SK114998A3 - Peptide derivatives, preparation method and use thereof - Google Patents

Description

Peptidové deriváty, spôsob prípravy a použitie

Oblasť techniky

Vynález sa týka určitých nových peptidových derivátov, ktoré majú farmakologicky výhodné vlastnosti na použitie pri liečení autoimunitných ochorení alebo stavov ako je reumatoidná artritída alebo ďalšie ochorenia sprostredkované T-bunkami závislými na MHC II. triedy. Vynález ďalej zahrňuje farmaceutické prípravky z nových chemických zlúčenín, spôsob prípravy týchto nových zlúčenín a ich použitie na liečenie jedného alebo viacerých spomenutých ochorení alebo stavov a tiež ich použitie na výrobu nových liečiv na takéto liečenie.

Doterajší stav techniky

Stimulácia ľudskej imunitnej odpovede závisí na rozpoznaní proteínových antigénov T-bunkami. Avšak samotné T-bunky nemôžu odpovedať na antigén, sú iba antigénom aktivované, pokiaľ sa antigén naviaže na molekuly hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) na povrchu buniek prezentujúcich antigén, ako sú B-bunky, makrofágy alebo dendritické bunky.

Molekuly MHC I. triedy vyvolajú odpoveď zabíjačských T-buniek, ktorá vedie k deštrukcii buniek nesúcich antigén. Molekuly MHC II. triedy vyvolajú odpoveď pomocných T-buniek, ktorá riadi rozvoj a dozrievanie vybraných B-buniek (t.j. tvorbu antigén-špecifických protilátok) a aktiváciu makrofágov.

Kritickou požiadavkou imunitného systému je schopnosť rozlišovať medzi vlastnými (self) a nevlastnými (nonself ’·), t.j. cudzími antigénmi.

Takéto odlíšenie je nevyhnutné na to, aby umožnilo imunitnému systému odpovedať na škodlivé cudzorodé patogény a pritom udržovať toleranciu k vlastným proteínom, a aby tak zabránilo poškodeniu vlastného tkaniva. Autoimunitné ochorenie vzniká vtedy, keď tolerancia vlastného zlyháva, čo umožňuje imunitnému systému reagovať proti vlastnému tkanivu, napríklad proti kĺbom v prípade reumatoidnej artritídy. Predpokladá sa, že udržovanie tolerancie a teda zabránenie autoimunitným ochoreniam závisí v kritickej miere na molekulách MHC.

Zistenie, že mnoho autoimunitných ochorení je spojených s dedičnosťou určitých alel MHC, dáva predpoklad na kľúčovú úlohu molekúl MHC v patogenéze autoimunitných ochorení. Tak napríklad roztrúsená mozgovo-miechová skleróza je spojená s dedičnosťou alely HLA-DR2, diabetes mellitus závislý na inzulíne je spojený s HLA-DR3 a/alebo HLA-DR4 a Hashimotova tyroitída s HLA-DR5. Obzvlášť silné spojenie existuje medzi predispozíciou k vývoju chronickej zápalovej kĺbovej reumatoidnej artritídy a dedičnosťou alel HLA-DR4Dw4 a/alebo HLA-DR4W14 a/alebo HLA-DR1. Predpokladá sa, že molekuly MHC spojené s autoimunitným ochorením sa viažu na určité vlastné antigény (self-antigens), prezentujú ich T-bunkám a tým stimulujú autoimunitnú odpoveď.

Iné peptidy, ktoré sa môžu viazať na MHC molekuly spojené s autoimunitou a/alebo ktoré môžu zabrániť väzbe vlastného antigénu alebo nahradiť už naviazaný vlastný antigén a/alebo inhibujú aktiváciu T-buniek (najmä aktivitu patogénnych T-buniek, t.j. Thl-buniek) a/alebo zvyšujú aktivitu ochranných T-buniek (t.j. Th2-buniek), alebo peptidy, ktoré interagujú s molekulami MHC alternatívnymi mechanizmami, ktoré bránia alebo modifikujú stimuláciu autoimunitnéj odpovede sprostredkovanej molekulami MHC, môžu špecificky potlačiť autoimunitnú odpoveď.

Agens takého druhu by poskytol možnosť liečenia autoimunitného ochorenia a pritom by zabránil celkovému potlačeniu imunitného systému, čo je doteraz obmedzujúci a škodlivý vedľajší účinok. Takéto oblasti by mali významné výhody v porovnaní so súčasným liečením ochorení, ako je napríklad reumatoidná artritída. V praxi je bežné liečenie reumatoidnej artritídy v počiatočnom štádiu pomocou prípravkov utišujúcich symptómy, ako je napríklad NSAID, ktoré nemajú na postup ochorenia žiadny prospešný vplyv a sú pritom často spojené s nežiaducimi vedľajšími účinkami. Liečenie vážnejších ochorení spočíva v použití takzvaných prípravkov druhej línie. Sú to často obyčajne cytotoxické zlúčeniny, ktoré majú obmedzenú účinnosť a ich toxicita môže spôsobiť vážne problémy. Agens modifikujúci ochorenie a založený na racionálnom podklade, ktorý by nebol spojený s nešpecifickou cytotoxicitou, by priniesol významný prospech v liečení reumatoidnej artritídy.

Peptidy, ktoré sa viažu na molekuly MHC a inhibujú aktiváciu T-buniek, boli opísané v medzinárodných patentových prihláškach WO 92/02543, WO 93/05011 a WO 95/07707.

Hoci už bolo objavených mnoho peptidov, ktoré inhibujú na HLA-DR obmedzenú aktiváciu aktiváciu T-buniek tým, že sa viažu na molekuly HLA-DR, existuje stála potreba ďalších zlúčenín, ktoré sa viažu na tieto molekuly a/alebo bránia väzbe alebo nahradzujú už naviazané vlastné antigény a/alebo inhibujú aktiváciu T-buniek a/alebo zvyšujú aktivitu ochranných T-buniek, alebo interagujú s molekulami MHC alternatívnymi mechanizmami a tak zabraňujú alebo modifikujú stimuláciu autoimunitnej odpovede, ktorá je príčinou ochorení a už spomenutých stavov.

Podstata vynálezu

Zistili sme, že peptidy podľa predloženého vynálezu (opísané ďalej) prekvapivo vykazujú také (t.j. už uvedené) farmakologicky výhodné vlastnosti, a preto sú základom predloženého vynálezu.

Jeden aspekt vynálezu poskytuje peptidový derivát podľa všeobecného vzorca I

P - R¹- R²- R³- R⁴ (I) kde

P je hydrofóbny zvyšok, R¹ je sekvencia 5 L-aminokyselín a R³ je jedna L-aminokyselina, alebo R^x je sekvencia 3 L-aminokyselín a R³ je sekvencia 3 L-aminokyselín,

R² je skupina podľa všeobecného vzorca II alebo III,

(III) kde

Ra a Rb sú nezávisle vybrané zo súboru obsahujúceho vodík a alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka a A je metylénová skupina (CH₂) alebo kyslík, a R^d je OH, NH₂ alebo NRcRd, kde Rc je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, a ďalej skupinu 2-karbamoylcyklopentylovú, 2-pyridylmetylovú, 4-karbamoylcyklohexylovú, 4-karbamoylcyklohexylmetylovú, 3-karbamoylfenylovú, 4-karbamoylfenylovú, 4-(karbamoylmetyl)fenylovú, 4-(karboxymetyl)fenylovú, 4-(metoxykarbonylmetyl)fenylovú, 2-morfolinoetylovú a skupinu podľa všeobecného vzorca -A^x-G^x, kde

A^x je alkylénová skupina s 3 až 7 atómami uhlíka alebo je A^x je vybraná zo (1) skupiny so všeobecným vzorcom -A²-B², kde A² je p-fenylénová alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a B² je alkylénová skupina s 1 až 4 atómami uhlíka, alebo A² je metylénová skupina a B² je p-fenylénová alebo 1,4-cyklohexylénová skupina , a (2) skupiny podľa všeobecného vzorca -A³-B³-C³, kde A³ je metylénová skupina, B³ je p-fenylénová alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a C³ je alkylénová skupina s 1 až 3 atómami uhlíka, a

G1 je skupina podľa všeobecného vzorca -N=C[N(Rp₂)] , kde každá Rp je nezávisle vybraná zo súboru obsahujúceho vodík, metylovú, etylovú a propylovú skupinu, alebo A^x je skupina podľa všeobecného vzorca -A⁴-B⁴, kde A⁴ je p-fenylén a B⁴ je -CH₂-CO- a G^x je 2-morfolinoetylová alebo 4-[2-(hydroxyetoxy)etyl]piperazín-l-ylová skupina, a Rd je vodík alebo alkylová skupina s 1 až 4 atómami uhlíka, alebo

R⁴ je 1-piperazinylová, 4-metyl-l-piperazinylová, 4-amidino-1-piperazinylová, 4-[2-(hydoxyetoxy)etyl]-1-piperazinylová, 1-piperidylová skupina alebo 4-substituovaná-l-piperidylová skupina, kde je substituent v polohe 4 vybraný zo súboru obsahujúceho karboxylovú, karbamoylovú, N-(2-aminoetyl)karbamoylovú a N-(4-aminobutyl)karbamoylovú skupinu, alebo

R⁴ je sekvencia 1 až 6 aminokyselín alebo ich amidov; alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ.

Pritom aminokyselina v R⁴ môže byť buď D- alebo L-stereoizomér. Ďalej ak je R⁴ definovaná ako hydroxylová skupina (OH), rozumie sa tým hydroxylová skupina C-koncovej aminokyseliny z R³. Podobne ak je R⁴ definovaná ako NH^, NRcRd, piperazinylová alebo piperidylová skupina atď., znamená to, že hydroxylová skupina C-konca aminokyseliny z R³ je nahradená touto skupinou. Ak sa tu používa termín aminokyselina, je tým mienená alfa-aminokyselina. Ďalej ak sa tu používa termín

L-aminokyselina, zahrňuje tiež aminokyseliny ako Gly, 2, 2-dietylGly, aza-alanín a aza-glycín, ktoré nemajú žiadny chirálny atóm uhlíka. Generický termín ako alkylová skupina zahrňuje varianty tak s priamym, ako aj rozvetveným reťazcom, ak to dovoľuje počet atómov uhlíka. Tá istá konvencia platí aj pre ostatné radikálové skupiny.

V odbore je dobre známe, že zlúčeniny, ktoré majú chirálne centrum môžu existovať vo forme racemickej zmesi (alebo zmesi diastereoizomérov ak existuje viac ako jedno chirálne centrum) alebo ako opticky aktívny enantiomér alebo diastereoizomér. V odbore je dobre známe aj to, že konkrétna biologická aktivita spojená s racemickou alebo diastereoizomérickou zmesou je dôsledkom, a to z väčšej časti alebo aj výlučne, aktivity jediného opticky aktívneho izoméru. Je potrebné rozumieť tomu tak, že vynález sa týka akejkoľvek formy peptidového derivátu podľa všeobecného vzorca I, ktorá vykazuje uvedené farmaceutický výhodné vlastnosti. Spôsob, ako získať jednotlivý opticky aktívny izomér, je v odbore dobre známy, napríklad ide o separáciu z racemickej alebo diastereoizomerickej zmesi, ktorá obsahuje izomér, pomocou konvenčných metód ako je chromatografia, alebo chirálnou syntézou, ktorá využíva ako východiskový materiál vhodný opticky aktívny materiál alebo medziprodukt, ako je to v ďalej uvedených príkladoch. Takisto je v odbore dobre známe, ako stanoviť farmakologické vlastnosti takýchto racemických alebo diastereoizomerických zmesí a jednotlivých opticky aktívnych izomérov, napríklad pomocou testov opísaných v tejto prihláške. Odborník , je preto schopný bez ťažkostí získať určité izoméry peptidových derivátov podľa vzorca I, ktoré majú tu uvedené výhodné farmakologické vlastnosti.

Je preto zrejmé, že predložený vynález zahrňuje akúkoľvek polymorfnú formu, akýkoľvek tautomér alebo akýkoľvek solvát alebo ich zmes, peptidového derivátu podľa všeobecného vzorca I, ktorý vykazuje tu uvedené výhodné farmakologické vlastnosti .

Vhodné hodnoty pre α-aminokyseliny v R¹ a R³ zahrňujú napríklad 20 prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín kódovaných genetickým kódom, predovšetkým alanín (Ala), kyselinu glutamovú (Glu), glycín (Gly), histidín (His), izoleucín (íle), lyzín (Lys), asparagín (Asn), glutamín (Gin), arginín (Arg), treonín (Thr), valín (Val) a prolín (Pro). Aminokyseliny ako je napríklad sarkozín (Sar), 3,3,3-trifluoroalanín, 2, 2-dietylglycín, kyselina 2,3-diaminopropánová (Dap), kyselina 2,4-diaminobutánová (Dab), kyselina 2-aminobutánová (Abu), homoarginín, homofenyalanín, trans-4-hydroxyprolín (Hyp), aza-alanín (Azala, H₂N-N(CH₃)-COOH), aza-glycín (Azgly, H₂N-NH-COOH), kyselina 1,2,3,4-tetrahydro-izochinolín-3-karboxylová (Tie), kyselina oktahydroindol-2-karboxylová (Oic) a kyselina dekahydroizochinolín-3-karboxylová (Dic) sú tiež vhodné (čo sa týka Dic, ide o formu, v ktorej majú obidve kruhové spojenia R konfiguráciu alebo majú obidve S konfiguráciu). Zodpovedajúce N²-metylované aminokyseliny sa môžu použiť rovnako ako zodpovedajúce aminokyseliny, kde voľná karboxylová skupina postranného reťazca je esterifikovaná (napríklad ako alkylester s alkylovou skupinou s 1 až 6 atómami uhlíka alebo benzylester) a voľná aminoskupina postranného reťazca je alkylovaná (napríklad metylovaná), acetylovaná alebo premenená na karbamát (napríklad alkylkarbamát, ako napríklad metyl- alebo etylkarbamát, fenyl- alebo benzylkarbamát).

Ďalšie vhodné hodnoty pre R¹ a R³ zahrňujú napríklad 2-substituovaný glycín, kde substituent v polohe 2 je skupina podľa všeobecného vzorca -(CH2)sNH2, kde s je 1 až 3, alebo skupina podľa všeobecného vzorca -(CH2)pN(Re)3*.X“, kde p je 2 až 4 a X^- je opačný ión (ako napríklad acetát, trifluoroacetát, hydroxid alebo chlorid), alebo skupina podľa všeobecného vzorca -(CH ) N(Re) , kde q je 0 až 4, alebo skupina podľa všeobecného vzorca -(CH2)₂_N=C[N(Re)₂]₂, kde r je 1 až 4 a Re je v troch predchádzajúcich skupinách nezávisle vybrané zo súboru obsahujúceho vodík a alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka (napríklad metylovú alebo etylovú skupinu).

Hodnota pre R¹je zaujímavá predovšetkým v prípade, keď ide o sekvenciu 5 aminokyselín, a zahrňuje napríklad sekvencie s piatou aminokyselinou (pri čítaní zľava doprava) Val alebo

Thr a sekvencie, kde štvrtou a piatou aminokyselinou sú Lys-Val, Arg-Val, Lys-Thr, Arg-Thr, Ala-Val alebo Ala-Thr.

Zvláštne hodnoty pre R¹, keď ide o sekvenciu 5 aminokyselín, zahrňujú napríklad Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Ala-Lys-Ala-Ala-Val, Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Val, Ala-Lys-Ala-Lys-Val, Al

Ala-Lys-Ala-Arg-Val,

Ile-Ala-Ala-Arg-Thr,

Ala-Arg-Ala-Lys-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-Ala-Ala-Thr,

Ala-Ala-Asn-Arg-Val alebo X-Ala-Ala-Ala-Thr, kde X je -NH.CH[CH₂NH.C(=NH).NH₂].CO- (ďalej sa táto skupina označuje termínom Gap) alebo -NH.CH(CH₂N=C[N(CH₃)₂J₂).CO- (ďalej sa táto skupina označuje termínom GapMe4), pričom výhodné skupiny sú Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Gap-Ala-Ala-Ala-Thr a GapMe4-Ala-Ala-Ala-Thr. Výhodné sú potom predovšetkým skupiny Arg-Ala-Ala-Ala-Val a Arg-Ala-Ala-Ala-Val.

Hodnota pre R¹, zaujímavá predovšetkým v prípade, keď ide o sekvenciu 3 aminokyselín, zahrňuje napríklad sekvencie, v ktorých aminokyselina susediaca s R² je Ala a sekvencie v ktorých druhá a tretia aminokyselina (pri čítaní zľava doprava) sú Lys-Ala, Arg-Ala, Ile-Ala a Ala-Ala.

Hodnota pre R^x, zaujímavá o sekvenciu 3 aminokyselín, Ala-Lys-Ala, Ala-Arg-Ala, predovšetkým v prípade, keď ide zahrňuje napríklad sekvencie Arg-Ala-Ala, Arg-Ile-Ala,

Arg-Ile-Arg a Ile-Arg-Ala, a predovšetkým Ala-Arg-Ala.

Hodnota pre R³, zaujímavá predovšetkým v prípade, keď ide o sekvenciu 3 aminokyselín, zahrňuje napríklad sekvencie, kde prvá aminokyselina (pri čítaní zľava doprava, t.j. susediaca s R²) je Ala alebo Leu.

Výhodná hodnota R³, keď ide o sekvenciu 3 aminokyselín, zahrňuje napríklad Ala-Ala-Ala, Leu-Arg-Ala a predovšetkým Ala-Arg-Ala.

Výhodná hodnota R³, keď ide o jednu aminokyselinu, zahrňuje napríklad Ala, Gly a Azgly, a predovšetkým Ala.

Konkrétne hodnoty pre Ra a Rb zahrňujú v prípade, že ide o alkylové skupiny, napríklad metylovú, etylovú a propylovú skupinu.

Výhodné hodnoty Ra a Rb zahrňujú napríklad vodík a metylovú skupinu.

Vhodná hodnota pre hydrofóbny zvyšok P (ktorý je výhodne pripojený k aminoskupine N-koncovej aminokyseliny v R^x) zahrňuje napríklad organickú hydrofóbnu skupinu ako je napríklad hydrofóbna alifatická, aromatická, heteroaromatická alebo zmiešaná alifatická/aromatická alebo alifatická/heteroaromatická organická skupina s 5 až 20 atómami uhlíka (a 1, 2 alebo 3 atómami vybranými zo súboru obsahujúceho kyslík, síru a dusík pre skupiny obsahujúce heteroarylovú skupinu), napríklad skupiny podľa všeobecného vzorca R-, R.CO-, R.SO₂~, R.O.CO-, R.NHC0-, R.O.CS-, R.S.CO-, R.NHCS-, R.S.CS- A R.CS-, kde R zahrňuje napríklad alkylovú skupinu s 5 až 10 atómami uhlíka, arylovú, heteroarylovú, arylalkylovú, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka, heteroarylalkylovú, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka, diarylalkylovú, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 8 atómov uhlíka, arylalkenylo vú, kde alkenylová arylcyklopropylovú, cykloalkylalkylovú, skupina obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka, cykloalkylovú a 5 až 10 atómami uhlíka, kde cykloalkylovú skupina obsahuje 5 až atómov uhlíka a alkylová skupina obsahuje 2 až 6 atómov uhlíka, 3-bifenylovú, 4-bifenylovú, 4-cyklohexylfenylovú,

2-naftyloxymetylovú, 3-naftyloxymetylovú, fenoxyfenylovú a tetrahydronaftylovú skupinu, a arylovú alebo heteroarylovú skupinu, ktorej hodnota R nesie ako substituenta jednu alebo viac alkylových skupín s 1 až 4 atómami uhlíka, halogénových, kyanových alebo alkoxylových skupín s 1 až 4 atómami uhlíka.

Jedno uskutočnenie vynálezu zahrňuje napríklad peptidové deriváty podľa všeobecného vzorca I, kd,e P je R.CO- v zmysle uvedenej definície. Ďalšie zvláštne uskutočnenie vynálezu za hrňuje napríklad peptidové deriváty podľa všeobecného vzorca I, kde P je hydrofóbna alifatická, aromatická alebo alifatická/aromatická organická skupina s 5 až 20 atómami uhlíka.

