KR19990087123A - 펩티드 유도체 - Google Patents

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로날드 코튼
필립 네일 에드워즈
리챠드 윌리암 아더 루크
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돈 리사 로얄
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 약학적으로 유용한 펩티드 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염과, 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며,
화학식 I
상기 식에서 P, R1, R2, R3및 R4는 본 명세서에 기재된 바와 같다. 신규 펩티드 유도체는 류마티스양 관절염과 같이 MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가면역 또는 염증성 질병을 치료하는데 효과적이다. 본 발명은 또한 신규의 펩티드 유도체를 제조하는 방법과 약학적 치료시 본 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

펩티드 유도체
인체 면역 응답의 자극은 T 세포에 의한 단백질 항원의 인식과 관련이 있다. 그러나, T 세포는 항원에 단독으로 응답할 수 없고 항원 제공 세포, 예를 들어 B 세포, 대식세포 또는 수상돌기 세포의 표면상의 대조직 적합성 복합체(MHC) 분자와 결합되는 항원에 의해서만 유도된다.
MHC 클래스 I 분자는 항원을 보유하는 세포의 파괴를 초래하는 T-킬러 세포 응답을 유발한다. MHC 클래스 II 분자는 선택된 B 세포의 팽창과 성숙(즉, 항원-특이 항체를 생성) 및 대식 세포의 활성을 조절하는 T-헬퍼 세포 응답을 유도한다.
면역 시스템에 중요한 필수 조건은 "자가" 및 "비-자가"(즉, 이종) 항원을 구별하는 능력이다. 이러한 구별력을 이용하면, 면역 시스템이 자가-단백질에 대한 면역 관용은 유지하면서 이종 병원체의 침입에 대한 응답을 증가시키고, 따라서 정상 조직에 대한 손상을 예방할 수 있다. 자가면역 질병은 자가-면역관용이 파괴되어 면역 시스템이 류마티스양 관절염의 관절에서와 같이 자가-조직에 대해 반응할 때 생긴다. 면역관용을 유지하여 자가 면역 질병을 피하기 위해서는 MHC 분자의 작용이 중요하다고 생각된다.
여러 자가면역 질병이 특정 MHC 대립 유전자의 유전과 관련이 있다는 관찰결과는 자가면역 질병의 병인론에 MHC 분자가 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다. 예를 들어 다발성 경화증은 HLA-DR2의 유전과 관련이 있고, 인슐린 의존성 진성 당뇨병은 HLA-DR3 및/또는 HLA-DR4, 하시모도 갑상선염은 HLA-DR5의 유전과 관련이 있다. 특히, 만성 염증성 관절 질병 류마티스양 관절염의 발생에 대한 소인과 HLA-DR4Dw4 및/또는 HLA-DR4w14 및/또는 HLA-DR1의 유전 사이에 특히 강한 연관성이 존재한다. 자가면역 질병과 관련된 MHC 분자는 특정 자가-항원에 결합하고 이 항원을 T세포에 제공하므로써 자가면역 응답을 자극하는 것으로 생각된다. 기타 자가면역과 관련된 MHC 분자에 결합하고/또는 그 결합을 방지하거나 이미 결합된 자가-항원을 대치할 수 있으며/또는 T 세포 활성(특히 병원성 T 세포(예, Th 1 세포)의 활성)을 억제하고/또는 보호성 T 세포(예, Th2 세포)의 활성을 증가시키는 기타 펩티드, 또는 상기 MHC 분자를 통해 매개된 자가면역 응답의 자극을 방지하고 변형시키기 위해서 대안적 활성 메카니즘에 의해 MHC 분자와 상호 작용하는 펩티드는 자가면역 응답을 특이적으로 억제할 수 있다.
이러한 종류의 제제는 면역 시스템의 일반적인 억제를 피하면서 자가면역 질병에 대한 치료법을 제공하며, 따라서 해로운 부작용을 제한할 수 있다. 이런 유형의 프로필은 류마티스양 관절염과 같은 질병에 대한 현행 치료법에 비해 현저한 장점을 제공한다. 초기에 NSAID와 같은 증상 경감제를 사용하여 류마티스양 관절염 치료를 병행할 수 있으나, 이는 병의 진행에 대한 이로운 효과를 제공하지 못하며 종종 원하지 않는 부작용과 관련이 있다. 더 중증 질병의 치료는 제2-계통제(second-line agent)로 불리우는 제제를 사용한다. 종종 이들은 심각한 독성문제를 야기할 수 있으며 제한된 효능을 가지는 일반적인 세포독성 화합물이다. 따라서 비-특이적 세포 독성과 연관이 없는 질병 조절제는 류마티스양 관절염의 치료에 상당한 잇점을 제공할 것이다.
펩티드는 국제 특허 출원, 공개 번호 WO 92/02543, WO 93/05011 및 WO 95/07707에 개시되어 있으며, 이 펩티드는 MHC 분자와 결합하고 T-세포 활성을 억제한다.
여러 펩티드가 HLA-DR 분자에 결합하여 HLA-DR 제한된 T-세포 활성을 억제하는 것으로 관찰되었지만, 전술한 질병 또는 증상을 유발하는 자가면역 응답의 자극을 예방하거나 변형시키기 위해서, 상기 분자에 결합시키고/또는 결합을 방지하거나 이미 결합된 자가 항원을 대치시키고/또는 T-세포 활성을 억제하고/또는 보호성 T-세포의 활성을 증가시키거나, 대안적인 활성 메카니즘으로 MHC 분자와 상호 작용하는 대안적인 화합물에 대한 요구는 여전히 남아있다.
본 발명의 펩티드 유도체(후술)는 놀랍게도 약리적으로 유용한 특성을 갖고 있다는 사실을 발견하였고, 이것이 본 발명의 기초가 된다.
본 발명은 류마티스양 관절염 및 기타 MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 질병 등의 자가면역 질병 또는 의학적 증상을 치료하는데 사용하기 위해 약리적으로 유용한 특성을 보유하는 특정 신규 펩티드 유도체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 신규 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 이의 제조 방법, 및 1종 이상의 전술한 질병 또는 의학적 증상을 치료하고 이 의학적 치료를 위한 신규의 약제 제조에 사용하기 위한 이 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제1목적은 하기 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
상기 식에서,
P는 소수성 잔기이고; R1은 5개의 L-아미노산 서열이고 R3는 단일 L-아미노산이거나; 또는 R1은 3개의 L-아미노산 서열이고 R3는 3L 아미노산의 서열이며;
R2은 하기 화학식 II 또는 하기 화학식 III으로 표시되는 기이며, 이 때 Ra 및 Rb는 각각 수소 및 C1-4알킬에서 선택되며, A는 메틸렌(CH2) 또는 산소이며;
R4는 OH, NH2또는 NRcRd이며, 여기서 Rc는 C1-4알킬, 2-카바모일시클로펜틸, 2-피리딜메틸, 4-카바모일시클로헥실, 4-카바모일시클로헥실메틸, 3-카바모일페닐, 4-카바모일페닐, 4-(카바모일메틸)페닐, 4-(카르복시메틸)페닐, 4-(메톡시카르보닐메틸)페닐, 2-모르폴리노에틸 및 화학식 -A1-G1로 표시되는 기에서 선택되며, 이 때
A1은 알킬렌이거나 또는
A1은 (1) 화학식 -A2-B2-로 표시되는 기(A2는 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이고 B2는 C1-4알킬렌이거나, 또는 A2는 메틸렌이고 B2는 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌); 및
(2)화학식 -A3-B3-C3로 표시되는 기(A3는 메틸렌, B3는 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이고 C3는 C1-3알킬렌)에서 선택되며;
G1은 화학식 -N=C[N(Rp)2]2로 표시되는 기이며, 각 Rp는 각각 수소, 메틸, 에틸 및 프로필에서 선택되거나; 또는
A1은 화학식 -A4-B4-로 표시되는 기(A4는 p-페닐렌이고 B4는 -CH2-CO-)이며
G1은 2-모르폴리노에틸 또는 4-[2-(2-히드록시에톡시)에틸]피페라진-1-일이며;
Rd는 수소 또는 C1-4알킬이거나; 또는
R4는 1-피페라지닐, 4-메틸-1-피페라지닐, 4-아미디노-1-피페라지닐, 4-(2-(2-히드록시에톡시)에틸)-1-피페라지닐, 1-피페리딜 또는 4-치환된-1-피페리딜이며, 여기서 4-치환체는 카르복시, 카바모일, N-(2-아미노에틸)카바모일 및 N-(4-아미노부틸)카바모일에서 선택되거나; 또는
R4는 1 내지 6개의 아미노산 서열 또는 이의 아미드.
R4의 아미노산은 각각 D-입체화학 또는 L-입체화학을 가질 수 있다. 또한, R4가 히드록시기(OH)로 정의될 때, R3의 C-말단 아미노산의 히드록시기인 것으로 이해할 수 있다. 유사하게 R4가 NH2, NRcRd, 피페라지닐, 피페리딜 등으로 정의되면, 이는 R3의 C-말단 아미노산의 히드록시기가 이들 기로 대치된다는 것을 의미한다. 이런 아미노산은 α-아미노산을 의미한다. 이와 관련된 L-아미노산은 키랄 탄소 원자를 갖지 않는 Gly, 2,2-디에틸Gly, 아자-알라닌 및 아자-글리신과 같은 아미노산을 포함한다. "알킬"과 같은 일반명은 탄소수가 허용되는 한 다양한 직쇄 또는 분지쇄를 포함한다는 것을 또한 알 수 있다. 동일한 규정이 기타 라디칼에 대해서도 적용된다.
키랄 중심을 가진 화합물은 라세미체(또는 하나 이상의 키랄 중심이 있는 부분입체 이성체 혼합물)의 형태, 또는 광학적으로 활성인 거울상 이성체 또는 부분입체 이성체로 존재할 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 라세믹 혼합물 또는 부분입체 이성체 혼합물과 관련된 특정 생물학적 활성은 대개 또는 유일하게 단일 광학적 활성 이성체에서 유래할 수 있다는 것 또한 당업계에 공지되어 있다. 그러므로, 본 발명은 전술한 약학적으로 유용한 특성을 보유하는 화학식 I의 펩티드 유도체의 임의의 형태에 관한 것임을 알 수 있을 것이다. 또한 본원에서 예시하는 바와 같이, 광학적으로 활성인 단일 이성체를 얻는 방법, 예를 들어 이성체를 포함하는 라세믹 혼합물 또는 부분입체 이성체 혼합물로부터 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법을 사용하여 분리하거나, 또는 적절한 광학적 활성 출발 물질 또는 중간 물질을 사용하여 키랄 합성시키는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 또한 예를 들어 본원에 개시된 분석 방법을 사용하여 라세믹 혼합물 또는 부분입체 이성체 혼합물과 개개의 광학적 활성 이성체의 약리학적 특성을 결정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 따라서 당업자는 본원에서 언급하는 유용한 약리적 특성을 가진 화학식 I의 펩티드 유도체의 특정 이성체를 용이하게 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에서 언급하는 유용한 약리적 특성을 가진 화학식 I의 펩티드 유도체의 임의의 다형 형태, 임의의 호변 이성체나 임의의 용매화물, 또는 이의 혼합물을 포함한다.
R1및 R3를 포함하는 α-아미노산에 대한 적절한 독립 값은, 예를 들어 유전자 코드에 의해 암호되는 20개의 자연 발생적 아미노산, 특히 알라닌(Ala), 글루탐산(Glu), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 이소루이신(Ile), 리신(Lys), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 아르기닌(Arg), 트레오닌(Thr), 발린(Val) 및 프롤린(Pro)을 포함한다. 사르코신(Sar), 3,3,3-트리플루오로알라닌, 2,2-디에틸글리신, 2,3-디아미노프로판산(Dap), 2,4-디아미노부탄산(Dab), 2-아미노부탄산(Abu), 호모아르기닌, 호모페닐알라닌, 트랜스-4-히드록시프롤린(Hyp), 아자-알라닌[H2N-N(CH3)-COOH; Azala], 아자-글리신[H2N-NH-COOH; Azgly], 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(Tic), 옥타히드로인돌-2-카르복실산(Oic), 데카히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(Dic) 등의 아미노산도 적절하다. (여기서 Dic는 고리연결이 R 배열과 S 배열을 모두 가진 형태를 의미한다). 해당 N2-메틸화된 아미노산 뿐만 아니라, 유리 측쇄 카르복실산 작용기가 에스테르화되고(예, C1-6알킬 또는 벤질 에스테르) 유리 측쇄 아미노기가 알킬화(예, 메틸화), 아세틸화되거나 또는 카바메이트(예, 메틸 또는 에틸과 같은 알킬 카바메이트, 페닐 또는 벤질 카바메이트)로 전환된 해당 아미노산을 사용할 수 있다. R1및 R3의 적절한 예는 예를 들어 2-치환된 글리신이며, 여기서 2-치환체는 화학식 -(CH2)sNH2(여기서 s는 1 내지 3)로 표시되는 기, 화학식 -(CH2)pN(Re)3 +.X-(여기서 p는 2 내지 4이고, X-는 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 수산화물 또는 염화물과 같은 반대 이온)로 표시되는 기, 또는 화학식 -(CH2)qN(Re)2(여기서 q는 0 내지 4)로 표시되는 기, 또는 화학식 -(CH2)rN=C[N(Re)2]2(여기서 r은 1 내지 4)로 표시되는 기이며, 나중 3개 기의 Re는 각각 수소 및 C1-4알킬(메틸 또는 에틸)에서 선택된다.
5개의 아미노산 서열인 경우, R1의 특정 값은 예를 들어 제5 아미노산이(왼쪽에서 오른쪽으로 판독) Val 또는 Thr인 서열과 제4 및 제5 아미노산이 Lys-Val, Arg-Val, Lys-Thr, Arg-Thr, Ala-Val 또는 Ala-Thr인 서열을 포함한다.
5개의 아미노산 서열인 경우 R1에 대한 특정 값으로는 예를 들어, Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Ala-Lys-Ala-Ala-Val, Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Val, Ala-Lys-Ala-Lys-Val, Ala-Arg-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Lys-Val, Ala-Lys-Ala-Arg-Val, Ile-Ala-Ala-Arg-Thr., Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Ala-Ile-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-His-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Asn-Arg-Val 또는 X-Ala-Ala-Ala-Thr(여기서 X는 -NH.CH[CH2NH.C(=NH).NH2].CO-(이하 "Gap"로 칭함) 또는 -NH.CH(CH2N=C[N(CH3)2]2).CO-(이하 "GapMe4"로 칭함)이 있으며, 이중 Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Gap-Ala-Ala-Ala-Thr 및 GapMe4-Ala-Ala-Ala-Thr이 바람직하다. Arg-Ala-Ala-Ala-Val 및 Arg-Ala-Ala-Ala-Thr이 특히 바람직하다.
3개의 아미노산 서열인 경우 R1의 특정 예는, 예를 들어 R2에 이웃한 아미노산이 Ala인 서열과 제2 및 제3 아미노산이(왼쪽에서 오른쪽으로 판독) Lys-Ala, Arg-Ala, Ile-Ala 및 Ala-Ala인 서열이다.
3개의 아미노산 서열인 경우 R1의 특별한 예는, 예를 들어 Ala-Lys-Ala, Ala-Arg-Ala, Arg-Ala-Ala, Arg-Ile-Ala 및 Ile-Arg-Ala이며 특히 Ala-Arg-Ala이 바람직하다.
3개의 아미노산 서열인 경우 R3의 특정 예는, 예를 들어 제1아미노산(왼쪽에서 오른쪽으로 판독, 즉 R2에 이웃함)이 Ala 또는 Leu인 서열을 포함한다.
3개의 아미노산 서열이 존재하는 경우 바람직한 R3은 예를 들어 Ala-Ala-Ala, Leu-Arg-Ala이며, 특히 Ala-Arg-Ala가 바람직하다.
단일 아미노산인 경우 바람직한 R3은 예를 들어 Ala, Gly 및 Azgly이며, 특히 Ala가 바람직하다.
알킬기인 경우 Ra 및 Rb의 특정 예는, 예를 들어 메틸, 에틸 및 프로필이다.
Ra 및 Rb의 바람직한 예는, 예를 들어 수소 및 메틸이다.
소수성 잔기 P(R1의 N-말단 아미노산의 아미노기에 결합된 것)에 대한 적절한 예는, 예를 들어 C5-20(및 헤테로아릴 함유기인 경우에는 산소, 황 및 질소로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자 함유)의 소수성 지방족, 방향족, 헤테로방향족 또는 혼합된 지방족/방향족이나 지방족/헤테로방향족 유기기 등의 유기 소수성기, 예를 들어, 화학식 R-, R.CO-, R.SO2- R.O.CO-, R.NHCO-, -R.O.CS-, R.S.CO- R.NHCS-, R.S.CS- 및 R.CS-로 표시되는 기를 포함하며, 여기서 R은 예를 들어 C5-10알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴C2-10알킬, 헤테로아릴C2-10알킬, 디아릴C2-8알킬, 아릴C2-10알케닐, 아릴시클로프로필, C5-10시클로알킬, C5-10시클로알킬C2-6알킬, 3-이페닐, 4-이페닐, 4-시클로헥실페닐, 2-나프틸옥시메틸, 3-나프틸옥시메틸, 페녹시페닐 및 테트라히드로나프틸이며, 아릴 또는 헤테로아릴기의 R값은 하나 이상의 C1-4알킬, 할로겐, 시아노 또는 C1-4알콕시 치환체를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 일양태는 예를 들어 화학식 I의 펩티드 유도체(P는 전술한 바와 같은 RCO-임)를 포함한다. 본 발명의 추가의 바람직한 일양태는 예를 들어, 화학식 I의 펩티드 유도체(여기서 P는 C5-20의 소수성 지방족, 방향족 또는 지방족/방향족 유기기)를 포함한다.
