HU222198B1 - A T-sejtek aktiválódását gátló peptidszármazékok, eljárás előállításukra és a vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények - Google Patents

Abstract

A találmány (I) általános képletű új peptidszármazékokra ésgyógyászatilag alkalmazható sóikra vonatkozik, amelyek az autoimmunbetegségek és hasonló rendellenességek kezelésében hasznosíthatófarmakológiai aktivitással rendelkeznek. A képletben P egy hidrofóbmaradékot jelent, R1 egy öt L-aminosavból álló szekvenciát ésugyanakkor R3 egyetlen L-aminosavat jelent, vagy R1 egy három L-aminosavból álló szekvenciát, és ugyanakkor R3 egy három L-aminosavbólálló szekvenciát jelent, R2 egy (II) vagy (III) általános képletűcsoportot jelent, amelyekben Ra és Rb egymástól függetlenülhidrogénatomot vagy 1–4 szénatomos alkilcsoportot, A pedigmetiléncsoportot (CH2) vagy oxigénatomot képvisel, és R4hidroxilcsoportot, aminocsoportot vagy egy –NRcRd képletű csoportotjelent, amelyben Rd hidrogénatomot vagy 1–4 szénatomos alkilcsoportotképvisel, és Rc jelentése 1–4 szénatomos alkil-, 2-karbamoil-ciklopentil-, 2-piridil-- metil-, 4-karbamoil-ciklohexil-, 4-karbamoil-ciklohexil-metil-, 3-karbamoil-fenil-, 4-karbamoil-fenil-,4-(karbamoil- metil)-fenil-, 4-(karboxi-metil)-fenil-, 4-(metoxi-karbonil-metil)-fenil- vagy 2-morfolino-etil-csoport, vagy Rc egy –A1–G1 képletű csoportot jelent, vagy R4 1-piperazinil-, 4-metil-1-piperazinil-, 4-amidino-1-piperazinil-, 4-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etil]-1-piperazinil- vagy 1-- piperidilcsoportot vagy a 4-es helyzetbenkarboxil-, karbamoil-, N-(2-amino-etil)-karbamoil- vagy N-(4-amino-bu-til)-karbamoil-csoporttal szubsztituált 1-piperidilcsoportot jelent,vagy R4 egy 1–6 aminosavból álló szekvenciát vagy annak amidjátjelenti. ŕ

Description

A találmány olyan új peptidszármazékokra vonatkozik, amelyek az autoimmun betegségek és hasonló rendellenességek (például reumás arthritis és II. osztálybeli MHC-fiiggő T-sejtek által közvetített más betegségek) kezelésében hasznosítható farmakológiai aktivitással rendelkeznek. A találmány továbbá az új peptidszármazékokat tartalmazó gyógyászati készítményekre, az új peptidszármazékok előállítási eljárásaira, valamint az új vegyületek gyógyászati célú és gyógyszergyártásban való felhasználására vonatkozik.

Az emberi immunválasz fellépése attól függ, hogy a T-sejtek felismerik-e a fehérje antigéneket. A T-sejtek azonban önmagukban nem képesek antigénre válaszolni, hanem csak akkor reagálnak az antigénre, ha az egy antigénhordozó sejt, például egy B-sejt, egy makrofág vagy egy dendritsejt felületén lévő MHC (major histocompatibility complex) molekulával komplexálódik.

Az I. osztálybeli MHC-molekulák T-öló sejtválaszt keltenek, ami az antigént hordozó sejt szétroncsolását eredményezi. AII. osztálybeli MHC-molekulák T-segító sejtválaszt keltenek, ami egyes kiválasztott B-sejtek expanzióját és érését (azaz antigénspecifikus antitestek képződését) és a makrofágok aktiválódását vezérli.

Az immunrendszerrel szemben támasztott alapvető követelmény, hogy képes legyen megkülönböztetni a „saját” és a „nem saját” (azaz idegen) antigéneket. Ez a megkülönböztető mechanizmus teszi képessé az immunrendszert arra, hogy a behatoló idegen kórokozókkal szemben úgy adjon immunválaszt, hogy egyidejűleg tolerálja a saját fehérjéket. így a normál szövetek károsodása megelőzhető. Autoimmun betegség akkor lép fel, amikor ez az öntolerancia csökken, és ennek hatására az immunrendszer a saját szövetek (például reumás arthritisben az ízületi szövetek) ellen támad. A jelenlegi ismeretek szerint az öntolerancia fennmaradását - és így az autoimmun betegségek kiküszöbölhetőségét döntően befolyásolja az MHC-molekulák működése.

Az a tapasztalat, hogy számos autoimmun betegség speciális MHC-allélek öröklődésével kapcsolatos, arra utal, hogy az MHC-molekulák kulcsszerepet játszanak az autoimmun betegségek körfolyamatában. így például a sclerosis multiplex a HLA-DR2, az inzulinfüggő cukorbetegség a HLA-DR3 és/vagy HLA-DR4, míg a Hashimoto-féle pajzsmirigygyulladás a HLA-DR5 öröklődésével kapcsolatos. Különösen szoros összefüggést tapasztaltak a krónikus ízületgyulladással járó reumás arthritisre való hajlam és a HLA-DR4Dw5 és/vagy HLA-DR4wl4 és/vagy HLA-DR1 öröklődése között. A jelenlegi ismeretek szerint az autoimmun betegségben szerepet játszó MHC-molekulák egyes saját antigénekhez kötődnek, és így azokat a T-sejtek számára hozzáférhetővé teszik, ami autoimmun választ kelt. Más peptidek, amelyek az autoimmun betegségben szerepet játszó MHC-molekulákhoz tudnak kötődni és/vagy megakadályozzák a saját antigének kötődését vagy kiszorítják a már megkötött saját antigéneket és/vagy gátolják a T-sejtek (elsősorban a patogén T-sejtek, így a Th-l-sejtek) aktivitását és/vagy fokozzák a védő T-sejtek (például a Th-2-sejtek) aktivitását, vagy az MHC-molekulákkal más hatásmechanizmus szerint kölcsönhatásba lépő, és ennek révén az adott MHC-molekulák által közvetített autoimmun választ megakadályozó vagy módosító peptidek specifikusan visszaszoríthatják az autoimmun választ.

Az ilyen típusú hatóanyagok lehetőséget nyújtanának az autoimmun betegségek kezelésére anélkül, hogy egyúttal káros mellékhatásként az immunrendszer általános működése is visszaszorulna. Ez a hatásprofil az egyes autoimmun betegségek, például a reumás arthritis jelenlegi kezelésmódjával összehasonlítva komoly előnyöket jelentene. A reumás arthritis jelenlegi kezelésmódja során a betegnek kezdetben tünetcsökkentő szereket, például nemszteroid típusú gyulladásgátló anyagokat adnak, amelyek a betegség kifejlődésére semmiféle kedvező hatást nem gyakorolnak, de gyakran nem kívánt mellékhatásokat idéznek elő. A súlyosabb betegségek kezelése úgynevezett második vonalbeli szerek használatán alapul. Ezek sok esetben általános citotoxikumok, így csak korlátozottan hatékonyak, és súlyos toxicitási problémákat okozhatnak. így a betegség oki kezelésére alkalmas, nemspecifikus citotoxicitástól mentes szerek felhasználása igen jelentős előnyökkel járna a reumás arthritis kezelésében.

A WO 92/02543, WO 93/05011 és WO 95/07707 számú nemzetközi közzétételi irat MHC-molekulákat megkötő és a T-sejtek aktiválódását gátló peptideket ismertet.

Noha eddig már több olyan peptidet felismertek, amelyek HLA-DR-molekulákhoz kötődve gátolják a HLA-DR által szabályozott T-sejt-aktiválódást, változatlanul szükség van további vegyületekre, amelyek ilyen molekulákhoz kötődnek, és/vagy amelyek megakadályozzák a saját antigének megkötődését vagy kiszorítják a már megkötött saját antigéneket, és/vagy amelyek gátolják a T-sejtek aktiválódását, és/vagy amelyek fokozzák a védő T-sejtek aktivitását, vagy amelyek más hatásmechanizmus szerint lépnek kölcsönhatásba az MHCmolekulákkal úgy, hogy megelőzik vagy módosítják a fentiekben ismertetett betegségek vagy rendellenességek fellépéséhez vezető autoimmun válasz keltését.

Munkánk során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a későbbiekben ismertetendő peptidszármazékok ilyen hasznos farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek.

A találmány tárgyát képezik tehát az (I) általános képletű peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik - a képletben

P egy, a későbbiekben meghatározandó hidrofób maradékot jelent,

R¹ egy öt L-aminosavból álló szekvenciát és ugyanakkor R³ egyetlen L-aminosavat jelent, vagy

R¹ egy három L-aminosavból álló szekvenciát és ugyanakkor R³ egy három L-aminosavból álló szekvenciát jelent,

R² egy (II) vagy (III) általános képletű csoportot jelent, amelyekben Ra és Rb egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoportot, A pedig metiléncsoportot (CH₂) vagy oxigénatomot képvisel, és

R⁴ hidroxilcsoportot, aminocsoportot vagy egy -NRcRd képletű csoportot jelent, amelyben Rd hidro2

HU 222 198 Bl génatomot vagy 1-4 szénatomos alkilcsoportot képvisel, és Rc jelentése 1-4 szénatomos alkil-, 2-karbamoilciklopentil-, 2-piridil-metil-, 4-karbamoil-ciklohexil-, 4karbamoil-ciklohexil-metil-, 3-karbamoil-fenil-, 4-karbamoil-fenil-, 4-(karbamoil-metil)-fenil-, 4-(karboxi-metil)-fenil-, 4-(metoxi-karbonil-metil)-fenil- vagy 2-morfolino-etil-csoport, vagy Rc egy -A’-G¹ képletű csoportot jelent, ahol

A¹ jelentése 3-7 szénatomos alkiléncsoport, vagy (1) -A²-B²- képletű csoport, amelyben A² p-fenilénvagy 1,4-ciklohexiléncsoportot és B² 1-4 szénatomos alkiléncsoportot jelent, vagy A² metiléncsoportot és B² p-fenilén- vagy 1,4-ciklohexiléncsoportot képvisel, vagy (2) -A³-B³-C³- képletű csoport, amelyben A³ metiléncsoportot, B³ p-fenilén- vagy 1,4-ciklohexiléncsoportot, míg C³1-3 szénatomos alkiléncsoportot jelent, és ugyanakkor G¹ -N=C[N(Rp)₂]₂ csoportot jelent, amelyben az egyes Rp csoportok egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy metil-, etil- vagy propilcsoportot jelentenek, vagy

A¹ -A⁴-B⁴- képletű csoportot jelent, amelyben A⁴ p-feniléncsoportot, B⁴ pedig -CH₂CO- csoportot képvisel, és ugyanakkor G¹ 2-morfolino-etil- vagy 4-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etil]-piperazin- 1-il-csoportot jelent, vagy

R⁴ 1-piperazinil-, 4-metil-l-piperazinil-, 4-amidinoΙ-piperazinil-, 4-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etil]-l-piperazinil- vagy 1-piperidilcsoportot vagy a 4-es helyzetben karboxil-, karbamoil-, N-(2-amino-etil)-karbamoilvagy N-(4-amino-butil)-karbamoil-csoporttal szubsztituált l-piperidilcsoportot jelent, vagy

R⁴ egy 1-6 aminosavból álló szekvenciát vagy annak amidját jelenti.

Az R⁴ helyén álló aminosavak egymástól függetlenül D- vagy L-konfigurációjúak lehetnek. Ha R⁴ hidroxilcsoportot jelent, ez az R³ helyén álló aminosav Cterminális részén lévő hidroxilcsoportnak felel meg. Hasonlóan, ha R⁴ -NH₂, -NRcRd, piperazinil-, piperidilés hasonló csoportokat jelent, ezek a csoportok az R³ helyén álló aminosav C-terminális részének hidroxilcsoportját helyettesítik. A leírásban használt „aminosav” megjelölésen α-aminosavakat értünk. Az „L-aminosav” megjelölésen olyan aminosavakat (például Gly-t, 2,2-dietil-Gly-t, aza-alanint és aza-glicint) is értünk, amelyeknek nincs királis szénatomja. A szénláncot tartalmazó csoportok általános megjelölésén (ilyen például az „alkilcsoport”) mind az egyenes láncú, mind a szénatomszám által lehetővé tett elágazó láncú csoportokat értjük. Hasonlóan értelmezzük az egyéb csoportok általános megjelöléseit is.

Jól ismert, hogy a királis centrumot tartalmazó vegyületek racemátok (vagy egynél több királis centrum jelenléte esetén diasztereoizomer elegyek), optikailag aktív enantiomerek és diasztereoizomerek formájában létezhetnek. Jól ismert az is, hogy esetenként egy racém vagy diasztereoizomer elegynél észlelt biológiai aktivitás nagyrészt vagy kizárólag az egyik optikailag aktív izomer jelenlétének tulajdonítható. A találmány az (I) általános képletű peptidszármazékok mindazon formáira kiterjed, amelyek a korábban ismertetett, gyógyászatilag hasznosítható biológiai jellemzőkkel rendelkeznek. Az egyedi optikailag aktív izomerek szakember számára jól ismert módszerekkel - például optikailag aktív kiindulási anyagokat vagy közbenső termékeket alkalmazó királis szintézissel - alakíthatók ki, és szintén jól ismert módszerekkel (például kromatografálással) különíthetők el a racém vagy diasztereoizomer elegyekből. A racém és diasztereoizomer elegyek, valamint az egyedi optikailag aktív izomerek farmakológiai jellemzői szintén jól ismert módszerekkel (például a későbbiekben közlendő vizsgálatokkal) határozhatók meg. Ennek megfelelően az (I) általános képletű peptidek fent meghatározott hasznos farmakológiai tulajdonságokkal rendelkező formáit szakember egyszerűen előállíthatja és azonosíthatja.

A találmány a fent ismertetett hasznos farmakológiai tulajdonságokkal rendelkező (I) általános képletű peptidszármazékok összes lehetséges polimorf és/vagy tautomer módosulatát és/vagy szolvátját, valamint azok keverékeit is magában foglalja.

Az R¹ és R³ helyén álló vagy részét képező a-aminosavak közül példaként a genetikus kód által kódolt húsz természetes aminosavat, így az alanint (Ala), a glutaminsavat (Glu), a glicint (Gly), a hisztidint (His), az izoleucint (Ile), a lizint (Lys), az aszparagint (Asn), a glutamint (Gin), az arginint (Arg), a treonint (Thr), a valint (Val) és a prolint (Pro) említjük meg. Más aminosavak is alkalmasak, amelyek például a következők lehetnek: szarkozin (Sár), 3,3,3-trifluor-alanin, 2,2-dietil-glicin, 2,3-diamino-propánkarbonsav (Dap), 2,4-diaminobutánkarbonsav (Dab), 2-amino-butánkarbonsav (Abu), homoarginin, homo(fenil-alanin), transz-4-hidroxi-prolin (Hyp), aza-alanin [H2N-N(CH3)-COOH, Azala], aza-glicin [H2N-NH-COOH, Azgly], 1,2,3,4-tetrahidroizokinolin-3-karbonsav (Tic), oktahidroindol-2-karbonsav (Oic) és dekahidroizokinolin-3-karbonsav (Dic). (A „Dic” megjelölésen azokat a formákat értjük, ahol mindkét gyűrűkapcsolódás R-konfigurációjú vagy mindkét gyűrűkapcsolódás S-konfigurációjú.) Alkalmasak továbbá a megfelelő N²-metilezett aminosavak, valamint azok az aminosavszármazékok is, amelyek az oldalláncban lévő szabad karboxilcsoportot észterezett formában (például 1-6 szénatomos alkil- vagy benzilészterként) vagy az oldalláncban lévő szabad aminocsoportot alkilezett (például metilezett), acetilezett vagy karbamáttá (így alkil- /például metil- vagy etil-/, fenilvagy benzil-karbamáttá) alakított formában tartalmazzák. Az R¹ és R³ helyén álló vagy részét képező aminosavak további alkalmas képviselői a 2-es helyzetben szubsztituált glicinszármazékok, ahol a 2-es helyzetű szubsztituens -(CH2)_SNH₂, -(CH₂)_pN(Re)₃ ⁺.X-(CH₂)_qN(Re₂) vagy -(CH₂)_rN=C[N(Re)₂]₂ képletű csoport lehet, és az utóbbi képletekben s értéke 1-3, p értéke 2-4, q értéke 0-4, X- elleniont (például acetát-, trifluor-acetát-, hidroxil- vagy kloridiont) jelent, és az egyes Re csoportok egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy 1-4 szénatomos alkilcsoportot (például metil- vagy etilcsoportot) jelentenek.

R¹ öt aminosavból álló szekvenciaként különösen előnyösen jelenthet például olyan szekvenciát, amely3

HU 222 198 Β1 ben - balról jobbra leolvasva - az ötödik aminosav Val vagy Thr, vagy a negyedik és ötödik aminosav Lys-Val, Arg-Val, Lys-Thr, Arg-Thr, Ala-Val vagy Ala-Thr.

R¹ öt aminosavból álló szekvenciaként például a következőket jelentheti: Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Ala-LysAla-Ala-Val, Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-AlaVal, Ala-Lys-Ala-Lys-Val, Ala-Arg-Ala-Lys-Val, AlaLys-Ala-Arg-Val, Ile-Ala-Ala-Arg-Thr, Arg-Ala-AlaAla-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Ala-Ile-Ala-Arg-Val, Ala-ArgAla-His-Val, Ala-Arg-Ala-AIa-Thr, Ala-Ala-Asn-ArgVal vagy X-Ala-Ala-Ala-Thr, ahol X jelentése -NH-CH[CH₂NH-C(=NH)-NH₂]-CO- (a továbbiakban „Gap”) vagy -NH-CH[CH₂N=C(N/CH₃/₂)₂]-CO(a továbbiakban: „GapMe₄”). A felsoroltak közül előnyös az Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Gap-AlaAla-Ala-Thr és GapMe₄-Ala-Ala-Ala-Thr szekvencia, különösen előnyös az Arg-Ala-Ala-Ala-Val és Arg-AlaAla-Ala-Thr szekvencia.

R¹ három aminosavból álló szekvenciaként különösen előnyösen jelenthet például olyan szekvenciákat, amelyek R²-vel szomszédos aminosavként Ala-t tartalmaznak, valamint olyan szekvenciákat, amelyekben balról jobbra olvasva - a második és harmadik aminosav Lys-Ala, Arg-Ala, Ile-Ala vagy Ala-Ala.

R¹ három aminosavból álló szekvenciaként különösen előnyösen jelenthet például Ala-Lys-Ala, Ala-ArgAla, Arg-Ala-Ala, Arg-Ile-Ala és Ile-Arg-Ala szekvenciát, amelyek közül kiemelkedően előnyös az Alá-ArgAla szekvencia.

R³ három aminosavból álló szekvenciaként különösen előnyösen jelenthet például olyan szekvenciákat, amelyekben a balról jobbra haladva az első (azaz az R²-vel szomszédos) aminosav Alá vagy Leu.

R³ három aminosavból álló szekvenciaként különösen előnyösen jelenthet Ala-Ala-Ala, Leu-Arg-Ala vagy - kiemelkedően előnyösen - Ala-Arg-Ala szekvenciát.

Az R³ helyén álló egyedi aminosav előnyösen például Alá, Gly vagy Azgly, különösen előnyösen Alá lehet.

Ra és Rb alkilcsoportként például metil-, etil- vagy propilcsoportot jelenthet.

Ra és Rb előnyösen például hidrogénatomot vagy metilcsoportot jelenthet.

A P helyén álló hidrofób csoport (amely az R'-ben lévő N-terminális aminosav aminocsoportjához kapcsolódik) például szerves hidrofób csoport, így 5-20 szénatomot (és adott esetben 1, 2 vagy 3 oxigén-, kénés/vagy nitrogén-heteroatomot) tartalmazó hidrofób alifás, aromás, heteroaromás vagy vegyes alifás/aromás vagy alifás/heteroaromás szerves csoport lehet. Ezek közül példaként az R-, R-CO-, R-SO₂-, R-O-CO-, R-NH-CO-, R-O-CS-, R-S-CO-, R-NH-CS-, R-S-CS- és R-CS- képletű csoportot említjük meg. A képletekben R például 5-10 szénatomos alkil-, aril-, heteroaril-, aril-(2-10 szénatomos alkil)-, heteroaril(2-10 szénatomos alkil)-, diaril-(2—8 szénatomos alkil)-, aril-(2-10 szénatomos alkenil)-, aril-ciklopropil-, 5-10 szénatomos cikloalkil-, 5-10 szénatomos cikloalkil-(2—6 szénatomos alkil)-, 3-bifenil-, 4-ciklohexil-fenil-, 2-naftil-oxi-metil-, 3-naftil-oxi-metil-, fenoxi-fenilés tetrahidronaftilcsoportot jelenthet, amelyek közül bármelyik aril- vagy heteroarilcsoporthoz adott esetben egy vagy több 1-4 szénatomos alkil-, halogén-, cianoés/vagy 1-4 szénatomos alkoxiszubsztituens kapcsolódhat. A találmány szerinti vegyületek egyik alcsoportját azok az (I) általános képletű vegyületek alkotják, amelyekben P a fenti meghatározásnak megfelelő R-COcsoportot jelent. A találmány szerinti vegyületek további alcsoportját alkotják azok az (I) általános képletű peptidszármazékok, amelyekben P 5-20 szénatomos hidrofób alifás, aromás vagy alifás/aromás szerves csoportot jelent.

