ►裝 -n^i HI · 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（50 ) (H-III-OH)之合成

將碳酸鉀（2 · 5克）加到（幻_ 2 _ (丨_芊氧羧基-6 -氧基-丨，7 · 二氮雜環[4·4]壬_7 -基）丙酸甲酯（3·3克）/甲醇（4〇毫升） ，/水（40毫升）混合物中並將混合物置於周溫下攪掉1〇小 時。甩濃鹽酸將其pH値調整到〜.5後將混合物蒸乾。將剩 餘物溶在水（40毫升）中並用濃鹽酸將pH値調到3。之後用 二氯甲烷萃取該混合物C2 X 5 0毫升）。將合併萃取液脱水 (MgS〇4)並蒸乾而得泡沫物（28克）。將該泡沫物溶在甲醇 (2 0毫升）中並加入環己烯（〇 7克）接著加入i 〇 0/〇 p d / c (〇 5 克）。將該混合物回流2小時後，冷卻，過濾並將滤液蒸乾 而得泡沫狀（幻-2 - ( 6 _氧基-1，7，·二氮雜環[4 · 4 ]壬-7 _基） 丙酸；NMR (心-DMSO):某些譜锋因非鏡像異構物的混合 物而雙線化，1.25 和 1.3 (2s，3H)，1.8 (m，4H)，2.0 (m，2H)， 3.0 (m，2H)，3·3 (m，2H)，4.5 (m, 1H)。 2·5 (§一)_2-[1-(9-苐基甲氧羰基）-6-氧基-1，7-二氮雜環 [4.4]壬-7-基）丙酸（Fmoc- ΙΙΙ-ΟΗ)之合成 -_ _ -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於⑶-2-(6-氧基.u二致雜環[4·4]壬基）丙酸 (0·42克）/水（2毫升）中加人超量的固體碳酸氫鋼且接著加 入9-第基甲基丁二酸亞胺基碳酸酉旨⑽克^丙晒㈠毫 升）。將混合物攪拌18小時。然後將混合物加到水（ι〇毫升） 中，用乙醚（10毫升）萃取並分開液層。（丟棄醚萃取液卜 用濃鹽酸將水層的ρΗ値調到〜3後，用二氣甲燒萃取（2χ ίο毫升）。分出合併萃取液，脱水（MgS〇4)並蒸發而得白色 泡沫狀苐基曱氧羰基）_6-氧基“，厂二氮雜 環[4.4]壬-7-基）丙酸（〇 62 克）；NMR (d6_DMs〇 (373K)):某些譜峰因非鏡像異構物混合物而雙線化，i 3 (2d，3H)，1.6-2.0 (m，6H)，3.05 (m，1H)，3.2-3.45 (m, 3H)， 4.2-4.4 (m，1H)，4.5 (m，1H)，6·2 (s，2H)，7·35 (m，4H)，7·8 (m，4H) 〇 2.6 PhV-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-pip-NH2 之 合成及異構物分離 合成的第一部份係用類似於實施例1 · 4所述方法進行，但 用？1110〇-111_〇11取代？111〇(^111)-011。於此例子中係經由下 述方式將酸活化而進行醯化：酸（1毫莫耳），HBTU(1毫莫 耳），二異丙基乙胺（2毫莫耳），DMF(4亳升）。所有偶合 都在小於4 5分鐘之後由Kaiser檢驗看出已完全。此方法係 -54- 本紙張尺度適用申國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} I裴- -訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 A7 B7 五、發明説明（52 ) 用來得到Fmoc-Val-III-Ala-Pip-NH·樹脂。然後將該胜 肽樹脂轉移到ABI 431自動胜肽合成器，於其上遵照下述製 造商對摻合HBTU / HOBT化學的單一醯化反應所建議的條 件偶合序列中其餘的殘基。在去保護基後，用DMF洗樹脂 (10X 10-20 毫升）。用 HBTU(1 當量），H0BT(1 當量），和 DIPEA(2當量）在DMF中將羧酸（1毫莫耳）活化約1 1分鐘後 才轉移到樹脂。進行醯化反應約60分鐘後，用DMF洗樹脂 (1 0 X 1 0 - 2 0毫升）。每一階段的去Fmoc保護基都是用2 0 % 六氫吨啶/ D M F溶液進行（各5毫升處理1 0分鐘兩次）。於 每一去保護基後，都用DMF充分地洗樹脂（5 X 10毫升）。 用三氟乙酸（TFA)，三乙矽烷（TES)和水（1〇毫升， 95 : 5 : 5)混合物處理15小時從樹脂上切下胜肽。濾掉樹 脂’用TF Α充分地洗，將收集到的濾液經由旋轉蒸發濃縮 乾後用乙醚研析所得剩餘物而得Phv· Aia-Ala_ Ala-Lys-Val_III-Ala-Pip-NH2，其中含有兩種主要的成份（RP-HPLC (Vydac 218TP54C18 管柱）顯示爲 52 : 48 混合物）。使 用乙腈：水（含〇」％ TFA)20_50〇/〇梯度在2〇分鐘期間以1 毫升/分的流速測得較大極性的非鏡像異構物以12.5分鐘 的滯留時間洗提出而較低極性的非鏡像異構物以165分鐘 滯留時間洗提出。將胜肽以基本上所實施例i · 4所述的製 備型RP-HPLC進一步純化得到兩種分離的成份，兩者經 RP-HPLC測得>95%之純度。較高極性的非鏡像異構物比 較低極性的非鏡像異構物在檢驗A和B中更具效力且經分析 如下· RP-HPLC(20-50%乙腈梯度，20分鐘，流速1毫升 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇><297公釐） Γ請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) $ ’訂· 492978 A 7 B7 五、發明説明（53 ) /分）;帶留時間= 12.3分；質譜測定法，m/e (ES+) 994.5 (ΜΗ ) ’·胺基酸分析· Ala 3 99，Lys 1.20，Val 0.73。 _實一施 H ： phv_Ala_Lys-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip- nh2 其合成係用人工進行，且其純化係用類似實施例i 4所述 方法實施’偶合和將Fmoc-保護胺基酸與Fmoc-IIb-OH去 保護皆依恰當順序完成。產物係經類似於實施例1.4所述 方式以HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予以鑑定；RP_ HPLC(用含〇·ι〇/0 TFA的乙腈/水，2〇分鐘期25_4〇0/〇乙腈 梯度洗提，流速1·〇毫升/分）滯留時間=5 56分；質譜測定 法 ’ m/e (ES+) 926.5 (MH+);胺基酸分析得到（Ala+IIb) 5.87，Lys 1 · 12 0 宜施例 1 : Phy-Ile-Ala-Ala-Arg-Thr-IIb-Ala-Papa - nh2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-=口 其合成係用人工實施者，且其純化係用類似實施例i 4所 述方法進行，偶合和將Fmoc-Papa-OH (取代Fmoc-Pip_ OH) ’ Fmoc-保護胺基酸和Fmoc-IIb-OH去保護係以恰當 順序進行。其產物係經類似實施例i · 4所述方式以Hplc， 質譜測定法和胺基酸分析間鑑定；rp_hplc (用含0.1% TFA的乙腈和水，30分鐘期20-50%乙腈梯度洗提，流速 1.0毫升/分）滯留時間=1108分；質譜測定法，m / e (ES+) 1048.7 (MH+);胺基酸分析：Arg 0.98，Ala 3.00， lib 1·27，Thr 0·86，lie 0.88 〇

Fmoc-Papa-OH 係經由用類似於 Ε. Atherton and R. C. -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 492978 A7 B7 五、發明説明（54 )

Sheppard (” Solid phase peptide synthesis : a practical approach”，IRL press，1989，5 1 頁）對N_Fmoc-L_ 甲硫胺酸 所述方法製得：