Zvláštne hodnoty R zahrňujú v prípade, že je to alkylová skupina s 5 až 10 atómami uhlíka, napríklad: pentylovú, izopentylovú, terc-pentylovú, 2-metylpentylovú, hexylovú, izohexylovú, 5-metylhexylovú a oktylovú skupinu, ak je to arylová skupina, napríklad: fenylovú, naftylovú a indenylovú skupinu, ak je to heteroarylová skupina, napríklad: 2-, 3-, 5- alebo 6-indolylovú, 2-, 3-, 5- alebo 6-indolinylovú, 2-, 3-, 5- alebo 6-benzo[b]tiofenylovú, tienylovú, 2-, 4- alebo 5-benzotiazolylovú, 2-, 4- alebo 5-benzoxazolylovú, 2-, 4- alebo 5- benzimidazolylovú, 1,4-benzodioxanylovú s väzbou v polohe 2-, 3-, 6- alebo 7-, a 2-, 3-, 5- alebo 6-benzofuranylovú skupinu, ak je to arylalkylovú skupina, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka, potom: arylalkylovú skupinu, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 6 atómov uhlíka (a kde arylová skupina zahrňuje napríklad ktorúkoľvek zo špecifických hodnôt pre arylovú skupinu, ktorá už bola uvedená a alkylová skupina zahrňuje napríklad metylénovú, etylénovú, trimetylénovú a pentametylénovú skupinu) ako napríklad: 2-fenyletylovú, 3-fenylpropylovú, 4-fenylbutylovú a 5-fenylpentylovú skupinu, ak je to heteroarylalkylová skupina, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka, potom: heteroarylalkylovú skupinu, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 6 atómov uhlíka (a kde heteroarylová skupina zahrňuje napríklad ktorúkoľvek hodnotu pre heteroarylovú skupinu, ktorá už bola uvedená a alkylová skupina zahrňuje napríklad metylénovú, etylénovú, trimetylénovú, tetrametylénovú a pentametylénovú skupinu) ako je 2-(2-kyanobenzo[b]tiofen-5-yl)etylová skupina, ak je to diarylalkylová skupina, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 8 atómov uhlíka, potom: diaryalkylovú skupinu, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 6 atómov uhlíka, ako je 2,2-difenyetylová, 3,3-difenylpropylová a 4,4-difenylbutylová skupina, ak je to arylalkenylová skupina, kde alkenylová skupina obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka, potom: arylalkenylovú skupinu, kde alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 atómov uhlíka, ako styrylová, 3-fenyl propén-2-ylová a 4-fenylbutén-l-ylová skupina, ak je to arylcyklopropylová skupina, potom: fenycyklopropylovú, 1-naftylcyklopropylovú a 2-naftylcyklopropylovú skupinu, ak je to cykloalkylová skupina s 5 až 10 atómami uhlíka, potom: cyklopentylovú, cyklohexylovú a 1-adamantylovú skupinu, ak je to cykloalkylalkylová skupina, kde cykloalkylovú skupina obsahuje 5 až 10 atómov uhlíka a alkylová skupina obsahuje 2 až 6 atómov uhlíka, potom: 2-(cyklohexyl)etylovú, 3-(cyklohexyl)propylovú a 4-(cyklohexyl)butylovú skupinu. Zvláštna hodnota pre substituent na arylovej skupine R zahrňuje napríklad metylovú a etylovú skupinu, chlóridovú, bromidovú a jodidovú skupinu, metoxyskupinu, etoxyskupinu a kyanovú skupinu.

Hydrofóbny zvyšok R tiež zahrňuje napríklad hydrofóbnu

L-aminokyselinu ako analógy ako je 3-(2-tienyl)alanín, je fenylalanín (Phe) a jej hydrogenované cyklohexylalanín (Cha), parachloroPhe, tyrozín (Tyr), Tyr(Ometyl), Tryptofán (Trp), bifenylalanín, 3-(1-naftyl)alanín, 3-(2-naftyl)alanín a jeho hydrogenované analógy, 3-(1-adamantyl)alanín (Ada), Glu(Obenzyl), 3-(benzyloxy)Ala, 3-(benzylsulfanyl)Ala a 9-fluorenylGly, z ktorých každý môže prípadne niesť na N-konci hydrofóbnu alifatickú, aromatickú, heteroaromatickú alebo zmiešanú alifatickú/aromatickú alebo alifatickú/heteroaromatickú organickú skupinu ako je definované alebo uvedené v príkladoch. Alternatívne môže hydrofóbna aminokyselina prípadne niesť napríklad ďalšiu sekvenciu 1 až 3 aminokyselín vybraných z ktorejkoľvek z hodnôt R^x a R³, ktoré už boli definované. Tak napríklad P konkrétne zahrňuje sekvencie Ala-Cha,

Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe a Ala-Ala-Ala-Phe. Prvá aminokyselina takejto sekvencie 1 až 3 aminokyselín (pri čítaní zľava doprava) môže byť Lalebo D-aminokyselina a môže prípadne niesť hydrofóbnu alifatickú, aromatickú, heteroaromatickú alebo zmiešanú alifatickú/aromatickú alebo alifatickú/heteroaromatickú organickú skupinu ako je už definované alebo uvedené v príkladoch.

11a

Ďalšie zvláštne hodnoty pre P zahrňujú napr. 3-(benzyloxykarbonyl)propionyl-Phe, 3-(benzylkarbonyl)pro-pionyl-Cha,

4-(benzyloxykarbonyl)butyryl-Phe, 4-benzyloxykarbonyl)butyryl-Cha, (5-oxopyrolidín-2-yl)karbonyl-Phe-Tyr, (5-oxopyrolidín-2-yl)karbonyl-Glu(Obenzyl)-Tyr, acetyl-Glu(Obenzyl)-Tyr, difenylmetyl. CONH. CH₂CH₂. CO-Cha, difenylmetyl. CONH. CH₂CH₂.

CO-Tyr, difenylmetyl.CONH.CH₂CH_aCH₂.CO-Cha, difenylmetyl.

CONH.CH₂CH₂CH₂.CO-Tyr, difenylmetyl.NHCOCH₂CH₂CH₂.CO-Tyr, benzyl.NHCOCH₂CH₂CO-Cha, benzyl.NHCOCH₂CH_aCO-Tyr, N-acetyl-4chloro-beta-hydroxyPhe, 4-fenoxyfenyl.NHCO-benzyl.NHCO.CH_aCH₂

CO.(N-metylPhe), benzyl.NHCO.CH₂CH₂CONH.CH(CHPh₂).CO, benzyl. NHCO.CH₂CH₂CO-Tyr, a ďalej 3,3-difenyl-propionylovú, trans-cinamoylovú, 5-fenylvalerylovú a 3-(2-kyano-benzo[b]tiofén-5-yl)propionylovú skupinou.

Zvlášť zaujímavá hodnota P zahrňuje napr. Ph(CH₂)₄.CO-(S-fenylvaleryl(Phv)), Ph.(CH₂)₄.CS a 3-(2-kyano-benzo[b]tiofén-5-yl)propionylovú skupinu.

Výhodná hodnota pre hydrofóbny zvyšok P zahrňuje napr.

3-(2-kyano-benzo[b]tiofén-5-yl)propionylovú a najmä 5-fenylvalerylovú (Phv) skupinu.

Keď Rc je skupina všeobecného vzorca -A^x-G^x, zvláštna hodnota pre A^x, ak je to alkenylová skupina, zahrňuje napr. metylénovú, etylénovú, propylénovú a butenylovú skupinu, zvláštna hodnota pre B², ak je to alkenylová skupina s 1 až 4 atómami uhlíka, zahrňuje napr. metylénovú, etylénovú a propylénovú skupinu, a zvláštna hodnota pre C³, ak je to alkenylová skupina s 1 až 3 atómami uhlíka, zahrňuje napr. metylénovú, etylénovú a propylénovú skupinu.

Zvláštna hodnota pre -A^x-G^x zahrňuje napríklad 3-guanidínpropylovú, 4-(2-guanidínetyI)fenylovú, 4-(2-morfolino-etyl-NH.CO.CH₂)fenylovú a 4-(4-[2-(2-hydroxy-etoxy)12 etyl]piperazin-l-yl.CO.CH₂)fenylovú skupinu.

Zvláštna hodnota pre R⁴, ak je to sekvencia 1 až 6 aminokyselín alebo ich amidov, zahrňuje napríklad sekvenciu L-aminokyselín nezávisle vybranú z hodnôt R^x a R³ už definovaných (ako je Äla-Thr-Gly-OH), alebo príslušných D-analógov, alebo sekvencie obsahujúce tak D- ako aj L-aminokyseliny, ako je amid odvodený z amoniaku, alkylamín s alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 atómy uhlíka (ako je metylamín) alebo dialkylamín s alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 atómy uhlíka (ako je dimetylamín). Zvláštny súbor hodnôt pre R⁴ zahrňuje napríklad tu definované hodnoty v prípade, že R⁴ nie je sekvencia 1 až 6 aminokyselín.

Výhodná hodnota pre R⁴ zahrňuje napríklad 4-karbamoyl-l-piperidylovú skupinu (zvyšok piperidín-4-karboxamidu, Pip-NH__), 4-karboxy-l-piperidylovú (zvyšok piperidín-4-karboxylovej kyseliny, Pip-OH), 4-(karbamoylmetyl)anilínovú (zvyšok

4-aminofenylacetamidu, Papa-NH₂), 4-(karboxymetyl)anilínovú (zvyšok 4-aminofenyloctovej kyseliny, Papa-OH) a 4-(2-guanidimetyl)anilínovú skupinu (zvyšok 2-(4-aminofenyl)etylguanidínu, Pape-NHC(=NH)NH₂).

Zvláštny súbor hodnôt pre R⁴ zahrňuje napríklad Pip-NH₂, Papa-NH₂, Pape-NHC(=NH)NH₂ a NHRc, kde Rc je 3-guanidínpropylová, 2-morfolinoetylová alebo 4-(2-(2-hydroxyetoxy)etyl-l-piperazinylová skupina.

Výhodná hodnota pre R² zahrňuje napríklad skupinu podľa vzorca II, najmä Ha a predovšetkým Ilb.

(Ha)

(Hb)

Výhodný súbor peptidových derivátov podľa vzorca I zahrňuje napríklad peptidové deriváty, kde R¹ je sekvencia 5 aminokyselín a R³ je jedna L-aminokyselina, pričom sekvencie R¹ a R³ majú ktorúkoľvek z hodnôt už definovaných vrátane zvláštnych a výhodných hodnôt pre R^x a R³. V rámci tohto súboru je zvlášť výhodný podsúbor peptidových derivátov obsahujúci napríklad také deriváty, kde R² je skupina podľa vzorca II, predovšetkým podľa Ha a najmä podľa Ilb. Ďalší podsúbor zvlášť výhodných peptidových derivátov zahrňuje napríklad také deriváty, kde R⁴ je Papa-NH2. Zvlášť výhodný také deriváty, kde R³ Ala-Papa-NH2.

Pip-OH, -Pip-NH₂, -Papa-OH alebo podsúbor zlúčenín zahrňuje napríklad spolu s R⁴ je Äla-Pip.NH^ alebo

Ďalší výhodný súbor peptidových derivátov podľa vynálezu zahrňuje napríklad také deriváty, kde R^x je sekvencia 5 L-aminokyselín podľa vzorca AA1-AA2-AA3-AA4-AA5, kde AA1 je vybraná zo skupiny obsahujúcej Ala, íle, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4 a 3,3,3-trifluoroalanín, predovšetkým Ala, íle, Arg, Gap a GapMe4, najmä Ala, Arg a GapMe4 a hlavne Ala a Arg, AA2 je vybraná zo skupiny obsahujúcej Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, íle, Tie, 3,3,3-trifluoroalanín a N⁶-dietylLys, predovšetkým Ala, Arg, íle, Lys a Tie, najmä Ala, Arg, Lys a íle a hlavne Ala a Arg,

AA3 je vybraná zo skupiny obsahujúcej Ala, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp a N³-dietylDap, predovšetkým Ala, His, Asp a Asn, najmä Ala a Asn a hlavne Ala,

AA4 je vybraná zo skupiny obsahujúcej Ala, Lys, Asn, Arg, Thr,

Glu, Sar, Gly, Pro, His a N^e-dietylLys, predovšetkým Ala, Arg, Lys a His, najmä Ala, Arg a His a hlavne Ala, a AA5 je vybraná zo skupiny obsahujúcej Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn a N³-dietylDap, predovšetkým Thr, Val a Dap a najmä Thr a Val, a kde R³ je jedna aminokyselina vybraná zo súboru obsahujúceho Ala, Gly, Dap, azaalanín a azaglycín, predovšetkým Ala, Gly a azaglycín, najmä Ala a Gly a hlavne Ala, a kde P, R² a R⁴ majú ktorúkoľvek hodnotu už definovanú, vrátane zvláštnych a výhodných. V rámci tohto súboru zvláštny podsúbor zlúčenín obsahuje napríklad také, kde sekvencia AA1-AA2-AA3-AA4-AA5 je vybraná zo súboru obsahujúceho Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Ile-Ala-Ala-Arg-Thr, Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Arg-Val, Ala-Ile-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-His-Val, Ala-Ala-Asn-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Gap-Ala-Ala-Ala-Thr, GapMe4-Ala-Ala-Ala-Thr a Ala-Ala-Ala-Arg-Thr. Výhodné sú zlúčeniny, kde R⁴ je Pip-NH₂, Papa-NH₂ a Pape-NHC(=NH)NH^.

Ďalší výhodný súbor peptidových derivátov podľa vynálezu obsahuje napríklad také deriváty, kde R¹ je sekvencia 3 L-aminokyselín podľa vzorca AA1-AA2-AA3, kde

AA1 je vybraná zo súboru obsahujúceho Ala, íle, Tyr, Val, Glu, Gap, GapMe4 a 3,3,3-trifluoroalanín, predovšetkým Ala, íle, Arg, Gap a GapMe4, najmä Ala, Arg a GapMe4 a hlavne Ala a Arg, AA2 je vybraná zo súboru obsahujúceho Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, íle, Tie, 3,3,3-trifluoroalanín a N^e-dietyl-Lys, predovšetkým Ala, Arg, íle, Lys a Tie, najmä Ala, Arg, Lys a íle a hlavne Ala a Arg,

AA3 je vybraná zo súboru obsahujúceho Ala, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp a N³-dietylDap, predovšetkým Ala, His, Asp a Asn, najmä Ala a Asn a hlavne Ala, a R³ je sekvencia 3 L-aminokyselín podľa vzorca AA6-AA7-AA8, kde AA6 je vybraná zo súboru obsahujúceho Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Ser, His a Dap, predovšetkým Ala, Leu a Pro a najmä Ala,

AA7 je vybraná zo súboru obsahujúceho Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic a Dic, najmä Ala a Arg, a AA8 je vybraná zo súboru obsahujúceho Ala, Gly, Dap, azaalanín a azaglycín, predovšetkým Ala, Gly a azaglycín a najmä Ala, a P, R² a R⁴ majú ktorúkoľvek hodnotu definovanú vyššie vrátane zvláštnych a výhodných hodnôt. V rámci tohto súboru zvláštny podsúbor zlúčenín zahrňuje napríklad také, kde sekvencia AA1-AA2-AA3 je vybraná z Ala-Lys-Ala a Ala-Arg-Ala a sekvencia AA6-AA7-AA8 je vybraná z Ala-Ala-Ala a Ala-Arg-Ala. Výhodné sú zlúčeniny, kde R⁴ je Pip-NH_a, Papa-NH_a a Pape-NHC(=NH)NH_a.

Výhodný aspekt predloženého vynálezu obsahuje peptidové deriváty podľa všeobecného vzorca I, kde R² je skupina podľa vzorca II (a najmä kde A je metylénová skupina), predovšetkým podľa vzorca Ilb a P, R¹, R³ a R⁴ majú ktorúkoľvek z definovaných hodnôt, vrátane zvláštnych a výhodných hodnôt.

Ďalší výhodný aspekt predloženého vynálezu obsahuje peptidové deriváty podľa všeobecného vzorca I, ktoré obsahujú arginínový zvyšok, predovšetkým zlúčeniny, v ktorých prvý aminokyselinový zvyšok v R¹ (pri čítaní zľava doprava), ak R^xje sekvencia 5 L-aminokyselín, je argininyl (ako napríklad Arg-Ala-Ala-Ala-Val a Arg-Ala-Ala-Ala-Thr) a zlúčeniny, v ktorých prvý aminokyselinový zvyšok v R^x, ak je to sekvencia 3 L-aminokyselín, je argininyl a/alebo druhý aminokyselinový zvyšok v R³, ak je to sekvencia 3 L-aminokyselín, je argininyl (ako keď R^x je Arg-Ala-Ala a R² je Ala-Ala-Ala alebo keď tak R^x ako aj R² je Ala-Arg-Ala).

Ďalší aspekt predloženého vynálezu obsahuje peptidové deriváty podľa všeobecného vzorca I, kde R² je skupina podľa vzorca Hla alebo Illb,

(Hla) (Illb) a kde P, R¹, R³ a R⁴ majú ktorúkoľvek z už uvedených hodnôt, vrátane zvláštnych a výhodných hodnôt.

Medzi zvlášť zaujímavé zlúčeniny podľa vynálezu patria napríklad špecifické uskutočnenia vynálezu v oddiele Príklady uskutočnenia vynálezu. Z nich zlúčeniny uvedené v príkladoch 5, 16, 19, 23 a 24 sú zvlášť dôležité a tak tieto zlúčeniny, ako aj ich farmaceutický prijateľné soli, sú ďalšími aspektami vynálezu.

Vzorec zlúčeniny z príkladu 5 (sekvencia SEQ ID NO: 5):

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Val-N'···

H

Vzorec zlúčeniny z príkladu 16 (sekvencia SEQ ID

NO: 17):

^Me2^N _Xx,NMe₂

Phv— N

H

ch₂conh₂

Vzorec zlúčeniny z príkladu 19 (sekvencia SEQ ID NO: 20):

Vzorec zlúčeniny z príkladu 23 (sekvencia SEQ ID NO: 24):

Phv-Ala-Arg-Ala-N

H

N-Ala-Arg-Ala-N-^~^H

CH₂CONH₂

Vzorec zlúčeniny z príkladu 24 (sekvencia SEQ ID NO: 25):

CN

Farmaceutický prijateľné soli zahrňujú pre peptidové deriváty, ktoré sú dostatočne zásadité, napríklad také soli, ktoré majú voľnú aminoskupinu, soli s kyselinami, ktoré tvoria fyziologicky prijateľné anióny, ako sú soli s minerálnymi kyselinami, napríklad s halogénvodíkmi (ako je napríklad chlorovodík a bromovodík), kyselinou sulfónovou a fosfónovou, a s organickými kyselinami ako je kyselina octová, oxalová, vínna, mandľová, p-toluénsulfónová, metánsulfónová, trifluoroctová a podobne, a pre peptidové deriváty, ktoré sú dostatočne kyslé, napríklad také soli, ktoré majú voľnú karboxylovú skupinu, soli so zásadami, ktoré tvoria fyziologicky prijateľné katióny, ako sú soli s alkalickými kovmi (ako sodík a draslík) a kovmi alkalických zemín (ako horčík a vápnik), amóniové soli a soli hliníka, a tiež soli s vhodnými organickými zásadami ako je etanolamín, metylamín, dietylamín, izopropylamín, trietylamín a podobne.

Peptidové deriváty podľa vzorca I alebo ich farmaceutický prijateľné soli, ako už bolo uvedené, budú prospešné farmakologicky pôsobiť u teplokrvných živočíchov (vrátane človeka) na rad autoimunitných ochorení alebo stavov, a to na liečenie symptómov alebo ako ochorenie modifikujúci agens alebo ako profylaktický prípravok. Medzi takéto ochorenia patria napríklad reumatoidná artritída, roztrúsená mozgovo-miechová skleróza, Goodpasterov syndróm, idiopatická trombocytopenická purpura, juvenilná reumatoidná artritída, celiakia, systémový lupus erytematosus, ankylozujúca spondylartritída, Sjogrenov syndróm, myasténia gravis, diabetes I. typu (závislý na inzulíne), Hashimotova choroba, Graveho choroba, Addisonova choroba, sklerodermia, polymyozitída, dermatomyozitída, pemfigus, pemfigoid, autoimunitná hemolytická anémia, perniciózna anémia, glomerulonefritída, odmietnutie štepu a podobne, najmä však reumatoidná artritída a roztrúsená mozgovo-miechová skleróza (sclerosis multiplex).

Užitočnosť peptidových derivátov podľa vzorca I alebo ich farmaceutický prijateľných solí je možné hodnotiť pomocou rôznych štandardných testov a klinických štúdií vrátane tých, ktoré sú opísané v medzinárodných patentových prihláškach

WO 92/02543, WO 93/05011 a WO 95/07707 (a ich modifikáciách) a tiež tých, ktoré sú ďalej opísané v prihláške. Peptidové deriváty podľa vzorca I vykazujú významnú aktivitu v jednom alebo vo viacerých testoch a štúdiách.