R például a következő csoportokat jelentheti: 5-10 szénatomos alkilcsoportok, így pentil-, izopentil-, terc-pentil-, 2-metil-pentil-, hexil-, izohexil-, 5-metil-hexil- és oktilcsoport, arilcsoportok, így fenil-, naftil- és indenilcsoport, heteroarilcsoportok, így 2-, 3-, 5és 6-indolil-, 2-, 3-, 5- és 6-indolinil-, 2-, 3-, 5- és 6-benzo[b]tiofenil-, tienil-, 2-, 4- és 6-benzotiazolil-, 2-, 4- és 5-benzoxazolil-, 2-, 4- és 5-benzimidazolil-, a 2-es, 3as, 6-os vagy 7-es helyzetben kapcsolódó 1,4-benzodioxanil- és 2-, 3-, 5- és 6-benzo-füranil-csoport, aril(2-10 szénatomos alkil)-csoportok, így arilrészként a fent felsorolt arilcsoportok bármelyikét, alkilrészként pedig például metilén-, etilén-, trimetilén-, tetrametilén- és pentametiléncsoportot tartalmazó aril-(2-6 szénatomos alkil)-csoportok, köztük 2-fenil-etil-, 3-fenilpropil-, 4-fenil-butil- és 5-fenil-pentil-csoport, heteroaril-(2—10 szénatomos alkil)-csoportok, így heteroarilrészként a fent felsorolt heteroarilcsoportok bármelyikét, alkilrészként pedig például metilén-, etilén-, trimetilén-, tetrametilén- és pentametiléncsoportot tartalmazó heteroaril-(2-6 szénatomos alkil)-csoportok, köztük 2-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-etil-csoport, diaril(2-8 szénatomos alkil)-csoportok, köztük diaril(2-6 szénatomos alkil)-csoportok, így 2,2-difenil-etil-, 3,3-difenil-propil- és 4,4-difenil-butiI-csoport, aril(2-10 szénatomos alkenil)-csoportok, köztük aril(2-6 szénatomos alkenil)-csoportok, így sztiril-, 3-fenil-propen-2-il- és 4-fenil-buten-l-il-csoport, aril-ciklopropil-csoportok, így fenil-ciklopropil-, 1-naftil-ciklopropil- és 2-naftil-ciklopropil-csoport, 5-10 szénatomos cikloalkilcsoportok, így ciklopentil-, ciklohexil- és 1-adamantilcsoport, továbbá 5-10 szénatomos cikloalkil-(2—6 szénatomos alkil)-csoportok, így 2-ciklohexiletil-, 3-ciklohexil-propil- és 4-ciklohexil-butil-csoport. Az R helyén álló árucsoportokhoz kapcsolódó szubsztituens például metil-, etil-, metoxi-, etoxi- és cianocsoport, továbbá klór-, bróm- és jódatom lehet.

A P helyén álló hidrofób maradék hidrofób L-aminosav is lehet, amelyek közül példaként a következőket soroljuk fel: fenil-alanin (Phe) és hidrogénezett analógjai (így ciklohexil-alanin /Cha/), p-klór-Phe, 3-(2-tienil)-alanin, tirozin (Tyr) Tyr(O-metil), triptofán (Tip), bifenil-alanin, 3-(l-naftil)-alanin, 3-(2-naftil)-alanin és hidrogénezett analógjaik, 3-(l-adamantil)-alanin (Ada),

HU 222 198 Β1

Glu(O-Benzil), 3-(benzil-oxi)-Ala, 3-(benzil-szulfanil)Ala és 9-fluorenil-Gly, amelyek N-terminusához adott esetben a fentiekben meghatározott hidrofób alifás, aromás, heteroaromás vagy vegyes alifás/aromás vagy alifás/heteroaromás szerves csoport kapcsolódhat. A hidrofób aminosavhoz továbbá adott esetben egy további 1-3 aminosavból álló szekvencia is kapcsolódhat, ezek például az R¹ és R³ jelentésénél felsoroltak lehetnek. A P csoport például Ala-Cha, Ala-Ala-Cha, Tyr-AlaAla-Cha, Tyr-Ala-Ala-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe és AlaAla-Ala-Phe szekvenciát tartalmazhat. Az 1-3 aminosavból álló további szekvencia balról jobbra olvasva első aminosavja L- vagy D-aminosav lehet, és ehhez adott esetben egy a fentiekben meghatározott hidrofób alifás, aromás, heteroaromás vagy vegyes alifás/aromás vagy alifás/heteroaromás szerves csoport is kapcsolódhat.

P a következő csoportokat is jelentheti: 3-(benziloxi-karbonil)-propionil-Phe, 3 -(benzil-oxi-karbonil)propionil-Cha, 4-(benzil-oxi-karbonil)-butiril-Phe, 4(benzil-oxi-karbonil)-butiril-Cha, (5-oxo-pirrolidin-2il)-karbonil-Phe-Tyr, (5-oxo-pirrolidin-2-il)-karbonilGlu(O-Benzil)-Tyr, acetil-Glu(O-Benzil)-Tyr, difenilmetil-CONH-CH₂CH₂-CO-Cha, difenil-metilCONH-CH₂CH₂-CO-Tyr, difenil-metilCONH-CH₂CH₂CH₂CO-Cha, difenil-metilCONH-CH₂CH₂CH₂-CO-Tyr, difenil-metilNHCO-CH₂CH₂CH₂-CO-Cha, difenil-metilNHCO-CH₂CH₂CH₂-CO-Tyr, benzilNHCO-CH₂CH₂-CO-Cha, benzilNHCO-CH₂CH₂-CO-Tyr, N-acetil-4-klór-p-hidroxiPhe, 4-fenoxi-fenil-NHCO-, benzilNHCO-CH₂CH₂-CO-(N-metil-Phe), benzilNHCO-CH₂CH₂-CONH-CH(CHPh₂)-CO-, benzilNHCO-CH₂CH₂-CO-Tyr, 3,3-difenil-propionil-, transz-cinnamoil-, 5-fenil-valeril- és 3-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-propionil-csoport.

P előnyösen például Ph-(CH₂)₄-CO- [5-fenil-valeril- (Phv)J, Ph-(CH₂)₄-CS- és 3-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-propionil-csoportot jelenthet.

A P helyén álló hidrofób maradék előnyösen például 3-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-propionil- vagy 5fenil-valeril-(Phv) csoport, különösen előnyösen Phvcsoport lehet.

Ha Re -A'-G¹- képletű csoportot jelent, az A¹ helyén álló alkiléncsoport például metilén-, etilén-, propilén- vagy butiléncsoport lehet. Az A¹ csoport részét képező E¹ csoport 1-4 szénatomos alkiléncsoportként például metilén-, etilén- és propiléncsoportot, az A¹ csoport részét képező C³ csoport pedig 1-3 szénatomos alkiléncsoportként például metilén-, etilén- és propiléncsoportot jelenthet.

Az -A'-G¹- csoport például 3-guanidino-propil-, 4-(2-guanidino-etil)-fenil-, 4-(2-morfolino-etilNH-CO-CH₂)-fenil- vagy 4-[4-(2-/2-hidroxi-etoxi/etil)-piperazin-l-il-CO-CH₂]-fenil-csoport lehet.

R⁴ 1-6 aminosavból álló szekvenciaként vagy amidjaként például a következőket jelentheti: az R¹ és R³ csoport jelentésénél fent felsorolt L-aminosavak bármelyikéből álló szekvencia (például Ala-Thr-Gly-OH), ezek D-analógjai, D- és L-aminosavakat egyaránt tartalmazó szekvenciák, továbbá ezek amidjai, így az ammóniával, 1-4 szénatomos alkil-aminokkal (például metil-aminnal) és di(l—4 szénatomos alkil)-aminokkal (például dimetil-aminnal) képezett amidok.

R⁴ előnyösen például a következő csoportokat jelentheti·. 4-karbamoil-l-piperidil-csoport [a piperidin-4-karboxamid (Pip-NH₂) maradéka], 4-karboxi-l-piperidilcsoport [a piperidin-4-karbonsav (Pip-OH) maradéka], 4(karbamoil-metil)-anilino-csoport [a 4-amino-fenil-acetamid (Papa-NH₂) maradéka], 4-(karboxi-metil)-anilinocsoport [a 4-amino-fenil-ecetsav (Papa-OH) maradéka], és 4-(2-guanidino-etil)-anilino-csoport [a 2-(4-amino-fenil)-etil-guanidin (Pape-NHC/=NH/NH₂) maradéka],

R⁴ például Pip-NH₂, Papa-NH₂, PapeNHC(=NH)NH₂ vagy NHRc csoportot jelenthet, ahol az utóbbiban Re 3-guanidino-propil-, 2-morfolino-etilvagy 4-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etil]-l-piperazinil-csoportot képvisel.

R² előnyösen (II) általános képletű csoportot, különösen előnyösen (Ila) általános képletű csoportot, kiemelkedően előnyösen (Ilb) képletű csoportot jelenthet.

Az (I) általános képletű peptidszármazékok egyik előnyös csoportját például azok a vegyületek alkotják, amelyekben R¹ öt L-aminosavból álló szekvenciát és R³ egyetlen L-aminosavat jelent (az aminosavak és szekvenciák előnyös és különösen előnyös képviselői azonosak a korábban felsoroltakkal). Az ebbe a csoportba tartozó vegyületek különösen előnyös képviselői azok a származékok, amelyekben R² (II) általános képletű csoportot, különösen előnyösen (Ila) általános képletű csoportot, kiemelkedően előnyösen (Ilb) képletű csoportot jelent. A különösen előnyös peptidszármazékok további csoportját alkotják azok a vegyületek, amelyekben R⁴ -Pip-OH, -Pip-NH2, -Papa-OH vagy -Papa-NH2 csoportot jelent. A fenti vegyületek egyik kiemelkedően előnyös alcsoportjában R³ és R⁴ együttesen Ala-Pip-NH2 vagy Ala-Papa-NH₂ csoportot jelent.

A találmány szerinti peptidszármazékok egy újabb előnyös csoportját alkotják azok a vegyületek, amelyekben R¹ egy AA1-AA2-AA3-AA4-AA5 általános képletű, öt L-aminosavból álló szekvenciát jelent, ahol AA1 jelentése Alá, He, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe₄ vagy 3,3,3-trifluor-alanin, előnyösen Alá, He, Arg, Gap vagy GapMe₄, különösen előnyösen Alá, Arg vagy GapMe₄, kiemelkedően előnyösen Alá vagy Arg,

AA2 jelentése Alá, Lys, Glu, Sár, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-trifluor-alanin vagy N⁶-dietil-Lys, előnyösen Alá, Arg, Ile, Lys vagy Tic, különösen előnyösen Alá, Arg, Lys vagy Ile, kiemelkedően előnyösen Alá vagy Arg,

AA3 jelentése Alá, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn vagy N³-dietil-Dap, előnyösen Alá, His, Asp vagy Asn, különösen előnyösen Alá vagy Asn, kiemelkedően előnyösen Alá,

AA4 jelentése Alá, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sár, Gly, Pro, His vagy N⁶-dietil-Lys, előnyösen Alá, Arg, Lys vagy His, különösen előnyösen Alá, Arg vagy His, kiemelkedően előnyösen Alá, és

HU 222 198 Bl

AA5 jelentése Thr, Val, Alá, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn vagy N³-dietil-Dap, előnyösen Thr, Val vagy Dap, különösen előnyösen Thr vagy Val, és ugyanakkor R³ egyetlen L-aminosavat, éspedig Ala-t, Gly-t, Dap-t, aza-alanint vagy aza-glicint, előnyösen Ala-t, Gly-t vagy aza-glicint, különösen előnyösen Ala-t vagy Gly-t, kiemelkedően Ala-t jelent, míg

P, R² és R⁴ jelentése a fenti (az előnyös, különösen előnyös és kiemelkedően előnyös jelentéseket is beleértve). Az ebbe a csoportba tartozó vegyületek egyik alcsoportját azok a származékok képezik, amelyekben az AA1-AA2-AA3-AA4-AA5 szekvencia Ala-Ala-AlaLys-Val, Ile-Ala-Ala-Arg-Thr, Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-ArgAla-Arg-Val, Ala-Ile-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-HisVal, Ala-Ala-Asn-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Thr, AlaArg-Ala-Arg-Thr, Gap-Ala-Ala-Ala-Thr, GapMe4-AlaAla-Ala-Thr vagy Ala-Ala-Ala-Arg-Thr szekvenciát jelent. Előnyösek azok a származékok, amelyekben R⁴ -Pip-NH2, -Papa-NH₂ vagy -Pape-NHC(=NH)NH₂ csoportot jelent.

A találmány szerinti peptidszármazékok egy újabb előnyös csoportját alkotják azok a vegyületek, amelyekben

R¹ három L-aminosavból álló, AA1-AA2-AA3 általános képletű szekvenciát jelent, amelyben AA1 jelentése Alá, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe₄ vagy 3,3,3-trifluor-alanin, előnyösen Alá, Ile, Arg, Gap vagy GapMe₄, különösen előnyösen Alá, Arg vagy GapMe₄, kiemelkedően előnyösen Alá vagy Arg,

AA2 jelentése Alá, Lys, Glu, Sár, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-trifluor-alanin vagy N⁶-dietil-Lys, előnyösen Alá, Arg, Ile, Lys vagy Tic, különösen előnyösen Alá, Arg, Lys vagy Ile, kiemelkedően előnyösen Alá vagy Arg,

AA3 jelentése Alá, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn vagy N³-dietil-Dap, előnyösen Alá, His, Asp vagy Asn, különösen előnyösen Alá vagy Asn, kiemelkedően előnyösen Alá,

R³ három L-aminosavból álló, AA6-AA7-AA8 általános képletű szekvenciát jelent, amelyben AA6 jelentése Gly, Leu, Lys, Alá, Pro, Glu, Sár, His vagy Dap, előnyösen Alá, Leu vagy Pro, különösen előnyösen Alá,

AA7 jelentése Pro, Alá, Lys, Arg, Glu, Sár, Gly, Oic vagy Dic, előnyösen Alá vagy Arg, és AA8 jelentése Alá, Gly, Dap, aza-alanin vagy aza-glicin, előnyösen Alá, Gly vagy aza-glicin, különösen előnyösen Alá, míg

P, R² és R⁴ jelentése a fenti, az előnyös és különösen előnyös jelentéseket is beleértve. Az ebbe a csoportba tartozó vegyületek előnyös képviselői azok, amelyekben az AA1-AA2-AA3 képletű szekvencia jelentése Ala-LysAla vagy Ala-Arg-Ala, az AA6-AA7-AA8 képletű szekvencia jelentése pedig Ala-Ala-Ala vagy Ala-Arg-Ala. Előnyösek azok a vegyületek, amelyekben R⁴ -Pip-NH₂, -Papa-NH₂ vagy -Pape-NHC(=NH)NH₂ csoportot jelent.

Az (I) általános képletű peptidszármazékok előnyös képviselői azok a vegyületek, amelyekben R² (II) általános képletű csoportot, és ebben A előnyösen metiléncsoportot jelent [R² különösen előnyösen (Ilb) képletű csoport lehet], míg P, R¹, R³ és R⁴ jelentése a fenti, az előnyös és különösen előnyös jelentéseket is beleértve.

Az (I) általános képletű peptidszármazékok további előnyös képviselői az argininmaradékot tartalmazó vegyületek, elsősorban azok, amelyekben az R¹ helyén álló, öt L-aminosavat tartalmazó szekvenciában balról jobbra olvasva az első aminosavmaradék arginin (ilyen például az Arg-Ala-Ala-Ala-Val és Arg-Ala-Ala-AlaThr szekvencia), vagy amelyekben az R¹ helyén álló, három L-aminosavat tartalmazó szekvencia második aminosavmaradéka arginin, és/vagy az R³ helyén álló, három L-aminosavat tartalmazó szekvencia második aminosavmaradéka arginin (így például R¹ jelentése ArgAla-Ala és R³ jelentése Ala-Ala-Ala, vagy R¹ és R³ egyaránt Ala-Arg-Ala szekvenciát jelent).

Szintén előnyösek azok az (I) általános képletű peptidszármazékok, amelyekben R² (Illa) vagy (lllb) képletű csoportot jelent, míg P, R¹, R³ és R⁴ jelentése a fenti, az előnyös és különösen előnyös jelentéseket is beleértve.

A találmány szerinti vegyületek egyes képviselőit a példákban soroljuk fel. Ezek közül kiemelkedően előnyösek az 5., 16., 19., 23. és 24. példában leírt peptidszármazékok - azaz az (1), (2), (3), (4) és (5) képletű vegyületek -, és azok gyógyászatilag alkalmazható sói.

A kellően bázikus (például szabad aminocsoportot tartalmazó) peptidszármazékok gyógyászatilag alkalmazható sói élettanilag elfogadható aniont szolgáltató savakkal, így ásványi savakkal (például hidrogén-halogenidekkel, köztük sósavval és hidrogén-bromiddal, kénsavval és foszforsavval) és szerves savakkal (például ecetsavval, oxálsawal, borkősavval, mandulasavval, p-toluolszulfonsawal, metánszulfonsavval és trifluor-ecetsawal) képezett sók, míg a kellően savas (például szabad karboxilcsoportot tartalmazó) peptidszármazékok gyógyászatilag alkalmazható sói élettanilag elfogadható kationt szolgáltató bázisokkal képezett sók, így alkálifémsók (például nátrium- és káliumsók), alkáliföldfémsók (például magnézium- és kalciumsók), alumíniumsók, ammóniumsók, továbbá alkalmas szerves bázisokkal (például etanol-aminnal, metil-aminnal, dietil-aminnal, izopropil-aminnal és trimetil-aminnal) képezett sók lehetnek.

Miként már közöltük, az (I) általános képletű peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik meleg vérűeken (köztük embereken) egy sor autoimmun betegségre vagy hasonló állapotra kedvező farmakológiai hatást gyakorolnak, így ezek a vegyületek a tünetek kezelésére, a betegség módosítására vagy a betegség megelőzésére alkalmasak. A találmány szerinti vegyületekkel kedvezően befolyásolható betegségek például a következők: reumás arthritis, sclerosis multiplex, Goodpasture-szindróma, spontán trombopéniás purpura, fiatalkori reumás arthritis, genuin coeliakia, szisztémás lupus erythematosus, ízületmerevedéses csigolyagyulladás, Sjogren-szindróma, miaszténia gravis, 1-es típusú (inzulinfüggő) cukorbetegség, Hashimotokór, Grave-kór, Addison-kór, progresszív bőrkeménye6

HU 222 198 Bl dés, sokizomgyulladás, dermatomyositis, pemphigus vulgáris, hólyagos impetigo, autoimmun hemolitikus vérszegénység, vészes vérszegénység, glomerulonephritis és átültetések kilökődése. A találmány szerinti vegyületek különösen előnyösen alkalmazhatók reumás arthritisben és sclerosis multiplexben.

Az (I) általános képletű peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik biológiai hatásait standard tesztekkel és klinikai vizsgálatokkal - köztük a WO 92/02543, WO 93/05011 és WO 95/07707 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett módszerekkel és azok módosított változataival -, valamint a következőkben ismertetendő vizsgálatokkal értékelhetjük. Az (I) általános képletű peptidszármazékok egy vagy több ilyen vizsgálatban jelentős aktivitást mutattak.

„A ” vizsgálat: Tisztított HLA-DRpepiidhez való kötődésének vizsgálata in vitro körülmények között

Ez a vizsgálat annak bemutatására alkalmas, hogy az (I) általános képletű peptidszármazékok kötődnek-e a betegségekben szerepet játszó II. osztálybeli MHC-molekulákhoz. A vizsgálatot a következőképpen végeztük:

Biotin FHA_3o7_j2o-ból [az N-terminusnál hosszú láncú biotinnal derivatizált FHA(307-320)peptid, BiotinAhx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-LysLeu-Ala-Thr-Gly-OH] foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) 800 nanomólos oldatot készítettünk, és 30 μΐ így kapott oldatot inhibitorpeptid jelenlétében vagy távollétében V-mélyedéses mikrotitráló lemezeken (Nuncgyártmány) 48 órán át 30 μΐ 0,5-5 μg/ml koncentrációjú tisztított HLA-DR4Dw4-oldattal inkubáltunk. Az inkubációs időtartam elteltével 100 μΐ inkubátumot Nunc gyártmányú ELISA lemezekre (Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay) vittünk fel [a lemezeket előzetesen szobahőmérsékleten 1 órán át 10 μg/ml anti-MHC antitesttel (L243, ATCC HB55, lásd: Lampson és Levy: J. Immunoi. 125, 293-299 /1980/) vontuk be], majd 1 órán át 1% szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) és 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-tal blokkoltuk. További 1 óra elteltével a meg nem kötött peptidet lemostuk, és a lemezeket szobahőmérsékleten 2 órán át 0,01% detergenst, például ΝΡ-40-et (Sigma-gyártmány) tartalmazó PBS-tal 1:4000 arányban hígított streptavidin-peroxidázzal (Sigma-gyártmány) kezeltük. Újabb mosás után mindegyik lemezhez tetrametil-benzidén (TMB) -szubsztrátum-oldatot [1 TMB tabletta (Sigma-gyártmány) 10 ml 0,1 mólos citrát/acetát pufferben (pH 6,0) oldva +36 μΐ karbamid-hidrogén-peroxid (UHPO, Flukagyártmány)] adtunk. A reakció leállítására minden mélyedésbe 10 μΐ 2 M kénsavoldatot juttattunk, majd a megkötött peptid mennyiségének meghatározására 450 nmen leolvastuk az abszorbanciát. A peptid gátló aktivitását a koncentráció függvényében felvett abszorbanciagörbéből határoztuk meg.

A tisztított HLA-DR4Dw4-et a következőképpen állítottuk elő:

(i) HLA-DR kifejezése Baculovírus-rendszerben :

Rekombináns fehérjék nagy hozammal való előállítására jól bevált módszer a rekombináns fehérjék baculovírus-vektorokból való kifejezése rovarsejtekben [Luckow V. A. és Summers M. D.: Biotechnology 6,

47-551 (1988)]. Annak érdekében, hogy a heterodimer HLA-DR (például a HLA-DR4Dw4) egyetlen rekombináns baculovírus-vektorból kifejezhető legyen (ahelyett, hogy külön rekombináns vírusokat használnánk az a- és a β-lánchoz, majd koinfektálást végeznénk), az a- és β-láncot egyaránt hordozó kettős rekombináns baculovírust alakítottunk ki.

A pacYMl transzfer vektorba [Matsuura Y., Possee, R. D., Overton, H. A. és Bishop, D. H. L.: J. Gén. Vlrol. 68, 1233-1250 (1987)] az α-polipeptid szekvenciáját kódoló cDNS-t klónoztunk, és így a fehéije kifejezését a polihedrin promoter vezérlése alá helyeztük. Az egységet Sf21 rovarsejtekben való homológ rekombinációval beillesztettük a baculovírus-genomba, és igy az a-lánc számára egyetlen rekombináns baculovírust hoztunk létre. A rovarsejtek tenyésztésére és megfertőzésére, a homológ rekombinációra és a rekombináns vírusok azonosítására és elkülönítésére alkalmas technikát Summers M. D. D. és Smith G. E. részletesen ismerteti [A Manual of Methods fór Baculovírus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station, 1555. füzet (1987)]. A rekombináns vektorok kialakítására alkalmas molekuláris genetikai módszereket szintén részletesen ismerteti a szakirodalom, a legrészletesebb ismertetés Sambrook J., Fritsch, E. F. és Maniatis T. kézikönyvében [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)] található.