Fmoc-Papa-OH ： NMR (DMSO-d6) 3.5 (s? 2H), 4.25 (t, 1H), 4·5 (d，2H)，7.1 (d，2H), 7·4 (m，6H)，7·75 (d，2H)，7.9 (d5 2H)，9·6 (s，1H);質譜測定法，m/e (ES ) 372.1 (Μ·Η)_ 复施例-丄:Phv-Arg-Ala_Ala-Ala_Val-IIb-Ala-Pip- nh2 其合成係以類似實施例1.4所述方法人工實施的，偶合和 將Fmoc_保護胺基酸與Fmoc-IIb-OH去保護皆以恰當順序 完成。產物以類似於實施例1.4所述方式用製備型RP _ 1^1^純化，其係用含01〇/〇丁？八的乙腈-水梯度（15-40%乙 腈）於6 0分鐘内以i 〇毫升/分的流速洗提。產物以類似實 施例1 · 4所述方法經HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予以 鑑定：RP-HPLC(以含0.1% TFA的乙腈和水洗提，使用30 分鐘期間的10 —50%乙腈梯度，流速1.0毫升/分）滯留時間 = 18.28分；質譜測定法，m/e (ES+) 982.5 (MH+);胺基 酸分析 Arg 1.12，（Ala+IIb) 3.8，Vail.12。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 豈施例 6 ： Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb.Ala-Papa-NH2 其合成的第一部份係用人工實施，使用類似於實施例1 4 所述方法，偶合和將Fmoc-Papa-OH(取代Fmoc_Pip-OH)，Fmoc-保護胺基酸和Fmoc-IIb_OH去保護係以恰當 順序完成而得Fmoc-Thr(OBu)-IIb_Ala-Papa-NH-樹脂。 -57· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（55 ) 之後將該胜肽樹脂轉移到自動合成器（ACT 357 )並遵照製 造商對摻合HBTU/HOBT化學的單一醯化所建議之條件偶 合其餘的殘基。從樹脂切下胜肽並用類似實施例丨4所述 程序以製備型RP - HPLC純化。該胜肽以類似實施例丨4所 述方式經HPLC，質譜術和胺基酸分析予以鑑定；Rp-HPLC (用含0.1% TFA的乙腈和水洗提，使用3 〇分鐘期間的 10· 5 0%乙腈梯度，流速ΐ·〇毫升/分）滯留時間=1821分； 質譜測定法，m/e (ES+) 1006.4 (MH+);胺基酸分析得到 Arg 1·1〇，Ala 3.88，lib 1.04，Thr 0.95 〇 f 施例 7 : Phv-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Papa- NH2 其合成的第一部份係用人工實施，使用類似於實施例1.4 所述方法，偶合及將Fmoc-Papa-OH(取代Fmoc-Pip-OH)，Fmoc-保護胺基酸和Fmoc_IIb_OH去保護係以恰當 順序完成而得Fmoc-Val-IIb-Ala-Papa-NH-樹脂。之後將 該胜肽樹脂轉移到自動合成器（ABI 431)並遵照製造商對摻 合HBTU/HOBT化學的單一醯化所建議之條件偶合其餘的 殘基。從樹脂切下胜肽並用類似實施例2 · 6所述程序以製 備型RP · HPLC純化。該胜肽經類似實施例1 · 4所述方式以 HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予以鑑定；RP-HPLC (用 含0· 1% TFA的乙腈和水洗提，使用3 0分鐘期間内的1 〇 _ 50%乙腈梯度，流速1.0毫升/分）滞留時間=20.87分；質 譜測定法，m/e (ES+) 1004.6 (MH+);胺基酸分析得到 Arg 0.96，（Ala+IIb) 5.05，Val 0.97 0 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝· -訂 492978 A7 B7 五、發明説明（56 ) 實施例 8 : Phv-Ala-Arg-Ala-Arg_Val-IIb-Gly-Papa· NH2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其合成的第一邵份係人工實施者，使用類似於實施例1 4 所述方法，偶合和將Fmoc-Papa-OH(取代Fmoc-Pip-0H)，Fmoc-保護胺基酸和Fmoc_IIb-OH去保護，而得 Fmoc-Val-IIb-Gly-Papa_NH-樹脂。然後將胜肽樹脂轉移 到自動合成器（ABI 431)並遵循製造商對摻合HBTU/HOBT 化學的單一醯化所建議之條件偶合其餘的殘基。從樹脂切 下胜肽並用類似實施例2 · 6所述程序以製備型r p - HPLC純 化。該胜肽經類似實施例1 · 4所述方式以HPLC，質譜測定 法和胺基酸分析予以鑑定；RP-HPLC (用含0.1% TFA的乙 腈和水洗提，使用30分鐘期間内的10-50%乙腈梯度，流 速1. 〇毫升/分）滞留時間=18 · 12分；質譜測定法，m / e (ES+) 538.4 (M+2H+ + );胺基酸分析得到 Arg 0.92，Ala 2.16，（Gly+IIb) 2.12，Val 0.88。 實連l例 9 : Phv-Ala-Ile-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Pip- nh2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 其合成係人工實施者，且其純化係使用類似於實施例1 4 所述方法進行，偶合和將Fmoc-保護胺基酸和Fmoc-IIb-0 Η去保護係以恰當順序完成。其產物經類似於實施例1 4 的方式以HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予以鑑定；Rp-HPLC (用含〇· i〇/0 tfa的乙腈和水洗提，使用3 〇分鐘期間内 的1 0-5 0%乙腈梯度，流速丨〇毫升/分）滞留時間=23 4 分；質譜測定法，m/e (ES+) 1024.6 (MH+);胺基酸分析 -59- 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS ) M規格（21〇、χ297公釐） 492978 A7 B7 五、發明説明（57 ) 得到 Arg 1.15，（Ala+IIb) 3.88，Val 0.96，lie 1.02。 實施例 1 〇 : phv-Ala-Arg-Ala-His-Val-IIb-Ala-Papa- nh2 合成的第一部份係人工實施者，使用類似於實施例丨4所

述方法，偶合和將Fmoc-Papa-OH(取代Fmoc_Pip_〇H)， Fmoc -保護胺基酸和Fmoc-IIb-OH去保護係以恰當順序完 成而得Fmoc-Val_IIb_A】a_Papa-NH-樹脂。然後將胜肽樹 脂轉移到自動合成器（ABI 43 1)並遵循製造商對掺合HBTU /HOBT化學的單一醯化所建議之條件偶合其餘殘基。從樹 脂切下胜肽並用類似實施例2 · 6所述程序以製備型R p _ HPLC純化。該胜肽經類似實施例1 · 4所述方式以HPLC， 質譜測定法和胺基酸分析予以鏗定；RP-HPLC (用含0.1% TFA的乙腈和水洗提，使用3 0分鐘期間内的2 〇 - 5 0 %乙腈 梯度，流速1.0毫升/分）滞留時間=18.8分；質譜測定法， m/e (ES+) 1070.6 (MH+);胺基酸分析得到 Arg 1.02， (Ala+IIb) 4.12，Val 0.90，His 0.95。 复施例 1 1 : Phv-Ala-Ala-Asn-Arg-Val-IIb-Ala-Pip- nh2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 合成的第一部份係人工實施者，使用類似於實施例i 4所 述方法，偶合和將Fmoc·保護胺基酸與Fmoc_IIb-OH去保 遵係以恰當順序完成而得Fmoc-11 b _ A1 a _ Pip_ N Η -樹脂。 然後將胜肽樹脂轉移到自動合成器（ABI 431)上並遵循製造 商對於掺合HBTU/HOBT化學的單一醯化所建議之條件偶 合其餘的殘基。從樹脂切下胜肤並用類似實施例2.6的程 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 A7 ___ B7 五、發明説明（58 ) 序以製備型RP · HPLC純化。該胜肽經類似實施例丨4所述 方式以HPLC ’質晴測定法和胺基酸分析予以鍛定；Rp_ HPLC (用含0· 1% TFA的乙赌和水洗提，使用3 〇分鐘期間内 1 0 _ 5 0 %乙腈梯度’流速1 ·〇毫升/分）滯留時間=ι7 66分； 質譜分析法，m/e (ES+) 1025.5 (MH+);胺基酸分析得到 Arg 1.04，Ala 2.94，Val 0.95，Asp 1.05。 施例 12 ： Phv-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip- NH2 合成的第一部份係在ABI 43 1自動合成器上使用類似於實 施例2 · 6中所述自動進行，以恰當順序偶合Fmoc -保護胺基 酸而得Fmoc-Ala-Ala-Pip-NH-樹脂。合成的其餘部份係 以人工進行，且其產物以製備型RP_HPLC純化，使用的是 類似實施例1 · 4所述程序。該胜肽經類似於實施例丨.4所述 方式以HPLC ’質If測定法和胺基酸分析予以鐘定；Rp_ HPLC (用含0.1% TFA的乙腈和水洗提，使用3 〇分鐘期間内 的1 0-5 0%乙腈梯度，流速1·〇毫升/分）滯留時間=68 分；質譜測定，m/e (ES+) 954.6 (MH+);胺基酸分析得 到 Arg 1.09，（Ala+IIb) 5.88。 實施例 13 Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly- nh(ch2)3nh.c(=nh).nh2 (a)Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly- NH(CH2)3NH2 之製備 將2 -氯三苯甲基氯化物樹脂（0.4克約0.25毫莫耳的可得 氯）經由與1，3 -二胺基丙烷（0.42毫升）在周溫DMF(4毫升） -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝·