R의 특정 값은 예를 들어, C5-10알킬인 경우: 펜틸, 이소펜틸, 3차-펜틸, 2-메틸펜틸, 헥실, 이소헥실, 5-메틸헥실 및 옥틸; 아릴인 경우: 페닐, 나프틸 및 인데닐; 헤테로아릴인 경우: 2-인돌일, 3-인돌일, 5-인돌일, 6-인돌일, 2-인돌리닐, 3-인돌리닐, 5-인돌리닐, 6-인돌리닐, 2-벤조[b]티오페닐, 3-벤조[b]티오페닐, 5-벤조[b]티오페닐, 6-벤조[b]티오페닐, 티에틸, 2-벤조티아졸일, 4-벤조티아졸일, 5-벤조티아졸일, 2-벤조옥사졸일, 4-벤조옥사졸일, 5-벤조옥사졸일, 2-벤즈이미다졸일, 4-벤즈이미다졸일, 5-벤즈이미다졸일, 2-, 3-, 6-, 또는 7-위치에 결합한-1,4-벤조디옥사닐, 및 2-벤조푸라닐, 3-벤조푸라닐, 5-벤조푸라닐 또는 6-벤조푸라닐; 아릴C2-10알킬인 경우: 아릴C2-6알킬(여기서, 아릴 부분은 예를 들어 상기 주어진 아릴에 특한 임의의 특정 예를 포함하며, C2-6알킬 부분은 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌 및 펜타메틸렌을 포함함), 예를 들어 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 4-페닐부틸 및 5-페닐펜틸; 헤테로아릴C2-10알킬인 경우: 헤테로아릴C2-6알킬(여기서 헤테로아릴 부분은 예를 들어 전술한 헤테로아릴의 임의의 특정 값이며 C2-6알킬 부분은 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌 및 펜타메틸렌임), 예를 들어 2-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)에틸; 디아릴C2-8알킬인 경우: 디아릴C2-6알킬, 예를 들어 2,2-디페닐에틸, 3,3-디페닐프로필 및 4,4-디페닐부틸; 아릴C2-10알케닐인 경우: 아릴C2-6알케닐, 예를 들어 스티릴, 3-페닐프로펜-2-일 및 4-페닐부텐-1-일; 아릴시클로프로필인 경우: 페닐시클로프로필, 1-나프틸시클로프로필 및 2-나프틸시클로프로필; C5-10시클로알킬인 경우: 시클로펜틸, 시클로헥실 및 1-아다만틸; 및 C5-10시클로알킬C2-6알킬인 경우: 2-(시클로헥실)에틸, 3-(시클로헥실)프로필 및 4-(시클로헥실)부틸이다. R의 아릴기상에 치환체의 특정 예는 예를 들어, 메틸, 에틸, 클로로, 브로모, 요오도, 메톡시, 에톡시 및 시아노이다.
또한 소수성 잔기 P는 예를 들어, 페닐알라닌(Phe)과 같은 소수성 L-아미노산과 시클로헥실알라닌(Cha)과 같은 이의 수소첨가된 유사체, 파라-클로로페닐알라닌, 3-(2-티에닐)알라닌, 티로신(Tyr), Tyr(O메틸), 트립토판(Trp), 이페닐알라닌, 3-(1-나프틸)알라닌, 3-(2-나프틸)알라닌 및 수소 첨가된 이의 유사체, 3-(1-아다만틸)알라닌(Ada), Glu(O벤질), 3-(벤질옥시)Ala, 3-(벤질설파닐)Ala 및 9-플루오레닐Gly이 있으며, 각각은 임의적으로 전술한 바와 같이 N-말단 상에 소수성 지방족, 방향족, 헤테로방향족 또는 혼합된 지방족/방향족이나 지방족/헤테로방향족 유기기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 소수성 아미노산은 임의적으로 예를 들어, 전술한 R1및 R3의 임의의 예에서 선택된 1 내지 3개의 아미노산의 추가 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 P는 특정 서열 Ala-Cha, Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Phe, Ala-Phe-Phe-Phe 및 Ala-Ala-Ala-Phe이다. 1 내지 3개의 추가 아미노산 서열의 제1 아미노산은(왼쪽에서 오른쪽으로 판독) L-아미노산 또는 D-아미노산일 수 있으며, 또한 임의적으로 전술한 소수성 지방족, 방향족, 헤테로방향족 또는 혼합된 지방족/방향족이나 지방족/헤테로방향족 유기기를 포함할 수 있다.
또 다른 P의 특정 예는, 예를 들어 3-(벤질옥시카르보닐)프로피오닐-Phe, 3-(벤질옥시카르보닐)프로피오닐-Cha, 4-(벤질옥시카르보닐)부티릴-Phe, 4-(벤질옥시카르보닐)부티릴-Cha, (5-옥소-피롤리딘-2-일)카르보닐-Phe-Tyr, (5-옥소-피롤리딘-2-일)카르보닐-Glu(O벤질)-Tyr, 아세틸-Glu(O벤질)-Tyr, 디페닐메틸.CONH.CH2CH2.CO-Cha, 디페닐메틸.CONH.CH2CH2.CO-Tyr, 디페닐메틸.CONH.CH2CH2CH2.CO-Cha, 디페닐메틸.CONH.CH2CH2CH2.CO-Tyr, 디페닐메틸.NHCO.CH2CH2CH2.CO-Cha, 디페닐메틸.NHCO.CH2CH2CH2.CO-Tyr, 벤질.NHCO.CH2CH2.CO-Cha, 벤질.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr, N-아세틸-4-클로로-베타-히드록시Phe, 4-페녹시페닐.NHCO-, 벤질.NHCO.CH2CH2.CO.(N-메틸Phe), 벤질.NHCO.CH2CH2.CONH.CH(CHPh2)CO, 벤질.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr, 3,3-디페닐프로피오닐, 트랜스-신나모일, 5-페닐발레릴 및 3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)프로피오닐이다.
P의 특정 값은 예를 들어 페닐.(CH2)4.CO-(5-페닐발레릴(Phv)), 페닐.(CH2)4.CS- 및 3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)프로피오닐이다.
바람직한 소수성 잔기 P는 예를 들어, 3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)프로피오닐 및 5-페닐발레릴(Phv)이며, 특히 5-페닐발레릴(Phv)이 바람직하다.
Rc가 화학식 -A1-G1로 표시되는 기인 경우, A1의 특정 예는 알킬렌인 경우 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌이며, B2의 특정 예는 C1-4알킬렌인 경우 예를 들어 메틸렌, 에틸렌 및 프로필렌이며; 특정 C3예는 C1-3알킬렌인 경우 예를 들어 메틸렌, 에틸렌 및 프로필렌이다.
-A1-G1의 특정 예는, 예를 들어 3-구아니디노프로필, 4-(2-구아니디노에틸)페닐, 4-(2-모르폴리노에틸.NH.CO.CH2)페닐 및 4-(4-[2-(2-히드록시에톡시)에틸]피페라진-1-일.CO.CH2)페닐이다.
1 내지 6개의 아미노산 서열 또는 이의 아미드인 경우 R4의 특정 에는, 예를 들어 전술한 R1및 R3의 임의의 예에서 각각 선택된 L-아미노산 서열(예, Ala-Thr-Gly-OH) 또는 이의 D-유사체, 또는 D-아미노산과 L-아미노산을 포함하는 서열 또는 이의 아미드이며, 예를 들어 아미드는 암모니아, C1-4알킬아민(예, 메틸아민) 또는 디C1-4알킬아민(예, 디메틸아민)에서 유도된 것이다. R4의 특정 값은 예를 들어 R4가 1 내지 6개의 아미노산 서열이 아닌 경우 본원에서 정의한 값이다.
바람직한 R4예로는, 예를 들어 4-카바모일-1-피페리딜[피페리딘-4-카르복스아미드(Pip-NH2)의 잔기], 4-카르복시-1-피페리딜[피페리딘-4-카르복실산(Pip-OH)의 잔기], 4-(카바모일메틸)아닐리노[4-아미노페닐아세트아미드(Papa-NH2)의 잔기], 4-(카르복시메틸)아닐리노[4-아미노페닐아세트산(Papa-OH)의 잔기] 및 4-(2-구아니디노에틸)아닐리노[2-(4-아미노페닐)에틸구아니딘(Pape-NHC(=NH)NH2)의 잔기]가 있다.
R4의 특정 기로는 예를 들어 Pip-NH2, Papa-NH2, Pape-NHC(=NH)NH2및 NHRc이며, 여기서 Rc는 3-구아니디노프로필, 2-모르폴리노에틸 또는 4-(2-(2-히드록시에톡시)에틸-1-피페라지닐이 있다.
바람직한 R2로는 예를 들어 화학식 II로 표시되는 기, 특히 하기 화학식 IIa 더욱 바람직하게는 하기 화학식 IIb로 표시되는 기가 있다.
화학식 I의 펩티드 유도체의 바람직한 기는 예를 들어 R1이 5개의 L-아미노산 서열이고 R3이 단일 L-아미노산인 펩티드 유도체이며, 여기서 서열 R1및 R3은 특정하고 바람직한 예를 비롯하여 전술한 R1및 R3의 임의의 예를 갖는다. 이 군에서, 특히 바람직한 펩티드 유도체의 아군으로는, 예를 들어 R2가 화학식 II의 기, 특히 IIa로 표시되는 기, 더욱 바람직하게는 IIb로 표시되는 기인 것이 있다. 특히 바람직한 펩티드 유도체의 또 다른 아군으로는, 예를 들어 R4가 -Pip-OH, -Pip-NH2, -Papa-OH 또는 -Papa-NH2인 경우를 포함한다. 특히 바람직한 화합물의 아군은 예를 들어, R3가 R4와 함께 Ala-Pip.NH2또는 Ala-Papa-NH2를 형성하는 것이다.
본 발명에 속하는 펩티드 유도체의 또 다른 바람직한 군은 예를 들어 R1이 AA1-AA2-AA3-AA4-AA5로 표시되는 5개의 아미노산으로 이루어진 L-아미노산 서열을 포함하며, 여기서:
AA1은 Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4및 3,3,3-트리플루오로알라닌에서 선택되며, 바람직하게는 Ala, Ile, Arg, Gap 및 GapMe4에서, 더욱 바람직하게는 Ala, Arg 및 GapMe4에서, 더욱 더 바람직하게는 Ala 및 Arg에서 선택되며;
AA2는 Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-트리플루오로알라닌 및 N6-디에틸Lys에서 선택되며, 바람직하게는 Ala, Arg, Ile, Lys 및 Tic에서, 더욱 바람직하게는 Ala, Arg, Lys 및 Ile에서, 더욱 더 바람직하게는 Ala 및 Arg에서 선택되며;
AA3은 Ala, His, Gln, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn 및 N3-디에틸Dap에서 선택되며, 바람직하게는 Ala, His, Asp 및 Asn, 더욱 바람직하게는 Ala 및 Asn에서 선택되고, Ala은 더욱 더 바람직하며;
AA4는 Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His 및 N6-디에틸Lys에서 선택되며, 바람직하게는 Ala, Arg, Lys 및 His에서, 더욱 바람직하게는 Ala, Arg 및 His에서 선택되고, Ala은 더욱 더 바람직하며;
AA5는 Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn 및 N3-디에틸Dap에서 선택되며, 바람직하게는 Thr, Val 및 Dap에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 Thr 및 Val에서 선택되며;
R3은 Ala, Gly, Dap, 아자알라닌 및 아자글리신에서 선택된 단일 L-아미노산이며, 바람직하게는 Ala, Gly 및 아자글리신에서, 더욱 바람직하게는 Ala 및 Gly에서 선택되며, 더욱 더 바람직하게는 Ala이고; 여기서 P, R2, 및 R4은 전술한 바와 같이 특정하고 바람직한 예를 비롯한, 임의의 것일 수 있다. 이 군에 속하는, 화합물의 특정 아군은 예를 들어 Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Ile-Ala-Ala-Arg-Thr, Arg-Ala-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Arg-Val, Ala-Ile-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-His-Val, Ala-Ala-Asn-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Thr, Ala-Arg-Ala-Arg-Thr, Gap-Ala-Ala-Ala-Thr, GapMe4-Ala-Ala-Ala-Thr 및 Ala-Ala-Ala-Arg-Thr에서 선택된 서열 AA1-AA2-AA3-AA4-AA5이다. R4가 Pip-NH2, Papa-NH2및 Pape-NHC(=NH)NH2인 화합물이 바람직하다.
본 발명의 펩티드 유도체의 또 다른 바람직한 군은 예를 들어 R1이 AA1-AA2-AA3으로 표시되는 3개의 아미노산으로 이루어진 L-아미노산 서열이며, 여기서:
AA1은 Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4및 3,3,3-트리플루오로알라닌에서 선택되며, 바람직하게는 Ala, Ile, Arg, Gap 및 GapMe4에서, 더욱 바람직하게는 Ala, Arg 및 GapMe4에서, 더욱 더 바람직하게는 Ala 및 Arg에서 선택되며;
AA2는 Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-트리플루오로알라닌 및 N6-디에틸Lys에서 선택되며, 바람직하게는 Ala, Arg, Ile, Lys 및 Tic에서, 더욱 바람직하게는 Ala, Arg, Lys 및 Ile에서, 더욱 더 바람직하게는 Ala 및 Arg에서 선택되며;
AA3은 Ala, His, Gln, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn 및 N3-디에틸Dap에서 선택되며, 바람직하게는 Ala, His, Asp 및 Asn에서, 더욱 바람직하게는 Ala 및 Asn에서 선택되고, 더욱 더 바람직하게는 Ala이며;
R3은 AA6-AA7-AA8로 표시되는 3개의 아미노산으로 이루어진 L-아미노산 서열이며, 여기서:
AA6은 Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His 및 Dip에서, 더욱 바람직하게는 Ala, Leu 및 Pro에서 선택되며, 더욱 더 바람직하게는 Ala이며;
AA7은 Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic 및 Dic에서, 더욱 바람직하게는 Ala 및 Arg에서 선택되며;
AA8은 Ala, Gly, Dap, 아자알라닌 및 아자글리신에서, 바람직하게는 Ala, Gly 및 아자글리신에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 Ala이며;
P, R2및 R4은 전술한 특정하고 바람직한 에를 비롯한 임의의 예이다. 이 군에 속하는, 화합물의 특정 아군은 서열 AA1-AA2-AA3가 Ala-Lys-Ala 및 Ala-Arg-Ala에서 선택되고 서열 AA6-AA7-AA8은 Ala-Ala-Ala 및 Ala-Arg-Ala에서 선택되는 화합물이다. R4가 Pip-NH2, Papa-NH2및 Pape-NHC(=NH)NH2인 화합물이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 양태는 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체를 포함하며, 여기서 R2은 화학식 II의 군(특히 A는 메틸렌)이고, 더욱 바람직하게는 화학식 IIb로 표시되는 군이며, P, R1, R3및 R4는 전술한 특정하고 바람직한 임의의 값이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 아르기닌 잔기를 포함하는 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체를 포함하며, 5개의 아미노산으로 이루어진 L-아미노산 서열인 경우 R1의 제1 아미노산 잔기(왼쪽에서 오른쪽으로 판독)가 아르기닌(예, Arg-Ala-Ala-Ala-Val 및 Arg-Ala-Ala-Ala-Thr)인 화합물과, 3개의 아미노산으로 이루어진 L-아미노산인 경우 R1의 제2아미노산 잔기가 아르기닌이고/또는 3개의 아미노산으로 이루어진 L-아미노산인 경우 R3의 제 2아미노산 잔기는 아르기닌(예, R1이 Arg-Ala-Ala이고, R2가 Ala-Ala-Ala이거나 또는 R1및 R2가 모두 Ala-Arg-Ala인 경우)인 화합물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체를 포함하며, 여기서 R2가 하기 화학식 IIIa 또는 하기 화학식 IIIb로 표시되는 기이고, P, R1, R3및 R4는 전술한 특정하고 바람직한 예를 포함하는 임의의 예이다.
특히 관심의 대상이 되는 본 발명의 화합물은, 예를 들어 하기 실시예에 후술하는 특정 양태들이다. 이들 중 실시예 5, 16, 19, 23 및 24의 화합물은 특히 중요하며, 이들 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 본 발명의 추가의 특징을 제공한다.
실시예 5 (서열 번호 5)
실시예 16 (서열 번호 17)
실시예 19 (서열 번호 20)
실시예 23 (서열 번호 24)
및
실시예 24 (서열 번호 25)
예를 들어 약학적으로 허용 가능한 염으로는, 예를 들어 충분히 염기성인 펩티드 유도체의 경우, 예를 들어 유리 아미노기를 갖는 것, 생리학적으로 허용가능한 음이온을 형성하는 산과의 염, 예컨대 할로겐화수소(염화수소 및 브롬화수소), 설폰산 및 포스폰산과 같은 무기산과의 염과, 아세트산, 옥살산, 주석산, 만델산, p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 트리플루오로아세트산 등과 같은 유기산과의 염이 있으며, 충분히 산성인 펩티드 유도체의 경우, 예를 들어 유리 카르복실산기를 갖는 것, 생리학적으로 허용가능한 양이온을 형성하는 염기와의 염, 예를 들어 알카리 금속(예, 나트륨과 칼륨)과의 염, 알카리토금속(예, 마그네슘과 칼슘)과의 염, 알루미늄과의 염, 암모늄염 뿐만 아니라 에탄올아민, 메틸아민, 디에틸아민, 이소프로필아민, 트리메틸아민 등과 같은 적절한 유기 염기와의 염이 있다.
전술한 바와 같이, 화학식 I의 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 질병 조절제로서 또는 예방 치료제로서 또는 증상을 치료하기 위해서 자가면역 질병이나 의학적 증상을 갖는 항온 동물(인간 포함)에서 이로운 약리학적 효과를 제공할 것이다. 이러한 질병으로는 예를 들어, 류마티스양 관절염, 다발성 경화증, 굿파스튜어 증후군, 특발성 혈소판감소성 자반, 유년기 류마티스양 관절염, 복강 질병, 전신 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 중증 근무력증, 유형 I (인슐린 의존성) 당뇨병, 하시모토 질병, 그레이브스 질병, 아디손병, 경피증, 다발성근염, 피부근염, 심상성 펨피구스, 수포성 펨피고이드, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 사구체신염, 이식 거부반응 등이 있으며, 특히 류마티스양 관절염 및 다발성 경화증에 효과가 있다.
화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유용성은 국제 특허 출원 공개 번호 WO92/02543, WO93/05011 및 WO95/07707에 개시된 것(또는 이의 변형) 및 후술하는 것을 비롯하여 각종 표준 시험과 임상 연구로 평가할 수 있다. 화학식 I의 펩티드 유도체는 1종 이상의 시험 또는 연구에서 상당한 활성을 나타내었다.