A kettős rekombináns baculovírus kialakítására a pAcUWl transzfer vektorba [Weyer, U., Knight, S. és Possee, R. D.: J. Gén. Virol. 71, 1525-1534 (1990)] a β-láncot kódoló cDNS-t klónoztunk, és így a fehéije kifejezését a P10 promoter vezérlése alá helyeztük. Ezután az egységet az α-láncot hordozó egyszeres rekombináns baculovírus genomjába illesztettük. A kettős rekombináns vírusokat úgy mutattuk ki, hogy a transzfektálásból származó, véletlenszerűen kiemelt vírusokkal megfertőzött rovarsejteket membránokra helyezve olyan monoklónos antitesttel (például L243-mal) reagáltattuk, amely specifikusan felismeri a HLA-DR heterodimert. Az antitest Sf21 rovarsejtekhez való kötődését a szakirodalomból jól ismert standard áramlásos citometriával mutattuk ki. A HLA-DR-t kifejező stabil kettős rekombináns baculovírust plakkból tisztítottuk.

(ii) A HLA-DR megtisztítása rovarsejtektól:

A tisztításra Gorga és munkatársai (J. Bioi. Chem. 262, 16 087-16 094 (1987)] módszerének módosított változatát használtuk. 10 liter HLA-DR-t kifejező bacuIovírus/Sf21 sejtet (mintegy 2 χ 10¹⁰ sejt) teflonüveg homogenizátor felhasználásával, 10 löketben 100 ml szolubilizáló oldattal (összetétele: 5 mmol EDTA-nátriumsó, 50 mmol Trisz-HCl /pH 8,5/, 2% NP40, 150 nanomól NaCl, 1 mmol jód-acetamid, 1 mmol PMSF) homogenizáltunk. A homogenizátumot 1 órán át 100 000 g gyorsuláson centrifugáltuk, és a felülúszót elkülönítettük. LB3.1 anti-HLA-DR monoklónos antitestet [Gorga és munkatársai: Cell. Immunoi. 103, 160-172 (1986)] 50 mg L243/10 ml gyanta arányban kovalensen kötöttük gyors átfolyású Protein A-Sepharose gyantához (Pharmacia-gyártmány), 0,1% ΝΡ-40-et tartalmazó

HU 222 198 BI mmólos Trisz-HCl-oldattal (pH 8,0) előinkubáltuk, majd éjszakán át a felülúszóval inkubáltuk. Ezután a gyantát oszlopba töltöttük, és az oszloptérfogat hússzorosának megfelelő mennyiségű Trisz-pufferoldattal (10 mmol Trisz-HCl /pH 8,0/ +0,1% NP-40), majd az oszloptérfogat hússzorosának megfelelő mennyiségű foszfátpufferrel (0,15 mól NaCl, 50 nanomól Na₂HPO₄ /pH 7,0/ +1% oktil-glükozid) mostuk. A HLA-DR-t dietil-amin-pufferoldattal (50 mmol dietil-amin /pH 11,0/, 0,15 mól NaCl, 1% oktil-glükozid) eluáltuk. Az oszlopról leoldott eluátumfrakciókat 1 mólos TriszHCl-pufferoldattal (pH 8,0) azonnal semlegesítettük, és centricon-10 membránon való ultracentrifúgálással töményítettük. A fehérjetartalmat BCA fehéijeméréssel (Pierce), a tisztaságot SDA-PAGE elektroforézissel határoztuk meg.

Az „A” vizsgálatnak alávetett (I) általános képletű peptidszármazékok rendszerint körülbelül 1 pmol vagy annál lényegesen kisebb koncentrációban jelentős gátló hatást mutattak.

Előnyösek továbbá azok az (I) általános képletű peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyek HLA-DR3-hoz nem kötődnek, de HLA-DR1hez és/vagy HLA-DR4Dw4-hez és/vagy HLADR4Dwl4-hez igen. A HLA-DR3 olyan közönséges HLA-DR-allél, ami a reumás arthritisben nem játszik szerepet. Azokon a reumás arthritises betegeken tehát, amelyek szervezetében egyik alléiként HLA-DR3 található (ezek a teljes betegállomány mintegy egyharmadát teszik ki), ezek az (I) általános képletű peptidszármazékok nem befolyásolják a HLA-DR3-nak a védekező mechanizmusban kifejtett normális szerepét. Az ilyen peptidszármazékok tehát különösen előnyösen használhatók fel reumás arthritisben szenvedő betegek kezelésére, mert az immunrendszer normális működését kevésbé szorítják vissza, mint a nemszelektív DR-megkötő anyagok.

Az „A” vizsgálat egy változataként a következőképpen is vizsgáltuk a találmány szerinti peptidek egy vagy több HLA-DR-molekulához való kötődését:

(i) HLA-DR típusok tisztítása sejtvonalakból:

A tisztításra Gorga és munkatársai [J. Bioi. Chem. 262, 16 087-16 094 (1987)] módszerének módosított változatát használtuk. A humán HLA-DR antigéneket immunaffinitás-kromatográfiával tisztítottuk meg az azokat tartalmazó sejtvonalaktól. A következőképpen jártunk el: a megfelelő sejtvonal, azaz Hóm 2 (a DR1 forrása), BBF (a DR2 forrása), AVL-B (a DR3 forrása), JAH (a DR4Dw4 forrása), JHAF (a DR4Dwl3 forrása) vagy PE117 (a DR4Dwl4 fonása) sejtvonal lx 109-5 xlO⁹ pelletezett sejtjét 4 °C körüli hőmérsékleten, teflonüveghomogenizátor felhasználásával, 10 löketben 50 ml szolubilizáló oldattal (összetétele: 5 mmol EDTA-nátriumsó, 50 mmol Trisz-HCl /pH 7,4/, 2% NP40, 150 mmol NaCl, 1 mmol jód-acetamid, 1 mmol PMSF) homogenizáltunk. A homogenizátumot 1 órán át 100 000 g gyorsuláson centrifugáltuk, és a felülúszót elkülönítettük. LB3.1 anti-HLA-RD monoklónos antitestet [Gorga és munkatársai: Cell. Immunoi. 103, 160-172 (1986)] kovalens kötéssel CNBr-Sepharose 4B gyantához (Pharmacia-gyártmány) kapcsoltunk, a gyantát pufferoldattal (150 mmol NaCl, 50 mmol Trisz-HCl /pH 7,4/, 0,1% NP-40) előzetesen egyensúlyba hoztuk, majd éjszakán át a felülúszóval inkubáltuk. Ezután a gyantát oszlopba töltöttük, és az oszloptérfogat hússzorosának megfelelő mennyiségű pufferoldattal (0,15 mól NaCl, 50 mmol Trisz-HCl /pH 7,4/, 1% oktil-glükozid) mostuk. A HLADR-t dietil-amin-pufferoldattal (50 mmol dietil-amin /pH 11,0/, 0,15 mól NaCl, 1% oktil-glükozid) eluáltuk. Az oszlopról leoldott eluátumfrakciókat 0,5 mólos HEPES NaOH-pufferoldattal (pH 7,4) azonnal semlegesítettük. A fehérjetartalmat Biorad fehérjeméréssel, a tisztaságot SDS-PAGE elektroforézissel határoztuk meg.

(ii) Apeptidkötődés szelektivitásának vizsgálata:

Biotin-FHA₃₀₇_₃₂₀ foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) készített 200 nanomólos oldatát inhibitorpeptid jelenlétében vagy távollétében V-mélyedéses mikrotitráló lemezeken (Nunc-gyártmány) tisztított HLA-DR1, -DR2, -DR4Dw4, -DR4Dwl3 vagy -DR4Dwl4 pufferoldattal [PBS+0,01% NP-40 (Sigma)] készített, 2-20 pg/ml koncentrációjú oldatával inkubáltuk. A HLA-DR3 gátlásának vizsgálatakor az inkubáláshoz 400 nanomólos Biotin-Ahx-(D)Ala-Ala-Ala-Che-IleAla-Ala-Ala-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-(D)Ala-OH-oldatot és 20 pg/ml koncentrációjú tisztított HLA-DR3-oldatot használtunk. 48 órás inkubálás után az inkubátumokat az „A” vizsgálatnál leírtak szerint kezeltük, és az ott közöltek szerint mértük az abszorbanciát. A peptidek gátló hatását (IC₅₀ értékként kifejezve) Microcal Origin számítógépes programmal számítottuk ki.

„B” vizsgálat: T-sejt-aktiválódás gátlásának vizsgálata in vitro körülmények között

Ez a vizsgálat annak bemutatására alkalmas, hogy az (I) általános képletű peptidszármazékok gátolják-e a T-sejtek II. osztálybeli MHC-molekulák által közvetített immunválaszát.

Vizsgáltuk, hogy az inhibitorpeptidek gátolják-e a B52.24 rágcsáló T-sejt hibridóma sejtvonal serkentését. Ez a sejtvonal a HLA-DR4Dw4-molekulák által szolgáltatott FHA₃₀₇_₃₂₀ peptidre (H-Pro-Lys-Tyr-ValLys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) válaszol. A B52.24 sejtvonalat FHA₃₀₇_₃₂₀ peptiddel immunizált HLA-DR4Dw4 transzgén egerekből származó nyirokcsomó T-sejtek (WO 95/03331 számú nemzetközi közzétételi irat) és BW5147 rágcsáló T-sejt limfóma sejtvonal [White és munkatársai: J. Immunoi. 143, 1822 (1989)] fúziójával alakítottuk ki Woods és munkatársai módszerével [J. Exp. Med. 180, 173-181 (1994)], a T-sejt hibridómák képzésére a Current Protocols in Immunology 2. kötet 7.21. fejezetben leírt általános eljárást követve.

mélyedéses mikrotitráló lemezen (Nunc-gyártmány) 100 pmol és 0,1 pmol közötti (vagy kisebb) koncentrációjú inhibitorpeptidet vagy 100 pmol és 0,1 pmol között változó koncentrációjú, vagy 10 pmol állandó koncentrációjú antigén FHA_3O7__32O peptiddel kevertünk össze. Hígítószerként RPM1-1640 táptalajt (Gibco gyártmány) használtunk, a végtérfogat minden esetben 100 pl volt. HLA-DR4Dw4-et kifejező B-sejteket, például JAH EBV transzformált limfoblasztoid sejtvonalat (ECACC 85102909) vagy HLA-DR4Dw4 homozigó8

HU 222 198 Bl tás egyedből kapott és a Current Protocols in Immunology 7.22.1. fejezetében leírtak szerint Epsten Barr-vírussal transzformált B-sejteket glutáraldehiddel rögzítettünk úgy, hogy a sejteket 4 χ 10⁶ sejt/ml koncentrációban 30 másodpercig 1%-os glutáraldehidben (Sigma-gyártmány) szuszpendáltuk, majd a szuszpenzióhoz azonos térfogatú 200 mmolos lizinoldatot (Sigma-gyártmány) adtunk. 3 perc elteltével a sejteket 300 g gyorsuláson végzett centrifugálással elkülönítettük, RPMI-1640 táptalajjal mostuk, és mélyedésenként 2 χ 10⁵ sejtkoncentrációban a mikrotitráló lemezek antigént és inhibitorvegyületet tartalmazó mélyedéseibe juttattuk. A mikrotitráló lemezeket 2 órán át 37 °C-on, 5% CO₂-tartalmú légtérben inkubáltuk.

A mikrotitráló lemezeket 300 g gyorsuláson centrifugálva RPMI-1640 táptalajjal mostuk, kétszer leszívattuk, majd táptalajjal [RPMI-1640,10% boqúmagzatszérum (Gibco) és 2 mmol glutamin (Gibco)] elegyítve hozzáadtuk a B52.24 T-sejt hibridóma sejtvonalat mélyedésenként 10⁵ sejt koncentrációban. Ezután a mikrotitráló lemezeket újabb 2 napig inkubáltuk 37 °C-on, 5% CO₂-tartalmú légtérben. A lemezeket 10 percig 300 g gyorsuláson centrifugáltuk, majd mindegyik mélyedésből 150 μΐ felülúszót távolítottunk el, amit az IL-2 tartalomra való bioelemzés előtt -20 °C-on megfagyasztottunk.

A vizsgálandó felülúszókat tartalmazó tenyésztőlemezeket szobahőmérsékleten felengedni hagytuk, majd 100 ml felülúszót 96 kerek aljú mélyedéssel ellátott friss lemezekre vittünk át. IL-2-ből táptalajjal [Összetétele: RPMI-1640 (Gibco), 10% boíjúmagzatszérum (Advanced Protein Products), 100 pg/ml sztreptomicin, 100 egység/ml penicillin (Gibco), 2 mmol L-glutamin (Gibco) és 50 pmol 2-merkapto-etanol (Sigma)] 1:1 arányú sorozathígítást készítettünk úgy, hogy a standardgörbe felvételéhez 250 egység/ml és 0,04 egység/ml közötti IL-2-tartalmú elegysorozat álljon rendelkezésre. Egy IL-2 függő sejtvonal sejtjeit, például CTLL-2 sejteket [Natúré 268, 154-156 (1977)] vagy HT-2 sejteket [J. Immunoi. Methods 94-104 (1987)] összegyűjtöttük, táptalajjal kétszer mostuk, majd táptalajjal 5xl0⁴ sejt/ml koncentrációban újra szuszpendáltuk. A standardgörbe felvételére szolgáló mintákhoz és a vizsgálandó mintákhoz mélyedésenként 100-100 μΐ IL-2 függő sejtszuszpenziót adtunk. A tenyésztőlemezeket 72 órán át 37 °C-on, 5% CO₂-tartalmú légtérben inkubáltuk. Ezután mindegyik mélyedésbe 20 μΐ (1 mCi) 3H-timidint (Amersham Intemational-gyártmány) juttattunk, és a lemezeket további 16 órára visszahelyeztük az inkubátorba. Az egyes lemezek tartalmát üvegrostszűrőszövedéken felfogtuk, és β-szcintillációs számlálóval meghatároztuk a minták radioaktivitását.

Az így vizsgált (I) általános képletű peptidszármazékok általában körülbelül 10 pmol vagy annál lényegesen kisebb koncentrációban jelentős gátló hatást mutattak.

„C” vizsgálat: Késleltetett hiperérzékenységre kifejtett hatás vizsgálata Balb/c egereken

Ezzel a vizsgálattal az (I) általános képletű peptidek állatmodellen, in vivő körülmények között kifejtett aktivitása szemléltethető.

18- 20 g testtömegű nőstény Balb/c egerekből öttagú állatcsoportokat képeztünk. Az egerek horpaszába szubkután injekció formájában 0,1 ml ovalbuminemulziót [fiziológiás sóoldattal készített 2 mg/ml koncentrációjú ovalbuminemulzió (Sigma) és komplett Freundadjuváns (Sigma) 1:1 térfogatarányú elegye] adtunk be. 7 nappal az immunizálás után kettős tolómérős mikrométerrel lemértük az állatok lábfejének vastagságát, majd az állatok egyik hátsó lábának talprészébe fiziológiás sóoldatban 1% hővel aggregáltatott ovalbuminfehérjét tartalmazó 30 μΐ oldatot fecskendeztünk. 24 órával az antigén beadása után ismét lemértük az állatok lábfejének vastagságát, és kiszámítottuk a kezelt lábfej vastagságának a szemben lévő kontroli-lábfej vastagságához viszonyított %-os növekedését (ez a késleltetett hiperérzékenység mértéke). Az állatok testébe 24 órával az antigén beadása előtt Alzet típusú háromnapos ozmotikus miniszivattyút ültettünk be, és ennek segítségével az állatoknak inhibitort adtunk be 10 mg/kg és 0,1 pg/kg közötti napi dózisban. A gátlás %-os mértékét úgy számítottuk ki, hogy a csak hordozóanyaggal kezelt kontroliokon észlelt duzzadás mértékéből levontuk a kezelt állatokon észlelt duzzadás mértékét, a kapott különbséget osztottuk a kontrollértékkel, és szoroztuk 100-zal.

A fentiek szerint vizsgált (I) általános képletű peptidszármazékok rendszerint körülbelül 1 mg/kg-os vagy lényegesen kisebb napi dózisban jelentős mértékű gátlást fejtettek ki anélkül, hogy toxicitásra utaló vagy más, nem kívánt farmakológiai hatást észleltünk volna.

„D vizsgálat:

Ezzel a vizsgálattal az (I) általános képletű peptidszármazékok állatokon modellezett arthritisre in vivő körülmények között kifejtett hatása szemléltethető.

19- 21 g testtömegű nőstény Balb/c egerekből 5-10 tagú csoportokat képeztünk. Az állatok immunizálását a 0. napon, az immunserkentést pedig a 7. napon végeztük 0,1 ml emulzió szubkután befecskendezésével. Az emulzió fiziológiás sóoldattal készített 2 mg/ml koncentrációjú metilezett szarvasmarha-szérumalbumin (met-BSA, Sigma) oldat és 2,5 mg/ml Mycobacterium tuberculosissal (MTB, C, DT és PN, MAFF törzs, Weybridge, Surrey) kiegészített komplett Freund-adjuváns (Sigma) 1:1 térfogatarányú elegye volt, a végső MTB koncentráció tehát 3,5 mg/ml volt. Az állatoknak ugyanakkor intraperitoneálisan 0,1 ml injekciót is beadtunk, ami 10⁹ Bordetella pertussis mikroorganizmust (Wellcome Pertussis vakcina) tartalmazott fiziológiás sóoldatban. 14 nappal később az állatok egyik térdízületébe 30G méretű tű és Hamilton-fecskendő segítségével 10 μΐ intraartikuláris injekciót adtunk be, ami 100 pg met-BSA-t tartalmazott fiziológiás sóoldatban. Az állatok szemben lévő térdébe - ami kontrollként szolgált - ugyanakkor csak fiziológiás sóoldatot injektáltunk. 13 nap elteltével kettős tolómérős mikrométerrel lemértük mindkét térd vastagságát, és a kapott adatokból mindkét térdre kiszámítottuk a gyulladás/duzzadás mértékét. A méréshez a térd fölött és alatt mintegy 5-5 mm-re tompa végű ollóval bemetszettük a bőrt, majd a vágást a térd mentén folytatva lebenyt ké9

HU 222 198 Bl peztünk, amit csipesszel fogva óvatosan levágtunk, és így szabaddá tettük az alatta fekvő ízületet. A méréseket a térd legszélesebb részénél végeztük vízszintes irányban, miközben a behajlított végtagot rögzített helyzetben tartottuk. Ezután az (A-S)xlOO

S képlet alapján - ahol A az antigénnel kezelt térd, S pedig a csak sóoldattal kezelt térd vastagságát jelenti - kiszámítottuk az antigénnel kezelt térd %-os gyulladásfokozódását a kontrolihoz viszonyítva. Az állatok testébe 24 órával az antigén beadása előtt 14 napos ozmotikus miniszivattyút (Alzet) ültettünk be, aminek segítségével az állatoknak inhibitort adtunk be 10 mg/kg és 0,1 pg/kg közötti napi dózisban. A gyulladás/duzzadás gátlásának %-os mértékét a mért vastagságértékek alapján számítottuk ki úgy, hogy a csak hordozóanyaggal kezelt kontrollokon észlelt duzzadás értékéből levontuk az inhibitorral kezelt állatokon észlelt duzzadás értékét, a kapott különbséget osztottuk a kontrollértékkel, és szoroztuk 100-zal. A betegség további értékelésére a következő vizsgálatokat is elvégeztük: (1) gyulladás, ízületi hártyagyulladás és porc/csont eróziók szövettani értékelése a rögzített térd hematoxilinnal és eozirmal megfestett metszetein, és (2) az akut fázisreagensek szintjének meghatározása a szérumban, a szérum amiloid P-ben és/vagy a haptoglobinban.

A fentiek szerint vizsgált (I) általános képletű vegyületek rendszerint körülbelül 10 mg/kg-os vagy lényegesen kisebb napi dózisban jelentős mértékű gátlást fejtettek ki.

Az (I) általános képletű peptidszármazékok egyes képviselőinek aktivitásáról szemléltetésként közöljük, hogy az 5., 16. és 23. példában ismertetett vegyületek az „A” vizsgálatban 0,1 pmolnál kisebb koncentrációban jelentős mértékben kötődtek HLA-DR4Dw4-hez, és a „C” vizsgálatban 0,1 mg/kg-nál kisebb napi dózisban bizonyultak hatásosaknak. A vegyületek 3-as és 7,6-os pH-jú vizes közegekben kellően stabiloknak bizonyultak, extrudált polimer depókészítménnyé alakításuk során az extrudálás hatására csak minimális mértékben károsodtak, és az ilyen készítményekből való felszabadulás során csak minimális mértékben bomlottak le. Az „A” vizsgálat fent ismertetett második változatában a 23. példa szerinti vegyület jelentős mértékben kötődött HLA-DRl-hez, HLA-DR2-höz, HLA-DR4Dw4hez és HLA-DR4Dwl4-hez, de HLA-DR3-hoz csak kismértékben kötődött (IC₅₀ > 100 pmol).

Az (I) általános képletű peptidszármazékokat a rokon szerkezetű vegyületek előállítására alkalmas ismert peptidkémiai módszerek bármelyikével előállíthatjuk.

Az (I) általános képletű peptidszármazékokat például a következő szakkönyvekben leírt vagy azokkal analóg módszerekkel állíthatjuk elő: Atherton és Sheppard: „Solid Phase Peptide Synthesis: A practical approach” (kiadó: az Oxford University Press mellett működő IRL press, 1989), Stewart és Young: „Solid Phase Peptide Synthesis” (kiadó: Pierce Chemical Company, Illinois, 1984), „Principles of Peptide Synthesis” (kiadó : Springer Verlag, Berlin, 1984), és a Royal Society of Chemistry (Cambridge, Nagy-Britannia) által kiadott,Amino Acids, Peptides and Proteins” c. könyvsorozat 1-25. kötete (a 25. kötet 1994-ben jelent meg).