Test A: In vitro väzbový test s purifikovaným peptidom HLA-DR (Tento test je vhodný na dôkaz väzby peptidového derivátu podľa vzorca I s molekulami MHC II.t riedy spojenými s ochorením. ) μΐ biotín-FHA (peptid FHA(307-320) derivatizovaný dlhým reťazcom biotínu na N-konci, biotín-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) v koncentrácii 800 nM vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS) sa inkubuje s 30 μΐ purifikovaného HLA-DR4DW4 v koncentrácii 0,5 až 5 gg v jamkách tvaru V na mikrodoštičke (Nunc) počas 48 hodín buď s inhibítorovým peptidom alebo bez neho. Na konci inkubácie sa 100 μΐ prenesie na ELISA mikrodoštičku (Nunc) vopred pokrytú protilátkou anti-MHC (L243-ATCC (Americká kolekcia mikroorganizmov) HB55, ako publikovali Lampson a Levy, 1980, J. Immunol. 125, 293-229) v koncentrácii

Mg/ml počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa blokuje 1% roztokom hovädzieho sérového albumínu (BSA) v PBS a 0, 05% Tween20. Po ďalšej hodine sa nenaviazaný peptid opláchne a pridá sa streptavidínperoxidáza (Sigma) zriedená 1/4000 v PBS s 0,01% vhodného detergentu ako je NP-40 (Sigma) na 2 hodiny pri teplote miestnosti. Po ďalšom opláchnutí sa na každú doštičku pridá tetrametylbenzidénový (TMB) substrátový roztok (1 tableta TMB (Sigma) v 10 ml 0,1 M citrát/acetátového pufra, pH 6,0, s 36 μΐ peroxidu močoviny (UHPO) (Fluka). Reakcia sa zastaví pridaním 2 M kyseliny sírovej (10 μΐ do každej jamky) a množstvo naviazaného peptidu sa kvantifikuje meraním absorbancie pri vhodnej vlnovej dĺžke 450 nm. Inhibičná aktivita peptidu sa stanoví tak, že sa vynesie závislosť absorbancie od koncentrácie.

Purifikované molekuly HLA-DR4DW4 sa dajú získať nasledujúcimi spôsobmi:

(i) Expresia HLA-DR v bakulovírusovom systéme

Expresia rekombinantných proteínov z bakulovírusových vektorov v hmyzích bunkách je v odbore dobre známy spôsob ako získať vysoké výťažky rekombinantných proteínov (Luckow, V.A. a Summers, M.D., 1988, Biotechnology, 6, 47-551). Aby sa umožnila expresia heterodynamickej molekuly HLA-DR, t.j. HLA-DR4Dw4, z jediného rekombinantného bakulovírusového vektora (oproti možnosti použiť dva samostatné rekombinantné vírusy pre a a B reťazce a potom uskutočniť koinfekciu), skonštruuje sa rekombinantný bakulovírus, ktorý nesie tak a ako B reťazec.

cDNA kódujúca sekvenciu a polypeptidu sa klonuje do transferového vektora pacYMl (Matsuura, Y., Posee, R.D., Overton, H.A. a Bishop, D.H.L., J. Gen. Virol. 68, 1233-1250) a tým sa vloží expresia tohto proteínu pod kontrolu polyhedrinového promótora. Táto jednotka sa vloží do genómu bakulovírusu pomocou homológnej rekombinácie v hmyzích bunkách Sf21, čím sa vytvorí jednoduchý rekombinantný bakulovírus pre a reťazec. Spôsoby kultivácie a infekcie hmyzích buniek, homológnej rekombinácie a detekcie a izolácie rekombinantného vírusu boli kompletne opísané v práci Summers, M.D.D. a Smith, G.E., 1987 (A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin No. 1555). Molekulárno-genetické metódy na konštrukciu rekombinantných vektorov sú takisto dostupné v odbornej literatúre a sú kompletne opísané v príručke Sambrook, J., Fritsch, E.F. a Maniatis, T., 1989 (Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Prešs).

Na vytvorenie dvojitého rekombinantného bakulovírusu sa cDNA kódujúci B reťazec klonuje do transferového vektora pAcUWl (Weyer, U., Knight, S. a Possee, R.D., 1990, J. Gen. Virol. 70, 1990, 1525-1534), čím sa expresia proteínu vloží pod kontrolu promótora P10. Táto jednotka sa potom vloží do genómu jednoduchého rekombinantného bakulovírusu, ktorý už nesie a reťazec. Dvojitý rekombinantný vírus sa deteguje tak, že sa hmyzie bunky nanesú na membránu a nechajú sa reagovať s mo noklonálnou protilátkou, t.j. L243, ktorá špecificky rozpoznáva heterodimér HLA-DR. Naviazanie protilátky na hmyzie bunky sa deteguje použitím štandardnej metódy prietokovej cytometrie, ktorá je ľahko dostupná v literatúre. Stabilné dvojité rekombinantné bakulovírusy exprimujúce HLA-DR sa vyčistia z vírusových plakov.

(ii) Purifikácia HLA-DR z hmyzích buniek

Použitý spôsob purifikácie je modifikáciou spôsobu, ktorý opísal Gorga et al., 1987 (Gorga et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 16087-16094). Hmyzie bunky Sf21 s bakulovírusom exprimujúce HLA-DR (10 1 sa rovná približne 2xl0¹⁰ buniek) sa solubilizujú v 100 ml roztoku so zložením: 5 mM EDTA (sodná soľ), 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 2% NP-40, 150 nM NaCl, 1 mM jodoacetamid a 1 mM PMSF, a to homogenizáciou 10 ťahmi sklotefIónového homogenizátora. Homogenát sa centrifúguje pri 100 000 g počas 1 hodiny a potom sa odoberie supernatant. Supernatant sa potom cez noc inkubuje s monoklonálnou protilátkou anti-HLA-DR LB3.1 (Gorga et al., 1986, Celí Immunol. 103, 160-172) kovalentne naviazanej v pomere 50 mg L243 k 10 ml sepharózy s A-proteínom (Proteín A-Sepharose fast flow, Pharmacia) a preinkubovanej s 10 ml Tris-HCl, pH 8,0, a 0,1% NP-40. Živica sa potom nanesie do kolóny a premyje sa roztokom 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% NP-40 (20x objem kolóny) a potom roztokom 0,5 M NaCl, 50 nM Na_zHP0₄, pH 7,0, 1% oktylglukozidu (20x objem kolóny). HLA-DR sa potom eluuje roztokom 50 mM dietylamínu, pH 11,0, 0,15 M NaCl a 1% oktylglukozidu. Frakcie sa ihneď neutralizujú 1 M Tris-HCl, pH 8,0, a koncentrujú ultracentrifugáciou cez membránu Centricon-10. Obsah proteínu sa určí pomocou proteínového testu BCA (Pierce) a čistota pomocou SDS-PAGE elektroforézy.

Všeobecne platí, že peptidové deriváty podľa vynálezu podľa vzorca I, ktoré sa testovali v teste A, prejavovali významnú inhibíciu v koncentrácii 10 μΜ alebo nižšej.

Ďalší výhodný aspekt predloženého vynálezu obsahuje peptidové deriváty podľa vzorca I alebo ich farmaceutický prija teľné soli, ktoré sa neviažu na HLA-DR3, ale viažu sa na HLA-DR1 a/alebo HLA-DR4Dw4 a/alebo HLA-DR4DW14. HLA-DR3 je všeobecná alela HLA-DR, ktorá nie je spojená s reumatoidnou atrtritídou. U pacientov s reumatoidnou artritídou, ktorý nesú HLA-DR3 ako jednu z alel (čo je asi jedna tretina všetkých pacientov s reumatoidnou artritídou), peptidové deriváty podľa vynálezu teda nebudú narušovať normálnu funkciu HLA-DR3 obrany hostiteľa. Použitie takýchto peptidových derivátov je preto výhodné predovšetkým na liečenie pacientov s reumatoidnou artritídou, pretože povedie k menšej imunosupresii, než ku ktorej by došlo pri použití neselektívnych viazačov DR.

Ako ďalší variant k testu A na overenie schopnosti peptidov podľa vynálezu viazať jednu alebo viac molekúl HLA-DR sa použije nasledujúci test.

(i) Purifikácia typov HLA-DR z bunkových línií

Použitý spôsob purifikácie je modifikáciou spôsobu, ktorý opísal Gorga et al., 1987 (Gorga et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 16087-16094). Ľudské antigény HLA-DR sa purifikovali z rôznych bunkových línií pomocou imunoafinitnej chromatografie. Stručne opísané, 1 x 10® až 5 x 10® peletovaných buniek z vhodnej bunkovej línie vybranej zo skupiny obsahujúcej Hom2 (zdroj DRI), BBF (zdroj DR2), AVL-B (zdroj DR3), JAH (zdroj DR4DW4), JHAF (zdroj DR4DW13) a PE17 (zdroj DR4DW14) sa solubilizovalo pri 4 ’C v 50 ml 5 mM EDTA (sodná soľ), 50 mM Tris-HCl, pH 7,4,2% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM jodoacetamidu a 1 mM PMSF homogenizáciou 10 ťahmi skloteflónového homogenizátora. Homogenát sa centrifúguje pri 100 000 g počas 1 hodiny a potom sa odoberie supernatant. Potom sa supernatant cez noc inkubuje s monoklonálnou protilátkou anti-HLA-DR LB3.1 (Gorga et al., 1986, Celí Immunol. 103, 160-172) kovalentne naviazanou na CNBr-sefarózu 4B (Pharmacia) vopred vyrovnanú so 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, a 0,1% NP-40. Živica sa potom nanesie do kolóny a premyje sa roztokom 0,15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% oktylglukozid (20x objem kolóny). HLA-DR sa potom eluuje roztokom 50 mM dietylamínu, pH 11,0, 0, 15 M NaCl a 1% oktylglukozidu. Frakcie sa ihneď neutralizujú

0,5 M HEPES-NaOH, pH 7,4. Obsah proteínu sa určí pomocou proteínového testu Biorad a čistota pomocou SDS-PAGE elektroforézy· (ii) Peptidový selektívny väzbový test

200 nM biotín-FHA_30T__32o vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS) sa inkubuje buď s purifikovanými HLA-DR1, DR2, DR4Dw4, DR4DW13 alebo s DR4DW14 (2 až 20 jxg/ml) v jamkách tvaru V na mikrodoštičke (Nunc) počas 48 hodín buď s inhibítorovým peptidom alebo bez neho. Na inhibíciu DR3, biotín-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH sa inkuboval s purifikovanou DR3 (20 /xg/ml) tak ako už bolo opísané. Po 48 hodinách inkubácie sa inkubát ošetril a odmerala sa absorbancia rovnako ako je opísané v teste A. Inhibičná aktivita peptidu vyjadrená ako IC_so hodnota sa vypočítala pomocou softvéru Microcal Origin na osobnom počítači .

Test B: In vitro inhibícia aktivácie T-buniek (Tento test je vhodný na dôkaz schopnosti peptidových derivátov podľa vzorca I inhibovať imunitnú odpoveď T-buniek sprostredkovanú molekulami MHC II. triedy.)

Inhibítorové peptidy sa testovali preto, aby sa stanovilo ako sú schopné blokovať stimuláciu myšej T-bunkovej hybridómovej línie B52.24, ktorá odpovedá na peptid FHA (H-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gly-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) prezentovaný molekulami HLA-DR4Dw4. B52.24 bola vytvorená fúziou T-buniek lymfatických uzlín z transgénnej myši HLA-DR4Dw4 imunizovanej ^FHA _3OV__32O (Medzinárodná patentová prihláška WO 92/03331) s líniou myších lymfómových T-buniek BW5147 (White et al., 1989, J. Immunol. 143, 1822) podľa postupu, ktorý opísali Woods et al., 1994 (J. Exp. Med. 180, 173-181) a podľa všeobecne známeho spôsobu na vytváranie hybridómov T-buniek opísaného v Current Protocols in Immunology, Vol. 2, 7.21.

Inhibítorové peptidy v koncentrácii medzi 100 a 0,1 μΜ (alebo nižšej) sa zmiešali s antigénnym peptidom ^FHA _3OV__32O, a to buď v rôznych koncentráciách medzi 100 a 0,1 μΜ alebo v stálej koncentrácii

RPMI-1640 (Gibco) na (Nunc) v celkovom μΜ zriedením v kultivačnom médiu

96-jamkovej mikrotitračnej doštičke objeme 100 μΐ. B-bunky exprimujúce

HLA-DR4Dw4 ako bunková línia transformovaných lymfoblastoid ných buniek JAH EBV (Európska zbierka mikroorganizmov ECACC

85102909) alebo B-bunky odobrané jedincom homozygotným v HLA-DR4Dw4 a transformované vírusom Epstein-Barrovej spôso bom opísaným v Current Protocols in Immunology 7.22.1, boli fixované pomocou glutaraldehydu resuspendovaním v 1% glutaral dehyde (Sigma) počas 30 sekúnd na výslednú koncentráciu 4 x 10⁶ buniek/ml, a potom sa pridal rovnaký objem 200 mM lyží nu (Sigma) na 3 minúty. Bunky sa potom oddelili centrifugáciou pri 300 g, opláchli v RPMI-1640 a naniesli v množstve 2 x 10^s do každej jamky na mikrotitračnej doštičke, ktorá už obsahovala antigén a inhibítorové zlúčeniny. Mikrotitračná doštička sa inkubovala počas 2 hodín pri 37 ’C v 5% C0₂.

Potom sa mikrotitračná doštička opláchla RPMI-1640 pri 300 g a dvakrát odsala predtým ako sa pridala T-bunková hybridómová línia B52.24 v množstve 10^B buniek na jamku v kultivačnom médiu (RPMI-1640, 10% fetálne teľacie sérum (Gibco) a 2 mM glutamín (Gibco)). Mikrotitračná doštička sa ďalej inkubovala počas 2 dní pri 37 ‘C v 5% CO₂. Doštičky sa potom centrifugovali pri 300 g počas 10 minút a 150 μΐ supernatantu z každej jamky sa odobralo a uschovalo v teplote -20 ‘C pred tým, ako sa uskutočnil biotest na obsah IL-2.

Kultivačné doštičky so supernatantom na testovanie sa ponechali pri teplote miestnosti, aby sa rozmrazili a 100 μΐ supernatantu sa prenieslo na novú 96-jamkovú doštičku s jamkami s guľatým dnom. Na vytvorenie štandardnej krivky sa uskutočnilo sériové riedenie 1:1 IL-2 použitím kultivačného média (RPMI-1640 (Gibco), 10% teľacie fetálne sérum (Advanced Protein Products), 100 μΐ/ml streptomycín a 100 U/ml penicilín (Gibco), 2 mM L-glutamín (Gibco) a 50 μΜ 2-merkaptoetanol (Sigma)) v rozmedzí výslednej koncentrácie IL-2 250 jednotiek/ml až 0,04 jednotky/ml. Bunky bunkovej línie závislej na IL-2 ako sú bunky CTLL-2 (Náture, 1977, 268, 154-156) alebo bunky HT-2 (J. Immunol. Methods, 1987, 94-104) sa odobrali a dvakrát opláchli v kultivačnom médiu pred tým, ako sa resuspendovali na koncentráciu 5 x 10⁴ buniek/ml. 100 μΐ suspenzie buniek závislých na IL-2 sa pridalo ku každej jamke na štandardnú krivku a testovaným vzorkám. Kultivačné misky sa inkubovali počas 72 hodín pri 37 ’C a v 5% C0₂. Potom sa ku každej jamke pridalo 20 μΐ (1 mCi) 3H-tymidínu (Amersham International) a doštičky sa ďalej inkubovali v rovnakých podmienkach počas 16 hodín. Obsah každej jamky sa odobral na filter zo sklenených vláken a rádioaktivita sa merala pomocou beta scintilačného počítača pre doštičky.

Všeobecne sa dá zhrnúť, že peptidové deriváty podľa vzorca I definovaného vyššie, ktoré sa testovali v teste B, vykazovali významnú inhibíciu pri koncentrácii asi 10 μΜ alebo oveľa nižšej.

Test C: Peptidmi stimulovaná hypersenzitívna odpoveď oneskoreného typu (DTH, delayed type hypersensitivity) u myší BALB/C (Test je vhodný na dôkaz in vivo aktivity peptidových derivátov podľa vzorca I na zvieracom modeli.)

Samice myší BALB/C (18 až 20 g), vždy 5 v každej skupine, sa na boku subkutánne imunizovali 0,1 ml emulzie ovalbumínu (Sigma) (2 mg/ml vo fyziologickom roztoku) zmiešanej 1:1 (objem/objem) s Freundovým adjuvans (Sigma). O sedem dní neskôr sa zmerala hrúbka chodidla použitím dvojitého mikrometrického kalipera. Potom nasledovala provokačná subplanárna injekcia 30 μΐ 1% tepelne agregovaného ovalbumínového proteínu vo fyziologickom roztoku do vankúšika chodidla jednej zadnej končatiny. O 24 hodín po antigénnej provokácii sa zmerala hrúbka chodidiel a odpoveď DTH sa vypočítala ako percentuálne zväčšenie hrúbky chodidla po injekcii v porovnaní s kontralaterálnou kontrolnou končatinou. Inhibítory sa podávali 3 dni osmotickou minipumpou (Alzet) implantovanou 24 hodín pred antigénnou provokáciou a dávkovanie bolo 10 mg/kg/deň až 0,1 mg/kg/deň. Stupeň inhibície sa vypočítal odčítaním hodnoty opuchu pre inhibítorom ošetrené chodidlo od hodnoty pre kontrolu ošetrenú iba vehikulom, potom delením hodnotou kontroly a vynásobením 100%.

Všeobecne možno zhrnút, že peptidové deriváty podľa vzorca I definovaného v predchádzajúcom texte, ktoré sa testovali v teste C, prejavili významnú inhibíciu pri dávkovaní 1 mg/kg/deň a nižšom, a to bez zreteľného toxikologického alebo iného nežiaduceho účinku.

Test D:

(Tento test je vhodný na dôkaz in vivo aktivity peptidových derivátov podľa vzorca I na zvieracom modeli artritídy.)

Samice myší BALB/C (19 až 21 g, 5 až 10 v každej skupine) va v 0. deň imunizujú a na 7. deň ešte raz podporia subkutánnou injekciou 0,1 ml emulzie obsahujúcej rovnaké objemy metylovaného sérového albumínu (met-BSA, Sigma), 2 mg/ml vo fyziologickom roztoku, a Freundovho kompletného adjuvans (Sigma) doplneného o Mycobacterium tuberculosis (MTB, kmene C, DT a PN, MAFF, Weybridge, Surrey) v koncentrácii 2,5 mg/ml, čiže výsledná koncentrácia MTB bola 3,5 mg/ml. Súčasne sa naviac aplikuje i.p. injekcia 0,1 ml Bordetella pertussis (Pertussis vakcína Welcome), 10® mikroorganizmov vo fyziologickom roztoku. 0 14 dní neskôr sú zvieratá provokované do kolenného kĺbu dávkou 10 μΐ obsahujúcou 100 Mg met-BSA vo fyziologickom roztoku, ktorá je injikovaná intraartikulárne pomocou injekčnej striekačky Hamilton s ihlou 30G. Kontralaterálne koleno je injikované rovnakým objemom fyziologického roztoku a slúži ako kontrola. Stupeň zápalu/opuchu oboch kolien sa stanoví o 13 dní neskôr meraním pomocou dvojitého mikrometrického kalipera. Docieli sa to tak, že sa nožnicami s tupým koncom a pinzetou vytvorí incízia v koži približne 5 mm nad a pod kolenom a pozdĺž celého kolena, takže vznikne voľná chlopňa, ktorá sa potom odreže, aby sa odkryl celý pod ňou ležiaci klb. Meranie sa uskutočňuje v najširšej časti kolena, v horizontálnej rovi ne, na ohnutej končatine držanej vo fixovanej polohe. Percentuálne zvýšenie zápalu v kolene s injikovaným antigénom sa vypočíta podľa vzorca: (hrúbka kolena s injikovaným antigénom-hrúbka kolena s injikovaným fyziologickým roztokom / hrúbka kolena s injikovaným fyziologickým roztokom) x 100%. Inhibítory sa podávajú pomocou 14-dňových osmotických minipúmp (Alzet) implantovaných 24 hodín pred antigénnou provokáciou s dávkovaním v rozmedzí 10 mg/kg/deň až 0,1 mg/kg/deň. Percento inhibície zápalu/opuchu sa vypočíta z hodnôt nameranej hrúbky odpočítaním hodnoty opuchu pre inhibítorom ošetrenú skupinu od hodnoty pre skupinu ošetrenú iba vehikulom, potom delením hodnotou kontroly a vynásobením 100. Ďalšie hodnotenie ochorenia zahrňuje

1) histologické hodnotenie zápalu, synovitis a erózie kosti/chrupavky, uskutočňovanej na fixovanom reze kolena farbenom hematoxylínom a eozínom, a

2) stanovenie hladiny reaktantov akútnej fázy v sére, sérového amyloidu P a/alebo haptoglobínu.

Peptidové deriváty podľa vzorca I definované v predchádzajúcom texte vykazujú v teste D významnú inhibíciu pri dávkach 10 mg/kg/deň alebo nižších.