시험 A: 정제된 HLA-DR 펩티드의 시험관내 결합 분석(이 분석법을 사용하여 질병과 관련된 MHC 클래스 II 분자에 대한 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체의 결합을 입증할 수 있다). 인산 완충액(PBS)중 800nM인 30㎕의 비오틴-FHA307-320(FHA(307-320)펩티드, N-말단에서 장쇄 비오틴으로 유도체화됨, 비오틴-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH)을, 억제제 펩티드의 존재 또는 부재하에 48시간 동안 V자형-웰의 미세역가판(눙크)중 0.5㎍/㎖와 5㎍/㎖사이의 농도인 30㎖의 정제된 HLA-DR4Dw4와 함께 항온처리하였다. 항온처리 후에, 100㎕의 항온처리물을, 1시간 동안 실온에서 10㎍/㎖ 농도의 항-MHC 항체(L243-미국 모식균 배양소(ATCC)HB55 -람손 및 레비(1980)의 문헌 J. Immunol. 125, 293-299에 개시되어 있음)로 미리 피복시킨 효소면역흡착측정(ELISA) 평판(눙크)으로 이동시키고, PBS 및 0.05% 트윈 20중 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 1시간 동안 차단시켰다. 다시 1시간 후에, 결합되지 않은 펩티드를 세척해내고, NP-40(시그마)과 같은 적절한 세정제 0.01%와 PBS중 스트렙타비딘 퍼옥시다제(시그마)의 1/4,000 희석액을 2시간 동안 실온에서 첨가한다. 다시 세척후에, 테트라메틸벤지덴(TMB) 기질 용액[10㎖의 0.1M 구연산염/아세트산염 완충액(pH 6.0)과 36㎕ 우레아 과산화 수소(UHPO)(플루카)중 1TMB 정제(시그마)]을 각 평판에 첨가한다. 2M의 황산을 첨가하여 반응을 종결시키고(웰당 10㎕), 450nm에서 흡광도로 펩티드 결합의 양을 정량한다. 흡광도를 농도에 대해 플롯하여 펩티드의 억제 활성을 얻는다.
정제된 HLA-DR4Dw4는 하기와 같이 얻을 수 있다:
(i) 바큘로비루스 시스템중 HLA-DR의 발현
공지된 과정을 사용하여 바큘로비루스 벡터 유래의 곤충 세포중 재조합 단백질을 발현시켜 고수율의 재조합 단백질을 얻는다[루코브 브이에이 & 섬머스 엠디, 1988, Biotechnology, 6, 47-551]. 단일 재조합 바큘로비루스 벡터(α 및 β 쇄에 대해 별도의 재조합 비루스를 가지고, 따라서 동시-감염시키는 것과는 상반됨)로부터 헤테로이량체 HLA-DR, 예를 들어 HLA-DR4Dw4를 발현시키기 위해서 α 및 β 쇄를 보유하는 이중-재조합 바큘로비루스를 작제한다.
α 폴리펩티드의 서열을 암호하는 cDNA를 전달 벡터 pacYM1내로 클론시켜[마츠우라 와이.; 포쎄 알디; 오버톤 에이치에이 & 비숍 디에이치엘, 1987, J. Gen. Virol., 68, 1233-1250] 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 단백질을 발현시킨다. 이 단위체를 Sf21 곤충 세포에 동종 재조합에 의해 바큘로비루스 게놈내로 삽입시켜 α쇄에 대한 단일 재조합 바큘로비루스를 형성한다. 동종 재조합 및 재조합 비루스의 검출/분리를 위한 곤충 세포의 배양 및 감염 기술은 섬머스, 엠디디 및 스미스 지이(1987) 등의 문헌[A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures: Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin No. 1555]에 충분히 개시되어 있다. 재조합 벡터를 작제하는 분자 유전자 기술은 문헌의 내용을 쉽게 이용할 수 있으며, 삼브룩의 문헌[삼브룩 제이; 피취 이에프 & 마니아티스 티, (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2판. Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 가장 잘 개시되어 있다.
이중-재조합 바큘로비루스를 제조하기 위해서, β쇄를 암호하는 cDNA를 전달 벡터 pAcUW1[웨이어 유; Knight S & Possee RD, 1990, J. Gen. Virol., 71, 1525-1534]내로 클론시켜 P10 프로모터의 조절하에 단백질을 발현시킨다. 이어서, 단위체를 α쇄를 보유하는 단일 재조합 바큘로비루스의 게놈내로 삽입시킨다. 이중-재조합 비루스를, 막상에 무작위적으로 취한 비루스로 형질감염시킨 곤충 세포를 스폿하고, HLA-DR 헤테로이량체를 특이적으로 인식하는 모노클로널 항체(예, L243)를 이와 반응시켜 검출한다. Sf21 곤충 세포에 대한 항체의 결합은 문헌을 참고로 표준 유동 세포계측법을 사용하여 검출한다. HLA-DR을 발현하는 안정한 이중-재조합 바큘로비루스를 플라크-정제한다.
(ii) 곤충 세포 유래의 HLA-DR 정제
사용된 방법은 조르가 등의 문헌[조르가 등, 1987. J. Biol. Chem. 262, 16087-16094]에 개시된 방법의 변형이다. HLA-DR을 발현하는 바큘로비루스/Sf21 세포(10ℓ, 약 2×1010세포에 해당)를 테프론 유리 균질기로 10회 스트로크하여 균질시켜 100㎖의 5mM EDTA(나트륨염), 50mM 트리스-HCl pH 8.5, 2% NP40, 150nM NaCl, 1mM 요오도아세트아미드, 1mM PMSF중에서 용해시켰다. 균질화물을 1시간 동안 100,000g에서 회전시키고, 상등액을 수거하였다. 10㎖의 프로테인-A-세파로스 급유동(파마시아)에 대해 50mg의 L243의 비율로 공유결합되고 10mM 트리스-HCl, pH8.0, 0.1% NP-40으로 예비-항온처리한 항-HLA-DR 모노클로널 항체 LB3.1[조르가 등, 1986, Cell. Immunol. 103, 160-172]을 상등액과 함께 밤새 항온처리하였다. 이어서, 수지를 컬럼내로 붓고 10mM 트리스-HCl, pH8.0, 0.1% NP-40(20컬럼 부피)로 세척한 후 0.15M NaCl, 50nM Na2HPO4, pH7.0, 1% 옥틸글루코시드(20컬럼 부피)로 세척하였다. HLA-DR을 50mM 디에틸아민 pH11.0, 0.15M NaCl, 1% 옥틸글리코시드로 용출시켰다. 컬럼 분획물을 1M 트리스-HCl, pH8.0으로 즉시 중화시키고 센트리콘-10 막을 통해 초원심분리로 농축시켰다. BCA 단백질 분석(피어스)으로 단백질 함량을, SDS-PAGE 전기 영동으로 순도를 측정하였다.
일반적으로 테스트 A로 시험한 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체는 약 10μM 농도 또는 그 이하의 농도에서도 상당한 억제를 나타낸다.
본 발명의 추가의 바람직한 일양태는 HLA-DR3에는 결합하지 않으나, HLA-DR1 및/또는 HLA-DR4Dw4 및/또는 HLA-DR4Dw14에 결합하는 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. HLA-DR3는 류마티스양 관절염과 관련이 없는 공통 HLA-DR 대립유전자이다. 따라서, 대립 유전자중 하나로서 HLA-DR3을 보유하는 류마티스양 관절염 환자에서(류마티스양 관절염 환자의 약 1/3), 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체는 숙주-방어 작용중 HLA-DR3의 정상적인 역할을 저해하지 않을 것이다. 따라서, 펩티드 유도체의 사용은 비-선택적인 DR-결합체와 함께 발생하는 면역억제를 감소시킬 때 류마티스양 관절염 환자를 치료하는데 특히 유용하다.
테스트 A의 변형법으로서, 1종 이상의 HLA-DR 분자에 결합하는 본 발명의 펩티드의 능력은 하기와 같이 평가하였다:
(i) 세포주 유래의 HLA-DR형 정제
사용한 방법은 조르가 등의 문헌[조르가 등, 1987. J. Biol. Chem. 262, 16087-16094]에 개시된 방법의 변형이다. 인체 HLA-DR항원을 면역 친화도 크로마토그래피에 의해 각종 세포주로부터 정제하였다. 간단히 요약하여 설명하면, Hom 2(DR1의 공급원), BBF(DR2의 공급원), AVL-B(DR3의 공급원), JAH(DR4Dw4의 공급원), JHAF(DR4Dw13의 공급원) 또는 PE117(DR4Dw14의 공급원)에서 선택된 적절한 세포주의 1×109내지 5×109의 펠렛화된 세포를 약 4℃에서 테프론 유리 균질기로 10회 스크로크하여 균질시켜, 50㎖의 5mM EDTA(나트륨염), 50mM 트리스-HCl pH7.4, 2% NP40, 150mM NaCl, 1mM 요오도아세트아미드, 1mM PMSF중에서 용해시켰다. 균질화물을 1시간 동안 100,000g에서 회전시키고, 상등액을 수거하였다. CNBr-세파로스 4B(파마시아)에 공유결합 커플링된 항-HLA-DR 모노클로널 항체 LB3.1[조르가 등, 1986, Cell. Immunol. 103, 160-173]을 150mM의 NaCl, 50mM 트리스-HCl, pH7.4, 0.1% NP-40으로 예비-평형시키고, 상등액을 밤새 항온처리하였다. 이어서, 수지를 컬럼내로 팩킹시키고 0.15M NaCl, 50mM 트리스-HCl, pH7.4, 1% 옥틸글리코시드(20컬럼 부피)로 세척하였다. HLA-DR을 50mM 디에틸아민 pH11.0, 0.15M NaCl, 1% 옥틸글리코시드로 용출시켰다. 컬럼 분획물을 1M HEPES NaOH, pH7.4로 즉시 중화시켰다. 비오드 단백질 분석법으로 단백질 함량을, SDS-PAGE 전기 영동으로 순도를 측정하였다.
(ii) 펩티드 선택성 결합 분석
인산 완충액(PBS)중 200nM 비오틴-FHA307-320를 분석 완충액(PBS, 0.01% NP40(시그마))중 억제제 펩티드의 존재 또는 부재하에 정제된 HLA-DR1, DR2, DR4Dw4, DR4Dw13 또는 DR4Dw14와 함께 V자형-웰 미세 역가판(눙크)에서 항온처리하였다. DR3 억제의 경우, 400nM의 비오틴-Ahx-(D)Ala-Ala-Ala-Che-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr- Leu-Lys-Ala-Ala-(D)Ala-OH를 정제된 DR3(20㎍/㎖)과 항온처리하고, 전술한 바와 같이 항온처리하였다. 48시간 후에, 항온 배양물을 처리하고, 테스트 A에 개시된 바와 같이 흡광도를 측정하였다. 펩티드의 억제 활성은 IC50값으로 나타내고 Microcal Origin 소프트웨어를 사용하여 PC에서 계산하였다.
테스트 B: 시험관내 T세포 활성의 억제. (이 분석법은 MHC 클래스 II 분자에 의해 또는 이를 통해 매개되는 T세포 면역 응답을 억제하는 화학식 I의 펩티드 유도체의 능력을 나타내는데 사용할 수 있다).
HLA-DR4Dw4 분자에 의해 제공되는 FHA307-320펩티드(H-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH)에 반응하는 B52.24 쥐 T 세포 하이브리도마의 자극을 차단하는 능력에 대해 억제 펩티드를 시험하였다. 우즈 등의 문헌[우즈 등 (1994) J. Exp. Med. 180, 173-181]에 개시된 바와 같이 BW5147 쥐 T세포 림프종주[화이트 등(1989), J. Immunol. 143, 1822]를 사용하여 FHA307-320면역화된 HLA-DR4Dw4 변이 마우스(국제 특허 출원 공개 제 WO95/03331)로부터 취한 림프절 T 세포를 융합시킨 후 문헌[Current Protocols in Immunology, 2권, 7.21.]에 개시된 T 세포 하이브리도마의 생성에 대한 일반적인 방법으로 B52.24를 제조하였다.
100μM 내지 0.1μM(또는 그 이하) 농도의 억제 펩티드를, 최종 부피 100㎕로 96-웰 미세역가판(눙크)내의 RPM1-1640 배양 배지(기브코)에서 희석하여 10μM의 고정 농도로 또는 100μM 내지 0.1μM 사이로 농도를 다양하게 하여 항원 펩티드 FHA307-320와 혼합하였다. 림프아구 세포주(유럽 모식균 배양소 ECACC 85102909)로 형질전환된 JAH EBV와 같은 HLA-DR4Dw4를 발현하는 B 세포 또는 문헌[Current Protocols in Immunology 7.22.1]에 개시된 방법에 따라 엡스텐 바르 비루스로 형질전환되고 HLA-DR4Dw4 동종접합체로부터 취한 B 세포를 30초 동안 4×106세포/㎖ 농도로 1% 글루테르알데히드(시그마)에 현탁시키므로서 글루테르알데히드를 사용하여 고정시킨 후, 동일한 부피의 200mM 리신(시그마)을 3분 동안 첨가하였다. 300g으로 원심분리하여 세포를 회수하고, RPMI-1640으로 세척하고 항원 및 억제 화합물을 웰당 2×105세포 농도로 함유하는 미세역가판에 첨가하였다. 미세 역가판을 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 항원처리하였다.
이어서, 미세 역가판을 300g에서 원심분리하여 RPMI-1640에서 세척하고, 배양 배지(RPMI-1640, 10% 태아 소 혈청(기브코) 및 2mM 글루타민(기브코))중 웰당 105세포 농도로 B 25.24 T 세포 하이브리도마주를 첨가하기 전에 2회 흡입시켰다. 이어서, 미세 역가판을 37℃, 5% CO2에서 추가의 2시간 동안 항원처리하였다. 그 후, 판을 300g에서 10분 동안 원심분리하고, IL-2 함량 생체분석 전에 -20℃로 냉동된 모든 웰로부터 150㎕의 상등액을 제거하였다.
분석하고자 하는 상등액을 함유하는 배양평판을 실온에 두어 해동시키고 100㎖의 상등액을 새로운 96웰의 둥근 바닥 평판으로 이동시켰다. IL-2의 일련의 1:1 희석을 배양 배지(RPMI-1640(기브코), 10% 태아 소 혈청(어드밴스드 프로테인 프로덕츠), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100U/㎖ 페니실린(기브코), 2mM L-글루타민(기브코) 및 50μM 2-머캅토에탄올(시그마))를 사용하여 수행하여, 250 유니트/㎖에서 최종 0.04 유니트/㎖의 표준 곡선을 형성하였다. CTLL-2세포(Nature(1977) 268 154-156) 또는 HT-2 세포(J. Immunol. Methods(1987) 94-104)과 같은 IL-2 의존성 세포주를 수거하고 5×104세포/㎖로 재현탁시키기 전에 배양 배지를 사용하여 2회 세척하였다. 100㎕의 IL-2의존성 세포 현탁액을 표준 곡선의 각 웰과 시험 시료에 첨가하였다. 배양 평판을 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 항온처리하였다. 이 후, 20㎕(1mCi)의 3H-티미딘(아머샴 인터내쇼날)을 각 웰에 첨가하고, 평판을 다시 항온조에 두어 16시간 더 항온처리하였다. 각 평판의 내용물을 유리 섬유 필터 매트상에 수거하고 방사능활성을 베타평판 신틸레이션 계수관을 사용하여 측정하였다.
일반적으로, 테스트 B에서 시험한 화학식 I의 펩티드 유도체는 약 10μM 이하의 농도에서 상당한 억제를 나타내었다.
테스트 C: BALB/C 마우스중 펩티드 자극된 DHT(지연형 민감성). (이 분석법은 동물 모델중 화학식 I의 펩티드 유도체의 생체내 활성을 입증하는데 사용할 수 있다). 한 군당 5마리의 Balb/c 암컷 마우스(18 내지 20g)를 완전 프로인트 보조액(시그마)과 1:1로 혼합한 난알부민(시그마)(염수중 2㎎/㎖)의 0.1㎖ 유화액으로 측면상에 피하주사로 면역시켰다. 7일 후 이중 캘리퍼스 마이크로미터를 사용하여 발바닥 두께를 측정한 후 염수중 1% 가열-응집시킨 난알부민 단백질을 30 ㎕의 발바닥내 투여로 뒷 발바닥 한쪽에 항원투여하였다. 항원 투여 24시간 후에, 발바닥을 측정하고 반대편측부의 대조군에 비해 주사한 발바닥의 발바닥 두께의 증가율로 DTH 응답을 계산하였다. 10㎎/kg/일 내지 0.1㎍/kg/일 범위의 투여량으로 항원 투여하기 24시간 전에 이식된 삼투압 미니-펌프(알제트)로 3일간 억제제를 투여하였다. 억제 정도는 부형제를 사용한 대조군의 발바닥 팽창값에서 억제제로 치료한 발다닥의 팽창값을 뺀 후, 대조값으로 나누고 100%를 곱하여 계산하였다.
일반적으로, 테스트 C로 시험한 화학식 I의 펩티드 유도체는, 임의의 명백한 독소 또는 기타 바람직하지 않은 약리학적 효과없이, 1㎎/kg/일 이하의 양에서 상당한 억제를 나타내었다.
테스트 D: (이 분석법은 관절염 동물 모델중 화학식 I의 펩티드 유도체의 생체내 활성을 입증하는데 사용할 수 있다).
Balb/c 암컷 쥐(19g 내지 21g, 5∼10마리/군)을 0일 째에 면역시키고, 염수중 메틸화된 소 혈청 알부민(met-BSA, 시그마)과 2.5mg/㎖ 마이코박테리움 투더콜로시스(Mycobacterium trdercolosis)(MTB, 균주 C, DT 및 PN, MAFF, 웨이브릿지, 서레이)로 보충되어 최종 3.5mg/㎖ MTB 농도를 제공하는 완전 프로인트 보조액을 2mg/㎖의 동일 부피로 함유하는 0.1㎖의 유화액을 7일 째에 피하주사하여 추가 자극하였다. 추가의 0.1㎖의 염수중 109보르델텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 유기체(웰컴 퍼투시스 백신)를 동일한 시간에 복강내 주사한다. 14일 후에, 30G 바늘과 해밀턴 주사기를 사용하여 염수중 100㎍의 met-BSA를 함유하는 10㎕를 동물의 무릎 관절에 관절내 주사로 항원투여한다. 반대쪽 무릎은 동일 부피의 염수로 주사하고 대조군으로 사용한다. 양쪽 무릎과 관련된 염증/팽창 정도를 이중-캘리퍼스 마이크로미터를 사용하여 13일 후에 측정한다. 이는 평활-단부모양의 가위 및 핀셋으로 무릎 약 5mm 위와 아래를 피부 절개한 후 무릎의 측면을 따라 아래의 관절을 노출시키도록 조심스럽게 절단한 조직편을 형성하여 수행한다. 고정된 위치에 유지된 구부려진 다리의, 수평 평면상으로 무릎의 가장 넓은 부분을 통해 측정한다. 대조군에 비해 항원-투여된 무릎에서 염증 증가율(%)을 식에 따라 계산한다:[항원 주사된 무릎 두께 - 염수 주사한 무릎 두께/염수 주사한 무릎 두께]×100. 10㎎/kg/일 내지 0.1㎍/kg/일 범위의 투여량으로 항원 투여하기 24시간 전에 이식된 삼투압 미니-펌프(알제트)로 14일 동안 억제제를 투여하였다. 염증/팽창 억제율(%)은 부형제를 사용한 대조군 팽창값에서 억제제 치료군의 팽창값을 뺀 후, 대조값으로 나누고 100를 곱하여 계산하였다. 추가의 질병 평가는 1) 헤모톡실린(haemotoxylin) 및 에오신으로 염색한 고정된 무릎부에서 수행되는 염증, 활액막염 및 연골/뼈 부식의 조직학적 평가 및 2) 혈청, 혈청 아밀로이드 P 및/또는 헵토글로빈중 급성상 반응물의 농도 측정을 포함한다.
