PT882066E

PT882066E - Derivados peptidicos

Info

Publication number: PT882066E
Application number: PT97903488T
Authority: PT
Inventors: Ronald Cotton; Philip Neil Edwards; Richard William Arthur Luke
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1996-02-23
Filing date: 1997-02-18
Publication date: 2000-12-29
Also published as: GB9702377D0; KR19990087123A; CZ266398A3; AU1803597A; NZ330944A; HUP9901189A3; BR9707720A; PL328486A1; JP3468528B2; HK1015383A1; HRP970099A2; HUP9901189A2; CN1116305C; AU722877C; AR005974A1; EP0882066A1; CA2242809A1; CN1213379A; WO1997031023A1; IL125804A0

Description

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DESCRIÇÃO "DERIVADOS PEPTÍDICOS" A presente invenção refere-se a um tipo de derivados peptidicos novos que possuem propriedades farmacêuticas úteis para utilização no tratamento de doenças ou condições médicas auto-imunes, como artrite reumatóide e outras doenças mediadas por células T, dependentes do MHC de classe II. A invenção inclui também composições farmacêuticas dos novos compostos químicos, processos para a sua produção e sua utilização no tratamento de uma ou mais das doenças ou condições médicas acima mencionadas e na produção de novos medicamentos para utilização nestes tratamentos médicos. 0 estimulo da resposta imunitária depende do reconhecimento de antigénios proteicos pelas células T. No entanto, as células T não podem responder ao antigénio sozinho, sendo a sua resposta apenas desencadeada pelo antigénio quando complexado com moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) na superfície de uma célula que apresenta antigénios, como uma célula B, macrófago, ou célula dendrítica.

As moléculas do MHC de classe I desencadeiam uma resposta de células T-”killer", que resulta na destruição da célula que transporta o antigénio. As moléculas de MHC de classe II desencadeiam uma resposta de células T ajudantes que controlam a expansão e maturação de células B seleccionadas (i.e. a 1 Γ

produção de anticorpos específicos para os antigénios) e a activação de macrófagos.

Um requisito crítico do sistema imunitário é a capacidade de diferenciar entre antigénios "próprios" e "não próprios" (i.e. estranhos). Esta discriminação é necessária para permitir que o sistema imunitário tenha uma resposta aos agentes patogénicos estranhos, ao mesmo tempo que mantém a tolerância às próprias proteínas, evitando assim o dano dos tecidos normais. Uma doença auto-imune surge quando a tolerância às próprias células se desfaz, permitindo que o sistema imunitário reaja contra os próprios tecidos, como no caso das articulações na artrite reumatóide. Pensa-se que a manutenção da tolerância e portanto o impedimento de surgir uma doença auto-imune, depende de forma crítica da função das moléculas do MHC. A observação de que muitas doenças auto-imunes estão ligadas à hereditariedade de alelos particulares do MHC sugere que as moléculas do MHC têm um papel essencial na patogénese da doença auto-imune. Por exemplo, a esclerose múltipla está ligada à hereditariedade do HLA-DR2, a diabetes mellitus dependente de insulina a HLA-DR3 e/ou HLA-DR4 e a tiroidite de Hashimoto a HLA-DR5. Em particular, existe uma forte associação entre a predisposição ao desenvolvimento da doença inflamatória crónica das articulações, a artrite reumatóide, e a hereditariedade de HLA-DR4Dw4 e/ou HLA-DR4wl4 e/ou HLA-DR1. Pensa-se que as moléculas do MHC associadas com a doença auto-, imune se ligam a alguns antigénios próprios e os apresentam às células T, estimulando assim uma resposta auto-imune. Outros péptidos que se podem ligar às moléculas do MHC associadas com o sistema auto-imune e/ou impedir a ligação ou desalojar antigénios próprios já ligados e/ou que inibem a activação de 2 células Τ (especialmente a actividade de células T patogénicas (e.g. células Th 1)) e/ou que aumentam a actividade das células T protectoras (e.g. células Th 2), ou péptidos que interagem com moléculas do MHC por um mecanismo de acção alternativo, de modo a evitar ou modificar o estímulo de uma resposta auto-imune mediada pelas moléculas do MHC, poderão suprimir de forma especifica uma resposta auto-imune.

Um agente deste tipo poderia oferecer uma terapia para uma doença auto-imune, evitando ao mesmo tempo a supressão geral dos sistema imunitário e limitando deste modo os efeitos secundários prejudiciais. Este tipo de perfil teria vantagens significativas em relação.à terapia corrente para doenças como a artrite reumatóide. É prática usual tratar a artrite reumatóide inicialmente com agentes de alivio dos sintomas, como o NSAIDs, que não têm nenhum efeito benéfico na progressão da doença e estão muitas vezes associados com efeitos secundários indesejáveis. 0 tratamento de doenças mais graves baseia-se na utilização dos designados agentes de segunda linha. Muitas vezes, estes são compostos citotóxicos gerais que têm uma eficácia limitada e podem causar problemas de toxicidade graves. Um agente modificador de doenças, de acção racional, sem ter associada uma citotoxicidade não especifica traria assim benefícios significativos para o tratamento da artrite reumatóide.

Estão descritos péptidos nos pedidos de Patente Internacional com os Nos de publicação WO 92/02543, WO 93/05011 e WO/95/07707 que se ligam a moléculas do MHC e inibem a activação de células T. 3

Embora tenha sido descoberto um número de péptidos que inibem a activação de células T restrita a HLA-DR, por ligação a moléculas de HLA-DR, existe ainda a necessidade de compostos alternativos que se liguem a estas moléculas e/ou impeçam a ligação ou desalojem antigénios próprios já ligados e/ou inibam a activação de células T e/ou aumentem a actividade protectora de células T, ou que interajam com moléculas do MHC por um mecanismo de acção alternativo, de modo a impedir ou modificar o estimulo de uma resposta auto-imune que origine uma doença ou condição, como acima definidas.

Os requerentes descobriram que os derivados peptidicos de acordo com o presente invento (a seguir apresentados) possuem, surpreendentemente, estas propriedades de utilidade farmacológica e esta constitui a base para o presente invento.

De acordo com um aspecto do invento, proporciona-se um derivado peptídico de fórmula I p-r1-r2-r3-r4 em que P é um residuo hidrofóbico como definido nas páginas 9-13; R1 é lima sequência de 5 aminoácidos L e R3 é um único aminoácido L; ou R1 é uma sequência de 3 aminoácidos L e R3 é uma sequência de 3 aminoácidos L; R2 é um grupo de fórmula II (descrita a seguir) ou III (descrita a seguir) , em que Ra e Rb são independentemente seleccionados de entre hidrogénio e (1-4C) alquilo e A é metileno (CHp) ou oxigénio; e R4 é OH, NH2 ou NRcRd, em que Rc é seleccionado de alquilo (1-4C) , 2-carbamoilciclopentilo, 2-piridilmetilo, 4-carbamoil-ciclohexilo, 4-carbamoilciclohexilmetilo, 3-carbamoilfenilo, 4-carbamoilfenilo, 4-(carbamoilmetil)fenilo, 4-(carboximetil)- 4 li.

fenilo, 4-(metoxicarbonilmetil)fenilo, 2-morfolinoetilo e um grupo de fórmula -A1-G1 em que A1 é alquileno (C3-7) ou A' é seleccionado de (1) um grupo de fórmula -A2-B2, em que A2 é p-fenileno ou 1,4-ciclohexileno e B2 é alquileno(Cl-4) ou A2 é metileno e B2 é p-fenileno ou 1,4-ciclohexileno; e (2) um grupo de fórmula -A3-B3-C3, em que AJ é metileno, B3 é p-fenileno ou 1,4-ciclohexileno e C3 é alquileno(Cl-3); e G1 é um grupo de fórmula -N=C [N (Rp) 2] 2, em que cada um de Rp é independentemente seleccionado de hidrogénio, metilo, etilo e propilo; ou A1 é um grupo de fórmula -A4-B4, em que A4 é p-fenileno e B4 é -CH2-CO- e G1 é 2-morfolinoetilo ou 4-[2-(2-hidroxietoxi)-etil]piperazin-l-ilo; e Rd é hidrogénio ou alquilo (Cl-4); ou R4 é 1-piperazinilo, 4-metil-l-piperazinilo, 4-amidino-l-piperazinilo, 4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)-1-piperazinilo, 1-piperidilo ou 1-piperidilo substituído na posição 4, em que os substituintes na posição 4 são seleccionados de carboxi, carbamoilo, N- (2-aminoetil)carbamoilo e N-(4-aminobutil) -carbamoilo; ou R4 é uma sequência de 1 a 6 aminoácidos ou uma amina sua derivada ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável.

Deverá entender-se que um aminoácido de R4 pode ter independentemente a estereoquímica D ou L. Para além disso, quando R4 é definido como hidroxilo (OH), deve entender-se que este é um grupo hidroxilo do aminoácido do terminal C de R3. De modo idêntico, quando R4 é definido como NH2, NRcRd, piperazinilo, piperidilo, etc., significa que o grupo hidroxilo do aminoácido do terminal C de R3 é substituído por um grupo deste tipo. Deverá também entender-se que quando se refere um 5 Γ aminoácido, este é um alfa-aminoácido. Também deverá entender-se que quando se faz referência a um aminoácido L, também se incluem aminoácidos como a Gly, 2,2-dietilGly, aza-alanina e azaglicina, que não possuem nenhum átomo de carbono quiral. Deverá ainda entender-se que os termos genéricos como "alquilo" incluem variantes tanto de cadeia linear como ramificada, sempre que o número de átomos de carbono assim o permita. Aplica-se a mesma convenção a outros radicais. É bem conhecido na arte que os compostos com um centro quiral podem existir na forma de racemato (ou mistura de diaestereoisómeros, quando existe mais do que um centro quiral) ou como um enantiómero ou diastereoisómero opticamente activo. Também é bem conhecido na arte que uma actividade biológica particular associada com uma mistura racémica ou diastereomérica pode resultar em grande parte ou apenas de um único isómero opticamente activo. Deverá assim entender-se que a invenção se refere a qualquer forma de um derivado peptídico de fórmula I, que possui as propriedades farmaceuticamente úteis acima mencionadas. É bem conhecido na arte o modo de obtenção de um único isómero opticamente activo, por exemplo por separação de uma mistura racémica ou diastereomérica que contém o isómero, utilizando técnicas convencionais, como a cromatografia, ou por síntese quiral utilizando um material de partida ou intermediário opticamente activo adequado, como aqui exemplificado. Também é bem conhecido na arte o modo de determinação das propriedades farmacológicas destas misturas racémicas ou diastereoméricas, e os isómeros individuais opticamente activos, por exemplo utilizando os testes aqui descritos. 0 perito na arte é assim facilmente capaz de obter os isómeros particulares dos derivados peptídicos de fórmula I, com as propriedades farmacológicas benéficas aqui referidas. 6 Λ p ^^

Deverá também entender-se que o presente invento também inclui qualquer forma polimórfica, qualquer tautómero ou solvato, ou qualquer mistura sua derivada de um derivado peptidico de fórmula I, que possui as propriedades farmacológicas benéficas aqui referidas.

Exemplos independentes adequados para os α-aminoácidos que compreendem R1 e incluem, por exemplo, os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente codificados pelo código genético, em particular a alanina (Ala), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), lisina (Lys), asparagina (Asn), glutamina (Gin), arginina (Arg), treonina (Thr), valina(Val) e prolina (Pro). Os aminoácidos como a sarcosina (Sar), 3,3,3-trifluoroalanina, 2,2-dietilglicina, ácido 2,3-diaminopropanóico (Dap), ácido 2,4-diaminobutanóico (Dab), ácido 2-aminobutanóico (Abu), homoarginina, homofenilalanina, trans-4-hidroxiprolina (Hyp), aza-alanina [H2N-N (CH3) -COOH; Azala], azaglicina [H2N-NH-COOH;Azgly], ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico (Tic), ácido octa-hidroindol-2-carboxílico (Oic) , ácido decahidroisoquinolina-3-carboxílico (Dic), são também adequados. (Quando se utiliza o termo Dic significa as formas em que as junções de anel têm ambas a configuração R ou têm ambas a configuração S) . Também se podem utilizar os aminoácidos metilados em N2 correspondentes, bem como os aminoácidos correspondentes em que a função ácido carboxílico da cadeia lateral livre está esterificada (por exemplo como um éster de alquilo (Cl—6) ou benzilo) e um grupo amino da cadeia lateral livre está alquilado (por exemplo metilado) , acetilado ou convertido a um carbamato (por exemplo, um carbamato de alquilo (como metilo ou etilo), fenilo ou benzilo). Outros exemplos adequados para R1 e RJ incluem, por exemplo, glicina substituída na posição 2, em 7

ί u

que o substituinte na posição 2 é um grupo de fórmula -(CH2)'SNH2, em que s é 1 a 3, ou um grupo de fórmula - (CH2) pN (Re) 3*X~, em que p é 2 a 4 e X' é um contra ião (como acetato, trifluoroacetato, hidróxido ou cloreto) ou um grupo de fórmula - (CH2) qN (Re) 2 em que q é 0 a 4, ou um grupo de fórmula - (CH2) rN=C [N (Re) 2] 2, em que r é 1 a 4, em que nos últimos três grupos cada Re é independentemente seleccionado de entre hidrogénio e alquilo (Cl-4) (como metilo ou etilo).

Um exemplo de R1 de interesse particular quando este é uma sequência de 5 aminoácidos inclui, por exemplo, uma sequência em que o quinto aminoácido (lido da esquerda para a direita) é Vai ou Thr e uma sequência em que o quarto e quinto aminoácidos são Lys-Val, Arg-Val, Lys-Thr, Arg-Thr, Ala-Val ou Ala-Thr.

Um exemplo particular para R1' quando este é uma sequência de. 5 aminoácidos inclui, por exemplo, Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Ala-Lys-Ala-Ala-Val, Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Val, Ala-Lys-Ala-Lys-Val, Ala-Arg-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Lys-Val, Ala-Lys-Ala-Arg-Val, Ile-Ala-Ala-Arg-Thr, Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Ala-Ile-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-His-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Asn-Arg-Val ou X-Ala-Ala-Ala-Thr em que X é NH.CH [CH2NH.C (=NH) .NH2] .C0- (daqui para a frente referido como "Gap"), OU NH.CH [CH2N=C [N (CH3) 2 ] 2 - C0- (daqui para a frente referido como r,GapMe4"), em que Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Gap-Ala-Ala-Ala-Thr e GapMe4-Ala-Ala-Ala-Thr são preferidos. Prefere-se em particular Arg-Ala-Ala-Ala-Val e Arg-Ala-Ala-Ala-Thr . 8 V Γ u

Um exemplo de R1 de interesse particular quando este é uma sequência de 3 aminoácidos inclui/ por exemplo uma sequência em que o aminoácido adjacente a R2 é Ala e uma sequência em que o segundo e terceiro aminoácidos (lidos da esquerda para a direita) são Lys-Ala, Arg-Ala, Ile-Ala e Ala-Ala.

Um exemplo de R1 de interesse especial quando este é uma sequência de três aminoácidos inclui, por exemplo, Ala-Lys-Ala, Ala-Arg-Ala, Arg-Ala-Ala, Arg-Ile-Ala e Ile-Arg-Ala, em especial Ala-Arg-Ala.

Um exemplo de R3 de interesse particular quando este é uma sequência de três aminoácidos inclui, por exemplo, uma sequência em que o primeiro aminoácido (lido da esquerda para a direita, i.e. adjacente a R2) é Ala ou Leu.

Um exemplo preferido para R3 quando este é uma sequência de três aminoácidos inclui, por exemplo, Ala-Ala-Ala, Leu-Arg-ala e em especial Ala-Arg-Ala.

Um exemplo de R3 preferido quando este é um único aminoácido inclui, por exemplo, Ala, Gly e Azgly, em especial Ala.

Exemplos particulares para Ra e Rb quando estes são alquilo incluem, por exemplo, metilo, etilo e propilo.

Um exemplo de Ra e Rb preferido inclui, por exemplo, hidrogénio e metilo.

Um exemplo adequado para o resíduo hidrofóbico P (que, como deve notar-se, está ligado ao grupo amino do aminoácido do 9 \1 L-Cj terminal-N de R1) inclui, por exemplo, um grupo hidrofóbico orgânico, como um grupo orgânico alifático, aromático, heteroaromático ou misto alifático/aromático ou alifático/heteroaromático, hidrofóbico com desde 5 a 20 átomos de carbono (sendo 1, 2 ou 3 heteroátomos seleccionados de entre oxigénio, enxofre e azoto para os grupos contendo heteroarilo), por exemplo, um grupo de fórmula R-, R.CO-, R.SO2-, R.O.CO-, R.NHCO-, R.O.CS-, R.S.CO-, R.NHCS-, R.S.CS- e R.CS-, em que R inclui, por exemplo, alquilo(C5-10), arilo, heteroarilo, arilalquilo(C2-10), heteroarilalquilo(C2-10), diarilalquilo(C2-8), arilalquenilo(C2-10), arilciclopropil, cicloalquilo(C5-10) , cicloalquil(C2-10)alquilo(C2-6), 3-bifenilo, 4-bifenilo, 4-ciclohexilfenilo, 2-naftiloximetilo, 3-naftiloximetilo, fenoxifenilo e tetrahidronaftilo, um grupo arilo ou heteroarilo em que os exemplos de R podem conter um ou mais substituintes alquilo(Cl—4), halogéneo, ciano ou alcoxi(Cl-4). Uma forma de concretização particular da invenção inclui, por exemplo, derivados peptidicos de fórmula I, em que P é R.CO-, como acima definido. Outra forma de concretização particular da invenção inclui, por exemplo, derivados peptidicos de fórmula I, em que P é um grupo orgânico alifático, aromático ou alifático/aromático, hidrofóbico de 5 a 20 átomos de carbono.

Exemplos particulares de R incluem, por exemplo, quando este é alquilo(C5-10): pentilo, isopentilo, terc-pentilo, 2-, metilpentilo, hexilo, isohexilo, 5-metilhexilo e octilo; quando é arilo: fenilo, naftilo e indenilo; quando é heteroarilo: 2-,3-,5-, ou 6-indolilo, 2-, 3-, 5- ou 6-indolinilo, 2-, 3-, 5-ou 6-benzo[b]tiofenilo, tienilo, 2-, 4- ou 5-benzotiazolilo, 2-, 4- ou 5-benzoxazolilo, 2-, 4- ou 5-benzimidazolilo, 1,4-benzodioxanilo ligado na posição 2-, 3-, 6- ou 7- e 2-, 3-, 5-ou 6-benzofuranilo; quando é arilalquilo(C2-10): arilalquilo- 10 r (C2-6) (em que a porção arilo inclui, por exemplo, qualquer dos exemplos específicos para arilo, referidos acima e a porção alquilo(C2-6) inclui, por exemplo, metileno, etileno, trimetileno, tetrametileno e pentametileno), como 2-feniletilo, 3-fenilpropilo, 4-fenilbutilo e 5-fenilpentilo; quando é heteroarilalquilo(C2-10):heteroarilalquilo(C2-6) (em que a porção heteroarilo inclui, por exemplo, qualquer dos exemplos específicos para heteroarilo acima referidos e a porção alquilo(C2-6) inclui, por exemplo, metileno, etileno, trimetileno, tetrametileno e pentametileno), tal como no 2— (2— cianobenzo[b]tiofen-5-il)etilo; quando é diarilalquilo(C2-8) : diarilalquilo(C2-6), como 2,2-difeniletilo, 3,3-difenilpropilo e 4,4-difenilbutilo; quando é arilalquenilo(C2-10): arilalquenilo(C2-6) como estirilo, 3-fenilpropen-2-ilo e 4-fenilbuten-l-ilo; quando é arilciclopropilo: fenilciclopropilo, 1-naftilciclopropilo e 2-naftilciclopropilo; quando é cicloalquilo(C5-10): ciclopentilo, ciclohexilo e 1-adamantilo; quando é cicloalquil(C5-10)alquilo(C2-6): 2-(ciclohexil)etilo, 3-(ciclohexil)propilo e 4-(ciclohexil)butilo. Um exemplo particular para um substituinte num grupo arilo de R inclui, por exemplo, metilo, etilo, cloro, bromo, iodo, metoxi, etoxi e ciano. 0 resíduo hidrofóbico P inclui também, por exemplo, um aminoácido L hidrofóbico, como a fenilalanina (Phe) e análogos seus derivados hidrogenados, como a ciclohexilalanina (Cha), para-cloroPhe, 3-(2-tienil)alanina, tirosina (Tyr), Tyr(Ometil), triptofano (Trp), bifenilalanina, 3— (1— naftilalanina, 3-(2-naftil)alanina e análogos seus derivados hidrogenados, 3-(1-adamantil)alanina) (Ada), Glu(OBenzil), 3-(benziloxi)Ala, 3-(benzilsulfanil)Ala e 9-fluorenilGly, podendo cada um destes possuir, opcionalmente, no terminal-N, 11 um grupo orgânico alifático, aromático, heteroaromático ou misto alifático/aromático ou alifático/heteroaromático, hidrofóbico, como definido ou exemplificado acima. Alternativamente, o aminoácido hidrofóbico pode conter opcionalmente, por exemplo, outra sequência de 1 a 3 aminoácidos seleccionados de quaisquer dos exemplos para R1 e R3 acima definidos. Por exemplo, P inclui as sequências particulares Ala-Cha, Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe e Ala-Ala-Ala-Phe. 0 primeiro aminoácido desta outra sequência de 1 a 3 aminoácidos (lida da esquerda para a direita) pode ser um aminoácido -L ou -D e pode ter também, opcionalmente, um grupo orgânico alifático, aromático, heteroaromático ou misto alifático/aromático ou alifático/heteroaromático, hidrofóbico, como definido ou exemplificado acima.