Az (I) általános képletű peptidszármazékokat előnyösen szilárd fázisú szintézissorozattal állítjuk elő. A módszer lényege a következő: A kialakítandó pepiidben C-terminális aminosavként szereplő aminosav α-aminocsoportjára (és szükség esetén az oldallánc megfelelő csoportjaira) védőcsoportot viszünk fel, majd szilárd hordozóhoz, például gyantához kapcsoljuk. Ha a kész peptid lehasításakor szabad karbonsavra van szükségünk, gyantaként 2-klór-tritil-klorid-gyantát vagy Merrifield-gyantát (klór-metil-polisztirol-divinilbenzol) használhatunk, míg ha a lehasításkor karboxamidot kívánunk képezni, gyantaként Rink Amide-gyantát [4-(2’,4’-dimetoxi-fenil-Fmoc-amino-metil)-fenoxigyanta] vagy Rink Amidé MBHA-gyantát [N-(4-/2’,4’dimetoxi-fenil-Fmoc-amino-metil/-fenoxi-acetamidonorleucil)-4-metil-benzhidril-amin-gyanta] használhatunk (az itt felsorolt gyanták a Calbiochem-Novabiochem cégtől szerezhetők be). Ezután a hordozóhoz kapcsolt aminosav α-aminocsoportjáról lehasítjuk a védőcsoportot. A C-terminális aminosavhoz kapcsolandó aminosav α-aminocsoportjára (és szükség esetén az oldallánc megfelelő csoportjaira) védőcsoportot viszünk fel, majd hozzákapcsoljuk a szilárd hordozón rögzített aminosavhoz. Ezután az α-aminocsoport védőcsoportjának lehasítását és a következő aminosavhoz kapcsolást lépésenként megismételjük, amelynek eredményeként a szilárd hordozóhoz kapcsolt, adott esetben védőcsoporto(ka)t is hordozó peptidet kapunk. A (II) vagy (III) általános képletű R² csoportot úgy építjük be a szekvenciába, hogy védett aminosav helyett (a) olyan vegyületek előállítására, amelyekben R² (II) általános képletű csoportot és ebben A metiléncsoportot jelent, egy megfelelően védett (3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-alkánkarbonsavat, (b) olyan vegyületek előállítására, amelyekben R² (II) általános képletű csoportot és ebben A oxigénatomot jelent, a fenti alkánkarbonsav oxaanalógját [amely például a J. Med. Chem. 36, 256-263 (1993) közleményben leírt vagy azzal analóg módszerrel állítható elő], vagy (c) olyan vegyületek előállítására, amelyekben R² (III) általános képletű csoportot jelent, egy (6-oxo-l,7-diaza-spiro[4.4]non-7-il)-alkánkarbonsavat használunk. Végül az adott esetben védőcsoporto(ka)t hordozó peptidet ismert módon - például trifluor-ecetsav, trietil-szilán és víz elegyével kezelve lehasítjuk a szilárd hordozóról. Megjegyezzük, hogy az oldallánchoz adott esetben kapcsolódó védőcsoportok esetenként a pepiidnek a szilárd hordozóról való lehasítása során is lehasíthatók, ezeket a védőcsoportokat azonban külön műveletben is lehasíthatjuk a pepiidnek a szilárd hordozóról való lehasítása előtt vagy után. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a polipeptid felépítése során egyes kapcsolási lépésekben reagensként két vagy több megfelelően védett aminosavból előre kialakított szekvenciát is használhatunk. A szintézist kézi és automatizált módon vagy ezek kombinálásával egyaránt végrehajthatjuk. Az automatizált szintézishez pél10

HU 222 198 Bl dául Applied Biosystems 431A vagy 430A peptidszintetizátort, Advanced Chemtech ACT357 peptidszintetizátort vagy hasonló automata peptidszintetizátorokat használhatunk.

A peptidek összeállítása során az aminosavaknak a reakcióban részt nem vevő funkciós csoportjaira megfelelő védőcsoportokat viszünk fel. Az N-terminális és az oldalláncban lévő aminocsoportok lehetséges védőcsoportjai közül a következőket soroljuk fel: 9-fluorenil-metoxi-karbonil- (Fmoc), terc-butoxi-karbonil- (Boc), bifenil-izopropoxi-karbonil- (Bpoc), 2-(3,5-dimetoxi-fenil)propil-2-oxi-karbonil- (Ddz), adamantil-oxi-karbonil(Adoc), allil-oxi-karbonil- (Aloc), 2,2,2-triklór-etoxi-karbonil- (Troc), benzil-oxi-karbonil- és különböző szubsztituált benzil-oxi-karbonil-csoportok. Ezeket a védőcsoportokat szokásos módszerekkel, például savas vagy lúgos kezeléssel, Pd(0) jelenlétében végzett katalitikus hidrogenolízissel vagy cink/ecetsav eleggyel való kezeléssel hasíthatjuk le a szintézis kívánt szakaszában.

Az argininmaradékot tartalmazó peptidek oldalláncban lévő guanidinocsoportjára felvihető védőcsoportok például a következők lehetnek: nitro-, adamantil-oxikarbonil-, 4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzolszulfonil(Mtr), 2,2,5,7,8-pentametil-kroman-6-szulfonil- (Pmc) és (különösen előnyösen) 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-szulfonrl- (Pbf) csoport.

Az oldalláncban lévő hidroxilcsoportokra védőcsoportként például terc-butil-, benzil- vagy tritil- (Tr) csoportot vihetünk fel. A hisztidinmaradékot tartalmazó peptidek oldalláncában lévő imidazolcsoportra védőcsoportként például tritil-, benzil-, tozil-, dinitro-fenil-, Adoc, Boc vagy Fmoc csoportot vihetünk fel.

Az oldalláncban lévő karboxilcsoportokat például észterré (így metil-, etil-, terc-butil-, benzil-, nitrobenzil-, allil- és 9-fluorenil-metil-észterré) alakítva védhetjük.

A védőcsoportok lehasítását 4-40 °C-on (előnyösen szobahőmérsékleten vagy ahhoz közeli hőmérsékleteken) végezzük. A reakcióidő 10 perc - 24 óra lehet.

Az egyedi aminosavakat például az általánosan használt azid-, szimmetrikus anhidrid-, vegyes anhidrid-, aktív észter- és karbodiimid-módszerekkel kapcsolhatjuk egymáshoz. Karbodiimidek (például diciklohexil- vagy diizopropil-karbodiimid) felhasználásakor a reakcióelegyhez különféle adalékokat, így 1-hidroxi-benzotriazolt (HOBT) vagy N-hidroxi-szukcinimidet is adhatunk. Az aminosavak összekapcsolásához azonban egyéb reagenseket, például lH-benzotriazol-l-il-oxotrisz-pirrolidino-foszfónium-hexafluor-foszfátot (PyBOP), 2-(lH-benzotriazol-1 -il)-l, 1,2,2-tetrametilurónium-tetrafluor-borátot (TBTU) vagy 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametil-urónium-hexafluorborátot (HBTU) is felhasználhatunk. A kapcsolási reakciót -20 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten végezhetjük, a reakcióidő 10 perc-24 óra lehet. A kapcsolási reakcióhoz reakcióközegként például N,N-dimetil-formamidot (DMF) használhatunk. Különösen előnyös módszer a HBTU, HOBT és diizopropil-etil-amin használata DMF jelenlétében.

A peptidszintézis fent felsorolt és további módszereit részletesen ismertetik a leírásban már idézett nemzetközi közzétételi iratok. A P helyén álló hidrofób maradékok közül az R-, R-CO-, R-SO₂-, R-O-CO-, R-NHCO-, R-O-CS-, R-S-CO-, R-NHCS-, R-S-CS- és R-CS- csoportot (vagy ha P hidrofób aminosavat vagy további aminosavakat hordozó hidrofób aminosavat jelent, a terminális aminocsoporthoz kapcsolódó fent felsorolt csoportokat) például zárólépésként vihetjük be a molekulába a terminális aminocsoport alkilezésével, acilezésével vagy más standard funkcionális módosításával. Ezt a műveletet a pepiidnek a hordozóról való lehasítása előtt vagy után egyaránt elvégezhetjük. Ha egyes R⁴ csoportok kialakításához C-terminális módosításokra van szükség, ezeket a peptidszintézis után hajthatjuk végre a funkciós csoportok módosításának szokásos módszereivel, eljárhatunk azonban úgy is, hogy a kialakítandó R⁴ csoportnak megfelelően választjuk meg a gyantát, vagy elsőként az R⁴ csoportnak megfelelő védett vegyületet (például megfelelően védett R⁴-H képletű vegyületet) kapcsoljuk a gyantához. Az (I) általános képletű peptidszármazékok előállításának jellemző módszereit a példákban részletesebben ismertetjük.

A találmány szerinti peptidszármazékok stabilitását például a következőképpen mérhetjük (megjegyezzük, hogy az eljárás során a mikróbás szennyeződések és a bomlás minimumra szorítása érdekében a peptidoldatok előállításához használt minden berendezést autoklávban sterilizálunk, és az összes anyagátvitelt Class II lamináris áramlású kamrában végezzük): 50 ml űrtartalmú lombikba steril 0,22 μπτ-es szűrő és 20 ml-es fecskendő segítségével körülbelül 20 ml Mcllvaine citromsav-foszfát-pufferoldatot (pH 3 vagy 7,6, az oldat 0,02% nátrium-azidot is tartalmaz) szűrünk be. Záródugós fiolába mintegy 1,2 mg peptidet helyezünk, és a peptidet pontosan lemérjük. Ezután a fiolába steril pipettával annyi pufferoldatot mérünk be, hogy 0,1 mg/ml peptidtartalmú oldatot kapjunk. A fiolát lezárjuk, és a peptidet rázogatás közben feloldjuk. Tíz kromatográfiás (HPLC) fiolába steril pipettával az így előállított peptidoldat körülbelül 1-1 ml-es aliquotjait mérjük be, majd a fiolákat lezárjuk. 5-5 fiolát -18 °C-on és 37 °C-on tárolunk. Ezután HPLC-val, a peptidcsúcs alatti terület mérésével meghatározzuk az oldatok peptidtartalmát. A mérést közvetlenül az oldatkészítés után, majd -18 °C-on és 37 °C-on való 1, 2, 3 és 4 hetes tárolás után végezzük. Az egyes időpontokban végzett mérésekhez mindig friss fiolát bontunk, és két mintát injektálunk. A kezdeti és a különböző későbbi időpontokban mért peptidcsúcs alatti területek arányából kiszámítjuk az adott ideig 37 °C-on való tárolás után változatlanul maradt peptid részarányát. Előnyösek azok a peptidszármazékok, amelyek legalább 90%-a (célszerűen legalább 95%-a) 3 és

7,6 pH-jú közegben 37 °C-on való tárolás után változatlan marad.

Az (I) általános képletű peptidszármazékokat rendszerint szokásos gyógyászati készítmények formájában adjuk be a terápiás vagy profilaktikus célú kezelést igénylő meleg vérűeknek (köztük embereknek).

A találmány továbbá gyógyászati készítményekre vonatkozik, amelyek (I) általános képletű peptidszár11

HU 222 198 Bl mazékot vagy gyógyászatilag alkalmazható sóját tartalmazzák gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyagokkal, hígítószerekkel és/vagy egyéb segédanyagokkal együtt.

A gyógyászati készítmények például orálisan adagolható kompozíciók (így tabletták, kapszulák vagy vizes vagy olajos oldatok, szuszpenziók vagy emulziók), nazálisán adagolható kompozíciók (így szippantóporok, orrcseppek vagy orrspray-k), vaginálisan vagy rektálisan adagolható kompozíciók (például kúpok), belélegezhető kompozíciók (így finom eloszlású porok vagy folyadékaeroszolok), szublinguálisan vagy bukkálisan adagolható kompozíciók (így tabletták vagy kapszulák), továbbá parenterálisan (így intravénás, szubkután, intramuszkuláris vagy intravaszkuláris injekció vagy infúzió formájában) adagolható kompozíciók (például steril vizes vagy olajos oldatok vagy szuszpenziók) lehetnek. A gyógyászati készítmények további formái a helyileg adagolható kompozíciók, így a krémek, kenőcsök és gélek, valamint a bőrre illeszthető tapaszok. A gyógyászati készítményeket általánosságban ismerteti a „Comprehensive Medicinái Chemistry” 5. kötetének 25.2. fejezete (szerk.: Hansch és munkatársai, kiadó: Pergamon Press, 1990).

A fenti készítményeket rendszerint szokásos módszerekkel, hagyományos excipiensek felhasználásával állítjuk elő. Az orális adagolásra szánt készítményekre előnyösen védőbevonatot viszünk fel annak érdekében, hogy védjük a polipeptid-hatóanyagot a gyomorban lévő enzimek hatásaitól.

A találmány szerinti gyógyászati készítmények előnyös képviselői az orálisan adagolható dózisegységek (például tabletták vagy kapszulák), amelyek dózisegységenként 2,5-500 mg, előnyösen 10-100 mg polipeptidet tartalmaznak, továbbá a parenterálisan adagolható gyógyszerformák, amelyek 1 ml oldatra vonatkoztatva 0,5-100 mg, előnyösen 1-10 mg polipeptidet tartalmaznak.

A parenterálisan adagolható készítmények előnyös képviselői az izotóniás sóoldattal vagy izotóniás dextrózoldattal készített, szükség esetén pH 5-9-re pufferolt oldatok. A parenterálisan adagolható készítmények nyújtott hatóanyag-felszabadulású kompozíciók is lehetnek, amelyek dózisegységenként rendszerint több polipeptidet tartalmaznak, mint a hagyományos injektálható készítmények. A nyújtott hatóanyag-felszabadulású készítmények előnyös képviselői a hatóanyag folyamatos felszabadulását biztosító készítmények, például az 58481 számú európai szabadalmi bejelentésben, vagy legalább egy bázikus csoportot tartalmazó (I) általános képletű peptidek esetére - a WO 93/24150 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett kompozíciók. A találmány szerinti peptidek egyes képviselői kedvező szolubilitási jellemzőik folytán különösen előnyösen alakíthatók nyújtott hatóanyag-felszabadulású parenterális készítményekké (elsősorban biológiailag lebontható poliésztereket, például polilaktidokat tartalmazó kompozíciókká), amelyekből a hatóanyag időben elnyújtva, kedvező profil szerint szabadul fel.

A találmány szerinti peptidek azon képviselői, amelyek egy vagy több bázikus csoportot tartalmaznak (közülük elsősorban az arginintartalmú peptidek) savas végcsoportot hordozó poliészterekkel (például polilaktidokkal) peptid-polimer sókat is képezhetnek. Oltalmi igényünk ezekre a peptid-polimer sókra is kiteljed. Az ilyen peptid-polimer sók egyes képviselői kedvező szolubilitási jellemzőik folytán különösen előnyösen alakíthatók (például a WO 93/24150 számú nemzetközi közzétételi iratban megadottak szerint) jó tárolási stabilitású, nyújtott hatóanyag-felszabadulású parenterális készítményekké, amelyekből a hatóanyag időben elhúzódóan, kedvező profil szerint szabadul fel. A nyújtott hatóanyag-felszabadulású parenterális készítmények dózisegységenként előnyösen 1-100 mg (például 5-50 mg) polipeptidet tartalmaznak. A nyújtott hatóanyag-felszabadulású parenterális készítmények előnyös képviselői azok, amelyekből a hatóanyag legalább 5 napon át szabadul fel.

A találmány szerinti peptidek előnyös képviselői azok is, amelyekből úgy képezhetők extrudált polimer depókészítmények, hogy az extrudálás során minimális a peptidveszteség, vagy a belőlük felszabaduló hatóanyag csak minimális mértékben bomlik. A találmány szerinti peptidek bomlásának mértékét például a következő módszerekkel vizsgálhatjuk:

Peptidtartalmú extrudált polimer depókészítmény előállítása:

Mintegy 20 mg pepiidet pontosan lemérünk, és annyi polimert [50/50 mól%-os poli(D,L-tejsav/glikolsav)-kopolimer, amelynek súly szerinti átlagos molekulatömege kb. 20 kD, polisztirolstandardokkal szemben méretkizárásos kromatográfiával meghatározott polidiszperzitása kb. 1,7] adunk hozzá, hogy körülbelül 20 tömeg%-os keveréket kapjunk. A keverékből anhidridmentes jégecettel körülbelül 10 tömeg/térfogat%-os oldatot készítünk. Az oldatot fagyasztva szárítjuk, és a fagyasztva szárított tennéket felhasználásig csökkentett nyomáson tároljuk.

Kisméretű laboratóriumi extruder tárolóterébe körülbelül 100 mg fagyasztva szárított anyagot töltünk, és a döngölőt lefelé mozgatva tömörítjük az anyagot. Az extrudert 90-95 °C-ra fűtjük fel, 10 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk, majd a fagyasztva szárított anyagot nyomás alatt körülbelül 1 mm átmérőjű hengeres extrudátummá extrudáljuk.

A peptidtartalmú extrudált polimer depókészítmény peptidtartalmának elemzése:

Két, körülbelül 5 mm hosszúságú peptidtartalmú extrudált polimer depókészítményt pontosan lemérünk, és a két darabot térfogatbeosztásos 25 ml-es lombikban külön-külön feloldjuk 1 ml anhidridmentes jégecetben. Körülbelül 1,5 óra elteltével mindkét lombikot desztillált vízzel 25 ml-re töltjük fel. A kicsapódott szilárd polimert 0,5 pm-es Millex PTFE szűrőn kiszűijük, és a szűrleteket („A” oldat) félretesszük.

Desztillált vízzel készített, 0,5 mg/ml koncentrációjú peptid törzsoldatból és anhidridmentes jégecettel készített, 2,5 mg/ml koncentrációjú polimer törzsoldatból a következő táblázatban megadottak szerint standard oldatsorozatot készítünk. A standard oldatok térfogatát desztillált vízzel 10 ml-re töltjük fel.

HU 222 198 Bl

Peptidkoncentráció, pg/ml	A polimer törzsoldat térfogata, pl	A peptid törzsoldat térfogata, pl
50	1000	1000
40	1000	800
30	1000	600
20	1000	400
10	1000	200
5	1000	100
0	1000	0

A kapott standard oldatokat 5 pm-es Millex PTFE szűrőn szüljük, majd a szűrlet aliquot részét és az „A” oldat aliquot részét kettős mintainjektálást használva HPLC-val elemezzük. A standard oldatokkal felvett kromatogramok peptidcsúcsa alatti területet az „A” oldat kromatogramján mért területtel egybevetve meghatározzuk az „A” oldat peptidkoncentrációját, és a kapott értékből kiszámítjuk az extrudált polimer depókészítmény peptidtartalmát. A találmány szerinti peptidek előnyös képviselői az extrudálás során csak minimális mértékben bomlanak, így az ezeket tartalmazó extrudált polimer depókészítmények peptidtartalma az elméleti mintegy 20 tömeg%-hoz közeli érték.

Az extrudált polimer depókészítményből in vitro körülmények között felszabadult peptid bomlásának vizsgálata:

0,02% nátrium-azidot tartalmazó Mcllvaine citromsav-foszfát-pufferoldatot (pH 7,6) 0,22 μ-os szűrőn szűrünk, és a szűrletet 4 °C-on tároljuk. Két kis fiolába körülbelül 10-10 mg peptidtartalmú extrudált polimer depókészítményt töltünk, és a készítményhez 2-2 ml pufferoldatot adunk. A fiolákat lezárjuk, és 1 hónapig 37 °C-os vízfürdőben tartjuk. Az egyhavi tárolás során meghatározott időközönként mindkét fiolából háromszor 0,6 ml folyadékot távolítunk el, és a mintákat HPLC-val közvetlenül elemezzük, vagy HPLC-fiolába töltve -18 °C-on tároljuk a HPLC-analízis előtt. Mintavétel után a depókészítményt tartalmazó mindkét fiolához 1,8 ml pufferoldatot adva pótoljuk az eltávolított folyadékmennyiséget.

Az egyes időpontokban vett folyadékmintákban lévő sértetlen peptid mennyiségét HPLC-val határozzuk meg, kettős mintainjektálást használva. A kromatogram peptidcsúcsa alatti területet standard pufferoldattal készített, ismert koncentrációjú peptidoldatok kromatogramján mért területekkel egybevetve kiszámítjuk a minta peptidkoncentrációját. Az egyes időpontokban vett folyadékmintákban lévő peptidbomlástermékek mennyiségét szintén HPLC-val határozzuk meg úgy, hogy a minta kromatogramjában megjelenő új csúcsok alatti területet vetjük egybe az ismert koncentrációjú peptidoldatok kromatogramjának peptidcsúcsa alatti területtel (itt feltételezzük, hogy az extinkciós koefficiens nem változott). A mintákban az egyes időpontokban mért sértetlen peptid- és peptidbomlástermék-mennyiségek alapján meghatározzuk a sértetlen peptid és az összes peptid (sértetlen peptid+peptidbomlástermékek) in vitro körülmények között észlelt átlagos kumulatív felszabadulási profilját. A találmány szerinti peptidek előnyös képviselői in vitro körülmények között felszabadulva csak csekély mértékben bomlanak, úgy, hogy a peptidbomlástermékek összmennyisége Mcllvain-pufferoldatban (pH 7,6) 1 hónapig 37 °C-on való tárolás után 10%-nál kevesebb, előnyösen 5%-nál kevesebb.

A találmány szerinti készítményeket a humángyógyászatban 70 kg testtömegű betegeknek rendszerint 10 pg és 5000 mg közötti, előnyösen 0,1-100 mg-os napi dózisban adjuk be, szükség esetén napi több részdózisra elosztva. A kezeléshez szükséges készítmény pontos mennyisége és a kezelés módja a beteg testtömegétől, korától és nemétől, a kezelendő betegség vagy rendellenesség fajtájától és súlyosságától és az orvosi gyakorlatban figyelembe veendő egyéb tényezőktől függően változik.

Az (I) általános képletű peptidszármazékokat vagy azok gyógyászatilag alkalmazható sóit terápiás vagy profilaktikus célokra egy vagy több olyan más gyógyhatású anyaggal együtt is adagolhatjuk, amelyek a korábban felsorolt betegségek vagy rendellenességek kezelésében, a tünetek csökkentésében vagy a betegség vagy rendellenesség módosításában kedvező hatást fejtenek ki. Ilyen egyéb gyógyhatású anyagok például a következők: nemszteroid gyulladásgátló anyagok (így ibuprofen és piroxicam), fájdalomcsillapítók (így paracetamol), kortikoszteroidok, izomemyesztők, lipoxigenázinhibitorok, metotrexát, azatioprin, D-penicillamin, ciklosporin-A és monoklónos antitestek (így anti-CD4 és anti-TNF). Cukorbetegség kezelésére a peptidszármazékokat inzulinnal vagy a cukorbetegség, illetve tünetei kezelésére alkalmas más gyógyszerekkel (például aldózreduktáz inhibitorokkal) együtt adagolhatjuk. Ezek a kombinált kezelésmódok is a találmány tárgyát képezik.