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 —*— ---B7 五、發明説明（59 ) 中反應1小時轉化成（3_胺基丙基;)胺基_樹脂。在用£)^/[17充 分洗滌後，將樹脂轉移到Applied Biosystens 430A胜肽合成 器上並遵循製造商所建議的條件進行經恰當保護的胺基酸 之逐次偶合和去保護。然後用甲醇洗該樹脂並乾燥（〇 722 克）。從樹脂上切下胜肽並用類似實施例2·6中所述程序以 製備型RP - HPLC予以純化。產物經類似實施例丨· 4中所述 方式以HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予以鑑定；Rp-HPLC (用含〇· 1% TFA的乙腈和水洗提，使用4〇分鐘期間的 1 0 - 5 0%乙腈梯度，流速I.2毫升/分）滞留時間=17 76分。 依此得到 Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2)3NH2(冷凍乾燥後爲329毫克）；質譜測定法，m /e (ES+) 916.5 (MH+)。 (b)Phv-Ala - Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2)3NH.C( = NH).NH2 之製備 將 Phv-Ala-Arg-Ala-Ala_Thr_IIb_Gly_NH(CH2)3 NH2(329毫克）溶於水（5毫升）/乙腈（5毫升）混合物中，加 入1-H-吡唑-1_甲脒鹽酸鹽（132毫克，3當量）和二異丙基 乙胺（52微升，1當量）。將混合物置於周溫下攪拌4天。將 該混合物以製備型RP - HPLC純化並以類似實施例1 · 4所述 方式經HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予以鑑定。依此得 到 Phv-Ala-Arg-Ala_Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2)3 NH.C( = NH).NH2(178 毫克）；RP-HPLC(用含 0.1% TFA 的乙腈和水洗提，使用4 0分鐘期間的1 〇 · 5 0 %乙腈梯度， 流速1.2毫升/分）滯留時間二18.42分；質譜測定法，m/e ___-62- __ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ' 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) b__ _裝· 492978 A7 B7 五、發明説明（60 ) (ES+) 958.5 (MH+);胺基酸分析得到 Thr 0.86，Gly 0.90 ; Ala 3.20，Arg 1.00 重施例 1 4 Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Gly-NHEt 合成的第一部份係在Applied Biosystems 430A合成器上進 行並遵循製造商建議條件進行經恰當保護的胺基酸之逐次 偶合和去保護，其係用Boc-Gly-Ο-苄基酯樹脂 (Merrifield樹脂）（0.54克，0.25毫莫耳）起始物。用甲醇洗 樹脂並乾燥（871毫克）後，與DMF(10毫升）和2M乙胺/甲 醇（1 0毫升）置於周溫下溫和攪拌7天。RP-HPLC顯示甲基 酯迅速釋放到溶液内接著轉化稍微更親水性的N _乙基醯 胺。過濾該混合物並用DMF洗樹脂。蒸掉溶劑得到粗製N-乙基醯胺形式的經保護胜肽。用TFA，TES和水（90 : 5 : 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 )混合物將胜肽去保護及用類似實施例2 · 6所述程序以製 備型RP-HPLC純化而得卩1^-八1&-八^-八1汪-八巧-1[111*-11 b _ G1 y - Ν Η E t ( 16 8毫克）。該胜肽以類似實施例1.4所述 方式經HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予以鑑定；RP-HPLC(用含0.1% TFA的乙腈和水洗提，使用40分鐘期間内 的10_ 50%乙腈梯度，流速1.2毫升/分）滯留時間=17.85 分；質譜測定法，m / e (ES+) 972.5 (MH+);胺基酸分析 得到 Thr 0.83，Gly 1.03; Ala 2.17，lib 0.9，Arg 2·00 實施例1 5和1 6

Phv-Gap· Ala· Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (實施 例15)

Phv-Gap(Me)4-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa_NH2 -63-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 4^2978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（61 ) (實施例1 6 ) (a) Phv-Dap_Ala_Ala-Ala-Thr_IIb-Ala-Papa_NH2 之 製備 合成係在 Applied Biosystems 430A 合成器上用 Fmoc Rink Amice樹脂（0.25毫莫耳）自動實施，並依照製造商的建議條 件進行經恰當保護的胺基酸之逐次偶合和去保護。D ap殘 基是經由在合成中的恰當階段使用moc- Dap(Boc)-OH而 組入者。將完成的樹脂乾燥。產率1 292克（重量增量，792 愛克）。使用類似實施例1 · 4所述程序從樹脂切下胜肽並用 製備型RP-HPLC純化，但使用Dynamax 60A管柱（一吋内 徑），用含0.1 %TFA的乙腈和水（1〇_4〇%乙腈梯度）在6〇 分鐘期間以12毫升/分的流速洗提而得Phv-Dap-Ala-