Outros exemplos particulares de P incluem, por exemplo, 3-(benziloxicarbonil)propionil-Phe, 3-(benziloxicarbonil)-propionil-Cha, 4-(benziloxicarbonil)butiril-Phe, 4-(benziloxicarbonil) butiril-Cha, (5-oxo-pirrolidin-2-il)carbonil-Phe-Tyr, (5-oxo-pirrolidin-2-il)carbonil-Glu(OBenzyl)-Tyr, acetil-Glu-(OBenzil)-Tyr, difenilmetil,CONH.CH2CH2.CO-Cha, difenilmetil.-CONH. CH2CH2 .CO-Tyr, difenilmetil. CONH. CH2CH2CH2. CO-Cha, difenilmetil . CONH. CH2CH2CH2. CO-Tyr, difenilmetil .NHCO. CH2CH2CH2. CO-Cha, difenilmetil.NHCO.CH2 CH2CH2. CO-Tyr, benzil .NHCO. CH2CH2. CO-Cha, benzil.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr, N-acetil-4-cloro-beta-hidroxiPhe, 4-fenoxifenil.NHCO-, benzil.NHCO.CH2CH2.CO. (N-metilPhe), benzil.-NHCO.CH2CH2 CONH.CH (CHPh2) .CO, benzil.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr, 3, 3-difenilpropionilo, trans-cinamoilo, 5-fenilvalerilo e 3—(2— cianobenzo[b]tiofen-5-il)propionilo. 12

Um exemplo de P de interesse particular inclui, por exemplo, Ph (CH2) 4 .C0- (5-fenilvaleril (Phv) ) , Ph.(CH2)4-CS e 3-(2-cianobenzo[b]tiofen-5-il)propionilo.

Um exemplo preferido para o resíduo hidrofóbico P inclui, por exemplo, 3-(2-cianobenzo[b]tiofen-5-il)propionilo e 5-fenilvaleril (Phv), especialmente o último.

Quando Rc é um grupo de fórmula -A1-G1, um exemplo particular para A1 quando este é alquileno inclui, por exemplo, metileno, etileno, propileno e butileno; um exemplo particular para B2 quando este é alquileno(Cl-4) inclui, por exemplo, metileno, etileno e propileno; e um exemplo particular para C3 quando este é alquileno(Cl-3) inclui, por exemplo, metileno, etileno e propileno.

Um exemplo particular para Α'-G1 inclui, por exemplo, 3-guanidinopropilo, 4-(2-guanidinoetil)fenilo, 4-(2-morfolino-etil.NHCO.CH2) fenilo e 4-(4-[2-(2-hidroxietoxi)etil]piperazin-l-il.CO.CH2) fenilo.

Um exemplo particular para R4 quando este é uma sequência de 1 a 6 aminoácidos, ou uma amida sua derivada inclui, por exemplo, uma sequência de aminoácidos -L independentemente seleccionados de entre quaisquer dos exemplos de R1 e R3 acima definidos (como Ala-Thr-Gly-OH) ou os seus análogos D, ou uma sequência que contém tanto aminoácidos D como L, ou uma amida sua derivada, como uma amida derivada de amoníaco, uma alquil(Cl-4)amina (como metilamina) ou uma di-alquil(Cl-4)amina (como dimetilamina) . Um grupo particular de exemplos de R4 inclui, por exemplo, os exemplos aqui definidos, em que R4 não é uma sequência de 1 a 6 aminoácidos. 13 Γ L-Cj ^^3*.

Um exemplo preferido para R4 inclui, por exemplo, 4-carbamoil-l-piperidilo (o resíduo de piperidina-4-carboxamida (Pip-NH2)), 4-carboxi-l-piperidilo (o resíduo de ácido piperi-dina-4-carboxílico (Pip-OH)), 4-(carbamoilmetil)anilino (o resíduo de 4-aminofenilacetamida (Papa-NH2) ) , 4-(carboxi-metil)anilino (o resíduo de ácido 4-aminofenilacético (Papa-OH) ) e 4-(2-guanidinoetil)anilino (o resíduo de 2-(4-amino-fenil)etilguanidina (Pape-NHC(=NH)NH2) .

Um grupo particular de exemplos de R4 inclui, por exemplo Pip-NH2, Papa-NH2, Pape-NHC (=NH) NH2 e NHRc, em que Rc é 3-guanidinopropilo, 2-morfolinoetilo ou 4-(2-(2-hidroxietoxi)-etil-l-piperazinilo.

Um exemplo de R2 preferido inclui, por exemplo, um grupo de fórmula II, especialmente lia e mais especialmente Ilb.

Um grupo preferido de derivados peptídicos de fórmula I inclui, por exemplo, derivados peptídicos em que Rl é uma sequência de cinco aminoácidos L e R3 é um único aminoácido L, em que a sequência R1 e RJ tem qualquer dos exemplos acima definidos, incluindo os exemplos particulares e preferidos para R1 e R3. Dentro deste grupo, um subgrupo de derivados peptídicos particularmente preferidos inclui, por exemplo, aqueles em que R2 é um grupo de fórmula II, especialmente lia e mais especialmente Ilb. Um outro subgrupo de derivados peptídicos particularmente preferidos inclui, por exemplo, aqueles em que R4 é Pip-OH, -Pip-NH2, Papa-OH ou Papa-NH2. Um subgrupo especialmente preferido de compostos inclui, por exemplo, aqueles em que R3 juntamente com R4 é Ala-Pip.NH2 ou Ala-Papa-NH2. 14 jj u, ^

Outro grupo preferido de derivados peptidicos de acordo com a invenção inclui, por exemplo aqueles em que R1 é uma sequência de 5 aminoácidos L representada por AA1-AA2-AA3-AA4-AA5 em que: AA1 é seleccionado de entre Ala, Ile, Tyr, Vai, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4 e 3,3,3-trifluoroalanina, particularmente Ala, Ile, Arg, Gap e GapMe4, especialmente Ala, Arg e GapMe4 e mais especialmente Ala e Arg; AA2 é seleccionado de entre Ala, Lys, Glu, Sar, Vai, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-trifluoroalanina e N6-dietilLys, particularmente Ala, Arg, Ile, Lys e Tic, especialmente Ala, Arg, Lys e Ile e mais especialmente Ala e Arg. AA3 é seleccionado de entre Ala, His, Gin, Vai, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn e N3-dietilDap, particularmente Ala, His, Asp e Asn, especialmente Ala e Asn e mais especialmente Ala; AA4 é seleccionado de entre Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His e N6-dietilLys, particularmente Ala, Arg, Lys e His, especialmente Ala, Arg e His e mais especialmente Ala; e AA5 é seleccionado de entre Thr, Vai, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn e N3-dietilDap, particularmente Thr, Vai e Dap e especialmente Thr e Vai; e R3 é um único aminoácido L seleccionado de entre Ala, Gly, Dap, aza-alanina e azaglicina, particularmente Ala, Gly e azaglicina, especialmente Ala e Gly e mais especialmente Ala; e em que P, R2 e R4 são qualquer dos exemplos, incluindo os 15 L-Ij )=^- exemplos particulares e preferidos acima definidos. Dentro deste grupo, um subgrupo particular de compostos inclui, por exemplo, aqueles em que a sequência AA1-AA2-AA3-AA4-AA5 é seleccionada de entre Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Ile-Ala-Ala-Arg-Thr, Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Arg-Val, Ala-Ile-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-His-Val, Ala-Ala-Asn-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Gap-Ala-Ala-Ala-Thr, GapMe4rAla-Ala-Ala-Thr e Ala-Ala-Ala-Arg-Thr. Os compostos em que R4 é Pip-NH2, Papa-NH2 e Pape-NHC(=NH)NH? são preferidos.

Um outro grupo preferido de derivados peptidicos de acordo com o invento inclui, por exemplo, aqueles em que R1 é uma sequência de 3 aminoácidos L representada por AA1-AA2-AA3 em que: AA1 é seleccionado de entre Ala, Ile, Tyr, Vai, Glu, Lys, Arg,

Gly, Gap, GapMe4 e 3,3,3-trifluoroanilina, particularmente Ala,

Ile, Arg, Gap e GapMe4 especialmente Ala, Arg e GapMe4 e mais especialmente Ala e Arg; AA2 é seleccionado de entre Ala, Lys, Glu, Sar, Vai, Arg, Gly, Pro, Ile, Lys e Tic, 3,3,3-trif luoroanilina e N6-dietilLys, particularmente Ala, Arg, Ile, Lys e Tic, especialmente Ala, Arg, Lys e Ile e mais especialmente Ala e Arg; AA3 é seleccionado de entre Ala, His, Glc, Vai, Thr, Glu, Gly,

Asp, Asn e N3-dietilDap, particularmente Ala, His, Asp e Asn, especialmente Ala e Asn e mais especialmente Ala; e R3 é uma sequência de 3 L-aminoácidos, representada por AA6-AA7-AA8, em que: AA6 é seleccionado de entre Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar,

His e Dap, particularmente Ala, Leu e Pro e especialmente Ala: 16 t L-Ci AA7 é seleccionado de entre Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic e Dic, especialmente Ala e Arg; e AA8 é seleccionado de entre Ala, Gly, Dap, aza-alanina e azaglicina, particularmente Ala, Gly e azaglicina e especialmente Ala; e P, R2 e R4 são qualquer dos exemplos, incluindo os exemplos particulares e preferidos, acima definidos. Neste grupo, um subgrupo particular de compostos inclui, por exemplo, os compostos em que a sequência AA1-AA2-ΑΆ3 é seleccionada de Ala-Lys-Ala e Ala-Arg-Ala e a sequência AA6-AA7-AA8 é seleccionada de Ala-Ala-Ala e Ala-Arg-Ala. Os compostos em que R^ é Pip-NH2, Papa-NH2 e Pape-NHC(=NH)NH2 são preferidos.

Um aspecto preferido do presente invento compreende derivados peptidicos de .fórmula I, em que R2 é um grupo de fórmula II (e especialmente em que A é metileno) , e mais especialmente Ilb e P e R1, R3 e R4 são qualquer exemplo, incluindo os exemplos particulares e preferidos acima definidos.

Um outro aspecto preferido do presente invento compreende derivados peptidicos de fórmula I que contêm um resíduo de arginina, particularmente compostos em que o primeiro resíduo de aminoácidos de R1 (lido da esquerda para a direita) quando este é uma sequência de 5 aminoácidos L, é arginina (como por exemplo Arg-Ala-Ala-Ala-Val e Arg-Ala-Ala-Ala-Thr) e compostos em que o segundo resíduo de aminoácidos de R1 quando este é uma sequência de 3 aminoácidos L é arginina e/ou o segundo resíduo de aminoácidos de R3 quando este é uma sequência de 3 aminoácidos L é arginina (tal como quando R1 é Arg-Ala-Ala e R2 é Ala-Ala-Ala ou quando R1 e R2 são ambos Ala-Arg-Ala) . 17 r

Um outro aspecto do presente invento compreende derivados peptidicos de fórmula I em que R2 é um grupo de fórmula IIIa ou Illb e P, R1, R3 e R4 são qualquer dos exemplos, incluindo os exemplos particulares e preferidos acima descritos. Na EP-A-284942 e DE-A-4034829 estão descritos péptidos semelhantes, embora com um número menor de residuos de aminoácidos.

Os compostos de acordo com a invenção de interesse particular incluem, por exemplo, as concretizações especificas descritas nos Exemplos seguintes. De entre estes, os compostos dos Exemplos 5, 16, 19, 23 e 34 têm importância especial e estes compostos, ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, são proporcionados como outras caracteristicas da invenção. (SEQID NO:5)

ΡΙιν-Α^-ΑΙβ-ΑΙβ-Αίθ-νθ^..... H

(SEQ ID NO: 17)

Me2N

Phv—^

X

v .NMe.r .N

CO -Ala-Ala-Ala-Thr-N H

CH.CONH, O (SEQ U) NO:20)

O

Gly-β-

NH ,tNH'

H 18

Λ V rli (SEQID N024)

I-1 O •CHjCONHj

Phv-Ala-Arg-Ata-N.....-Ala-Arg-Ala-N

Exemplo 23

(SEQ: ID NO: 25) CN

Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, para os derivados peptídicos suficientemente básicos, por exemplo os que têm um grupo âmino livre, sais com ácidos que formam aniões fisiologicamnete aceitáveis, tais como sais com ácidos minerais, por exemplo halogenetos de hidrogénio (como cloreto de hidrogénio e brometo de hidrogénio), ácido sulfónico e fosfónico e com ácidos orgânicos, como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, p-toluenossulfóniço, metanossul-fónico, trifluoroacético e semelhantes, e para derivados peptídicos que são suficientemente acídicos, por exemplo aqueles que têm um grupo carboxílico livre, sais com bases que formam catiões fisiologicamente aceitáveis, como sais com metais alcalinos (como sódio e potássio), metais alcalino-terrosos (como magnésio e cálcio) , sais de alumínio e de amónio, bem como sais com bases orgânicas adequadas, como etanolamina, metilamina, dietilamina, isopropilamina, trimetilamina e semelhantes. 19 r— U, ^ 11 '

Tal como referido acima, os derivados peptidicos de fórmula I, ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, terão um efeito farmacológico benéfico em animais de sangue quente (incluindo o homem), numa gama de doenças ou condições médicas auto-imunes, no tratamento de sintomas, ou como agente modificador da doença ou como tratamento profilático. Estas doenças podem incluir, por exemplo, artrite reumatóide, esclerose múltipla, síndroma de Goodpasture, púrpura trombocitopénica idiopática, artrite reumatóide juvenil, doença coelica, lúpus erithematosus sistémico, espondilite anquilo-sante, síndroma de Sjogren, myasthenia gravis, diabetes do tipo I (dependente de insulina), doença de Hashimoto, doença de Grave, doença de Addison, escleroderma, poliomiosite, dermato-miosite, pemphigus vulgaris, bullous pemphigoid, anemia hemolítica auto-imune, anemia perniciosa, glomerulonefrite, rejeições de enxertos e semelhantes, especialmente artrite reumatóide e esclerose múltipla. A utilidade dos derivados peptidicos de fórmula I, ou dos sais seus derivados farmaceuticamente aceitáveis, pode ser determinada utilizando uma variedade de testes e estudos clínicos padrão, incluindo os descritos no pedido de patente Internacional, No de publicação WO92/02543, W093/05011 e W095/07707 (ou suas modificações) e os a seguir descritos. Os derivados peptidicos de fórmula I mostram uma actividade significativa num ou mais destes testes ou estudos.

Teste A: Teste de ligação in vitro do péptido HLA-DR purificado (este teste pode ser utilizado para demonstrar a ligação de derivados peptidicos de fórmula I a moléculas de classe II do MHC associadas com a doença). Incubam-se 30 μΐ de biotina-péptido FHA3o7-32o (péptido FHA (307-320) , derivatizado com 20 biotina de cadeia longa no terminal-N, Biotina-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) a 800 nM em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 30 μΐ de HLA-DR4Dw4 purificado a uma concentração entre 0,5 e 5 μg/ml e placas de microtitulo com poços em V (Nunc) durante 48 horas, com ou sem péptidos inibidores. No final do período de incubação, transferem-se 100 μΐ do incubado para placas (Nunc) de ensaio imunoadsorvente ligado a enzimas (ELISA), previamente revestidas com um anticorpo anti-MHc (L243-American Type Culture Collection (ATCC) HB55- como descrito em Lampson e Levy (1980) J. Immunol. 125, 293-299) a uma concentração de 10 μg/ml, durante 1 hora à temperatura ambiente e em seguida bloqueia-se durante 1 hora com albumina de soro bovino (BSA) a 1% em PBS e Tween 20 a 0,05%. Após mais um período de 1 hora, remove-se por lavagem o péptido não ligado e adiciona-se uma diluição 1/4.000 de peroxidase de estreptavidina (Sigma) em PBS com 0,01% de um detergente adequado, como o NP-40 (Sigma), durante 2 horas à temperatura ambiente- Após nova lavagem, adiciona-se a cada uma das placas, uma solução de substracto tetrametilbenzideno (TMB) (1 comprimido de TMB (Sigma) em 10 ml de tampão citrato/acetato 0,1 M, pH 6,0 com 3,6 μΐ de peróxido de hidrogénio ureia (UHPO) (Fluka)). A reacção é parada por adição de ácido sulfúrico 2M (10 μΐ por poço) e lê-se a absorvância a 450 nm para quantificar a quantidade de péptido ligado. A actividade inibitória dos péptidos é obtida através do gráfico da absorvância em função da concentração. 21

0 HLA-DR4Dw4 purificado pode ser obtido como se segue: (i) Expressão de HLA-DR no sistema Baculovirus A expressão de proteínas recombinantes em células de insecto, a partir de vectores de baculovirus é um processo estabelecido, para a obtenção de rendimentos elevados de proteína recombinante [Luckow, VA & Summers, MD, 1988, Biotechnology, 6, 47-551]. A fim de permitir a expressão do HLA-DR heterodimérico, e.g. HLA-DR4Dw4, a partir de um único vector baculovirus recombinante (ao contrário de ter vírus recombinantes separados para as cadeias α e β e fazer em seguida a co-infecção), constrói-se um baculovirus recombinante que transporta ambas as cadeias α e β.

Faz-se a clonagem de um ADNc que codifica para a sequência do polipéptido oc no vector de transferência pacYMl [Matsuura, Y; Possee, RD; Overton, HA & Bishop, DHL, 1987, J.Gen. Virol., 68, 1233-1250] de modo a colocar a expressão da proteína sob o controlo do promotor polihedrina. A unidade é inserida no genoma do baculovirus por recombinação homóloga em células de insecto Sf21, a fim de criar um único baculovirus recombinante para a cadeia a. As técnicas para a cultura e infecção das células de insecto, para a recombinação homóloga e detecção/isolamento dos vírus recombinantes estão descritas de forma completa por Summers, MDD & Smith GE (1987) [A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell culture Procedures; Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin No. 1555]. As técnicas de genética molecular utilizadas para construir os vectores recombinantes são de igual modo facilmente acessíveis na literatura e estão descrita de forma bastante completa por Sambrook, J.; Fritsch, EF & Maniatis T. 22 rj-- L---- 111.1. n·^ (1989) [Molecular Cloning. A laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. A fim de criar o baculovírus recombinante duplo, faz-se a clonagem de um ADNc que codifica para a cadeia β no vector de transferência pAcUWl [Weyer, U; Knight, S & Possee, RD, 1990, J. Gen. Virol., 71, 1525-1534], a fim de colocar a expressão da proteína sob o controlo do promotor PIO. A unidade é em seguida inserida no genoma do baculovírus recombinante único, que transporta a cadeia a. Os vírus recombinantes duplos são detectados colocando as células de insecto, infectadas com vírus escolhidos ao acaso da transfecção, em membranas e fazendo a sua reacção com um anticorpo monoclonal, e.g. L243, o qual reconhece de forma específica o heterodímero HLA-DR. A ligação do anticorpo a células de insecto Sf21 é detectada utilizando técnicas de citometria de fluxo convencionais, facilmente acessíveis na literatura. Os baculovírus recombinantes duplos, estáveis, que expressam a HLA-DR são purificados em placas. (ii) Purificação de HLA-DR a partir de células de insectos O método utilizado é uma modificação do método descrito por Gorga et al. 1987 (Gorga et al. 1987, J. Biol. Chem. 262, 16087-16094). Os baculovírus que expressam HLA-DR/células Sf21 (10 1, que é aproximadamente igual a 2 x IO10 células) são solubilizados em 100 ml de EDTA 5 mM (sal de sódio), Tris-HCl 50 mM pH 8,5, NP40 a 2%, NaCl 150 nM, iodoacetamida 1 mM, PMSF 1 mM por homogeneização com 10 voltas num homogenizador de vidro teflon. 0 homogenato é girado a 100.000 x g durante 1 hora e o sobrenadante é recolhido. O anticorpo monoclonal anti-HLA-DR LB3.1 (Gorga et al., 1986, Cell. Immunol. 103, 160-172) 23

V lí t ligado de forma covalente, a uma razão de 50 mg de L243 para 10 ml de Proteína A-Sepharose fast flow (Pharmacia) e pré-incubado com Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NP-40 a 0,1%, é incubado durante a noite com o sobrenadante. A resina é em seguida colocada numa coluna e lavada com Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NP-40 0, 1% (20 volumes de coluna) seguido de NaCl 0,15 M, Na2HP04 50 nM, pH 7,0, octilglucósido a 0,1% (20 volumes de coluna). O HLA-DR é eluído com dietilamina 50 mM, pH 11,0, NaCl 0,15 M, octilglucósido a 1%. As fracções da coluna são imediatamente neutralizadas com Tris-HCl 1M pH 8,0 e concentradas por ultracentrifugação através de uma membrana centricon-10. O conteúdo em proteínas é determinado por um.teste de proteínas BCA (Pierce) e a pureza por electroforese SDS-PAGE.

Em geral, os derivados peptídicos de fórmula I como acima definidos, que foram testados no teste A, apresentaram uma inibição significativa a uma concentração de cerca de 10 μΜ, ou muito menos.

Um outro aspecto preferido do presente invento compreende um derivado peptídico de fórmula I, ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, que não se liga a HLA-DR3, mas que se liga a HLA-DR1 e/ou a HLA-DR4Dw4 e/ou HLA-DR4Dwl4. O HLA-DR3 é um alelo de HLA-DR comum, que não está associado com a artrite reumatóide. Assim, em pacientes com artrite reumatóide que possuem o HLA-DR3 como um dos seus alelos (o que corresponde a aproximadamente um terço do total de pacientes com artrite reumatóide), um derivado peptídico de fórmula I não irá interferir com o papel normal do HLA-DR3 na função de defesa do hospedeiro. A utilização de um derivado peptídico deste tipo é portanto particularmente vantajosa para o tratamento de pacientes com artrite reumatóide, uma vez que irá 24 resultar numa imunosupressão menor, do que aconteceria com um ligante DR não selectivo.

Como variante ao teste A, a capacidade de um péptido de acordo com o invento se ligar a uma ou mais moléculas HLA-DR foi determinada como se segue: (i) Purificação de tipos de HLA-DR de linhas celulares O método utilizado era uma modificação do método descrito por Gorga et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 16087-16094. Purificaram-se antigénios HLA-DR humanos a partir de várias linhas celulares por cromatografia de imunoafinidade. Em resumo, solubilizaram-se 1 x 109 - 5 x 109 células sedimentadas, da linha celular adequada, seleccionada a partir de Hom 2 (fonte de DR1), BBF (fonte de DR2), AVL-B (fonte de DR3), JAH (fonte de DR4Dw4), JHAF (fonte de DR4Dwl3) ou PE117 (fonte de DR4Dwl4), a aproximadamente 4°C em 50 ml de EDTA 5 mM (sal de sódio), Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NP40 a 2%, NaCl 150 mM, iodoacetamida 1 mM, PMSF 1 mM, por homogeneização com 10 voltas de um homogenizador de vidro teflon. O homogenato foi girado a 100.000 g durante 1 hora e recolheu-se o sobrenadante. O anticorpo monoclonal anti-HLA-DR LB3.1 (Gorga et al., 1986, Cell Immunol. 103, 160-173) ligado de forma covalente a CNBr-

Sepharose 4B (Pharmacia) foi pré-equilibrado com NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NP-40 a 0,1% e incubado durante a noite com o sobrenadante. A resina foi em seguida empacotada numa coluna e lavada com NaCl 0,15 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, octilglucósido a 1% (20 volumes de coluna). O HLA-DR foi eluido com dietilamina 50 mM, pH 11,0, NaCl 0,15 M, octilglucósido a 1%. As fracções da coluna foram imediatamente neutralizadas com HEPES 0,5 M NaOH pH 7,4. O conteúdo de proteína foi determinado. 25 por um teste de proteínas da Biorad e a pureza por electroforese SDS-PAGE. (ii) Testes de ligagão selectiva de péptidos

Incubou-se biotina 2 00 11M-FHA307-320 em solução salina tamponada com fosfato (PBS), quer com HLA-DR1, DR2, DR4Dw4, DR4Dwl3 ou DR4Dwl4, purificados (2-20 μg/πιl), em placas de microtítulo com poços em V (Nunc), com ou sem péptidos inibidores no tampão teste (PBS, NP40 a 0,01% (Sigma)). Para a inibição de DR3, incubou-se Biotina Ahx-(D)Ala-Ala-Ala-Che-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-(D)-ALa-OH 400 nM com DR3 purificado (20 μg/ml) e incubou-se como acima. Após 48 horas, trataram-se os incubados e fizeram-se leituras de absorvância como descrito no teste A. A actividade inibitória dos péptidos, expressa como valores de IC50, foi calculada utilizando o software Microcal Origin num PC.

Teste B: Inibição da activação de células T in vitro (Este teste também pode ser utilizado para demonstrar a capacidade dos derivados peptídicos de fórmula I inibirem a resposta imunitária de células T, mediada por, ou através, de uma molécula de classe II do MHC).

Testaram-se os péptidos inibidores quanto à capacidade de bloquear o estímulo da linha de hibridoma de células T de murídeo, B52.24, que responde ao péptido FHA3C7-320 (H-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) apresentado pelas moléculas HLA-DR4Dw4. A B52.24 foi produzida por fusão de células T do nódulo linfático retiradas de ratinhos transgénicos HLA-DR4Dw4 imunizados com FHA307-320 (Pedido de patente Internacional, No. de publicação WO95/03331) com a

V L-Cj , linha de linfoma de células T de murídeo BW5147 (White et al. (1989) J. Immunol. 143, 1822) como descrito em Woods et al. (1994) J. Exp. Med. 180, 173-181 e seguindo os métodos gerais para a produção de hibridomas de células T, descrita no Current Protocols in Immunology, volume 2, 7.21.

Misturaram-se péptidos inibidores a concentrações entre 100 e 0,1 μΜ (ou inferior) com o péptido antigénico FHA307-320, quer em concentrações variáveis entre 100 e 0,1 μΜ, quer a uma concentração fixa de 10 μΜ, por diluição em meio de cultura RPMI-1640 (Gibco) numa placa de microtitulo de 96 poços (Nunc) num volume final de 100 μΐ. Fixaram-se células B que expressam HLA-DR4Dw4, como a linha celular linfoblastóide transformada JAH EBV (European Culture Collection ECACC 85102909) ou células B obtidas a partir de um indivíduo homozigótico para HLA-DR4Dw4 e transformadas com o vírus Epstein Barr de acordo com o método descrito em Current Protocols in Immunology 7.22.1, utilizando gluteraldeído, por suspensão em gluteraldeído a 1% (Sigma) a 4 x 106 células/ml durante 30 segundos, após o que se adicionou um volume igual de lisina 200 mM (Sigma), durante 3 minutos. Recuperaram-se as células por centrifugação a 300 g, lavaram-se em RPMI-1640 e adicionaram-se a placas de microtitulo contendo antigénio e compostos inibidores a uma concentração de 2 x 105 células por poço. As placas de microtitulo foram incubadas durante 2 horas a 37°C e C02 a 5%.

As placas de microtitulo foram lavadas em seguida em RPMI-1640 por centrifugação a 300 g e aspiradas duas vezes antes da adição da linha de hibridoma de células T, B52.24, a uma concentração de 10b células por poço, em meio de cultura (RPMI-1640, soro fetal de vitela a 10% (Gibco) e glutamina 2 mM (Gibco)). As placas de microtitulo foram incubadas por mais 2 27

V

dias a 37°C e CO2 a 5%. As placas foram em seguida centrifugadas a 300 g durante 10 minutos e removeram-se 150 μΐ de sobrenadante de todos os poços, para serem congelados a -20°C, antes do bioensaio para determinar o conteúdo de IL-2.

As placas de cultura que contêm os sobrenadantes a ser testados foram deixadas descongelar à temperatura ambiente e transferiram-se 100 ml de sobrenadante para placas frescas de 96 poços de fundo redondo. Realizaram-se diluições em série 1:1 de IL-2, utilizando meio de cultura CRPMI-1640 (Gibco), soro fetal de vitela a 10% (Advanced Protein Products), estreptomicina 100 μg/ml e penicilina 100 U/ml (Gibco), L-glutamina 2 mM (Gibco) e 2-mercaptoetanol 50 μΜ (sigma)), para produzir uma curva padrão de 250 unidades/ml a 0,04 unidades/ml de IL-2 final. Fez-se a recolha de uma linha celular dependente de IL-2, como as células CTLL-2 (Nature (1977) 268 154-156) ou células HT-2 (J. Immunol. Methods (1987) 94-104) e lavou-se duas vezes utilizando meio de cultura antes de resuspender a 5 x 104 células/ml. Adicionaram-se 100 μΐ da suspensão de células dependente de IL-2 a cada poço da curva padrão e das amostras teste. Incubaram-se as placas de cultura durante 72 horas a 37 cC e C02 a 5%. Em seguida, adicionaram-se 20 μΐ (1 mCi) de 3H-timidina (Amersham International) a cada poço e incubaram-se de novo as placas durante mais 16 horas. Os conteúdos de cada placa foram recolhidos em almofadas de filtro de fibra de vidro e mediu-se a radioactividade utilizando um contador de cintilações beta.

Em geral, os derivados peptídicos de fórmula I como acima definidos testados no teste B apresentaram uma inibição 28 '

' V L· significativa a uma concentração de cerca de 10 μΜ ou muito menor.

Teste C: DTH estimulado por péptidos (hipersensibilidade do tipo retardado) em ratos BALB/C. (0 teste pode ser utilizado para demonstrar actividade in vivo dos derivados peptidicos de fórmula I num modelo animal). Imunizaram-se ratos fêmea Balb/c (18-20 g), 5 por grupo, subcutaneamente no flanco com 0,1 ml de uma emulsão de ovalbumina (Sigma) (2 mg/ml em solução salina) misturada 1:1 (v/v) com adjuvante de Freund completo (Sigma). Sete dias mais tarde, determinou-se a espessura da almofada da pata utilizando um micrómetro calibrador duplo, seguido de ataque numa almofada da pata traseira com 30 μΐ de injecção sub-plantar de proteína ovalbumina agregada pelo calor a 1%, em solução salina. Vinte e quatro horas após o desafio com o antigénio, mediram-se as almofadas das patas e calculou-se a resposta DTH como a percentagem de aumento da espessura da almofada da pata, na almofada da pata injectada, comparativamente com o controlo contralateral. Administraram-se os inibidores por meio de mini bombas osmóticas (Alzet) de 3 dias implantadas 24 horas antes do ataque com antigénio, em doses desde 10 mg/kg/dia a 0,1 pg/kg/dia. 0 grau de inibição foi calculado por subtracção do valor de inchamento das almofadas da pata tratadas com inibidor, em relação aos controlo doseados com veículo, dividindo pelo valor de controlo e multiplicando por 100%.

Em geral, os derivados peptidicos de fórmula I como acima definidos que foram testados no teste C mostraram uma inibição significativa a uma dose de cerca de 1 mg/kg/dia, ou muito menor, sem qualquer efeito toxicológico global ou outro efeito farmacológico adverso. 29

V

L-Cj

Teste D: (Este teste pode ser utilizado para demonstrar a actividade in vivo de derivados peptidicos de fórmula I num modelo animal de artrite).

Imunizam-se ratos fêmea Balb/c (19,21 g, 5-10/grupo) ao dia 0 e dá-se um reforço ao dia 7, com uma injecção subcutânea de 0,1 ml de uma emulsão que contém volumes iguais de albumina de soro bovino metilada 2 mg/ml (met-BSA, Sigma) em solução salina e adjuvante de Freund completo (Sigma), suplementado com Mycobacterium tuberculosis 2,5 mg/ml (MTB, estirpes C, DT e PN, MAFF, Weybridge, Surrey), originando assim uma concentração final de MTB de 3,5 mg/ml. Ao mesmo tempo, dá-se uma injecção i.p. adicional de 0,1 ml de 109 organismos Bordetella pertussis (vacina Pertussis da Wellcome). Catorze dias mais tarde, os animais são atacados numa articulação do joelho com uma injecção intra-articular de 10 μΐ contendo 100 μg de met-BSA numa solução salina, utilizando uma agulha de 30G e uma seringa hamilton. O joelho contralateral é injectado com um volume semelhante de solução salina e é utilizado como controlo. O grau de inflamação/inchamento associado com ambos os joelhos é determinado 13 dias mais tarde, fazendo a medição com um micrómetro de calibração duplo. Isto consegue-se fazendo uma incisão com tesouras de pontas rombas e forcepes na pele, aproximadamente a 5 mm acima e abaixo do joelho e continuando ao longo do lado do joelho para formar uma aba, que é então cuidadosamente removida para expor a articulação subjacente. As medições são feitas através da parte mais larga do joelho, no plano horizontal, com a perna flectida, mantida numa posição fixa. Calcula-se a percentagem de aumento da inflamação do joelho injectado com antigénio, comparativamente com a do controlo, utilizando a fórmula:[espessura do joelho injectado com antigénio - espessura do joelho injectado com solução 30

V

salina/espessura do joelho injectado com solução salina] x 100. Os inibidores são administrados utilizando mini-bombas osmóticas (Alzet) de 14 dias implantadas 24 horas antes do ataque com antigénio, a doses desde 10 mg/kg/dia a 0,1 μg/kg/dia. A percentagem de inibição da inflamação/inchamento é calculada a partir das medições de espessura, subtraindo o valor de inchamento no grupo tratado com inibidor, do valor do grupo doseado com veiculo, dividindo pelo valor de controlo e multiplicando por 100. A verificação adicional da doença envolve 1) a avaliação histológica da inflamação, sinovite e erosões da cartilagem/osso, desenvolvidas em secções· de joelho fixas coradas com hemotoxilina e eosina e 2) a determinação dos níveis de reagentes de fase aguda no soro, amilóide P no soro e/ou haptoglobina.

Os derivados peptídicos de fórmula I como acima definidos poderão apresentar uma inibição significativa no teste D, a uma dose de cerca de 10 mg/kg/dia ou muito menor. A título ilustrativo da actividade farmacológica de derivados peptídicos particulares de fórmula I, os compostos dos exemplo 5, 16 e 23 apresentaram todos uma ligação significativa ao HLA-DR4Dw4 no teste A a uma concentração <0,1 micromolar e eram activos a < 0,1 mg/kg/dia no Teste C. Estes compostos mostraram também uma boa estabilidade aquosa a pH 3 e pH 7,6, na forma de uma formulação de depósito de polímero extrudido, apresentaram uma perda mínima devido a degradação por extrusão e uma degradação mínima por libertação a partir da formulação de depósito deste tipo. Na variante do teste A, verificou-se que o composto do Exemplo 23 se liga de forma significativa a HLA-DRl, HLA-DR2, HLA-DR4w4 e HLA-DR4Dwl4, mas 31 Γ

não se ligou de forma significativa a HLA-DR3 (IC50 > 100 micromolar).

Pode-se preparar um derivado peptidico de fórmula I por qualquer processo bem conhecido na arte da química de péptidos, aplicável à síntese de péptidos análogos.

Pode-se obter um derivado peptidico de fórmula I, por exemplo por processos análogos aos descritos em "Solid Phase Peptide Synthesis: A praticai approach" por Atherton e Shepard (publicado pela IRL Press na Oxford University Press, 1989). "Solid Phase Peptide Synthesis" por Stewart e Young (publicado pela Pierce Chemical Company, Illinois, 1984), "Principies of Peptide Synthesis" (publicado pela Springer-Verlag, Berlim, 1984) e numa série de livros "Amino Acids, Peptides and Proteins" (volumes 1-25; volume 25 publicado em 1994) (publicado pela Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK).

De preferência, prepara-se um derivado peptidico de fórmula I por síntese sequencial de fase sólida. Utilizando esta técnica, o aminoácido que irá constituir o aminoácido do terminal-C do péptido é protegido no grupo alfa-amino e, se necessário, na cadeia lateral e é ligado a um suporte sólido, por exemplo uma resina, como a resina cloreto de 2-clorotritilo ou resina Merrifield (clorometil-polistireno-divinilbenzeno), no caso de ser necessário um ácido carboxílico livre após clivagem, ou resina Rink Amide (resina 4-(2'-4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminoetil)fenoxi) ou resina Rink Amide MBHA (N-4-(21,41-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacetamido-norleucil)-4-metil benzidrilamina) (todos disponíveis da Calbiochem-Novabiochem) quando é necessário uma carboxamida após clivagem, após o que se remove o grupo protector no grupo 32 alfa-amino. 0 aminoácido que será ligado ao aminoácido do terminal C é protegido no grupo alfa-amino e, se necessário, na cadeia lateral e ligado ao aminoácido do terminal C, que permanece ligado ao suporte sólido. 0 processo passo a passo de desprotecção do grupo alfa-amino e a ligação ao aminoácido seguinte é repetida para originar um polipéptido protegido ou não protegido ligado ao suporte sólido. 0 grupo R2 de fórmula II ou III é incorporado na sequência, utilizando um ácido (3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)alcanóico adequadamente protegido (para um derivado peptidico contendo II em que A = metileno) ou um análogo oxa correspondente obtido como descrito em J. Med. Chem., 1993, 36,, 256-263 ou por analogia com este (para um derivado peptidico que contém II em que A é oxigénio) , ou um ácido (6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7-il)alcanóico (para um derivado peptidico que contém III) em vez de um aminoácido protegido. 0 polipéptido protegido ou não protegido é libertado do suporte sólido por processos convencionais, por exemplo utilizando uma mistura de ácido trifluoroacético, trietilsilano e água. Deverá ter-se em conta que um grupo protector de uma cadeia lateral pode ser clivado nas condições utilizadas para libertar o péptido do suporte sólido, ou pode ser clivado como um passo separado, antes ou subsequentemente à libertação do péptido do suporte sólido. Também deve ter-se em conta que o processo para a construção do polipéptido pode ser modificado utilizando uma sequência de dois ou mais aminoácidos adequados num passo de ligação particular. A síntese pode utilizar técnicas manuais ou pode ser realizada automaticamente, utilizando por exemplo, um sintetizador de péptido 431A ou 430A da Applied Biosystems, um sintetizador de péptidos ACT357 da Advanced Chemtech ou pode-se utilizar um sintetizador de péptidos automático semelhante, ou uma combinação de ambas as técnicas. 33

V

Durante a construção dos péptidos, os grupos funcionais de aminoácidos que não estão envolvidos na reacção estão protegidos por vários grupos funcionais. Por exemplo, os grupos amino do terminal-N e da cadeia lateral podem ser protegidos utilizando 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), t-butoxicarbonilo (Boc), bifenilisopropoxicarbonilo (Bpoc), 2-[3,5-dimetoxi-fenil ].propil-2-oxicarbonilo (Ddz), adamantiloxicarbonilo (Adoc), aliloxicarbonilo (Aloc) 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo (Troe), benziloxicarbonilo e vários grupos benziloxicarbonilo substituídos. Estes grupos protectores podem ser clivados quando necessário por técnicas convencionais (e.g. tratamento com ácido ou base, hidrogenólise catalítica e tratamento com Pd(0) ou com zinco/ácido acético).

Os grupos protectores adequados utilizados para a protecção do grupo guanidino da cadeia lateral em péptidos que contêm um resíduo de arginina, incluem um grupo nitro, adamantiloxicarbonilo, 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenosulfonilo (Mtr), 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc) e (especialmente) 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf).

Os grupos protectores adequados utilizados para a protecção de um grupo hidroxi de cadeia lateral incluem t-butilo, benzilo e tritilo (Trt). Os grupos protectores adequados utilizados para o grupo imidazolo da cadeia lateral em péptidos que contêm um resíduo de histidina, incluem um grupo tritilo, benzilo, tosilo, dinitrofenilo, Adoc, Boc ou Fmoc.

Os grupos protectores adequados utilizados para a protecção de um grupo carboxilo de cadeia lateral incluem 34 1

vários ésteres (e.g. metilo, etilo, t-butilo, benzilo, nitrobenzilo, alilo e 9-fluorenilmetilo).

As reacções de clivagem dos grupos protectores podem ser realizadas a temperaturas na gama de 4°C a 40°C (de preferência a ou próximo da temperatura ambiente) e durante um período de tempo na gama de 10 minutos a 24 horas.

Os métodos de acoplamento adequados, utilizados para o acoplamento de aminoácidos individuais incluem a azida, anidrido simétrico, anidrido misto e várias ésteres e carbodiimidas activos, vulgarmente utilizados. No caso de várias' carbodiimidas (e.g. dicilohexil ou diisopropilcarbo-diimidas), podem também adicionar-se vários aditivos (e.g. 1-hidroxibenzotriazolo (HOBT) e N- hidroxisuccinimida). Para além disso, também se conseguem estabelecer as ligações de aminoácidos utilizando vários outros reagentes, e.g. hexafluorofosfato de lH-benzotriazolo-l-il-oxi-tris-pirrolidinofosfónio (PyBOP), tetrafluoroborato de (2-(lH-benzotriazolo-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (TBTU) e tetra-fluoroborato de (2-(lH-benzotriazolo-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (HBTU). As reacções de acoplamento podem ser realizadas a temperaturas na gama de -20°C e 40°C e durante um período de tempo entre 10 minutos e 24 horas. Um meio adequado para realizar as reacções de acoplamento inclui, por exemplo, N,N-dimetilformamida (DMF). Um método particularmente adequado inclui a utilização de HBTU, HOBT e diisopropiletilamina em DMF.

Este e outros métodos de síntese de péptidos são exemplificados nos Pedidos de Patente Internacional aqui referidos. Pode-se incorporar um resíduo hidrofóbico P, que é 35

um grupo de fórmula R-, R.CO-, R.S02, R.0.C0-,R.NHCO-, R.O.CS-, R.NHCS-, R.S.CS- e R.CS- (ou um grupo deste tipo presente como substituinte num grupo amino terminal de P, em que P é um aminoácido hidrofóbico ou um aminoácido hidrofóbico com outros aminoácidos) , por exemplo, como um passo final, por alquilação, acilação ou outra modificação de grupos funcionais convencional, de um grupo amino terminal (por exemplo antes ou subsequentemente à libertação do péptido de um suporte). Quando são necessárias modificações no terminal-C (a fim de se obter um exemplo para R'1) , estas podem ser realizadas após o péptido ser sintetizado, por modificação convencional de grupos funcionais, ou por escolha adequada da resina inicial de partida, ou da entidade protegida que é primeiro acoplada à resina (por exemplo, utilizando um grupo protegido adequado de fórmula R4-H). Exemplos típicos da preparação de derivados peptídicos de fórmula I são proporcionados nos exemplos a seguir.

Um procedimento típico para medição da estabilidade de um derivado peptídico de acordo com o presente invento, é como descrito a seguir, em que, para minimizar a contaminação microbiana e a degradação, todo o equipamento utilizado para preparar as soluções de péptidos é esterilizado num autoclave e todas as transferências de material são realizadas numa câmara de fluxo laminar de classe II. Filtram-se aproximadamente 20 ml de solução de ácido cítrico-tampão fosfato de Mcllvaine a pH 3 ou 7,6, contendo azida de sódio a 0,02%, para um frasco de 50 ml, utilizando um filtro estéril de 0,22 μχα e uma seringa de 20 ml. Pesam-se rigorosamente aproximadamente 1,2 mg de péptido num frasco tapado. Utilizando um ponta de pipeta estéril, adiciona-se solução tampão suficiente ao péptido no frasco, de forma a se obter uma concentração de péptido de 0,1 mg/ml. O 36 r

u K frasco é tapado e agitado para dissolver o péptido. Utilizando uma ponta de pipeta estéril, transferem-se aliquotas de aproximadamente 1 ml da solução de péptido para 10 frascos de HPLC, que são então tapados. Armazenam-se 5 frascos a -18 e 37°C. A área do pico de péptido para a solução é determinada por HPLC utilizando padrões adequados inicialmente e após armazenamento a -18 e 37°C durante 1, 2, 3 e 4 semanas, utilizando um frasco novo a cada ponto de tempo com injecções de amostra em duplicado. A percentagem de péptido que remanesce após armazenamento a 37°C a cada ponto de tempo é determinada a partir da razão entre a área de pico de péptido a cada ponto de tempo e a área inicial. Os derivados peptidicos preferidos de acordo com o presente invento têm mais de 90% e de preferência mais de 95% de péptido remanescente após armazenamento a 37°C, tanto a pH 3 como 7,6. O derivado peptidico de fórmula I será geralmente administrado para fins terapêuticos ou profiláticos a animais de sangue quente (incluindo o homem), que necessitem desse tratamento, na forma de uma composição farmacêutica, como é bem conhecido na arte farmacêutica.

De acordo com outra caracteristica do invento, proporciona-se uma composição farmacêutica que compreende um derivado peptidico de fórmula I, ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, em associação com um diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável. A composição pode ser numa forma adequada para utilização oral, por exemplo um comprimido, cápsula, solução aquosa ou oleosa, suspensão ou emulsão; para utilização nasal, por exemplo por inspiração, "spray" nasal ou gotas nasais; para 37 \ Ρ Lcí ^ Μ utilização vaginal ou rectal, por exemplo um supositório; para administração por inalação, por exemplo na forma de um pó finamente dividido ou um aerossol liquido; para utilização sublingual ou bucal, por exemplo um comprimido ou cápsula; ou para utilização parentérica (incluindo intravenosa, subcutânea, intramuscular, intravascular ou infusão), por exemplo na forma de uma solução ou suspensão aquosa ou oleosa, estéril. A composição pode ser numa forma adequada para administração tópica, como por exemplo cremes, unguentos e geles. Também se contemplam pachos dérmicos. A formulação em geral está descrita no capitulo 25.2 de Comprehensive Medicinal Chemistry, volume 5, Editor Hansch et al., Pergamon Press 1990.

Em geral, as composições acima podem ser preparadas de forma convencional utilizando excipientes convencionais. No entanto, no caso de uma composição para administração oral, pode ser conveniente para a composição incluir um revestimento para proteger o ingrediente activo polipeptídico da acção das enzimas do estômago.

Uma composição preferida de acordo com o invento é a que é adequada para administração oral na forma de dosagem unitária, por exemplo um comprimido, ou cápsula, que contém desde 2,5 a 500 mg, e de preferência 10 a 100 mg de polipéptido em cada dose unitária, ou a que é adequada para administração parentérica, que contém 0,5 a 100 mg de polipéptido por ml, e de preferência 1 a 10 mg de polipéptido por ml de solução.

Uma composição parentérica é de preferência uma solução em solução salina isotónica ou dextrose isotónica, tamponada se necessário a um pH de 5 a 9. Alternativamente, a composição parentérica pode ser concebida para uma libertação controlada, 38 rí : í u K- sendo neste caso a quantidade de polipéptido por dose unitária, em geral, maior do que o necessário quando se utiliza uma formulação injectável convencional. Uma formulação de libertação controlada preferida é uma formulação de libertação continua, por exemplo uma formulação do tipo descrito no pedido de patente europeia No. 58481, ou para péptidos de fórmula I que contêm pelo menos um grupo básico, uma formulação como descrito no pedido de patente internacional No. de publicação WO93/24150, cujos pedidos de patente são aqui incorporados para referência. Alguns péptidos de acordo com o presente invento, possuem caracteristicas de solubilidade que os tornam particularmente adequados para a produção e processamento de formulações parentéricas de libertação controlada, particularmente formulações que contêm poliésteres biodegradáveis, como poliláctidos, e para proporcionar formulações de libertação controlada com perfis de libertação benéficos. Para além disso, os péptidos de acordo com o presente invento que contêm um ou mais grupos básicos, particularmente arginina, podem também formar sais péptido-polímero com poliésteres de terminais ácidos, como poliláctidos, e estes péptidos e sais péptido-polímero constituem um outro aspecto do presente invento. Alguns destes sais possuem caracteristicas de solubilidade que os tornam particularmente adequados para a produção e processamento de formulações parentéricas de libertação controlada, por exemplo como descrito na WO93/24150 e para proporcionar formulações de libertação controlada com perfis de libertação e caracteristicas de estabilidade em armazenamento benéficas. Uma formulação parentérica de libertação controlada preferida contém desde 1 a 100 mg (como de 5 a 50 mg) de polipéptido por dose unitária. Uma formulação parentérica de libertação 39 VΓ U,

controlada preferida é também a que é concebida para a libertação controlada durante um período de pelo menos 5 dias.

Os péptidos preferidos de acordo com o presente invento incluem os que, quando na forma de uma formulação de um depósito de polímero extrudido, apresentam uma perda mínima devida a degradação por extrusão, ou que apresentam uma degradação mínima na libertação a partir de uma formulação de depósito deste tipo. Os processos típicos para a medição do nível de degradação de um péptido de acordo com o presente invento são como se segue:

Preparação de uma formulação de péptido, de depósito de polímero extrudido

Cerca de 20 mg de péptido são pesados com rigor e adiciona-se polímero suficiente (50/50% molar de copolímero poli(ácido láctico-D,L /ácido glicólico) com um peso molecular médio aproximado de 20 kD e uma polidispersidade de aproximadamente 1,7, tal como determinado por cromatografia de crivo molecular, relativamente a padrões de poliestireno), para produzir uma mistura de aproximadamente 20% p/p. Esta é dissolvida em ácido acético glacial isento de anidrido para produzir uma solução aproximadamente a 10% p/v. A solução é liofilizada e o produto liofilizado resultante é armazenado sob vácuo antes de utilização.

Carregam-se cerca de 100 mg de material liofilizado no tambor de um extrusor de laboratório de pequenas dimensões e o pistão é empurrado para consolidar a amostra. O extrusor é aquecido entre 90 e 95cC e mantido a esta temperatura durante 10 minutos antes de o material liofilizado ser extrudido sob 40

pressão, para originar um material extrudido cilíndrico de aproximadamente 1 mm de diâmetro.

Análise do conteúdo peptídico da formulação de péptido de depósito de polímero extrudido.

Pesam-se com rigor dois depósitos de polímero extrudido contendo o péptido, de aproximadamente 5 mm de comprimento e dissolve-se cada um em 1 ml de ácido acético glacial isento de anidrido em frascos volumétricos de 25 ml separados. Após cerca de 1,5 horas perfaz-se o volume de cada um até 25 ml com água destilada, o que faz com que o polímero precipite. Os sólidos são removidos por filtração utilizando um filtro Millex PTFE de 0,5 μιη e as soluções, A, são recolhidas.

Prepara-se uma série de soluções padrão a partir de uma solução mãe de péptido em água destilada a 0,5 mg/ml e uma solução mãe de ácido acético glacial isento de anidrido a 2,5 mg/ml, como se segue, perfazendo-se cada solução para um volume de 10 ml com água destilada. concentração do péptido ^g/ml) Volume de solução mãe de polímero (μΐ) Volume de solução mãe de péptido (μΐ) 50 1000 1000 40 1000 800 30 1000 600 20 1000 400 10 1000 200 5 1000 100 2-__j 1000 0

Cada padrão é filtrado através de um filtro PTFE Millex de 5 μπι e analisa-se uma alíquota de filtrado, juntamente com 41

j~' u ^^ alíquotas das soluções A, por HPLC, utilizando duplicados das injecções de amostra. 0 conteúdo em péptido da formulação de péptido de depósito de polímero extrudido é calculado a partir da concentração de péptido nas soluções A, que é determinado por comparação da área do pico de péptido nas soluções A com a área do pico de péptido de soluções padrão. Os péptidos preferidos de acordo com o presente invento apresentam uma perda mínima devido a degradação na extrusão e assim o conteúdo em péptido da formulação de depósito de polímero extrudido é próximo do valor teórico aproximado de 20% p/p.

Degradação do péptido por libertação in vitro a partir de um depósito de polímero extrudido

Filtra-se uma solução de ácido cítrico-tampão fosfato de Mcllvine a pH 7,6 contendo 0,02% de azida de sódio, através de um filtro de 0,22 μ e armazena-se a 4°C. Colocam-se aproximadamente 10 mg do depósito de polímero extrudido contendo péptido em dois frascos pequenos e adicionam-se 2 ml de solução tampão. Os frascos são tapados e armazenados num banho de água a 37°C durante um mês. A pontos de tempo adequados, ao longo de um mês, removem-se de cada frasco três alíquotas de 0,6 ml do meio de libertação e analisam-se por HPLC ou armazenam-se congeladas num frasco de HPLC a -18°C antes da análise por HPLC. Adicionam-se 1,8 ml de solução tampão a cada frasco que contém depósito, para substituir o meio de libertação que foi removido a cada ponto de tempo. A quantidade média de péptido intacto no meio de libertação em cada ponto de tempo é determinada por HPLC utilizando injecções de amostra em duplicado, por comparação da área do pico de péptido no meio de libertação com a área do 42 ,U u ^ pico de péptido de soluções tampão padrão de péptido, a concentrações conhecidas. A quantidade média aproximada de produtos de degradação peptidicos no meio de libertação em cada ponto de tempo é determinada por HPLC, comparando a área dos novos picos adicionais no meio de libertação, com a área do pico de péptido a partir das soluções tampão padrão, a concentrações conhecidas e assumindo que não houve alteração do coeficiente de extinção. 0 perfil de libertação cumulativo médio in vitro do péptido intacto e do péptido total (péptido intacto e produtos de degradação do péptido) é calculado a partir das quantidades de péptido intacto e produtos de degradação peptidicos no meio de libertação a cada ponto de tempo. Os péptidos preferidos de acordo com o presente invento, apresentam uma degradação mínima na libertação in vitro e apresentam assim produtos de degradação peptídica totais inferiores a 10% e de preferência inferiores a 5% do péptido total, após um mês de libertação in vitro para a solução tampão de Mcllvaine a pH 7,6 a 37°C. A composição de acordo com o invento será de um modo geral administrada ao homem de forma tal que, por exemplo, uma dose diária será de 10 microgramas a 5000 mg, de preferência de 0,1 a 100 mg, para um paciente de 70 kg, dada em doses divididas como necessário. A quantidade exacta de composição administrada e a via e forma de administração poderão depender do tamanho, idade e sexo do indivíduo a ser tratado e da doença, ou condição médica particulares a ser tratadas e da sua gravidade, de acordo com os princípios bem conhecidos na àrte da medicina.

Podem também administrar-se com vantagem um derivado peptídico de fórmula I, ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, para fins terapêuticos ou 43 p Lc, ^ profiláticos, juntamente com um mais outros agentes farmacológicos conhecidos na arte geral como sendo de valor para o tratamento ou alívio de sintomas (ou como agente modificador da doença) de uma ou mais doenças, ou condições médicas acima referidas, como NSAID (como o ibuprofeno ou piroxicam), um analgésico (como o paracetamol) um corticoesteróide, um relaxante muscular, um inibidor da lipoxigenase, metotrexato, azatioprina, D-penicilamina, ciclosporina A ou uma terapia de anticorpos monoclonais (como anti-CD4 ou anti-TNF). Na diabetes, o derivado peptídico pode ser co-administrado com insulina ou outras terapias para diabetes ou complicações da diabetes (como um inibidor da reductase de aldose). Deve entender-se que esta terapia de combinação constitui um outro aspecto do invento.

De acordo com outro aspecto do presente invento, proporciona-se um método para o tratamento de uma doença auto-imune ou inflamatória mediada por células T dependente de MHC de classe II, por exemplo uma ou mais das doenças . ou condições médicas aqui referidas, que compreende a administração a um animal de sangue quente (incluindo o homem) em necessidade desse tratamento de uma quantidade eficaz de um derivado peptídico de fórmula I, ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável. 0 invento proporciona também a utilização de um derivado peptídico de fórmula I, ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, para a produção de um novo medicamento para utilização no tratamento de uma doença auto-imune ou inflamatória mediada por células T dependente de MHC de classe II.

Para além da sua utilização acima mencionada na medicina terapêutica de humanos, os derivados peptídicos de fórmula I 44

são também úteis no tratamento veterinário de condições semelhantes que afectam animais de sangue quente comercialmente disponíveis, como cães, gatos, cavalos e gado. Em geral, para esse tratamento, o derivado peptídico de fórmula I será administrado numa quantidade e modo análogos aos descritos acima para a administração a humanos. Os derivados peptídicos de fórmula I são também importantes como ferramentas farmacológicas no desenvolvimento e padronização de sistemas teste para a avaliação dos efeitos de moléculas de classe II do MHC em animais de laboratório como gatos, cães, coelhos, macacos, ratos e ratinhos, como parte da pesquisa contínua de novos e melhores agentes terapêuticos, ou como agentes de diagnóstico. O invento será agora descrito pelos exemplos seguintes, não limitativos, nos quais, salvo indicação em contrário: (i) as concentrações e evaporações foram realizadas por evaporação rotativa in vácuo; (ii) as operações foram realizadas à temperatura ambiente, isto é na gama de 18-26°C; (iii) os rendimentos, quando fornecidos, pretendem ser um auxilio aos leitores e não são necessariamente o máximo atingível por um desenvolvimento diligente do processo; (iv) utilizaram-se as seguintes abreviaturas:

Phv = 5-fenilvalerilo; Boc = terc-butoxicarbonilo; tBu = tert-butilo; DMF = Ν,Ν-dimetilformamida: HOBT = 1-hidroxi-benzo-triazolo; Met = metionina; Fmoc = 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; Fmoc-Pip-OH = ácido N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)piperidin-4-carboxílico; Fmoc-Papa-OH = ácido 4-[N-(9-fluorenilmetoxi-carbonil) amino] fenilacético; CbZ = benziloxicarbonilo; Pmc = 2,25,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo; Pbf = 2,2,4,6,7-penta-metildihidrobenzofuran-5-sulfonilo; THF = tetrahidrofurano; 45

"V I—^ ^ DMSO = dimetilsulfóxido; HBTU = 2-(ΙΗ-benzotriazol-l-il)- 1,1,3,3-tetrametiluroniohexafluorofosfato; DIPEA = diisopropil-etilamina; TFA = ácido trifluoroacético; Su .é succinimida ligada por meio do átomo de azoto do anel; HPLC = cromatografia liquida de alta pressão; e RP-HPLC = cromatografia liquida de alta pressão de fase inversa (que, salvo indicação em contrário, foi realizada numa coluna Vydac C18 218TP54, 4,6 x 250 mm); (v) a cromatografia "flash" e a cromatografia em sílica gel foram realizadas em Kieselgel 60 da Merck (Art. No. 9385) obtido da E. Merck, Darmstadt, Alemanha; (vi) os espectros de iH RMN foram determinados a 200 MHz em CDC13 ou d6-dimetilsulfóxido (dg-DMSO), utilizando tetra-metilsilano (TMS) como padrão interno e são expressos como os valores de desvio químico (delta) em partes por milhão, relativos ao TMS utilizando abreviaturas convencionais para a designação dos picos principais; s, singleto; m multipleto; t, tripleto, br, largo, d, dubleto; (vii) utilizaram-se os seguintes aminoácidos protegidos com Fmoc para a introdução de um resíduo de Lys, Thr, Arg ou His: Para Lys: Fmoc-Lys(Boc)-OH; para Thr:Fmoc-Thr(OBu)-OH; para Arg:Fmoc-Arg(Pmc)-OH ou Fmoc-Arg(Pbf)-OH; e para His:Fmoc-His(Trt)-OH; (viii) no Exemplo 2 quando se refere a fórmula III, significa a fórmula III em que Rb é metilo; (ix) nos exemplos 17 e 31 quando se utiliza o termo "morfolina" para designar o produto, significa que o grupo morfolina está ligado pelo azoto do anel ao grupo metileno adj acente; (X) no exemplo 18 e 34, quando se utiliza o termo "N(CH2CH?) 2N", este representa um anel piperazina; e 46

(xi) no exemplo 30, quando se utiliza o termo "-Lys (=C (NMe2) para designar o produto, isto representa o resíduo de aminoácido L, -HN-CN [CH2CH2CH2CH2N=C (NMe2) 2] -CO- .