A találmány tárgya továbbá eljárás II. osztálybeli MHC-függő T-sejtek által közvetített autoimmun vagy gyulladásos betegségek (például a korábban felsorolt betegségek vagy rendellenességek) kezelésére oly módon, hogy a kezelést igénylő meleg vérűnek (köztük embereknek) valamely (I) általános képletű peptidszármazék vagy gyógyászatilag alkalmazható sója hatásos mennyiségét adjuk be. A találmány tárgyát képezi továbbá az (I) általános képletű peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik felhasználása a II. osztálybeli MHC-függő T-sejtek által közvetített autoimmun vagy gyulladásos betegségek kezelésére alkalmas új gyógyszerek kifejlesztésében.

Humángyógyászati felhasználásuk mellett az (I) általános képletű peptidszármazékok az állatgyógyászatban is felhasználhatók meleg vérű haszonállatok (így kutyák, macskák, lovak és szarvasmarhák) hasonló rendellenességeinek kezelésére. Állatgyógyászati célokra az (I) általános képletű peptidszármazékokat rendszerint a humán gyógyászati felhasználásnál már leírtakhoz hasonló mennyiségben és módon adagoljuk. Az (I) általános képletű peptidszármazékok farmakológiai segédeszközökként is felhasználhatók a II. osztálybeli

HU 222 198 BI

MHC-molekulák laboratóriumi állatokon (így macskákon, kutyákon, nyulakon, majmokon, patkányokon és egereken) kifejtett hatásának értékelésére alkalmas vizsgálati módszerek kidolgozásához és standardizálásához, új gyógyhatású anyagok kutatásához, valamint diagnosztikai reagensekként.

A találmányt az oltalmi kör korlátozása nélkül a következő példákban részletesebben ismertetjük. Ha a példákban mást nem közlünk, (i) a betöményítést vagy bepárlást csökkentett nyomáson, forgó bepárlókészülékben végeztük, (ii) a műveleteket szobahőmérsékleten, azaz 18-26 °C-on végeztük, (iii) a közölt hozamadatok csak tájékoztató jellegűek, és nem jelentik szükségképpen az elérhető maximumot, (iv) az alkalmazott rövidítések jelentése a következő: Phv=5-fenil-valeril, Boc=terc-butoxi-karbonil, tBu=terc-butil, DMF=N,N-dimetil-formamid, HOBT=l-hidroxi-benzotriazol, Met=metionin, Fmoc=9-fluorenil-metoxi-karbonil, Fmoc-Pip-OH=N(9-fluorenil-metoxi-karbonil)-piperidin-4-karbonsav, Fmoc-Papa-OH=4-[N-(9-fluorenil-metoxi-karbonil)-amino]-fenil-ecetsav, CbZ=benzil-oxi-karbonil, Pmc = 2,2,5,7,8-pentametil-kromán-6-szulfonil, Pbf=2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofurán5-szulfonil, THF=tetrahidrofurán, DMSO=dimetilszulfoxid, HBTU=2-(lH-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametil-urónium-hexafluor-foszfát, DIPEA=diizopropil-etil-amin, TFA=trifluor-ecetsav, Su=a gyűrűtagnitrogénatomon keresztül kapcsolódó szukcinimid, HPLC=nagynyomású folyadékkromatográfía, RPHPLC=reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia (ehhez, ha mást nem közlünk, 4,6 χ 250 mm méretű Vydac C18 218TP54 oszlopot használtunk), (v) a gyorskromatografáláshoz és a szilikagéles kromatografáláshoz Merck Kieselgel 60 (Art No. 9385) típusú szilikagélt használtunk (gyártja: E. Merck, Darmstadt, Németország), (vi) az NMR-spektrumokat 200 MHz frekvencián vettük fel CDCl₃-ban vagy hexadeutero-dimetil-szulfoxidban (DMSO-cQ, a kémiai eltolódásokat δ skálán, tetrametil-szilán (TMS) belső standardhoz viszonyított ppm egységekben adtuk meg, (vii) Lys, Thr, Arg és His maradékok beviteléhez a következő Fmoc-védett aminosavakat használtuk: Lys-hez: Fmoc-Lys(Boc)-OH, Thr-hoz: FmocThr(OBu)-OH, Arg-hoz: Fmoc-Arg(Pmc)-OH vagy Fmoc-Arg(Pbf)-OH, His-hez: Fmoc-His(Trt)-OH, (viii) a 2. példában említett (III) általános képletű csoportokban Rb metilcsoportot jelent, (ix) a 17. és 31. példában a termék nevében használt „morfolin” megjelölés azt jelenti, hogy a morfolincsoport gyűrűtag-nitrogénatomjánál kapcsolódik a szomszédos metiléncsoporthoz, (x) a 18. és 34. példában a termék nevében használt „N(CH₂CH₂)2N” jelölés piperazingyűrűt jelent, (xi) a 30. példában a termék nevében használt ,,-Lys(=C(NMe₂)₂-” jelölés a

-HN-CH[CH₂CH₂CH₂CH₂N=C(NMe₂)₂]-CO- képletű L-aminosavmaradékot jelenti.

1. példa

Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (1. szekvencia) előállítása

1.1. Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe [(6) képletű vegyület] szintézise:

g (0,028 mól) Boc-(D)-metionin 50 ml vízmentes dimetil-formamiddal készített oldatához 5,6 g N-metilmorfolint, 3,9 g L-alanin-metil-észter-hidrokloridot,

4,6 g HOBT-t és 5,3 g l-(3-/dimetil-amino/-propil)-3etil-karbodiimidet adtunk. Az elegyet éjszakán át kevertük. Az oldószert lepároltuk, és a maradékot 100 ml diklór-metán és 50 ml 5%-os vizes ecetsavoldat között megoszlattuk. Az állás közben kikristályosodott HOBT-t kiszűrtük, majd a szerves fázist elválasztottuk, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mostuk, vízmentes magnézium-szulfát fölött szárítottuk, és bepároltuk. A kapott

8,5 g maradékot zsugorított szűrőben gyorskromatografálva tisztítottuk, eluálószerként 0%-tól 100%-ig változó étertartalmú diklór-metán/éter elegyeket használtunk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítettük és bepároltuk. 7,2 g Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe-t kaptunk, a gumiszerű anyag állás közben kristályosodott.

NMR-spektrum adatai (CDC1₃): 1,4 (d, 3H), 1,45 (s,

9H), 1,95 (m, 1H), 2,1 (s, 3H), 2,1 (m, 1H), 2,6 (m,

2H), 3,75 (s, 3H), 4,3 (széles s, 1H), 4,6 (m, 1H),

5,3 (m, 1H), 6,9 (széles s, 1H).

1.2. (2S)-2-[(3R)-3-(N-/terc-butoxi-karbonil/-amino)-2-oxo-pirrolidin-l-il]-propionsav-metil-észter [(7) képletű vegyület] szintézise:

A reakciót víz kizárásával, vízmentes oldószerekben kell végezni, ellenkező esetben a termék epimerizálódik.

g Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe, 20 ml dimetil-formamid és 20 ml diklór-metán elegyéhez 10 ml metil-jodidot adtunk. Az elegyet 16 órán át állni hagytuk, majd szárazra pároltuk. A maradékhoz a metil-jodid nyomainak eltávolítására még kétszer 50 ml diklór-metánt adtunk, és a bepárlást megismételtük. A maradékot 300 ml dimetil-formamid és 300 ml diklór-metán elegyében oldottuk. Az oldatot 5 °C körüli hőmérsékletre hűtöttük, egy részletben 0,76 g 80%-os ásványolajos nátrium-hidrid-diszperziót adtunk hozzá, és 2 órán át ezen a hőmérsékleten kevertük. Ezután az elegyhez 50 ml telített vizes ammónium-klorid-oldatot adtunk, az elegyet szárazra pároltuk, és a maradékot víz és éter között megoszlattuk. Az éteres extraktumot vizes nátrium-klorid-oldattal mostuk, szárítottuk, majd bepároltuk. A gumiszerű maradékot zsugorított szűrőben gyorskromatografálva tisztítottuk, eluálószerként 25%-ról 100%-ra növekvő mennyiségű etil-acetátot tartalmazó etil-acetát/hexán elegyeket használtunk. 4,2 g (2S)-2-[(3R)-3-(N-/terc-butoxi-karbonil/-amino)2-oxo-pirrolidin-1 -il]-propionsav-metil-észtert kaptunk, a gumiszerű anyag állás közben kristályosodott. NMR-spektrum adatai (CDC1₃): 1,4 (s, 9H), 1,4 (d,

3H), 1,8 (m, 1H), 2,6 (m, 1H), 3,4 (m, 2H), 3,7 (m,

3H), 4,2 (m, 1H), 4,9 (q, 1H), 5,2 (széles s, 1H).

1.3. (2S)-2-[(3R)-3-(N-/9-fluorenil-metoxi-karbonil/-amino)-2-oxo-pirrolidin-l-il]-propionsav [azaz Fmoc-IIb-OH, (8) képletű vegyület] szintézise:

g (2S)-2-[(3R)-3-(N-/terc-butoxi-karbonil/-amino)2-oxo-pirrolidin-l-il]-propionsav-metil-észter, 60 ml ace14

HU 222 198 Bl tón, 40 ml víz és 24 ml tömény sósavoldat elegyét 3 órán át visszafolyatás közben forraltuk, majd az elegyet szárazra pároltuk. A maradékhoz vizet adtunk, és a bepárlást megismételtük. A maradékot 15 ml vízben oldottuk, és fölöslegben vett szilárd nátrium-hidrogén-karbonátot adtunk hozzá. Ezután az elegyhez 5,2 g 9-fluorenil-metil-szukcinimidil-karbonát és 30 ml aceton elegyét adtuk. Az elegyet 16 órán át kevertük, majd az oldószert lepároltuk, és a maradékot víz és éter között megoszlattuk. A vizes fázist elválasztottuk, sósavval 3 körüli pH-ra savanyítottuk, és diklór-metánnal extraháltuk. A szerves fázist vízzel mostuk, vízmentes magnézium-szulfát fölött szárítottuk, majd bepároltuk. A kapott fehér habot éterrel eldörzsölve kristályosítottuk. 4,2 g (2S)-2-[(3R)-N-/9fluorenil-metoxi-karbonil/-amino)-2-oxo-pirrolidin-1 il]-propionsavat kaptunk fehér szilárd anyagként, olvadáspont: 191-193 °C (bomlás).

NMR-spektrum adatai (CDC1₃): 1,4 (d, 3H), 2,0 (m,

1H), 2,6 (m, 1H), 3,4 (m, 2H), 4,2 (t, 1H), 4,4 (m,

3H), 4,9 (m, 1H), 5,8 (széles s, 1H), 7,4 (m, 4H),

7,6 (d, 2H), 7,7 (d, 2H).

1.4. Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (1. szekvencia) szintézise:

A peptidet Fmoc szilárd fázisú szintézissel állítottuk elő. Kiindulási anyagként alul szűrővel ellátott Bond Elut-csőbe (Varian, 15 ml) töltött 0,50 g (0,25 mmol) Fmoc Rink Amidé MBHA gyantát (Novabiochem-gyártmány) használtunk.

(a) A gyantát a védőcsoportok lehasítására kétszer 5 ml 20%-os dimetil-formamidos piperidinoldattal 1010 percig kezeltük, majd ötször 10 ml dimetil-formamiddal alaposan átmostuk.

(b) Az acilezéshez 353 mg (1 mmol) Fmoc-PipOH-t, 1,5 ml dimetil-formamidot, 165 mg (1 mmol) HOBT-t és 155 μΐ (1 mmol) diizopropil-karbodiimidet tartalmazó oldatot használtunk. A kapcsolást körülbelül 30 percig végeztük, majd a gyantát ötször 10 ml dimetil-formamiddal mostuk, és a gyanta kis mintáját Kaiser-teszttel [E. Kaiser és munkatársai: Anal. Biochem. 34, 595 (1970)] az acilezés teljessé válására vizsgáltuk.

A fenti (a) és (b) ciklust, azaz védőcsoport-eltávolítási és kapcsolási lépést

311 mg(l mmol) 394 mg (1 mmol) 339 mg (1 mmol) 468 mg (1 mmol) 311 mg (1 mmol) 311 mg(l mmol) 311 mg (1 mmol) 178 mg (1 mmol)

Fmoc-Ala-OH,

Fmoc-IIb-OH,

Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, végül 5-fenil-valeriánsav felhasználásával megismételtük. A kapcsolás időtartama minden esetben 30 perc körüli volt, és a gyanta kis részletét Kaiser-teszttel vizsgáltuk az acilezés befejeződésére. Az 5-fenil-valeriánsav esetén a Kaiser-teszt szerinti pozitív eredmény eléréséhez kétszeres kapcsolási időre volt szükség.

A peptidet 7,9 ml trifluor-ecetsav és 0,395 ml trietil-szilán elegyével lehasítottuk a gyantáról. 2 óra elteltével a gyantát körülbelül 150 ml diklór-metánnal mos10 tűk, és a kapott oldatot szárazra pároltuk. A kapott szilárd anyagot 25 ml éter és 25 ml víz között megoszlattuk, és az éteres fázist még kétszer 25 ml vízzel extraháltuk. A vizes fázisokat egyesítettük és fagyasztva szárítottuk.

A nyersterméket preparatív RP-HPLC-val (250 mmx22 mm méretű Vydac 218TP1022 oszlop) tisztítottuk. A nyersanyagot 5 ml 20%-os vizes acetonitril és 200 μΐ dimetil-formamid elegyében vittük fel az oszlopra. Eluálószerként 15%-ról gradiens szerint 35%ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,l%-os vizes TFA-oldat elegyet használtunk. Az eluálást 80 percig végeztük 10 ml/perc áramlási sebességgel. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítettük és fagyasztva szárítottuk. Fehér szilárd anyagként 84 mg (35%) Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂-t (1. szekvencia) kaptunk.

A terméket HPLC-analízissel, tömegspektroszkópiával és aminosavelemzéssel jellemeztük. RP-HPLC (4,6x250 mm méretű Vydac C18 218TP54 oszlop, eluálás 30 percig gradiens szerint 10%-ról 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%os vizes TFA-oldattal, áramlási sebesség: 1,0 ml/perc): 100%-os tisztaság, retenciós idő: 18,56 perc. Tömegspektrometria: m/e (ES+): 954,6 (MH+). Aminosavelemzés (savas hidrolízis 1% fenolt tartalmazó 6 M HC1oldattal 24 órán át 130 °C-on): (Alá+Ilb) 4,80, Val 1,11, Lys 1,07.

A Fmoc-Pip-OH-t E. Atherton és R. C. Sheppard NFmoc-L-metionin előállítására leírt módszeréhez [„Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach” 51. oldal (IRL Press, 1989)] hasonlóan állítottuk elő. Tömegspektrum: m/e (ES+) 352,2 (MH+). NMR-spektrum adatai (DMSO-d^): 1,3 (m, 2H), 1,7 (m, 2H), 2,5 (m, 2H), 2,9 (t, 2H), 3,7 (m, 1H), 4,2 (t,

1H), 4,4 (d, 2H), 7,4 (m, 4H), 7,7 (d, 2H), 7,9 (d,

2H).

2. példa

Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH₂ (2. szekvencia) előállítása és az izomerek szétválasztása

2.1. (RS)-2-Allil-N-(benzil-oxi-karbonil)-prolin [(9) képletű vegyület] szintézise:

27.5 ml 2 mólos lítium-diizopropil-amid-oldat (oldószer: hexán/THF) és 100 ml THF elegyébe -78 °Con, nitrogénatmoszférában 13 g N-(benzil-oxi-karbonil)-prolin-metil-észter és 20 ml THF elegyét csepegtettük. Az elegyet 30 percig kevertük, majd 5,5 ml allil-jodidot csepegtettünk be. Az elegyet még 30 percig kevertük, ezután szobahőmérsékletre hagytuk melegedni. Az elegyet 200 ml vizes ammónium-klorid-oldatba öntöttük, és kétszer 200 ml éterrel extraháltuk. Az éteres fázist bepároltuk. A maradékot szilikagélen kromatografálva tisztítottuk, eluálószerként gradiens szerint 20%ra növekvő hexántartalmú etil-acetát/hexán elegyeket használtunk. A megfelelő frakciókat szárazra pároltuk. Olaj formájában 9 g (RS)-2-allil-N-(benzil-oxi-karbonil)-prolin-metil-észtert kaptunk.

8.5 g így kapott anyag 40 ml metanollal készített oldatához 4,5 g nátrium-hidroxid 20 ml vízzel készített olló

HU 222 198 Β1 datát adtuk, és az elegyet 60 percig visszafolyatás közben forraltuk. Az elegy pH-ját tömény vizes sósavoldattal 7-re állítottuk, és a metanolt lepároltuk. A kapott vizes maradék pH-ját 3-ra állítottuk, és az elegyet kétszer 50 ml éterrel extraháltuk. Az éteres extraktumokat egyesítettük és bepároltuk. Gumiszerű anyagként (RS)-2-allil-N-(benzil-oxi-karbonil)-prolint kaptunk. NMR-spektrum adatai (DMSO-dg, 373 K): 1,9 (m,

2H), 2,1 (m, 2H), 2,6 (q, 1H), 2,9 (q, 1H), 3,4 (m,

1H), 3,6 (m, 1H), 5,0 (m, 4H), 5,75 (m, 1H), 7,3 (m, 5H).

2.2. [(RS)-2-Allil-N-(benzil-oxi-karbonil)-prolil](S)-alanin-metil-észter [(10) képletű vegyület] szintézise:

6,5 g (RS)-2-allil-N-(benzil-oxi-karbonil)-prolin és 30 ml dimetil-formamid elegyéhez 7,7 g HOBT-t, 6,6 g N-metil-morfolint, 4,5 g L-alanin-metil-észter-hidrokloridot és 5,7 g l-(3-/dimetil-amino/-propil)-3-etil-karbodiimidet adtunk. Az elegyet 18 órán át kevertük, majd bepároltuk. A maradékot éter és víz között megoszlattuk. Az elegyből kiszűrtük a HOBT-t, és a szerves fázist elkülönítettük. A szerves fázist bepároltuk, és a maradékot szilikagélen kromatografálva tisztítottuk. Eluálószerként 20%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő etil-acetát-tartalmú etil-acetát/hexán elegyeket használtunk. A megfelelő eluátumfrakciókat egyesítettük és szárazra pároltuk. 7 g [(RS)-2-allil-N-(benzil-oxi-karbonil)-prolil]-(S)-alanin-metil-észtert kaptunk. NMR-spektrum adatai (DMSO-d^, 373 K): 1,25 és 1,3 (2d, 3H), 1,75 (m, 2H), 2,2 (m, 2H), 2,65 (m, 1H),

2,9 (m, 1H), 3,4 (m, 1H), 3,65 (2s, 3H), 3,7 (m,

1H), 4,3 (2q, 1H), 5,0 (m, 4H), 5,7 (m, 1H), 7,3 (m,

5H), 7,4 és 7,5 (széles s, 1H). (A csúcskettőződések annak tulajdoníthatók, hogy a termék diasztereoizomerek elegye.)

2.3. (S)-2-[l-(Benzil-oxi-karbonil)-6-oxo-l,7-diaza-spiro[4.4]non-7-il]-propionsav-metil-észter [(11) képletű vegyület] szintézise:

1,45 g [(RS)-2-allil-N-(benzil-oxi-karbonil)-prolil](S)-alanin-metil-észter, 30 ml metanol és 20 ml víz elegyéhez 1,5 ml 4%-os vizes ozmium-tetroxid-oldatot adtunk. Az elegyet 10 percig argonatmoszférában kevertük, majd részletekben 2,45 g nátrium-peqodátot adtunk hozzá. Az elegyet 2 órán át kevertük, ezután 100 ml vizet adtunk hozzá, és az elegyet kétszer 70 ml etil-acetáttal extraháltuk. Az extraktumokat egyesítettük, szárítottuk, majd bepároltuk. A kapott 1,4 g gumiszerű anyagot 30 ml diklór-metánban oldottuk, és az oldatba 0,65 g trietil-szilánt, majd 4 g trifluor-ecetsavat csepegtettünk. Az elegyet 3 órán át kevertük, ezután bepároltuk, és a maradékot vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat és éter között megoszlattuk. Az éteres extraktumot elválasztottuk és szárazra pároltuk. A maradékot szilikagélen kromatografálva tisztítottuk, eluálószerként 25%-ról gradiens szerint 100%-ra növekvő etilacetát tartalmú etil-acetát/hexán elegyeket használtunk. A megfelelő frakciókat egyesítettük és szárazra pároltuk. 0,8 g (S)-2-[l-(benzil-oxi-karbonil)-6-oxo-l,7-diaza-spiro[4.4]non-7-il]-propionsav-metil-észtert kaptunk.

NMR-spektrum adatai (DMSO-d₆, 373 K): 1,25 és

1,35 (2d, 3H), 1,95 (m, 6H), 3,1-3,5 (m, 4H),

3,6 és 3,65 (2s, 3H), 4,5 és 4,65 (2q, 1H), 5,05 (m,

2H), 7,25 (m, 5H). (A csúcskettőződések annak tulajdoníthatók, hogy a tennék diasztereoizomerek elegye.)