Ala_Ala-Thr-IIb_Ala_Papa_NH2(304 毫克）。以類似實 施例1 · 4所述方式用HPLC和質譜術鐘定該胜肽；rp -HPLC (用含0.1〇/〇 TFA的乙腈和水洗提，使用40分鐘期間内 的1 0-4 0%乙腈梯度，流速1.2毫升/分）滯留時間= 24.5 分；質譜術，m/e (ES+) 937.1 (MH+)。 (b) 將（a)所得Dap胜肽溶在水（7毫升）/乙腈（8毫升）中並 用1峨峻·甲脒鹽酸鹽（13〇毫克）和二異丙基乙胺（5 3微 升）在周溫下處理一星期。rP_HPLC顯示只有40%轉化成 對應的Gap胜肽。嘗試性製備型rp_hplC無法完全分離該 兩成份。因此，用HBTU(8 7毫克）和二異丙基乙胺（50微升） 在D M F ( 5 0毫升）中處理該混合物丨6小時以使未改變的〇 ap 胜肽轉化成四甲基胍（GapMe4)胜肽。此化合物的特佳疏水 _ -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΐ〇χ297公釐） I ml ·ϋ_1 n ϋϋ ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 性使得製備型HPLC更容易（如（a)中所述條件），其係用與 上面（a)中所述相同條件進行的，得到 (I) Phv-Gap_Ala-Ala-Ala-Thr_IIb_Ala_Papa-NH2(8 0 毛克）其以類似於實施例1 4中所述方式經HPLC，質譜測定 法和胺基酸分析鑑定；RP-HPLC(4〇分鐘期間1〇_40%乙 腈梯度，流速1.2毫升/分）滯留時間=26 2分；質譜術，m / e (ES ) 978.5 (MH+);胺基酸分析得到 Thr 0.90，Ala 4.05 lib有，Gap的尖峰在Trp位置。 及 (II) Phv-Gap (Me )4_ Ala· Ala-Ala-Thr-IIb_ Ala-Papa- NH2(122^克），其依上述⑴鑑定；Rp_HpLC(洗提劑和 梯度如上面（1));帶留時間=28.4分；質譜術，m / e (ES+) 1〇34·6 (MH+);胺基酸分析得到 Thr 0·90，Ala 4.11 lib 存 在，Gap(Me)4尖峰在Trp位置。 —^ ίΗ 17 Phy-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly. NHCH2CH2-嗎啉 採用經保護片段策略。在Applied Bi〇systems 43〇A合成器 上經由用Fm〇C-Gly_〇H(2毫莫耳），與2-氯三苯甲基氣化 物樹脂（>ι克，1亳莫耳）在DMF(1〇毫升）中於N•二異丙基 乙胺（4毛莫耳）存在中偶合製成Fm〇c_Giy 氯三苯甲基 樹脂（1毫莫耳，1克）接著經由雙偶合策略予以伸長（以類 似實她例2.6中所述方式）而得經保護的胜肽樹脂（2 克）。在用二氯曱烷（30毫升），乙酸（5毫升）和三氟乙醇（5 笔升）於周溫下處理一小時以從樹脂切下胜肽後，濾掉樹脂 一 - 一 ------------------- 0S * 本紙張尺度顧中_家辟（CNS) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5·

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 492978 五、發明説明（63 並用二氯甲烷和乙酸洗。蒸掉溶劑及隨後從水乙腈冷凍乾 燥而得所要的經保護胜肽酸（1·23克）。以類似實施例丨4中 所述方式鑑足该胜肽；RP_HPLC(40分鐘期間20-80〇/〇乙 腈梯度，流速1.2毫升/分）滯留時間=26 2分。 將该經保護酸（235 ¾克，〇·2毫莫耳）用hbTU(76毫克， 1當量）與二異丙基乙胺（70微升）在DMF(10毫升）中偶合 到4 - ( 2 -胺基乙基）嗎啉（2 7微升，1當量）。蒸掉溶劑，用 9 0 % T F A / Η 2 Ο去保護和純化，採用類似實施例i 4中所 述程序，得到純醯胺（15〇毫克）。以類似實施例i · 4中所述 方式經HPLC ’質谱術和胺基酸分析鑑定該胜肤；Rp _ HPLC (40分鐘期間10-4 0%乙腈梯度，流速ι·2毫升/分） 滞留時間=18.6分；質譜術，m/e (ES+) 972.8 (MH+);胺 基酸分析得到 Thr0.6，Glyl.02，Ala2.94，IIb0.9，Arg 1.00 〇 實 施例 18 Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly- n(ch2ch2)2nch2ch2o-ch2ch2oh 使用類似於實施例1 7中所述程序，但使用4 - [ 2 - ( 2 -羥基 乙氧基）乙基]六氫吡畊取代4 ·( 2 -胺基乙基）嗎啉，因而得 到 Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-N(CH2CH2)2 NCH2CH20_CH2CH20H。以類似實施例1 ·4所述方式用 HPLC，質譜術和胺基酸分析鑑定該胜肽；RP-HPLC(使用 如實施例1 7中所用之洗提劑和梯度）滯留時間=20.5分；質 譜術，m/e (ES+) 1016.8 (ΜΗ+);胺基酸分析得到Thr 0·89，Gly 1.02，Ala 2.98，lib 1.05，Arg 1.0Q 0 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂_ 492978 A7 _B7 五、發明説明（64 ) 實施例 1 9 Phv-Arg-Ala-Ala· Ala-Thr-IIb-Gly _Papa- NHC( = NH)NH2 使用類似於實施例1 7中所述程序，但用4 _ (2 -胍基乙基） 苯胺取代4-(2 -胺基乙基）嗎琳’因

Ala-Ala-Thr-IIb-Gly_Papa-NHC( = NH)NH2。以類似實 施例1 · 4中所述方式用製備型HPLC純化胜肽，但使用 Vydac 201HS 1022管柱（一吋内徑）並用含0.1% TFA的乙腈-水梯度（1 0 - 3 5 %乙腈）於6 0分鐘期間以1 2毫升/分的流速 洗提。該胜肽經HPLC，質譜術和胺基酸分析鑑定；RP-HPLC (使用實施例1 7中所用洗提劑和梯度）滞留時間= 24.2 分；質譜術，m/e (ES+) 1021.1 (MH+);胺基酸分析得到 Thr 0.8，Gly 0.95，Ala 2.86，Arg 1·00，lib 存在。 4-(2 -狐基乙基）苯胺二鹽酸鹽的製備如下所述。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將4 -梢基苯乙胺鹽酸鹽（1·〇13克，5毫莫耳），1H-P比峻· 1·曱脒鹽酸鹽（0.733克，5毫莫耳）和Ν-二異丙基乙胺（0.88 毫升，5毫莫耳）在乙腈（1 〇毫升）和水（1 〇毫升）中的混合物 置於周溫下授拌1 6小時。分兩部份用Dynamax 60Α，C18 管柱（一吋内徑）以含有〇· 1〇/0 TFA的乙腈和水洗提進行製備 型RP-HPLC而得純4-硝基苯乙基胍。將產物溶在水（1〇〇毫 升）中，加入一滴濃鹽酸，接著加入5 % P d / C ( 100毫克） 並用氫氣冒泡通過該溶液4小時。濾掉觸媒並用水洗。蒸 發去除揮發性物質而（在氫氧化鉀丸上方乾燥後）得到棕色 泡沫狀4-(2-胍基乙基）苯胺二鹽酸鹽（〇.984克）。 實施例 2 0 Phv-Ala_Ala_Ala-Arg_Thr-IIb_Ala-Papa_ ___-67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 492978