전술한 화학식 I의 펩티드 유도체는 테스트 D에서 약 10mg/kg/일 또는 이하의 양에서 상당한 억제를 나타낼 수 있다.
화학식 I의 특정 펩티드 유도체의 약리학적 활성을 예시하는 과정에서, 실시예 5, 16 및 23의 화합물은 모두 테스트 A에서 <0.1μM의 농도에서 HLA-DR4Dw4에 상당한 결합을 나타내었으며, 테스트 C에서 <0.1mg/kg/일에서 활성을 나타내었다. 이들 화합물은 또한 pH3 및 pH7.6에서 우수한 수안정성을 나타내었으며, 압출된 중합체 데포우(depot) 제제의 형태에서 압출시 분해로 인한 최소 손실과 데포우 제제로부터의 방출시 최소 분해를 나타내었다. 테스트 A의 변형법에서, 실시예 23의 화합물은 HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR4Dw4 및 HLA-DR4Dw14에는 현저하게 결합하나 HLA-DR3에서 현저하게 결합하지 않는다는 것을 보여준다(IC50>100μM).
화학식 I의 펩티드 유도체를 유사 펩티드의 합성에 적용할 수 있는 펩티드 화학 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다.
화학식 I의 펩티드 유도체는, 예를 들어 아더톤 및 쉐파드의 문헌[옥스포드 유니버시티 프레스에서 IRL에 의해 출판, 1989] "고체상 펩티드 합성: 실질적인 접근법"에 개시된 방법과 유사한 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 스튜워드 및 영의 문헌[일리노이주 소재의 피어스 케미칼 콤파니에서 출판, 1984] "고체상 펩티드 합성", "펩티드 합성의 원리"[베를린 소재의 스프링거-베르락에 의해 출판 1984], 및 "아미노산, 펩티드 및 프로테인" 시리즈(1 내지 25권; 25권은 1994년 출판)[영국 캠브리지, 로얄 소사이어티 오브 케미스트리에서 출판]에 개시된 방법을 사용하여 화학식 I의 펩티드 유도체를 얻을 수 있다.
화학식 I의 펩티드 유도체는 고체상 일련 합성으로 제조하는 것이 바람직하다. 이 기술을 사용하여, 펩티드의 C-말단 아미노산이 되는 아미노산을 α-아미노기에서 보호하고, 필요에 따라 측쇄에서 보호하며, 고체 지지체상에 커플링시킨다. 고체 지지체의 예로는 수지, 예를 들어 유리 카르복실산이 절단 후에 필요한 경우 2-클로로트리틸클로라이드 수지나 메리필드(Merrifield) 수지(클로로메틸폴리스티렌-디비닐벤젠), 카르복스아미드가 절단 후에 필요한 경우 링크 아미드(Rink Amid) 수지(4(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)페녹시 수지나 링크 아미드(Rink Amid) MBHA 수지(N-(4(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르루이실)-4-메틸 벤즈히드릴아민 수지)(칼바오켐-노바바이오켐사 제품 이용)가 있으며, 이 후 α아미노기 상의 보호기를 제거한다. C-말단 아미노산에 결합된 아미노산을 α-아미노기와 필요에 따라 측쇄에서 보호하고 고체 지지체상에 결합하고 있는 C-말단 아미노산에 커플링시킨다. α-아미노기를 탈보호시킨 후 다음 아미노산에 커플링시키는 단계적 방법을 반복하여 고체 지지체상에 결합한 보호 또는 비보호 폴리펩티드를 제공한다. 화학식 II 또는 III의 R2기는, 보호된 아미노산 대신에 적절하게 보호된 (3-아미노-2-옥소-피롤리딘-1-일)알카논산(II를 함유하는 펩티드 유도체의 경우 A=메틸렌)이나 문헌[J.Med.Chem., 1993, 36, 256-263]에 개시된 방법을 사용하여 얻은 해당 옥사 유사체 또는 이의 유사체(II를 포함하는 펩티드 유도체의 경우 A는 산소) 또는 (6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7-일)알카논산(III을 함유하는 펩티드 유도체의 경우)를 사용하여 보호 또는 비보호 폴리펩티드 서열내로 삽입할 수 있다. 보호 또는 비보호 폴리펩티드를 표준 과정, 예를 들어 삼플루오로산, 트리에틸실란 및 물의 혼합물을 사용하여 고체 지지체로부터 유리시킨다. 측쇄 보호기는 고체 지지체로부터 펩티드를 유리시키는데 사용한 조건하에서 절단하거나, 또는 고체 지지체로부터 펩티드의 유리 전후에 별도 단계에서 절단시킬 수 있다. 폴리펩티드를 형성하는 과정은 특정 커플링 단계에서 적절하게 보호된 2개 이상의 아미노산 서열을 사용하여 변형시킬 수 있다. 예를 들어 어플라이드 바이오시스템스 431A 또는 430A 펩티드 합성기, 어드밴스드 켐텍크 ACT357 펩티드 합성기 또는 유사한 자동 펩티드 합성기를 사용하여 자동적으로 합성하거나 또는 수동 기술을 사용하여 합성할 수 있으며, 또는 이 두 기술의 조합 기술을 사용할 수 있다.
펩티드의 조합과정에서, 반응에 참여하지 않는 아미노산 작용기를 각종 작용기로 보호한다. 에를 들어 N-말단 및 측쇄 아미노기를, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc), t-부톡시카르보닐(Boc), 비페닐이소프로폭시카르보닐(Bpoc), 2-[3,5-디메톡시페닐]프로필-2-옥시카르보닐(Ddz), 아다만틸옥시카르보닐(Adoc), 알킬옥시카르보닐(Aloc), 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐(Troc), 벤질옥시카르보닐 및 각종 치환된 벤질옥시카르보닐기를 사용하여 보호할 수 있다. 이들 보호기는 표준 기술 (산 또는 염기 처리, 촉매 수소분해 및 Pd(O) 처리 또는 아연/아세트산 처리)로 필요에 따라 절단시킬 수 있다.
아르기닌 잔기를 함유하는 펩티드중 측쇄 구아니디노 기의 보호에 사용되는 적절한 보호기로는 니트로, 아다만틸옥시카르보닐, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐(Mtr), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc) 및 (특히) 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐(Pbf)기가 있다.
측쇄 히드록시기의 보호용으로 적절한 보호기는 t-부틸, 벤질 및 트리틸(Trt)이 있다. 히스티딘 잔기를 함유하는 펩티드중 측쇄 이미다졸기를 위한 적절한 보호기는 트리틸, 벤질, 토실, 디니트로페닐, Adoc, Boc 또는 Fmoc기가 있다.
측쇄 카르복실기의 보호에 사용하기 적절한 보호기로는 각종 에스테르(예, 메틸, 에틸, t-부틸, 벤질, 니트로벤질, 알릴 및 9-플루오레닐메틸)이 있다.
보호기 절단 반응은 4℃ 내지 40℃(바람직하게는 약 상온)의 온도에서 10분 내지 24시간 동안 수행할 수 있다.
개개의 아미노산의 커플링에 사용되는 적절한 커플링 방법은 일반적으로 사용되는 아지드, 대칭형 무수물, 혼합된 무수물 및 각종 활성 에스테르와 카르보디이미드를 포함한다. 각종 카르보디이미드(예, 디시클로헥실-카르보디이미드 또는 디이소프로필-카르보디이미드)의 경우, 여러 첨가제(예, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT) 및 N-히드록시숙신이미드)를 첨가할 수도 있다. 또한, 여러 기타 시약, 예를 들어 1H-벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레트(TBTU) 및 (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(HBTU)를 사용하여 아미노산 커플링시킬 수 있다. 커플링 반응은 -20℃ 내지 40℃의 온도에서 10분 내지 24 시간 동안 수행할 수 있다. 커플링 반응을 수행하기 위한 적절한 매체로는 예를 들어, N,N-디메틸포름아미드(DMF)가 있다. 특히 적절한 방법은 DMF중 HBTU, HOBT 및 디이소프로필에틸아민을 사용하는 것을 포함한다.
펩티드를 합성하는 상기 또는 기타의 방법은 본원에서 참고로 인용한 국제 특허 출원에 예시되어 있다. 화학식 R, R.CO-, R.SO2-, R.O.CO-, R.NHCO-, R.O.CS-, R.S.CO-, R.NHCS-, R.S.CS- 및 R.CS-의 기( 또는 P의 말단 아미노기상에 치환체로서 존재하는 기, 여기서 P는 소수성 아미노산 또는 추가의 아미노산기를 갖는 소수성 아미노산임)인 소수성 잔기 P를, 예를 들어 알킬화, 아실화 또는 말단 아미노기의 기타 표준 작용기 변형(예를 들어 지지체로부터 펩티드를 방출하기 전 또는 후)으로 최종 단계에서 삽입할 수 있다. C-말단 변형이 필요한 경우(R4의 특정 값을 얻기 위해서), 펩티드를 합성한 후에, 통상적인 작용기 변형 또는 초기 출발 수지나 수지에 먼저 커플링되는(화학식 R4-H의 적절하게 보호된 기를 사용) 보호체의 적절한 선택으로 수행할 수 있다. 화학식 I의 펩티드 유도체를 제조하는 통상의 실시에는 후술하는 실시예에 나타나있다.
본 발명의 펩티드 유도체의 안정성을 측정하는 통상적인 방법은 하기와 같으며, 미생물 오염 및 분해를 최소화하기 위해서, 펩티드 용액을 제조하는데 사용되는 모든 장비는 오토클레이브에서 멸균하며 모든 재료의 이동은 클래스 II 층류 캐비닛에서 수행한다. 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 pH3 또는 pH 7.6의 약 20㎖의 맥일반스 구연산-인산 완충 용액을 무균 0.22㎛ 필터 유니트 및 20㎖의 주사기를 사용하여 50㎖ 병내로 여과시킨다. 약 1.2mg의 펩티드를 마개가 있는 병에 정확히 칭량한다. 무균 피펫 팁을 사용하여, 충분한 양의 완충액을 병내의 펩티드에 첨가하여 0.1mg/㎖의 펩티드 농도를 제공한다. 병에 마개를 하고 진탕시켜 펩티드를 용해시킨다. 무균 피펫 팁을 사용하여, 약 1㎖의 펩티드 용액 분액을 10 HPLC 병으로 이동시킨 후 병에 마개를 한다. 5개의 병을 -18℃와 37℃에서 저장한다. 용액에 대한 펩티드 피크 면적을, 초기에 적절한 표준물질과, -18℃ 및 37℃에서 1, 2, 3 및 4주 동안 저장한 후에 각 시점에서 새로운 병을 사용한 이중 시료 주입법으로 HPLC에 의해 측정한다. 각 시점에서 37℃ 저장 후에 남아있는 펩티드의 백분율을 초기 면적에 대한 각 시점에서의 펩티드 피크의 면적비로 측정한다. 본 발명의 바람직한 펩티드 유도체는 37℃에서 저장한 후 pH3과 pH7.6에서 모두 펩티드의 90% 이상, 더욱 바람직하게는 남아있다.
화학식 I의 펩티드 유도체는 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 약학적 조성물의 형태로 치료를 요하는 항온 동물(인간 포함)에게 치료 또는 예방 목적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 제2의 목적은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께, 화학식 I의 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
조성물은 경구용, 예를 들어 정제, 캡슐, 수성액 또는 오일성 용액, 현탁액이나 유화액; 비강용, 예를 들어 후제, 비측 분사 또는 점비약; 질 또는 직장용, 예를 들어 좌약; 흡입 투여용, 예를 들어 미세한 분말 또는 액상 에어로졸; 혀밑 또는 협측용, 에를 들어 정제 또는 캡슐; 또는 비경구용(정맥내, 피하, 근육내, 혈관내 또는 주입), 예를 들어 무균 수용액 또는 오일성 용액이나 현탁액 등의 적절한 형태일 수 있다. 조성물은 크림, 연고 및 겔과 같은 국부 투여용으로 적절한 형태일 수 있다. 피부 패취 또한 가능하다. 일반적인 배합은 문헌[Comprehensive Medicinal Chemistry의 25.2장, Vol. 5, 편집자 한쉬 등, Pergamon Press 1990]에 개시되어 있다.
일반적으로 전술한 조성물은 종래 부형제를 사용하여 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 그러나, 경구 투여용 조성물의 경우, 펩티드 활성 성분을 위의 효소 활성으로부터 보호하는 코팅을 포함하는 조성물이 편리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 조성물은 예를 들어, 각 단위 복용량중 2.5mg 내지 500mg, 바람직하게는 10mg 내지 100mg의 폴리펩티드를 포함하는 정제 또는 캡슐의 적절한 경구투여용 단위 복용 형태, 또는 용액 1㎖당 0.5mg 내지 100mg, 바람직하게는 1mg 내지 10mg의 폴리펩티드를 포함하는 적절한 비경구 투여용 단위 복용형태이다.
비경구투여용 조성물은 필요에 따라 pH 5 내지 pH9로 완충시킨 등장 염수 또는 등장 덱스트로스중 용액이 바람직하다. 대안적으로, 비경구용 조성물은 단위 복용량당 폴리펩티드의 양이 통상적인 주입 제제를 사용하는 경우 보다 일반적으로 더 많은 경우 천천히 유리되도록 고안된 것일 수 있다. 천천히 유리되는 제제는 연속적인 유리 제제, 예를 들어 유럽 특허 출원 제58481호에 개시된 형태의 제제, 또는 하나 이상의 염기기를 포함하는 화학식 I의 펩티드의 경우 본원에서 참고로 인용한 특허 출원인 국제 특허 출원 공개 번호 WO93/24150에 개시된 제제일 수 있다. 본 발명의 특정 펩티드는 천천히 유리되는 비경구 제제를 제조 및 가공하는데 특히 적절하게 하는 용해 특성을 갖고 있으며, 이 제제는 특히 폴리락티스와 같은 생체분해성 폴리에스테르를 함유하며, 이로운 유리 프로필을 갖는 천천히 유리되는 제제를 제공한다. 또한, 하나 이상의 염기기, 특히 아르기닌을 함유하는 본 발명의 펩티드는 산-말단화된 폴리에스테르와 펩티드-중합체 염, 예를 들어 폴리락티드를 형성할 수 있으며, 이들 펩티드 및 펩티드-중합체 염은 본 발명의 추가의 양태를 구성한다. 특정염은 예를 들어 WO93/24150에 개시된 바와 같이, 천천히 유리되는 비경구 제제를 제조 및 가공하기에 특히 적절하게 하는 용해 특성을 제공하며, 이로운 유리 프로필과 저장 안정성을 갖는 천천히 유리되는 제제를 제공한다. 천천히 유리되는 바람직한 제제는 단위 복용량당 1mg 내지 100mg(예, 5mg 내지 50mg)의 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 천천히 유리되는 바람직한 비경구 제제는 또한 5일 이상 동안 천천히 유리되도록 고안된 것이다.
본 발명의 바람직한 펩티드는 압출 중합체 데포우 제제의 형태인 경우 데포우 제제로부터 유리시 최소의 분해를 나타내거나 압출시 분해에 의한 최소의 손실을 나타내는 것들을 포함한다. 본 발명의 펩티드의 분해 정도를 측정하는 통상적인 방법은 하기와 같다.
펩티드의 압출 중합체 데포우 제제의 제조
약 20mg의 펩티드를 정확하게 칭량하고 충분한 양의 중합체(평균 분자량이 약 20kD이고 폴리스티렌 표준물질에 대한 크기 제한 크로마토그래피로 측정할 때 약 1.7의 다분산성을 갖는 50/50 몰% 폴리(D,L-락트산/글리콜산)공중합체)를 첨가하여 약 20% w/w 혼합물을 생성한다. 이것을 무수물이 없는 빙초산에 용해시켜 약 10% w/v 용액을 형성한다. 이 용액을 냉동건조시키고 생성된 냉동 건조 생성물을 사용전에 진공하에서 저장한다.
약 100mg의 냉동 건조된 물질을 소규모 실험실용 압출기 배럴에 적재하고 피스톤을 밀어서 시료를 고화시킨다. 압출기를 90℃ 내지 95℃로 가열하고, 냉동 건조 물질을 압력하에서 압출시키기 전에 10분 동안 이 온도를 유지하여 약 1mm 직경의 원통 모양 압출물을 얻는다.
펩티드를 함유하는 압출 중합체 데포우 제제의 펩티드 함량 분석
2개의 펩티드를 함유하는 약 5mm 길이를 갖는 압출 중합체 데포우의 중량을 정확하게 칭량하고 각각을 별도의 25㎖ 부피 플라스크에서 1㎖의 무수물이 없는 빙초산에 용해시킨다. 약 1.5 시간 후에, 각각의 부피를 증류수를 이용하여 25㎖로 만들어 중합체를 침전시킨다. 0.5μM 밀렉스 PTFE 필터를 사용하여 고체를 여과시키고, 용액 A를 수거한다.
일련의 표준 용액을 증류수중 펩티드 저장 용액으로부터 0.5mg/㎖로, 무수물이 없는 빙초산중 중합체 저장 용액으로 부터 2.5mg/㎖로 하기와 같이 제조하고, 각 용액을 증류수를 이용하여 10㎖로 만든다.
펩티드 농도(㎍/㎖) 원료 중합체 용액 부피(㎕) 원료 폡티드 용액의 부피(㎕)
50 1000 1000
40 1000 800
30 1000 600
20 1000 400
10 1000 200
5 1000 100
0 1000 0
각 표준 물질을 5μM 밀렉스 PTFE 필터를 통해 여과시키고, 여과물 분액을 용액 A의 분액과 함께 이중 시료 주입법을 사용하여 HPLC로 분석한다. 펩티드의 압출 중합체 데포우 제제의 펩티드 함량은 용액 A중 펩티드의 농도로 계산하며, 이는 표준 용액으로부터 얻은 펩티드 피크 면적과 용액 A에서 얻은 펩티드 피크의 면적을 비교하므로써 측정한다. 본 발명의 바람직한 펩티드는 압출시 분해로 인한 손실을 최소화하며, 따라서 압출 중합체 데포우 제제의 펩티드 함량이 약 20% w/w의 이론값에 근접한다.