2.4. (S)-2-(6-Oxo-l,7-diaza-spiro[4.4]non-7-il)-propionsav [azaz H-III-OH, (12) képletű vegyület] szintézise:

3,3 g (s)-[l-(benzil-oxi-karbonil)-6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7-il]-propionsav-metil-észter, 40 ml metanol és 40 ml víz elegyéhez 2,5 g kálium-karbonátot adtunk, és az elegyet 10 órán át szobahőmérsékleten kevertük. Az elegy pH-ját tömény vizes sósavoldattal 5 körüli értékre állítottuk, majd az elegyet szárazra pároltuk. A maradékot 40 ml vízben oldottuk, és az oldatot tömény vizes sósavoldattal pH 3-ra savanyítottuk. A savas elegyet kétszer 50 ml diklór-metánnal extraháltuk. Az extraktumokat egyesítettük, vízmentes magnézium-szulfát fölött szárítottuk, majd bepároltuk. A kapott 2,8 g habot 20 ml metanolban oldottuk, és az oldathoz 0,7 g ciklohexént, majd 0,5 g 10%-os Pd/C katalizátort adtunk. Az elegyet 2 órán át visszafolyatás közben forraltuk, ezután lehűtöttük, szűrtük, és a szűrletet bepároltuk. Hab formájában 1,9 g (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7-il)-propionsavat kaptunk. NMR-spektrum adatai (DMSO-de): 1,25 és 1,3 (2s,

3H), 1,8 (m, 4H), 2,0 (m, 2H), 3,0 (m, 2H), 3,3 (m,

2H), 4,5 (m, 1H). (A csúcskettőződések annak tulajdoníthatók, hogy a termék diasztereoizomerek elegye·)

2.5. (S)-2-[l-(9-Fluorenil-metoxi-karbonil)-6-oxol,7-diaza-spiro[4.4]non-7-il]-propionsav [azaz FmocIII-OH, (13) képletű vegyület] szintézise:

0,42 g (S)-2-(6-oxo-l,7-diaza-spiro[4.4]non-7-il)propionsav és 2 ml víz elegyéhez fölöslegben vett szilárd nátrium-hidrogén-karbonátot, majd 0,7 g 9-fluorenil-metil-szukcinimidil-karbonát 3 ml acetonnal készített oldatát adtuk. Az elegyet 18 órán át kevertük. Ezután az elegyet 10 ml vízhez adtuk, 10 ml éterrel extraháltuk, és a vizes fázist elválasztottuk. (Az éteres extraktumokat elöntöttük.) A vizes fázist tömény vizes sósavoldattal kb. pH 3-ra savanyítottuk, majd kétszer 10 ml diklór-metánnal extraháltuk. Az extraktumokat egyesítettük, vízmentes magnézium-szulfát fölött szárítottuk, és bepároltuk. Fehér hab formájában 0,62 g (S)[1 -(9-fluorenil-metoxi-karbonil)-6-oxo-1,7-diaza-spiro[4.4]non-7-il]-propionsavat kaptunk.

NMR-spektrum adatai (DMSO-dg, 373 K): 1,6-2,0 (m, 6H), 3,05 (m, 1H), 3,2-3,45 (m, 3H), 4,2-4,4 (m, 1H), 4,5 (m, 1H), 6,2 (s, 2H), 7,35 (m, 4H), 7,8 (m, 4H). (A csúcskettőződések annak tulajdoníthatók, hogy a termék diasztereoizomerek elegye.)

2.6. Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH₂ (2. számú szekvencia) szintézise és az izomerek szétválasztása:

A szintézis első részét az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan végeztük, de Fmoc-IIb-OH helyett FmocIII-OH-t használtunk. Az acilezések során a savakat a következő összetételű elegyben aktiváltuk: 1 mmol sav,

HU 222 198 Β1

I mmol HBTU, 2 mmol diizopropil-etil-amin, 4 mmol DMF. Az elvégzett Kaiser-tesztek szerint az összes kapcsolás 45 percnél rövidebb idő alatt teljessé vált. Ezzel a módszerrel Fmoc-Val-III-Ala-Pip-NH-gyanta-terméket alakítottunk ki. Ezután a pepiidet hordozó gyantát ABI 431 típusú automata peptidszintetizátorba helyeztük, és a HBTU/HOBT-módszerrel való egyedi acilezésekre a gyártó által ajánlott körülmények között a helyes sorrendben hozzákapcsoltuk a további aminosavmaradékokat. A következőképpen jártunk el: A védőcsoport lehasítása után a gyantát tízszer 10-20 ml DMF-dal mostuk. A karbonsavat a gyantára való felvitel előtt DMF-ben mintegy

II percig aktiváltuk 1 mmol karbonsavra vonatkoztatva 1 ekvivalens HBTU, 1 ekvivalens HOBT és 2 ekvivalens DIPEA elegyével. Az acilezést körülbelül 60 percig végeztük, majd a gyantát tízszer 10-20 ml DMF-dal mostuk. A Fmoc lehasítására minden lépésben 20%-os DMF-os piperidinoldatot használtunk, a gyantát kétszer 10 percig kezeltük 5-5 ml oldattal. Az egyes lehasítási lépések után a gyantát ötször 10 ml DMF-dal alaposan mostuk.

Végül a gyantát 1,5 órán át 10 ml 90:5:5 térfogatarányú trifluor-ecetsav (TFA)/trietil-szilán (TES)/víz eleggyel kezelve lehasítottuk a peptidet a gyantáról. A gyantát kiszűrtük, TFA-val alaposan mostuk, és a szűrletet forgó bepárlókészüléken szárazra pároltuk. A maradékot éténél eldörzsöltük. Phv-Ala-Ala-AlaLys-Val-III-Ala-Pip-NH₂-t (2. szekvencia) kaptunk, ami Vydac 218TP54 Cl8 oszlopon végzett RP-HPLC szerint két izomer 52:48 arányú elegye volt. Az oszlopot 20%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő acetonitriltartalmú acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldat eleggyel 20 percig eluáltuk, az áramlási sebesség 1 ml/perc volt. A polárisabb diasztereoizomer 12,5 perc, a kevésbé poláris diasztereoizomer 16,5 perc retenciós idővel oldódott le az oszlopról. A kapott izomereket az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint preparatív RP-HPCL-val tovább tisztítottuk. Az így elkülönített két komponens mindegyike RP-HPLC szerint 95%-osnál nagyobb tisztaságú volt. Az „A” és „B” vizsgálatban a polárisabb diasztereoizomer a kevésbé polárisnál nagyobb hatékonyságúnak bizonyult.

A polárisabb diasztereoizomer jellemzői: RP-HPLC retenciós idő (a fenti körülmények között eluálva):

12,3 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 994,5 (MH+), aminosavelemzés: Alá 3,99, Lys 1,20, Val 0,73.

3. példa

Phv-Ala-Lys-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (3. szekvencia) előállítása

A szintézist manuálisan végeztük az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan úgy, hogy a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. A terméket az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint tisztítottuk, és jellemzőit is az ott közöltek szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RP-HPLC (25%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 20 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 5,56 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 926,5 (MH+), aminosavelemzés: (Ala+IIb)

5,87, Lys 1,12.

4. példa

Phv-Ile-Ala-Ala-Arg-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (4. szekvencia) előállítása

A szintézist manuálisan végeztük az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan úgy, hogy a Fmoc-Papa-OH-t (Fmoc-Pip-OH helyett felhasznált vegyület), a Fmocvédett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. A terméket az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint tisztítottuk, és jellemzőit is az ott közöltek szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RPHPLC (20%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 17,08 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1048,7 (MH+), aminosavelemzés: Arg 0,98, Alá 3,00, Ilb 1,27, Thr 0,86, Ile 0,88.

A Fmoc-Papa-OH-t az E. Atherton és R. C. Sheppard által [„Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach” 51. oldal (IRL Press, 1989)] N-Fmoc-L-metionin előállítására közölt módszerhez hasonlóan állítottuk elő. A Fmoc-Papa-OH jellemzői: tömegspektrum: m/e (ES-) 372,1 (M-H)-, NMR-spektrum adatai (DMSO-d₆): 3,5 (s, 2H), 4,25 (t, 1H), 4,5 (d, 2H), 7,1 (d, 2H), 7,4 (m, 6H), 7,75 (d, 2H), 7,9 (d, 2H), 9,6 (s, 1H).

5. példa

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (5. szekvencia) előállítása

A szintézist manuálisan végeztük az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan úgy, hogy a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. A terméket az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint RP-HPLC-val tisztítottuk (15%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 60 percig 10 ml/perc sebességgel eluálva), és jellemzőit is az ott közöltek szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 18,28 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 982,5 (MH⁺), aminosavelemzés: Arg 1,12, (Ala+IIb) 3,8, Val 1,12.

6. példa

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (6. szekvencia) előállítása

A szintézis első részét az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint manuálisan végeztük úgy, hogy a FmocPapa-OH-t (Fmoc-Pip-OH helyett használt vegyület), a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. Az így kapott Fmoc17

HU 222 198 Β1

Thr(OBut)-IIb-Ala-Papa-NH-gyanta-terméket ACT 357 típusú automata peptidszintetizátorba helyeztük, és a HBTU/HOBT-módszerrel való egyedi acilezésekre a gyártó által ajánlott körülmények között a helyes sorrendben hozzákapcsoltuk a további aminosavmaradékokat. Ezután a peptidet az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint lehasítottuk a gyantáról, majd az ott leírt RPHPLC-val tisztítottuk, és jellemzőit is az ott közöltek szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 18,21 perc, tömegspektrum: m/e (ES+): 1006,4 (MH⁺), aminosavelemzés: Arg 1,10, Ala 3,88, Ilb 1,04, Thr 0,95.

7. példa

Phv-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Papa-NH₂ (7. szekvencia) előállítása

A szintézis első részét az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint manuálisan végeztük úgy, hogy a FmocPapa-OH-t (Fmoc-Pip-OH helyett használt vegyület), a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. Az így kapott Fmoc-Val-IIb-AlaPapa-NH-gyanta-terméket ABI 431 típusú automata peptidszintetizátorba helyeztük, és a HBTU/HOBT módszerrel való egyedi acilezésekre a gyártó által ajánlott körülmények között a helyes sorrendben hozzákapcsoltuk a további aminosavmaradékokat. Ezután a peptidet a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint lehasítottuk a gyantáról, majd az ott leírt RP-HPLC-val tisztítottuk. A peptid jellemzőit az 1. példa 4. pontjában közöltek szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RPHPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 20,87 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1004,6 (MH⁺), aminosavelemzés: Arg 0,96, (Ala+IIb) 5,05, Val 0,97.

8. példa

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg- Val-Ilb-Gly-Papa-NH₂ (8. szekvencia) előállítása

A szintézis első részét az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint manuálisan végeztük úgy, hogy a FmocPapa-OH-t (Fmoc-Pip-OH helyett használt vegyület), a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. Az így kapott Fmoc-Val-Ilb-GlyPapa-NH-gyanta-terméket ABI 431 típusú automata peptidszintetizátorba helyeztük, és a HBTU/HOBTmódszerrel való egyedi acilezésekre a gyártó által ajánlott körülmények között a helyes sorrendben hozzákapcsoltuk a további aminosavmaradékokat. Ezután a peptidet a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint lehasítottuk a gyantáról, majd az ott leírt RP-HPLC-val tisztítottuk. A peptid jellemzőit az 1. példa 4. pontjában közöltek szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 18,12 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 538,4 (MH⁺), aminosavelemzés: Arg 0,92, Ala

2,16, (Gly+IIb) 2,12, Val 0,88.

9. példa

Phv-Ala-Ile-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (9. szekvencia) előállítása

A szintézist manuálisan végeztük az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan úgy, hogy a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. A terméket az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint tisztítottuk, és jellemzőit is az ott közöltek szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RPHPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 23,4 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1024,6 (MH⁺), aminosavelemzés: Arg 1,15, (Ala+IIb) 3,88, Val 0,96, Ile 1,02.

10. példa

Phv-Ala-Arg-Ala-His- Val-IIb-Ala-Papa-NH₂ (10. szekvencia) előállítása

A szintézis első részét az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint manuálisan végeztük úgy, hogy a FmocPapa-OH-t (Fmoc-Pip-OH helyett használt vegyület), a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. Az így kapott Fmoc-Val-IIb-AlaPapa-NH-gyanta-terméket ABI 431 típusú automata peptidszintetizátorba helyeztük, és a HBTU/HOBT módszerrel való egyedi acilezésekre a gyártó által ajánlott körülmények között a helyes sorrendben hozzákapcsoltuk a további aminosavmaradékokat. Ezután a peptidet a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint lehasítottuk a gyantáról, majd az ott leírt RP-HPLC-val tisztítottuk. A peptid jellemzőit az 1. példa 4. pontjában közöltek szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RPHPLC (20%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 18,8 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1070,6 (MH+), aminosavelemzés: Arg 1,02, (Ala+IIb) 4,12, Val 0,90, His 0,95.

11. példa

Phv-Ala-Ala-Asn-Arg- Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (11. szekvencia) előállítása

A szintézis első részét az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint manuálisan végeztük úgy, hogy a Fmocvédett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. Az így kapott Fmoc-Ilb-Ala-PipNH-gyanta-terméket ABI 431 típusú automata peptidszintetizátorba helyeztük, és a HBTU/HOBT módszerrel való egyedi acilezésekre a gyártó által ajánlott körülmények között a helyes sorrendben hozzákapcsoltuk a

HU 222 198 Bl további aminosavmaradékokat. Ezután a peptidet a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint lehasítottuk a gyantáról, majd az ott leírt RP-HPLC-val tisztítottuk. A peptid jellemzőit az 1. példa 4. pontjában közöltek szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RPHPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 17,66 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1025,5 (MH+), aminosavelemzés: Arg 1,04, Alá 2,94, Val 0,95, Asp 1,05.

12. példa

Phv-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (12. szekvencia) előállítása

A szintézis első részét ABI 431 típusú automata peptidszintetizátorban végeztük a 2. példa 6. lépésében leírtak szerint úgy, hogy a Fmoc-védett aminosavakat a megfelelő sorrendben egymáshoz kapcsoltuk. A kapott Fmoc-Ala-Ala-Pip-NH-gyanta-terméken manuálisan folytattuk a szintézist az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint, majd a terméket az ott leírtak szerint preparatív RP-HPLC-val tisztítottuk. A peptid jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 16,68 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 954,6 (MH⁺), aminosavelemzés: Arg 1,09, (Ala+IIb) 5,88.

13. példa

Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-Ilb-GlyNH(CH₂)₃NH-C(=NH)-NH₂ (14. szekvencia) előállítása (a) Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIbGly-NH(CH₂)₃NH₂ (13. szekvencia) előállítása:

0,4 g 2-klór-tritil-klorid-gyantát (körülbelül 0,25 mmol lecserélhető klórt tartalmaz) 4 ml DMF-ban 1 órán át szobahőmérsékleten 0,42 ml 1,3-diamino-propánnal reagáltatva (3-amino-propil)-amino-gyantává alakítottunk. A gyantát DMF-dal alaposan mostuk, majd Applied Biosystems 430A típusú peptidszintetizátorba töltöttük, és a gyártó által ajánlott körülmények között sorban hozzákapcsoltuk a megfelelő védett aminosavakat, miközben lépésenként lehasítottuk a védőcsoportokat. Ezután a gyantát metanollal mostuk, majd szárítottuk. Az így kapott 0,722 g tömegű peptidtartalmú gyantáról a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint lehasítottuk a peptidet, majd az ott közöltek szerint RP-HPLC-val tisztítottuk. Fagyasztva szárítás után 329 mg Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIbGly-NH(CH₂)₃NH₂-t (13. szekvencia) kaptunk. A termékjellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 40 percig 1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 17,76 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 916,5 (MH+).

(b) Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIbGly-NH(CH₂)₃NH-C(=NH)-NH₂ (14. szekvencia) előállítása:

329 mg Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-GlyNH(CH₂)₃NH₂ (13. szekvencia) 5 ml víz és 5 ml acetonitril elegyével készített oldatához 132 mg (3 ekvivalens) lH-pirazol-l-karboxamidin-hidrokloridot és 52 μΐ (1 ekvivalens) diizopropil-etil-amint adtunk. Az elegyet 4 napig szobahőmérsékleten kevertük, majd preparatív RP-HPLC-val tisztítottuk. A kapott termék jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. 178 mg Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIbGly-NH(CH₂)₃NH-C(=NH)-NH₂-t (14. szekvencia) kaptunk. RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldat eleggyel 40 percig

1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 18,42 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 958,5 (MH⁺), aminosavelemzés: Thr 0,86, Gly 0,90, Alá 3,20, Arg 1,00.

14. példa

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Gly-NHEt (15. szekvencia) előállítása

A szintézis első részét Applied Biosystems 430A típusú peptidszintetizátorban végeztük. 0,54 g (0,25 mmol) Boc-Gly-O-benzil-észter-gyantából (Merrifield-gyanta) indultunk ki, amire a gyártó által ajánlott körülmények között sorban rákapcsoltuk a megfelelő aminosavakat, a védőcsoportok lépésenkénti eltávolításával. A gyantát metanollal mostuk, szárítottuk, majd a kapott 871 mg gyantát 10 ml DMF és 10 ml 2 mólos metanolos etilamin-oldat elegyéhez adtuk, és az elegyet 7 napig szobahőmérsékleten enyhén kevertük. RP-HPLC-val kimutattuk, hogy a metil-észter gyorsan oldatba megy, majd lassan a kissé hidrofilebb jellegű N-etil-amiddá alakul. Az elegyet szűrtük, a gyantát DMF-dal mostuk, és a szűrletet bepároltuk. A nyers, védett peptidet N-etil-amidja formájában kaptuk. A pepiidről 90:5:5 térfogatarányú TFA/TES/víz eleggyel lehasítottuk a védőcsoportot, majd a 2. példa 6. pontjában leírtakhoz hasonlóan preparatív RP-HPLC-val tisztítottuk. 168 mg Phv-Ala-ArgAla-Arg-Thr-IIb-Gly-NHEt-ot (15. szekvencia) kaptunk. A termékjellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/ 0,1%-os vizes TFA-oldattal 40 percig 1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 17,85 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 972,5 (MH+), aminosavelemzés: Thr 0,83, Gly 1,03, Alá 2,17, Ilb 0,9, Arg 2,00.

75. és 16. példa

Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (16. szekvencia) és Phv-Gap(Me)₄-Ala-Ala-Ala-Thr-llbAla-Papa-NH₂ (16. szekvencia) előállítása (a) Phv-Dap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (36. szekvencia) előállítása:

A szintézist Applied Biosystems 430A típusú automata peptidszintetizátorban végeztük. 0,25 mmol Fmoc19

HU 222 198 Β1

Rink Amidé gyantából indultunk ki, amire a gyártó által ajánlott körülmények között sorban rákapcsoltuk a megfelelő aminosavakat, a védőcsoportok lépésenkénti eltávolításával. A Dap-maradékot Fmoc-Dap(Boc)-OH felhasználásával építettük be a szintézis megfelelő szakaszában. A peptid felépítése után a gyantát szárítottuk. 1,292 g tömegű gyantát kaptunk, ami 792 mg tömegnövekedést jelentett. A peptidet lehasítottuk a gyantáról, és preparatív RP-HPLC-val tisztítottuk. Ezeket a műveleteket az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy 2,54 cm belső átmérőjű Dynamax 60A oszlopot használtunk, és az eluálást 10%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal végeztük 60 percig, 12 ml/perc áramlási sebességgel. 304 mg Phv-DapAla-Ala-Ala-Thr-Ilb-Ala-Papa-NH₂-t (36. szekvencia) kaptunk. A peptid jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A peptid jellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 40 percig 1,2 ml/perc áramlási sebességgel eluálva) retenciós idő: 24,5 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 937,1 (MH+).

(b) Az (a) lépésben kapott Dap-peptidet 7 ml víz és 8 ml acetonitril elegyében oldottuk, 130 mg 1-H-pirazol1-karboxamidin-hidrokloridot és 53 μΐ diizopropil-etilamint adtunk hozzá, és a reakciót szobahőmérsékleten 1 héten át folytattuk. Az ekkor végzett RP-HPLCvizsgálat szerint csak az anyag 40%-a alakult át a megfelelő Gap-peptiddé. A két vegyületet RP-HPLC-val nem sikerült teljesen szétválasztani egymástól. Ezért az elegyet 50 ml DMF-ban 87 mg HBTU-val és 50 μΐ diizopropil-etil-aminnal 16 órán át reagáltatva a változatlan Dappeptidet a megfelelő tetrametil-guanidin (GapMe₄) peptiddé alakítottuk. Az így kapott vegyület megnövekedett hidrofobicitása révén az (a) pontban leírt HPLC-val egyszerűbben elválasztható volt a Gap-peptidtől. A kromatografálást az (a) pontban leírtak szerint elvégezve a következő anyagokat kaptuk, amelyek jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg:

(i) 80 mg Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-PapaNH₂ (16. szekvencia). RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 40 percig

1.2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő:

26.2 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 978,5 (MH+), aminosavelemzés: Thr 0,90, Alá 4,05, Ilb kimutatható, a Trp-helyzetben Gap-csúcs.

(ii) 122 mg Phv-GapMe₄-Ala-Ala-Ala-Thr-IIbAla-Papa-NH₂ (17. szekvencia). RP-HPLC (az /i/ pontban leírtak szerint eluálva) retenciós idő: 28,4 perc, tömegspektrum: mZe (ES+) 1034,6 (MH⁺), aminosavelemzés: Thr 0,90, Alá 4,11, Ilb kimutatható, a Trphelyzetben GapMe₄-csúcs.

17. példa

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIbGly-NHCH₂CHj-morfolin (18. szekvencia) előállítása

A peptidet védettfragmens-módszerrel állítottuk elő. Applied Biosystems 430A automata peptidszintetizátorban 1 g (1 mmol) Fmoc-Gly-O-klór-tritil-gyantát állítottunk elő úgy, hogy 1 g (1 mmol) 2-klór-tritil-klorid-gyantát 10 ml DMF-ban, 4 mmol N,N-diizopropiletil-amín jelenlétében 2 mmol Fmoc-Gly-OH-val kapcsoltunk, majd ezt a 2. példa 6. pontjában leírtakhoz hasonlóan kettős kapcsolással meghosszabbítottuk. 2,15 g védett peptid/gyanta együttest kaptunk, amit a peptid lehasítása végett szobahőmérsékleten, 1 órán át 30 ml diklór-metán, 5 ml ecetsav és 5 ml trifluor-etanol elegyével kezeltünk. A gyantát kiszűrtük, és diklór-metán és ecetsav elegyével mostuk. A szűrletből lepároltuk az oldószert, a maradékhoz vizes acetonitrilt adtunk, és az elegyet fagyasztva szárítottuk. 1,23 g védett peptid-karbonsavat kaptunk, amelynek jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. RP-HPLC (20%-ról gradiens szerint 80%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFAoldattal 40 percig 1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 26,2 perc.

235 mg (0,2 mmol) így kapott védett peptid-karbonsavat 10 ml DMF-ban, 76 mg (1 ekvivalens) HBTU és 70 μΐ diizopropil-etil-amin jelenlétében 27 μΐ (1 ekvivalens) 4-(2-amino-etil)-morfolinhoz kapcsoltunk. Az oldószert lepároltuk, a védőcsoportokat 90%-os TFA/víz eleggyel lehasítottuk, és a terméket tisztítottuk. Ezeket a műveleteket az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint végeztük. 150 mg tiszta amidot kaptunk, aminek jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFAoldattal 40 percig 1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 18,6 perc, tömegspektrum: mZe (ES+) 972,8 (MH+), aminosavelemzés: Thr 0,6, Gly 1,02, Alá 2,94, Ilb 0,9, Arg 1,00.