Na lepšiu ilustráciu farmakologickej aktivity zvláštnych peptidových derivátov podľa vzorca I, všetky zlúčeniny podľa príkladov 5, 16 a 23 prejavili významnú väzbu s HLA-DR4DW4 v teste A pri koncentrácii < 0,1 gmol/l a boli aktívne pri dávke < 0,1 mg/kg/deň v teste C. Tieto zlúčeniny majú tiež dobrú stabilitu vo vodnom prostredí pri pH 3 a pH 7,6, a vo forme extrudovaných polymérnych depotných liečivých prípravkov vykazujú minimálne straty degradáciou pri extrúzii a minimálnu degradáciu pri uvoľňovaní z takéhoto depotného liečivého prípravku. Vo variante testu A sa dokázalo, že zlúčenina podľa príkladu 23 sa významne viazala s HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR4DW4 a HLA-DR4DW14, ale neviazala sa s HLA-DR3 (IC > 100 μιηοΐ/ΐ) .

Peptidové deriváty podľa vzorca I sa dajú pripraviť akýmkoľvek spôsobom, ktorý je známy v odbore peptidovej chémie a ktorý je vhodný na syntézu analogických peptidov.

Peptidové deriváty podľa vzorca I sa môžu získať napríklad postupmi analogickými s tými, ktoré sú opísané napríklad v Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach autorov Athertona a Shepparda (vydané v IRL Press, Oxford University press, 1989), Solid Phase Peptide Synthesis od Stevarda a Younga (vydané v Pierce Chemical Company, Ilinois, 1984), Principles of Peptide Synthesis (vydané v Springer-Verlag, Berlín, 1984) a v sérii Amino Acids, Peptides and Proteins (diely 1-25, diel 25 bol vydaný v r. 1994 v Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK).

Výhodne sa peptidový derivát podľa vzorca I pripraví postupnou syntézou v pevnej fáze. Použitím tohto spôsobu sa u aminokyseliny, ktorá je C-koncovou aminokyselinou peptidu, ochráni jej α-aminoskupina (protekcia aminoskupiny), a ak je to potrebné aj aminoskupina v postrannom reťazci, a aminokyselina sa naviaže na pevný nosič, napríklad živicu, ako je 2-chlorotritylchloridová živica alebo živica Merrifield (t.j. chlórmetylpolystyrén-divinylbenzén) v prípade, že po štiepení je voľná napríklad karboxylová kyselina, alebo živica Rink amid (4-(2',4·-dimetoxyfenyl-Fmoc-aminometyl)-fenoxylová živica) alebo živica Rink amid MBHA (N-(4-(2*,4¹-dimetoxyfenyl-Fmoc-aminometyl) -f enoxyacetamido-norleucyl) -4-metylbenzhydrylaminová živica) (tu uvedené živice sú dostupné od firmy Calbiochem-Novabiochem) v prípade, že je po štiepení vyžadovaný karboxamid, a potom sa ochranná skupina na a-aminoskupine odstráni. Aminokyselina, ktorá má byť pripojená k C-koncovej aminokyseline, je chránená na svojej α-aminoskupine, a ak je to potrebné tiež na postrannom reťazci, a naviazaná na C-koncovú aminokyselinu, ktorá zostáva naviazaná na pevný nosič. Postupný proces deprotekcie (odstránenia ochrannej skupiny naviazanej na aminoskupinu) α-aminoskupiny a naviazania ďalšej aminokyseliny sa opakuje a tak postupne vzniká chránený a nechránený polypeptid naviazaný na pevný nosič. Skupina R² vo vzorci II alebo III je vložená do sekvencie použitím vhodne chránenej (3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl )alkánove j kyseliny (pre peptidové deriváty obsahujúce II, kde A je metylénová skupina) alebo zodpovedajúceho oxa-analógu, získaného ako je opísané v J. Med. Chem. 36, 1993, 256-263, alebo analogickým postupom (pre peptidové deriváty obsahujúce II, kde A je kyslík), alebo (6-oxo-l,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)alkánovej kyseliny (pre peptidové deriváty obsahujúce III) na mieste chránenej aminokyseliny. Chránený alebo nechránený polypeptid je uvoľnený z pevného nosiča štandardným postupom, napríklad použitím zmesi trifluóroctovej kyseliny, trietylsilánu a vody. Je výhodné, keď sa ochranná skupina postranného reťazca odštiepi v podmienkach použitých na uvoľnenie peptidu z pevného nosiča, ale môže sa tiež odštiepiť v samostatnom kroku pred uvoľnením peptidu z pevného nosiča alebo po ňom. Je tiež výhodné, keď sa spôsob prípravy polypeptidu modifikuje použitím sekvencie dvoch alebo viacerých vhodne chránených aminokyselín vo zvláštnom väzbovom kroku. Celá syntéza sa môže uskutočňovať ručným spôsobom alebo sa môže uskutočniť automaticky, napríklad použitím syntetizátorov peptidov, ako je 431A alebo 430B firmy Applied Biosystems, alebo ACT357 firmy Advanced Chemtech, alebo použitím podobných automatických syntetizátorov, alebo kombináciou oboch spôsobov.

V priebehu syntézy peptidov sú aminokyselinové funkčné skupiny, ktoré sa nezúčastňujú na reakcii, chránené rôznymi funkčnými skupinami. Tak napríklad N-koncové aminoskupiny a aminoskupiny postranného reťazca môžu byť chránené použitím 9-fluorenylmetoxykarbonylovej (Fmoc), t-butoxykarbonylovej (Boe), bifenylizopropoxykarbonylovej (Bpoc), 2-[3,5-dimetoxyfenyl]propyl-2-oxykarbonylovej (Ddz), adamantyloxykarbonylovej (Adoc), alyloxykarbonylovej (Aloc), 2,2,2-trichlóretoxykarbonylovej (Troc) alebo benzylkarbonylovej skupiny a rôznych substituovaných benzyloxykarbonylových skupín. Tieto ochranné skupiny môžu byť odštiepené podľa potreby použitím štandardných spôsobov (t.j. napríklad pôsobením kyseliny alebo zásady, katalytickou hydrolýzou a pôsobením Pd(0) alebo pôsobením zinku/kyseliny octovej).

Vhodné ochranné skupiny použité na ochranu guanidínovej skupiny postranného reťazca v peptidoch obsahujúcich arginínový zvyšok zahrňujú nasledujúce skupiny: nitroskupinu, adamantyloxykarbonylovú, 4-metoxy-2,3,6-trimetylbenzénsulfonylovú (Mtr), 2,2,5,7,8-pentametylchróman-6-sulfonylovú (Pmc) a (najmä) 2,2,4,6,7-pentametyldihydrobenzofurán-5-sulfonylovú (Pbf) skupinu.

Vhodné ochranné skupiny použité na ochranu hydroxylovej skupiny postranného reťazca zahrňujú t-butylovú, benzylovú a tritylovú (Trt) skupinu. Vhodné ochranné skupiny použité na ochranu imidazolovej skupiny v peptide obsahujúcom histidínový zvyšok zahrňujú tritylovú, benzylovú, tozylovú a dinitrofenylovú skupinu, a ďalej Adoc, Boe a Fmoc.

Vhodné ochranné skupiny použité na ochranu karboxylovej skupiny postranného reťazca zahrňujú rôzne estery (napríklad obsahujúce metylovú, etylovú, t-butylovú, benzylovú, nitrobenzylovú, alylovú a 9-fluorenylmetylovú skupinu).

Reakcia odštiepenia ochrannej skupiny sa môže uskutočniť v teplotnom rozmedzí od 4 ’C do 40 ‘C (výhodne pri teplote miestnosti) a v časovom období 10 minút až 24 hodín.

Vhodné metódy na spájanie (párovanie) jednotlivých aminokyselín všeobecne používajú azid, symetrický anhydrid, zmiešaný anhydrid a rôzne aktívne estery a karbodiimidy. V prípade rôznych karbodiimidov (napríklad dicyklohexyl- alebo diizopropylkarbodiimidov) sa môže pridať množstvo rôznych aditív (napríklad 1-hydroxybenzotriazol, HOBT, a N-hydroxysukcinimid). Okrem toho sa spájanie aminokyselín dá dosiahnuť i použitím radu ďalších reagencií, napríklad lH-benzotriazol-l-yl-oxy-tris-pyrolidinfosfóniumhexafluorofosfátu (PyBOP), (2-(lH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3, 3-tetrametyluróniumtetrafluoroborátu (TBTU) a (2-(ΙΗ-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetrametyluróniumtetrafluorofosfátu (HBTU). Spojovacie reakcie sa môžu uskutočňovať pri teplote v rozmedzí -20 ‘C až -40 ’C a v časovom období od 10 minút do 24 hodín. Vhodné médium na uskutočnenie spojovacej reakcie zahrňuje napríklad N, N-dimetylformamid (DMF). Zvlášť vhodný spôsob zahrňuje použi tie HBTU, HOBT a diizopropyletylénamínu v DMF.

Tieto a ďalšie spôsoby syntézy peptidov sú uvedené v tu citovaných medzinárodných patentových prednáškach. Hydrofóbny zvyšok P, čo je skupina podľa vzorca R-, R.CO-, R.SO2, R.O.CO-, RNHCO-, R.O.CS-, R.S.CO-, R.NHCS-, R.S.CS- a R.CS (alebo taká skupina prítomná ako substituent na koncovej aminoskupine P, keď P je hydrofóbna aminokyselina, ktorá nesie ďalšie aminokyseliny), sa môže vložiť, napríklad v záverečnom kroku, alkyláciou, acyláciou alebo inou štandardnou funkčnou modifikáciou terminálnej aminoskupiny (napríklad pred uvoľnením peptidu z nosiča alebo po ňom). Ak sú potrebné modifikácie C-konca (aby sa získala zvláštna hodnota pre R⁴), môžu sa uskutočniť potom, ako sa nasyntetizuje peptid, a to konvenčnou modifikáciou funkčných skupín alebo vhodným výberom počiatočnej živice alebo ochrannej skupiny naviazanej na živicu (napríklad použitím vhodne chránenej skupiny podľa vzorca R⁴-H). Typické príklady prípravy peptidových derivátov podľa vzorca I sú ďalej uvedené v príkladovej časti.

Typické spôsoby merania stability peptidových derivátov podľa predloženého vynálezu sú uvedené ďalej. Aby sa v týchto meraniach minimalizovala mikrobiálna kontaminácia a degradácia, sú všetky zariadenia na prípravu peptidových roztokov sterilizované autoklávovaním a všetky prenosy materiálu sú uskutočňované v boxe II. bezpečnostnej triedy s laminárnym prúdením.

ml citrátového/fosfátového pufra (Mcllvain) s hodnotou pH 3 alebo pH 7,6, ktorý obsahuje 0,02% azid sodný, sa prefiltruje pomocou filtračnej jednotky a injekčnej striekačky. Približne 1,2 mg peptidu sa presne odváži v uzavretej skúmavke. Pipetou so sterilnou špičkou sa do skúmavky k peptidu pridá dostatočné množstvo pufra tak, aby koncentrácia peptidu bola 0,1 mg/ml. Skúmavka sa uzavrie a pretrepe, aby sa peptid rozpustil. Použitím pipety so sterilnou špičkou sa prenesie alikvot asi 1 ml peptidového roztoku do nádobiek na HPLC, ktoré sa potom uzatvoria. 5 nádobiek sa uchová pri -18 “C a 37 ‘C. Plocha peptidového vrcholu (peak) takéhoto roztoku sa určí použitím HPLC pomocou rôznych štandardov, a to na začiatku a po uschovaní pri -18 *C a 37 ’C počas 1, 2, 3 a 4 týždňov, pričom sa pre každý časový bod použijú čisté skúmavky a dvojitá injektáž vzorky. Percento peptidu zachované po uschovaní v 37 ’C v každom časovom bode sa vyjadrí ako pomer plôch peptidového vrcholu v každom časovom bode k ploche na začiatku. Výhodné peptidové deriváty podľa vynálezu majú po uskladnení v 37 ‘C zachované percento vyššie ako 90%, výhodne vyššie ako 95%, tak pri pH 3 ako aj pri pH 7,6.

Peptidové deriváty podľa vzorca I sa budú podávať na účely liečenia alebo profylaxie teplokrvným živočíchom (vrátane človeka), ktorí vyžadujú také ošetrenie vo forme farmaceutického prípravku, ako je v odbore farmácie dobre známe.

Ďalší aspekt vynálezu poskytuje liečivý prípravok, ktorý obsahuje liečivé peptidové deriváty podľa vzorca I alebo ich farmaceutický prijateľné soli v spojení s ďalším ich farmaceutický prijateľnými riedidlami a pomocnými látkami.

Prípravok môže byť vo forme vhodnej na perorálne podávanie, ako je napríklad tableta, tobolka, vodný alebo olejový roztok, suspenzia alebo emulzia, na nazálne použitie ako nosný prášok na šnupanie, nosný sprej alebo nosné kvapky, na vaginálne alebo rektálne použitie ako čípok, na podávanie inhaláciou ako jemného prášku alebo kvapalného aerosólu, na sublinguálne alebo bukálne použitie ako tableta alebo tobolka, alebo na parenterálne podávanie (vrátane podávania intravenózneho, subkutánneho, intramuskulárneho, intravaskulárneho alebo podávania infúziou) ako napríklad sterilný vodný alebo olejový roztok alebo suspenzia. Prípravok môže byť aj vo forme vhodnej na topické podávanie ako je napríklad krém, masť a gél. Do úvahy pripadajú aj kožné náplaste. Formulácia takýchto prípravkov je všeobecne opísaná v kapitole 25.2 knihy Comprehensive Medicinal Chemistry Vol. 5, ed: Hansch et al., Pergamon Press, 1990.

Vo všeobecnosti sa môže uviesť, že uvedené prípravky sa dajú pripraviť obvyklým spôsobom použitím bežných excipientov.

Avšak v prípade prípravku na perorálne použitie je výhodné, aby prípravok obsahoval ochranný obal, ktorý ochráni aktívnu polypeptidovú zložku pred pôsobením enzýmov v žalúdku.

Výhodný liečivý prípravok podľa vynálezu je taký, ktorý je vhodný na perorálne podávanie v jednotkovej liekovej forme ako je tableta alebo tobolka, ktorá obsahuje 2,5 mg až 500 mg, výhodne 10 mg až 100 mg polypeptidu v každej jednotkovej dávke, alebo prípravok vhodný na parenterálne podávanie, ktorý obsahuje 0,5 g až 100 mg polypeptidu v 1 ml, výhodne 1 mg až 10 mg v 1 ml roztoku.

Parenterály prípravok je výhodne vo forme roztoku a izotonickom soľnom roztoku (fyziologickom roztoku) alebo v izotonickom roztoku dextrózy, ktoré sa môžu v prípade potreby pufrovať na pH medzi 5a 9. Prípadne môže byť parenterálny prípravok v takej forme, ktorá je určená na predĺžené uvoľňovanie liečiva, a v tomto prípade je množstvo polypeptidu na jednotkovú dávku všeobecne vyššie ako sa požaduje v prípade konvenčnej injekčnej formy. Výhodná forma prípravku s predĺženým postupným (kontinuálnym) uvoľňovaním liečiva je napríklad taká forma, ktorá je opísaná v Európskej patentovej prihláške č. 58481, alebo, v prípade peptidov obsahujúcich aspoň jednu bázickú skupinu, forma opísaná v Medzinárodnej patentovej prihláške č. WO 93/24150, na ktorú sa týmto odkazuje. Určité peptidy podľa predloženého vynálezu majú také charakteristiky rozpustnosti, že sú zvlášť vhodné na prípravu liekových foriem s predĺženým uvoľňovaním liečiva, predovšetkým potom prípravky obsahujúce biologicky rozložiteľné polyestery ako polylaktidy, a tiež pre prípravky vo forme s predĺženým uvoľňovaním liečiva a veľmi vhodným a prospešným profilom uvoľňovanie liečiva. Okrem toho, peptidy podľa vynálezu, ktoré obsahujú jednu alebo viac bázických skupín, môžu vytvárať peptid-polymérové soli s kyselinou zakončené polyestermi ako sú polylaktidy, a takéto peptidy a peptid-polymérové soli predstavujú ďalší aspekt predloženého vynálezu. Niektoré z týchto solí majú také charakteristiky rozpustnosti, že sú zvlášť vhodné na prípravu parenterálnych liekových foriem s predĺženým uvoľňovaním liečiva, napríklad také, ktoré opisuje Medzinárodná patentová prih láska WO 93/24150, a tiež pre formy s predĺženým uvoľňovaním liečiva a veľmi vhodným a prospešným profilom uvoľňovania liečiva. Výhodný parenterálny prípravok vo forme s predĺženým uvoľňovaním liečiva obsahuje od 1 mg do 100 mg (napríklad 5 mg až 50 mg) polypeptidu v jednotkovej liekovej forme. Výhodná lieková forma s predĺženým uvoľňovaním liečiva je i taká forma, ktorá je určená na predĺžené uvoľňovanie liečiva až počas 5 dní. Výhodné peptidy podľa predloženého vynálezu zahrňujú také peptidy, ktoré ak sú vo forme extrudovaného polymérneho depotného prípravku, vykazujú minimálnu degradáciu pri uvoľňovaní z takéhoto depotného prípravku. Typický spôsob merania úrovne degradácie peptidu podľa predloženého vynálezu je uvedený v nasledujúcom odstavci.

Príprava extrudovaného polymérneho depotného liečivého prípravku z peptidu

Asi 20 mg peptidu sa presne odváži a pridá sa dostatok polyméru (50/50% mólový kopolymér poly(D,L-kyselina mliečna/kyselina glykolová) s molekulovou hmotnosťou približne 20 kDa a polydisperzitou 1,7 (ako sa stanoví veľkostne vylučovacou chromatografiou vzhľadom na polystyrénový štandard), takže vznikne približne 20% (hmotnosť/hmotnosť) zmes. Tá sa rozpustí v anhydride jednoduchej ľadovej kyseliny octovej za vzniku asi 10% (hmotnosť/objem) roztoku. Roztok sa potom suší zo zmrazeného stavu (lyofilizuje) a lyofilizovaný produkt sa pred použitím uchováva vo vákuu.

Asi 100 mg lyofilizovaného materiálu sa vloží do valca malého laboratórneho extrudéra (vytlačovacieho stroja) a vzorka sa stlačí piestom. Potom sa extrudér zahreje na teplotu medzi 90 až 95 ’C a na tejto teplote sa ponechá 10 minút pokým sa materiál pod tlakom vytláča za vzniku extrudátu s priemerom približne 1 mm.

Analýza obsahu peptidu v extrudovanom polymérnom depotnom liečivom prípravku

Dva kúsky s dĺžkou približne 5 mm z extrudovaného poly mérneho prípravku obsahujúceho peptidy sa presne odvážia a každý z nich sa rozpustí v 1 ml anhydridu jednoduchej ľadovej kyseliny octovej v samostatnej 25 ml volumetrickej nádobe. Asi po 1,5 hodine sa objem v každej nádobe doplní destilovanou vodou do 25 ml, čo spôsobí precipitáciu polyméru. Usadenina sa prefiltruje cez 0,5 pm PTFE filter Millex a roztoky, A, sa odoberú.

Pripraví sa séria štandardných roztokov zo zásobného roztoku peptidu v destilovanej vode s koncentráciou 0,5 mg/ml a zásobného roztoku polyméru v anhydride jednoduchej ľadovej kyseliny octovej s koncentráciou 2,5 mg/ml podľa nasledujúcej tabuľky, pričom každý roztok sa doplní destilovanou vodou do 10 ml.

koncentrácia peptidu (Mg/ml)	objem zásobného roztoku polyméru (μΐ)	objem zásobného roztoku peptidu (μΐ)
50	1000	1000
40	1000	800
30	1000	600
20	1000	400
10	1000	200
5	1000	100
0	1000	0

Každý štandardný roztok sa prefiltruje cez 5 pm PTFE filter Millex a potom sa alikvót filtrátu spolu s alikvotmi roztoku A analyzuje pomocou HPLC s dvojitým vstrekovaním vzoriek. Obsah peptidov sa v extrudovanom polymérnom depotnom liečivom prípravku vypočíta z koncentrácie peptidu v roztoku A, ktorá sa stanoví porovnaním plochy peptidového vrcholu v roztokoch A s plochou peptidového vrcholu štandardných roztokov. Výhodné peptidy vykazujú minimálnu stratu degradáciou pri extrúzii a obsah peptidu v extrudovanom polymérnom depotnom prípravku je blízky teoretickej hodnote približne 20% (hmotnosť/hmotnost).

Degradácia peptidov pri in vitro uvoľňovaní z extrudovaného polymérneho prípravku

Mcllvaneov citrátový/fosfátový pufor s pH 7,6, ktorý obsahuje 0,02% azid sodný, sa prefiltruje cez 0,22 μια filter a uchová pri 4 ’C. Približne 10 mg extrudovaného polymérneho depotného prípravku obsahujúceho peptid sa vloží do dvoch malých nádobiek a pridajú sa 2 ml pufrového roztoku. Potom sa nádobky uzatvoria a uchovajú vo vodnom kúpeli s teplotou 37 ’C počas 1 mesiaca. Po jednom mesiaci sa vo vhodných časových okamihoch odoberú 0,6 ml alikvoty uvoľňovacieho média z každej nádobky a analyzujú sa priamo pomocou HPLC alebo sa uchovajú vo fľaštičkách na HPLC pri teplote -18 ’C pred analýzou. 1,8 ml pufrového roztoku sa pridá do každej nádobky, ktorá obsahuje prípravok, aby sa tak nahradilo odobrané uvoľňovacie médium.