、發明説明（65 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 nh2 合成的第一部份係人工實施者，使用類似於實施例2 6所 述之方法，利用HBTU/DIPEA活化及將Fmoc-保護胺基酸 和Fmoc-Ilb-ΟΗ以恰當順序偶合和去保護而得Fm〇(>IIb_ Ala-Papa-NH-樹脂。然後將胜肽樹脂轉移到自動合成器 (ABI 431)並遵循製造商對摻合HBTU/H〇BT化學的單一醯 化所建議之條件偶合其餘的殘基。從樹脂切下胜肽並用類 似實施例2.6所述程序以純化。該胜肽經類似實施例丨4所 述方式以HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予以鑑定；Rp_ HPLC (用含0.1% TFA的乙腈和水洗提，使用2〇分鐘期間内 的2 0-40%乙腈梯度，流速1〇毫升/分）滞留時間=1157 分；質譜測定法，m / e (ES+) 1006.4 (MH+)，503.8 (M+2H+ + )，514.8 (M+H+ + Na + );胺基酸分析得到：Ala 4 · 1 9，Arg 0.91，Thr0.74。 复施例 21 Phv-Ala_Arg-Ala_Arg_Thr_IIb-Azgly-Papa-NH2 合成的第一部份係用類似於實施例2.6所述方法人工進行 的’其中使用HBTU/DIPEA活化及將Fmoc-保護胺基酸和 Fmoc -11 b - Ο Η以恰當順序偶合和去保護，不同處在於有另 摻入Azgly殘基。該Azgly殘基係經由用Fmoc-Azgly-OSu(依EP 518655所述製得）（4當量）與η〇ΒΤ(0·25當量）在 D M F中於5 0 C下偶合4小時而摻入者。依此得到Fmoc· IIb_AzGly-Papa-NH-樹脂。之後將該胜肽樹脂轉移到自 動合成器（ABI 43 1)並遵循製造商對摻合HBTU/HOBT化學 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（2丨0'乂297公^7 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 零裝· 492978 A7 B7 五、發明説明（66 ) 的單一醯化所建議之條件偶合其餘的殘基。從樹脂切下胜 肽並用類似實施例2 · 6所述程序予以純化。該胜肽經類似 實施例1 · 4所述方式以HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予 以鑑定；RP-HPLC(用含0.1% TFA的乙腈和水洗提，使用 2 0分鐘期間内的1 5 _ 3 5 %乙腈梯度，流速！·〇毫升/分）滯 留時間二8· 10分；質譜測定法，m / e (負電子噴佈（E S -)) 1076.4 (MH-);胺基酸分析得到：Ala 2.10，Arg 2.00， Thr 0·99。 _實施例 2 2 Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-NH2 使用類似實施例2 1所述程序。合成的第一部份是用人工 實施的’採用HBTU/DIPEA活化而得Fmoc-IIb·Azgly_ NH-樹脂。之後將該胜肽樹脂轉移到自動合成器（abi 430A) 並遵循製造商對摻合HBTU/HOBT化學的單一醯化所建議 之條件偶合其餘的殘基。從樹脂切下胜肽並用類似實施例 2 · 6所述程序以製備型R p _ HPLC純化。該胜肽經類似實施 例1 · 4所述方式以HPLC，質譜測定法和胺基酸分析予以鑑 定；RP-HPLC (用含0.1% TFA的乙腈和水洗提，使用2 〇分 鐘斯間内的20-3 5%乙腈梯度，流速1.〇毫升/分）滞留時間 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) = 7.26 分；質譜測定法，m / e(ES + ) 945.6 (MH+)，473.4 (M+2H+ + );胺基酸分析得到 Ala 2.08，Arg 2.00，Thr 0·78 〇 i施例 2 3 Phv-Ala-Arg-Ala-lib-Ala-Arg-Ala-Papa- NH2 使用類似實施例2.6所述程序，不同處在於整個胜肽组合 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準·（ CNS ) A4規格（210X297公釐） 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（67 ) 體係以人工實施，用HBTU/DIPEA活化，將？111〇〇?狂卩汪· OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc_Arg(Pbf)-〇H，Fmoc-IIb- 0 Η和5 -苯基戊酸依恰當順序偶合。用類似實施例2 · 6中所 述程序將胜肤從樹脂切下。以類似實施例1.4所述方式用 製備型RP-HPLC純化產物，其中係用含0.1% TFA的乙腈-水梯度（15-30%乙腈）於90分鐘期間以1〇毫升/分流速洗 提。產物以類似實施例1 · 4所述方式經HPLC，質譜術和胺 基酸分析予以鑑定；RP-HPLC (用含〇. 1% TFA的乙腈和水 洗提，使用3 0分鐘期間的1 5 - 3 0 %乙腈梯度，流速1 .〇毫升 /分）滯留時間=20.02分；質譜測定法，m / e(ES + ) 1061.6 (MH+)，531.4 (M+2H++ );胺基酸分析得到 Ala 4.16，Arg 2.00，lib 存在。 實施例2 4 3-(2•氰基苯幷[b]苯硫_5_基）丙醯基_Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH2 合成和純化係用類似於實施例1.4所述方法人工實施的， 將 Fmoc-Papa-OH(取代 Fmoc-Pip_〇H)，Fmoc_ 保護胺基 酸和Fmoc-IIb-OH以恰當順序偶合和去保護，並用3 _(2_ 氣基冬幷[b]苯硫-5-基）丙酸取代5 -苯基戊酸。以類似實施 例1.4所述方式用製備型RP-HPLC純化產物，其中係用含 0.1% TFA的乙腈-水梯度（15-40%乙腈）於60分鐘期間以 1 0耄升/分的流速洗提。產物以類似實施例1 4所述方式 經HPLC ’質譜術和胺基酸分析予以鑑定；rp_hplc(用本 0· 1 % TFA的乙腈和水洗提，使用3 〇分鐘期間的1 q _ $ 〇 %乙 ___-70· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~ ----—- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（68 ) 腈梯度，流速1.0毫升/分）滯留時間=17.58分；質譜測定 法，m/e(ES + ) 114·7 (MH+);胺基酸分析得到：Arg 2·86，Ala 4.12，lib 1.00 〇 3 - (2 -氰基苯幷[b ]苯硫-5 _基）丙酸係依下述得到的： (a)將雷氏鎳（1克）和胼水合物（3毫升）在6 〇 t下加到5 _硝 基苯幷[b]噻吩-2-羧酸乙酯（25克）（依Syn. c〇mm，（1991)， 2±，959-964中所述得到者）/乙醇（5〇〇毫升）中。隨即發生 激烈反應且混合物回流。以1 〇分鐘間隔加入更多份的雷氏 鎳（1克）和肼水合物（3毫升）直到總共加入15毫升爲止，然 後將混合物回流9 0分鐘。過濾熱混合物並將濾、液蒸發。將 剩餘物溶解在熱乙醇（3 00毫升）中並加入活性碳。過濾該混 奋物並將濾、液悉乾而得5 -胺基苯幷[bp塞吩_2_幾酸乙酉旨 (1 8克）爲淡育色固體。將該固體加到〜〇 °c，擾拌濃鹽酸 (5 0耄升）水/水（13〇毫升）混合物中。慢慢地加入亞硝酸 納（5.6克）/水（20毫升）後，將混合物置於下再攪拌3〇 分鐘。之後，加入碘化鉀（130克）/水（2〇〇毫升）。讓混合 物熱到周溫後，在5 0。(：加熱3 0分鐘。將混合物冷卻，用氯 仿萃取（150毫升）並用偏亞硫酸氫鈉溶液萃取有機層。將有 機層脱水（MgS〇4)並蒸乾而得棕色油。該油在氧化矽上用 己烷遞增到1 〇 〇/〇乙酸乙酯/己烷梯度層析術純化。合併恰 當的洗提份並蒸發而得5_碘基苯幷[b]嘧吩羧酸乙酯 (14 克）爲油狀物；NMR (d6_DMS〇) : i 35 (t，3H)，4 4 & 2H)，7·8 (dd，1H)，7.9 (d，1H)，8.15 (s，1H)，8.45 (d，1H)。 (b )將氫氧化鈉（5克）/水（15〇毫升）加到5 _碘基苯幷[^ ]遠 _ -71 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -訂‘