18. példa

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIbGly-N(CH₂CH2)₂NCH₂CH₂O-CH₂CH₂OH (19. szekvencia) előállítása

A 17. példában leírtak szerint eljárva, de 4-(2-amino-etil)-morfolin helyett 4-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etil]-piperazint használva állítottuk elő a cím szerinti vegyületet, amelynek jellemzőit az 1. példa 4. pontjában közöltek szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RP-HPLC (a 17. példában leírtak szerint eluálva) retenciós idő: 20,5 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1016,8 (MH+), aminosavelemzés: Thr 0,89, Gly 1,02, Alá 2,98, Ilb 1,05, Arg 1,00.

19. példa

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-PapeNHC(=NH)NH₂ (20. szekvencia) előállítása

A 17. példában leírtak szerint eljárva, de 4-(2-amino-etil)-morfolin helyett 4-(2-guanidino-etil)-anilint használva állítottuk elő a cím szerinti vegyületet. Ezt a vegyületet preparatív HPLC-val tisztítottuk az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint, azzal a különbséggel, hogy 2,54 cm belső átmérőjű Vydac 201HS1022 oszlopot használtunk, és az eluálást 10%-ról gradiens szerint

HU 222 198 Bl

35%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,l%-os vizes TFA-oldattal 60 percig 12 ml/perc sebességgel végeztük. A peptid jellemzői a következők: RP-HPLC (a 17. példában leírtak szerint eluálva) retenciós idő: 24,2 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1021,1 (MH⁺), aminosavelemzés: Thr 0,8, Gly 0,95, Alá 2,86, Arg 1,00, Ilb kimutatható.

A 4-(2-guanidino-etil)-anilin-dihidrokloridot a következőképpen állítottuk elő:

1,013 g (5 mmol) 4-nitro-fenil-etil-amin-hidroklorid, 0,733 g (5 mmol) lH-pirazol-l-karboxamidinhidroklorid, 0,88 ml (5 mmol) diizopropil-etil-amin, 10 ml acetonitril és 10 ml víz elegyét 16 órán át szobahőmérsékleten kevertük. Az elegyet két részletben preparatív RP-HPLC-val tisztítottuk. 2,54 cm belső átmérőjű Dynamax 60A Cl 8 oszlopot használtunk, az eluálószer acetonitril és 0,1% TFA-t tartalmazó víz volt. A kapott tiszta 4-nitro-fenetil-guanidint 100 ml vízben oldottuk, az oldathoz 1 csepp tömény vizes sósavoldatot, majd 100 mg 5%-os palládium/csontszén katalizátort adtunk, és az oldatba 4 órán át hidrogént buborékoltattunk. A katalizátort kiszűrtük, vízzel mostuk, és a szűrletből lepároltuk az illékony anyagokat. A maradékot kálium-hidroxid-pasztillák fölött szárítottuk. Barna hab formájában 0,984 g 4-(2-guanidino-etil)-anilin-dihidrokloridot kaptunk.

20. példa

Phv-Ala-Ala-Ala-Arg-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (21. szekvencia) előállítása

A szintézis első részét a 2. példa 6. pontjában leírtakhoz hasonlóan, manuálisan végeztük. Aktivátorként HBTU/DIPEA elegyet használva a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk egymással, miközben a védőcsoportokat lépésenként lehasítottuk. A kapott Fmoc-IIb-AlaPapa-NH-gyanta-terméket ABI 431 típusú automata peptidszintetizátorba helyeztük, és az egyedi acilezések HBTU/HOBT-módszeirel való végrehajtásának a gyártó által ajánlott körülményei között hozzákapcsoltuk a még hiányzó aminosavakat. Ezután a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint lehasítottuk a peptidet a gyantáról, majd tisztítottuk. A peptid jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A peptid jellemzői a következők: RP-HPLC (20%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%os vizes TFA-oldattal 20 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 11,57 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1006,4 (MH+), 503,8 (M+2H++), 514,8 (M+H++Na⁺), aminosavelemzés: Alá 4,19, Arg 0,91, Thr 0,74.

21. példa

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-lIb-Azgly-Papa-NH₂ (22. szekvencia) előállítása

A szintézis első részét manuálisan végeztük a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint úgy, hogy HBTU/DIPEA aktivátor jelenlétében a helyes sorrendben összekapcsoltuk a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t, miközben a védőcsoportokat lépésenként lehasítottuk.

Kivételt képezett az Azgly-maradék beépítése, amelynek során a gyantát DMF-ban, 0,25 ekvivalens HOBT jelenlétében, 50 °C-on 4 órán át Fmoc-Azgly-OSu-val (az 518 655 számú európai szabadalmi leírásban közöltek szerint kapott vegyület) kapcsoltuk. A kapott FmocIlb-Azgly-Papa-NH-gyanta-terméket ABI 431 automata peptidszintetizátorba helyeztük, és a HBTZ/HOBTmódszerrel való egyedi acilezésekre a gyártó által ajánlott körülmények között hozzákapcsoltuk a többi aminosavmaradékot. Ezután a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint lehasítottuk a gyantáról a peptidet és tisztítottuk. A peptid jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RP-HPLC (15%-ról gradiens szerint 35%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,l%-os vizes TFA-oldattal 20 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 8,10 perc, tömegspektrum: m/e (ES-) 1076,4 (MHj, aminosavelemzés: Alá 2,10, Arg 2,00, Thr 0,99.

22. példa

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-NH₂ (23. szekvencia) előállítása

A 21. példában leírtakhoz hasonlóan jártunk el. A szintézis első részét manuálisan végeztük, HBTU/DIPEA aktivátort használva. Az így kapott Fmoc-IIb-Azgly-NH-gyanta-terméket ABI 430A típusú automata peptidszintetizátorba töltöttük, és a HBTU/HOBT-módszerrel való egyedi acilezésre a gyártó által ajánlott körülmények között hozzákapcsoltuk a többi aminosavmaradékot. Ezután a peptidet a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint lehasítottuk a gyantáról, majd RP-HPLC-val tisztítottuk. A peptid jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A peptid jellemzői a következők: RP-HPLC (20%-ról gradiens szerint 35%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,l%-os vizes TFA-oldattal 20 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 7,26 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 945,6 (MH+), 473,4 (M+2H++), aminosavelemzés: Alá 2,08, Arg 2,00, Thr 0,78.

23. példa

Phv-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH₂ (24. szekvencia) előállítása

A 2. példa 6. pontjában leírtakkal analóg módon jártunk el, azzal a különbséggel, hogy a teljes peptidegyüttest manuálisan alakítottuk ki úgy, hogy HBTU/DIPEA aktivátort felhasználva a helyes sorrendben összekapcsoltuk egymással a Fmoc-Papa-OH-t, a Fmoc-AlaOH-t, a Fmoc-Arg(Pbf)-OH-t, a Fmoc-IIb-OH-t és az 5-fenil-valeriánsavat. A peptidet a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint hasítottuk le a gyantáról. A peptidet az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint preparatív RP-HPLCval tisztítottuk, az eluálást 15%-ról gradiens szerint 30%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,l%-os vizes TFA-oldattal végeztük 90 percig, 10 ml/perc áramlási sebességgel. A termékjellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC

HU 222 198 Bl (15%-ról gradiens szerint 30%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFAoldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 20,02 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1061,6 (MH+), 531,4 (M+2H⁺⁺), aminosavelemzés: Ala 4,16, Arg 2,00, Ilb kimutatható.

24. példa

3-(2-Ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-propionil-Ala-ArgAla-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH₂ (25. szekvencia) előállítása

A szintézist manuálisan végeztük az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan úgy, hogy a Fmoc-PapaOH-t (a Fmoc-Pip-OH helyett használt vegyület), a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. A szintézisben 5-fenil-valeriánsav helyett 3-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-propionsavat használtunk. A terméket az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan preparatív RP-HPLC-val tisztítottuk, az eluálást 15%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal végeztük 60 percig, 10 ml/perc sebességgel. A termék jellemzőit is az 1. példa 4. pontjában közöltek szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC (15%-ról gradiens szerint 50%ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 17,58 perc, tömegspektrum: m/e(ES+) 1114,7 (MH+), aminosavelemzés: Arg 2,86, Ala 4,12, Ilb 1,00.

A 3-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-propionsavat a következőképpen állítottuk elő:

(a) 25 g 5-nitro-benzo[b]tiofén-2-karbonsav-etilészter [a Syn. Comm. 21, 959-964 (1991) közleményben leírtak szerint kapott vegyület] és 500 ml etanol elegyéhez 60 °C-on 1 g Raney-nikkelt és 3 ml hidrazinhidrátot adtunk. Heves reakció indult be, és a visszafolyató hűtő alatt megindult az elegy forrása. Az elegyhez 10 perces időközönként további 1 g Raney-nikkelt és 3 ml hidrazin-hidrátot adtunk összesen 15 ml beadagolásáig, majd az elegyet 90 percig visszafolyatás közben forraltuk. Az elegyet forrón szűrtük, és a szűrletet bepároltuk. A maradékot 300 ml forró etanolban oldottuk, és az oldathoz aktív szenet adtunk. Az elegyet szűrtük, és a szűrletet szárazra pároltuk. Halványsárga szilárd anyagként 18 g 5-amino-benzo[b]tiofén-2-karbonsav-etil-észtert kaptunk. Ezt a szilárd anyagot keverés közben 50 ml tömény vizes sósavoldat és 130 ml víz 0 °C körüli hőmérsékletű elegyéhez adtuk. Az elegyhez lassan 5,6 g nátrium-nitrit 20 ml vízzel készített oldatát adtuk, és az elegyet még 30 percig 0 °C-on kevertük. Ezután az elegyhez 130 g nátrium-jodid 200 ml vízzel készített oldatát adtuk. Az elegyet szobahőmérsékletre hagytuk melegedni, ezután 30 percig 50 °C-on tartottuk. Az elegyet lehűlni hagytuk, és 150 ml kloroformmal extraháltuk. A szerves fázist vizes nátrium-metabiszulfit-oldattal mostuk, vízmentes magnézium-szulfát fölött szárítottuk, majd bepároltuk. A barna, olajos maradékot szilikagélen kromatografáltuk, eluálószerként gradiens szerint növekvő mennyiségű hexánt tartalmazó etil-acetát/hexán elegyeket (végső elegy: 10% etil-acetátot tartalmazó hexán) használtunk. A megfelelő eluátumfrakciókat egyesítettük és bepároltuk. Olaj formájában 14 g 5-jód-benzo[b]tiofén-2-karbonsavetil-észtert kaptunk.

NMR-spektrum adatai (DMSO-d^: 1,35 (t, 3H), 4,4 (q, 2H), 7,8 (dd, 1H), 7,9 (d, 1H), 8,15 (s, 1H), 8,45 (d, 1H).

(b) 14 g 5-jód-benzo[b]tiofén-2-karbonsav-etil-észter és 200 ml etanol elegyéhez 5 g nátrium-hidroxid 150 ml vízzel készített oldatát adtuk, és az elegyet 16 órán át kevertük. Az elegyet mintegy 150 ml végtérfogatra bepároltuk, és a koncentrátumot híg vizes sósavoldattal 3 körüli pH-ra savanyítottuk. A savas elegyet kétszer 100 ml dietil-éterrel extraháltuk. A szerves extraktumokat egyesítettük, vízmentes magnézium-szulfát fölött szárítottuk, majd bepároltuk. Szilárd anyagként 11,7 g 5-jód-benzo[b]tiofén-2-karbonsavat kaptunk.

NMR-spektrum adatai (DMSO-d^: 7,8 (dd, 1H), 7,9 (d, 1H), 8,05 (s, 1H), 8,45 (d, 1H).

(c) 3,05 g 5-jód-benzo[b]tiofén-2-karbonsav és 30 ml diklór-metán elegyéhez 2,7 ml oxálsavat és 1 csepp DMF-ot adtunk, aminek hatására gázfejlődés indult meg. A gázfejlődés megszűnése után az elegyet szárazra pároltuk, és a maradékot 10 ml tetrahidrofuránban oldottuk. Az oldatot részletekben 25 ml tömény vizes ammóniaoldathoz adtuk. A beadagolás után az elegyet 1 órán át kevertük. A kivált szilárd anyagot kiszűrtük, vízzel mostuk, és csökkentett nyomáson szárítottuk. A kapott 3 g szilárd anyagot 15 ml DMF-ban oldottuk, és az oldatot 20 ml DMF és 3 g foszforil-klorid 0 °C-os elegyéhez adtuk. Az elegyet 2 órán át kevertük, majd 60 ml vízhez adtuk. A kivált szilárd anyagot kiszűrtük, vízzel mostuk, és csökkentett nyomáson szárítottuk. 2,65 g halványsárga, porszerű 2-ciano-5-jódbenzo[b]tiofént kaptunk.

NMR-spektrum adatai (DMSO-dJ: 7,9 (dd, 1H), 8,0 (d, 1H), 8,3 (s, 1H), 8,45 (d, 1H).

(d) 4,8 g 2-ciano-5-jód-benzo[b]tiofén és 25 ml DMF elegyéhez 2 g metil-akrilátot, 2,35 g trietil-amint és 0,05 g palládium-acetátot adtunk, és az elegyet 30 percig argonatmoszférában 90 °C-on kevertük. Az elegyet lehűlni hagytuk, majd 50 ml vízhez adtuk. A kivált szilárd anyagot kiszűrtük, kloroformban oldottuk, és az oldathoz aktív szenet adtunk. Az elegyet szűrtük, a szűrletet vízmentes magnézium-szulfát fölött szárítottuk, majd az oldószert lepároltuk. 2,5 g 3-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-akrilsav-metil-észtert kaptunk. NMR-spektrum adatai (DMSO-dJ: 3,75 (s, 3H), 6,7 (d, 1H), 7,8 (d, 1H), 8,0 (dd, 1H), 8,2 (d, 1H), 8,3 (d, 1H), 8,85 (s, 1H).

(e) 2,5 g 3-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-akrilsavmetil-észtert 20 ml tetrahidrofuránban, 0,5 g 10%-os palládium/csontszén katalizátor jelenlétében hidrogéneztünk. Amikor a szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint (eluálószer: 1:4 arányú etil-acetát/hexán elegy) a kiindulási anyag főtömege elfogyott, a hidrogénezést leállítottuk, az elegyet szűrtük, és a szűrletet bepároltuk. 1,45 g 2-ciano-ben22

HU 222 198 Bl zo[b]tiofén-5-propionsav-metil-észtert kaptunk mintegy 20% kiindulási anyaggal szennyezve. 1,4 g így kapott termék 10 ml tetrahidrofuránnal és 3 ml vízzel készített oldatához 0,23 g nátrium-hidroxidot adtunk, és az elegyet 2 órán át kevertük. Az elegy pH-ját tömény vizes sósavoldattal 5 körüli értékre állítottuk, majd a tetrahidrofuránt lepároltuk. A vizes maradék pH-ját tömény vizes sósavoldattal 3 körüli értékre állítottuk, és az elegyet diklór-metánnal extraháltuk. Az extraktumot vízmentes magnézium-szulfát fölött szárítottuk, majd bepároltuk. A maradékot reverz fázisú kromatografálással tisztítottuk, C₁₈ hordozót és eluálószerként 40%ról gradiens szerint 75%-ra növekvő metanoltartalmú vizes metanolt használtunk. A megfelelő eluátumfrakciókat egyesítettük és bepároltuk. Fehér szilárd anyagként 0,28 g 2-ciano-benzo[b]tiofén-5-propionsavat kaptunk.

NMR-spektrum adatai (CDC1₃): 2,88 (t, 2H), 3,1 (t,

2H), 7,4 (d, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,8 (d, 1H), 7,85 (s, 1H).

25. példa

Phv-Arg-Ala-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH₂ (26. szekvencia) előállítása

A szintézist manuálisan végeztük az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan úgy, hogy a Fmoc-Papa-OH-t (Fmoc-Pip-OH helyett használt vegyület), a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. A terméket az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint tisztítottuk, és jellemzőit is az ott közöltek szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 17,45 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1061,9 (MH+), aminosavelemzés: Arg 1,94, Alá 4,04, Ilb 1,02.

26. példa

Phv-Arg-Ile-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH₂ (27. szekvencia) előállítása

A szintézist ABI 431 típusú automata peptidszintetizátorban végeztük, a Fmoc-Papa-OH-t és a Fmocvédett aminosavakat a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint a helyes sorrendben egymáshoz kapcsolva. A Fmoc-IIb-OH-t manuálisan vittük fel. A termék jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFAoldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 20,7 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1103,8 (MH+), aminosavelemzés: Arg 1,92, Alá 3,03, Ilb 0,96, Ile 1,08.

27. példa

Phv-lle-Arg-Ala-IIb-Leu-Arg-Ala-Papa-NH₂ (28. szekvencia) előállítása

A szintézist manuálisan végeztük az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan úgy, hogy a Fmoc-Papa-OH-t (Fmoc-Pip-OH helyett használt vegyület), a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIb-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. A terméket az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint tisztítottuk, és jellemzőit is az ott közöltek szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 30 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 23,8 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1145,7 (MH⁺), aminosavelemzés: Arg 1,98, Alá 1,92, Leu 0,99, Ile 1,09, Ilb kimutatható.

28. példa

Phv-Ala-Arg-Ala-Ilc-Ala-Ala-Ala-Papa-NH₂ (29. szekvencia) előállítása

A szintézist manuálisan végeztük az 1. példa 4. pontjában leírtakhoz hasonlóan úgy, hogy a FmocPapa-OH-t (Fmoc-Pip-OH helyett használt vegyület), a Fmoc-védett aminosavakat és a Fmoc-IIc-OH-t a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, miközben a védőcsoportokat lehasítottuk. A termék HPLC-val való tisztítására nem volt szükség. A termékjellemzőit az 1. példa 4. pontjában közöltek szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RP-HPLC (20%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 20 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 10,45 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 962,5 (MH⁺), 492,8 (M+H+Na)⁺⁺, aminosavelemzés: Alá 4,90, Arg 1,00, IIc kimutatható.

A Fmoc-IIc-OH-t az 1. példában a Fmoc-IIb-OH előállítására leírtak szerint állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy az első lépésben L-alanin-metil-észter-hidroklorid helyett glicin-metil-észter-hidrokloridot használtunk. A következő közbenső termékeket kaptuk:

Boc-(D)-Met-Gly-OMe 80%-os hozammal. NMRspektrum adatai (CDC1₃): l,4d (s, 9H), 2,0d (m, 1H), 2,ld (m, 1H), 2,ld (s, 3H), 2,6d (t, 2H), 3,8d (s, 3H), 4,05d (m, 2H), 4,4d (m, 1H), 5,3d (széles s, 1H), 6,8d (széles s, 1H).

2-[(3R)-3-(N-/terc-butoxi-karbonil/-amino)-2-oxopirrolidin-l-il]-ecetsav-metil-észter 50%-os hozammal. NMR-spektrum adatai (CDC1₃): l,45d (s, 9H), 2,0d (m, 1H), 2,6d (m, 1H), 3,4d (m, 2H), 3,8d (s, 3H), 4,05d (q, 2H), 4,ld (m, 1H), 5,55 (széles s, 1H).

2-[(3R)-3-(N-/9-fluorenil-metoxi-karbonil/-amino)2-oxo-pirrolidin-l-il]-ecetsav 75%-os hozammal. NMR-spektrum adatai (DMSO-d₆): l,9d (m, 1H), 2,3d (m, 1H), 3,3d (m, 2H), 4,0d (q, 2H), 4,3d (m, 4H), 7,4d (m, 4H), 7,6d (m, 2H), 7,9d (d, 2H).

29. példa

Phv-Arg-Ala-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Papa-NH₂ (30. szekvencia) előállítása

A szintézist ACT 357 típusú automata peptidszintetizátorban végeztük, Rink Amidé MBHA-gyanta felhasználásával úgy, hogy a Fmoc-Papa-OH-t és a Fmocvédett aminosavakat a helyes sorrendben egymáshoz kapcsoltuk. A Fmoc-IIb-OH-t manuálisan vittük be a

HU 222 198 Bl peptidbe. Az automata szintézislépéseket a gyártó által az egyedi acilezésekre ajánlott körülmények között végeztük úgy, hogy a karbonsavat a gyantára való felvitel előtt 11 perccel aktiváltuk DMF-ban, 1 mmol karbonsavra számítva 1 ekvivalens diizopropil-karbodiimiddel és 1 ekvivalens HOBT-val. Az acilezést körülbelül 60 percig végeztük, majd a mosást és a védőcsoport lehasítását a 2. példa 6. pontjában leírtak szerint hajtottuk végre. A Fmoc-IIb-OH manuális kapcsolását HBTU/HOBT-módszerrel végeztük, Bond Elut-csőben. Az 5-fenil-valeriánsav esetén a Kaiser-teszt kívánt eredményének eléréséhez kétszeres kapcsolási időre volt szükség. A szintézis végén a peptidet az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint hasítottuk le a gyantáról, és az ott közöltek szerint preparatív RP-HPLC-val tisztítottuk. A termékjellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termék jellemzői a következők: RP-HPLC (20%-ról gradiens szerint 35%-ra növekvő mennyiségű acetonitrilt tartalmazó acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 15 percig 1,0 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 10,33 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 976,5 (MH+), 499,9 (M+H+Na)++, aminosavelemzés: Alá 5,02, Arg 1,00, Ilb 1,22.

30. példa

Phv-Lys^CÍNMepJ-Ala-Ala-Ala-Thr-lIb-AlaPapa-NH₂ (31. szekvencia) előállítása

A 15. példa (a) pontjában leírtak szerint jártunk el, de Fmoc-Dap(Boc)-OH helyett Fmoc-Lys(Boc)-OH-t használtunk. A peptidet a gyantáról lehasítva és RPHPLC-val tisztítva 270 mg Phv-Lys-Ala-Ala-Ala-ThrIIb-Ala-Papa-NH₂-t kaptunk. Az így kapott peptid, 94 mg HBTU, 88 pl diizopropil-etil-amin és 50 ml DMF elegyét 16 órán át kevertük. Az elegyet bepároltuk, és a maradékot a 15. példa (a) pontjában leírtak szerint RP-HPLC-val tisztítottuk. A termék jellemzőit az

1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 40%-ra növekvő acetonitriltartalmú acetonitril/0,1%-os TFA-oldattal 40 percig 1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 29,83 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1077,27 (MH⁺), aminosavelemzés: Thr 1,0, Alá 4,3, Arg 1,00, Ilb kimutatható, tetrametil-homoarginin kimutatható.