Priemerné množstvo intaktného peptidu v uvoľňovacom médiu v každom čase odberu sa stanoví pomocou HPLC s dvojitým vstrekovaním vzoriek, a to porovnaním plochy peptidového vrcholu v uvoľňovacom médiu s plochou peptidového vrcholu štandardných peptidových roztokov so známou koncentráciou. Priemerné množstvo peptidových degradačných produktov v uvoľňovacom médiu sa stanoví v každom čase odberu pomocou HPLC s dvojitým vstrekovaním vzoriek, a to porovnaním plochy ďalších nových vrcholov v uvoľňovacom médiu s plochou peptidového vrcholu štandardných peptidových roztokov so známou koncentráciou pri súčasnom predpoklade, že extinkčný koeficient sa nezmenil. Priemerný kumulatívny profil in vitro uvoľňovania intaktného peptidu a celkového peptidu (t.j. intaktného peptidu a peptidových degradačných produktov) je stanovený z množstva intaktného peptidu a peptidových degradačných produktov v každom čase odberu. Výhodné peptidy podľa vynálezu vykazujú minimálnu degradáciu pri in vitro uvoľňovaní a tak degradačná produkty tvoria menej ako 10%, a výhodne menej ako 5% celkového peptidu po jednom mesiaci in vitro uvoľňovania do Mcllvaneovho pufra pri pH 7,6 a teplote 37 ’C.

Prípravok podľa vynálezu sa bude všeobecne podávať človeku napríklad v dennej dávke od 10 pg do 5 000 mg, výhodne od 0,1 mg do 100 mg pre 70 kg pacienta, a to v prípade potreby v rozdelených dávkach. Presné podávané množstvo a spôsob podá37 nia závisí od hmotnosti, veku a pohlavia liečenej osoby a od konkrétneho ochorenia alebo stavu, ktorý je liečený a na jeho závažnosti, v súlade so zásadami známymi v medicíne.

Peptidové deriváty podľa vzorca I alebo ich farmaceutický prijateľné soli sa môžu výhodne podávať na liečebné alebo profylaktické účely spolu s jedným alebo viacerými inými farmakologickými agensami, ktoré sú v odbore všeobecne známe tým, že liečia alebo zmierňujú symptómy alebo pôsobia ako ochorenie modifikujúci agens jedného alebo viacerých ochorení alebo stavov opísaných v predchádzajúcom texte, ako sú NSAID (ako ibuprofén alebo piroxicam) alebo analgetiká (paracetamol), kortikosteroidy, myorelaxancia, inhibítory lipoxygenázy, metotrexát, azatioprín, D-penicilínamín, Cyklosporín-A, alebo liečebné monoklonálne protilátky (ako anti-CD4 alebo anti-TNF). V prípade diabetu sa môžu peptidové deriváty podávať spolu s inzulínom alebo inými liekmi na diabetes alebo sprievodné komplikácie ( ako je inhibítor aldózoreduktázy). Takéto kombinované liečenie je ďalším aspektom predloženého vynálezu.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu poskytuje spôsob liečenia autoimunitných a zápalových ochorení sprostredkovaných T-bunkami závislými na molekulách MHC II. triedy, ako sú ochorenia a stavy uvedené už v predchádzajúcom texte, pričom spôsob obsahuje podávanie účinného množstva peptidového derivátu podľa vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli teplokrvnému živočíchovi (vrátane človeka), ktorý takéto liečenie potrebuje. Vynález tiež poskytuje použitie peptidového derivátu podľa vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli na výrobu nových liekov na liečenie autoimunitných a zápalových ochorení sprostredkovaných T-bunkami závislými na molekulách MHC II. triedy.

Okrem uvedeného použitia na liečenie ľudí sú peptidové deriváty podľa vzorca I užitočné tiež pri veterinárnom liečení podobných stavov u komerčne cenných teplokrvných živočíchov, ako sú psi, mačky, kone a hovädzí dobytok. Všeobecne sa na takéto liečenie bude peptidový derivát podľa vzorca I podávať v analogickom množstve a analogickým spôsobom k tým, ktoré už boli opísané na podávanie človeku. Peptidové deriváty podľa vzorca I sú tiež cenným farmakologickým nástrojom na vývoj a štandardizáciu testovacích systémov na vyhodnocovanie vplyvu molekúl MHC II. triedy u laboratórnych zvierat ako sú mačky, psi, králiky, opice, potkany a myši, čo je súčastou prebiehajúceho výskumu nových a zlepšených liečivých prípravkov, a tiež sú vhodné ako diagnostické reagencie.

Vynález bude v nasledujúcom oddiele ilustrovaný príkladmi, ktoré ale vynález nijako neobmedzujú, a pre ktoré platí (ak nie je výslovne uvedené inak):

(i) zakoncentrovanie a odparovanie sa uskutočnilo rotačnou evaporáciou vo vákuu (ii) postupy sa uskutočňovali pri teplote miestnosti, t.j. v rozmedzí 18 až 26 “C (iii) výťažky, ak sú uvedené, slúžia len ako pomocná hodnota pre čitateľa a rozhodne nie sú zhodné s maximálnym výťažkom, ktorý sa dá získať dôsledným vývojom postupu (iv) v príkladoch sa používajú nasledujúce skratky

Phv = 5-f enylvaleryl, Boe = terc-butoxykarbonyl, tBu = terc-butyl, DMF = Ν,Ν-dimetylformamid, HOBT = 1-hydroxybenzo-triazol, Met = metionín, Fmoc = 9-fluorenylmetyloxykarbonyl, Fmoc-Pip-OH = N-(9-fluorenylmetoxykarbonyl)piperidín-4-karboxylová kyselina, Fmoc-Papa-OH = 4-[N-(9-fluorenylmetoxykarbonyl)amino]fenyloctová kyselina, CbZ = benzyloxykarbonyl, Pmc = 2,2,5,7,8-pentametylchróman-6-sulfonyl, Pbf = 2,2,4,6,7-pentametyldihydrobenzofurán-5-sulfonyl, THF = tetrahydrof urán, DMSO = dimetylsulfoxid, HBTU = 2-(lH-benzotriazol-1-y1)-1,1,3,3-tetrametyluróniumhexafluorofosfát, DIPEA = diizopropyletylamín, TFA = trifluóroctová kyselina, Su = sukcinimid pripojený prostredníctvom atómu dusíka, ktorý je súčasťou kruhu, HPLC = vysokotlaková kvapalinová chromatografia a RP-HPLC = vysokotlaková kvapalinová chromatografia s reverznou fázou (ktorá bola, ak nie je uvedené inak, uskutočnená na kolóne Vydac C18 218TP54, 4, 6 x 250 mm) (v) veľmi rýchla chromatografia a chromatografia na oxide kremičitom sa uskutočňovali s použitím silikagélu Kiselgel 60 (katalóg, č. 9385) firmy Merck (E. Merck, Darmstadt, Nemecko) (vi) ^XH NMR spektra sa merala pri 200 MHz v CDC1₃ alebo d -dimetylsulfoxidu (d -DMSO) s použitím tetrametylsilánu (TMS) ako vnútorného štandardu a je vyjadrená ako hodnota chemického posunu (delta hodnota) v ppm vzhľadom na TMS, pričom sa na označenie hlavných vrcholov používajú bežné skratky: s = singlet, m = multiplet, t = triplet, br = široký (broad), d = duplet (vii) nasledujúce aminokyseliny chránené Fmoc sa použili na zavedenie zvyšku Lys, Thr, Arg alebo His:

Lys: Fmoc-Lys (Boe)-OH, Thr: Fmoc-Thr (Obu)-OH, Arg:

Fmoc-Arg(Pmc)-OH alebo Fmoc-Arg(Pbf)-0H, His: Fmoc-His(Trt)-OH (viii) v príklade 2, ak sa odkazuje na vzorec III, znamená to vzorec III, kde Rb je metylová skupina (ix) v príkladoch 17 a 31, kde sa v mene produktu používa termín morfolín, to znamená, že morfolínová skupina je pripojená k priľahlej metylénovej skupine prostredníctvom dusíka, ktorý je súčasťou kruhu (x) v príkladoch 18 a 34, kde sa v mene produktu používa termín N(CH₂CH₂)₂N, tento termín predstavuje piperazínový kruh (xi) v príklade 30, kde je v mene produktu použitý termín ”-Lys(=C(NMe₂)₂-, tento termín predstavuje L-aminokyselinový zvyšok -NH-CH[CH₂CH₂CH₂CH₂N=C(NMe₂)₂]-CO-.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (sekvencia

SEQ ID NO: 1)

1.1 Syntéza Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe

5,6 g N-metylmorfolínu, 3,9 g metylesteru L-alaninylhydrochloridu, 4,6 g HOBT a 5,3 g l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu sa pridalo do roztoku 7 g (0,028 mol) Boc-(D)-metionínu v 50 ml suchého DMF. Zmes sa miešala cez noc. Rozpúšťadlo sa odstránilo odparením a zvyšok sa rozdelil medzi 100 ml dichlórmetánu a 50 ml 5% vodnej kyseliny octovej. Státím HOBT kryštalizoval, odstránil sa filtráciou a organická vrstva sa oddelila a premyla hydrogénuhličitanom sodným, usušila (MgSO^) a odparila. 8,5 g zvyšku sa purifikovalo velmi rýchlou chromatografiou v sintrovej nálevke elúciou so zmesou dichlórmetánu a éteru (0% až 100% éter). Frakcie obsahujúce produkt sa spojili a odparili za vzniku 7,2 g Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe ako gumy, ktorá státím kryštalizovala: NMR (CDC1J: 1,4 (d, 3H) , 1,45 (s, 9H) , 1,95 (m, 1H) , 2,1 (s, 3H), 2,1 (m, 1H), 2,6 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,4 (bs, 1H), 4, 6 (m, 1H), 5,3 (m, 1H), 6,9 (bs, 1H).

1.2 Syntéza metyl-(2S)-2-[(3R)-3-(N-[terc-butyloxykarbonyl]amino) -2-oxo-pyrolidin-l-yl ] propionátu

Poznámka: Tento postup sa musí uskutočňovať v suchých podmienkach so suchými rozpúšťadlami, inak nastane epimerizá cia.

K 8 g Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe sa pridalo 10 ml metyljodidu v zmesi 20 ml DMF a 20 ml dichlórmetánu, zmes sa nechala stáť 16 hodín a potom odparila do sucha. Ďalej sa pridalo x 50 ml dichlórmetánu a odparilo, aby sa odstránil zvyšný metyljodid a zvyšok sa rozpustil v zmesi 300 ml DMF a 300 1 dichlórmetánu. Zmes sa ochladila na približne 5 ’C a pridalo sa 0,76 g hydridu sodíka (80% disperzia v minerálnom oleji) v jednej porcii a zmes sa 2 hodiny miešala pri tejto teplote. Pridalo sa 50 ml saturovaného vodného chloridu amónneho a zmes sa odparila do sucha a potom rozdelila medzi vodu a éter. Éterový extrakt sa premyl soľným roztokom a usušil a odparil za vzniku gumy, ktorá sa purifikovala veľmi rýchlou chromatografiou v sintrovej nálevke (25% etylacetát:hexán až 100% etylacetát) za vzniku 4,2 g metyl(2S)-2-[(3R)-3-(N-[terc-butoxykarbonyl]amino)-2-oxo-pyrolidin-l-yl]propionátu ako gumy, ktorá státím kryštalizovala: NMR (CDC1₃): 1,4 (s, 9H), 1,4 (d, 3H), 1,8 (m, 1H), 2,6 (m, 1H), 3,4 (m, 2H) , 3,7 (m, 3H), 4,2 (m, 1H), 4,9 (q, 1H), 5,2 (bs, 1H).

1.3 Syntéza kyseliny (2S)-2-( (3R)-3-(N-[9-fluorenylmetyloxykarbonyl ]amino) -2-oxo-pyrolidin-l-yl Jpropiónovej (Fmoc-IIb-OH)

g metyl(2S)-2-[(3R)-3-(N-[terc-butyoxykarbonyl]ami no ) -2-oxo-pyrolidin-l-yl ]propionátu sa udržovali vo vare v zmesi 60 ml acetónu, 40 ml vody a 24 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej počas 3 hodín a potom sa zmes odparila do sucha. Pridala sa rozpustil v 15 ml sodný v nadbytku.

voda a odparenie sa opakovalo. Zvyšok sa vody a pridal sa pevný hydrogénuhličitan Pridalo sa 5,2 g 9-fluorenylmetylsukcini midylkarbonátu v 30 ml acetónu. Zmes sa miešala 16 hodín, po42 tom sa odparením odstránilo rozpúšťadlo a zvyšok sa rozdelil medzi vodu a éter. Vodná vrstva sa oddelila, jej pH sa upravilo na približne 3 kyselinou chlorovodíkovou a extrahovala sa dichlórmetánom. Organická vrstva sa premyla vodou, usušila (MgSO^) a odparila za vzniku bielej peny, ktorá kryštalizovala pri trení s éterom za vzniku 4,2 g kyseliny (2S)-2-[ (3 R) -3- (N- [ 9-f luorenylmetyloxykarbonyl ]amino) -2-oxo-pyrolidin-l-yl]propiónovej ako pevnej bielej látky, mp. 191-3 ’C (dec), NMR (CDC1₃): 1,4 (d, 3H) , 2,0 (m, 1H) , 2,6 (m, 1H), 3,4 (m, 2H), 4,2 (t, 1H) , 4,4 (m, 3H) , 4,9 (m, 1H) , 5,8 (bs, 1H), 7,4 (m, 4H), 7,6 (d, 2H), 7,7 (d, 2H) .

1.4 Syntéza Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 1)

Peptid sa pripravil syntézou pevnej fázy Fmoc, ktorá začína z 0,50 g (0,25 mmol) živice Fmoc Rink Amide MBHA (Novabiochem) v skúmavke Bond Elut (Varian, 15 ml, vyplnenej na dne filtrom).

a) Živica sa zbavila ochrany (deprotekcia) použitím 20% roztoku piperidínu v DMF (dve ošetrenia, každé s 5 ml po 10 minútach). Po deprotekcii sa živica dôkladne premyla 5 x 10 ml DMF.

b) Acylácia sa uskutočňovala pridaním 353 mg (1 mmol) roztoku Fmoc-Pip-OH, 1,5 ml DMF, 165 mg (1 mmol) HOBT a 155 μΐ (1 mmol) diizopropylkarbodiimidu. Spojený produkt sa ponechal približne 30 minút, premyl sa 5 x 10 ml DMF a v malej časti živice sa kontrolovalo dokončenie acylácie s použitím testu podľa Kaisera (E. Kaiser et al., Anál. Biochem. 34, p.595, 1970)

Uvedená deprotekcia a) a spojovací cyklus b) sa opakovali s použitím:

311 mg (1 mmol) Fmoc-Ala-OH,

394 mg (1 mmol) Fmoc-IIb-OH,

339 mg (1 mmol) Fmoc-Val-OH,

468	mg	d	mmol)	Fmoc-Lys (Boe) -OH,
311	mg	(1	mmol)	Fmoc-Ala-OH,
311	mg	(1	mmol)	Fmoc-Ala-OH,
311	mg	(1	mmol)	Fmoc-Ala-OH, a
178	mg	(1	mmol)	kyseliny 5-fenylvalérovej

V každom prípade bol čas spojovacej reakcie okolo 30 minút a v malej časti živice sa kontrolovalo dokončenie acylácie Kaiserovým testom. Kyselina fenylvalérová vyžadovala dvojitú spojovaciu reakciu, aby sa získal pozitívny výsledok Kaiserovým testom.

Peptid sa odštiepil od živice s použitím zmesi 7,9 ml kyseliny trifluóroctovej a 0,395 ml trietylsilánu. Po dvoch hodinách sa živica premyla približne 150 ml dichlórmetánu a výsledný roztok sa odparil do sucha. Výsledná pevná látka sa rozdelila medzi 25 ml éteru a 25 ml vody a potom sa éter extrahoval ďalšími porciami vody - 2 x 25 ml. Vodné fázy sa spojili a lyofilizovali.

Hrubý produkt sa purifikoval s použitím preparatívnej RP-HPLC (kolóna Vydac 218TP1022, 250 mm x 22 mm), hrubý materiál sa naniesol v 5 ml 20% acetonitrilu/vody s 200 μΐ DMF. Elúcia sa uskutočňovala na gradiente acetonitril-voda obsahujúcom 0,1% TFA (15-35%acetonitril) viac ako 80 minút pri prietoku 10 ml/minútu. Frakcie obsahujúce produkt sa spojili a lyof ilizovali za vzniku Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH^ (sekvencia s identifikačným číslom 1) ako pevnej bielej látky v množstve 84 mg (35%).

Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín.

RP-HPLC s kolónou Vydac C18, 218TP54, 4,6 x 250 mm, elúcia s acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 až 50% acetonitrilového gradientu viac ako 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu, indikovala 100% čistotu, retenčný čas 18,56 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (pozitívny elektrosprej (ES^-4·)) 954,6 (ΜΗ*), analýza aminokyselín (kyslá hydrolýza viac ako 24 hodín s použitím roztoku 6N HC1 obsahujúceho 1% fenol pri 130 ’C) poskytla (Ala+IIb) 4,80, Val 1,11, Lys 1,07.

Fmoc-Pip-OH sa získal spôsobom analogickým so spôsobom opísaným v práci E. Atherona a R. C. Shepparda (Solid phase peptide synthesis: a practical approach, IRL press, 1989, p.51) pre N-Fmoc-L-metionín: Fmoc-Pip-OH: NMR (DMSO-d_e): 1,3 (m, 2H), 1,7 (m, 2H), 2,5 (m, 2H), 2,9 (t, 2H), 3,7 (m, 1H),

4,2 (t, 1H), 4,4 (d, 2H), 7,4 (m, 4H), 7,7 (d, 2H), 7,9 (d, 2H), hmotnostná spektrometria m/e (ES*) 352,2 (MH*).

Príklad 2

Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH^ a separácia izomérov (sekvencia SEQ ID NO: 2)

2.1 Syntéza (RS)-2-alyl-N-(benzyloxykarbonyl)prolínu g metylesteru N-benzyloxykarbonylprolínu v 20 ml THF sa po kvapkách pridalo k 27,5 ml (2M v hexáne/THF) diizopropylamidu lítneho v 100 ml THF v -78 ’C pod dusíkom. Zmes sa miešala 30 minút a potom sa po kvapkách pridalo 5,5 ml alyljodidu a zmes sa miešala ďalších 30 minút, potom sa nechala zohriať na teplotu okolia. Potom sa zmes pridala k 200 ml vodného chloridu amónneho a extrahovala s 2 x 200 ml éteru. Éterová vrstva sa odparila a zvyšok sa purifikoval chromatografiou na oxide kremičitom s použitím hexánového gradientu stúpajúceho k 20% etyacetát:hexánu. Príslušné frakcie, odparené do sucha, poskytli 9 g (RS)-2-alyl-N-(benzyloxykarbonylJprolinátu ako oleja.

8,5 g tejto látky sa rozpustilo v 40 ml metanolu a 4,5 g hydroxidu sodného pridaného v 20 ml vody a zmes sa udržovala vo vare 60 minút. pH zmesi sa potom upravilo na 7 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a metanol sa odstránil odparením. pH zmesi sa upravilo na 3 a zmes sa extrahovala 2 x 50 ml éteru. Spojené éterové extrakty sa odparili za vzniku (RS) - 2-alvl-N- (benzvloxvkarbonvl) prolínu ako gumy, NMR (d₆-DMSO (373K)): 1,9 (m, 2H) , 2,1 (m, 2H) , 2,6 (q, 1H) , 2,9 (q, 1H), 3,4 (m, 1H), 3,6 (m, 1H) , 5,0 (m, 4H) , 5,75 (m, 1H) ,

7,3 (m, 5H).

2.2 Syntéza metylesteru [ (RS) -2-alyl-N- (benzyloxykarbonyl) prolyl]-(S)-alanínu

7,7 g HOBT, 6,6 g N-metylmorfolínu, 4,5 g metylesteru L-alaninylhydrochloridu a 5,7 g l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidu sa pridalo k 6,5 g (RS)-2-alvl-N-(benzyloxykarbonyl)prolínu v 30 ml DMF a zmes sa miešala 18 hodín a potom sa odparila. Zvyšok sa rozdelil medzi éter a vodu, prefiltroval, aby sa odstránil HOBT a separovala organická vrstva. Organická vrstva sa odparila a zvyšok sa purifikoval chromatografiou na oxide kremičitom s použitím gradientu 20% etylacetátu v hexáne stúpajúcemu na 50% etylacetát v hexáne. Príslušné frakcie sa spojili a odparili do sucha za vzniku 7 g metylesteru ľ íRS) -2-alvl-N- í benzvloxvkarbonvl) prolyl 1 -(S)-alanínu, NMR (d_e-DMS0 (373K)): niekoľko zdvojení vrcholov spôsobené zmesou diastereoizomérov, 1,25 a 1,3 (2d, 3H), 1,75 (m, 2H), 2,2 (m, 2H), 2,65 (m, 1H), 2,9 (m, 1H) , 3,4 (m, 1H), 2,65 (2s, 3H), 3,7 (m, 1H), 4,3 (2q, 1H), 5,0 (m, 4H) , 5,7 (m, 1H), 7,3 (m, 5H), 7,4 a 7,5 (bs, 1H) .

2.3 Syntéza metyl (S)-2-(l-benzyloxykarbonyl-6-oxo-l,7-diaza spiro [4.4]ηοη-7-yl)propionátu (CbZ-III-OMe)

1,5 ml 4% vodného roztoku oxidu osmičelého sa pridalo k 1,45 g metylesteru ľ (RS) -2-alvl-N- (benzvloxvkarbonyl)prolyl]”(S)-alanínu v zmesi 30 ml metanolu a 20 ml vody. Zmes sa miešala 10 minút v argónovej atmosfére, a potom sa po častiach pridalo 2,45 g jodistanu sodného. Zmes sa dve hodiny miešala, potom sa pridalo 100 ml vody a zmes sa extrahovala 2x 70 ml etylacetátu. Spojené extrakty sa usušili a odparili za vzniku

1.4 g gumy. Guma sa rozpustila v 30 ml dichlórmetánu a 0,65 g trietylsilánu a potom sa po kvapkách pridali 4 g kyseliny trif luór octové j. Zmes sa miešala 3 hodiny, odparila sa a zvyšok sa rozdelil medzi vodný hydrogénuhličitan sodný a éter. Éterový extrakt sa oddelil a odparil do sucha. Zvyšok sa purifikoval chromatografiou na oxide kremičitom s použitím gradientu 25% etylacetátu v hexáne stúpajúcom na 100% etylacetát. Príslušné frakcie sa spojili a odparili do sucha za vzniku 0, 8 g metyl(S)-2-(l-benzyloxykarbonyl-6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]-non-7-y1)propionátu, NMR (d_e~DMSO (373K)): niekoľko zdvojení vrcholu spôsobené zmesou diastereoizomérov, 1,25 a 1, 35 (2d, 3H), 1,95 (m, 6H), 3,1-3,5 (m, 4H), 3,6 a 3, 65 (2s, 3H), 4,5 a 4,65 (2q, 1H), 5,05 (m, 2H), 7,25 (m, 5H).

2.4 Syntéza kyseliny (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7-yl)propiónovej (H-III-OH)

Ο

2,5 g uhličitanu draselného sa pridalo k 3,3 g metyl (S) -2-( l-benzyloxykarbonyl-6-oxo-l, 7-diazaspiro[ 4.4]non-7-yl)propionátu v zmesi 40 ml metanolu a 40 ml vody a zmes sa miešala pri teplote okolia 10 hodín. pH sa upravilo na približne 5 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a zmes sa odparila do sucha. Zvyšok sa rozpustil v 40 ml vody a pH sa upravilo na 3 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Zmes sa potom extrahovala 2 x 50 ml dichlórmetánu. Spojené extrakty sa usušili (MgSO^) a odparili pričom poskytli 2,8 g peny. Pena sa rozpustila v 20 ml metanolu a pridalo sa 0,7 g cyklohexánu, ktorý nasledovalo 0,5 g 10% Pd/C. Zmes sa udržovala vo vare 2 hodiny, ochladila, prefiltrovala a filtrát sa odparil za vzniku 1,9 g kyseliny (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7-yl)propiónovej ako peny, NMR (d_e-DMSO): niekoľko zdvojení vrcholov spôsobené zmesou diastereoizomérov, 1,25 a 1,3 (2s, 3H), 1,8 (m, 4H), 2,0 (m, 2H) , 3,0 (m, 2H), 3,3 (m, 2H), 4,5 (m, 1H).

2.5 Syntéza kyseliny (S)-2-[l-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)6—oxo—1,7-diazaspiro[4.4 ]non-7-yl Jpropiónovej (Fmoc-III-OH)

OH

K 0,42 g kyseliny (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7-yl)propióhovej sa pridal pevný hydrogénuhličitan sodný v nadbytku v 2 ml vody a potom sa pridalo 0,7 g 9-fluorenylme- tylsukcinimidylkarbonátu v 3 ml acetónu. Zmes sa miešala 18 hodín. Zmes sa potom pridala k 10 ml vody, extrahovala sa 10 ml éteru a vodná vrstva sa oddelila (éterové extrakty sa vyhodili). pH vodnej vrstvy sa upravilo približne na 3 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a potom sa vrstva extrahovala 2 x 10 ml dichlórmetánu. Spojené extrakty sa odparili za vzniku 0,62 g kyseliny (S)-2-[l-(9-fluorenylmetyloxykarbonyl)-6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7-ylJpropiónovej ako bielej peny, NMR (d_e-DMSO (373K)): niekoľko zdvojení vrcholov spôsobené zmesou diastereoizomérov, 1,3 (2d, 3H), 1, 6 - 2, 0 (m, 6H), 3,05 (m, 1H), 3,2 - 3,45 (m, 3H), 4,2 - 4,4 (m, 1H), 4,5 (m, 1H), 6,2 (s, 2H), 7,35 (m, 4H), 7,8 (m, 4H).

2.6 Syntéza Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH-, a separácia izomérov (sekvencia SEQ ID NO: 2)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala s použitím podobnej metódy ako je metóda opísaná pre príklad 1.4, ale s použitím Fmoc-III-OH namiesto Fmoc-IIb-OH. V tomto prípade sa acylácie uskutočňovali aktiváciou kyselín nasledujúcim spôsobom: 1 mmol kyseliny, 1 mmol HBTU, 2 mmol diizopropyletylamínu, 4 ml DMF. Pri všetkých spojovacích reakciách sa pri Kaiserovom teste pozorovalo, že boli kompletné po menej ako 45 minútach. Táto metóda sa použila za vzniku Fmoc-Val-III-Ala-Pip-NH-živice. Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor peptidov ABI 431, kde sa spojili zostávajúce reziduá do sekvencie podľa odporúčania výrobcu pre jednotlivé acylácie začleňujúce chemický postup s použitím HBTU/HOBT, ako nasleduje. Po deprotekcii sa živica premyla 10 x 10 - 20 ml DMF. 1 mmol kyseliny karboxylovej sa aktivoval 1 ekvivalentom HBTU.

ekvivalent HOBT a 2 ekvivalenty DIPEA v DMF približne minút pred prenosom na približne 60 minút a potom DMF. Deprotekcia Fmoc sa v živicu. Acylácia sa uskutočňovala sa živica premyla 10 x 10 až 20 ml každom štádiu uskutočňovala s pou žitím 20% roztoku piperidínu v DMF (dve ošetrenia 5 ml, každé 10 minút). Po každej deprotekcii sa živica dôkladne premyla 5 x 10 ml DMF.

Peptid sa od živice odštiepil pôsobením 10 ml zmesi kyseliny trifluóroctovej (TFA), trietylsilánu (TES) a vody (90:5: 5) počas 1,5 hodiny. Živica sa odfiltrovala, dôkladne premyla TFA, odobraný filtrát sa koncentroval do sucha rotačným odparením a potom sa výsledný zvyšok rozotieral éterom za vzniku Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH₂ (sekvencia s identifikačným číslom 2) obsahujúcej dve hlavné zložky (RP-HPLC (kolóna Vydac 218TP54 C18) indikovala zmes 52:48). Viac polárny diastereomér sa eluoval s retenčným časom 12,5 minúty a menej polárny diastereomér s retenčným časom 16,5 minúty s použitím 20 - 50% gradientu acetonitril:voda (obsahujúcom 0,1% TFA) 20 minút pri rýchlosti prietoku 1 ml/minútu. Peptid sa ďalej purifikoval preparatívnou HPLC, v podstate ako je opísané pre príklad 1.4, za vzniku dvoch izolovaných zložiek, obe čisté >95% pri RP-HPLC. Viac polárny diastereoizomér bol účinnejší ako menej polárny diastereoizomér v testoch A a Ba bol charakterizovaný nasledovne:

RP-HPLC (20 - 50% acetonitrilový gradient 20 minút, rýchlosť prietoku 1 ml/minútu), retenčný čas = 12,3 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 994,5 (ΜΗ*), analýza aminokyselín poskytla Ala 3,99, Lys 1,20, Val 0,73.

Príklad 3

Phv-Ala-Lys-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 3)

Syntéza sa uskutočňovala ručne a purifikácia sa uskutočňovala s použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade

1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklad 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 25 - 40% acetonitrilového gradientu 20 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 5,56 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 926,5 (ΜΗ*), analýza aminokyselín poskytla (Ala+IIb) 5,87, Lys 1,12.

Príklad 4

Phv-Ile-Ala-Ala-Arg-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO:

4)

Syntéza sa uskutočňovala ručne a purifikácia sa uskutočňovala s použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade

1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc-Papa-OH (použité namiesto Fmoc-Pip-OH) , Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom, aký je opísaný v príklad 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 20 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 17,08 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1048,7 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 0,98, Ala 3,00, Ilb 1,27, Thr 0,86, íle 0,88.

Fmoc-Pap-OH sa získal analogickým spôsobom k tomu, ktorý opísal E. Atheron a R. C. Sheppard (Solid Phase peptide synthesis: a practical approach, IRL press, 1989, p. 51) pre

N-Fmoc-L-metionín.

Fmoc-Pap-OH: NMR (DMSO-d_e) 3,5 (s, 2H) , 4,25 (t, 1H) , 4,5 (d, 2H), 7,1 (d, 2H), 7,4 (m, 6H), 7,75 (d, 2H), 7,9 (d, 2H), 9,6 (s, 1H), hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 372,1 (MH*).

Príklad 5

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO:

5) έί

Syntéza sa uskutóčňovälá ručné š použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade 1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí. Produkt sa purifikoval s použitím preparatívnej RP-HPLC podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, elúcia gradientom acetonitril-voda obsahujúcom 0,1% TFA (15 - 40% acetonitrilu) 60 minút, pri rýchlosti prietoku 10 ml/minútu. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 18,28 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 982,5 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 1,12, (Ala+IIb) 3,8, Val 1,12.

Príklad 6

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ ( sekvencia SEQ ID NO: 6)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala ručne s použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade 1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc-Papa-OH (použité namiesto Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí za vzniku Fmoc-Thr(OBu)-IIb-Ala-Papa-NH-živice. Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor (ACT 357) a zostávajúce rezíduá sa spájali podľa odporúčania výrobcu pre jednotlivé acylácie, ktoré začleňuje chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval preparatívnou RP-HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 1.4. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1, 0 ml/minútu), retenčný čas = 18,21 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES+) 1006,4 (MH*), analýza aminokyselín poskytla

Arg 1,10, Ala 3,88, Ilb 1,04, Thr 1,95.

Príklad 7

Phv-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Papa-NH^ ( sekvencia SEQ ID NO: 7)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala ručne s použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade 1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc-Papa-OH (použité namiesto Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí za vzniku Fmoc-Val-IIb-Ala-Papa-NH-živice. Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zostávajúce rezíduá sa spájali podľa odporúčania výrobcu pre jednotlivé acylácie, ktoré začleňuje chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval preparatívnou RP-HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 2.6. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetoB nitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1, 0 ml/minútu), retenčný čas = 20,87 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1004,6 (MH*), analýza aminokyselín poskytla

Arg 0,96, (Ala+IIb) 5,05, Val 0,97.

Príklad 8

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Val-IIb-Gly-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 8)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala ručne s použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade 1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc-Papa-OH (použité namiesto Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH za vzniku Fmoc-Val-IIb-Gly-Papa-NH-živice. Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zostáva53 júce rezíduá sa spájali podľa odporúčania výrobcu pre jednotlivé acylácie, ktoré začleňujú chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval preparatívnou RP-HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 2.6. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 18,12 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 538,4 * (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 0,92, Ala 2,16, (Gly+IIb) 2,12, Val 0,88.

Príklad 9

Phv-Ala-Ile-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO:

9)

Syntéza sa uskutočňovala ručne a purifikácia sa uskutočňovala s použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade

1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklad 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 23,4 minúty, hmotnostná spekt- rometria, m/e (ES*) 1024,6 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 1,15, (Ala+IIb) 3,88, Val 0,96, íle 1,02.

Príklad 10

Phv-Ala-Arg-Ala-His-Val-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO:

10)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala ručne s použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade 1.4, spojovacej reak cie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc-Papa-OH (použité namiesto Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH za vzniku Fmoc-Val-IIb-Ala-Papa-NH-živice. Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zostávajúce rezíduá sa spájali podľa odporúčania výrobcu prejednotlivé acylácie, ktoré začleňujú chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval preparatívnou RP-HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 2.6. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 20 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 18,8 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES+) 1070,6 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 1,02, (Ala+IIb) 4,12, Val 0,90, His 0,95.

Príklad 11

Phv-Ala-Ala-Asn-Arg-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO:

11)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala ručne s použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade 1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí za vzniku Fmoc-IIb-Ala-Pip-NH-živice. Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zostávajúce rezíduá sa spájali podľa odporúčania výrobcu pre jednotlivé acylácie, ktoré začleňujú chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval preparatívnou RP-HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 2.6. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 17,66 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1025,5 (MH*), analýza aminokyselín poskyt55 la Arg 1,04, Ala 2,94, Val 0,95, Asp 1,05.

Príklad 12

Phv-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip-NH^ (sekvencia SEQ ID NO: 12)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala automaticky na automatizovanom syntetizátore ABI 431 s použitím podobnej metódy ako je opísaná v príklade 2.6, ktorá spája aminokyseliny chránené Fmoc v príslušnom poradí za vzniku Fmoc-Ala-Ala-Pip-NH-živice. Zvyšok syntézy sa uskutočňoval ručne a produkt sa purifikoval preparatívnou RP-HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 1.4. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklade 1.4, ŔP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 16,68 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 954,6 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 1,09, (Ala+IIb) 5,88.

Príklad 13

Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH_,)₃NH.C(=NH) . NH^ (sekvencia SEQ ID NO: 14)

a) Príprava Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH₂)₃NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 13)

0,4 g 2-chlorotritylchloridovej živice (0,25 mmol dostupného chlóru) sa konvertovalo na (3-aminopropyl)aminoživicu reakciou s 0,42 ml 1,3-diaminopropánu v 4 ml DMF 1 hodinu pri teplote okolia. Po dôkladnom premytí pomocou DMF sa živica preniesla do syntetizátora peptidov od firmy Applied Biosystems 430A a postupne sa uskutočňovali spojovacie reakcie a deprotekcie príslušných aminokyselín podľa odporúčania vý robcu. 0,722 g živice sa potom premylo metanolom a usušilo. Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval preparatívnou RP-HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 2.6. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 40 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), retehčný čas = 17, 76 minúty. Tak sa po lyofilizácii získalo 329 mg Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH₂)₃NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 3) hmotnostná spektrometria, m/e (ES+) 916, 5 (MH*).

b) Príprava Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH₂) ₃NH.C(=NH).NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 14)

329 mg Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH₂)₃NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 13) sa rozpustilo v zmesi 5 ml vody a 5 ml acetonitrilu a 132 mg (3 ekvivalenty) 1-H-pyrazol-l-karboxamidínhydrochloridu a pridalo sa 52 μΐ (1 ekvivalent) diizopropyletylamínu. Zmes sa miešala 4 dni pri teplote okolia. Zmes sa purifikovala preparatívnou RP-HPLC a charakterizovala HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4.

Tak sa získalo 178 mg Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH₂)₃NH.C(=NH).NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 14), RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 40 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), retenčný čas = 18,42 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES+) 958,5 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,86, Gly 0,90, Ala 3,20, Arg 1,00.

Príklad 14

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Gly-NHEt (sekvencia SEQ ID NO: 15)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala na syntetizátore peptidov Applied Biosystems 430A a postupné spájacie reakcie a deprotekcia príslušných aminokyselín sa uskutočňovali podľa odporúčania výrobcu, začínajúc od 0,54 g (0,25 mmol) Boc-Gly-O-benzylesterovej živice (živica Merrifield). 871 mg živice sa premylo metanolom a usušilo a potom sa jemne miešalo s 10 ml DMF a 10 ml 2M etylamínu v metanole 7 dní pri teplote okolia. RP-HPLC indikovala rýchle uvoľňovanie metylesteru do roztoku nasledované pomalou konverziou na menej hydrofilný N-etylamid. Zmes sa filtrovala a živica sa premyla s DMF. Odparenie rozpúšťadiel poskytlo . hrubý chránený peptid ako N-etylamid. Deprotekcia peptidu sa uskutočnila s použitím zmesi TFA, TES a vody (90:5:5) a peptid sa purifikoval preparatívnou RP-HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 2.6 za vzniku 168 mg Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Gly-NHEt (sekvencia SEQ ID NO: 15). Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom aký je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrÍlového gradientu 40 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu) , retenčný čas = 17,85 minúty, hmotnostná spektroskopia, m/e (ES*) 972,5 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,83, Gly 1,03, Ala 2,17, Ilb 0,9, Arg 2,00.

Príklady 15 a 16

Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (Príklad 15) (sekvencia SEQ ID NO: 16)

Phv-Gap(Me)₄-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (Príklad 16) (sekvencia SEQ ID NO: 17)

a) Príprava Phv-Dap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 36)

Syntéza sa uskutočňovala automaticky na syntetizátore peptidov od firmy Applied Biosystems 430A s použitím 0,25 mmol živice Fmoc Rink Amide a postupné spojovacie reakcie a deprotekcia príslušných aminokyselín sa uskutočňovali podľa odporúčania výrobcu. Zvyšok Dap sa začleňoval s použitím

Fmoc-Dap(Boc)-OH v príslušnom štádiu syntézy. Dokončená živica sa usušila. Výťažok bol 1,292 g (hmotnostný prírastok, 792 mg). Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval sa preparatívnou RP-HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 1.4, ale s použitím kolóny Dynamax 60A (vnútorný priemer 2,54 cm (1 palec)) elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA (gradient 10 - 40% acetonitril) 60 minút pri rýchlosti prietoku 12 ml/minútu za vzniku 304 mg Phv-Dap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 36). Peptid sa charakterizoval HPLC a hmotnostnou spektroskopiou podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 10 - 40% acetonitrÍlového gradientu 60 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), retenčný čas = 24,5 minúty, hmotnostná spektroskopia, m/e (ES*) 937,1 (ΜΗ*).

b) Peptid Dap z a) sa rozpustil v 7 ml vody a 8 ml acetonitrilu a ošetril sa 130 mg 1-H-pyrazol-l-karboxyamidínhydrochloridu a 53 μΐ diizopropyletylamínu 1 týždeň pri teplote okolia. RP-HPLC indikovala iba 40% konverziu na zodpovedajúci peptid Gap. Pokusná preparatívna RP-HPLC úplne zlyhala v oddelení týchto dvoch zlúčenín. V súlade s tým sa zmes ošetrila 87 mg HBTU a 50 μΐ diizopropyletylamínu v 50 ml DMF 16 hodín, aby sa nezmenený peptid Dap konvertoval na tetrametylguanidínový (GapMe^) peptid. Zvýšená hydrofóbnosť tejto zlúčeniny umožnila ľahšiu preparatívnu HPLC (podmienky ako je opísané v a)), ktorá sa uskutočňovala za rovnakých podmienok ako tá, ktorá je opísaná v a) vyššie za vzniku oboch

i) 80 mg Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 16), ktorá sa charakterizovala HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, RP-HPLC (10 - 40% acetonitrÍlový gradient 40 minút, rýchlosť prietoku 1, 2 ml/minútu), retenčný čas = 26,2 minúty, hmotnostná spektroskopia, m/e (ES*) 978,5 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,90, Ala 4,05, Ilb prítomný, vrchol v pozícii Trp pre Gap.

ii) 122 mg Phv-Gap(Me)_A-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sek venčia s identifikačným číslom 17), ktorá sa charakterizovala ako v i) vyššie, RP-HPLC (elúcia a gradient ako v i) vyššie), retenčný čas = 28,4 minúty, hmotnostná spektroskopia, m/e (ES*) 1034,6 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,90, Ala 4,11, Ilb prítomný, vrchol v pozícii Trp pre Gap(Me)^.

Príklad 17

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NHCH^CH^-morf olín (sekvencia SEQ ID NO: 18)

Na túto syntézu sa použila stratégia chráneného fragmentu. 1 g (1 mmol) Fmoc-Gly-O-chlorotritylovej živice sa pripravil automaticky na syntetizátore peptidov od firmy Applied Biosystems 430A spojením 2 mmol Fmoc-Gly-OH s 1 g (1 mmol) 2-chlorotritylchloridovej živice v 10 ml DMF v prítomnosti 4 mmol N-diizopropyletylamínu a predlžoval sa stratégiou dvojitého spájania (podobným spôsobom ako je opísané v príklade 2.6) za vzniku 2,15 g chránenej peptidovej živice. Po odštiepení od živice 30 ml dichlórmetánu, 5 ml kyseliny octovej a 5 ml trifluóretanolu pri teplote okolia 1 hodinu sa živica odfiltrovala a premyla dichlórmetánom a kyselinou octovou. Odparenie rozpúšťadiel a následná lyofilizácia z vodného acetonitrilu poskytla 1,23 g vyžadovaného chráneného peptidu. Peptid sa charakterizoval podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, RP-HPLC (20 - 80% acetonitrilový gradient 40 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), retenčný čas = 26,2 minúty.

235 mg (0,2 mmol) chránenej kyseliny sa spojilo s 27 μΐ (1 ekvivalent) 4-(2-aminoetyl)morfolínu v 10 ml DMF, so 76 mg (1 ekvivalent) HBTU a 70 μΐ diizopropyletylamínu. Odparenie rozpúšťadiel, deprotekcia 90% TFA/H_aO a purifikácia s použitím podobného spôsobu ako je opísané v príklade 1.4 poskytli 150 mg čistého amidu. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, RP-HPLC (10 - 40% acetonitrilový gradient 40 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), reten60 čný čas = 18,6 minúty, hmotnostná spektroskopia, m/e (ES*)

972,8 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,6, Gly 1,02, Ala 2,94, Ilb 0,9, Arg 1,0.

Príklad 18

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-N(CH₂CH₂) ₂NCH₂CH₂O-CH₂CH₂OH (sekvencia SEQ ID NO: 19)

S použitím postupu analogickému k tomu, ktorý je opísaný v príklade 17, ale pri použití 4-[ 2-(2-hydroxyetoxy )etyl ]piperazínu namiesto 4-(2-aminoetyl)morfolínu, sa získala Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-N(CH CH ) NCH CH O-CH CH OH (sekvencia SEQ ID NO: 19). Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, RP-HPLC (s použitím elúcie a gradientu ako v príklade 17) retenčný čas = 20,5 minúty, hmotnostná spektroskopia, m/e (ES*) 1016,8 (MH*) , analýza aminokyselín poskytla Thr 0,89, Gly 1,02, Ala 2,98, Ilb 1, 05, Arg 1,00.

Príklad 19

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-Pape-NHC(=NH)NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 20) f

S použitím postupu analogickému k tomu, ktorý je opísaný v príklade 17, ale pri použití 4-(2-guanidínetyl) anilínu namiesto 4-(2-aminoetyl)morfolínu, sa získala Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-Pape-NHC(=NH)NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 20). Peptid sa purifikoval preparatívnou RP-HPLC podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, ale s použitím kolóny Vydac 201HS1022 (vnútorný priemer 2,54 cm (1 palec)) a elúcie s gradientom acetonitril-voda obsahujúca 0,1% TFA (10 -35% acetonitril) 60 minút pri rýchlosti prietoku 12 ml/minútu. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, RP-HPLC (s použitím elúcie a gradientu ako v príklade 17) retenčný čas = 24,2 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1021,1 (ΜΗ*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,8, Gly 0,95, Ala 2,86, Arg 1,0, Ilb prítomný.

4-(2-guanidínetyl)anilíndihydrochlorid sa pripravil nasledujúcim postupom:

1,013 g (5 mmol) 4-nitrofenetylamínhydrochloridu, 0, 73 3 g (5 mmol) lH-pyrazol-l-karboxamidínhydrochloridu a 0, 88 ml (5 mmol) N-diizopropyletylamínu v 10 ml acetonitrilu a 10 ml vody sa miešalo 16 hodín pri teplote okolia. Preparatívna RP-HPLC sa uskutočňovala v dvoch častiach s použitím kolóny Dynamax 60A, C18 (vnútorný priemer 2,54 cm (1 palec)), elúcia a acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA za poskytnutia čistého 4-nitrofenylguanidínu. Produkt sa rozpustil v 100 ml vody a pridala sa 1 kvapka koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej, ktorú nasledovalo 5% paládium na 100 mg uhlíka a roztokom 4 hodiny prebublával vodík. Katalyzátor sa odstránil filtráciou a premyl vodou. Prchavé látky sa odstránili odparením za vzniku 0,984 g 4-(2-guanidínetyl)anilíndihydrochloridu ako hnedej peny (po vysušení cez pelety hydroxidu draselného).

Príklad 20

Phv-Ala-Ala-Ala-Arg-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 21)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala ručne s použitím podobnej metódy ako bola opísaná v príklade 2.6, s použitím aktivácie HBTU/DIPEA a spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí za vzniku Fmoc-IIb-Ala-Papa-NH-živice. Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zostávajúce rezíduá sa spájali podľa odporúčania výrobcu pre jednotlivé acylácie, ktoré začleňujú chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval s pou žitím podobného postupu ako bol opísaný v príklade 2.6. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 20 - 40% acetonitrilového gradientu 20 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 11,57 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES·¹·) 1006,4 (ΜΗ”⁴), 503,8 (M+2H*-), 514,8 (M+H*+NA*), analýza aminokyselín poskytla Ala 4,19, Arg 0,91, Thr 0,74.

Príklad 21

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-Papa-NH (sekvencia SEQ ID NO: 22)

Prvá časť syntézy sa uskutočňovala ručne s použitím podobnej metódy ako bola opísaná v príklade 2.6, s použitím aktivácie HBTU/DIPEA a spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí, okrem začlenenia zvyšku Azgly. Zvyšok Azgly sa začlenil spojovacou reakciou 4 ekvivalentov Fmoc-Azgly-OH (získaný ako je opísané v EP 518655) s 0,25 ekvivalentu HOBT v DMF 4 hodiny v 50 ’C. Získala sa tak Fmoc-IIb-Azgly-Papa-NH-živica. Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zostávajúce rezíduá sa spájali podľa odporúčania výrobcu pre jednotlivé acylácie, ktoré začleňujú chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval s použitím podobného postupu ako bol opísaný v príklade 2.6. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 15 - 35% acetonitrilového gradientu 20 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 8,10 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (negatívny elektrosprej (ES^-) 1076,4 (ΜΗ^-), analýza aminokyselín poskytla Ala 2,10, Arg 2,00, Thr 0,99.

Príklad 22

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-NH^ (sekvencia SEQ ID NO:

23)

Použil sa analogický postup ako ten, ktorý je opísaný v príklade 21. Prvá časť syntézy sa uskutočňovala ručne s použitím aktivácie HBTU/DIPEA za vzniku Fmoc-IIb-Azgly-NH-živice. Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zostávajúce rezíduá sa spájali podľa odporúčania výrobcu pre jednotlivé acylácie, ktoré začleňujú chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid sa odštiepil od živice a purifikoval s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 2.6. Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 20 - 35% acetonitrilového gradientu 20 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 7,26 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 945,6 (MH*), 473,4 (M+2H**), analýza aminokyselín poskytla Ala 2,08, Arg 2,00, Thr 0,78.

Príklad 23

Phv-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO:

24)

Použil sa analogický postup ako ten, ktorý je opísaný v príklade 2.6, okrem toho, že celé spájanie peptidov sa uskutočňovalo ručne s použitím aktivácie HBTU/DIPEA, spájanie Fmoc-Pap-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-IIb-OH a kyseliny 5-fenylvalérovej v príslušnom poradí. Peptid sa odštiepil od živice s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 2.6. Produkt sa purifikoval s použitím preparatívnej RP-HPLC podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, elúcia gradientom acetonitril-voda obsahujúca 0,1% TFA (15-30% acetonitril) 90 minút pri rýchlosti prietoku 10 ml/minútu. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 15 - 30% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 20,02 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1061,6 (MH*), 531,4 (M+2H**), analýza aminokyselín poskytla Ala 4,16, Arg 2,00, Ilb prítomný.

Príklad 24

3-(2-kyanobenzo[b]tiofen-5-yl)propionyl-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH^ (sekvencia SEQ ID NO: 25)

Syntéza a purifikácia sa uskutočňovali ručne s použitím podobnej metódy ako bola opísaná v príklade 1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc-Papa-OH (použité namiesto Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí a s použitím kyseliny 3-(2-kyanobenzo[b]tiofen-5-yl)propiónovej namiesto kyseliny 5-fenylValérovej. Produkt sa purifikoval s použitím preparatívnej RP-HPLC podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, elúcia s gradientom acetonitril-voda obsahujúca 0,1% TFA (15-40% acetonitril) 60 minút pri rýchlosti prietoku 10 ml/minútu. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 17,58 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1114,7 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 2,86, Ala 4,12, Ilb 1,0.

Kyselina 3-(2-kyanobenzo[b]tiofen-5-yl)propiónová sa získala nasledovne:

a) 1 g Raneyovho katalytického niklu a 3 ml hydrazínhydrátu sa pridali k 25 g etyl 5-nitrobenzo[b]tiofén-2-karboxylátu (získaný ako je opísané v Syn. Comm. 21, 959-964, 1991) v 500 ml etanolu pri 60 'C. Nasledovala prudká reakcia a zmes sa privi edla do varu. Ďalšie diely Raneyovho niklu (1 g) a hydrazínhydrátu sa pridávali v 10-minútových intervaloch, až kým sa nepridalo celkové množstvo 15 ml, a zmes sa potom udržovala vo vare 90 minút. Horúca zmes sa prefiltrovala a filtrát sa odparil. Zvyšok sa rozpustil v 300 ml horúceho etanolu a pridalo sa aktívne uhlie. Zmes sa prefiltrovala a filtrát sa odparil do sucha za vzniku 18 g etyl 5-aminobenzo[b]tiofén-2-karboxylátu ako pevnej svetložltej látky. Pevná látka sa pridala k miešanej zmesi 50 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej a 130 ml vody pri približne 0 ’C. Pomaly sa pridal roztok dusitanu sodného vo vode a potom sa zmes miešala pri 0 ’C ďalších 30 minút. Potom sa pridal roztok 130 g jodidu draselného v 200 ml vody. Zmes sa nechala zohriať na teplotu okolia a potom sa zohrievala 30 minút pri 50 ’C. Zmes sa nechala vychladnúť, extrahovala 150 ml chloroformu a organická vrstva sa premyla roztokom vodného siričitanu sodného. Organická fáza sa vysušila (MgSO^) a odparila za vzniku hnedého oleja. Olej sa purifikoval chromatografiou na oxide kremičitom pri použití hexánového gradientu stúpajúceho k 10% etylacetát/hexán. Príslušné frakcie sa spojili a odparili za vzniku 14 g 5-jodobenzo[b]tiofén-2-karboxylátu ako oleja, NMR (d_e-DMSO): 1,35 (t, 3H), 4,4 (q, 2H), 7,8 (dd, 1H), 7,9 (d, 1H), 8,15 (s, 1H), 8,45 (d, 1H).

b) 5 g hydroxidu sodného v 150 ml vody sa pridalo k 14 g 5-jodobenzofb]tiofén-2-karboxylátu v 200 ml etanolu a zmes sa miešala 16 hodín. Zmes sa koncentrovala na asi 150 ml odparením a v zmesi sa upravilo pH na približne 3 pridaním zriedenej kyseliny chlorovodíkovej. Zmes sa potom extrahovala 2 x 100 ml dietyléteru. Spojené organické extrakty sa usušili (MgSO^) a odparili za vzniku 11,7 g kyseliny 5-jodobenzo[b]tiofén-2-karboxylovej ako pevnej látky, NMR (d₆~DMSO): 7,8 (dd, 1H), 7,9 (d, 1H), 8,05 (s, 1H), 8,45 (d, 1H) .

c) 2,7 ml oxalylchloridu a 1 kvapka DMF sa pridali k 3,05 g kyseliny 5-jodobenzo[b]tiofén-2-karboxylovej v 30 ml dichlórmetánu, čo spôsobilo vývoj plynu. Potom, keď sa vývoj plynu ukončil, sa zmes odparila do sucha a zvyšok sa rozpustil v 10 ml THF. Roztok sa pridal po častiach k 25 ml koncentrova-

neho vodného čpavku. Po ukončení pridávania sa zmes miešala 1 hodinu. Pevná látka, ktorá precipitovala, sa zozbierala filtráciou, premyla vodou a usušila vo vákuu. 3 g pevnej látky sa rozpustili v 15 ml DMF a zmes sa pri 0 ’C pridala k zmesi 20 ml DMF a 3 g fosforylchloridu. Zmes sa 2 hodiny miešala. Zmes sa potom pridala do 60 ml vody a pevná látka, ktorá precipitovala, sa zozbierala filtráciou, premyla vodou a usušila vo vákuu za vzniku 2,65 g 2-kyano-5-jodobenzo[bjtiofénu ako svetložltého prášku, NMR (d₆-DMS0): 7,9 (dd, 1H), 8,0 (d, 1H), 8,3 (s, 1H), 8,45 (d, 1H) .

d) 2 g metylakrylátu, 2,35 g trietylamínu a 0,05 g paládiumacetátu sa pridalo k 4,8 g 2-kyano-5-jodobenzo[b]tiofénu v 25 ml DMF a zmes sa miešala v argónovej atmosfére 30 minút pri 90 'C. Zmes sa nechala vychladnúť a potom sa pridala do 50 ml vody. Pevná látka, ktorá precipitovala, sa zozbierala filtráciou a rozpustila v chloroforme. Pridalo sa aktívne uhlie, zmes sa prefiltrovala a filtrát sa usušil (MgSO^). Rozpúšťadlo sa odstránilo odparením za vzniku 2,5 g metyl-3-(2-kyanobenzo[b]tiofen-5-yl)akrylátu, NMR (d_e-DMSO): 3,75 (S, 3H), 6,7 (d, 1H), 7,8 (d, 1H) , 8,0 (dd, 1H), 8,2 (d, 1H), 8,3 (d, 1H), 8,85 (s, 1H).

e) 2,5 g metyl-3-(2-kyanobenzo[b]tiofen-5-yl)akrylátu sa hydrogénovalo v 20 ml THF pri použití 10% paládia na 0,5 g uhlíka ako katalyzátora dovtedy, kým nezmizla väčšina počiatočnej látky pri chromatografii na tenkej vrstve (doštičky z oxidu kremičitého eluované etylacetát/hexánom 1:4). Zmes sa prefiltrovala a odparila za vzniku 1,45 g metyl-2-kyanobenzo[b]tiofén-5-propionátu kontaminovaného s približne 20% počiatočnej látky. 0,23 g hydroxidu sodného sa pridalo k zmesi 1,4 g tohto produktu v 10 ml THF a 3 ml vody a zmes sa miešala dve hodiny. pH zmesi sa upravilo približne na 5 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a koncentrovalo odparením, aby sa odstránil prítomný THF.

Príklad 25

Phv-Arg-Ala-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 26)

Syntéza sa uskutočňovala ručne a purifikácia sa uskutočňovala s použitím podobnej metódy ako bola opísaná v príklade 1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc-Papa-OH (použité namiesto Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 17,45 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1061,9 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 1,94, Ala 4,04, Ilb 1,02.

Príklad 26

Phv-Arg-Ile-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 27)

Syntéza sa uskutočňovala automaticky na automatizovanom syntetizátore (ABI 431) s použitím podobnej metódy ako bola opísaná v príklade 2.6, spájajúcej aminokyseliny chránené Fmoc-Papa-OH a Fmoc v príslušnom poradí s výnimkou, že Fmoc-IIb-OH sa začlenil ručne. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 20,7 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1061,9 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 1,92, Ala 3,03, Ilb 0,96, íle 1,08.

Príklad 27

Phv-Ile-Arg-Ala-IIb-Leu-Arg-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO:

28)

Syntéza sa uskutočňovala ručne a purifikácia sa uskutočňovala s použitím podobnej metódy ako bola opísaná v príklade 1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc-Papa-OH (použité namiesto Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 10 - 50% acetonitrilového gradientu 30 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 23,8 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1145,7 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Arg 1,98, Ala 1,92, Leu 0,99, íle 1,09, Ilb prítomný.

Príklad 28

Phv-Ala-Arg-Ala-IIc-Ala-Ala-Ala-Papa-NH^ (sekvencia SEQ ID NO: 29)

Syntéza sa uskutočňovala ručne s použitím podobnej metódy ako bola opísaná v príklade 1.4, spojovacej reakcie a deprotekcie aminokyselín chránených Fmoc-Papa-OH (použité namiesto Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH v príslušnom poradí. Produkt nevyžadoval purifikáciu preparatívnou HPLC. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá obsahuje 0,1% TFA, s použitím 20 - 40% acetonitrilového gradientu 20 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 10,45 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 962,5 (ΜΗ*), 492,8 (M+H+Na)**, analýza aminokyselín poskytla Ala 4,90, Arg 1,00, líc prítomný.

Fmoc-IIc-OH sa získal použitím podobného postupu ako bol opísaný v príklade 1 pre prípravu Fmoc-IIb-OH, ale pri použití metylesteru glycínu namiesto metylesteru L-alaninylhydrochloridu v kroku 1.1. Získali sa nasledujúce medziprodukty:

Boc-(D)-Met-Gly-OMe, v 80% výťažku, NMR (CDC1₃): l,4d (s, 9H), 2,Od (m, 1H), 2,ld (m, 1H), 2,ld (s, 3H), 2,6d (t, 2H), 3,8d (s, 3H), 4,05d (m, 2H), 4,4d (m, 1H), 5,3d (bs, 1H), 6,8d (bs, 1H), mety 1- 2 - [ (3R) - 3 -JJ- [ terc-buty1oxykarbonyl ] amino) - 2 -oxopyroli din-l-yl]acetát, v 50% výťažku, NMR (CDC1₃): l,45d (s, 9H), 2, Od (m, 1H) , 2,6d (m, 1H), 3,4d (m, 2H), 3,8d (s, 3H), 4,05d (q, 2H), 4,ld (m, 1H), 5,55 (bs, 1H), kyselina 2-[(3R)-3-(H-[9-fluorenylmetyloxykarbonyl]amino)-2-oxo-pyrolidin-l-yl]octová, v 75% výťažku, NMR (d -DMSO): e

1,9d (m, 1H), 2,3d (m, 1H) , 3,3d (m, 2H), 4,Od (q, 2H), 4,3d (m, 4H), 7,4d (m, 4H), 7,6d (m, 2H), 7,9d (d, 2H).

Príklad 29

Phv-Arg-Ala-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Papa-NH^ (sekvencia SEQ ID NO: 30)

Syntéza sa uskutočňovala automaticky na automatizovanom syntetizátore peptidov ACT 357 (s použitím živice Rink Amide MBHA) spájajúcej aminokyseliny chránené Fmoc-Papa-OH a Fmoc v príslušnom poradí s výnimkou, že Fmoc-IIb-OH sa začlenil ručne. Automatické spojovacie reakcie sa uskutočňovali podlá odporúčania výrobcu pre jednotlivé acylácie aktiváciou 1 mmol karboxylovej kyseliny s 1 ekvivalentom diizopropylkarbodiimidu a 1 ekvivalentom HOBT a DMF približne 11 minút pred prenesením na živicu. Acylácia sa uskutočňovala približne 60 minút a premývacie a deprotekčné postupy sa uskutočňovali podobným spôsobom ako je opísané v príklade 2.6. Ručné spojovacie reakcie Fmoc-IIb-OH sa uskutočňovali v skúmavke Bond Elut pri použitím chemického postupu s použitím HBTU/HOBT. Kyselina 5-fenylvalérová vyžadovala dvojitú spojovaciu reakciu, aby sa získal pozitívny výsledok Kaiserovým testom. Potom sa peptid odštiepil od živice a purifikoval s použitím preparatívnej RP-HPLC podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4. Produkt sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou, ktorá

7.

obsahuje 0,1% TFA, s použitím 20 - 35% acetonitrilového gradientu 15 minút, rýchlosť prietoku 1,0 ml/minútu), retenčný čas = 10,33 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 976,5 (MH*), 499,9 (M+H+Na)**, analýza aminokyselín poskytla Ala 5,

02, Arg 1,00, Ilb 1,22.

Príklad 30

Phv-Lys (=C (NMe₂) ) -Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvencia SEQ ID NO: 31)

Použitím analogického postupu s tým, ktorý je opísaný v príklade 15 a), ale pri použití Fmoc-Lys(Boc)-OH namiesto Fmoc-Dap(Boc)-OH, sa tak získalo, potom čo sa peptid odštiepil od živice a po purifikácii preparatívnou RP-HPLC, 270 mg Phv-Lys-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂. 270 mg peptidu sa potom miešalo v zmesi 94 mg HBTU, 88 μΐ diizopropyletylamínu a 50 ml DMF 16 hodín. Zmes sa odparila a zvyšok sa purifikoval preparatívnou RP-HPLC s použitím analogického postupu ako je opísaný v príklade 15 a). Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísaný v príklade 1.4, RP-HPLC (10 - 40% acetonitrilový gradient 40 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), retenčný čas = 29,83 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1077,27 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 1,0, Ala 4,3, Arg 1,00, Ilb prítomný, tetrametylhomoarginín prítomný.

Príklady 31 až 33

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NHCH^CH^-morf olín (príklad 31) (sekvencia SEQ ID NO: 32)

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OCH₃ (príklad 32) (sekvencia SEQ ID NO: 33)

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (príklad 33) (sekvencia SEQ ID NO: 34)

1,67 g (1 mmol) hydroxymetylpolystyrénovej živice sa miešalo pri teplote okolia s 1,5 g (4 mmol) Fmoc-Papa-OH, 0,628 ml diizopropylkarbodiimidu a 61 mg (0,5 mmol) dimetylaminopyridínu v 5 ml DMF a 20 ml dichlórmetánu 2 hodiny. Živica sa prefiltrovala a premyla 5 x 20 ml DMF a 5 x 20 ml metanolu a sušila vo vákuu pri 40 ’C (výťažok 2,105 g). Peptidová živica sa potom preniesla na automatizovaný syntetizátor (ABI 430A) a zostávajúce aminokyseliny chránené Fmoc sa spájali podobným spôsobom ako je opísané v príklade 2.6 za vzniku 2,992 g chránenej peptidovej živice. Peptidová živica sa potom suspendovala v zmesi 10 ml DMF a 10 ml metanolu a pridalo sa 0, 88 ml 4-(2-aminoetyl)morfolínu, nasledovaného katalytickým množstvom kyanidu draselného (50 mg). Po 7 dňoch pri teplote okolia sa zmes prefiltrovala a živica sa premyla 5 x 20 ml DMF. Živica sa okamžite resuspendovala v zmesi 10 ml DMF, 10 ml metanolu a 50 mg kyanidu draselného. Po 4 dňoch sa zmes prefiltrovala a živica sa premyla 5 x 20 ml DMF. Všetky filtráty a roztoky sa po premytí spojili a odparili do sucha. Po deprotekcii 90% TFA/H^O a odstránení prchavých látok odparením sa zvyšok purifikoval preparatívnou HPLC s použitím podobného postupu ako je opísaný v príklade 1.4 za vzniku 3 produktov. Produkty sa charakterizovali nasledovne:

mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NHCH^CH^-morfolínu (sekvencia SEQ ID NO: 32), RP-HPLC (10 - 50% acetonitrilový gradient 40 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), retenčný čas = 19,5 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1119,8 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,58, Ala 3,84, Arg 1,16, Ilb 1,0.

mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OCH₃ (sekvencia SEQ ID NO: 33), RP-HPLC (10 - 50% acetonitrilový gradient 40 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), retenčný čas = 27, 7 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1021,6 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,61, Ala 3, 80, Arg 1,22, Ilb 0,97.

155 mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (sekvencia SEQ ID NO: 34), RP-HPLC (10 - 50% acetonitrilový gradient 40

Ét o minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), retenčný čas = 24,2 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES*) 1007,5 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,62, Ala 3,78, Arg 1,20, Ilb 0,98.

Príklad 34

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-N(CH CH ) N-(CH ) O (CH ) OH ^2 «2 ^2 ^2 Si «2 ^2 (sekvencia SEQ ID NO: 35)

235 mg 4-(2-( 2-hydroxyetoxy) etyl jpiperazínu sa pridalo k zmesi 135 mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH, 51 mg HBTU, 47 μΐ DIPEA a 10 ml DMF a zmes sa miešala 60 minút. Prchavé látky sa odstránili odparením a zvyšok sa purifikoval s použitím podobného postupu ako je opísané v príklade 1.4 za vzniku 115 mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-N( CH₂CH ) NCH CH -OCH CH OH (sekvencia s identifikačným číslom 35). Peptid sa charakterizoval HPLC, hmotnostnou spektroskopiou a analýzou aminokyselín podobným spôsobom ako je opísané v príklade 1.4, RP-HPLC (elúcia acetonitrilom a vodou obsahujúcou 0,1% TFA, s použitím 10 - 40% acetonitrilového gradientu 40 minút, rýchlosť prietoku 1,2 ml/minútu), retenčný čas = 18, 83 minúty, hmotnostná spektrometria, m/e (ES+) 1163,8 (MH*), analýza aminokyselín poskytla Thr 0,62, Ala 3,80, Arg 1,22, Ilb 0,97.

Príklad 35

Zlúčeniny vynálezu sa môžu podávať na liečebné alebo profylaktické použitie teplokrvným živočíchom ako je človek vo forme bežných farmaceutických prípravkov, ktorých typický príklad obsahuje nasledovné:

Roztok na injekcie

0,01 až 100 mg aktívnej zložky sa rozpustí až v 2 ml vodného injekčného nosiča, pričom vznikne koncentrácia aktívnej zložky medzi 0,01 až 100 mg/ml. Vodný injekčný nosič sa pufruje na hodnotu pH medzi 5 a 8 s použitím farmaceutický prijateľného pufra (napríklad fosfátový alebo acetátový pufor) a obsahuje farmaceutický prijateľný prípravok upravujúci osmotický tlak (napríklad chlorid sodný alebo dextróza), ktorý sa pridá, aby sa dosiahla izotonickosť. Nosič môže prípadne obsahovať aj ďalšie farmaceutický prijateľné excipienty, ako sú rozpúšťadlá (napríklad DMSO, etanol, propylénglykol alebo polyetylénglykol), konzervačné prípravky a antioxidanty. Aktívna zložka môže byť typicky niektorým z príkladov v tomto texte a môže byť prítomná ako farmaceutický prijateľná soľ.

Chemické vzorce:

• -,2____ p ---PJ---K --* ‘ '

(i±ib čh₃

Zoznam sekvencii (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 1 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA:

(D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-piperidín-4-karboxamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1

Xaa Ala Ala Lys Val Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 2 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7-yl)propanoyl]-Ala-piperidín-4-karboxamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 2

Xaa Ala Ala Lys Val Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 3 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĎŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:.

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 4 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka =[(S )-2-((R)-3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = Ala-piperidín-4-karboxamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3

Xaa Lys Ala Xaa Ala Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 4 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ile (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ . /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pyro lidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4

Xaa Ala Ala Arg Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 5 (í) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-karboxamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 5

Xaa Ala Ala Ala Val Xaa

5 §6 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 6 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)—2—((R)-3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 7 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl) propanoyl ] -Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7

Xaa Ala Ala Arg Val Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 8 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6

M ^; · (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-( (R)-3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl) propanoyl ] -Gly-4 -aminof enylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 8

Xaa Arg Ala Arg Val Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 9 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-S-amino-Z-oxo-pyrolidin-l-yl ) propanoyl ]-Ala-piperidín-4-karboxamid (Xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO; 9

Xaa íle Ala Arg Val Xaa

5 ä3 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 10 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-( (R)-3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10

Xaa Arg Ala His Val Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 11 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = ”5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-piperidín-4-karboxamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11

Xaa Ala Asn Arg Val Xaa

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 12 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĎŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 4

- · *·♦, (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ''ĎALŠÍ” /poznámka = ”[(S)-2-( (R)-3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala” (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = Ala-piperidín-4-karboxamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12

Xaa Arg Ala Xaa Ala Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 13 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = ”5-fenylpentanoyl-Ala” (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl )propanoyl]-Gly-3-aminopropylamín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 13

Xaa Arg Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 14 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl Jpropanoyl ]-Gly-3-aminopropylguanidín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 14

Xaa Arg Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 15 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl Jpropanoyl ]-Gly-NHetyl (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15

Xaa Arg Ala Arg Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 16 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1

r. 88 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-3-guanidinoAla (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 16

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 17 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-3-(terametylguanidino)Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyro lidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 18 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Gly-4-(2-aminoetyl)morfolín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 18

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 19 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-( (R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Gly-piperazin-4-yl.CH CH OCH CH OH

2 2 2 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 19

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 20 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)—2—((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-ylJpropanoyl]-Gly-4-aminofénetylguanidín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 20

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 21 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DÍŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 21

Xaa Ala Ala Arg Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 22 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S )-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-[NH-NH-CO]-4-aminofenylacetamid (Xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 22

Xaa Arg Ala Arg Thr Xaa (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 23 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoylJ-NH-NH-CONH^ (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 23

Xaa Arg Ala Arg Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 24 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid

Ši (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 4 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 24

Xaa Arg Ala Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 25 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = ”3-(2-kyanobenzo[b]tiofén-5-yl)propanoyl-Ala” (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 4 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala” (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 25

Xaa Arg Ala Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 26 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 4 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyroIidin-1-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = Ala-4-aminofenylacetamid (Xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 26

Xaa Ala Ala Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 27 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 4 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyro97 lidin-l-yl) propanoyl ] -Ala*' (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 27

Xaa íle Ala Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ IĎ NO: 28 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 4 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Leu (ix) ZNAK:

(A).MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 28

Xaa Arg Ala Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 29 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENÍE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Ala” (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 4 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = ”[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)acetylJ-Ala” (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ” /poznámka = Ala-4-aminofenylacetamid” (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 29

Xaa Arg Ala Xaa Ala Xaa

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 30 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 4 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl ]-Ala (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 30

Xaa Ala Ala Xaa Ala Xaa

5 íoÔ (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 31 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: 1ineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-tetrametylhomo-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl ] -Ala-4-aminof enylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 31

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA 0 SEKVENCII SEQ ID NO: 32 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna

101 (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl ] -Ala- (4-aminof enylCH .CO.NH.CH .CH -morfolín

2 2 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 32

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 33 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

102 (A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [metylester kyseliny (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenyloctovej (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 33

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 34 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /po známka = ”[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl ] -Ala-4-aminof enyloctová kyselina (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 34

103

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 35 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl ] -Ala-4-aminof enylpiperazin-4-yl-CH₂CH₂OCH₂CH₂OH (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 35

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII SEQ ID NO: 36 (i) CHRAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina

104 (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TYPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 1 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = 5-fenylpentanoyl-Dpr (ix) ZNAK:

(A) MENO/OZNAČENIE: peptid (B) POZÍCIA: 6 (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: /produkt = ĎALŠÍ /poznámka = [(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 36

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Peptidový derivát všeobecného vzorca I, P-R¹-R²-R³-R⁴, kde

   P je hydrofóbny zvyšok,

   R¹ je sekvencia 5 L-aminokyselín a R³ je jedna

   L-aminokyselina, alebo

   R¹ je sekvencia 3 L-aminokyselín a R³ je sekvencia 3 L-aminokyselín,

   R² je skupina všeobecného vzorca II alebo III, (II) (III) kde

   Ra a Rb sú nezávisle vybrané zo súboru obsahujúceho vodík a alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka a A je metylénová skupina alebo kyslík, a

   R⁴ je OH, NH_a alebo NRcRd, kde Rc je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka,
2. 2-karbamoylcyklopentylovú, 2-pyridylmetylovú, 4-karbamoylcyklohexylovú, 4-karbamoylcyklohexylmetylovú, 3-karbamoylfenylovú, 4-karbamoylfenylovú, 4-(karbamoylmetyl)fenylovú,

   4—(karboxymetyl)fenylovú, 4-(metoxykarbonylmetyl)fenylovú,

   2-morfolínoetylovú skupinu a skupinu všeobecného vzorca -A^’-G¹, kde A¹ je alkylénová skupina s 3 až 7 atómami uhlíka alebo je A¹ je vybraná zo

   106 (1) skupiny všeobecného vzorca -A²-B², kde A² je p-fenylénová alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a B² je alkylénová skupina s 1 až 4 atómami uhlíka, alebo A² je metylénová skupina a B² je p-fenylénová alebo 1,4-cyklohexylénová skupina, a (2) skupiny všeobecného vzorca -A³-B³-C³, kde A³ je metylénová skupina, B³ je p-fenylénová alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a C³ je alkylénová skupina s 1 až 3 atómami uhlíka, a

   G^x je skupina so všeobecným vzorcom -N=C[N(Rp₂) ] , kde každá Rp je nezávisle vybraná zo súboru obsahujúceho vodík, metylovú, etylovú a propylovú skupinu, alebo

   A^x je skupina všeobecného vzorca -A⁴-B⁴, kde A⁴ je p-fenylénová skupina a B⁴ je -CH₂~CO- a G^x je 2-morfolínoetylová alebo 4-[ 2-(hydroxyetoxy)etyl Jpiperazín-l-ylová skupina, a Rd je vodík alebo alkylová skupina s 1 až 4 atómami uhlíka, alebo

   R⁴ je 1-piperazinylová, 4-metyl-l-piperazinylová, 4-amidino-1-piperazinylová, 4-(2-(2-hydoxyetoxy)etyl)-1-piperazinylová, 1-piperidylová skupina alebo 4-substituovaná-1-piperidylová skupina, kde substituent v polohe 4 je vybraný zo súboru obsahujúceho karboxylovú, karbamoylovú, N-(2-aminoetyl) karbamoylovú a N-(4-aminobutyl) karbamoylovú skupinu, alebo

   R⁴ je sekvencia 1 až 6 aminokyselín alebo ich amidov;

   alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

   2. Peptidový derivát podľa nároku 1, kde P je alifatická, aro- matická alebo zmiešaná alifatická/aromatická organická skupina s 5 až 20 atómami uhlíka, alebo heteroaromatická alebo zmiešaná alifatická/heteroaromatická organická skupina s 5 až 20 atómami uhlíka a 1, 2 alebo 3 heteroatómami vybranými zo súboru, ktorý obsahuje kyslík, síru a dusík, alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ. í i
3. 3. Peptidový derivát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 alebo 2, J kde R⁴ je OH, NH₂ alebo NRcRd, kde Rc je vybraná zo súboru, | ktorý obsahuje alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka,

   107

   2-karbamoylcyklopentylovú, 2-pyridylmetylovú, 4-karbamoylcyklohexylovú, 4-karbamoylcyklohexylmetylovú, 3-karbamoylfenylovú, 4-karbamoylfenylovú, 4-(karbamoylmetyl)fenylovú, 4-(karboxymetyl)fenylovú, 2-morfolínoetylovú skupinu a skupinu všeobecného vzorca -A^x-G^x, kde A^x je alkylénová skupina s 3 až 7 atómami uhlíka alebo je A^x je vybraná zo (1) skupiny všeobecného vzorca -A²-B², kde A² je p-fenylénová alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a B² je alkylénová skupina * s 1 až 4 atómami uhlíka, alebo A² je metylénová skupina a B² je p-fenylénová alebo 1,4-cyklohexylénová skupina, a * (2) skupiny všeobecného vzorca -A³-B³-C³, kde A³ je metylénová skupina, B³ je p-fenylénová alebo 1,4-cyklohexylénová skupina a C³ je alkylénová skupina s 1 až 3 atómami uhlíka, a

   G^x je skupina všeobecného vzorca -N=C[N(Rp₂) J , kde každá skupina Rp je nezávisle vybraná zo súboru obsahujúceho vodík, metylovú, etylovú a propylovú skupinu a Rd je vodík alebo alkylová skupina s 1 až 4 atómami uhlíka,

   R⁴ je 1-piperazinylová, 4-metyl-l-piperazinylová, 4-amidino-1-piperazinylová, 4-(2-( 2-hydoxyetoxy) etyl) -1-piperazinylová , 1-piperidylová skupina alebo 4-substituovaná-1-piperidylová skupina, kde substituent v polohe 4 je vybraný zo súboru obsahujúceho karboxylovú, karbamoylovú, é, N-(2-aminoetyl)karbamoylovú a N-(4-aminobutyl) karbamoylovú skupinu, alebo

   R⁴ je sekvencia 1 až 6 aminokyselín alebo ich amidov;

   alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
4. 4. Peptidový derivát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1, 2 alebo

   3, kde P je alifatická, aromatická alebo zmiešaná alifatická/aromatická organická skupina s 5 až 20 atómami uhlíka,

   L-aminokyseliny v R^x a R³ sú nezávisle vybrané zo súboru, ktorý obsahuje Ala, Glu, Gly, His, íle, Lys, Asn, Gin, Arg, Thr a Val, a

   R⁴ je OH, NH_a alebo NHRc, kde Rc je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, 2-karbamoylcyklopentylovú, 2-pyridylmetylovú, 4-karbamoylcyklohexylovú, 4-karbamoylcyklohexylmetylovú, 3-karbamoylfe108 nylovú, 4-karbamoylfenylovú, 4-(karbamoyletyl)fenylovú skupinu, alebo R^A je 1-piperazinylová, 4-metyl-l-piperazinylová, 4-amidino-l-piperazinylová alebo 1-piperidylová skupina, alebo 4-substituovaná-l-piperidylová skupina, kde je substituent v polohe 4 vybraný zo súboru, ktorý obsahuje karboxylovú, karbamoylovú, N-(2-aminoetyl)karbamoylovú a N-(4-aminobutyl)karbamoylovú skupinu, alebo R⁴ je sekvencia 1 až 6 aminokyselín alebo ich amidov, alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
5. 5. Peptidový derivát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1, 2 alebo 3, kde R^x je sekvencia 5 L-aminokyselín vzorca AA1-AA2-AA3-AA4-AA5, kde

   AA1 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Ala, íle, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe^ a 3,3,3-trifluoroalanín, AA2 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, íle, Tie, 3,3,3-trifluoroalanín a

   His, Gin, Val,

   Lys, Asn, Arg,

   Val, Ala, Gly, a kde R³ je jedna aminokyselina vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Ala, Gly, Dap, azaalanín a azaglycín, alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
6. 6. Peptidový derivát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1, 2 alebo 3, kde R^x je sekvencia 3 L-aminokyselín vzorca AA1-AA2—AA3, kde

   AA1 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Ala, íle, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe^ a 3,3,3-trifluoroalanín,

   AA2 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, íle, Tie, 3,3,3-trif luoroalanín a N^e-dietylLys,

   AA3 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Ala, His, Gin, Val,

   N⁶-dietylLys,

   AA3 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Ala, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn a N³-dietylDap,

   AA4 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Ala, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His a N⁶-dietylLys, a AA5 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Thr, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn a N³-dietylDap,

   109

   Thr, Glu, Gly, Asp, Asn a N³-dietylDap, a R³ je vybraná zo sekvencii 3 L-aminokyselín podľa vzorca AA6-AA7-AA8, kde

   AA6 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His a Dap,

   AA7 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic a Dic, a

   AA8 je vybraná zo súboru, ktorý obsahuje Ala, Gly, Dap, azaalanín a azaglycín, alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
7. 7. Peptidový derivát podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 6, kde R² je skupina všeobecného vzorca Ilb alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
8. 8. Peptidový derivát podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 7, kde hydrofóbna skupina P je 5-fenylvalerylová skupina, alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
9. 9. Peptidový derivát podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 8, kde R⁴ je 4-karbamoyl-l-piperidylová, 4-(karbamoylmetyl)anilínová alebo 4-(2-guanidínetyl)anilínová skupina, alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

   í
10. 10. Peptidový derivát podľa nároku 1, ktorý je vybraný zo zlú- l čenín znázornených vzorcami

    110

    Phv-Ara-AIs-Ala-Ala-Val-N'^,,,’‘\/N

    H R

    O c·

    N

    CO-Ala-Ala-Ala-T’nr-N

    H v

    o

    Phv-Ala-Arg-Ala-N

    H kde Phv je 5-fenylvalerylová skupina, alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

    111
11. 11. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje peptidový derivát podľa vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ, v spojení s jeho farmaceutický prijateľným riedidlom alebo pomocnou látkou (nosičom).
12. 12 .

    alebo čujú spájajú alebo viacerých ochranná prijateľnej soli, vyznáže sa v príslušnom poradí postupne aminokyseliny alebo sekvencie dvoch chránených aminokyselín, kde vhodná vyjadrená vzorcom H-II-OH alebo

    H-III-OH a com R⁴-H, N-koncovej

    P a odstránili pevný nosič.

    Spôsob prípravy peptidového derivátu podľa nároku 1 alebo jeho farmaceutický c i sa tým, vhodne chránené vhodne skupina je prípadne je vhodná ochranná skupina vyjadrená vzora potom sa prípadne modifikuje funkčná skupina aminoskupiny, aby sa zaviedla hydrofóbna skupina akékoľvek zostávajúce ochranné skupiny a celý
13. 13. Spôsob liečenia autoimunitných alebo zápalových ochorení sprostredkovaných T-bunkami závislými na MHC II. triedy, t vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie účinného množstva peptidového derivátu podľa vzorca I alebo alebo ^v jeho farmaceutický prijateľnej soli teplokrvnému cicavcovi, ktorý takéto liečenie potrebuje.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že sa použije na liečenie reumatoidnej artritídy alebo roztrúsenej mozgovo-miechovej sklerózy (sclerosis multiplex).
15. 15. Použitie peptidového derivátu podľa vzorca I alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli na výrobu nového liečiva na použitie na liečenie autoimunitného alebo zápalového ochorenia sprostredkovaného T-bunkami závislými na MHC II. triedy.