丁 ° I I 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（69 吩-2 -羧酸乙酯（1 4克）/乙醇（200毫升）中並將混合物攪掉 1 6小時。將混合物蒸發濃縮到約15〇毫升並添加稀鹽酸將 混合物調整到〜PH3。之後用乙醚萃取混合物（2 X 1〇〇毫 升）。將合併有機萃取液脱水（MgSOO並蒸發而得固體弘硤 基苯幷[b]嘍吩-2_ 羧酸（11.7 克）；NMR (d6-DMSO) ; 7.8 (dd，1H)，7·9 (d，1H)，8.05 (s5 1H)，8.45 (d，1H)。 (c) 將草醯氯（2.7毫升）和DMF(1滴）加到5·碘基苯幷[b]嘆 吩-2-羧酸（3.05克）/二氯甲烷（30毫升）中，隨即開始冒出 氣體。於停止冒氣後，將混合物蒸乾並將剩餘物溶在 thf(io毫升）中。將該溶液分數份地加到濃氨水（25亳升） 中。於添加完畢後，將混合物攪拌丨小時。過濾收集沉澱 固體’用水洗後眞空乾燥。將該固體（3克）溶在Dmf(15毫 升）中並於0。(：下將該混合物加到d M F ( 2 0毫升）/磷醯氯（3 克）混合物中。將混合物攪拌2小時。之後將混合物加到水 (60毫升）中，過濾收集沉澱固體，用水洗並眞空乾燥而得 2-氰基-5-碘基苯幷[b]嘧吩（2.65克）爲淡黃色粉末；NMr (d6-DMSO) ; 7.9 (dd，1H), 8.0 (d，1H)，8.3 (s，1H)，8.45 (d， 1H) 〇 ’ (d) 將丙烯酸甲酯（2克），三乙胺（2 35克）和乙酸鈀（〇〇5克） 加到2 -氰基-5-碘基苯幷[b]嘍吩（4.8克）/DMF(25亳升） 中並將該混合物置於90°C氬氣下攪拌3〇分鐘。將混合物冷 卻後加到水（5 0毫升）中。過濾收集沉澱固體並溶於氯仿 中。加入活性碳，過濾混合物並將濾液脱水（]V[gS04)。蒸 掉溶劑而得3-(2 -氰基苯幷[b]苯硫-5-基）丙烯酸甲酯（2.5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（70 ) 克）；NMR (d6_DMSO” 3·75 (s，3H), 6.7 (d，1H), 7.8 (d, 1H)，8.0 (dd，1H)，8.2 (d，1H), 8.3 (d5 1H)，8.85 (s，1H)。 (e)將3-(2-氰基苯幷[b]苯硫-5-基）丙烯酸甲酯（2.5克）在 THF(20毫升）中用i〇〇/0披鈀碳（〇 5克）作爲觸媒予以氫化 到用薄層層析術（氧化矽板，用乙酸乙酯/己烷1 : 4洗提） 觀察到大部份起始物已消失爲止。過濾混合物並蒸發而得 雜含〜2 0 %起始物的2 ·氰基苯幷[b ]嘧吩_ 5 -丙酸甲酯（1.45 克）。將氫氧化鈉（0.23克）加到此產物（1.4克）/THF(10毫 升）/水（3毫升）混合物中並將混合物攪拌2小時。用濃鹽 酸將混合物調整到〜PH5並蒸發濃縮去除所含THF。之後 用濃鹽酸將混合物調整到〜pH3並用二氯甲烷萃取混合 物。將萃取物脱水（MgS04)並蒸發。剩餘物經用C18擔體和 4 0 %甲醇/水遞增到7 5 %甲醇/水梯度進行逆相層析術純 化。合併恰當洗提份並蒸發而得白色固體2-氰基苯并[b] 口塞吩-5·丙酸（〇·28 克）。NMR (CDC13) : 2·88 (、2H), 3.1 (t， 2H)，7·4 (d，1H)，7·75 (s5 1H)，7.8 (d，1H)，7.85 (s, 1H)。 j & 例 2 5 Phv-Arg-Ala-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH2 合成係以人工實施，且進行純化，其係使用類似於實施 例 1.4 所述方法，將 Fmoc-Papa-OH(取代 Fmoc-Pip-OH)， Fmoc _保護胺基酸和Fmoc -11 b - Ο Η依恰當順序偶合和去保 護。該產物經類似實施例1 · 4所述方式以HPLC，質譜測定 法和胺基酸分析予以鑑定；RP_HPLC (用含〇· i〇/0 TFA的乙 腈和水洗提，使用3 0分鐘期間内的1 〇 · 5 〇 %乙腈梯度，流 — -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丁 492978 A7 B7 五、發明説明（71 ) 速1·〇毫升/分）滯留時間=17.45分；質譜測定法，m / e(ES + ) 1061.9 (MH+);胺基酸分析得到：Arg 1.94，Ala 4.04，lib 1·02 〇 實施例 2 6 Phv-Arg-Ile-Al 壮- Ilb-Ala-Arg-Al 汪-Papa nh2 用類似於實施例2.6中所述方法在自動合成器（ABI 43 1 ) 上自動進行該合成，將Fmoc-Papa-OH和Fmoc-保護胺基酸 依恰當順序偶合，不同處在於Fmoc-IIb-OH係經人工摻合 的。該產物經類似實施例1 · 4所述方式以HPLC，質譜測定 法和胺基酸分析予以鑑定；RP_HPLC(用含0.1% TFA的乙 腈和水洗提，使用3 0分鐘期間内的1 0 - 5 0 %乙腈梯度，流 速1.0毫升/分）滯留時間=20.7分；質譜測定法，m/e (ES + ) 1103.8 (MH+);胺基酸分析得到 Arg 1·92，Ala 3.03，lib 0.96，lie 1.08 〇 ^~知例 2 7 Phv-Ile-Arg-Ala-IIb-Leu-Arg-Ala-Papa- NH2 合成係經人工實施的，且進行純化，採用類似於實施例 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1.4 所述之程序，將 Fmoc-Papa_OH(取代 Fmoc_Pip-OH)， Fmoc -保護胺基酸和Fmoc-IIb-OH依恰當順序偶合和去保 護。其產物經類似實施例1 · 4所述方式以HPLC，質譜測定 法和胺基酸分析予以鑑定；RP_HPLC (用含0.1% TFA的乙 腈和水洗提，使用3 0分鐘期間内的丨〇 _ 5 〇 〇/〇乙腈梯度，流 速1.0毫升/分）滯留時間= 23.8分；質譜測定法，m / e (ES + ) 1145.7 (ΜίΓ);胺基酸分析得到 Arg 1.98，Ala ____-74-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇χ 297公釐） -- 492978 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（72 ) 1·92，Leu 0.99，lie 1.09，lib 存在。 A-趣例 2 8 Phv-Ala-Arg-Ala-lie-Ala-Ala-Ala-Papa- nh2 合成係用人工實施的，使用類似於實施例i. 4所述方法， 將 Fmoc-Papa_OH(取代 Fmoc-Pip-OH)，Fmoc_ 保護胺基 酸和Fmoc-IIb-OH依恰當順序偶合和去保護。該產物不需 要製備HPLC純化。該產物以類似實施例1.4所述方式經 HPLC，質譜術和胺基酸分析予以鑑定；Rp_HPLC (用含 0· 1% TFA的乙腈和水洗提，使用2 0分鐘期間内的2 0 - 4 0 % 乙膾梯度，流速1.0毫升/分）滯留時間= 10.45分；質譜測 定法，m/e(ES + ) 962.5 (MH+)，492.8 (M+H+Na)++ ;胺基 酸分析得到Ala 4.90，Arg 1.00, lie存在。