압출 중합체 데포우로부터 시험관내 유리시 펩티드 분해
0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 맥일반 구연산-인산 완충액 pH7.6 용액을 0.22μ 필터를 통해 여과시키고 4℃에서 저장한다. 약 10mg의 펩티드를 함유하는 압출 중합체 데포우를 2개의 작은 병에 놓고 2㎖의 완충액 용액을 첨가한다. 이어서 병을 마개로 막고 1개월 동안 37℃의 수욕에 저장한다. 1개월 후 적절한 시기에, 3개의 0.6㎖의 유리 매체 분액을 각 병으로부터 제거하고, HPLC로 분석하거나 HPLC로 분석하기 전에 -18℃의 HPLC 병에 냉동 저장한다. 1.8㎖의 완충액을 데포우를 함유하는 각각의 병에 첨가하여 각각의 시점에서 제거되는 유리 매체를 대체한다.
각 시점의 유리 매체에서 손상되지 않은 펩티드의 평균 양은 이중 시료 주입법을 사용하여 공지된 농도의 펩티드 표준 완충액으로부터 얻은 펩티드 피크 면적과 유리 매체에서 얻은 펩티드 피크 면적을 비교하여 HPLC로 측정한다. 각 시점에서 유리 매체의 펩티드 분해 생성물의 대략적인 평균양은 공지된 농도의 펩티드 표준 완충액으로부터 얻은 펩티드 피크 면적과 유리 매체에서 얻은 새로운 추가 피크 면적을 비교한 후 흡광 계수가 변하지 않는다는 가정하에 HPLC로 측정한다. 손상되지 않은 펩티드와 총 펩티드(손상되지 않은 펩티드와 펩티드 분해 생성물)의 시험관내 평균 누적 유리 프로필은 각 시점의 유리 매체에서 손상되지 않은 펩티드와 펩티드 분해 생성물의 양으로부터 측정한다. 본 발명의 바람직한 펩티드는 시험관내에서 최소의 분해를 나타내며, 따라서 시험관내 유리 1개월 후에 pH7.6, 37℃의 맥일반스 완충액내로 총 펩티드의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 총 펩티드 분해 생성물을 나타낸다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 예를 들어 체중 70kg의 환자의 경우 일일 사용량이 10㎍ 내지 5000mg, 바람직하게는 0.1mg 내지 100mg이 되도록 필요에 따라 분할하여 인간에게 투여한다. 투여되는 정확한 양 및 투여 경로와 형태는 치료할 사람의 크기, 연령 및 성과, 치료할 특정 질병 또는 의학적 증상 및 이의 경중에 따라 달라지며, 이는 의료 업계에 공지된 원리이다.
화학식 I의 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, 전술한 1종 이상의 질병 또는 의학적 증상을 치료 또는 경감시키는데 효과적이라고 업계에 일반적으로 공지된 1종 이상의 기타 약리학적 제제(또는 질병 조절제), 예를 들어 NSAID(예, 이부프로펜 또는 피록시캄), 진통제(예, 파라세타몰), 코르티코스테로이드, 근육 이완제, 리폭시게나아제 억제제, 메토트렉세이트, 아자티오프린, D-페니실아민, 시클로스포린 A 또는 모노클로널 항체 치료제(예, 항-CD4 또는 항-TNF)와 함께 치료 또는 예방용으로 투여하는 것이 유리할 수 있다. 당뇨병에서, 펩티드 유도체는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증을 치료하기 위한 인슐린 또는 기타 치료제(예, 알도스 리덕타제 억제제)와 동시-투여할 수 있다. 이러한 조합 치료법은 본 발명의 추가의 양태임을 인지해야 한다.
본 발명의 제3의 목적은 MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가면역 또는 염증성 질병, 예를 들어 본원에서 기술한 1종 이상의 질병 또는 의학적 증상을 치료하는 방법을 제공하는 것이며, 이 방법은 화학식 I의 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 치료를 요하는 항원 동물(인간 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 제4의 목적은 또한 MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가면역 또는 염증성 질병을 치료하는데 사용하기 위한 신규 약제의 제조에 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공하는 것이다.
인간용 치료 약제 용도외에, 화학식 I의 펩티드 유도체는 상업적으로 유용한 항온-동물, 예를 들어 개, 고양이, 말 및 소에 영향을 주는 유사한 증상의 수의용 치료에도 또한 유용하다.
일반적으로, 이러한 치료를 위해서, 화학식 I의 펩티드 유도체를 인간에게 투여한 것과 유사한 양 및 방식으로 투여한다. 새롭고 개선된 치료제를 계속적으로 찾기 위한 일부로서 또는 진단용 제제의 일부로서 화학식 I의 펩티드 유도체는 실험실용 동물, 예를 들어 고양이, 개, 토끼, 원숭이, 래트 및 마우스중 MHC 클래스 II 분자의 영향을 평가하기 위한 테스트 시스템의 개발 및 표준화에 약리학적 도구로서 가치가 있다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 예시될 것이며, 특별한 언급이 없으면 하기와 같은 조건을 사용한다:
(i) 농축 및 증발은 진공에서 회전식 증발기로 수행하였다.
(ii) 실온, 즉 18℃∼26℃에서 조작하였다.
(iii)수율은, 제공된 경우, 공정 진행에 의해 달성가능한 최대 수율일 필요는 없으며 단지 독자의 보조용이다.
(iv) 하기의 약어를 사용한다:
Phv= 5-페닐발레릴; Boc= 3차-부톡시카르보닐; tBu= 3차-부틸; DMF= N,N-디메틸포름아미드; HOBT=1-히드록시-벤조트리아졸; Met= 메티오닌; Fmoc= 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐; Fmoc-Pip-OH= N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)피페리딘-4-카르복실산; Fmoc-Papa-OH= 4-[N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)아미노]페닐아세트산; CbZ= 벤질옥시카르보닐; Pmc= 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐; Pbf= 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐; THF= 테트라히드로푸란; DMSO= 디메틸설폭시드; HBTU=2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트; DIPEA= 디이소프로필에틸아민; TFA= 트리플루오로아세트산; Su는 고리 질소 원자를 통해 결합된 숙신이미드; HPLC= 고압 액체 크로마토그래피; 및 RP-HPLC=역상 고압 액체 크로마토그래피(기타의 언급이 없으면 Vydac C18 칼럼 218TP54, 4.6×250mm에서 수행);
(v) 실리카상의 섬광 크로마토그래피 및 크로마토그래피는 독일 다름슈타트에 소재하는 에 메르크사에서 입수한 Merck Kieselgel 60(제품 번호 9385)에서 수행하였다;
(vi) H1NMR 스펙트럼은 내부 표준 물질로 테트라메틸실란(TMS)을 사용하여 CDCL3또는 d6-디메틸설폭시드(d6-DMSO)중 200Mhz에서 측정하였고, 화학적 이동(델타)값을 TMS에 대한 ppm으로 나타내었으며 주요 피크에 대한 통상적인 약어를 사용하였다: s, 단일선; m, 다중선; t, 3중선; br.폭이 넓음; d 이중선;
(vii) 다음 Fmoc-보호된 아미노산은 Lys, Thr, Arg 또는 His 잔기를 도입시키는데 사용하였다:
Lys의 경우: Fmoc-Lys(Boc)-OH; Thr의 경우: Fmoc-Thr(OBu)-OH; Arg의 경우: Fmoc-Arg(Pmc)-OH 또는 Fmoc-Arg(Pbf)-OH; 및 His의 경우: Fmoc-His(Trt)-OH;
(viii) 실시예 2에서, 화학식 III은 Rb가 메틸인 화학식 III을 의미한다.
(ix) 실시예 17 및 실시예 31에서, 생성물의 명칭중 "모르폴린"은 모르폴린기가 메틸렌기에 이웃한 고리 질소에 결합한다는 것을 의미한다.
(x) 실시예 18 및 34에서, 생성물의 명칭중 "N(CH2CH2)2N"는 피페라진 고리를 의미한다; 및
(xi) 실시예 30에서, 생성물의 명칭중 "-Lys(=C(NMe2)2-"는 L-아미노산 잔기 -HN-CH[CH2CH2CH2CH2N=C(NMe2)2]-CO-를 의미한다.
실시예 1
Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH2(서열 번호 1)의 제조
1.1 Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe의 합성
N-메틸모르폴린(5.6g), L-알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드(3.9g), HOBT(4.6g) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드(5.3g)를 건조 DMF(50㎖)중 Boc-(D)-메티오닌(7g, 0.028mol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 증발시켜 제거하고 잔여물을 디클로로메탄(100㎖)과 5% 수성 아세트산(50㎖)사이에 분배시켰다. 정치시 HOBT를 결정화시키고 여과시켜 제거하고, 유기층을 분리하고 수성 중탄산 나트륨으로 세척하고, 건조(MgSO4)시킨 후 증발시켰다. 디클로로메탄과 에테르(0% 내지 100% 에테르)의 혼합물로 용출시켜 소결 깔대기에서 잔여물(8.5g)을 섬광 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획물을 혼합하고 증발시켜 Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe(7.2g)을 검으로 얻었으며 정치시 결정화된다; NMR(CDCl3): 1.4(d, 3H), 1.45(s, 9H), 1.95(m, 1H), 2.1(s, 3H), 2.1(m, 1H), 2.6(m, 2H), 3.75(s, 3H), 4.3(bs, 1H), 4.6(m, 1H), 5.3(m, 1H), 6.9(bs, 1H).
1.2 메틸 (2S)-2-[(3R)-3-(N-[3차-부틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피오네이트의 합성
주의: 이 서열은 건조 용매를 사용하여 건조 조건하에서 수행되어야만 하며, 그렇지 않으면 에피머화 반응이 발생한다.
메틸 요오드화물(10㎖)를 DMF(20㎖) 및 디클로로메탄(20㎖)의 혼합물중 Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe(8g)에 첨가하고 혼합물을 16시간 동안 정치시킨 후 증발시켜 건조하였다. 디클로로메탄(2×50㎖)을 더 첨가하고 잔여 메틸 요오드화물을 증발시켜 제거한 후, 잔여물을 DMF(300㎖) 및 디클로로메탄(300㎖)의 혼합물중 용해시켰다. 혼합물을 ∼5℃로 냉각시키고 수산화 나트륨(0.76g의 광유중 80% 분산액)을 일부 첨가하고 혼합물을 이 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 포화 수성 염화 암모늄(50㎖)을 첨가하고 혼합물을 증발시켜 건조한 후 물과 에테르 사이에 분배시켰다. 에테르 추출물을 염수로 세척하고 건조시키고 증발시켜 검을 얻었으며, 이를 소결 깔대기(25% 에틸 아세테이트:헥산 내지 100% 에틸아세테이트)에서 섬광 크로마토그래피로 정제하여 메틸 (2S)-2-[(3R)-3-(N-[3차-부틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피오네이트를 검으로(4.2g) 얻고 이를 정치하여 결정화하였다: NMR(CDCl3): 1.4(s, 9H), 1.4(d, 3H), 1.8(m, 1H), 2.6(m, 1H), 3.4(m, 2H), 3.7(m, 3H), 4.2(m, 1H), 4.9(q, 1H), 5.2(bs, 1H).
1.3 (2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-플루오레닐메틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피온산(Fmoc-IIb-OH)의 합성
메틸 (2S)-2-[(3R)-3-(N-[3차-부틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피오네이트(4g)을 아세톤(60㎖), 물(40㎖) 및 진한 염산(24㎖)의 혼합물중 3시간 동안 환류시킨 후 혼합물을 증발시켜 건조하였다. 물을 첨가하고 증발을 반복하였다. 잔여물을 물(15㎖)에 용해시키고 과량의 고체 중탄산나트륨을 첨가하였다. 아세톤(30㎖)중 9-플루오레닐메틸 숙신이미딜 카보네이트(5.2g)를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 교반한 후 용매를 증발시켜 제거하고 잔여물을 물과 에테르 사이에 분배시켰다. 수성층을 분리하고 pH를 염산으로 ∼3으로 조정한 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고, 건조(MgSO4)시키고 증발시켜 백색 발포체를 얻었으며, 이를 에테르로 분쇄시 결정화하여 백색 고형분으로서 (2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-플루오레닐메틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]프로피온산(4.2g), mp. 191-193℃(분해)을 얻었다; NMR(CDCl3): 1.4(d, 3H), 2.0(m, 1H), 2.6(m, 1H), 3.4(m, 2H), 4.2(t, 1H), 4.4(m, 3H), 4.9(m, 1H), 5.8(bs, 1H), 7.4(m, 4H), 7.6(d, 2H), 7.7(d, 2H).
1.4 Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH2(서열 번호 1)의 합성
Bond Elut tube(배리언, 15㎖, 바닥에 여과기가 장착)에서 Fmoc 링크 아미드 MBHA 수지(노바바이오켐, 0.50g, 0.25mmol)로 출발하여 Fmoc 고체상 합성으로 펩티드를 제조하였다.
(a) DMF중 20% 피페리딘 용액을 사용하여(각 10분 동안 5㎖로 2회 처리) 수지를 탈보호시켰다. 탈보호 후에, 수지를 DMF(5×10㎖)로 잘 세척하였다.
(b) Fmoc-Pip-OH(353mg, 1mmol), DMF(1.5㎖), HOBT(165mg, 1mmol) 및 디이소프로필카르보디이미드(155㎕, 1mmol) 용액을 첨가하여 아실화시켰다. 약 30분 동안 커플링시키고, DMF(5×10㎖)로 세척하고 카이저 테스트(이.카이저 등, (1970), Anal. Biochem. 34, 595)를 사용하여 아실화가 종료되었는지에 대해 수지 소량을 검사하였다.
상기 탈보호 (a) 및 커플링 사이클(b)을 하기를 사용하여 반복하였다:
Fmoc-Ala-OH (311mg, 1mmol);
Fmoc-IIb-OH (394mg, 1mmol);
Fmoc-Val-OH (339mg, 1mmol);
Fmoc-Lys(Boc)-OH (468mg, 1mmol);
Fmoc-Ala-OH (311mg, 1mmol);
Fmoc-Ala-OH (311mg, 1mmol);
Fmoc-Ala-OH (311mg, 1mmol); 및
5-페닐발레산 (178mg, 1mmol).
각 경우에, 커플링 시간은 약 30분이며 수지 소량을 카이저 테스트로 아실화 종료에 대해 검사하였다. 페닐발레산은 카이저 테스트로 양성 결과를 얻기 위해서 이중 커플링을 필요로하였다.
트리플루오로아세트산(7.9㎖) 및 트리에틸실란(0.395㎖)의 혼합물을 사용하여 수지로부터 펩티드를 절단시켰다. 2시간 후에, 수지를 디클로로메탄(약 150㎖)으로 세척하고 생성 용액을 증발시켜 건조하였다. 생성 고체를 에테르(25㎖) 및 물(25㎖) 사이에 분배시킨 후 에테르를 추가의 물(2×25㎖)로 추출하였다. 수성상을 혼합하고 냉동건조시켰다.
정제용 RP-HPLC(Vydac 218TP1022 칼럼, 250mm×22mm)를 사용하고, 200㎕의 DMF와 5㎖의 20% 아세토니트릴/물에 미정제 물질을 적재하여 미정제 생성물을 정제하였다. 80분 동안 10㎖/분의 유속으로 0.1% TFA(15%∼35% 아세토니트릴)을 함유하는 아세토니트릴-물의 구배로 용출시켰다. 생성물을 함유하는 분획물을 혼합하고 냉동건조시켜 Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH2(서열 번호 1)을 백색 고형분으로 얻었다(84mg, 35% 수율).
이 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다.
0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시키고, 30분 동안 1.0㎖/분의 유속으로 10%∼50% 아세토니트릴 구배를 사용한 RP-HPLC Vydac C18 칼럼, 218TP54, 4.6×250mm은 100% 순도, 체류시간 18.56 분을 나타내었다; 질량 분광분석법, m/e(양성 전기분무(ES+)) 954.6(MH+); 아미노산 분석(130℃에서 1% 페놀을 함유하는 6N HCl 용액을 사용하여 24시간 동안 산 가수분해), (Ala+IIb) 4.80, Val 1.11, Lys 1.07.
N-Fmoc-L-메티오닌에 대해 이.아더톤 및 알.시.쉐퍼드의 문헌["Solid phase peptide synthesis: a practical approach", IRL press, 1989, p51]에 개시된 방법과 유사한 방법을 사용하여 Fmoc-Pip-OH를 얻었다:
Fmoc-Pip-OH: NMR(DMSO-d6): 1.3(m 2H), 1.7(m, 2H), 2.5(m, 2H), 2.9(t, 2H), 3.7(m, 1H), 4.2(t, 1H), 4.4(d, 2H), 7.4(m, 2H), 7.7(d, 2H), 7.9(d, 2H); 질량 분광분석 m/e(ES+) 352.2(MH+).
실시예 2
Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH2(서열번호 2) 및 이성체의 분리
2.1 (RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤린의 합성
THF(20㎖)중 N-벤지옥시카르보닐프롤린 메틸 에스테르(13g)를 -78℃에서 질소하에 THF(100㎖)중 리튬 디이소프로필아미드(27.5㎖, 헥산/THF중 2M)에 적가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후 알릴 요오드화물(5.5㎖)을 적가하고 혼합물을 30분동안 더 교반한 후 상온으로 가온하였다. 이어서, 혼합물을 수성 염화 암모늄(200㎖)에 첨가하고 에테르(2×200㎖)로 추출하였다. 에테르층을 증발시키고 잔여물을 헥산에서 20% 에틸 아세테이트:헥산으로 증가하는 구배를 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하였다. 증발시켜 건조한 적절한 분획물에서 오일로서 메틸 (RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤리네이트(9g)를 얻었다.
8.5g의 이 물질을 메탄올(40㎖)에 용해시키고, 수산화 나트륨(4.5g)을 물(20㎖)에 첨가하고 혼합물을 60분 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물의 pH를 진한 염산을 사용하여 7로 조정하고 메탄올을 증발시켜 제거하였다. 혼합물의 pH를 3으로 조정하고, 혼합물을 에테르(2×50㎖)로 추출하였다. 혼합된 에테르 추출물을 증발시켜 (RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤린을 검으로 얻었다: NMR(d6-DMSO (373K)): 1.9(m, 2H), 2.1(m, 2H), 2.6(q, 1H), 2.9(q, 1H), 3.4(m, 1H), 3.6(m, 1H), 5.0(m, 4H), 5.75(m, 1H), 7.3(m, 5H)
2.2 [(RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤릴]-(S)-알라닌 메틸 에스테르의 합성
HOBT(7.7g), N-메틸모르폴린(6.6g), L-알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드(4.5g) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보디이미드(5.7g)을 DMF(30㎖)중 (RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤린(6.5g)에 첨가하고 혼합물을 18시간 동안 교반한 후 증발시켰다. 잔여물을 물과 에테르사이에 분배시키고, 여과시켜 HOBt를 제거하고 유기층을 분리하였다. 유기층을 증발시키고, 잔여물을 헥산중 20% 에틸 아세테이트에서 헥산중 50% 에틸 아세테이트로 증가하는 구배를 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획물을 혼합하고 증발시켜 건조하여 [(RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤릴]-(S)-알라닌 메틸 에스테르(7g)을 얻었다; NMR(d6-DMSO (373K)): (일부 이중 피크는 부분입체 이성체의 혼합물에 의한 것임) 1.25 및 1.3(2d, 3H), 1.75(m, 2H), 2.2(m, 2H), 2.65(m, 1H), 2.9(m, 1H), 3.4(m, 1H), 3.65(2s, 3H), 3.7(m, 1H), 4.3(2q, 1H), 5.0(m, 4H), 5.7(m, 1H), 7.3(m, 5H), 7.4 및 7.5(bs, 1H).
2.3 메틸 (S)-2-(1-벤질옥시카르보닐-6-옥소-1,7-디아자스피로[4.4]논-7-일)프로피오네이트 (CbZ-III-OMe)의 합성
오스뮴 테트록시드(1.5㎖의 4% 수용액)를 메탄올(30㎖) 및 물(20㎖)의 혼합물중 [(RS)-2-알릴-N-(벤질옥시카르보닐)프롤릴]-(S)-알라닌 메틸 에스테르(1.45g)에 첨가하였다. 혼합물을 아르곤하에서 10분 동안 교반한 후 나트륨 페리오데이트(2.45g)를 분할하여 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 교반한 후 물(100㎖)을 첨가하고 혼합물을 에틸 아세테이트(2×70㎖)로 추출하였다. 혼합된 추출물을 건조시키고 증발시켜 1.4g의 검을 얻었다. 이 검을 디클로로메탄(30㎖) 및 트리에틸실란(0.65g)에 용해시킨 후 트리플루오로아세트산(4g)을 적가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하고, 증발시키고, 잔여분을 수성 중탄산 나트륨과 에테르 사이에 분배시켰다. 에테르 추출물을 분리하고 증발시켜 건조하였다. 잔여물을 헥산중 25% 에틸 아세테이트에서 100% 에틸 아세테이트로 증가하는 구배를 사용하여 실리카 상에서 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획물을 혼합하고 증발시켜 건조하여 메틸 (S)-2-(1-벤질옥시카르보닐-6-옥소-1,7-디아자스피로[4.4]논-7-일)프로피오네이트(0.8g)을 얻었다; NMR(d6-DMSO (373K)): (일부 이중 피크는 부분입체 이성체의 혼합물에 의한 것임) 1.25 및 1.35(2d, 3H), 1.95(m, 6H), 3.1-3.5(m, 4H), 3.6 및 3.65(2s, 3H), 4.5 및 4.65(2q, 1H), 5.05(m, 2H), 7.25(m, 5H)
2.4 (S)-2-(6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7-일)프로피온산(H-III-OH)의 합성
탄산 칼륨(2.5g)을 메탄올(40㎖) 및 물(40㎖)의 혼합물중 메틸 (S)-2-(1-벤질옥시카르보닐-6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7-일)프로피오네이트(3.3g)에 첨가하고 혼합물을 10시간 동안 상온에서 교반하였다. pH를 진한 염산을 사용하여 ∼5로 조정하고 혼합물을 증발시켜 건조하였다. 잔여물을 물(40㎖)에 용해시키고 pH를 진한 염산을 사용하여 3으로 조정하였다. 이어서, 혼합물을 디클로로메탄(2×50㎖)으로 추출하였다. 혼합된 추출물을 건조(MgSO4) 및 증발시켜 발포체(2.8g)를 형성하였다. 이 발포체를 메탄올(20㎖)에 용해시키고 시클로헥산(0.7g)을 첨가한 후 10% Pd/C(0.5g)를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 환류시키고, 냉각시키고 여과시키며, 여과물을 증발시켜 (S)-2-(6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7일)프로피온산(1.9g)을 발포체로 얻었다; NMR(d6-DMSO (373K)): (일부 이중 피크는 부분입체 이성체의 혼합물에 의한 것임) 1.25 및 1.3(2s, 3H), 1.8(m, 4H), 2.0(m, 2H), 3.0(m, 2H), 3.3(m, 2H), 4.5(m, 1H).
2.5 (S)-2-[1-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-6-옥소-1,7-디아자스피로-[4,4]-논-7-일]프로피온산(Fmoc-III-OH)의 합성
과량의 고체 중탄산 나트륨을 물(2㎖)중 (S)-2-(6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7-일)프로피온산(0.42g)에 첨가한 후 아세톤(3㎖)중 9-플루오레닐메틸 숙신이미딜 카르보네이트(0.7g)를 첨가하였다. 혼합물을 18시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 물(10㎖)에 첨가하고, 에테르(10㎖)로 추출하고 수성층을 분리하였다. (에테르층은 버렸다). 수성층의 pH를 진한 염산을 사용하여 ∼3으로 조정한 후 디클로로메탄(2×10㎖)으로 추출하였다. 혼합된 추출물을 분리하고, 건조(MgSO4)시킨 후 증발시켜 (S)-2-[1-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-6-옥소-1,7-디아자스피로[4,4]논-7-일]프로피온산(0.62g)을 백색 발포체로서 얻었다; NMR(d-DMSO (373K)): (일부 이중 피크는 부분입체 이성체의 혼합물에 의한 것임) 1.3(2d, 3H), 1.6-2.0(m, 6H), 3.05(m, 1H), 3.2-3.45(m, 3H), 4.2-4.4(m, 1H), 4.5(m, 1H), 6.2(s, 2H), 7.35(m, 4H), 7.8(m, 4H).
2.6 Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH2(서열번호 2)의 합성 및 이성체의 분리
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 합성의 제1부분을 수행하였으나, 단 Fmoc-IIb-OH 대신 Fmoc-III-OH를 사용하였다. 이 경우, 하기 방법으로 산의 활성화에 의해 아실화시켰다: 산(1mmol), HBTU(1mmol), 디이소프로필에틸아민(2mmol), DMF(4㎖). 45분 미만이 시간이 지난후에 카이저 테스트에 의해 모든 커플링이 완료되었음을 확인하였다. 이 방법을 사용하여 Fmoc-Val-III-Ala-Pip-NH-수지를 얻었다. 이어서, 펩티드 수지를 ABI 431 자동 펩티드 합성기로 이동시키고, 이 합성기에서 서열중 남은 잔기를 하기와 같이 HBTU/HOBT 화학물질을 삽입시키는 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에 따라 커플링시켰다. 탈보호 후에, 수지를 DMF(10×10∼20㎖)로 세척하였다. 수지로 이동시키기 전에 약 11분 동안 DMF중 HBTU(1당량), HOBT(1당량) 및 DIPEA(2당량)로 카르복실산(1mmol)을 활성화시켰다. 약 60분 동안 아실화시킨 후 수지를 DMF(10×10∼20㎖)로 세척하였다. 각 단계에서 DMF중 20% 피페리딘 용액(각각 10분 동안 5㎖로 2회 처리)을 사용하여 Fmoc 탈보호시켰다. 각 탈보호 후에, 수지를 DMF(5×10㎖)로 철저하게 세척하였다.
트리플루오로아세트산(TFA), 트리에틸실란(TES) 및 물(10㎖, 90:5.5)의 혼합물로 1.5 시간 동안 처리하여 수지로부터 펩티드를 절단시켰다. 수지를 여과하고 TFA로 철저하게 세척하고, 수거된 여과물을 회전식 증발을 사용하여 건조물로 농축시킨 후 생성 잔여물을 에테르로 분쇄하여 2개의 주 성분(RP-HPLC(Vydax 218TP54 C18 칼럼)은 52:48 혼합물임을 나타냄)을 함유하는 Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH2(서열번호 2)를 생성한다. 1㎖/분의 유속에서 20분 동안 20% 내지 50%의 아세토니트릴:물(0.1% TFA 함유) 구배를 사용하여 더욱 극성인 부분입체 이성체는 12.5 분의 체류 시간으로 용출되고 덜 극성인 부분입체 이성체는 16.5분의 체류 시간으로 용출된다. 실시예 1.4에 개시된 바와 같이 필수적으로 펩티드를 정제용 RP-HPLC로 추가 정제하여 2개의 분리된 성분을 얻었으며, 이는 모두 RP-HPLC에 의해 >95% 순도를 나타내었다. 더 극성인 부분입체 이성체는 덜 극성인 부분입체 이성체보다 테스트 A와 테스트 B에서 더 큰 유효성을 나타내었으며, 하기와 같은 특성을 가진다:
RP-HPLC(20분 동안 20∼50% 아세토니트릴 구배, 유속 1㎖/분, 체류시간 = 12.3분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 994.5(MH+); 아미노산 분석, Ala 3.99, Lys 1.20, Val 0.73.
실시예 3
Phv-Ala-Lys-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(서열 번호 3)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성한 후 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 20분 동안 25% 내지 40% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 5.56분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 926.5(MH+); 아미노산 분석, (Ala+IIb) 5.87, Lys 1.12.
실시예 4
Phv-Ile-Ala-Ala-Arg-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 4)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH(Fmoc-Pip-OH 대신 사용), Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성하고 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 20% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 17.08분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1048.7(MH+); 아미노산 분석, Arg 0.98, Ala 3.00, IIb 1.27, Thr 0.86, Ile 0.88.
N-Fmoc-L-메티오닌에 대해 이.아더톤 및 알.씨 쉐퍼드의 문헌["Solid phase peptide synthesis: a practical approach", IRL press, 1989, p51]에 개시된 것과 유사한 방법으로 Fmoc-Papa-OH를 얻었다:
Fmoc-Papa-OH: NMR(DMSO-d6) : 3.5(s, 2H), 4.25(t, 1H), 4.5(d, 2H), 7.1(d, 2H), 7.4(m, 6H), 7.75(d, 2H), 7.9(d, 2H), 9.6(s, 1H); 질량 분광분석 m/e(ES-) 372.1(M-H)-
실시예 5
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Val-IIb-Ala-Pip-NH2(서열 번호 5)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성시켰다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 0.1% TFA을 함유하는 아세토니트릴-물의 구배(15%∼40% 아세토니트릴)로 60분 이상 10㎖/분의 유속으로 용출시킨 생성물을 정제용 RP-HPLC를 사용하여 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석을 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 18.28분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 982.5(MH+); 아미노산 분석, Arg 1.12, (Ala+IIb) 3.8, Val 1.12.
실시예 6
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 6)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH(Fmoc-Pip-OH 대신 사용), Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성의 제1부를 수행하여 Fmoc-Thr(OBu)-IIb-Ala-Papa-NH-수지를 얻었다. 펩티드를 자동 합성기 (ACT 357)로 이동시키고 남은 잔여물을 HBTU/HOBT 화학물질을 삽입하는 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에 따라 커플링시켰다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하고 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 18.21분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1006.4(MH+); 아미노산 분석, Arg 1.10, Ala 3.88, IIb 1.04, Thr 0.95.
실시예 7
Phv-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 7)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH(Fmoc-Pip-OH 대신 사용), Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성의 제1부를 수행하여 Fmoc-Val-IIb-Ala-Papa-NH-수지를 얻었다. 이어서 펩티드 수지를 자동화된 합성기 (ABI 431)로 이동시키고 남은 잔여물을 HBTU/HOBT 화학물질을 삽입하는 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에 따라 커플링시켰다. 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하고 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 20.87분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1004.6(MH+); 아미노산 분석, Arg 0.96, (Ala + IIb) 5.05, Val 0.97.
실시예 8
Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Val-IIb-Gly-Papa-NH2(서열 번호 8)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH(Fmoc-Pip-OH 대신 사용), Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성의 제1부를 수행하여 Fmoc-Val-IIb-Gly-Papa-NH-수지를 얻었다. 이어서 펩티드 수지를 자동화된 합성기 (ABI 431)로 이동시키고 남은 잔여물을 HBTU/HOBT 화학물질을 삽입하는 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에 따라 커플링시켰다. 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하고 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 18.12분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 538.4(M+2H++); 아미노산 분석, Arg 0.92, Ala 2.16, (Val + IIb) 2.12, Val 0.88.
실시예 9
Phv-Ala-Ile-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Pip-NH2(서열 번호 9)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성하고 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 23.4분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1024.6(MH+); 아미노산 분석, Arg 1.15, (Val + IIb) 3.88, Val 0.96, Ile 1.02.
실시예 10
Phv-Ala-Arg-Ala-His-Val-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 10)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH(Fmoc-Pip-OH 대신 사용), Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성의 제1부를 수행하여 Fmoc-Val-IIb-Ala-Papa-NH-수지를 얻었다. 이어서 펩티드 수지를 자동화된 합성기 (ABI 431)로 이동시키고 남은 잔여물을 HBTU/HOBT 화학물질을 삽입하는 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에 따라 커플링시켰다. 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하고 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산으로 분석하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 20% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 18.8분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1070.6(MH+); 아미노산 분석, Arg 1.02, (Ala+IIb) 4.12, Val 0.90, His 0.95.
실시예 11
Phv-Ala-Ala-Asn-Arg-Val-IIb-Ala-Pip-NH2(서열 번호 11)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성의 제1부를 수행하여 Fmoc-IIb-Ala-Pip-NH-수지를 얻었다. 이어서 펩티드 수지를 자동화된 합성기 (ABI 431)로 이동시키고 남은 잔여물을 HBTU/HOBT 화학물질을 삽입하는 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에 따라 커플링시켰다. 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하고 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 17.66분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1025.5(MH+); 아미노산 분석, Arg 1.04, Ala 2.94, Val 0.95, Asp 1.05.
실시예 12
Phv-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(서열 번호 12)
실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-보호된 아미노산을 커플링시키는 자동 합성기 (ABI 431)에서 자동으로 합성의 제1부를 수행하여 Fmoc-Ala-Ala-Pip-NH-수지를 얻었다. 이어서 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 남은 합성을 수동으로 수행하고, 정제용 RP-HPLC로 생성물을 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 16.68분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 954.6(MH+); 아미노산 분석, Arg 1.09, (Ala+IIb) 5.88.
실시예 13
Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2)3NH.C(=NH).NH2(서열 번호 14)
(a) Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2)3NH2(서열 번호 13)의 제조
2-클로로트리틸 클로라이드 수지(0.4g, 이용가능한 염소 약 0.25mmol)를 1시간 동안 상온에서 DMF(4㎖)중 1,3-디아미노프로판(0.42㎖)과 반응시켜 (3-아미노프로필)아미노-수지로 전환시켰다. DMF로 잘 세척한 후, 수지를 Applied Biosystems 430A 펩티드 합성기로 이동시키고 제조업자의 추천 사항에 따라 적절한 보호 아미노산을 연속적으로 커플링 및 탈보호시켰다. 이어서, 수지를 메탄올로 세척하고 건조하였다(0.722g). 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단시키고 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 40분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 17.76분. 따라서 Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2)3NH2(서열 번호 13)(냉동 건조후 329mg); 질량 분광분석, m/e(ES+) 916.5(MH+)을 얻었다.
(b) Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2)3NH.C(=NH).NH2(서열 번호 14)의 제조
Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2)3NH2(서열 번호 13)(329mg)을 물(5㎖)과 아세토니트릴(5㎖)의 혼합물에 용해시키고, 1-H-피라졸-1-카르복스아미딘 히드로클로라이드(132mg, 3 당량) 및 디이소프로필에틸아민(52㎕, 1당량)을 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 4일 동안 교반하였다. 혼합물을 정제용 RP-HPLC로 정제하고 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석, 특성화하였다. 따라서, Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH2)3NH.C(=NH).NH2(서열 번호 14)(178mg)을 얻었다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 40분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 18.42분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 958.5(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.86, Gly 0.90; Ala 3.20, Arg 1.00.
실시예 14
Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Gly-NHEt (서열 번호 15)
Boc-Gly-O-벤질 에스테르 수지(메리필드 수지)(0.54g, 0.25mmol)로 출발하여 Applied Biosystems 430A 합성기에서 합성의 제1부를 수행하고 제조업자의 추천 사항에 따라 적절하게 보호된 아미노산을 연속적으로 커플링 및 탈보호시켰다. 수지를 메탄올로 세척하고 건조(871mg)한 후 DMF(10㎖) 및 메탄올중 2M 에틸아민(10㎖)과 함께 상온에서 7일 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC로 메틸 에스테르가 용액내로 급격하게 유리된 후 약간 더 소수성인 N-에틸아미드로 서서히 전환된다는 것을 알았다. 혼합물을 여과하고 수지를 DMF로 세척하였다. 용매를 증발시켜 미정제, 보호된 펩티드를 N-에틸아미드로서 얻었다. TFA, TES 및 물(90:5:5)을 사용하여 펩티드를 탈보호시키고 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 정제용 RP-HPLC로 정제하여 Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Gly-NHEt (서열 번호 15)(168mg)을 얻었다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 40분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 17.85분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 972.5(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.83, Gly 1.03; Ala 2.17, IIb 0.9, Arg 2.00.
실시예 15 및 실시예 16
Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(실시예 15)(서열 번호 16)
Phv-Gap(Me)4-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(실시예 16)(서열 번호 17)
(a) Phv-Dap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 36)의 제조
Fmoc 링크 아미드 수지(0.25mmol)을 사용하여 Applied Biosystems 430A 합성기에서 자동으로 합성하고, 제조업자의 추천 사항에 따라 적절한 보호 아미노산을 연속적으로 커플링 및 탈보호시켰다. Dap 잔기를 Fmoc-Dap(Boc)-OH를 사용하여 합성의 적절한 단계에서 삽입시켰다. 반응이 완료된 수지를 건조하였다. 수율 1.292g(중량 수득, 792mg). 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하고 정제용 RP-HPLC로 정제하였으나, 단 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물(10% 내지 40% 아세토니트릴 구배)로 용출시킨 Dynamax 60A 칼럼(내부 직경 1인치)을 사용하여 Phv-Dap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 36)(304mg)를 얻었다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 40분 동안 10% 내지 40% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 24.5분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 937.1(MH+).
(b) (a)에서 얻은 Dap 펩티드를 물(7㎖)와 아세토니트릴(8㎖)에 용해시키고 1-H-피라졸-1-카르복시아미딘 히드로클로라이드(130mg)와 디이소프로필에틸 아민(53㎕)로 상온에서 1주일 동안 처리하였다. RP-HPLC로 단지 40% 만이 해당 Gap 펩티드로 전환되었음을 알 수 있다. 정제용 RP-HPLC를 이용하여 두 개의 화합물로 완전히 분리하는데 실패하였다. 따라서, 혼합물을 DMF(50㎖)중 HBTU(87mg) 및 디이소프로필에틸아민(50㎕)로 16시간 동안 처리하여 변화되지 않은 Dap 펩티드를 테트라메틸구아니딘(GapMe4) 펩티드로 전환시켰다. 이 화합물의 극소수성에 의해 더 용이하게 PHLC 정제((a)에 개시된 조건) 할 수 있으며, 전술한 (a)에 개시된 동일한 조건을 사용하여 수행하므로써 (i) 및 (ii)를 얻었다.
(i)Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 16)(80mg)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(40분 동안 10% 내지 40% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 26.2분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 978.5(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.90, Ala 4.05, IIb 존재, Gap를 위한 Trp 위치에 피크, 및
(ii) Phv-Gap(Me)4-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 17)(122mg)
전술한 (i)에서와 같이 특성화하였다; RP-HPLC(전술한 (i)와 동일한 용출물과 구배 이용) 체류 시간= 28.4분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1034.6(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.90, Ala 4.11, IIb 존재, Gap(Me4)를 위한 Trp 위치에 피크.
실시예 17
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NHCH2CH2-모르폴린(서열 번호 18)
보호된 단편을 이용하는 방법을 채택하였다. N-디이소프로필에틸아민(4mmol)의 존재하에 DMF(10㎖)중 Fmoc-Gly-OH(2mmol)을 2-클로로트리틸클로라이드 수지(1g, 1mmol)와 커플링시켜 Applied Biosystems 430A 합성기에서 자동으로 Fmoc-Gly-O-클로로트리틸 수지(1 mmol, 1g)을 제조하고 이중 커플링 방법(실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법)으로 연장시켜 보호된 펩티드 수지(2.15g)을 얻었다. 상온에서 1시간 동안 수지를 디클로로메탄(30㎖), 아세트산(5㎖) 및 트리플루오로에탄올(5㎖)을 사용하여 수지로부터 절단한 후에, 수지를 여과하고 디클로로메탄 및 아세트산으로 세척하였다. 용매를 증발시킨 후 수성 아세토니트릴로 냉동 건조시켜 필요한 보호 펩티드산(1.23g)을 얻었다. 펩티드를 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 특성화하였다;RP-HPLC(40분 동안 10% 내지 40% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 18.6분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 972.8(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.6, Gly 1.02, Ala 2.94, IIb 0.9, Arg 1.00.
실시예 18
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-N(CH2CH2)2NCH2CH2O-CH2CH2OH(서열 번호 19)
4-(2-아미노에틸)모르폴린 대신 4-[2-(2-히드록시에톡시)에틸]피페라진을 사용하는 것 외에는 실시예 17에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-N(CH2CH2)2NCH2CH2O-CH2CH2OH(서열 번호 19)를 얻었다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 펩티드를 특성화하였다; RP-HPLC(실시예 17에서 사용한 용출물과 구배를 이용) 체류 시간= 20.5분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1016.8(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.89, Gly 1.02, Ala 2.98, IIb 1.05, Arg 1.00.
실시예 19
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-Pape-NHC(=NH)NH2(서열 번호 20)
4-(2-아미노에틸)모르폴린 대신 4-(2-구아니디노에틸)아닐린을 사용한 것 외에는 실시예 17에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-Pape-NHC(=NH)NH2(서열 번호 20)를 얻었다. 펩티드를 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 정제용 HPLC로 정제하였으나, 단, Vydac201 HS 1022 칼럼(1인치 직경)을 사용하고 12㎖/분의 유속에서 0.1% TFA(10% 내지 35% 아세토니트릴)을 함유하는 아세토니트릴-물의 구배로 60분 동안 용출시켰다. HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 펩티드를 특성화하였다; RP-HPLC(실시예 17에서 사용한 용출물과 구배를 이용) 체류 시간= 24.2분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1021.1(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.8, Gly 0.95, Ala 2.86, Arg 1.00, IIb 존재.
4-(2-구아니디노에틸)아닐린 디히드로클로라이드를 하기와 같이 제조하였다.
아세토니트릴(10㎖) 및 물(10㎖)중 4-니트로펜에틸아민 히드로클로라이드(1.013g, 5mmol), 1H-피라졸-1-카르복스아미딘 히드로클로라이드 (0.733 g, 5mmol) 및 N-디이소프로필에틸아민(0.88㎖, 5mmol)을 16시간 동안 상온에서 교반하였다. 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킨 Dynamax 60A, C18 칼럼(1인치 내부 직경)을 사용하여 2부분으로 정제용 RP-HPLC를 수행하여 순수한 4-니트로펜에틸구아니딘을 얻었다. 생성물을 물(100㎖)에 용해시키고 1 방울의 진한 염산을 첨가한 후 5% 탄소상 팔라듐(100mg)을 첨가하고, 4시간 동안 용액을 통해 수소 거품을 형성시켰다. 촉매를 여과시켜 제거하고 물로 세척하였다. 휘발성 물질을 증발시켜 제거하여 4-(2-구아니디노에틸)아닐린 디히드로클로라이드(0.984g)를 갈색 발포체로서 얻었다(수산화 나트륨 펠렛상에서 건조시킨 후).
실시예 20
Phv-Ala-Ala-Ala-Arg-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 21)
실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하고, HBTU/DIPEA 활성을 이용하여 적절한 순서로 Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성의 제1부를 수행하여 Fmoc-IIb-Ala-Papa-NH-수지를 얻었다. 펩티드 수지를 자동 합성기 (ABI 431)로 이동시키고 남은 잔기를 HBTU/HOBT 화학물질을 삽입하는 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에 따라 커플링시켰다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하고 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 20분 동안 20% 내지 40% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 11.57분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1006.4(MH+), 503.8(M+2H++), 514.8(M+H++Na+); 아미노산 분석, Ala 4.19, Arg 0.91, Thr 0.74.
실시예 21
Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-Papa-NH2(서열 번호 22)
실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하고, HBTU/DIPEA 활성을 이용하여 적절한 순서로 Fmoc-보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성의 제1부를 수행하였으나, 단 Azgly 잔기를 삽입시켰다. Azgly 잔기는 DMF중 HOBT(0.25 당량)와 Fmoc-Azgly-OSu(EP 518655에 개시된 대로 얻음)(4당량)를 50℃에서 4시간 동안 커플링시켜 삽입시켰다. 따라서, Fmoc-IIb-AzGly-Papa-NH 수지를 얻었다. 펩티드 수지를 자동 합성기 (ABI 431)로 이동시키고 남은 잔기를 HBTU/HOBT 화학물질을 삽입하는 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에 따라 커플링시켰다. 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하고 정제하였다. 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 20분 동안 15% 내지 35% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 8.10분; 질량 분광분석, m/e(음성 전기분무(ES-)) 1076.4(MH-), 아미노산 분석: Ala 2.10, Arg 2.00, Thr 0.99.
실시예 22
Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-NH2(서열 번호 23)
실시예 21에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하였다. HBTU/DIPEA 활성을 이용하여 수동으로 합성의 제1부를 수행하여 Fmoc-IIb-Azgly-NH-수지를 얻었다. 펩티드 수지를 자동 합성기 (ABI 430A)로 이동시키고 남은 잔기를 HBTU/HOBT 화학물질을 삽입하는 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에 따라 커플링시켰다. 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하고 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 20분 동안 20% 내지 35% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 7.26분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 945.6(MH+), 473.4(M+2H++); 아미노산 분석, Ala 2.08, Arg 2.00, Thr 0.78.
실시예 23
Phv-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH2(서열 번호 24)
실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하였으나, 단 HBTU/DIPEA 활성을 이용하여 적당한 순서로 Fmoc-Papa-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-IIb-OH 및 5-페닐발레산을 커플링시켜 수동으로 전체 펩티드 조합체를 얻었다. 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 90분 동안 10㎖/분의 유속에서 0.1% TFA을 함유하는 아세토니트릴-물(15% 내지 30% 아세토니트릴)로 용출시킨 정제용 RP-HPLC로 생성물을 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 15% 내지 30% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 20.02분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1061.6(MH+), 531.4(M+2H++); 아미노산 분석, Ala 4.16, Arg 2.00, IIb 존재.
실시예 24
3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)프로피오닐-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH2(서열 번호 25)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 적당한 순서로 Fmoc-Papa-OH(Fmoc-Pip-OH 대신 사용), Fmoc-보호된 아미노산 및 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시키고, 5-페닐발레산 대신에 3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)프로피온산을 사용하여 수동으로 합성 및 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 60분 동안 10㎖/분의 유속에서 0.1% TFA을 함유하는 아세토니트릴-물(15% 내지 40% 아세토니트릴)로 용출시킨 정제용 RP-HPLC로 생성물을 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 17.58분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1114.7(MH+); 아미노산 분석, Arg 2.86, Ala 4.12, IIb 1.00.
3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)프로피온산을 하기와 같이 얻었다:
(a) 라니 니켈(1g) 및 히드라진 수화물(3㎖)를 60℃에서 에탄올(500㎖)중 에틸 5-니트로벤조[b]-2-카르복실레이트(25g)(Syn. Comm.(1991), 21, 959-964에 개시된 방법으로 얻음)에 첨가하였다. 격렬한 반응을 계속하고 혼합물을 환류시켰다. 라니 니켈(1g)과 히드라진 수화물(3㎖)을 총 15㎖가 첨가될 때까지 10분 간격으로 분할하여 첨가한 후 혼합물을 90분 동안 환류시켰다. 고온 혼합물을 여과시키고 여과물을 증발시켰다. 잔여물을 고온 에탄올(300㎖)에 용해시키고 활성화된 목탄을 첨가하였다. 혼합물을 여과시키고 여과물을 증발시켜 건조하여 에틸 5-아미노벤조[b]티오펜-2-카르복실레이트(18g)을 연황색 고체로서 얻었다. 이 고체를 ∼0℃에서 진한 염산(50㎖)과 물(130㎖)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 물(20㎖)중 질산 나트륨(5.6g) 용액을 서서히 첨가한 후 혼합물을 0℃에서 30분 더 교반하였다. 이어서, 물(200㎖)중 요오드화 칼륨(130g) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 상온으로 가온한 후 30분 동안 50℃에서 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 클로로포름(150㎖)으로 추출하고 유기상을 나트륨 메타비스설파이트 용액으로 세척하였다. 유기상을 건조(MgSO4)하고 증발시켜 갈색 오일을 얻었다. 헥산에서 10% 에틸 아세테이트/헥산으로 증가되는 구배를 이용하여 오일을 실리카상에서 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획물을 혼합하고 증발시켜 에틸 5-요오도벤조[b[티오펜-2-카르복실레이트(14g)을 오일로서 얻었다; NMR(d6-DMSO): 1.35(t, 3H), 4.4(q, 2H), 7.8(dd, 1H), 7.9(d, 1H), 8.15(s, 1H), 8.45(d, 1H).
(b) 물(150㎖)중 수산화 나트륨(5g)을 에탄올(200㎖)중 에틸 5-요오도벤조[b]티오펜-2-카르복실레이트(14g)에 첨가하고 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 증발시켜 약 150㎖로 농축시키고 묽은 염산을 첨가하여 혼합물을 ∼pH3으로 조정하였다. 이어서, 혼합물을 디에틸 에테르(2×100㎖)로 추출하였다. 혼합된 유기 추출물을 건조(MgSO4)하고 증발시켜 5-요오도벤조[b]티오펜-2-카르복실산(11.7g)을 고체로서 얻었다; NMR(d6-DMSO): 7.8(dd, 1H), 7.9(d, 1H), 8.05(s, 1H), 8.45(d, 1H).
(c) 옥살릴 클로라이드(2.7㎖) 및 DMF(1 방울)를 디클로로메탄(30㎖)중 5-요오도벤조[b]티오펜-2-카르복실산(3.05g)에 첨가한 후, 기체가 방출되기 시작하였다. 기체의 방출이 멈추면, 혼합물을 증발시켜 무수상태로 만들고 잔여물을 THF(10㎖)에 용해시켰다. 용액을 진한 수성 암모니아(25㎖)에 분할하여 첨가하였다. 첨가가 끝난 후에, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과시켜 수거하고 물로 세척하고 진공하에서 건조시켰다. 고체(3g)을 DMF(15㎖)에 용해시키고 혼합물을 0℃에서 DMF(20㎖)와 포스포릴 클로라이드(3g)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 물(60㎖)에 첨가하고 침전된 고체를 여과시켜 수거하고, 물로 세척하고 진공에서 건조시켜 2-시아노-5-요오도벤조[b]티오펜(2.65g)을 연황색 분말로서 얻었다; NMR(d6-DMSO) : 7.9(dd, 1H), 8.0(d, 1H), 8.3(s, 1H), 8.45(d, 1H)
(d) 메틸 아크릴레이트(2g), 트리에틸아민(2.35g) 및 팔라듐 아세테이트(0.05g)을 DMF(25㎖)중 2-시아노-5-요오도벤조[b]티오펜(4.8g)에 첨가하고 혼합물을 30분 동안 90℃에서 아르곤하에 교반하였다. 혼합물을 냉각한 후 물(50㎖)에 첨가하였다. 침전된 고체를 여과시켜 수거하고 클로로포름에 용해시켰다. 활성 목탄을 첨가하고 혼합물을 여과시킨 후 여과물을 건조(MgSO4)시켰다. 용매를 증발시켜 제거하여 메틸 3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)아크릴레이트(2.5g)를 얻었다;
NMR(d6-DMSO) : 3.75(s, 3H), 6.7(d, 1H), 7.8(d, 1H), 8.0(dd, 1H), 8.2(d, 1H), 8.3(d, 1H), 8.85(s, 1H)
(e) 대부분의 출발 물질이 박막 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산 1:4로 용출시킨 실리카판)에 의해 사라질 때까지 10% 탄소상 팔라듐(0.5g)을 촉매로서 사용하여 THF(20㎖)에서 메틸 3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5-일)아크릴레이트(2.5g)를 수소첨가하였다. 혼합물을 여과하고 증발시켜 ∼20% 출발 물질로 오염된 메틸 2-시아노벤조[b]티오펜-5-프로피오네이트(1.45g)를 얻었다. 수산화 나트륨(0.23g)을 THF(10㎖) 및 물(3㎖)중 생성물(1.4g)의 혼합물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진한 염산으로 ∼pH5로 조정하고 증발시켜 농축하여 존재하는 THF를 제거하였다. 이어서 혼합물의 pH를 진한 염산으로 ∼pH3으로 조정하고 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 건조(MgSO4)하고 증발시켰다. 잔여물은 C18지지체와 40% 메탄올/물에서 75% 메탄올/물로 증가되는 구배를 사용한 역상 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획물을 혼합하고 증발시켜 2-시아노벤조[b]티오펜-5-프로피온산(0.28g)을 백색 고체로서 얻었다; NMR(CDCl3) : 2.88(t, 2H), 3.1(t, 2H), 7.4(d, 1H), 7.75(s, 1H), 7.8(d, 1H), 7.85(s, 1H).
실시예 25
Phv-Arg-Ala-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH2(서열 번호 26)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH(Fmoc-Pip-OH 대신), 보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성하고 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 17.45분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1061.9(MH+); 아미노산 분석, Arg 1.94, Ala 4.04, IIb 1.02.
실시예 26
Phv-Arg-Ile-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH2(서열 번호 27)
실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH와 Fmoc-보호된 아미노산을 커플링시켜 자동 합성기(ABI 431)에서 자동으로 합성하였으며, 단, Fmoc-IIb-OH는 수동으로 삽입하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 20.7분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1103.8(MH+); 아미노산 분석, Arg 1.92, Ala 3.03, IIb 0.96, Ile 1.08.
실시예 27
Phv-Ile-Arg-Ala-IIb-Leu-Arg-Ala-Papa-NH2(서열 번호 28)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH(Fmoc-Pip-OH 대신), 보호된 아미노산과 Fmoc-IIb-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성하고 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 30분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 23.8분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1145.7(MH+); 아미노산 분석, Arg 1.98, Ala 1.92, Leu 0.99, Ile 1.09, IIb 존재.
실시예 28
Phv-Ala-Arg-Ala-IIc-Ala-Ala-Ala-Papa-NH2(서열 번호 29)
실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여, 적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH(Fmoc-Pip-OH 대신), 보호된 아미노산과 Fmoc-IIc-OH를 커플링 및 탈보호시켜 수동으로 합성하였다. 생성물은 정제용 HPLC로 정제할 필요가 없다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 20분 동안 20% 내지 40% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 10.45분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 962.5(MH+), 492.8(M+H+Na)++; 아미노산 분석, Ala 4.90, Arg 1.00, IIc 존재.
Fmoc-IIb-OH를 제조하기 위해 실시예 1에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 Fmoc-IIc-OH를 얻었으나, 단 단계 1.1에서 L-알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드 대신 글리신 메틸 에스테르 히드로클로라이드를 사용하였다. 하기의 중간물질을 얻었다:
Boc-(D)-Met-Gly-OMe; 80% 수율; NMR(CDCl3) : 1.4d(s, 9H), 2.0d(m, 1H), 2.1d(m, 1H), 2.1d(s, 3H), 2.6d(t, 2H), 3.8d(s, 3H), 4.05d(m, 2H), 4.4d(m, 1H), 5.3d(bs, 1H), 6.8d(bs, 1H);
메틸 2-[(3R)-3-(N-[3차-부틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]아세테이트; 50% 수율; NMR(CDCl3) : 1.45d(s, 9H), 2.0d(m, 1H), 2.6d(m, 1H), 3.4(m, 2H), 3.8d(s, 3H), 4.05d(q, 2H), 4.1d(m, 1H), 5.55(bs, 1H);
2-[(3R)-3-(N-[9-플루오레닐메틸옥시카르보닐]아미노)-2-옥소-피롤리딘-1-일]아세트산; 75% 수율; NMR(d6-DMSO): 1.9d(m, 1H), 2.3d(m, 1H), 3.3d(m, 2H), 4.0d(q, 2H), 4.3d(m, 4H), 7.4d(m, 4H), 7.6d(m, 2H), 7.9d(d, 2H).
실시예 29
Phv-Arg-Ala-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Papa-NH2(서열 번호 30)
적절한 순서로 Fmoc-Papa-OH와 Fmoc-보호된 아미노산을 커플링시켜 ACT 357 자동 펩티드 합성기(링크 아미드 MBHA 수지를 사용)에서 자동으로 합성하였으며, 단, Fmoc-IIb-OH는 수동으로 삽입하였다. 수지에 전달하기 전에 약 11분 동안 DMF중 디이소프로필카르보이미드(1 당량) 및 HOBT(1 당량)으로 카르복실산(1mmol)을 활성화시켜, 단일 아실화를 위해 제조업자가 추천한 조건에서 자동 커플링시켰다. 약 60분 동안 아실화를 수행하고, 세척 및 탈보호 과정을 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법으로 수행하였다. Fmoc-IIb-OH의 수동 커플링은 HBTU/HOBT 화학물질을 사용하여 본드 일루트 관에서 수행하였다. 5-페닐발레산은 카이저 테스트에 의해 양성 결과를 얻기 위해서 이중 커플링을 필요로하였다. 이어서, 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법으로 펩티드를 절단하고 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 15분 동안 20% 내지 35% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.0㎖/분) 체류 시간= 10.33분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 976.5(MH+), 499.9(M+H+Na)++; 아미노산 분석, Ala 5.02, Arg 1.00, IIb 1.22.
실시예 30
Phv-Lys(=C(NMe2)2)-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(서열 번호 31)
Fmoc-Dap(Boc)-OH 대신 Fmoc-Lys(Boc)-OH를 사용한 것 외에는 실시예 15(a)에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하고, 수지로부터 펩티드를 절단하고 정제용 RP-HPLC로 정제하여, Phv-Lys-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2(270mg)을 얻었다. 이어서, 펩티드(270mg)을 HBTU(94mg), 디이소프로필에틸아민(88㎕) 및 DMF(50㎖)의 혼합물에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 증발시키고 남은 잔여물을 실시예 15(a)에 개시된 것과 유사한 방법으로 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 펩티드를 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석하여 특성화하였다; RP-HPLC(40분 동안 10% 내지 40% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 29.83분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1077.27(MH+); 아미노산 분석, Thr 1.0, Ala 4.3, Arg 1.00, IIb 존재; 테트라메틸호모아르기닌 존재.
실시예 31-33
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NHCH2CH2-모르폴린(실시예 31) (서열 번호 32)
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OCH3(실시예 32)(서열 번호 33)
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH(실시예 33) (서열 번호 34)
히드록시메틸 폴리스티렌 수지(1.67g, 1mmol)을 DMF(5㎖)와 디클로로메탄(20㎖)중 Fmoc-Papa-OH(1.5g, 4mmol), 디이소프로필카르보디이미드(0.628㎖, 4mmol) 및 디메틸아미노피리딘(61mg, 0.5mmol)와 함께 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과시키고, DMF(5×20㎖) 및 메탄올(5×20㎖)로 세척하고 40℃의 진공에서 건조하였다(수율 2.105g). 이어서, 펩티드 수지를 자동 합성기(ABI 430A)로 이동시키고 남은 Fmoc-보호된 아미노산을 실시예 2.6에 개시된 것과 유사한 방법으로 커플링시켜 보호 펩티드 수지(2.992g)를 얻었다. 이어서, 펩티드 수지를 DMF(10㎖)와 메탄올(10㎖)의 혼합물중 현탁시키고, 4-(2-아미노에틸)모르폴린(0.88㎖)을 첨가한 후 시안화 칼륨(50mg)의 촉매량을 첨가하였다. 상온에서 7일 후, 혼합물을 여과하고 수지를 DMF(5×20㎖)로 세척하였다. 수지를 즉시 DMF(10㎖), 메탄올(10㎖) 및 시안화 칼륨(50mg)의 혼합물에 재현탁시켰다. 4일 후, 혼합물을 여과하고, 수지를 DMF(5×20㎖)로 세척하였다. 두가지 처리를 모두 한 여과물 및 세척물을 혼합하고 증발시켜 무수상태로 만들었다. 90% TFA/H2O로 탈보호시키고, 증발에 의해 휘발성 물질을 제거한 후, 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 잔여물을 정제용 RP-HPLC로 정제하였으며, 그 결과 3종의 생성물을 얻었다. 이 생성물들은 하기와 같은 특성을 가진다:
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NHCH2CH2-모르폴린(서열 번호 32)(40mg);
RP-HPLC(40분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 19.5분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1119.8(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.58, Ala 3.84, Arg 1.16, IIb 1.00.
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OMe(서열 번호 33)(37mg);
RP-HPLC(40분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 27.7분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1021.6(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.61, Ala 3.80, Arg 1.22, IIb 0.97.
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH(서열 번호 34)(155mg);
RP-HPLC(40분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 24.2분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1007.5(MH+); 아미노산 분석, Thr 0.62, Ala 3.78, Arg 1.20, IIb 0.98.
실시예 34
Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-N(CH2CH2)2N-(CH2)2O(CH2)2OH (서열 번호 35)
4-[2-(2-히드록시에톡시)에틸]피페라진(235mg)을 Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr- IIb-Ala-Papa-OH(135mg), HBTU(51mg), DIPEA(47㎕) 및 DMF(10㎖)의 혼합물에 첨가하고 혼합물을 60분 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 증발시켜 제거하고 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 정제용 HPLC로 잔여물을 정제하여 Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-N(CH2CH2)2NCH2CH2-OCH2CH2OH(서열 번호 34) (115mg)을 얻었다. 실시예 1.4에 개시된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성물을 HPLC, 질량 분광분석 및 아미노산 분석으로 특성화하였다; RP-HPLC(0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴과 물로 용출시킴, 40분 동안 10% 내지 50% 아세토니트릴 구배를 이용, 유속 1.2㎖/분) 체류 시간= 18.83분; 질량 분광분석, m/e(ES+) 1163.8(MH+); 아미노산 분석: Thr 0.62, Ala 3.80, Arg 1.22, IIb 0.97
실시예 35
본 발명의 화합물은 통상적인 약학적 조성물의 형태로 인간을 비롯한 항온 동물에게 치료용 또는 예방용으로 투여될 수 있으며, 이의 전형적인 예는 하기를 포함한다:
주입액
0.01mg 내지 100mg의 활성 성분을 최대 2㎖의 수성 주입 부형제에 용해시켜 0.01mg/㎖ 내지 100mg/㎖의 활성 성분 농도를 제공한다. 이 수성 주입 부형제는 약학적으로 허용 가능한 완충액(예, 인산염 또는 아세트산염)을 사용하여 pH 5 내지 pH 8로 완충시키고, 등장성을 얻기 위해 첨가되는 약학적으로 허용 가능한 삼투성 조절제(예, 염화 나트륨 또는 덱스트로스)를 포함한다. 부형제는 임의적으로 가용화제(예, DMSO, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 보존제 및 산화 방지제와 같은 약학적으로 허용 가능한 기타 부형제를 포함할 수 있다. 활성 성분은 전형적으로 전술한 실시예에 개시된 것일 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로서 존재하는 것일 수 있다.
서열목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 제네카 리미티드
(B) 스트리트 : 스탠호프 게이트 15
(C) 도시 : 런던
(E) 국가 : 영국
(F) 우편 번호(ZIP) : 더블유1와이 6엘엔
(G) 전화 : 0171 304 5000
(H) 팩스 : 0171 304 5151
(I) 텔렉스 : 0171 834 2042
(ii) 발명의 명칭 : 펩티드 유도체
(iii) 서열의 수 : 36
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC compatible
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatenIn Release #1.0, Version #1.30(EPC)
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 : GB 9603855.9
(B) 출원 일자 : 1996년 2월 23일
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 : GB 9620819.4
(B) 출원 일자 : 1996년 10월 5일
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일-프로파노일]-Ala-피페리딘-4-카르복스아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-(6-옥소-1,7-디아자스피로[4.4]논-7일)프로파노일]-Ala-피페리딘-4-카르복스아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 4
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="Ala-피페리딘-4-카르복스아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 3:
(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ile"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 4:
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-피페리딘-4-카르복스아이드"
(xi) 서열 : 서열 번호 5:
(2) 서열 번호 6에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 6:
(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트아미드]"
(xi) 서열 : 서열 번호 7:
(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Gly-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 8:
(2) 서열 번호 9 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-카르복스아미드]"
(xi) 서열 : 서열 번호 9:
(2) 서열 번호 10 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트아미드]"
(xi) 서열 : 서열 번호 10:
(2) 서열 번호 11 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-피페리딘-4-카르복스아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 11:
(2) 서열 번호 12 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 4
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="Ala-피페리딘-4-카르복스아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 12:
(2) 서열 번호 13 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Gly-3-아미노프로필아민]"
(xi) 서열 : 서열 번호 13:
(2) 서열 번호 14 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Gly-3-아미노프로필구아니딘"
(xi) 서열 : 서열 번호 14:
(2) 서열 번호 15 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Gly-NH에틸"
(xi) 서열 : 서열 번호 15:
(2) 서열 번호 16 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-3-구아니디노Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트아미드]"
(xi) 서열 : 서열 번호 16:
(2) 서열 번호 17 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-3-(테트라메틸구아니디노)Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 17:
(2) 서열 번호 18 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Gly-4-(2-아미노에틸)모르폴린"
(xi) 서열 : 서열 번호 18:
(2) 서열 번호 19 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Gly-피페라진-4일.CH2CH2OCH2CH2OH"
(xi) 서열 : 서열 번호 19:
(2) 서열 번호 20 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Gly-4-아미노펜에틸구아니딘"
(xi) 서열 : 서열 번호 20:
(2) 서열 번호 21 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 21:
(2) 서열 번호 22 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-[NH-NH-CO]-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 22:
(2) 서열 번호 23 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-NH-NH-CONH2"
(xi) 서열 : 서열 번호 23:
(2) 서열 번호 24 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 4
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 24:
(2) 서열 번호 25 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="3-(2-시아노벤조[b]티오펜-5일)프로파노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 4
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 25:
(2) 서열 번호 26 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 4
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 26:
(2) 서열 번호 27 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 4
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 27:
(2) 서열 번호 28 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ile"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 4
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Leu"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 28:
(2) 서열 번호 29 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 4
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)아세틸]-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 29:
(2) 서열 번호 30 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 4
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 30:
(2) 서열 번호 31 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-테트라메틸호모Arg-"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 31:
(2) 서열 번호 32 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-(4-아미노페닐.CH2.CO.NH.CH2.CH2.모르폴린"
(xi) 서열 : 서열 번호 32:
(2) 서열 번호 33 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트산 메틸 에스테르"
(xi) 서열 : 서열 번호 33:
(2) 서열 번호 34 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐 아세트산"
(xi) 서열 : 서열 번호 34:
(2) 서열 번호 35 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Arg"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세틸-피페라진-4-일-CH2CH2OCH2CH2OH"
(xi) 서열 : 서열 번호 35:
(2) 서열 번호 36 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 1
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="5-페닐펜타노일-Dpr"
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: 펩티드
(B) 존재 위치: 6
(D) 기타 정보:/ 생성물= "기타"
/노트="[(S)-2-((R)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)프로파노일]-Ala-4-아미노페닐아세트아미드"
(xi) 서열 : 서열 번호 36:

Claims (15)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 이의 염:
    화학식 I
    상기 식에서,
    P는 소수성 잔기이고;
    R1은 5개의 L-아미노산 서열이고 R3는 단일 L-아미노산이거나; 또는
    R1은 3개의 L-아미노산 서열이고 R3는 3개의 L-아미노산 서열이며;
    R2은 하기 화학식 II 또는 하기 화학식 III으로 표시되는 기이며, 이 때 Ra 및 Rb는 각각 수소 및 C1-4알킬에서 선택되며, A는 메틸렌(CH2) 또는 산소이며;
    화학식 II
    화학식 III
    R4는 OH, NH2또는 NRcRd이며, 여기서 Rc는 C1-4알킬, 2-카바모일시클로펜틸, 2-피리딜메틸, 4-카바모일시클로헥실, 4-카바모일시클로헥실메틸, 3-카바모일페닐, 4-카바모일페닐, 4-(카바모일메틸)페닐, 4-(카르복시메틸)페닐, 4-(메톡시카르보닐메틸)페닐, 2-모르폴리노에틸 및 화학식 -A1-G1로 표시되는 기에서 선택되며, 이때
    A1은 C3-7알킬렌이거나 또는
    A1은 (1) 화학식 -A2-B2-로 표시되는 기(A2는 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이고 B2는 C1-4알킬렌이거나, 또는 A2는 메틸렌이고 B2는 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이며); 및
    (2)화학식 -A3-B3-C3로 표시되는 기(A3는 메틸렌, B3는 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이고 C3는 C1-3알킬렌)에서 선택되며;
    G1은 화학식 -N=C[N(Rp)2]2로 표시되는 기이며, 각 Rp는 각각 수소, 메틸, 에틸 및 프로필에서 선택되거나; 또는
    A1은 화학식 -A4-B4-로 표시되는 기(A4는 p-페닐렌이고 B4는 -CH2-CO-)이며
    G1은 2-모르폴리노에틸 또는 4-[2-(2-히드록시에톡시)에틸]피페라진-1-일이며;
    Rd는 수소 또는 C1-4알킬이거나; 또는
    R4는 1-피페라지닐, 4-메틸-1-피페라지닐, 4-아미디노-1-피페라지닐, 4-(2-(2-히드록시에톡시)에틸)-1-피페라지닐, 1-피페리딜 또는 4-치환된-1-피페리딜이며, 여기서 4-치환체는 카르복시, 카바모일, N-(2-아미노에틸)카바모일 및 N-(4-아미노부틸)카바모일에서 선택되거나; 또는
    R4는 1 내지 6 개의 아미노산 서열 또는 이의 아미드.
  2. 제1항에 있어서, P가 C5-20의 지방족, 방향족, 혼합된 지방족/방향족 유기기이거나, 또는 C5-20과 산소, 황 및 질소로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하는 헤테로방향족 또는 혼합된 지방족/헤테로방향족 유기기인 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    R4는 OH, NH2또는 NRcRd이며, 여기서 Rc는 C1-4알킬, 2-카바모일시클로펜틸, 2-피리딜메틸, 4-카바모일시클로헥실, 4-카바모일시클로헥실메틸, 3-카바모일페닐, 4-카바모일페닐, 4-(카바모일메틸)페닐, 4-(카르복시메틸)페닐, 2-모르폴리노에틸 및 화학식 -A1-G1로 표시되는 군에서 선택되며, 이때
    A1은 C3-7알킬렌이거나 또는
    A1은 (1) 화학식 -A2-B2-로 표시되는 기(A2는 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이고 B2는 C1-4알킬렌이거나, 또는 A2는 메틸렌이고 B2는 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이며); 및
    (2)화학식 -A3-B3-C3로 표시되는 기(A3는 메틸렌, B3는 p-페닐렌 또는 1,4-시클로헥실렌이고 C3는 C1-3알킬렌)에서 선택되며;
    G1은 화학식 -N=C[N(Rp)2]2로 표시되는 기이며, 각 Rp는 각각 수소, 메틸, 에틸 및 프로필에서 선택되며; Rd는 수소 또는 C1-4알킬이거나; 또는
    R4는 1-피페라지닐, 4-메틸-1-피페라지닐, 4-아미디노-1-피페라지닐, 4-(2- (2-히드록시에톡시)에틸)-1-피페라지닐, 1-피페리딜 또는 4-치환된-1-피페리딜이며, 여기서 4-치환체는 카르복시, 카바모일, N-(2-아미노에틸)카바모일 및 N-(4-아미노부틸)카바모일에서 선택되거나; 또는
    R4는 1 내지 6개의 아미노산 서열 또는 이의 아미드인 것이 특징인, 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    P는 C5-20의 지방족, 방향족 또는 혼합된 지방족/방향족 유기기이며;
    R1및 R3을 구성하는 L-아미노산은 Ala, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Asn, Gln, Arg, Thr 및 Val에서 각각 선택되며;
    R4는 OH, NH2, NHRc이며, 이 때 Rc는 C1-4알킬, 2-카바모일시클로펜틸, 2-피리딜메틸, 4-카바모일시클로헥실, 4-카바모일시클로헥실메틸, 3-카바모일페닐, 4-카바모일페닐 및 4-(카바모일메틸)페닐이거나; 또는 R4는 1-피페라지닐, 4-메틸-1-피페라지닐, 4-아미디노-1-피페라지닐, 1-피페리딜 또는 4-치환된-1-피페리딜이며, 여기서 4-치환체는 카르복시, 카바모일, N-(2-아미노에틸)카바모일 및 N-(4-아미노부틸)카바모일에서 선택되거나; 또는 R4는 1 내지 6개의 아미노산 서열 또는 이의 아미드인 것이 특징인, 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 AA1-AA2-AA3-AA4-AA5로 표시되는 5개의 L-아미노산으로 이루어진 서열을 포함하며, 여기서:
    AA1은 Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4및 3,3,3-트리플루오로알라닌에서 선택되며;
    AA2는 Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-트리플루오로알라닌 및 N6-디에틸Lys에서 선택되며;
    AA3은 Ala, His, Gln, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn 및 N3-디에틸Dap에서 선택되며;
    AA4는 Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His 및 N6-디에틸Lys에서 선택되며;
    AA5는 Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn 및 N3-디에틸Dap에서 선택되며;
    R3은 Ala, Gly, Dap, 아자알라닌 및 아자글리신에서 선택된 단일 아미노산인 것이 특징인, 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 AA1-AA2-AA3으로 표시되는 3개의 L-아미노산으로 이루어진 서열이며, 여기서:
    AA1은 Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4및 3,3,3-트리플루오로알라닌에서 선택되며;
    AA2는 Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-트리플루오로알라닌 및 N6-디에틸Lys에서 선택되며;
    AA3은 Ala, His, Gln, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn 및 N3-디에틸Dap에서 선택되며;
    R3은 AA6-AA7-AA8로 표시되는 3개의 L-아미노산으로 이루어진 서열이며, 여기서:
    AA6은 Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Sar, His 및 Dap에서 선택되며;
    AA7은 Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic 및 Dic에서 선택되며;
    AA8은 Ala, Gly, Dap, 아자알라닌 및 아자글리신에서 선택되는 것이 특징인, 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, R2가 하기 화학식 IIb로 표시되는 기인 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
    화학식 IIb
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 소수성 기 P가 5-페닐발레릴인 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, R4가 4-카바모일-1-피페리딜, 4-(카바모일메틸)아닐리노 또는 4-(2-구아니디노에틸)아닐리노인 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  10. 제1항에 있어서,
    및
    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염(상기 Phv는 5-페닐발레릴기를 나타냄)으로부터 선택되는 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  11. 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 화학식 I의 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물.
  12. 적절하게 보호된 아미노산 또는 적절하게 보호된 2개 이상의 아미노산의 서열, 화학식 H-II-OH 또는 H-III-OH의 적절하게 보호된 기 및 임의적으로 화학식 R4-H의 적절하게 보호된 기를 적당한 순서로 차례로 커플링시킨 후 N-말단 아미노기의 임의의 작용기를 변형시켜 소수성기 P를 도입하는 단계, 및 남아 있는 임의의 보호기와 임의의 고체 지지체를 제거하는 단계를 포함하여, 제1항에 기재된 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제조하는 방법.
  13. 치료를 요하는 온혈 동물에게 화학식 I의 펩티드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가면역 질병 또는 염증성 질병을 치료하는 방법.
  14. 제14항에 있어서, 류마티스양 관절염 또는 다발성 경화증을 치료하는 방법.
  15. MHC 클래스 II 의존성 T-세포 매개된 자가면역 질병 또는 염증성 질병의 치료에 사용하기 위한 신규 약제의 제조에 사용되는, 화학식 I의 펩티드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
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