Exemplo 1. Preparação de Phv-AI a-AI a-AI a-Lys-Val-IIb-Ala-Pip- NH2 (SEQ ID NO: 1)

S

1.1 Síntese de Boc-(D)-Met-(L)-Ala-Ome

Adicionou-se N-metilmorfolina (5,6 g), cloridrato de éster de L-alanina metil (3,9 g) , HOBT (4,6 g) e 1-(3- dimetilaminopropil)3-etilcarbodiimida (5,3 g) a uma solução de Boc-(D)-metionina (7g, 0, 028 mol) em DMF seco (50 ml). A mistura foi agitada durante a noite. Removeu-se o solvente por evaporação e o resíduo foi particionado entre diclorometano (100 ml) e ácido acético aquoso a 5% (50 ml) . Em repouso, o HOBT cristalizou e foi removido por filtração e a camada orgânica foi separada e lavada com bicarbonato de sódio aquoso, seca (MgSCb) e evaporada. O resíduo (8,5 g) foi purificado por cromatografia "flash" num funil sinterizado, fazendo a eluição com uma mistura de diclorometano e éter (0% a 100% de éter) . Combinaram-se as fracções que contêm produto e evaporaram-se para originar Boc- (D) -Met- (L) -Ala-OMe (7,2 g) na forma de uma goma que cristalizou em repouso; RMN (CDC13) : 1,4 (d, 3H) , 1,45 (s, 9H) , 1,95 (m, 1H) , 2,1 (s, 3H) , 2,1 (m, 1H) , 2,6 (m, 2H) , 3,75 (s, 3H) , 4,3 (bs, 1H) , 4,6 (m, 1H) , 5,3 (m, 1H) , 6,9 (bs, 1H) . 47 r 1.2 Síntese de (2S)-2-[(3R)-3-(N-[terc-butoxicarbonilo]-amino)-2-oxo-pirrolidin-l-il]propionato de metilo

O

Nota: Esta sequência deverá ser realizada sob condições secas com solventes secos, pois caso contrário ocorrerá a epimerização.

Adicionou-se iodeto de metilo (10 ml) a Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe (8 g) numa mistura de DMF (20 ml) e diclorometano (20 ml) e deixou-se a mistura em repouso durante 16 horas e em seguida evaporou-se até à secura. Adicionou-se mais diclorometano (2 x 50 ml) e evaporou-se para remover o iodeto de metilo residual e o residuo foi dissolvido numa mistura de DMF (300 ml) e diclorometano (300 ml) . Arrefeceu-se a mistura a ~5cC e adicionou-se hidreto de sódio (0,76 g de uma dispersão a 80% em óleo mineral) numa porção e agitou-se a mistura a esta temperatura durante 2 horas. Adicionou-se cloreto de amónio saturado (50 ml) e evaporou-se a mistura até à secura e em seguida particionou-se entre água e éter. Lavou-se o extracto de éter com salmoura e secou-se e evaporou-se para originar uma goma que foi purificada por cromatograf ia "flash" num funil sinterizado (acetato de etilo:hexano a 25% até acetato de etilo a 100%) para originar (2S)-2-[(3R)-3-[N-[terç-butoxi-carbonil]amino)-2-oxo-pirrolidin-l-il]propionato na forma de uma goma (4,2 g) que cristalizou em repouso; RMN (CDCI3) : 1,4 (s, 9H) , 1,4 (d, 3H) , 1,8 (m, 1H) , 2,6 (m, 1H) , 3,4 (m, 2H) , 3,7 (m, 3H) , 4,2 (m, 1H) , 4,9 (q, 1H) , 5,2 (bs, 1H) . 48 1.3 Síntese de ácido (2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-fluorenil-metiloxicarbonil]amino)-2-oxo-pirrolidin-l-il]propiónico (Fmoc-IIb-OH)

Levou-se ao refluxo (2S)-2-[(3R)-3-(N-[terc-butiloxi-carbonil]amino)-2-oxo-pirrolidin-l-il]proionato de metilo (4 g) numa mistura de acetona (60 ml) , água (40 ml) e ácido clorídrico concentrado (24 ml) durante 3 horas e em seguida evaporou-se a mistura até à secura. Adicionou-se água e repetiu-se a evaporação. Dissolveu-se o resíduo em água (15 ml) e adicionou-se, em excesso, bicarbonato de sódio sólido. Adicionou-se carbonato de 9-fluorenilmetil succinimidilo (5,2 g) em acetona (30 ml) . Agitou-se a mistura durante 16 horas e em seguida removeu-se o solvente por evaporação e repartiu-se o resíduo entre água e éter. Separou-se a camada aquosa, ajustou-se o pH para ~3 com ácido clorídrico e extraiu-se com diclorometano. A camada orgânica foi lavada com água, seca (MgSCt) e evaporada para originar uma espuma branca que cristalizou por trituração com éter, para originar ácido (2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-fluorenilmetiloxicarbonil]amino)-2-oxo-pirro-lidin-l-il]propiónico (4,2 g) na forma de um sólido branco, pf. 191-3°C (dec) ; RMN (CDC13) : 1,4 (d, 3H) , 2,0 (m, 1H) , 2,6 (m, 1H) , 3,4 (m, 2H) , 4,2 (t, 1H) , 4,4 (m, 3H) , 4,9 (m, 1H) , 5,8 (bs, 1H), 7,4 (m, 4H), 7,6 (d, 2H) , 7,7 (d, 2H) . 49 j-v ^t 1.4 Síntese de Phv-ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH2 (SEQ ID NO:1) O péptido foi preparado por síntese de fase sólida Fmoc, começando com Resina Fmoc Rink Amide MBHA (Novabiochem, 0,50 g, 0,25 mmol) num tubo Bond Elut (Varian, 15 ml, ajustado com um filtro no fundo) (a) A resina foi desprotegida utilizando uma solução a 20% de piperidina em DMF (dois tratamentos com 5 ml durante 10 minutos cada) . Após desprotecção, a resina foi bem lavada com DMF (5 x 10 ml). (b) A acilação foi realizada por adição de uma solução de

Fmoc-Pip-OH (353 mg, 1 mmol), DMF (1,5 ml), HOBT (165 mg, 1 mmol) e diisopropilcarbodiimida (155 microlitros, 1 mmol). O acoplamento foi deixado por aproximadamente 30 minutos, lavado com DMF (5 x 10 ml) e uma pequena porção da resina foi analisada quanto à finalização da acilação utilizando o teste de Kaiser (E. Kaiser et al., (1970), Anal. Biochem. 34, 595) A desprotecção (a) e ciclo de acoplamento (b) acima mencionados foram repetidos utilizando,

Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) ; Fmoc-IIb-OH (394 mg, 1 mmol); Fmoc-Val-OH (339 mg, 1 mmol); Fmoc-Lys(Boc)-OH (468 mg, 1 mmol); Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol); Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol) ; Fmoc-Ala-OH (311 mg, 1 mmol); Ácido 5-fenilvalérico (178 mg, 1 mmol) ; 50 L·, ξ* Γ

Em cada caso, o tempo de acoplamento foi de cerca de 30 minutos e uma pequena porção da resina foi analisada quanto à finalização da acilação pelo teste de Kaiser. O ácido fenilvalérico necessitou de um par duplo para se obter um resultado positivo pelo teste de Kaiser. 0 péptido foi clivado a partir da resina utilizando uma mistura de ácido trifluoroacético (7,9 ml) e trietilsilano (0,395 ml). Após 2 horas, a resina foi lavada com diclorometano (aproximadamente 150 ml) e a solução resultante foi evaporada até à secura. O sólido resultante foi particionado entre éter (25 ml) e água (25 ml) e em seguida o éter foi extraído com novas porções de água (2 x 25 ml) . As fases aquosas foram combinadas e liofilizadas.

Purificou-se o produto bruto utilizando RP-HPLC preparativa (coluna Vydac 218TP1022, 250 mm x 22 mm), carregando o material bruto em 5 ml de acetonitrilo/água a 20% com 200 microlitros de DMF. A eluição foi realizada com um gradiente de acetonitrilo-água contendo TFA a 0,1% (acetonitrilo a 15-33%) durante 80 minutos, a um caudal de 10 ml/minuto. As fracções que contêm produto foram combinadas e liofilizadas para originar

Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH2 (SEQ ID N0:1) na forma de um sólido branco (84 mg; rendimento de 35%) 0 produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos. A RP-HPLC numa coluna Vydac C18, 218TP54, 4,6 x 250 mm, eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50% durante 30 minutos, 51

L-Ci caudal 1,0 ml/minuto, indicou uma pureza de 100%, tempo de retenção 18,56 minutos, espectroscopia de massa, m/e (electrospray positivo (ES+)) 954, 6 (MH+) ; análise de aminoácidos (hidrólise ácida durante 24 horas utilizando uma solução de HCL 6N contendo fenol a 1% a 130°C) originou (Ala-Ilb) 4,80. Vai 1,11, Lys 1,07. O Fmoc-Pip-OH foi obtido por um método análogo ao descrito em E. Atherton e R.C. Sheppard ("Solid phase peptide synthesis: a praticai approach", IRL press, 1989, pag 51) para N-Fmoc-L-metionina:

Fmoc-Pip- OH: RMN (DMSO-de) 1,3 (m, 2H) , 1,7 (m, 2H) , 2,5 (m, 2H), 2,9 (t, 2H) , 3,7 (m, 1H), 4,2 (t, 1H), 4,4 (d, 2H) , 7,4 (m, 4H) , 7,7 (d, 2H) , 7,9 (d, 2H), espectroscopia de massa m/ e (ES+) 352,2 (MH+)

Exemplo 2, Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH2 e separação de isómeros (SEQ ID NO:2) 2.1. Síntese de (RS)-2-alil-N-(benziloxicarbonil)prolina

Adicionou-se o éster de metilo da N-benziloxi- carbonilprolina (13 g) em THF (20 ml), gota a gota, a litio diisopropilamida (27,5 ml, 2M em hexano/THF) em THF (100 ml) a -78°C sob atmosfera de azoto. Agitou-se a mistura durante 30 minutos e em seguida adicionou-se iodeto de alilo (5,5 ml) gota 52

a gota e agitou-se a mistura por mais 30 minutos e em seguida deixou-se aquecer até à temperatura ambiente. Em seguida adicionou-se a mistura a cloreto de amónio aquoso (200 ml) e extraiu-se com éter (2 x 200 ml). A camada de éter foi evaporada e purificou-se o resíduo por cromatografia em sílica, utilizando um gradiente de hexano que aumenta para 20% de acetato de etilo:hexano. As fracções adequadas, evaporadas até à secura, originaram (RS) -2-alil-N-(benziloxicarbonil)prolinato de metilo (9 g) na forma de um óleo.

Dissolveram-se 8,5 g deste material em metanol (40 ml) e adicionou-se hidróxido de sódio (4,5 g) em água (20 ml) e levou-se a mistura ao refluxo durante 60 minutos. O pH da mistura foi em seguida ajustado para 7 com ácido clorídrico concentrado e removeu-se o metanol por evaporação. O pH da mistura foi ajustado para 3 e a mistura foi extraída com éter (2 x 50 ml) . Os extractos combinados foram evaporados para originar (RS)-2-alilo-N-(benziloxicarbonil)prolina na forma de uma goma: RMN (d6-DMSO (373K) ) : 1,9 (m, 2H), 2,1 (m, 2H), 2,6 (q, 1H) , 2,9 (q, 1H) , 3,4 (m, 1H) , 3,6 (m, 1H) , 5,0 (m, 4H) , 5,75 (m, 1H), 7,3 (m, 5H). 2.2 Síntese de éster de [(RS)-2-alil-N-(benziloxi carbonil) propil]-(S)-alanina metilo

O

53 Γ L·,

Adicionou-se HOBT (7,7 g), N-metilmorfolina (6,6 g), cloridrato de éster de metilo da L-alanina metil (4,5 g) e 1—(3— dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida (5,7 g) a (RS)-2-alil-N-(benziloxicarbonil)prolina (6,5 g) em DMF (30 ml) e agitou-se a mistura durante 18 horas e em seguida evaporou-se. O resíduo foi particionado entre éter e água, filtrado para remover o HOBt e a camada orgânica foi separada. Evaporou-se a camada orgânica e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica, utilizando um gradiente de 20% de acetato de etilo em hexano, aumentando para 50% de acetato de etilo em hexano. Combinaram-se as fracções adequadas e evaporaram-se até à secura para originar o éster de metilo da .[(RS)-2-alilo-N-(benziloxicarbonil)propil]-(S)-alanina (7 g) ; RMN (dô-DMSO (373K)): alguma duplicação de picos devido à mistura de diaestereoisómeros, 1,25 e 1,3 (2d, 3H) , 1, 75 (m, 2H) , 2, 2 (m, 2H), 2, 65 (m, 1H), 2,9 (m, 1H), 3,4 (m, 1H), 3,65 (2s, 3H) , 3,7 (m, 1H), 4,3 (2q, 1H), 5,0 (m, 4H) , 5, 7 (m , 1H), 7,3 (m, 5H) , 7,4 e 7,5 (bs, 1H) . 2.3 Síntese de metil(S)-2-(l-benziloxicarbonil-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-il)propionato (CbZ-III-OMe)

Adicionou-se tetróxido de ósmio (1,5 ml de uma solução aquosa a 4%) a éster de metilo da [ (RS) -2-alil-N-(benziloxicarbonil)-propil]-(S)-alanina (1,45 g) numa mistura de metanol (30 ml) e água (20 ml) . A mistura foi agitada sob atmosfera de árgon durante 10 minutos e em seguida adicionou-se 54 p L··. ^^ periodato de sódio (2,45 g) em porções. A mistura foi agitada durante 2 horas e em seguida adicionou-se água (100 ml) e extraiu-se a mistura com acetato de etilo (2 x 70 ml) . Os extractos combinados foram secos e evaporados para originar 1,4 g de uma goma. Dissolveu-se a goma em diclorometano (30 ml) e trietilsilano (0,65 g) e em seguida adicionou-se ácido trifluoroacético (4 g) gota a gota. A mistura foi agitada durante 3 horas, evaporada e o resíduo particionado entre bicarbonato de sódio aquoso e éter. O extracto de éter foi separado e evaporou-se até à secura. Purificou-se o resíduo por cromatografia em sílica utilizando um gradiente de 25% de acetato de etilo em hexano, aumentando para 100% de acetato de etilo. Combinaram-se as fracções adequadas e evaporaram-se até à secura para originar (S)-2-(l-benziloxicarbonil-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-il)propionato de metilo (0,8 g) ; RMN (d6-DMSO (373K)): alguma duplicação de picos devido a mistura de diaestereoisómeros, 1,25 e 1,35 (2d, 3H), 1,95 (m, 6H) , 3,1-3,5 (m, 4H) , 3,6 e 3,65 (2s, 3H) , 4,5 e 4,65 (2q, 1H) , 5,05 (m, 2H), 7,25 (m, 5H). 2.4 Síntese de ácido (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-il)propiónico (H-III-OH)

O

Adicionou-se carbonato de potássio (2,5 g) a (S)-2-(1-benziloxicarbonil-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]ηοη-7-il)propionato de metilo (3,3 g) numa mistura de metanol (40 ml) e água (40 ml) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 10 horas. O pH foi ajustado para ~5 com ácido clorídrico 55 concentrado e evaporou-se a mistura até à secura. O resíduo foi dissolvido em água (40 ml) e o pH ajustado para 3 com ácido clorídrico concentrado. A mistura foi extraída em seguida com diclorometano (2 x 50 ml) . Secaram-se os extractos combinados (MgSOJ e evaporaram-se para se obter uma espuma (2,8 g) .

Dissolveu-se a espuma em metanol (20 ml) e adicionou-se em seguida ciclohexano (0,7 g) seguido de Pd/C a 10% (0,5 g) .

Levou-se a mistura ao refluxo durante 2 horas, arrefeceu-se, filtrou-se e evaporou-se o filtrado para originar ácido (S)—2— (6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]ηοη-7-il)propiónico na forma de uma espuma (1,9 g) ; RMN (d5-DMSO) : alguma duplicação de picos devido à mistura de diastereoisómeros, 1,25 e 1,3 (2s, 3H), 1,8 (m, 4H) , 2,0 (m, 2H) , 3,0 (m, 2H) , 3,3 (m, 2H) , 4,5 (m, 1H) . 2.5 Síntese de ácido (S)-2-[1-(9-fluorenilmetiloxicarbonil)-6-oxo-l,7-diazaspiro-[4,4]non-7-il]propiónico (Fmoc-III-OH)

Adicionou-se bicarbonato de sódio sólido em excesso a ácido (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]ηοη-7-il)propiónico (0,42 g) em água (2 ml) e em seguida adicionou-se carbonato de 9-fluorenilmetil succinimidilo (0,7 g) em acetona (3 ml). A mistura foi agitada durante 18 horas. Adicionou-se em seguida a mistura a água (10 ml), extraiu-se com éter (10 ml) e separou-se a camada aquosa. (Desprezaram-se os extractos de éter). 56 ί ^

Ajustou-se ο ρΗ da camada aquosa para ~3 com ácido clorídrico concentrado e em seguida extraiu-se com diclorometano (2 x 10 ml). Separaram-se os extractos combinados, secaram-se (MgSOJ e evaporaram-se para originar ácido (S)-2-(1-(9-fluorenil-metiloxicarbonil)-6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]ηοη-7-il)propiónico (0,62 g) na forma de uma espuma branca; RMN (dg-DMSO) (373 K) : alguma duplicação de picos devido a mistura de diastereoisómeros, 1,3 (2d, 3H), 1,6-2,0 (m, 6H), 3,05 (m, 1H), 3,2-3,45 (m, 3H) , 4,2-4,4 (m, 1H) , 4,5 (m, 1H) , 6,2 (s, 2H), 7,35 (m, 4H) , 7,8 (m, 4H) . 2.6 Síntese de Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Vai -111-Ala-Pip-NH2 e separação de isómeros (SEQ ID NO:2) A primeira parte da síntese foi realizada utilizando uma metodologia semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4, mas utilizando Fmoc-III-OH em vez de Fmoc-IIb-OH. Neste caso, as acilações foram realizadas por activação dos ácidos do seguinte modo: Ácido (1 mmol), HBTU (1 mmol) , diisopropiletilamina (2 mmol), DMF (4 ml) . Verificou-se que todas as ligações estavam completas pelo teste de Kaiser, após menos de 45 minutos. Utilizou-se esta metodologia para se obter Fmoc-Val-III-Ala-Pip-NH-resina. A resina de péptido foi em seguida transferida para um sintetizador de péptidos automático ABI 431, em que os resíduos remanescentes na sequência foram ligados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples incorporando química de HBTU/HOBT, como se segue. Após desprotecção, lavou-se a resina com DMF (10 x 10-20 ml) . O ácido carboxílico (mmol) foi activado com HBTU (1 equivalente), HOBT (1 equivalente) e DIPEA (2 equivalentes) em DMF durante aproximadamente 1 minutos, antes de transferência para a resina. A acilação foi realizada durante aproximadamente 60 57

V lí minutos e em seguida a resina foi lavada com DMF (10 x 10-20 ml). A desprotecção de Fmoc em cada fase foi realizada utilizando uma solução a 20% de piperidina em DMF (dois tratamentos com 5 ml durante 10 minutos cada). Após cada desprotecção, a resina foi bem lavada com DMF (5 x 10 ml). 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com uma mistura de ácido trifluoroacético (TFA), trietilsilano (TES) e água (10 ml, 90:5:5) durante 1,5 horas. Removeu-se a resina por filtração, lavou-se bem com TFA, concentrou-se o filtrado recolhido até à secura, por evaporação rotativa e o resíduo resultante foi triturado com éter para originar Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH2 (SEQ ID NO:2), contendo dois componentes principais (a RP-HPLC (coluna Vydac 218TP54C18) indicou uma mistura a 52:48). O diastereoisómero mais polar eluiu com um tempo de retenção de 12,5 minutos e o diastereoisómero menos polar com um tempo de retenção de 16,5 minutos, utilizando um gradiente de acetonitilo:água (contendo TFA a 0,1%) de 20-50% durante 20 minutos, a um caudal de 1 ml/minuto. O péptido foi ainda purificado por RP-HPLC preparativa, essencialmente como descrito para o exemplo 1.4, para originar os dois componentes isolados, ambos >95% puros por RP-HPLC. O diastereoisómero mais polar era mais potente do que o diastereoisómero menos polar, nos testes A e B, e era caracterizado como se segue: RP-HPLC (gradiente de acetonitrilo de 20-50% durante 20 minutos, caudal 1 ml/minuto) tempo de retenção=12,3 minutos; espectrometria de massa, m/e (ES+) 994,5 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Ala 3,99, Lys 1,20, Vai 0,73. 58 ^

Exemplo 3. Phv-Al a -Ly s -Al a -1 Ib-Al a -AI a -Ala -Pip-NH2 (SEQ ID NO:3) A síntese foi realizada manualmente e a purificação foi realizada utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-OH pela ordem adequada. 0 produto foi caracterizado por HPLC, espectrometria de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1 %, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 25-40% durante 20 minutos, caudal 1,0 ml/minuto) tempo de retenção = 5,56 minutos; espectrometria de massa, m/e (ES+) 926, 5 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou (Ala + Ilb) 5,87, Lys 1,12.

Exemplo 4. Phv-Ile-Ala-Ala-Arg-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO:4) A síntese foi realizada manualmente e a purificação foi realizada utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo Fmoc-Papa-OH (utilizado em vez de Fmoc-Pip-OH) , os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-OH, pela ordem adequada. O produto foi .caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1 %, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 25-50% durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto) tempo de retenção = 17,08 minutos; espectrometria de massa, m/e (ES+) 1048,7 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Arg 0,98, Ala 3,00, Ilb 1,27, Thr 0,86, Ile 0,88. 59

0 Fmoc-Papa-OH foi obtido por um método análogo ao descrito em E. Atherton e R.C. Sheppard ("solid phase peptide synthesis: a praticai approach", IRL press, 1989, página 51) para N-Fmoc-L-metionina:

Fmoc-Papa-OH:RMN (DMSO-de) 3,5 (s, 2H) , 4,25 (t, 1H) , 4,5 (d, 2H) , 7,1 (d, 2H) , 7,4 (m, 6H) , 7,75 (d, 2H) , 7,9 (d, 2H) , 9,6 (s, 1H); espectrometria de massa m/e (ES~) 372, 1 (M-H)~.

Exemplo5. Phv-Ar g - AI a-AI a - ALa-Vai -1 Ib-Ala-Pip-NH2 (SEQ ID NO:5) A síntese foi realizada manualmente utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-OH pela ordem adequada. O produto foi purificado utilizando RP-HPLC preparativa de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4, eluindo com um gradiente de acetonitrilo-água contendo TFA a 0,1% (15-40% de acetonitrilo) durante 60 minutos a um caudal de 10 ml/minuto. O produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o exemplo 1,4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50% durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto), tempo de retenção = 18,28 minutos; espectrometria de massa, m/e (ES+) 982,5 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Arg 1,12 (Ala + Ilb) 3,8, Vai 1,12.

Exemplo 6. Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO:6) A primeira parte da síntese foi realizada manualmente, utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 60 ç U, 1.4, acoplando e desprotegendo Fmoc-Papa-OH (utilizado em vez do Fmoc-Pip-OH), os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-0H, pela ordem adequada para originar Fmoc-Thr(OBu)-Ilb-Ala-Papa-NH-resina. A resina de péptido foi então transferida para um sintetizador automático (ACT 357) e os resíduos remanescentes foram acoplados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples incorporando química de HBTU/HOBT. 0 péptido foi clivado a partir da resina e purificado por RP-HPLC preparativa, utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4. 0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4, RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1 %, utilizando um gradiente de acetonitrilo 10-50% durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto) tempo de retenção = 18,21 minutos; espectrometria de massa, m/e (ES+) 1006,4 (MH+), a análise de aminoácidos originou Arg 1,10, Ala 3,88, Ilb 1,04, Thr 0,95.

Exemplo 7. Phv-Al a-AI a-AI a - Ar g-Va 1 -1 Ib-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO:7) A primeira parte da síntese foi realizada manualmente, utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo Fmoc-Papa-OH (utilizado em vez de Fmoc-Pip-OH), os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-Ilb-OH pela ordem adequada, para originar Fmoc-Val-IIb-Ala-Papa-NH-resina. A resina de péptido foi em seguida transferida para um sintetizador automático (ABI 431) e os resíduos remanescentes foram acoplados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples, incorporando química de HBTU/HOBT. O péptido foi clivado da resina e purificado por RP- 61 V f u

HPLC preparativa, utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6. 0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 30 minutos, caudal 1.0 ml/minuto) tempo de retenção = 20,87 minutos, espectrometria de massa, m/e (ES+) 1004, 6 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Arg 0.96, (Ala + Ilb) 5,05, Vai 0,97.

Exemplo 8. Phv-Ala-Arg-AIa-Arg-Vai -1 Ib-Gly-Papa-NH2 (SEQ ID NO:8) A primeira parte da síntese foi realizada manualmente, utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo o Fmoc-Papa-OH (utilizado em vez de Fmoc-Pip-OH) , os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-OH pela ordem adequada, para originar Fmoc-Val-IIb-Gly-Papa-NH-resina. A resina de péptido foi em seguida transferida para um sintetizador automático (ABI 431) e os resíduos remanescentes foram acoplados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples, incorporando química de HBTU/HOBT. O péptido foi clivado da resina e purificado por RP-HPLC preparativa, utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6. O péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 30 minutos, caudal 1.0 ml/minuto) tempo de retenção = 18,12 minutos, espectrometria de massa, m/e (ÊS+) 538,4 (M'r2H','+) ; a análise de 62 t rr

\I aminoácidos originou Arg 0.92, Ala 2,16 (Gly + Ilb) 2,12, Vai 0, 88.

Exemplo 9. Phv-Ala-Ile-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Pip-NH2 (SEQ ID NO:9) A síntese foi realizada manualmente, e a purificação foi realizada utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-OH pela ordem adequada. O produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o exemplo 1.4/ RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto) tempo de retenção = 23,4 minutos, espectrometria de massa, m/e (ES+) 1024, 6 (MHT); a análise de aminoácidos originou Arg 1,15, (Ala + Ilb) 3,88, Vai 0,96, Ile 1,02.

Exemplo 10. Phv-Ala-Arg-Ala-His-Val-IIb-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO:10) A primeira parte da síntese foi realizada manualmente, utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo o Fmoc-Papa-OH (utilizado em vez de Fmoc-Pip-OH) , os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-Ilb-OH pela ordem adequada, para originar Fmoc-Val-IIb-Ala-Papa-NH-resina. A resina de péptido foi em seguida transferida para um sintetizador automático (ABI 431) e os resíduos remanescentes foram acoplados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples, incorporando química de HBTU/HOBT. O péptido foi clivado da resina e purificado por RP- 63 U Κ ΗΡΙΟ preparativa, utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6. 0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos, de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 20-50%, durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto) tempo de retenção = 18,8 minutos, espectrometria de massa, m/e (ES+) 1070, 6 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Arg 1,02, (Ala + Ilb) 4,12, Vai 0,90, His 0,95.

Exemplo 11. Phv-Al a-AI a-As n-Ar g - Va 1 -1 Ib-Ala-Pip-NH2 (SEQ ID NO:11) A primeira parte da síntese foi realizada manualmente, utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-OH pela ordem adequada, para originar Fmoc-IIb-Ala-Pip-NH-resina. A resina de péptido foi em seguida transferida para um sintetizador automático (ABI 431) e os resíduos remanescentes foram acoplados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples, incorporando química de HBTU/HOBT. 0 péptido foi clivado da resina e purificado por RP-HPLC preparativa, utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6. 0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos, de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto) tempo de retenção = 17,66 minutos, espectrometria de massa, m/e (ES+) 1025,5 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Arg 1,04, Ala 2,94, Vai 0,95, Asp 1,05. 64 \

t

Exemplo 12. Phv-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2 (SEQ ID NO:12) A primeira parte da síntese foi realizada automaticamente num sintetizador automático ABI 431, utilizando uma metodologia semelhante à descrita para o Exemplo 2.6, acoplando os aminoácidos protegidos com Fmoc pela ordem adequada, para originar Fmoc-Ala-Ala-Pip-NH-resina. 0 remanescente da síntese foi realizado manualmente e o produto foi purificado por RP-HPLC preparativa, utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4. 0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto) tempo de retenção = 16,68 minutos, espectrometría de massa, m/e (ES+) 954,6 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Arg 1,09, (Ala + Ilb) 5,88.

Exemplo 13. Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH (CH2) 3NH. C (=NH) .NH2 (SEQ ID NO:14) (a) Preparação de Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH (CH2) 3NH2 (SEQ ID NO:13) A resina de cloreto de 2-clorotritilo (0,4 g ca. 0,25 mmol de cloro disponível) foi convertida a (3-aminopropil)amino-resina por reacção com 1,3-diaminopropano (0,42 ml) em DMF (4 ml) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem com DMF, transferiu-se a resina para um sintetizador de péptidos 430A da Applied Biosystems e o acoplamento sequencial e desprotecção dos aminoácidos protegidos adequados foi realizado 65

de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. A resina foi em seguida lavada com metanol e seca (0, 722 g) . O péptido foi clivado da resina e purificado por RP-HPLC preparativa utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6. O produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 40 minutos, caudal 1,2 ml/minuto) tempo de retenção = 17,76 minutos. Obteve-se assim Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2) 3NH2 (SEQ ID NO: 13) (329 mg após liofilização) , espectrometria de massa, m/e (ES+) 916, 5 (MH+) . (b) Preparação de Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly- NH(CH2)3NH.C(=NHH) ,nh2 (SEQ ID NO:14)

Dissolveu-se Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH (CH2) 3NH2 (SEQ ID NO: 13) (329 mg) numa mistura de água (5 ml) e acetonitrilo (5 ml) e adicionou-se cloridrato de 1-H-pirazolo-1-carboxamidina (132 mg, 3 equivalentes) e diisopropiletilamina (52 microlitros, 1 equivalente). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 4 dias. A mistura foi purificada por RP-HPLC preparativa e caracterizada por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4. Obteve-se assim Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH (CH2) 3NH.C (=NH) .NH2 (SEQ ID NO:14) (178 mg); RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 40 minutos, caudal 1,2 ml/minuto) tempo de retenção = 18,42 minutos, espectrometria de massa, m/e (ES+) 958,5 (MH+) ; a 66 análise de aminoácidos originou Thr 0.86, Gly 0,90; Ala 3,20, Arg 1,00.

Exemplo 14. Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Gly-NHEt (SEQ ID NO:15) A primeira parte da síntese foi realizada num sintetizador 430A da Applied Biosystems e o acoplamento e desprotecção sequenciais dos aminoácidos protegidos adequados foi realizado de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante, começando com resina de éster de Boc-Gly-O-Benzil (resina Merrifield) (0,54 g, 0,25 mmol) . A resina foi lavada com metanol e seca (871 mg) e em seguida agitada cuidadosamente com DMF (10 ml) e etilamina 2M em metanol (10 ml), à temperatura ambiente durante 7 dias. A RP-HPLC indicou uma libertação rápida do éster de metilo para a solução seguido de uma conversão lenta para a N-etilamida ligeiramente mais hidrofilica. A mistura foi filtrada e a resina foi lavada com DMF. A evaporação dos solventes originou o péptido bruto, protegido como N-etilamida. O péptido foi desprotegido utilizando uma mistura de TFA, TES e água (90:5:5) e purificado por RP-HPLC preparativa utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6, para originar Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-Ilb-Gly-NHEt (SEQ ID NO: 15) (168 mg). O péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos, de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 40 minutos, caudal 1,2 ml/minuto) tempo de retenção = 17,85 minutos, espectroscopia de massa, m/e (ES+) 972, 5 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Thr 0.83, Gly 1,03, Ala 2,17, Ilb 0,9, Arg 2,00. 67

r \í

Exemplos 15 e 16.

Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (Exemplo 15) (SEQ ID NO:16)

Phv-Gap(Me) 4-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (Exemplo 16) (SEQ ID NO:17) (a) Preparação de Phv-Dap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO:36) A síntese foi realizada automaticamente num sintetizador 430A da Applied Biosystems, utilizando resina Fmoc Rink Amide (0,25 mmol) e o acoplamento e desprotecção sequenciais dos aminoácidos protegidos adequados, foram realizados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. O resíduo Dap foi incorporado utilizando Fmoc-Dap(Boc)-OH na fase adequada da síntese. A resina completa foi seca. Rendimento de 1,292 g (ganho de peso, 792 mg). O péptido foi clivado da resina e purificado por RP-HPLC preparativa utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4, mas utilizando uma coluna Dynamax 60A (diâmetro interno de 1 polegada (2,54 cm)), eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1% (gradiente de acetonitrilo de 10-40%, durante 60 minutos, caudal 1,2 ml/minuto, para originar Phv-Dap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(SEQ ID NO:36) (304 mg). 0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa, de um modo semelhante ao descrito para o exemplo 1,4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-40%, durante 40 minutos, caudal 1,2 ml/minuto) tempo de retenção = 24,5 minutos, espectroscopia de massa, m/e (ES*) 937,1 (MH+) . 68

(b) 0 péptido Dap (a) foi dissolvido em água (7 ml) e acetonitrilo (8 ml) e tratado com cloridrato de 1-H-pirazolo-l-carboxiamidina (130 mg) e diisopropiletilamina (53 microlitros) à temperatura ambiente, durante 1 semana. A RP-HPLC indicou uma conversão de apenas 40% para o péptido Gap correspondente. A tentativa de RP-HPLC preparativa falhou em separar completamente os dois compostos. Deste modo, a mistura foi tratada com HBTU (87 mg) e diisopropiletilamina (50 microlitros) em DMF (50 ml) , durante 16 horas, para converter o péptido Dap não modificado no péptido tetrametilguanidina (GapMe*) . A hidrofobicidade extra deste composto permitiu uma HPLC preparativa mais fácil (condições como descrito em (a) ), que foi realizada utilizando condições idênticas às descritas em (a) acima, para originar tanto (i) Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO: 16) (80 mg), que foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa, análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no exemplo 1.4, RP-HPLC (gradiente de acetonitrilo de 10-40% durante 40 min, caudal de 1,2 ml/minuto) tempo de retenção = 26,2 minutos, espectroscopia de massa, m/e (ES+) 978,5 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Thr 0,90, Ala 4,05, Ilb presente, pico na posição Trp para Gap. e (ii) Phv-Gap (Me) 4-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (122 mg) (SEQ ID NO:17), que foi caracterizado como para (i) acima; RP-HPLC (eluente e gradiente como em (i) acima) tempo de retenção = 28,4 minutos; espectroscopia de massa, m/e (ES+)1034, 6 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Thr 0,90, Ala 4,11, Ilb presente, pico na posição Trp para Gap(Me)4. 69 V Γ u

Exemplo 17. Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-I Ib-Gly-NHCH2CH2“Morf olina (SEQ ID NO:18)

Adoptou-se uma estratégia de fragmento protegido. Preparou-se automaticamente uma resina Fmoc-Gly-O-Clorotritilo (1 mmol, lg) num sintetizador 430A da Applied Biosystems, acoplando o Fmoc-Gly-OH (2 mmol) com a resina cloreto de 2-clorotritilo (lg, 1 mmol) em DMF (10 ml) na presença de N-diisopropiletilamina (4 mmol) e alongou-se por uma estratégia de acoplamento duplo (de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6), para originar a resina de péptido protegido (2,15 g). Após clivagem a partir da resina com diclorometano (30 ml) , ácido acético (5 ml) e trifluoroetanol (5 ml) à temperatura ambiente durante 1 hora, a resina foi removida por filtração e lavada com diclorometano e ácido acético. A evaporação dos solventes e subsequente liofilização a partir de acetonitrilo aquoso originou o ácido do péptido protegido desejado (1,23 g) . 0 péptido foi caracterizado de um modo semelhante ao descrito, no Exemplo 1.4, RP-HPLC (gradiente de acetonitrilo de 20-80% durante 40 minutos, caudal 1,2 ml/minuto) ,. tempo de retenção = 26,2 minutos. 0 ácido protegido (235 mg, 0,2 mmol) foi acoplado a 4-(2-aminoetil)morfolina (27 microlitros, 1 equivalente) em DMF (10 ml) com HBTU (76 mg, 1 equivalente) e diisopropiletilamina (70 microlitros). A evaporação do solvente, desprotecção com TFA/H20 a 90% e purificação, utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4, originou a amida pura (150 g) . O péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos, de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (gradiente de acetonitrilo de 10-40% durante 40 minutos, caudal 1,2 ml/minuto) tempo de retenção 70

Il

; U

= 18,6 minutos; espectroscopia de massa, m/e (ES+) 972,8 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Thr 0.6, Gly 1,02, Ala 2,94, Ilb 0,9, Arg 1,00.

Exemplo 18. Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-I Ib-Gly-N (CH2CH2) NCH2CH20-

CH2CH2OH (SEQ ID NO:19)

Utilizando um processo análogo ao descrito no exemplo 17 mas utilizando 4-[2-(2-hidroxietoxi)etil]piperazina em vez de 4-(2-aminoetil)morfolina, obteve-se Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-Ilb-Gly-N (CH2CH2) NCH2CH20-CH2CHzOH (SEQ ID N0:19).;0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos, de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4; RP-HPLC (utilizando um eluente e gradiente como no Exemplo 17) tempo de retenção = 20,5 minutos; espectroscopia de massa, m/e (ES+) 1016,8 (ΜΗΓ) ; a análise de aminoácidos originou Thr 0.89, Gly 1,02, Ala 2,98, Ilb 1,05, Arg 1,00.

Exemplo 19. Phv-Arg-Ala-AIa-Ala-Thr-IIb-Gly-Pape-NHC(=NH)NH2 (SEQ ID NO:20)

Utilizando um processo análogo ao descrito no Exemplo 17 mas utilizando 4-(2-guanidinoetil)anilina em vez de 4-(2-aminoetil)morfolina, obteve-se Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-Pape-NHC(=NH)NH2 (SEQ ID NO:20). 0 péptido foi purificado por HPLC preparativa de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4, mas utilizando uma coluna Vydac 201HS1022 (diâmetro interno de 1 polegada (2,54 cm)) e eluindo com um gradiente de acetonitrilo-água contendo TFA a 0,1% (10-35% de acetonitrilo) durante 60 minutos a um caudal de 12 ml/minuto. O péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de 71

aminoácidos; RP-HPLC (utilizando um eluente e gradiente como no Exemplo 17) tempo de retenção = 24,2 minutos; espectroscopia de massa, m/e (ES+) 1021,1 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Thr 0.8, Gly 0,95, Ala' 2,86, Arg 1,00, Ilb, presente.

Preparou-se o dicloridrato de 4-(2-guanidinoetil)anilina como se segue.

Agitou-se cloridrato de 4-nitrofenetilamina (1,013 g, 5 mmol), cloridrato de lH-pirazolo-l-carboxamidina (0,733 g, 5 mmol) e N-diisopropiletilamina (0,88 ml, 5 mmol) em acetonitrilo (10 ml) e água (10 ml) à temperatura ambiente durante 16 horas. Realizou-se a RP-HPLC preparativa em duas porções utilizando uma coluna Cl 8 Dynamax 60A, (diâmetro interno de 1 polegada (2,54 cm)) eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1% para originar 4-nitrofenetilguanidina pura. Dissolveu-se o produto em água (100 ml) e adicionou-se uma gota de ácido clorídrico concentrado, seguido de 5% de paládio em carbono (100 mg) e borbulhou-se hidrogénio através da solução, durante 4 horas. Removeu-se o catalisador por filtração e lavou-se com água. Removeu-se o material volátil por evaporação para originar cloridrato de 4-(2-guanidinoetil)anilina na forma de uma espuma castanha (0,984 g) (após secagem sobre um sedimento de hidróxido de potássio).

Exemplo 20. Phv-Al a -AI a -AI a -Arg - Thr -1 Ib-Al a - Papa -NH2 (SEQ ID NO:21) A primeira parte da síntese foi realizada manualmente, utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no Exemplo 2.6, utilizando activação HBTU/DIPEA e acoplando e desprotegendo os aminoácidos protegidos com Fmoc, e Fmoc-IIb-OH, na ordem adequada, para originar Fmoc-IIb-Ala-Papa-NH- 72 resina. A resina de péptido foi transferida para um sintetizador automático (ABI 431) e os resíduos remanescentes foram acoplados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples, incorporando química de HBTU/HOBT. 0 péptido foi clivado da resina e purificado utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6. 0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo durante 20 minutos, caudal 1,0 ml/minuto) , tempo de retenção = 11,57 minutos, Espectroscopia de massa, m/e (ES+) 1006,4 (MH+), 514,8 (M+H"+Na+) ; a análise de aminoácidos originou: Ala 4,19, Arg 0,91, Thr 0,74

Exemplo 21. Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-Papa-NH2 (SEQ ID NO:22) A primeira parte da síntese foi realizada manualmente, utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no Exemplo 2.6, utilizando activação HBTU/DIPEA e acoplando desprotegendo os aminoácidos protegidos com Fmoc, e Fmoc-IIb-OH, na ordem adequada, excepto para a incorporação do resíduo Azgly. O resíduo Azgly foi incorporado por acoplamento com Fmoc-Azgly-OSu (obtido como descrito em EP 518655) (4 equivalentes) com HOBT (0,25 equivalentes) em DMF a 50°C, durante 4 horas. Obteve-se assim Fmoc-IIb-Azgly-Papa-NH-resina. A resina de péptido foi transferida para um sintetizador automático (ABI 431) e os resíduos remanescentes foram acoplados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples incorporando química de HBTU/HOBT. O péptido foi clivado da resina e purificado utilizando um processo 73 semelhante ao descrito no Exemplo 2,6. 0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 15-35%, durante 20 minutos, caudal 1,0 ml/minuto), tempo de retenção = 8,10 minutos, Espectroscopia de massa, m/e (electrospray negativo (ES-)) 1076,4 (MH-); a análise de aminoácidos originou: Ala 2,10, Arg 2,00, Thr 0,99.

Exemplo 22. Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-NH2 (SEQ ID NO:23)

Utilizou-se um processo análogo ao descrito no Exemplo 21. A primeira parte da síntese foi realizada manualmente, utilizando activação HBTU/DIPEA para originar Fmoc-IIb-Azgly-Papa-NH-resina. A resina de péptido foi transferida para um sintetízador automático (ABI 430A) e os resíduos remanescentes foram acoplados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples incorporando química de HBTU/HOBT. O péptido foi clivado da resina e purificado utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6. O péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 20-35% durante 20 minutos, caudal 1,0 ml/minuto), tempo de retenção = 7,26 minutos, Espectrometria de massa, m/e (ES+) 945,6 (MH+);473, 4 (M+2H++) ; a análise de aminoácidos originou: Ala 2,08, Arg 2,00, Thr 0, 78 . 74

Exemplo 23. Phv-Al a -Ar g-Al a -1 Ib - AI a - Ar g - AI a - Papa-NH2 (SEQ ID NO:24)

Utilizou-se um processo análogo ao descrito no Exemplo 2.6, excepto que a totalidade da construção do péptido foi realizada manualmente utilizando activação HBTU/DIPEA, acoplando Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, FKioc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ilb-OH e ácido 5-fenilvalérico, na ordem adequada. 0 péptido foi clivado da resina e purificado utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6. 0 produto foi purificado utilizando RP-HPLC preparativa de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4, eluindo com um gradiente de acetonitrilo-água contendo 0,1% TFA (acetonitrilo 15-30%) durante 90 minutos a um caudal de 10 ml/minuto. O produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 15-30%, durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto), tempo de retenção = 20,02 minutos, Espectrometria de massa, m/e (ES+) 1061,6 (MH+) ; 531,4 (M+2HI + ) ; a análise de aminoácidos originou Ala 4,16, Arg 2,00, Ilb.

Exemplo 24. 3-(2-cianobenzo[b]tiofen-5-il)propionil-Ala-Arg-

Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO:25) A síntese e purificação foram realizadas manualmente, utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo o Fmoc-Papa-OH (utilizado em vez de Fmoc-Pip-OH), aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-OH, na ordem adequada e utilizando ácido 3-(2-cianobenzo[b]tiofen- 75 f-> ^ \1 5—i1)propiónico, em vez de ácido 5-fenilvalérico. 0 produto foi purificado utilizando RP-HPLC preparativa de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4, eluindo com um gradiente de acetonitrilo-água contendo TFA a 0,1% (acetonitrilo 15-40%) durante 60 minutos a um caudal de 10 ml/minuto. O produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto), tempo de retenção = 17,58 minutos, Espectrometria de massa, m/e (ES+) 1114,7 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou: Arg 2,86, Ala 4,12, Ilb 1,00. 0 ácido 3-(2-cianobenzo[b]tiofen-5-il)propiónico foi obtido como se segue: (a) Adicionou-se níquel de Raney (1 g) e hidrato de hidrazina (3 ml) a 5-nitrobenzo[b]tiofen-2-carboxilato de etilo (25 g) (obtido como descrito em Syn. Comm., (1991), 2^, 959- 964) em etanol (500 ml) a 60°C. Ocorreu uma reacção vigorosa e a mistura foi levada ao refluxo. Adicionaram-se outras porções de níquel de Rainey (1 g) e hidrato de hidrazina (3 ml) a intervalos de 10 minutos, até se ter adicionado um total de 15 ml e a mistura foi em seguida levada ao refluxo durante 90 minutos. Filtrou-se a mistura quente e evaporou-se o filtrado. Dissolveu-se o resíduo em etanol quente (300 ml) e adicionou-se carvão activado. Filtrou-se a mistura e evaporou-se o filtrado até à secura para originar 5-aminobenzo[b]tiofen-2-carboxilato de etilo (18 g) na forma de um sólido amarelo pálido.

Adicionou-se o sólido a uma mistura, com agitação, de ácido clorídrico concentrado (50 ml) e água (130 ml) a ~0°C.

Adicionou-se lentamente uma solução de nitrito de sódio (5,6 g) 76

X rt— L-i ^

M em água (20 ml) e deixou-se em seguida a mistura sob agitação a 0°C, por mais 30 minutos. Adicionou-se uma solução de iodeto de potássio (130 g) em água (200 ml) . Deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente e em seguida aqueceu-se a 50°C durante 30 minutos. Deixou-se a mistura arrefecer, extraiu-se com clorofórmio (150 ml) e lavou-se a camada orgânica com solução de metabisulfito de sódio. Secou-se a fase orgânica (MgS04) e evaporou-se para originar um óleo castanho. O óleo foi purificado por cromatografia em sílica utilizando um gradiente de hexano aumentando para 10% de acetato de etilo/hexano. Combinaram-se as fracções adequadas e evaporaram-se para originar 5-iodobenzo[b]tiofen-2-carboxilato de etilo (14 g) na forma de um óleo; RMN (d6-DMSO) : 1,35 (t,3H), 4,4 (q,2H), 7,8 (dd,1H), 7,9 (d, 1H), 8,15(s, 1H), 8,45 (d, 1H). (b) Adicionou-se hidróxido de sódio (5 g) em água (150 ml) a 5-iodobenzo[b]tiofen-2-carboxilato de etilo (14 g) em etanol (200 ml) e agitou-se a mistura durante 16 horas. Concentrou-se a mistura a cerca de 150 ml por evaporação e ajustou-se a mistura para pH ~3, por adição de ácido clorídrico diluído. Extraiu-se em seguida a mistura com éter dietílico (2 x 100 ml). Secaram-se os extractos orgânicos combinados (MgS04) e evaporou-se para originar ácido 5-iodobenzo[b]tiofen-2-carboxílico (11,7 g) na forma de um sólido; RMN (ds-DMSO) : 7,8 (dd, 1H), 7,9 (d, 1H) , 8,05 (s, 1H) , 8,45 (d, 1H) . (c) Adicionou-se cloreto de oxalilo (2,7 ml) e DMF (1 gota) a ácido 5-iodobenzo[b]tiofen-2-carboxílico (3,05 g) em diclorometano (30 ml), altura em que se iniciou a evolução de gás. Após terminar a evolução de gás, evaporou-se a mistura até à secura e dissolveu-se o resíduo em THF (10 ml) . Adicionou-se a solução a amoníaco aquoso concentrado (25 ml), em porções. No 77 final da adição, agitou-se a mistura durante 1 hora. Recolheu-se o sólido que precipitou por filtração, lavou-se com água e secou-se sob vácuo. Dissolveu-se o sólido (3 g) em DMF (15 ml) e adicionou-se a mistura a 0°C a uma mistura de DMF (20 ml) e cloreto de fosforilo (3 g). Agitou-se a mistura durante 2 horas. A mistura foi em seguida adicionada a água (60 ml) e recolheu-se o sólido que precipitou por filtração, lavou-se com água e secou-se sob vácuo para originar 2-ciano-5- iodobenzo[b]tiofen (2,65 g) na forma de um pó amarelo; RMN (d6DMS0); 7,9 (dd, 1H) , 8,0 (d, 1H) , 8,3 (s, 1H) , 8,45 (d, 1H) . (d) Adicionou-se acrilato de metilo (2 g) , trietilamina (2,35 g) e acetato de paládio (0,05 g) a 2-ciano-5-iodobenzo[b]tiofen (4,8 g) em DMF (25 ml) e agitou-se a mistura sob árgon a 90°C durante 30 minutos. Deixou-se a mistura arrefecer e em seguida adicionou-se a água (50 ml) . O sólido que precipitou foi recolhido por filtração e dissolvido em clorofórmio. Adicionou-se carvão activado, filtrou-se a mistura e secou-se o filtrado (MgS04) . Removeu-se o solvente por evaporação para originar 3-(2-cianobenzo[b]tiofen-5-il)acrilato de metilo (2,5 g) ; RMN (d6-DMS0) : 3,75 (s, 3H) , 6,7 (d, 1H), 7,8 (d, 1H), 8,0 (dd, 1H), 8,2 (d, 1H) , 8,3 (d, 1H) , 8,85 (s, 1H) . (e) 0 3-(2-cianobenzo[b]tiofen-5-il)acrilato de metilo (2,5 g) foi hidrogenado em THF (20 ml) utilizando paládio a 10% em carbono (0,5 g) como catalisador até a maioria do material de partida ter desaparecido, por cromatografia de camada fina (placas de sílica, com eluição com acetato de etilo/hexano 1:4). Filtrou-se a mistura e evaporou-se para originar 2-cianobenzo[b]tiofen-5-propionato de metilo (1,45) contaminado com ~20% de material de partida. Adicionou-se hidróxido de 78 V.

sódio (0,23 g) a uma mistura deste produto (1,4 g) em THF (10 ml) e água (3 ml) e agitou-se a mistura durante 2 horas. A mistura foi ajustada para ~pH5 com ácido clorídrico concentrado e concentrada por evaporação para remoção do THF presente. O pH da mistura foi em seguida ajustado para ~pH 3 com ácido clorídrico concentrado e a mistura foi extraída com diclorometano. O extracto foi seco (MgSCM e evaporado. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase inversa utilizando um suporte C13 e um gradiente de 40% de metanol/água, aumentando para 75% de metanol/água. As fracções adequadas foram combinadas e evaporadas para originar ácido 2-cianobenzo[b]tiofen-5-propiónico (0,28 g) na forma de um sólido branco; RMN (CDC13) , 2,88 (t, 2H) , 3,1 (t, 2H) , 7,4 (d, 1H) , 7,75 (s, 1H), 7,8 (d, 1H) , 7,85 (s, 1H) .

Exemplo 25. Ph v-Ar g-AI a-AI a -1 Ib-AI a-Ar g-AI a - Papa -NH2 (SEQ ID NO: 2 6) A síntese foi realizada manualmente e a purificação foi realizada utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo o Fmoc-Papa-OH (utilizado em vez de Fmoc-Pip-OH), os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-OH, na ordem adequada. 0 produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto), tempo de retenção = 17,45 minutos, Espectrometria de massa, m/e (ES+) 1061,9 (MH+); a análise de aminoácidos originou: Arg 1,94, Ala 4,04, Ilb 1,02. 79

V 1—

Exemplo 26. Phv-Arg-I1e-AIa-IIb-AIa-Arg-AIa-Papa-NH2 (SEQ ID NO:27) A síntese foi realizada automaticamente num sintetizador automático (ABI 431) utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no Exemplo 2.6, acoplando o Fmoc-Papa-OH e os aminoácidos protegidos com Fmoc na ordem adequada, com a excepção de que o Fmoc-IIb-OH foi incorporado manualmente. 0 produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto), tempo de retenção = 20,7 minutos, Espectrometria de massa, m/e (ES+) 1103,8 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou: Arg 1,92, Ala 3,03 Ilb 0,96, Ile 1,08.

Exemplo 27. Phv-Ile-Arg-Ala-IIb-Leu-Arg-AIa-Papa-NH2 (SEQ ID NO:28) A síntese foi realizada manualmente e a purificação foi realizada utilizando uma metodologia semelhante ao descrito para o Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo o Fmoc-Papa-OH (utilizado em vez de Fmoc-Pip-OH), os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIb-OH, na ordem adequada. O produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50%, durante 30 minutos, caudal 1,0 ml/minuto), tempo de retenção = 23,8 minutos, Espectrometria de massa, m/e (EST) 1145,7 (MH+) ; a 80 análise de aminoácidos originou: Arg 1,98, Ala 1,92, Leu 0,99, Ile 1,09, Ilb presente.

Exemplo 28. Phv-Ala-Arg-Ala-IIc-Ala-Ala-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO: 29) A síntese foi realizada manualmente, utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no Exemplo 1.4, acoplando e desprotegendo o Fmoc-Papa-OH (utilizado em vez de Fmoc-Pip-OH) , os aminoácidos protegidos com Fmoc e Fmoc-IIc-OH, na ordem adequada. O produto não necessitou de purificação por HPLC preparativa. O produto foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 20-40%, durante 20 minutos, caudal 1,0 ml/minuto), tempo de retenção = 10.45 minutos,

Espectrometria de massa, m/e (ES+) 962,5 (MH+) , 492,8 {MTH+Na)++; a análise de aminoácidos originou: Ala 4,90, Arg 1,00 IIc presente.

Obteve-se o Fmoc-IIc-OH utilizando um processo análogo ao descrito no Exemplo 1 para a preparação de Fmoc-IIb-OH, mas utilizando cloridrato de éster de metilo da glicina em vez de cloridrato de éster de metilo da L-alanina metil no passo 1.1. Obtiveram-se os seguintes intermediários:

Boc-(D)-Met-Gly-OMe; com rendimento de 80%; RMN (CDC13) : l,4d (s, 9H) , 2, Od (m, 1H) , 2,ld (m, 1H) , 2,ld(s, 3H) , 2,6d(t, 2H) , 3,8d(s, 3H), 4,05d(m, 2H), 4,4d(m, 1H), 5,3d(bs, 1H), 6,8d(bs, 1H) ; 2 — [3(R)-(N-[terc-butiloxicarbonil]amino)-2-oxo-pirroli-din-l-il]acetato de metilo; com rendimento de 50%; (RMN CDC13) : l,45d 81

Lc, -a. vf ' (s, 9H) , 2, Od (m, 1H), 2,6d (m, 1H) , 3,4d (m, 2H) , 3,8d (s, 3H), 4,05d(q,2H), 4,ld(m, 1H) , 5,55(bs,lH); ácido 2-[(3R)-3-(N-[9-fluorenilmetiloxicarbonil]amino)-2-oxo-pirroli-din-l-il]acético; com rendimento de 75%; RMN (d6-DMSO): l,9d(m, 1H) , 2,3d (m, 1H) , 3,3d (m, 2H) , 4,0d(q,2H), 4,3d(m,4H), 7,4d(m,4H), 7,6(m,2H), 7, 9d(d,2H) .

Exemplo 29. Phv-Arg-Ala-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO;30) A síntese foi realizada automaticamente num sintetizador de péptidos automático ACT 357 (utilizando resina Rink Amida MBHA) , acoplando o Fmoc-Papa-OH e os aminoácidos protegidos com Fmoc na ordem adequada, com a excepção de que o Fmoc-IIb-OH foi incorporado manualmente. Os acoplamentos automáticos foram realizados de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante para acilações simples, por activação do ácido carboxílico (1 mmol) com diisopropilcarbodiimida (1 equivalente) e HOBT (1 equivalente) em DMF durante aproximadamente 11 minutos antes da transferência para a resina. A acilação foi realizada durante aproximadamente 60 minutos e os processos de lavagem e desprotecção foram realizados de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 2.6. O acoplamento manual de Fmoc-IIb-OH foi realizado num tubo Bond Elut utilizando química HBTU/HOBT. O ácido 5-fenilvalérico requer um par duplo para se obter um resultado positivo pelo teste de Kaiser. O péptido foi em seguida clivado da resina e purificado por RP-HPLC preparativa utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no Exemplo 1.4. O produto , foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao 82 Γ descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 20-35%, durante 15 minutos, caudal 1,0 ml/minuto) , tempo de retenção = 10.33 minutos, Espectroscopia de massa, m/e (ES+) 976, 5 (MHT) , 499, 9 (M+H+Na)++; a análise de aminoácidos originou: Ala 5,02, Arg 1,00 Ilb 1,22.

Exemplo 30. Phv-Lys (=C (NMe2) 2) -Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (SEQ ID NO:31)

Utilizando um processo análogo ao descrito para o Exemplo 15(a), mas utilizando Fmoc-Lys(Boc)-OH em vez de Fmoc-Dap(Boc)-OH, obteve-se, após o péptido ter sido clivado da resina e após purificação por RP-HPLC preparativa, Phv-Lys-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (270 mg) . 0 péptido (270 mg) foi em seguida agitado numa mistura de HBTU (94 mg) , diisopropiletilamina (88 microlitros) e DMF (50 ml) durante 16 horas. A mistura foi evaporada e o resíduo foi purificado por RP-HPLC preparativa, utilizando um processo análogo ao descrito no Exemplo 15 (a). 0 péptido foi caracterizado por HPLC, espectroscopia de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4; RP-HPLC (gradiente de acetonitrilo de 10-40% durante 40 minutos, caudal 1,2 ml/minuto), tempo de retenção = 29.83 minutos, Espectroscopia de massa, m/e (ES+) 1077,27 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou: Thr 1,0, Ala 4,3, Arg. 1,00, Ilb presente; tetrametilhomoarginina presente. 83 Μ '

Exemplos 31-33. Ph ν - Ar g -Ala -AI a -AI a - Th r -1 Ib - AI a - Papa -NHCH2CH2 -

Morfolina (Exemplo 31) (SEQ ID NO:32)

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OCH3 (Exemplo 32) (SEQ ID NO:33)

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (Exemplo 33) (SEQ ID NO:34)

Agitou-se a resina hidroximetil poliestireno (1,67 irnnol) à temperatura ambiente com Fmoc-Papa-OH (1,5 g, 4 mmol), diiso-propilcarbodiimida (0,628 ml, 4 mmol) e dimetilaminopiridina (61 mg, 0,5 mmol) em DMF (5 ml) e diclorometano (20 ml) durante 2 horas. A resina foi filtrada e lavada com DMF (5 x 20 ml) e metanol (5 x 20 ml) e seca sob vácuo a 4 0°C (rendimento de 2,105 g) . A resina de péptido foi em seguida transferida para um sintetizador automático (ABI 430 A) e os restantes aminoácidos protegidos com Fmoc foram acoplados de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 26, para originar a resina de péptido protegida (2,992 g). A resina de péptido foi em seguida suspendida numa mistura de DMF (10 ml) e metanol (10 ml) e adicionou-se 4-(2-aminoetil)morfolina (0,88ml), seguida de uma quantidade catalítica de cianeto de potássio (50 mg) . Após 7 dias à temperatura ambiente, a mistura foi filtrada e a resina foi lavada com DMF (5 x 20 ml) . A resina foi imediatamente re-suspendida numa mistura de DMF (10 ml), metanol (10 ml) e cianeto de potássio (50 mg). Após 4 dias, a mistura foi filtrada e a resina foi lavada com DMF (5 x 20 ml) . Todos os filtrados e lavagens de ambos os tratamentos foram combinados e evaporados até à secura. Após desprotecção com TFA/H20 a 90% e remoção do material volátil por evaporação, purificou-se o resíduo por RP-HPLC preparativa, utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4, para originar 3 produtos. Os produtos foram caracterizados como se segue: 84

V

U

Phv-Arg-Al a-AI a-AI a - Thr -1 Ib-Ala-Papa-NHCH2CH2-Morf olina (SEQ ID NO:32) (40 mg) RP-HPLC (gradiente de acetonitrilo de 10-50% durante 40 minutos, caudal 1,2 ml/minuto) tempo de retenção = 19,5 minutos; espectrometria de massa, m/e (ES+) 1119,8 (MH)+; a análise de aminoácidos originou Thr 0,58, Ala 3,84, Arg, 1,16, Ilb 1,00;

Phv-Arg-Al a-AI a-Ala-Thr-Ilb-Ala-Papa-OMe (SEQ ID NO:33) (37 mg); RP-HPLC (gradiente de acetonitrilo de 10-50% durante 40 min, caudal 1,2 ml/minuto) tempo de retenção = 27,7 minutos; espectrometria de massa, m/e (ES+) 1021,6 (MH+) ; a análise de aminoácidos originou Thr 0,61, Ala 3,80, Arg 1,22, Ilb 0,97;

Phv-Arg-Ala-AIa-AIa-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (SEQ ID NO:34) (155 mg) ; RP-HPLC (gradiente de acetonitrilo de 10-50% durante 40 min, caudal 1,2 ml/minuto) tempo de retenção = 24,2 minutos, espectrometria de massa, m/e (ES+) 1007, 5 (MH)+; a análise de aminoácidos originou Thr 0,62, Ala 3,78, Arg 1,20, Ilb 0,98.

Exemplo 34.

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-N (CH2CH2) 2N- <CH2) zO (CH2) 2OH (SEQ ID NO:35)

Adicionou-se 4-[2-(2-hidroxietoxi)etil]piperazina (235 mg) a uma mistura de Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (135 mg), HBTU (51 mg), DIPEA (47 microlitros) e DMF (10 ml) e

agitou-se a mistura durante 60 minutos. Removeu-se o material volátil por evaporação e purificou-se o resíduo por HPLC 85 L-Cj ^

preparativa, utilizando um processo semelhante ao descrito no Exemplo 1.4, para originar Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-N (CH2CH2) 2NCH2CH2-OCH2CH2OH (SEQ ID NO: 35) (115 mg). O péptido foi caracterizado por HPLC, espectrometria de massa e análise de aminoácidos de um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 1,4; RP-HPLC (eluindo com acetonitrilo e água contendo TFA a 0,1%, utilizando um gradiente de acetonitrilo de 10-50% durante 40 minutos, caudal 1,2 ml/minuto) tempo de retenção = 18,83 minutos, espectrometria de massa, m/e (ES+) 1163,8 (Mh)+; a análise de aminoácidos originou Thr 0,62, Ala 3,80, Arg 1,2, Ilb 0,97.

Exemplo 35

Os compostos de acordo com o invento podem ser administrados para utilização terapêutica ou profilática a animais de sangue quente como o homem, na forma de composições farmacêuticas convencionais, em que um exemplo típico inclui o-seguinte:

Solução injectável

Dissolve-se 0,01 a 100 mg de ingrediente activo em até 2 ml de um veículo de injecção aquoso, a fim de se obter uma concentração de ingrediente activo entre 0,01 a 100 mg/ml. 0 veículo de injecção aquoso é tamponado a pH entre 5 e 8 utilizando um tampão farmaceuticamente aceitável (por exemplo, fosfato ou acetato) e contém um agente de ajuste de tonicidade, farmaceuticamente aceitável (por exemplo cloreto de sódio ou dextrose) adicionado para se obter isotonicidade. O veículo pode conter também opcionalmente outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis, como agentes solubilizantes (por 86 ί y| L-i, exemplo DMSO, etanol, propilenogilcol ou polietilenoglicol), preservantes e antioxidantes. 0 ingrediente activo pode ser tipicamente um exemplo descrito anteriormente e poderá estar presente de modo conveniente na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

Fórmulas Químicas P—R1—R2—R3—R4 I

lllh 87

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL

(i) REQUERENTE

(A) NOME: ZENECA LIMITED

(B) RUA: 15 STANHOPE GATE

(C) CIDADE: LONDRES

(E) PAÍS: REINO UNIDO

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): W1Y 6LN (G) TELEFONE: 0171 304 5000 (H) TELEFAX: 0171 304 515 (I) TELEX: 0171 834 2042

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: DERIVADOS PEPTÍDICOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS : 36 (iv) FORMA DE LEITURA DO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão # 1.30 (EPO) (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: GB 9603855.9 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 23-FEV-1996 (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: GB 9620819.4 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 05-OCT-1996 88

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)propa-noil]Ala-piperidin-4-carboxamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.1:

Xaa Ala Ala Lys Vai Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA 89 y L-Cj (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-(6-oxo-1,7-diazaspiro[4.4]ηοη-7-il)-propanoil]Ala-piperidin-4-carboxamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.2:

Xaa Ala Ala Lys Vai Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 90 -|>b (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = 5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l- il)propanoil]Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "Ala-piperidin-4-carboxamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.3:

Xaa Lys Ala Xaa Ala Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA 91

(A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ile" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.4:

Xaa Ala Ala Arg Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 92

V

V r I L— (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]Ala-piperidin-4-carboxamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.5:

Xaa Ala Ala Ala Vai Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 93

(ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.6:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 94 ί

V (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = ”[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-4-aminofenilacetamida]" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.7:

Xaa Ala Ala Arg Vai Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" 95

V r-' UCj

(ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Gly-4-aminofenilacetamida]" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.8:

Xaa Arg Ala Arg Vai Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 96

V ll LCi , (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopírrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-piperidin-4-carboxamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.9:

Xaa Ile Ala Arg Vai Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10

(i) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota 97 L-c, Γ "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil ] -Ala-4-aitiinofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.10:

Xaa Arg Ala His Vai Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO” /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-piperidin-4-carboxamida" 98

: r Si (χί) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.11:

Xaa Ala Asn Arg Vai Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALZAÇÃO: 6 99

V

r

Vi (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto= "OUTRO" /nota= "Ala-piperidina-4-carboxamida’ (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.12:

Xaa Arg Ala Xaa Ala Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13

(i) CARACTERÍSTICAS.DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 11 -1-il)- (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin· propanoil]-Gly-3-aminopropilamina]" 100 η\l

U (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.13:

Xaa Arg Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aitiinoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il) propanoil]-Gly-3-aminopropilguanidina" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.14:

Xaa Arg Ala Ala Thr Xaa 101

t 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido i (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: - 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopírrolidin-l-il)-propanoil]-Gly-NHetil" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.15:

Xaa Arg Ala Arg Thr Xaa 1 5 102

t (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-3-guanidino-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il) propanoil]-Ala-4-aminofenilacetamida] (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.16:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA 103

V I ή—’ (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto - "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-3-(tetrametilguanidino) Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l il)propanoil]-Ala-4-aminofenilacetamida]" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.17:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 104.

V 1—^ (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l- il)propanoil]-Gly-4-(2-aminoetil)morfolina" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.18:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 105 1

(ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l- il) propanoil] -Gly-piperazin-4-il. CH2CH2OCH2CH2OH" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.19:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" 106 /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l- il)propanoil]-Gly-4-aminofenetilguanidina" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.20:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido 107

V /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l- il)propanoil]-Gly-4-aminofenetilguanidina" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.20:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: . (A) NOME/CHAVE: péptido 107

(Γ-' U Ιί . (Β) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il) -propanoil]-Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.21:

Xaa Ala Ala Arg Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 22

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = 108 ^ L-^J ^^ "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-(NH-NH-CO)-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.22:

Xaa Arg Ala Arg Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 23

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il) -propanoil]-NH-NH-CONH2" 109

V

Lcj (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.23:

Xaa Arg Ala Arg Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 24

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "3-(2-cianobenzo[b]tiofen-5il)-propanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala "

(ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 110 \

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "OUTRO" /nota = "Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.24:

Xaa Arg Ala Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 25

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala " 111

(ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "OUTRO" /nota = "Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.25:

Xaa Arg Ala Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 26

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = 112 u "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala "

(ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "OUTRO" /nota = "Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.26:

Xaa Ala Ala Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 27

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido 113 (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO” /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala "

(ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "OUTRO" /nota = "Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.27:

Xaa Ile Ala Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 28

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ile" 114 (|— L-^ ^--Cb (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Leu "

(ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "OUTRO" /nota = "Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.28:

Xaa Arg Ala Xaa Arg Xaa 1 5 2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 29

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido 115

V

L-ii (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto - "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)acetil] -Ala "

(ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "OUTRO" /nota = "Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.29:

Xaa Arg Ala Xaa Ala Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 30

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 116

U I \ί (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala "

(ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "OUTRO" /nota = "Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.30:

Xaa Ala Ala Xaa Ala Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 31

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 117

t (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-tetrametilhomoArg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = " [ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.31:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 32

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 118 i

V (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍ S TICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propa-noil] -Ala- (4-aminofenil .CH2 .CO.NH.CH2 .CH2 .morfolina" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.32:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2·) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 33

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 119 (ix) (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "éster metilico do ácido [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)propanoil]-Ala-4-aminofenilacético" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.33:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 34

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Ala" 120

t (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "ácido [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l- il)propanoil]-Ala-4-aminofenilacético" (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.34:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 35

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Arg" CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 121 (ix) r i \ (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-4-aminofenilacetil-piperazin-4-il- CH2CH2OCHCH2CH2OH" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.35:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 36

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = "5-fenilpentanoil-Dpr" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "OUTRO" /nota = 122 "[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopirrolidin-l-il) propanoil]-Ala-4-aminofenilacetamida" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.36:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5

Lisboa, 08 de Setembro de 2000

O AGEN TE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

123

Claims

\

REIVINDICAÇÕES 1. Derivado peptídico de fórmula I, P-R1-]*2-]*3-!^4 ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, em que P é um resíduo hidrofóbico seleccionado de (a) um grupo orgânico alifático, aromático ou misto alifático/aromático de desde 5 a 20 átomos de carbono, ou um grupo orgânico heteroaromático ou misto alifático/heteroaromático de desde 5 a 20 átomos de carbono e 1, 2 ou 3 heteroátomos seleccionados de entre oxigénio, enxofre e azoto; (b) fenilalanina, e análogos seus derivados hidrogenados, para-clorofenilalanina, 3-(2-tienil)alanina, tirosina, Tyr(Ometil), triptofano, bifenilalanina, 3-(l- naftil)alanina, 3-(2-naftil)alanina e análogos seus derivados hidrogenados, 3-(1-adamantil)alanina, Glu(Obenzil), 3-(benziloxi)Ala, 3-(benzilsulfanil)Ala e 9-fluorenilGly, podendo cada um possuir, opcionalmente, no terminal N, um grupo orgânico alifático aromático, heteroaromático, ou misto alifático/aromático ou alifático/heteroaromático como definido em (a); e (c) Ala-Cha-, Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe e Ala-Ala-Ala-Phe, em que o primeiro aminoácido pode ser um aminoácido L- ou D- e pode possuir opcionalmente um grupo orgânico alifático, aromático, heteroaromático ou misto alifático/aromático ou alifático/heteroaromático, como definido em (a); R1 é uma sequência de 5 aminoácidos L e R3 é um único aminoácido L; ou 1 ^ U, ^^ R1 é uma sequência de 3 aminoácidos L e R3 é uma sequência de 3 aminoácidos L; R2 é um grupo de fórmula II ou fórmula III

It m em que Ra e Rb são independentemente seleccionados de entre hidrogénio e alquilo (Cl-4) e A é metileno ou oxigénio; e R4 é OH, NH? ou NRcRd, em que Rc é seleccionado de entre alquilo(Cl-4), 2-carbamoilciclopentilo, 2-piridilmetilo, 4-carbamoilciclohexilo, 4-carbamoilciclohexilmetilo, 3-carbamoilfenilo, 4-carbamoilfenilo, 4-(carbamoilmetil)-fenilo, 4-(carboximetil)fenilo, 4-(metoxicarbonilmetil)-fenilo, 2-morfolinoetilo e um grupo de fórmula -A1-G1 em que A1 é alquileno (C3-7) ou A1 é seleccionado de (1) um grupo de fórmula A2 -B2 em que A2 é p-fenileno ou 1,4-ciclohexileno e B2 é alquileno(Cl-4) ou A2 é metileno e B^ é p-fenileno ou 1,4-ciclohexileno; e (2) um grupo de fórmula A3-BJ-C3, em que A3 é metileno, B3 é p-fenileno ou 1,4-ciclohexileno e C3 é alquileno(Cl-3); e G1 é um grupo de fórmula -N=C [N (Rp) 2] 2 em que cada Rp é independentemente seleccionado de entre hidrogénio, metilo, etilo e propilo; ou A1 é um grupo de fórmula -A4-B4-, em que A4 é p-fenileno e B4 é CH2-CO- e G1 é 2-morfolinoetilo ou 4— [2— (2 — hidroxietoxi)etil]piperazin-l-ilo; e Rd é hidrogénio ou alquilo(Cl-4); ou R4 é 1-piperazinilo, 4-metil-l-piperazinilo, 4-amidino-l-piperazinilo, 4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)-1-piperazinilo, 2 V V Γ Ι,ΙΙΙΙΒ 1-piperidilo ou 1-piperidilo substituído na posição 4, em que o substituinte na posição 4 é seleccionado de entre carboxi, carbamoilo, N-(2-aminoetil)carbamoilo e N-(4-aminobutil)carbamoilo; ou R* é uma sequência de 1 a 6 aminoácidos ou uma amida sua derivada.
2. Derivado peptídico, ou sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, em que P é um grupo orgânico alifático, aromático ou misto alifático/aromático de desde 5 a 20 átomos de carbono, ou um grupo orgânico heteroaromático ou misto alifático/heteroaromático de desde 5 a 20 átomos de carbono e 1, 2 ou 3 heteroátomos seleccionados de entre oxigénio, enxofre e azoto.
3. Derivado peptídico ou um sal seu derivado farmaceu ticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1 em que P é seleccionado de entre 3-(benziloxi-carbonil)propionil-Phe, 3- (benziloxicarbonil)propionil-Cha, 4-(benziloxicarbonil)butiril-Phe, 4-(benziloxicarbonil) butiril-Cha, (5-oxo-pirrolidin-2-il)carbonil-Phe-Tyr, (5-oxo-pirrolidin-2-il)carbonil-Glu(OBenzil)-Tyr, acetil-Glu(OBenzil)-Tyr, difenilmetil .CONH.CH2CH2.CO-Cha, difenilmetil. CONH. CH2CH2. CO-Tyr, difenilmetil. CONH. - CH2CH2CH2.CO-Cha, difenilmetil .CONH.CH2CH2CH2.CO-Tyr, . difenilmetil. NHCO.CH2CH2CH2.CO-Cha, difenilmetil. NHCO.-CH2CH2CH2.CO-Tyr, benzil .NHCO.CH2CH2.CO-Cha, benzil. NHCO.-CH2CH2.CO-Tyr, N-acetil-4-cloro-beta-hidroxiPhe, 4-fenoxi-fenil.NHCO., benzil. NHCO.CH2CH2.CO (N-metilPhe) , benzil.-NHCO. CH2CH2 . CONH. CH (CHPh2) .CO, benzil.NHCO. CH2CH2 . CO-Tyr, 3 V rr\í L-C. t 3,3-difenilpropionilo, trans-cinamoilo, 5-fenilvalerilo e 3-(2-cianobenzo[b]tiofen-5-il)propionilo.
4. Derivado peptídico ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 em que R4 é OH, NH2 ou NRcRd, em que Rc é seleccionado de entre alquilo(Cl-4), 2-carbamoil- ciclopentilo, 2-piridilmetilo, 4-carbamoilciclohexilo, 4-carbamoilciclohexilmetilo, 3-carbamoilfenilo, 4-carba-moilfenilo, 4-(carbamoilmetil)fenilo, 4-(carboximetil)-fenilo, 2-morfolinoetilo e um grupo de fórmula -A±-G1 em que Aj é alquileno (C3-7) ou A1 é seleccionado de (1) um grupo de fórmula -A2 -B2- em que A2 é p-fenileno ou 1,4-ciclohexileno e B2 é alquileno(Cl-4) ou A2 é metileno e B2 é p-fenileno ou 1,4-ciclohexileno; e (2) um grupo de fórmula -A3-B3-C3-, em que A3 é metileno, B3 é p-fenileno ou 1,4-ciclohexileno e CJ é alquileno(Cl-3); e G1 é um grupo de fórmula -N=C [N (Rp) 2] 2 em que cada Rp é independentemente seleccionado de entre hidrogénio, metilo, etilo e propilo; e Rd é hidrogénio ou alquilo(Cl-4) ; ou R4 é 1-piperazinilo, 4-metil-l-piperazinilo, 4-amidino-l-piperazinilo, 4- (2- (2-hidroxietoxi)etil)-1-piperazinilo, 1-piperidilo ou 1-piperidilo substituído na posição 4, em que o substituinte na posição 4 é seleccionado de entre carboxi, carbamoilo, N-(2-aminoetil)carbamoilo e N-(4-aminobutil)carbamoilo; ou R4 é uma sequência de 1 a 6 aminoácidos ou uma amida sua derivada. 4 I ! VÍ U K- t
5. Derivado peptidico ou sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 4 em que P é um grupo orgânico alifático, aromático ou misto alifático/aromático de desde 5 a 20 átomos de carbono; os aminoácidos-L compreendendo R1 e R3 são independentemente seleccionados de entre Ala, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Asn, Gin, Arg, Thr e Vai; e R4 é OH, NH2, NHRc, em que Rc é seleccionado de entre alquilo(Cl — 4), 2-carbamoilciclopentilo, 2-piridilmetilo, 4-carbamoilciclohexilo, 4-carbamoilciclohexilmetilo, 3-carbamoilfenilo, 4-carbamoilfenilo, 4-(carbamoilmetil)-fenilo, ou R4 é 1-piperazinilo, 4-metil-l-piperazinil, 4-amidino-l-piperazinilo, 1-piperidilo ou 1-piperidilo substituído na posição 4, em que o substituinte na posição 4 é seleccionado de entre carboxi, carbamoilo, N-(2-aminoetil)carbamoil e N-(4-aminobutil)carbamoilo; ou R4 é uma sequência de 1 a 6 aminoácidos ou uma amida sua derivada. 5 V

L-Cj ^^ AA5 é seleccionado de entre Thr, Vai, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn e N3-dietilDap; e R3 é um único aminoácido' seleccionado de entre Ala, Gly, Dap, aza-alanina e azaglicina.
7. Derivado peptidico ou sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, 2, 3 ou 4 em que R1 é uma sequência de 3 aminoácidos L representada por AA1-AA2-AA3, em que AA1 é seleccionado de entre ala, Ile, Tyr, Vai, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4 e 3,3,3-trifluoroalanina; AA2 é seleccionado de entre Ala, Lys, Glu, Sar, Vai, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-trifluoroalanina e N6-dietilLys; e AA3 é seleccionado de entre Ala, His, Gin, Vai, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn e N3-dietilDap; e R3 é seleccionado de uma sequência de 3 aminoácidos L representada como AA6-AA7-AA8, em que AA6 é seleccionado de entre Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His e Dap; AA7 é seleccionado de entre Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic e Dic; e AA8 é seleccionado de entre Ala, Gly, Dap, aza- alanina e azaglicina
8. Derivado peptidico ou sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que Rz é um grupo de fórmula Ilb. 6

lib
9. Derivado peptídico, ou sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o grupo hidrofóbico P é 5-fenilvalerilo.
10. Derivado peptídico, ou sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que R4 é 4-carbamoil-l-piperidilo, 4-(carbamoilmetil)anilino ou 4(2-guanidinoetil)anilino.
11. Derivado peptídico de acordo com a reivindicação 1, ou sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, seleccionado de

Phv-Arg-Ala Ala -Ala-Th r-N"···

2 7 Phv-Ala-Arg-Ala- N **"’ H

O N - AIa-Arg-A!a-N-^y-CH2CON'Hs £ CN

CO-Ala-Arg-Ala-N'’*" H

N-Ala-Arg-Ala-N-^ y-CHaCONK O

ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, em que Phv representa um grupo 5-fenilvalerilo
12. Composição farmacêutica que compreende. um derivado peptidico de fórmula I, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, em associação com um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
13. Processo para a produção de um derivado peptidico ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, que compreende acoplar sequencialmente, na ordem adequada, aminoácidos protegidos ou sequências de dois ou mais aminoácidos protegidos de forma adequada, um grupo protegido de forma adequada de fórmula H-II-OH ou H-III-OH e, opcionalmente, um grupo protegido de forma adequada de fórmula R4-H, seguido de uma modificação opcional do grupo funcional do grupo amino do terminal N, a fim de introduzir um grupo hidrofóbico P, e remoção de quaisquer grupos protectores remanescentes e qualquer suporte sólido. 8 14 . Derivado peptidico de fórmula I de acordo com a reivindicação 1, para utilização como substância farmaceuticamente activa. 15. Utilização de um derivado peptidico de fórmula I, de acordo com a reivindicação 1 ou um sal seu derivado farmaceuticamente aceitável, para a produção de um novo medicamento para utilização no tratamento de uma doença auto-imune ou inflamatória, mediada por células T dependente de MHC de classe II. 16. Utilização de um derivado peptidico de acordo com a reivindicação 15 para o tratamento de artrite reumatóide, ou esclerose múltipla. Lisboa, 08 de Setembro de 2000 O AGENTE OFICIA]- DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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