Fmoc-IIc-OH係用類似實施例1中對Fmoc-IIb-OH製備 所述程序但在步驟1.1中用甘胺酸甲酯鹽酸鹽取代L -丙胺 酸甲酯鹽酸鹽。得到下列中間體：

Boc-(D)-Met-Gly-OMe ; 80% 產率；NMR (CDC13): 1.4d (s5 9H), 2.0d (m9 1H), 2.Id (m, 1H), 2.Id (s5 3H), 2.6d (t, 2H)，3.8d (s，3H), 4.05d (m，2H)，4.4d (m，1H)，5.3d (bs，1H), 6.8d (bs，1H); 2 - [ ( 3 K) 3 - (H-[第三丁氧羰基]胺基） 2 -氧基-吡咯啶卜 基]乙酸甲酯；50%產率；NMR (CDC13) : 1.45d (s，9H), 2.0d (m9 1H), 2.6d (m9 1H), 3.4d (m, 2H), 3.8d (s, 3H)? 4.05d (q, 2H), 4.1d (m, 1H)? 5.55 (bs9 1H)； 2-[(3EJ-3-(M_-[9 -苐基甲氧羰基]胺基）-2-氧基-吡咯啶- -75 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 冒裝· -訂 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（73 ) 卜基]乙酸；7 5 0/0 產率；NMR(d6DMSO):19d(m，1H)， 2.3d (m，1H)，3.3d (m，2H)，4.0d (q，2H)，4.3d (m，4H)，7.4d (m, 4H)，7.6d (m，2H)，7.9d (d，2H)。 實#__例 29 Arg-Ala_Ala-IIb-Ala-Ala_Ala_Papa_ NH2 合成係在ACT 357自動胜肽合成器上自動進行（使用Rink Amide MBHA樹脂），將Fmoc-Papa-OH和 Fmoc_保護胺基 依恰當順序偶合’不同處在於Fmoc -11 b - Ο Η係經人口組 入者。依照製造商對單一醯化所建議的條件進行自動偶 合，其係在轉移到樹脂之前，用二異丙基碳化二醯亞胺（1 當量）和ΗΟΒΤ(1當量）在DMF中將羧酸（1毫莫耳）活化。進 行約6 0分的醯化後，以類似實施例2 6中所述方式進行洗 務和去保護程序。Fmoc-IIb-OH的人工偶合係在Bond Elut 管内用HBTU/HOBT化學進行。5 -苯基戊酸需要雙重偶合 以得到Kaistr檢驗的正結果。然後，從樹脂切下胜肽並用 類似實施例2 · 6所述程序以製備型rp _ HPLC純化。該產物 經類似實施例1 · 4所述方式以HPLC，質譜測定法和胺基酸 分析予以鑑定；RP-HPLC (用含0.1% TFA的乙腈和水洗 提，使用1 5分鐘期間内的2 0 · 3 5 %乙腈梯度，流速1 .〇毫升 /分）滞留時間=1〇.33分；質譜測定法，111/608+) 976.5 (MH+)，499.9 (M+H+Na)++ ;胺基酸分析得到 Ala 5.02，Arg 1.00, lib 1.22 〇 實施例 3 0_ Phv-Lys( = C(NMe2)2)-Ala-Ala-Ala-Thr_ IIb-Ala-Papa-NH2 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、一''口 丁 492978 A7 ________B7 五、發明説明（74 ) 使用類似實施例15(a)中所述程序，但使用Fmoc-Lys (Boc)-OH取代Fmoc-Dap(Boc)-OH，因而在從樹脂切下 胜肽並用製備型r p · HPLC純化後得到p h v _ L y s A1 a - A1 a _ Ala-Thi*_IIb-Ala-Papa-NH2(270 毫克）。然後將胜肽 (270 ¾克）置於HBTU(94毫克），二異丙基乙胺（88微升）和 DMF (50毫升）混合物中攪拌1 6小時。將混合物蒸發並用 類似於實施例1 5(a)中所述程序以製備型Rp-HPLC純化剩 餘物。該胜肽經類似實施例1 · 4所述方式以HPLC，質譜測 定法和胺基酸分析予以鑑定；RP—HPLC (使用4 0分鐘期間 内的10·40%乙腈梯度，流速ι·2毫升/分）滞留時間= 29.83 分；質譜測定法，m/e(ES+) 1077.27 (ΜΗ+);胺基酸分析 得到Thr 1，〇，Ala 4.3，Arg 1.00，IIb存在；四甲基高精胺 酸存在。 實施例3 13 3

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala - Thr-IIb-Ala-Papa-NHCH2CH2- 嗎啉（實施例3 1 ) P hv-Arg-Ala· Ala-Ala-Thr-lib-Ala-Papa - OCH3 (實施 例3 2 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (實施例 33) 將羥甲基聚苯乙晞樹脂（1.67克，1毫莫耳）與Fmoc-Papa-〇Η(1·5克，4毫莫耳），二異丙基破化二醯亞胺（0.628毫 升，4毫莫耳）和二曱胺基吡啶（61毫克，〇·5毫莫耳）在 DMF(5毫莫耳）和二氣甲烷（20毫升）中於周溫下攪摔2小 -77- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（75 ) 時。濾出樹脂並用DMF(5X20毫升）和甲醇（5x2〇毫升） 洗後，在40°眞空中乾燥（產量2.105克）。然後將胜肽樹脂 轉移到自動合成裔（ABI 430A)並以類似實施例2 · 6中所述 方式偶合其餘的Fmoc -保護胺基酸而得經保護的胜肽樹脂 (2.992克）。之後將胜肽樹脂懸浮在〇^1?(10毫升）/甲醇 (1 0毫升）混合物中，加入4 ·( 2 -胺基乙基）嗎琳（〇· 88毫升） 接著加入催化量的氰化钾（5 0毫克）。置於周溫七天後，過 濾、混合物並用D M F洗樹脂（5 X 2 0愛升）。立即將樹脂再懸 浮於DMF(10毫升）/甲醇（10毫升）/氰化鉀（50毫克）混 合物之中。四天後，過濾混合物並用D M F洗樹脂（5 X 2 0 毫升）。將兩道處理的所有濾、液和洗液合併並蒸乾。於用 90% TFA/H20去保護及蒸發去除揮發性物質之後，以類 似於實施例1.4中所述程序用製備型RP - HPLC純化剩餘物 而得3產物。彼等產物經鑑定如下：

Phv_Arg-Ala-Ala-Ala-Thr_IIb-Ala-Papa-NHCH2CH2_ 嗎琳（4 0毫克）； RP-HPLC(40分鐘期間10·5 0°/〇乙腈梯度，流速1.2毫升/ 分）滞留時間=19.5分；質譜測定法，m / e(ES+) 1119.8 (MH+);胺基酸分析得到 Thr0.58，Ala3.84，Argl.16, IIbl.00;

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala· Thr-IIb-Ala-Papa-OMe (3 7 亳 克）； RP-HPLC (40分鐘期間10-50%乙腈梯度，流速I2毫升/ 分）滞留時間=27.7分；質譜測定法，m / e(ES+) 1021.6 -78- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — ί——----•裝一I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -訂 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（76 ) (MH+);胺基酸分析得到 Thr0 61，Ala3.80，Argl.22, lib 0.97 ；

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH( 155 毫 克）； RP-HPLC(40分鐘期間内1 0-5 0%乙腈梯度，流速I2毫升 /分）滯留時間=24.2分；質譜測定法，m/e(ES+) 1007.5 (MH+);胺基酸分析得到 Thr 0.62，Ala 3.78，Arg 1.20, lib 0.98 〇 實施例3 4

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr_IIb-Ala· Papa _ N(CH2 CH2 ) 2 n_(ch2)2o(ch2)2oh 將4-[2-(2_羥基乙氧基）乙基]六氫吡畊（235毫克）加到 Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH( 135 毫 克），HBTU(51 毫克），DIPEA(47 微升）和 DMF(10 毫升） 的混合物中並將混合物攪拌6 0分鐘。蒸掉揮發物，剩餘物 經類似實施例1.4中所述程序用製備型HPLC純化而得卩1!^-

Arg-Ala-Ala-Ala· Thr-IIb-Ala-Papa-N(CH2 CH2)2 NCH2CH2_OCH2CH2〇H(115毫克）。該胜肽以類似實施例 1.4所述方式經HPLC，質譜術和胺基酸分析予以鑑定； RP-HPLC(用含0.1% TFA的乙腈和水洗提，使用4〇分鐘期 間的10-50%乙腈梯度，流速1.2毫升/分）滞留時間=18 83 分；質譜測定法’ m / e (ES+) 1163 ·8 (MH)+ ;胺基酸分析 得到 Thr 0.62，Ala 3.80，Arg 1.22，lib 0.97。 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 、-=& 492978 A7 B7 五、發明説明（ 77 化學式 P —R1——R2—R3—R4 人 Η

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0 Ra II 〇 Ra lla 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 人 Η

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〇 Ν 〇 CH3 lllb -80 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 492978 89. 4· 11 修正 年"補充 一~^ 8610ΤΓΤ3號專利申請案 中文補充說明書(89年4月） 式I之胜肽與HLA-DR4Dw4之結合係利用說明書中之試驗A所評估。所得 之結果表示為IC5〇值(微莫耳)如下： 1編號 平均ICW微莫耳） 實例編號 平均1C “微莫耳) 1 1.11 18 0.06 2 1.85 19 0.03 3 2.11 20 0.02 4 0.01 21 0.09 5 0.07 22 0.73 6 0.01 23 0.03 7 0.10 24 0.05 8 0.50 25 0.02 9 0.05 26 0.01 10 0.03 27 0.01 11 4.74 28 0.16 12 0.38 29 0.03 13 0.42 30 0.01 14 0.47 31 0.01 15 0.03 32 0.01 16 0.03 33 0.02 17 0.07 34 0.01

U:\TYPE\EN\WKC\ATYPE\B\WKC-1 ,DOC\ 1\TP

Claims (1)

1. 492978 第86102113號專利申請案 Μ中文申請專利範圍修正本(9〇年5月）g88 9C年 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 月曰•厂補充 土_種式I，p-rLrIrLr4之胜肽衍生物，或其醫藥可 接受的鹽，其中 P為5 -苯基戊醯基或3-(2 -氰基苯并[b]苯硫-5-基）丙 醯基； R1為表成AA1-AA2-AA3-AA4-AA5的5L -胺基酸序 列且R3為選自Ala，Gly及Azgly之單一 L_胺基酸；或 R1為表成AA6-AA7-AA8的3L-胺基酸序列且R3為表 成AA9-AA10_AA11的3L-胺基酸序列； AA1 係選自 Ala，lie，Arg，Gap，GapMe4 及 Lys(=C(NMe2)2 ; AA2 係選自 Ala，Arg 及 lie ; AA3係選自Ala及Asn ; AA4 係選自 Lsy，Arg，Ala及 His ; AA5係選自Val及Thr ; AA6 係選自 Ala，Arg 及 lie ; AA7 係選自 Lys，Arg，Ala 及 lie ; AA8 為 Ala ; AA9係選自Ala及Leu ; AA1 0係選自Ala及Arg ; AA1 1 為 Ala ;R2為式II或式III基 本 χ- 人 N Η

   (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 492978 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 其中Ra和Rb係獨立選自氫和（丨-斗㈠烷基且a為亞甲 基；且 R4為NH2或NRcRd其中Rc係選自（卜代）烷基，4_ (胺甲醯基甲基）苯基，4-(羧甲基）苯基，4_(甲氧羰甲基） 苯基’ 2-嗎啉基乙基及式-A^G1基其中Αι為（3C)伸烷 基或A1為式- A2-B2 -基其中A2為對-伸苯基且B2為（ΙΑ C)伸 烷基； 及 G1為式-N = C[N(Rp)2]2基其中各Rp為氫；或 或A1為式- A4-B4基其中A4為對-伸苯基且B4為_CH2_ C0 -且G1為2_嗎淋基乙基胺基或4-[2-(2-輕基乙氧基） 乙基]六氫吡畊-1-基；且Rd為氫；或 R4為4-(2-(2-¾基乙氧基）-乙基）-1-六氫p比ϊτ井基或4_ 胺甲醯基-1 -六氫吡啶基。 2·根據申請專利範圍第1項之胜肽衍生物，或其醫藥可接 受的鹽’其中R4為NHRc其中Rc係選自4-(胺甲醯基甲 基）苯基，4-(2•胍基乙基）苯基，2-嗎啉基乙基及3-胍 基丙基；或R4為4-(2-(2-羥基乙氧基）-乙基六氫吡 口井基或4 -胺甲酿基-1-六氫ρ比淀基。 3·根據申請專利範圍第1項之胜肽衍生物，或其醫藥可接 受的鹽，其中R1為表成ΑΑ1·ΑΑ2-ΑΑ3_ΑΑ4_ΑΑ5的 5L-胺基酸序列，其中ΑΑ4-ΑΑ5係選自 Lys-Val，Arg-Val，Lys-Thr，Arg-Thr，Ala-Val及Ala-Thr;以及 R3係為選自Ala，Gly及Azgly之單一L胺基酸。 4.根據申請專利範圍第1項之胜肽衍生物，或其醫藥可接 -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------_裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T 492978 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 受的鹽，其中R1為表成AA1-AA2-AA3-AA4-AA5的 5 L -胺基酸序列，其係選自 Ala-Ala_Ala-Lys-Val，Ile-Ala-Ala-Arg-Thr, Arg-Ala-Ala-Ala-Val5 Arg-Ala-Ala-Ala-Thr? Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Arg-Val, Ala-Ile-Ala-Arg-Val，Ala-Arg-Ala-His-Val, Ala-Ala-Asn-Arg-Val, Ala-Arg-Ala - Ala-Thr， Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Gap-Ala-Ala-Ala- Thr，GapMe4-Ala-Ala-Ala-Thr， Ala-Ala-Ala-Arg-Thr 及 Lys(=C(Nme2)2-Ala-Ala-Ala-Thr ;以及 R3係為選自Ala，Gly及Azgly之單-L胺基酸。 5. 根據申請專利範圍第1項之胜肽衍生物，或其醫藥可接 受的鹽，其中R1為表成AA6-AA7-AA8的3L-胺基酸序 歹1J，其係選自 Ala-Arg-Ala，Arg-Ala-Ala，Arg-Ile-Ala，Ile-Arg-Ala 及 Ala-Lys-Ala ;以及 R3為表成AA9-AA10-AA11的3L-胺基酸序列者，其 係選自 Ala_Arg_Ala，Leu-Arg-Ala及 Ala_Ala-Ala· 6. 根據申請專利範圍第1至5項之任一項之胜肽衍生物，或 其醫藥可接受的鹽，其中R2為式lib.基 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

   -3 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐） 492978 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 7.根據申請專利範圍第1至5項之任一項之胜肽衍生物，或 其醫藥可接受的鹽，其中該疏水性P基為5 -苯基戊醯 基。 8·根據申請專利範圍第1至5項之任一項之胜肽衍生物，或 其醫藥可接受的鹽，其中R4為4-胺甲醯基-1-六氩吡淀 基，4-(胺甲醯基甲基）苯胺基或4-(2-胍基乙基）苯胺 基。 9·根據申請專利範圍第1項之胜肽衍生物，或其醫藥可接 受的鹽，其係選自 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) Phv-A「g-Ala-Ala-Ala-Val-N’·· Η

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   N\ NH 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 492978 Α8 Β8 C8 D8 申請專利範圍 Phv~AlB~ArQ-Al3- N1 Η 和·

   r^N. Η Ala-Arg-Ala-J^(^-CH2C〇NH; CN

   N 請 先 閎 讀 背 之 注 意 I 旁 裝 H Ala-Arg-Ala$^^-CH2C〇NH2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 或其醫樂可接受的鹽之中者，其中Phv表5 -苯基戊g| 基。 10· —種用於治療第11類Μ H C依賴性T -細胞媒介自體免疫或 發炎性疾病之醫藥組合物，其包括根據申請專利範園第 1項之式I胜肽衍生物或其醫藥可接受的鹽，組合著醫藥 可接受的稀釋劑或載劑。 11·根據申請專利範圍第1 〇項之醫藥組合物，其係用以治鳴 風濕性關節炎或多發性硬化者。 12·根據申請專利範圍第1項之式！胜肽其醫藥可寺 受鹽’其係用於製備治療第11類Μ H C 細胞媒^ 自體免疫或發炎性疾病所用之新穎醫藥。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公董）