31-33. példa

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIbAla-Papa-NHCH₂CH₂-morfolin (32. szekvencia), PhvArg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OCH_} (33. szekvencia) és Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (34. szekvencia) előállítása

1,67 g (1 mmol) hidroxi-metil-polisztirol-gyanta, 1,5 g (4 mmol) Fmoc-Papa-OH, 0,628 ml (4 mmol) diizopropil-karbodiimid, 61 mg (0,5 mmol) dimetil-amino-piridin, 5 ml DMF és 20 ml diklór-metán elegyét 2 órán át szobahőmérsékleten kevertük. A gyantát kiszűrtük, ötször 20 ml DMF-dal és ötször 20 ml metanollal mostuk, és csökkentett nyomáson 40 °C-on szárítottuk. Az így kapott, 2,105 g tömegű peptid/gyanta terméket ABI 430A típusú automata peptidszintetizátorba töltöttük, és a 2. példa 6. pontjában leírtakhoz hasonlóan hozzákapcsoltuk a Fmoc-védett aminosavak maradékát. A kapott 2,992 g tömegű peptid/gyanta terméket 10 ml DMF és 10 ml metanol elegyében szuszpendáltuk, és 0,88 ml 4-(2-amino-etil)-morfolint, majd katalitikus mennyiségű (50 mg) kálium-cianidot adtunk hozzá. Az elegyet 7 napig szobahőmérsékleten tartottuk, ezután szűrtük, és a gyantát ötször 20 ml DMF-dal mostuk. A szűrleteket és a mosófolyadékokat egyesítettük, és szárazra pároltuk. A maradékról 90% trifluor-ecetsavat tartalmazó vízzel lehasítottuk a védőcsoportokat, az elegyet szárazra pároltuk, végül a maradékot az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint preparatív RP-HPLC-val tisztítottuk. A következő három terméket kaptuk:

mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-PapaNHCH₂CH₂-morfolin (32. szekvencia). RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő acetonitriltartalmú acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 40 percig 1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 19,5 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1119,8 (MH⁺), aminosavelemzés: Thr 0,58, Alá 3,84, Arg 1,16, Ilb 1,00.

mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OMe (33. szekvencia). RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő acetonitriltartalmú acetonitril/0,1%-os vizes TFA oldattal 40 percig 1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 27,7 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1021,6 (MH⁺), aminosavelemzés: Thr 0,61, Alá 3,80, Arg 1,22, Ilb 0,97.

155 mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (34. szekvencia). RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő acetonitriltartalmú acetOnitril/0,1%-os vizes TFA oldattal 40 percig 1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 24,2 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1007,5 (MH⁺), aminosavelemzés: Thr 0,62, Alá 3,78, Arg 1,20, Ilb 0,98.

34. példa

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-PapaN(CH₂CH₂)2N-(CH₂)₂O-(CH₂)₂OH(35. szekvencia) előállítása

135 mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH, 51 mg HBTU, 47 pl DIPEA és 10 ml DMF elegyéhez 235 mg 4-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etil]-piperazint adtunk, és az elegyet 60 percig kevertük. Az illékony anyagokat lepároltuk, és a maradékot az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint preparatív HPLC-val tisztítottuk. 115 mg cím szerinti peptidet kaptunk, amelynek jellemzőit az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint határoztuk meg. A termékjellemzői a következők: RP-HPLC (10%-ról gradiens szerint 50%-ra növekvő acetonitriltartalmú acetonitril/0,1%-os vizes TFA-oldattal 40 percig 1,2 ml/perc sebességgel eluálva) retenciós idő: 18,83 perc, tömegspektrum: m/e (ES+) 1163,8 (MH⁺), aminosavelemzés: Thr 0,62, Alá 3,80, Arg 1,22, Ilb 0,97.

35. példa

A találmány szerinti vegyületeket szokásos gyógyászati készítmények formájában használhatjuk fel meleg vérnek (köztük emberek) terápiás vagy profilaktikus

HU 222 198 Bl célú kezelésére. A gyógyászati készítmények egyik jellemző példája a következő:

Injekciós oldat

Legföljebb 2 ml injektálható vizes hordozóanyagban 0,01-100 mg hatóanyagot feloldva 0,01-100 mg/ml koncentrációjú injektálható készítményt állítunk elő. Az injektálható vizes hordozóanyag az izotóniás ozmózisnyomás beállítására alkalmas gyógyszerészeti segédanyagot (például nátrium-kloridot vagy dextrózt) tartalmazó, gyógyászatilag alkalmazható pufferral (például foszfátvagy acetátpufferral) 5 és 8 közötti pH-értékre pufferolt vizes oldat lehet, ami adott esetben más gyógyszerészeti segédanyagokat, így szolubilizálószereket (például dime5 til-szulfoxidot, etanolt, propilénglikolt vagy polietilénglikolt), konzerválószereket és/vagy antioxidánsokat is tartalmazhat. A hatóanyag jellemzően az előző példák valamelyikében ismertetett (I) általános képletű vegyület lehet, amit a készítmény rendszerint gyógyászatilag alkal10 mazható sója formájában tartalmaz.

A SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE

1. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Alá” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-piperidin-4-karboxamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Alá Alá Lys Val Xaa 1 5

2. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-(6-oxo-l,7-diaza-spiro[4.4]-non-7-il)-propanoil]-Ala-piperidin-4-karboxamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Alá Alá Lys Val Xaa 1 5

3. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid

HU 222 198 Bl (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 4 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„Ala-piperidin-4-karboxamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Lys Ala Xaa Ala Xaa 1 5

4. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés : 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ile” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Arg Thr Xaa 1 5

5. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala-piperidin-4-karboxamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Ala Val Xaa 1 5

6. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav

HU 222 198 Bl (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5

7. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Arg Val Xaa 1 5

8. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Gly-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Ala Arg Val Xaa 1 5

9. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav

HU 222 198 Bl (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-piperidin-4-karboxamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ile Ala Arg Val Xaa 1 5

10. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Ala His Val Xaa 1 5

11. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-piperidin-4-karboxamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Asn Arg Val Xaa 1 5

12. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav

HU 222 198 Β1 (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 4 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„Ala-piperidin-4-karboxamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Alá Xaa Alá Xaa 1 5

73. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Gly-3-amino-propil-amin” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Alá Alá Thr Xaa 1 5

14. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Gly-3-amino-propil-guanidin” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Alá Alá Thr Xaa

5

HU 222 198 Β1

15. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Gly-NH-etil” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Alá Arg Thr Xaa 1 5

16. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-3-guanidino-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Alá Alá Alá Thr Xaa 1 5

17. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-3-(tetrametil-guanidino)-ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Alá Alá Alá Thr Xaa

5

HU 222 198 BI

18. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Gly-4-(2-amino-etil)-morfolin” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Alá Alá Alá Thr Xaa 1 5

19. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Gly-piperazin-4-il-CH₂CH₂OCH₂CH₂OH” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Alá Alá Alá Thr Xaa 1 5

20. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Gly-4-amino-fenetil-guanidin” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Alá Alá Alá Thr Xaa

5

HU 222 198 Bl

21. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Alá” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Alá Alá Arg Thr Xaa 1 5

22. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Alá” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-(NH-NH - CO)-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Alá Arg Thr Xaa 1 5

23. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-MH-NH-CONH₂” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Alá Arg Thr Xaa

5

HU 222 198 Bl

24. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 4 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Alá Xaa Arg Xaa

5

25. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=” 3-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-propanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 4 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Alá Xaa Arg Xaa

5

26. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg”

HU 222 198 Bl (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 4 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pinOlidin-l-il)-propa noil]-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Alá Alá Xaa Arg Xaa

5

27. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 4 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ile Alá Xaa Arg Xaa

5

28. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa : peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék= „egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ile” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 4 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Leu” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Alá Xaa Arg Xaa

5

HU 222 198 Bl

29. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 4 (D) egyéb információ: /termék=,,egyéb” /megjegyzés=„[((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-acetil]-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Arg Ala Xaa Ala Xaa

5

30. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 4 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Xaa Ala Xaa

5

31. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-tetrametil-homo-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid

HU 222 198 Bl (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala-4-amino-fenil-acetamid” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5

32. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg :

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala-(4-amino-fenil)-CH₂CONHCH₂CH₂-morfolin” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5

33. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg :

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propa noil]-Ala-4-amino-fenil-ecetsav-metil-észter” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5

34. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid

HU 222 198 Bl (B) elhelyezkedés: 6 (D)egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-4-amino-fenil-ecetsav” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5

35. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Arg” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-4-amino-fenil-acetil-piperazin-4-il-CH2CH2OCH2CH₂OH (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa 1 5

36. szekvencia:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 6 aminosav (B) típus: aminosav (C) száltípus: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 1 (C) egyéb információ: /termék=„egyéb”/megjegyzés=„5-fenil-pentanoil-Dpr” (ix) Jelleg:

(A) név/kód: peptid (B) elhelyezkedés: 6 (D) egyéb információ: /termék=„egyéb” /megjegyzés=„[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo-pirrolidin-l-il)-propanoil]-Ala-4-amino-fenil-ecetsav” (xi) A szekvencia leírása:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

Claims (16)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. (I) általános képletű peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik - a képletben

   P jelentése hidrofób maradék, éspedig (a) 5-20 szénatomos alifás, aromás vagy vegyes alifás/aromás szerves csoport, vagy egy 5-20 szénatomot és egy, két vagy három oxigén-, kén- és/vagy nitrogénatomot tartalmazó heteroaromás vagy vegyes alifás/heteroaromás szerves csoport;

   (b) fenil-alanin (Phe) és hidrogénezett analógjai, pklór-fenil-alanin, 3-(2-tienil)-alanin, tirozin, Tyr(O-metil), triptofán, bifenil-alanin, 3-(l-naftil)-alanin, 3-(2naftil)-alanin és hidrogénezett analógjaik, 3-(l-adamantil)-alanin, Glu(O-Benzil), 3-(benzil-oxi)-Ala, 3-(benzil-szulfanil)-Ala és 9-fluorenil-Gly, amelyek N-terminusához adott esetben a fenti (a) pontban meghatározott hidrofób alifás, aromás, heteroaromás vagy vegyes alifás/aromás vagy alifás/heteroaromás szerves csoport kapcsolódhat, vagy

   HU 222 198 Β1 (c) Ala-Cha, Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-AlaAla-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe és Ala-Ala-Ala-Phe, ahol az első aminosav L- vagy D-aminosav lehet, és ehhez adott esetben egy a fenti (a) pontban meghatározott hidrofób alifás, aromás, heteroaromás vagy vegyes alifás/aromás vagy alifás/heteroaromás szerves csoport is kapcsolódhat;

   R¹ egy öt L-aminosavból álló szekvenciát és ugyanakkor R³ egyetlen L-aminosavat jelent, vagy

   R^l egy három L-aminosavból álló szekvenciát és ugyanakkor R³ egy három L-aminosavból álló szekvenciát jelent,

   R² egy (II) vagy (III) általános képletű csoportot jelent, amelyekben Ra és Rb egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy 1-4 szénatomos alkilcsoportot, A pedig metiléncsoportot (CH₂) vagy oxigénatomot képvisel, és

   R⁴ hidroxilcsoportot, aminocsoportot vagy egy -NRcRd képletű csoportot jelent, amelyben Rd hidrogénatomot vagy 1-4 szénatomos alkilcsoportot képvisel, és Re jelentése 1-4 szénatomos alkil-, 2-karbamoil-ciklopentil-, 2-piridil-metil-, 4-karbamoil-ciklohexil-, 4-karbamoil-ciklohexil-metil-, 3-karbamoil-fenil-,

   4- karbamoil-fenil-, 4-(karbamoil-metil)-fenil-, 4-(karboxi-metil)-fenil-, 4-(metoxi-karbonil-metil)-fenilvagy 2-morfolino-etil-csoport, vagy Re egy -A'-G¹ képletű csoportot jelent, ahol

   A'jelentése 3-7 szénatomos alkiléncsoport, vagy (1) -A²-B²- képletű csoport, amelyben A² p-fenilénvagy 1,4-ciklohexiléncsoportot és B² 1-4 szénatomos alkiléncsoportot jelent, vagy A² metiléncsoportot és B² p-fenilén- vagy 1,4-ciklohexiléncsoportot képvisel, vagy (2) -A³-B³-C³- képletű csoport, amelyben A³ metiléncsoportot, B³ p-fenilén- vagy 1,4-ciklohexiléncsoportot, míg C³1-3 szénatomos alkiléncsoportot jelent, és ugyanakkor G' -N=C[N(Rp)₂]₂ csoportot jelent, amelyben az egyes Rp-csoportok egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy metil-, etil- vagy propilcsoportot jelentenek, vagy

   A¹ - A⁴-B⁴- képletű csoportot jelent, amelyben A⁴ pfeniléncsoportot, B⁴ pedig -CH₂CO- csoportot képvisel, és ugyanakkor G¹ 2-morfolino-etil- vagy 4-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etil]-piperazin-l-il-csoportot jelent, vagy

   R⁴ 1-piperazinil-, 4-metil-l-piperazinil-, 4-amidinoΙ-piperazinil-, 4-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etil]-l-piperazinil- vagy 1-piperidilcsoportot vagy a 4-es helyzetben karboxil-, karbamoil-, N-(2-amino-etil)-karbamoilvagy N-(4-amino-butil)-karbamoil-csoporttal szubsztituált 1-piperidilcsoportot jelent, vagy

   R⁴ egy 1-6 aminosavból álló szekvenciát vagy annak amidját jelenti.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyekben P egy

   5- 20 szénatomos alifás, aromás vagy vegyes alifás/aromás szerves csoportot, vagy egy 5-20 szénatomot és egy, két vagy három oxigén-, kén- és/vagy nitrogénatomot tartalmazó heteroaromás vagy vegyes alifás/heteroaromás szerves csoportot jelent.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyekben P jelentése 3-(benzil-oxi-karbonil)-propionil-Phe, 3-(benziloxi-karbonil)-propionil-Cha, 4-(benzil-oxi-karbonil)butiril-Phe, 4-(benzil-oxi-karbonil)-butiril-Cha, (5oxo-pirrolidin-2-il)-karbonil-Phe-Tyr, (5-oxo-pirrolidin-2-il)-karbonil-Glu(O-Benzil)-Tyr, acetil-Glu(OBenzil)-Tyr, difenil-metil-CONH - CH₂CH₂ - CO-Cha, difenil-metil-CONH-CH₂CH₂-CO-Tyr, difenil-metilCONH-CH₂CH₂CH₂CO-Cha, difenil-metilCONH-CH₂CH₂CH₂-CO-Tyr, difenil-metilNHCO-CH₂CH₂CH₂-CO-Cha, difenil-metilNHCO-CH₂CH₂CH₂-CO-Tyr, benzilNHCO-CH₂CH₂-CO-Cha, benzilNHCO-CH₂CH₂-CO-Tyr,N-acetil-4-klór-p-hidroxiPhe, 4-fenoxi-fenil-NHCO-, benzilNHCO-CH₂CH₂-CO-(N-metil-Phe), benzilNHCO-CH₂CH₂-CONH-CH(CHPh₂)-CO-, benzilNHCO-CH₂CH₂-CO-Tyr, 3,3-difenil-propionil-, transz-cinnamoil-, 5-fenil-valeril- vagy 3-(2-ciano-benzo[b]tiofen-5-il)-propionil-csoport.
4. 4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyekben

   R⁴ hidroxilcsoportot, aminocsoportot vagy egy -NRcRd képletű csoportot jelent, amelyben Rd hidrogénatomot vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoportot képvisel, és Rc jelentése 1-4 szénatomos alkil-, 2-karbamoil-ciklopentil-, 2-piridil-metil-, 4-karbamoil-ciklohexil-, 4-karbamoil-ciklohexil-metil-, 3-karbamoil-fenil-, 4-karbamoil-fenil-, 4-(karbamoil-metil)-fenil-, 4-(karboxi-metil)-fenil- vagy 2-morfolino-etil-csoport, vagy Rc egy -A'-G¹ képletű csoportot jelent, ahol A¹ jelentése 3-7 szénatomos alkiléncsoport, vagy (1) -A²-B²- képletű csoport, amelyben A² p-fenilénvagy 1,4-ciklohexiléncsoportot és B² 1-4 szénatomos alkiléncsoportot jelent, vagy A² metiléncsoportot és B² p-fenilén- vagy 1,4-ciklohexiléncsoportot képvisel, vagy (2) -A³-B³-C³- képletű csoport, amelyben A³ metiléncsoportot, B³ p-fenilén- vagy 1,4-ciklohexiléncsoportot, míg C³ 1-3 szénatomos alkiléncsoportot jelent, és ugyanakkor G¹ -N=C[N(Rp)₂]₂ csoportot jelent, amelyben az egyes Rp csoportok egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy metil-, etil- vagy propilcsoportot jelentenek, vagy

   R⁴ 1-piperazinil-, 4-metil-l-piperazinil-, 4-amidino1 -piperazinil-, 4-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etil]-1 -piperazinil- vagy 1-piperidilcsoportot vagy a 4-es helyzetben karboxil-, karbamoil-, N-(2-amino-etil)-karbamoilvagy N-(4-amino-butil)-karbamoil-csoporttal szubsztituált 1-piperidilcsoportot jelent, vagy

   R⁴ egy 1-6 aminosavból álló szekvenciát vagy annak amidját jelenti.
5. 5. Az 1., 2. vagy 4. igénypont szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyekben

   P 5-20 szénatomos alifás, aromás vagy vegyes alifás/aromás szerves csoportot jelent, az R¹ és R³ csoportban szereplő L-aminosavak jelentése egymástól függetlenül Ala, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Asn, Gin, Arg, Thr és Val, és

   HU 222 198 Β1

   R⁴ hidroxilcsoportot, aminocsoportot vagy egy -NHRc csoportot jelent, amelyben Rc 1-4 szénatomos alkil-, 2-karbamoil-ciklopentil-, 2-piridil-metil-, 4-karbamoil-ciklohexil-, 4-karbamoil-ciklohexil-metil-, 3karbamoil-fenil-, 4-karbamoil-fenil- vagy 4-(karbamoil-metil)-fenil-csoportot jelent, vagy

   R⁴ 1-piperazinil-, 4-metil-l-piperazinil-, 4-amidino1-piperazinil- vagy 1-piperidilcsoportot vagy a 4-es helyzetben karboxil-, karbamoil-, N-(2-amino-etil)-karbamoil- vagy N-(4-amino-butil)-karbamoil-csoporttal szubsztituált l-piperidilcsoportot jelent, vagy

   R⁴ egy 1 -6 aminosavból álló szekvenciát vagy annak amidját jelenti.
6. 6. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyekben R¹ egy öt L-aminosavból álló, AA1-AA2-AA3AA4-AA5 általános képletű szekvenciát jelent, ahol AA1 jelentése Alá, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe₄ vagy 3,3,3-trifluor-alanin,

   AA2 jelentése Alá, Lys, Glu, Sár, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-trifluor-alanin vagy N⁶-dietil-Lys,

   AA3 jelentése Alá, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn vagy N³-dietil-Dap,

   AA4 jelentése Alá, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sár, Gly, Pro, His vagy N⁶-dietil-Lys, és AA5 jelentése Thr, Val, Alá, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn vagy N³-dietil-Dap, és ugyanakkor R³ egyedi aminosavként Ala-t, Gly-t, Dap-t, aza-alanint vagy aza-glicint jelent.
7. 7. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyekben R^l egy három L-aminosavból álló, AA1-AA2AA3 általános képletű szekvenciát jelent, ahol

   AA1 jelentése Alá, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe₄ vagy 3,3,3-trifluor-alanin,

   AA2 jelentése Alá, Lys, Glu, Sár, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-trifluor-alanin vagy N⁶-dietil-Lys, és AA3 jelentése Alá, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn vagy N³-dietil-Dap, és ugyanakkor R³ egy három L-aminosavból álló, AA6AA7-AA8 általános képletű szekvenciát jelent, ahol AA6 jelentése Gly, Leu, Lys, Alá, Pro, Glu, Sár, His vagy Dap,

   AA7 jelentése Pro, Alá, Lys, Arg, Glu, Sár, Gly, Oic vagy Dic, és

   AA8 jelentése Alá, Gly, Dap, aza-alanin vagy aza-glicin.
8. 8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyekben R² (Ilb) képletű csoportot jelent.
9. 9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyekben a P helyén álló hidrofób csoport 5-fenilvaleril-csoport.
10. 10. Az előző igénypontok bármelyike szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik, amelyekben R⁴ 4-karbamoil-l-piperidil-, 4-(karbamoilmetil)-anilino- vagy 4-(2-guanidino-etil)-anilino-csoportot jelent.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti peptidszármazékok közé tartozó 1,2,3,4 és 5 képletű vegyületek - a képletekben Phv 5-fenil-valeril-csoportot jelent - és gyógyászatilag alkalmazható sóik.
12. 12. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű peptidszármazékot vagy gyógyászatilag alkalmazható sóját tartalmazza, gyógyászatilag alkalmazható hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal együtt.
13. 13. Eljárás az 1. igénypont szerinti peptidszármazékok és gyógyászatilag alkalmazható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően védett aminosavakat vagy két vagy több megfelelően védett aminosavból álló szekvenciát, egy megfelelően védett H-II-OH vagy H-III-OH általános képletű vegyületet és adott esetben egy megfelelően védett R⁴-H általános képletű vegyületet a helyes sorrendben összekapcsolunk egymással, majd kívánt esetben az N-terminális aminocsoportot funkcionálisan módosítjuk, bevisszük a hidrofób P-csoportot, és az adott esetben még jelen lévő védőcsoportokat és/vagy még jelen lévő szilárd hordozót eltávolítjuk.
14. 14. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű peptidszármazékok gyógyszerkészítmények hatóanyagaiként való felhasználásra.
15. 15. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű peptidszármazékok vagy gyógyászatilag alkalmazható sóik felhasználása II. osztálybeli MHC-függő T-sejtek által közvetített autoimmun vagy gyulladásos betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására.
16. 16. A 15. igénypont szerinti peptidszármazékok felhasználása reumás arthritis vagy sclerosis multiplex kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására.