TW212760B - - Google Patents

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212760 Λ 6 13 6 經濟部屮央櫺準局员工消费合作社印製 五、發明説明（1 ) 肝疾病有急性肝炎，慢性肝炎，中_性肝障碍，肝癌 ,肝硬化，脂肪肝，及門脈壓亢進症等等，於日本推定 每年有18萬人發生急性肝炎，120萬人罹患慢性肝炎， 22萬人有肝硬化，而肝癌則為2萬人，其中已知肝炎經 過長期後一部分轉移成肝硬化，而其一部分更進一步變 成肝癌（日本厚生省肝炎研究疫學班諝査成績.昭和54 年）。因此肝炎之預防，經過觀察，及治療對肝硬化與 肝癌之預防而言極為重要。近年已開發肝炎，肝癌之動 物模式而利用於肝疾病之研究[森等，肝膽眸，jj(5): 9 0 5 - 9 1 0 ( 1 9 8 9 )]。肝炎之治療在急性肝炎方面原則上採 用靜餐與食物療法，至於慢性肝炎之活動型，尤其B型 肝炎，則有各種治療法之苜試[嫌田，總合臨床，139(7) :1837-1842(1990)]。使用於治療肝炎之抗病毐剤、有干 擾素（Interfe「on),樹腰糖腺式（Adenine arabinoside, Ara-A),阿西克羅比Ucyc丨ovir, ACV)等，其有效率以 血清轉換率（Seroconversion ratio抗原成陰性，抗體 成陽性之比率）表示，干擾素為20〜305![Hoofnagle et al..'未 s己名雜誌 0:1318-1325(1988〉], Ara-A 為 10 〜30¾ [Garcia et al., Ann. Intern, Med., 10 7 ： 2 7 8 - 2 8 5 ( 1 9 8 7 ) ] . ACV為約 27 J； [Graeme J. M·, et al., J· Med. Virol, ^J:81-87(1987)];而免疫諏節劑有皮铒頫固酵，干* 素-7 ,白血球間f - 2 [ I n t e r丨e u It i η - 2 ,以下簡寫為1匕-2; Kakumau S ., et al., He p a t o logy ^ = 487-492 (1988)], (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙尺度逍用中囷國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） 經濟部屮央梂準局β工消费合作社印製 Λ 6 _Β_6 五、發明説明（2 ) 0Κ432, 西安尼達諾 （C丨anidano1e; Β1um A.L·· e t a I . , L a n c e t 丄| : 1 1 5 3 - 1 1 5 5 ( 1 9 7 7 )],左旋四眯唑 [Levamisole； Fattovich G. et al., Gastroentero logy £J:692-696(1986)]等，但其有效率在6〜303!範圍。目 前認為最有效之免疫療法即皮質類固醇脱離療法之有效 率為15〜45X，但其適應性有很大限制，必須選擇充分 之肝預防能病例[Hoofnagle et al., Ann. Intern. Med. 1 04: 1 2 - 1 7 ( 1 986 ) ] 〇 而干擾素亦有長期使用結果出現抗體之報告，故治療 肝炎有其界限[卩〇「「65 0<；31.，（1,^931；〇丨，^_:351*· 3 5 7 ( 1 9 8 9 ) ] 〇 因此在本業界期望開發安金且可提高肝炎治療效果之 藥劑。 链於上述情況，本發明者等以提供與該業界期望符合 之肝炎預防及治療用蕖劑為目的而加強研究，在其過程 中發現已知可活化淋巴細胞並明療具促進IL- 2.抗賭産 生作用等各種生物活性，因而進行B藥品應用研究之白 血球間素- lUnterleukin-l,以下簡寫為IL-1)及其衍 生物及本申誧者等新開發之IL-1衍生物，具有顯著抑制 肝炎發病之作用（肝炎發症阻止作用），發現為與上述目 的符合之肝炎預防及治療劑，因而完成本發明。 本發明與含IL-1及其衍生物中至少S取1種為有效成 分為待擻之肝炎預防，治療劑有P。 -4- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂 線_ 本紙张尺度逍用中國國家標準（CNS) Ψ4規格（210x297公釐） Λ 6 13 6 212760 五、發明説明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本發明之肝炎預防，治療劑如上述以IL-1及其衍生物 為有效成分為必須條件，據此發揮顆箸肝炎發病阻止作 用，因而對肝炎之預防及治療極為有效。 本發明之治療劑之有效成分IL-1含由编碼具淋巴細胞 活化因素（Lymphocyte activating factor)活性多胜防 基因鹽基序列鑑定之有159個氨基酸序列之IL-la與有 153 健氨基酸序列之 IL-l/S[Proc. Natl. Acad. Sci. 8_1 ： 7 9 0 7 - 7 9 1 1 ( 1 9 84 ) ； Nature 315:641 (1985)；

Nucleic Acid Research 13_： 5869(1985)]等兩種。可為 由其生産細胞以常法抽取，分離之天然型或可為依遣傅 工程技Μ所得重組基因型。 IL-1之衍生物有許多種.其代表例可包含本申請人等 先前申請有關具各種氛基酸序列之IL-la衍生物及IL-1/3 衍生物[參照歐洲專利公開1 8799 1號。歐洲專利公開第 237967賊（_日本專利待開昭63-152398¾).歃洲專利公 開第237073號（日本專利待開昭63-164899號），歐洲專 利公開第352816號（日本專利特開平2-167298¾)等]。 IL-1衍生物之具膀例如下述： 經濟部中央梂準杓貝工消费合作社印製 (1)以序列编號1代表之IL-la氛基酸序列中第36位 Asn與第141位Cys之至少一艏執基酸殘基缺失或被其他 软基酸殘基取代而改變®基酸序列之衍生物。 (2 )以序列编號2 (於此序列中X a a表示構成人膀之α - 氛基酸殘基）代表之IL-lc(衍生物®基酸序列中谋足下 -5 - 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)〒4規格（210x297公龙） 212760 Λ 6 13 6 五、發明説明（4 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部屮央棵準局β工消费合作社印製 列（a)〜（d)條件之至少一項之改變氨基酸序列之衍生物 :(a)第16位Arg缺失，（b)該第16位A「g被其他氨基酸 殘基取代，（c)第1位Ser至第14位Phe之氨基酸序列缺 失，及（d)第1位Se「至第]5位Met之氨基酸序列缺失。 (3)以序列编號3代表之IL-1/3氛基酸序列中滿足下列 (a)〜（d)條件之至少一項之改變氨基酸序列之IL-ΙΘ衍 生物：（a)由第1位AU,第3位Val,第4位Arg,第5 位Ser,第8位Cys,第11位A「g,第30位His,第71位 Cys,第 93 位 Lys,第 97位 Lys,第 98位 A「g,第 99 位 Phe, 第103位Lys,第120位T「p,第121位Ty「，第153位Se「等 中至少菝取1餾氨基酸殘基缺失或被其他氨基酸殘基取 代；（b)由第1位Arg至第9位Th「之氨基酸序列全部或 其中至少1値氬基酸殘基缺失[但如（a)所述第1位Ala ，第3位V a 1 ,第4位A「g .第5位S e r ,第8位C y s等氨 基酸殘基中至少有1餾缺失時除外];(c)由第103位 Lys至第153位Se「之氛基酸序列全部或其中至少1値氛 基酸殘基缺失[但如（a)所述第103位Lys,第120位Τγρ, 第12〗位Ty「，第153位Ser等氛基酸殘基中至少有1鲴缺 失時除外];(d )於序列編號3之N末端付加®基酸殘 基，或付加以序列编號4代表之第1 ’位M e t至第1 1 6 '位 Asp之教基酸序列，或付加該序列C末端之一部分餌基 酸序列。 上述各式與以下本説明窨之氛基酸及多胜呔之表示依 -6 - 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)肀4規格(210x297公度) 經濟部屮央樑準局β工消费合作社印製 212760 Λ 6 _Β6_ 五、發明説明（5 ) IUPAC及IUPAC-IUB命名法或規則之縮寫宇與記號表示法 或本分野慣用缩寫字與記號。又氨基酸殘基之數與位置 無論有缺失或付加均依序列编號1 (IL- Ια)與序列编號 3 (IL-1/3)之表示。但於IL-1/S衍生物中表示氨基酸殘 基位置之數值有附Γ) 號 者依序列编號4之氨基酸序 列。 上述IL-1之各種衍生物包含IL-lct與IL-1/3氨基酸序 列中特定位置之特定氛基酸殘基以其他氛基酸殘基取代 之氨基酸序列多胜肽與付加氨基酸殘基於特定位置之氛 基酸序列多胜呔；此可取代或付加之氨基酸殘基只要是 構成人體蛋白質之c(氨基酸殘基均可，尤其中性氨基酸 殘基較適合。但Cys因其SH基而在分子中或分子間形成 雙硫鍵，故考應及此，上述氨基酸殘基以Cys以外之氨 基酸殘基較適合。 於IL-la衍生物中恃別適合之cr氛基酸殘基例如第16 位 A「g為 Gly,第 36 位 Asn 為 Asp,第 141 位 Cys為 Ser。 於IL-1/3衍生物中待別適合之a氛基酸殘基例如第4 位 Arg為 Gly, Lys, Gin, Asp,第8 位 Cys為Se「， Ala, 第11位A「g為Gln.第30位His為Ty「，第71位Cys為Se「， Ala, Val,第 93位 Lys為 Leu. Asp,第 98位 Arg為 Leu, 第103位Lys為Gin,第120位T「p為Arg,第121位Ty「為 Gin,附加N末端則為Met, Leu, Arg, Asp等。 IL-Ια與IL-1/9及其衍生物具淋巴細胞活化因子活性 -7 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂 線- 本紙尺度边用中國Η家標準（CNS)屮4規格(210x297公龙) 212760 Λ 6 Β 6 經濟部屮央橾準而员工消费合作社印製 五、發明説明（t> ) (LAF活性），抑制腫瘤细胞增殖活性（GIF活性）.菌落刺 撖因子（CSF)。干擾素（IF), IL-2, IL-3等各種細胞分 裂素類（cytokinin)之促進生産活性，抗炎症活性，防 止放射線障碍作用等等；而已知有用於促進抗體産生與 增強疫苗效果等之免疫条刺激劑，抗腫瘤劑，CSF, IL-2, IL-3等細胞分裂素類之促進生産劑，抗炎症劑，放射線 障碍防止劑等藥品.但該IL-1類具肝炎預防，.治療效果 則完金未知，而此肝炎預防，治療效果與上述已知各種 藥理效果之相關性亦無任何報告，故該IL-1類可利用為 肝炎預防，治療劑乃由本發明者等首次發現之事實。 本發明之治療劑做為有效成分之各種IL-Ια衍生物與 IL-1/3衍生物均為己知或可以己知遣傅工程技g製造之 。亦即利用前述编碼持定多胜呔之基因，重組於徹生物 載體，在該擻生物細胞内複製，轉錄，轉譯而製成所欲 衍生物，尤其此方法可能大置生産故較有利。 於上述方法中使用之基因可依磷酸三酯法[Hature 310:105(1984)]等常法，由核酸之化學合成而全部合成 ，但以利用IL-1或其前驅髑之编碼基因而合成較為簡便 。例如以該基因為原料.依含上述化學合成方法之常法 ,改變為前述待定氛基酸序列之编碼核酸序列而容易製 成。编碼IL-1或其前驅體之基因均可利用已知者（如參 照曰本專利恃開昭62-174022號公報）。 上述核酸（齧基）序列之改變操作亦可依已知方法，因 -8- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· •1T- 線. 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS) V4規格（210x297公及：） 經濟部屮央楳準局β工消f合作社印製 212760 Λ 6 _Β6_ 五、發明説明（7 ) 應目檫多胜呔之氨基酸序列實施之[遣傳工程技替可參 照”Molecular Cloning”， Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ] 〇 例如可採用DNA之切斷，接合，磷酸化等為目的之限 制酶，DNA粘接酶，聚核甘酸激酶，Μ A聚合酶等各種 酵素處理之常用方法，此等酵素均可以市售品容易獲得 。使用於此等操作之基因或核酸之分離，精製亦可依常 法，如璜脂醣電氣泳動法等。又所得基因之複製，亦如 後述可依利用通常載體之方法。而编碼所希望氨基酸序 列之DNA片段或合成結合子亦可依上述化學合成容易製 造之。上述所希望氨基酸基對應之密碼子為已知並可任 意菝擇，如可依考慮所利用寄主之密碼子使用頻度等之 常法[N u c 1 . A c i d s R e s . , : 4 3 - 7 4 U 9 8 1 )]。而此等核 酸序列之密碼子之部分改變亦可依常法，使用编碼所希 望改變之約15〜30量體合成寡聚核甘酸為引子而採用定 點誘變等方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,互2:5662-5666 (1984)]。 由上述方法所得基因之邇基序列，可利用Maxam-Gi lbert之化學修飾法（Methed Enzyaol , 65:499-560 (1980)]或使用M13噬睹膀之燹脱《核甘酸鏈終止法 [Messing & Vieira. Gene, :269-276(1982)]以進行 其決定與確認。 上述操作與方法之具體例之一部分敘述於後續之《例 本紙張尺度边用中國國家標準（CNS)肀4規格（210x297公龙） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線· 212760 Λ 6 Β 6 經濟部屮央楳準扃β工消#合作社印製 五、發明説明（8 ) 中，但該方法並不受限制，可任意使用本技薛中熟知之 各種方法。 如此可提供编碼具特定氨基酸序列多胜呔之基因（以 下稱該基因為目標基因）。 該待定多胜呔可利用該目標基因依已知一般基因重組 技術製造之。更詳言之，製造該目標基因能夠在寄主細 胞中表現之重組DNA ,將此導入寄主細胞予以轉化，培 養該轉化體即可。 在此寄主細胞可利用真核生物或原核生物，真核生物 細胞含脊椎動物，酵母等細胞，脊椎動物細胞有瘗猴細 胞之 COS 細胞[Gluznan, Cell, 0:175-1 8 2 ( 1 9 8 1 )]及 中國田鼠卵《細胞二氫藥酸還原酶缺失株[Urlauband & Chasin, Proc. Natl. S c ί . U . S . A . 7_7 :4216-4220 (1980)]等常被使用，但不在此限。脊椎動物細胞之表 現載體可使用具百位於欲表現基因上流之起動基因，RHA 接合部位，多腺甘化部位，及轉錄终止序列等者，並必 要時可具有後製起點。該表現載體例如具SV40初期起動 基因之 pSV2dhfr[Subraraani et al., Mol. Cell. Biol., J_: 8 5 4 - 8 6 4 ( 1 9 8 1 )].但不在此限。 宾核徹生物一般常用酵母（¾，尤其Saccharoayces屬 酵母阑。其表現載fit例如具有對酸性磷酸梅蕋因之起動 基因之 p AM82[Miyanohara e t a 1 . , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., M:l-5(1983)]等常被使用。 -1 0 - (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝. 訂- 線_ 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS) f 4規格（210x297公¢) 212760 Λ 6 Ο 6 經濟部屮央標準尺员工消费合作社印製 五、發明説明（9 ) 原核生物之寄主一般常使用大腸®與祜草菌，例如使 用在該寄主薗中可能複製之質體載體，為使目標基因在 此載體中表現，在該基因上流附加起動基因及S D [ S h i n e & Da Ua「no)鹽基序列，5蛋白質合成開始所必須之ATG密 碼子而成表現質體。大腸菌寄主常用Escherichia coli K12®株.載體則常用PBR322,但不在此限，已知各種 菌株及載體均可利用。起動基因如色氨酸（T「p)起動基 因，卩^起動基因，lac起動基因，lpp起動基因等均可 使用且可表現目標基因。 以使用T「p起動基因為例時.菝取具Τγρ起動基因輿 SD序列之載體ρΤΜΙ[今本文男，代謝22.289(1985)]為表現載 體，將附加ATG之编碼所需多胜呔之基因連結於其SD序 列下流所存在之限制酶Clal部位即可。另外，不限於 利用直接表現糸，亦可利用/9半乳耱tf酶或；9内S胺酶 等之融合蛋白質表現糸。 如此所得表現載賭之導入寄主細胞及轉化方法可採用 一般方法，例如吸集對數增殖期細胞，（：3(：12處理使成 DNA容易自然進入狀態，而使載體進入等方法^於該方 法中，亦可依常法加MgCl2或RbCl2於培餐綦中.使轉 化效率提高。S外亦可採用將寄主細胞球狀腌化或原生 質腌化後進行轉化。 如此所得《化阑株侬常法垴萑，使所需多胜呔生産笛 棟。使用於此培餐之培餐基，可使用通常細胞培餐惯用 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝·

•1T 線· 本紙張尺度边用中國Η家楳準（CNS)甲4規格（210x297公釐） Λ 6 Β 6 212760 五、發明説明（id (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 之各種培養基，具體例如L培養基，E培養基，M9培養 基等及添加一般所知各種磺素源，氮素源，無機馥類， 維生素類之該培養基。又使用上述TRP起動基因時，一 般為使該基因容易動作而使用添加酪蛋白氬基酸之M9最 少培養基，並於培養中適當時期添加吲呤丙烯酸等強化 TRP起動基因作用之藥劑於培養基中。 由如此所得含活性物質之培養物中分離，精製目標多 胜呔，亦即前述特定IL-1衍生物，可依常法進行。由寄 主抽出該多胜呔時以採用滲透壓衝擊法等較溫和手段較 能保持其高次構造。 上述分離，精製可依利用該多胜呔之物理，化學性質 之各種處理操作而實施[「生化學數據書I」，PP1175-1259,第1版，1980.6.23東京化學同仁發行]。該方法 之具體例如用一般蛋白沈澱劑處理，超過濾法，凝膠過 濾法，液賭色層分析，遠心分離，電氣泳動，親和性色 層分析，透析及此等之各種組合。 經濟部屮央榀準工消費合作社印製 上述操作之更具體例如以下述方法«施：由培餐上淸 液部分精製目棟多胜呔。此部分精製以使用有機溶劑 (丙酮，甲酵，乙酵，丙醇，二甲替甲K胺）或有機酸 (醋酸.過》酸.三氛醋酸）為蛋白質沈澱劑之處理，使 用硫酸銨.硫酸納，磷酸納等髓析劑之處理，及/或使 用透析膜.平板膜.中空纖維膜等之超過濾處理等進行 -12- 本紙張尺度迻用中國Η家標準(CNS)平4規格(210x297公釐) Λ 6 Β 6 212760 五、發明説明（11) 其次將上得粗精製物以凝膠過濾而收集具目榡物質活 性分劏。凝膠過濾劑並無特別限制，砀聚耱凝膠，聚丙 烯醯胺凝驂，瓊脂耱凝膠，聚丙烯醅胺-瓊脂糖凝謬， 繼雒素等均可使用。其具體例如Sephadex G, Sephadex L Η , Sepharose, Sephacry 1 (以上 Pharmacia Fine Chemicals Co.出品）.Cellofine(Chisso Co.出品）， Biogel P. Biogel Α(Βίο. Rad Lab.出品），Ultrogel (LKB Co.出品），TSK-G(Togo Soda Mfg. Co.出品）等市 售品。 上得凝駿過濾活性分劃再經羥链灰色管柱色層分析， 離子交換管柱色層分析（DEAE, CM, SP)色譜聚焦法，逆 相高速液體色析等及其各種組合而精製，乃分離，收得 IL-la衍生物與IL-1/9衍生物之特定多胜呔均勻物質。 本發明之肝炎預防，治療劑以含U-Ια, IL-1/3及其 衍生物為有效成分為必須條件，其他可為與通常«藥組 成物相同，可任意配合其他藥理學有效成分與製劑學慣用 成分，可依常法調製成適合其應用之B藥組成物形態。 與上述《藥組成物可配合之成分，尤其於安定化IL-1 活性膊靥面而言，例如人血淸白蛋白等白蛋白類與通常 之L氛基酸類（以半胱規酸.甘錤酸較適合）：其添加贵 並無限制，但對I L - 1活性胞毎1 w s以白蛋白類約〇 . 〇 1〜 l〇ms,氛基酸約0.001〜10ηκ (二種以上氛基酸並用時為 其合計《)為較適當。又上述段藥組成物可依需要配合 -1 3 - 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)中4規格（210x297公；¢) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 經濟部+央橾準局β工消费合作社印製 212760 Λ 6 13 6 經濟部中央懔準局员工消費合作社印製 五、發明説明（12) 添加糖類（葡萄糖，甘露糖，半乳糖，果糖等單糖類， 甘露耱酵，肌酵，木耱醇等耱酵類，Μ糖，麥穿糖，乳 糖等雙耱類，蕕聚糖，羥丙基澱粉等多糖類，其中以Μ 糖，麥穿耱，甘露耱醇，肌醇，蕕聚耱較佳），離子性 與非離子性表面活性劑（聚氣乙二醇花鍬耱烷酯糸，聚 氣乙烯烷醚条，花鍬耱單醯酯糸，脂肪酸甘油酯糸等） 耱類以每lus 1L-1活性體加約0.1«g以上，而以約 1〜lOOmg範圍較適合，及.表面活性劑以毎lwg IL-1活 性體加約O.OOOlng以上，而以約0.001〜O.lmg範圍較適 合。 本發明之治療劑之調製方法一般為藥理學有效量IL-1 活性體（IL-lcr,丨L-1/9,及其衍生物）與依需要添加之 t述成分配合適當翳藥製劑載體調製成製劑組成物形態。 該製劑載體可使用通常慣用於製劑調製之充填劑，增量 劑，結合劑，濕潤劑，崩坯劑等賦形劑及稀釋劑等。製 劑製成物之形態並無特別限制，可如錠劑，粉劑，粒劑 ，丸劑等固形劑，亦可為液_，懸浮劑，乳劑等注射劑 形態，亦可為在使用前添加適當載體而成液狀之乾燥製 品，此等製劑組成物均依常法諏製而成。 可採用為載體之緩衝液並無特定限制，如檸慊酸-磷 酸納.檸檬酸-檸攧酸納，_酸-醋酸納，磁酸納-磷酸 氫納，榉檬酸-硼砂等之PH4-8,尤以pH 5- 6之各種緩衡 液均可。 -1 4- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝* -5 _ 線- 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210X297公*) 212760 Λ 6 Η 6 經濟部中央橾準局员工消費合作杜印製 五、發明説明（13) 所得轚藥製劑依該製劑組成物形態經適當途徑投藥， 如注射劑形態翳藥製劑以靜脈内，肌肉内，皮下，皮内 腹腔内投藥等方式投蕖，而因形劑形態醫蕖製劑則以經 口或經胃賭方式投醫_製劑中之有效成分置及該製 劑投藥董依該製_投_方法，投藥形態.使用目的，患 者症狀等而適當選擇，通常調製成含有效成分約0.0000 1 〜80重量百分率之製劑形態，將此製劑以其所含有效成 分量對成人1人毎日約O.Olwg〜l〇*g範圍内投藥。此 投藥不一定1日1次，可分為1日3〜4次。實施例： 以下以參考例與實施例詳細說明本發明。又各實施例中 之生理活性以下述方法測定。 [活性测定] (1 ) IL-1活性測定： 依 Oppenheim之方法[J. Iamunol, 1 16 :1466(1976)], 以利用（3H/He J条家鼠胸腺細胞測定之LAF活性表示之。 (2) G IF活性潮定： 將稀釋成各種濃度之供轼樣品液各〇.ln丨注入96孔擻 量滴定板，再加含人黑素瘤細胞Α375 2X 10 4 /β丨濃度 之103： FCS之EagU's MEM懸浮液0.1ml,於二氣化磺培 養器（N a p c 〇 C 〇 . , L t d ,)内培餐4日。加0 , 0 5 J!中性紅 (和光純藥社製）〇.05ml於各小孔，37¾培養2小時。除 去上淸液，縷缓加0.3*丨磷酸缓衝生理食鹽水於各小孔 -1 5 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. -°_ 線. 本紙張尺度遑用中國Η家標準（CKS)甲4規格(210x297公*) Λ 6 Β6 212760 五、發明説明（14) 以洗淨。除去洗淨液，加丨磷酸納-乙醇等量混合液 於各小孔，以撖攪拌器振通數分鐘，將進入細胞内之色 素量以96孔微置滴定板用分光光度計（Titer Check Multisean, Flow Lab.製品）於540//·测定吸光度，求 得抑制增殖活性。取50¾抑制對照細胞增殖之試驗組（即 取顯示對照組吸光度測定值之1/2吸光度測定值之試驗 Μ之稀釋率倒數）做為GIF活性單位。故如GIF活性為 10單位時，稀釋該供試樣品倍時仍具有抑制細胞增殖 50%之活性。 參者例]:IL-Ισ衍生物[16G，36D，141S]之製造 (1)讕製IL-Ια衍生物表現用質體： 在此使用之質體Ptrp IL-lot -141S如記載於歐洲專利 公開第237073號公報，利用含編碼IL-la前驅體蛋白質 之 cDNA之質體 pcD-GIP-207[具有 E.coliX1776/pcD-GIF-207(日本撤工研條寄第1294號）之質體]與由pTMI (今本， 同前）所得霣龌Ptrp IL-la-113,依位黏誘變法[Proc. Hatl. Acad. Sci.,Aj:5662-5666(1984)]所得，具有 编碼IL-lct衍生物（序列緬號1之IL-la氨基酸序列中 第141位Cys以Ser取代之氨基酸序列）之基因。

由質體 Ptrp IL-lct-141S 切取 ClaI-Bai«HI 527bp DHA Η段，粘接於IL-1/3位黏誘變用載體fl· IL-1乃lppt [Bioche®. Biophys. Res. Comnun., 1 5 0 *-1106-1114 (1988)]之 Clal-BamHI 長片段.卽得 Π· IL-1K-141S 本紙張尺度逍用中國Η家標準(CNS)甲4規格(210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝- 線- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 212760 Λ 6 Η 6 經濟部中央標準扃员工消費合作社印製 五、發明說明（15) •將此感染幫肋噬_體》13([〇7(簀酒造）得單股DNA U s D HA )，做為誘變鑄型。 以T4聚核甘酸撖酶磷酸化之5〜磷酸化合成寡聚核甘 ®M5'-ACTTTATGGGGATCATCA-3')為引子，用「寡聚核甘 _導向生醴外誘變」（AmefshaB UK製品，#RPN 2322)進 行位點誘變。 由1 P〇li MV1304(寶酒造）轉化株得ssDNA,依雙脫氧 核β酸鳙終止法進行序列分析，得目樣基因變異重組體 (轉形體>『】.IL-lot- 16G· 141S/E· coli HV 1304 · 此質體為序列编號1之氨基酸序列中第16位Arg被取 代為Gly,第36位為Asn,第141位Cys被取代為Se「之多 胜呔之表現質鱧。 上述轉形體以 Esche「丨 chia coli MV1304/fl* IL-lot ♦ 16G-141S之名託存於日本工業技術院撖生物工業技術 研究所，其託存编號為撤工研條寄第2434號（FERM BP-2434) „ (2).轉形醱之培養： 上得耱形體（MV130 4/fl. IL-la · 16G· 141S)接種於 含安比西林100/u g/nl之下列組成LB培養基600b1,於37 10振盪培餐過夜即得前培養液。 UB培養基組成] Bacto-Peptone(Difco) 1 0 g / Jl Bacto-Yeast Extract (Difco) 5 g / Jl -17- (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210X：297公釐) 212760 Λ 6 Β6 五、發明説明（16) N a C 1 ( W a k ο ) 1 0 g / .0. 上得前培養液600a丨接種於下列組成生産培養基30JI , 於50 ft容量醱酵瓶（日立）中，以36.51C, 0.5VVM通氣量 ,12〇rp«i攬拌數等條件下培蓍14小時。 f生産培養基組成]

Na 2 Η P0 4 * 12Η 2 0 ΚΗ 2 Ρ0 4 NaC 1 ΝΗ 4 C 1 Bacto-Casami no acid Bacto-Yeast extract L-Cysteine · H C1 L - P r ο 1 i n e L-Leucine 6g/ .3, 3 g / . A 0 . 5 g / Q. 1 g / Q. 1 0 g / 1 o. 5 g / a 7 5 m g / Si 7 5 b g / Jl 7 5 m g / il 以4K NaOH調整pH = 7.4, 121*C, 3〇Βίη高壓殺®處理或 123Ό, 2〇Βίη蒸汽加熱處理後，於接種時將下列各成分 溶液（另行滅菌）以無®狀態添加： (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝- 訂· · · ·線·

J 經濟部中央慄準局貝工消費合作社印製 1 Η MgSO 4 ♦ 4 Η ? 0 1M CaCl 2 · 2Η ? 0 7.5mg Thiamine.HC1 40% Glucose 2 b 1 / Jl 0 . 1 1 / Jl 1 m 1 / Jl 1 8 . 7 5 b 1 / Jl 培餐終了時將»臞懸浮於lMHa2HP〇4 30〇Bl,於冷 室過夜後，在冷室中對1〇bM Tris· HC1, PH8.0透析2 18 本紙張尺度逍用中a B家樣準(CNS)甲4規格(210X297公激) 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 213760 λ6 ___Β6_ 五、發明説明（17) 天，透析液經遠心分離U6000xg)分成上清液與沈澱物 〇 (3) IL-lc(衍生物之精製： 上得上淸液以2 Μ醋酸調整p Η = 3後，使用S P - Η P L C fTosoh Co.製品，使用 TSK 凝膠 SP-5PW 管柱（5.5x20cb) .以下列條件精製： 洗脱液A:50*M_酸納，pH4. 5 洗脱液B:50bM醋酸納，pH5.5 密度梯度： 時間（分） ％ B 0 0 30 0 130 100 160 100 165 0 195 0 流速：3 0 b丨/ b i η 上述結果於滯留時間114-113分可檢出GIF活性分劃。 此分劃依上述條件再度進行SP-HPLC得GIF活性分劃。將 此二分fl牧集後以離子交換色析（DEAE-HPLC)精製。 管柱：TSK凝醪 DEAE-5PW, 5,5x20cm(Tosoh Co.) 洗脱液 A : 20bM Tr i s-HC 1 , pH8 . 0 洗脱液 B:含 0.5bM NaCl 之 20mM Tris-HCl, pH8.0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- _ 線· -19- 本紙張尺度逍用中B國家標準（CNS)甲4規格(210X297公*) 212760 A 6 B6 經濟部中夬漂準局员工消費合作社印製 五、發明説明ί8 ) 密度梯度： 時間（分〉 0 0 30 0 1 50 60 155 100 185 100 190 0 流速：30ml/inin 其結果於滞留時間98.8〜102.8分處可檢出GIF活性分 劓。此分劃以超過濾法（YM-5薄暌，Amikon Co.)使成20 mM链酸納缓衝液（PH7.0)之溶液組成而濃縮得濃縮精製 品。其等電點為5.0。 (4) IL-let衍生物之確認： (a )氨基酸組成： 上得濃縮精製品3 0 W 1小心放入6 X 5 0 b b厚硬質玻璃試 管底部，再將此試管放入反應小玻管中，以Pico Tag Work Station (Waters Co.)進行真空乾燥。加 6N HC1 200« 1(含U Pheno丨）於該試管，小心脱氣後封管，於 130P加水分解4小畤。加0.2N HC丨400 w 1於加水分解 物，做為氨基酚分析用試料。 氬基酸分析以日立835型氨基酸分析計，注入上述試 料溶液250«丨後進行分析。分離之氨基酸以正酞醛檢出 。至於定量則以試料之前後分析之標準氨基酸製成之曲 -20- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝· -5 _ 線- 本紙張尺度通用中國國家標準(CMS)甲4規格(210X297公釐) 212760 Λ 6 13 6 五、發明説明 (19) 線進订ΰ 其結果以Phe為基準（10克分子量），將各氨基酸所含 克分子量比示如第]表。又於上述分析條件下無法測定 Pro, C y s, Tr p 〇 第1表 S齊郎十失噤準鬲貝1.消費合作fi印奴 氨基酸 克分子置tt Asp及 / 或 Asn 21.1 Th r 11.2 S e r 11.5 G 1 u 及 /或 G 1 η 18.3 G 1 y 8.8 Ala H i* 1 14.3 A Q V a I Met 0.0 2.0 lie 10.4 Leu 15.2 Ty r 6.7 P h e (10) L y s 11.1 ? 9 Π 1 s A r g O « ^ 2.7 ——21—— 本紙張凡度逍用中B國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂- 線- 212760 Λ 6 116 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（20) (Β )氨基酸序列： 上得濃綰精製品50wl(相當於298pmol)以蛋白質序列 分析儀（Protein Sequencer, Model 470A, Appl. ied B ί 〇 s y s t e n s I n c .製）分析。生成之P T H -氛基酸以3 3 S：乙 腈水溶液100〜500ί/Χ適當稀釋，取其5W£注入於自動取 搛器（Autosaapler, Model 710B, Waters Co.)。色析 糸統以421型控制器使2台Beckman 112型幫浦動作•管 柱 2»»Χ 250ββ)裝填 liltrasphere DDS-5un,以管柱加熱 器保持5 51*流速0.3|11丨/1111、，以20«^醋酸納與乙腈混 合液進行梯度洗脱法分離，分析時間為45分鐘。其結果 N末端領域之36餾氨基酸序列如下： Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Gly5 10 15 » He He Lys Tyr Glu Phe lie Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gin Ser He20 25 30 Πe Arg Ala Asp35 由上结果可確認所得濃縮精製品為序列編號2代表之 iL-l〇[衍生物之第16位Arg被Gly取代之多胜敝^又基因 之第36位氨基酸為Asn,而所得精製品則為Asp。於天然 型IL-1 or覼察播知第36位氨基酸為Asp時為安定之衍生 物，於本實例之IL - 1 a衍生物亦發生相同之變異。 參考例2: IL-lor衍生物[△ (1-14) . 36D. 141S]之製造 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 本紙張尺度通用中國Η家樣準(CNS)甲4規格(210x297公*) 212760 A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（21) (1 >調製IL-1 α衍生物表現質體： 利用質體P trp IL-lcr-361)· 141S [歃洲専利公開第 2 3 7073號公報記載，具有該質體之大腸_HB101株以 Escherichia coli HB101/IL-lot -36D· 141S之名託存 於擻工研，託存编號FERM BP-1295],依位點誘變法如 下實施。 由霣體 P trp IL-lot-36D· 141S 切出 Clal -BaaiHI 5 2 7 b p D N A片段.如同參考例1粘接於f 1 · I L - 1 Tpp T之 Clal-BamHI 長片段而得 fl* IL-la-36D. 141S ,感染於S3肋噬®醱M13K07(寶酒造）得ssDHA,做為誘 變薄型。 以合成寡聚核甘酸（5 ' - AAGGGTATCGATTATGATGAGGATCATC-3' 為引子，如同參考例1用寡聚核甘酸導向生體外誘變進 * 行位點待異性誘變。 由E.coil MV1184(寳酒造 > 轉形®株得ssDNA,以雙脱 氣鏈终止法進行DHA序列分析.得目標基因變異重組體 fl- IL-la-A(l-14)-36D· 141S/E.coil HV1184〇 此質體為序列編號2之氨基酸序列中缺失第1〜14位 氨基酸序列，且第36位Xaa為Asp,第141位Xaa為Seri 多胜呔之表現質體。 上述轉形體以[卜:3(^6「丨（：》1!3<:〇1丨》^1184/1'1*1匕-1α · Δ(1-14)36ϋ· 141S]之名託存於工業技術院撖生 物工業技術研究所，编號FERM ΒΡ-2433。 -23 - (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝· 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210X297公釐) 212760 A 6 B6 五、發明説明（22) 使用上述質體，與參考例大約相同方法進行目稼 IL-Ια衍生物之表現及精製。獲得[IL-la -△ (1-14) • 36D· 14〗S]。其活性比為1.0X106GIF單位/ ng蛋白 質。 (2) IL-lcr衍生物之確認： (a )氬基酸組成： 依參考例l,(4)(a)之方法分析上得IL -Ια衍生物之氨 基酸組成。以P h e為7所得結果列如第2表。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 線· 經濟部中央慄準局員工消費合作社印製 -24- 本紙張尺度通用中國國家標準(CNS)甲4規格(210X297公釐) 212760 A 6 B 6 五、發明説明（23) 第2表 氬基酸 克分子量比 Asp 19.0 Th r 11.0 S e r 7.1 G 1 u 16.3 G I y 5 . 3 Ala Va 1 13.2 5.8 Met lie 4.0 10.3 Leu 13.8 Ty r 5 . 7 Phe (7) L y s His 10.0 3.2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 訂- 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 (b >氬基酸序列： 依參者例l,(4)(b>敘述方法進行上得IL-lct衍生物N 末端領域氨基酸序列分析。其結果N末端領域15锢氨基 酸序列如下： -25- 本紙張尺度逍用中國國家楳準(CNS)甲4規格(210X297公*) 212760 Λ 6 Β6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（24) Met Met Arg He He Lys Tyr Glu Phe He Leu Asn Asp Ala Leu5 15 由此可確認所得衍生物為序列編號2代表之u-lag 基酸序列中缺失第1-14位氨基酸序列。 參考例3 : I L - 1 a衍生體[△ (1 - 1 5 > ]之製诰 (1) 調製IL-lct衍生物表現用質醴： 利用IL-1/S位點特異性誘變用載體fl· IL-1/3 lppT 「Βί〇cheb . Biophys. Res. Connun. 150-1106-1114 (1988)1,以 EcoRI 切斷，DNA 聚合 _I(Klenow 片段）處 理，自行粘接製成EcoRI位點缺失之fl· IL-1厶1PPT △ RI,再由此質體切出Hpal -BanHI長Η段。 另外由質體P trp IL-Ια -113(歐洲專利公開第237073 號公報記載）切出EcoRI -BaisHI短片段，介合成聯结子 [5'-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTTAATATTATGAGAA TCATCAAATACG-3'及 5'-AATTCGTATTTGATGATTCTCATAATAT T/UACCTCCTTACGTGAACTTGCGTACTAGTT-3’]與上述 Hpa I -BanHI長Η段連接，得目標基因變異之轉形體111·^-1α · Δ (l-15)/E.coli HV1184。 此質為序列编號2之氨基酸序列中缺失第1-15位氨基 酸序列，且第36位Xaa為Asn,第14〗位Xaa為Cys之IL-la 衍生物之表現質醱。 (2) 製造IL-la衍生物： 以上述質體輿參考例1所述方法大約相囘，進行目樣 -26- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) '裝- 本紙張尺度遑用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公货） 212760 Λ 6 136

五、發明説明（25) U-】a衍生物之表現及精製。 含質 *Λ(1-15)之大賜 SME.coli HB101) 以參考例1相同條件培養（60JI)後.遠心分離（16000xg) 收集舖醱，懸浮於1M磷酸緩衡液（pH6.0)於冷室過夜後 對0.01M磷酸嫌衡液（PH6.0)透析2天，透析液逋心分離 ( 1 600xg)成上清液與沈澱。 沈澱物以上述方法重複2次操作，收集各上清液供下 述精製操作。 (3)精製IL-1 α衍生物： 上得上清液利用DEAE-HPLC[Tosoh Co.製品，使用TSK (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部屮央標準局員工消費合作社印製

凝睽 DEAE-5PW管柱（5.5X 20cb)], 以下列條件精製。 洗脱液A : 20bM Tr i s-HC 1 ♦ pH8.0 洗脱液B : 20bM Tris-HCl ♦ pH8.0 + 0 . 5M NaC1 濃度梯度： 時間C分） %B 0 0 30 0 150 60 155 100 185 100 190 0 流速：3 »丨/ m ί η 各別收集滞留時間88〜93分U分劃）與99〜103分（Β分 眚Ϊ ),分別超過 濾（YM-5薄膜）濃縮 後，以凝膠遇濾HPLC -27- 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210X297公；¢) 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 212760 A6 _B_6 五、發明説明（26) 「Tosoh Co.使用 TSK 凝醪 G-2000SWG 管柱（21.5 x 600ibb), 洗液PBS]精製。 上述精製之A分劃以2M醋酸調整pH4後，用SP-HPLC [Tosoh Co. TSK 凝膠 SP-5PW 管柱（21.5X 150am)]以下列 條件溶離。 洗脱液A : 5 0 * Μ醋酸納，p Η 5 . 0 洗脱液 Β:50βΜ醋酸納，ρΗ5.0 +0.5Μ Naci 濃度梯度： 時間（分） ％ B 0 0 20 0 110 4 5 115 100 130 100 135 0 流速：30b丨/min 收集滞留時間87〜93分之分劃，以YM-5薄膜與20bM磷 酸納嫌衝液（PH6.0)超過濾濃縮成精製品。 (4) IL-loc 之確認： (1)依參考例l,(4)(a>所敘述相同方法進行上得精製品 之氨基酸分析，以Phe為7所得結果列如第3表。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂_ 線. -28- 本紙張尺度通用中國Η家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐） 212760 Λ 6 Β6 五、發明説明（27) 第3表 氛基酸 克分子量比 Asp 18.0 Thr 11.2 S e r 6.8 G 1 u 17.1 G 1 y 5.8 Ala 13.1 Va 1 5.7 Met 2.8 lie 10.9 Leu 14.1 T y r 5.9 Phe ⑺ L y s U ； 〇 10*2 0 〇 Π 1 s A r g 〇 * V 3.1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 線· 經齋郎中夹標準局貝工消費合作社印製 (2)如同參考例l,(4)(b),分析上得IL-la衍生物N末 端領域氨基酸序列，其結果N末端領域23値氛基酸 序列如下： -29 - 本紙張尺度逍用中B Η家樣準(CNS)甲4規格(210x297公釐） 212760 A 6 B6 五、發明説明（28) Met Arg lie lie Lys Tyr Glu Phe lie Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gin5 10 15 Ser lie lie Arg Ala Asn Asp ,20 由此可確認所得衍生物為以序列編號2代表I L - 1 c(衍 生物氛基酸序列中缺失第1-15位氬基酸序列，且第36位 Xaa為 Asn〇 (3)上得B分剷如同上述A分制進行精製及氛基酸分析 。以Phe為7所得結果列如第4表。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 經齊郎中矢漂"咼員工消費合作法印製 _ 3 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐) 212760 Λ 6 Β 6 五、發明説明（25) 第4表 氨基酸 克分子置比 Asp 18.3 Th r 11.3 S e r 6.7 G 1 u 17.2 G 1 y 5.7 Ala 13.2 Va 1 5.8 Met 2.9 lie 10.9 Leu 14.1 T y r 5.9 Phe (7 ) L y s 9.9 His 3.0 A r g 3.1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 經濟部屮央標準局員工消費合作社印製 (4)就上述Β分劃精製品進行輿參考例1,(4)(2)相同之 氨基酸序列分析，其結果N末端領域23桓氛基酸序 列如下： 本紙張尺度逍用中Β B家標準(CNS)甲4規格(210X297公釐) 212760 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（3d Met Arg lie lie Lys Tyr Glu Phe lie Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gin5 10 15 Ser lie lie Arg Ala Asp Asp20 由此可確認所得衍生物為以序列《號2代表之IL-l〇r 衍生物氛基酸序列中缺失第1-15位氨基酸序列，且第36 位 Xaa為 Asp。 參考例4:Ι!^1α衍生物[△ (1-15) · 36D. 141S]之製造 (1)諝製U-Ια衍生物表現用質鼸： 利用質艚p trp IL-la · 36D· 141S.依位黏待異性 誘變法如下述進行。 由質體 P trp IL-l〇(-36D. 141S 切出 Clal -Ba，HI 527bp DNAH 段，與 fl· IL-1/QIpp T 之 Clal-BanHI 長 Η段粘接成fl· U-lct-36D· 141S(同參考例1),以此 感柰幫肋噬豳體M13K07(賣酒造），得ssDNA,做為誘 變鑄型。 以合成寡聚核甘酸（5'-GTATCGATAATGAGAATCATC-3’] 為引子，用寡聚核甘酸導向生體外誘變組件U^arsha· Co.)進行位黏待異性誘變（同參考例1)。 由E.coil MA1184轉形_株得ssDNA,以雙脱氧鏈終止 法進行DNA序列分析，得目標基因變異之轉形體fl* IL-1α -Δ (1-14) · 36D · 141S/E. co ί 1 MV 1 184〇 再依下法製造大量培餐用表現載體：上述fl* IL-1/9 -32- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝- -ί _ 參紙張尺度遑用中國國家樣準(CNS)甲4規格(210x297公釐) 212760 A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（31) Up T以 Mlul, Sail 切斷，DNA 聚合酶（Klenow 片段）® 理，T4DHA粘接酶粘接得fl· IL-1/9 1PP TAMS。再將此 EcoRI切斷，DNA聚合期MKlenow片段，自行粘接，再以 Aatll 切斷，T4DNA聚合除，Bgll 聯結子（pGAAGATCTTC) 處理，使Aatfl位黠改變為Bgll。同樣以Sail切斷， DNA 聚合酶（KlenowH 段 Xbal 聯結子（pGCTCTAGAGC) 處理，使Sail位黏改變為Xbal。由此切出（：131-B a m Η I 5 . 5 k b D N A 長片段，與 f 1 · I L - 1 α △(卜 1 5 ) · 36D* 141S之 Clal -BamHI 482bp DNAH 段粘接。得 fl · IL-Ια Δ (1-15) * 36D· 141SA(AatI ->BglD , Sall—Xbal),再由此切出 Bgll-Xballl09bp DNAH 段。 另外將PAT153之Clal位黏改成Bg丨I , Dral改成 Xba I ,以 BglE，Xba I 切斷得 Bgll -Xbal 2 514 bp DHA 長片段，再與先前之Bg丨E-XbaI1109bp DHAH段粘接， 將目樣重組麵 PAT, IL-lot △ (1-15) · 36D· 141S。 此質釀為序列编號2之氨基酸序列中缺失第1-15位氨 基酸序列，旦第36位Xaa為Asp,第141位Xaa為Ser之IL-1«衍生物表現質體。（以样重組體培餐裂造蛋白質而製 成附加轉譯開始密碼子來源Met之蛋白質時，實際上製 成缺失第1-14位氨基酸之多胜肽。 上得轉形體以[Escherichia coil HBlOl/pAT IL-lot ΔΠ-15)· 36D· 141S]之名託存於工業技術院撤生物工 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度通用中國國家橒準(CNS)甲4規格(210X297公釐) 212760 Λ 6 Β6 經濟部屮央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 卢2) 業研究所，託存编號FERM ΒΡ-2483。 (2>轉形醴之培養： 上述轉形醱接種於含四琛素l〇ii g/m丨之下列組成LB培養 基600·1,於37*0振盪培餐過夜得前培餐液。 U Β培養基組成] Bacto-trypton (Difco) 1 0 g / Jl Bact. o-Yeast extract (Difco) 5 g / Jl NaC 1 (Wako) 1 0 g / Jl 上得前培餐液600i«丨接種於下列組成之生産培餐基30Λ ，於50 α容量醱酵瓶（日立 >以36.5¾. IV V Μ通氣量， 300rp*檷拌數培餐16小時。 [生産培養基組成] Na2 HP〇4 * 12H2 0 6 g/ A >KH 2 P〇 4 3g/ .a HaC 1 0 . 5g/ Jl NH 4 C1 1g/Ά Case in hydrolysate (sigma) lOg/Jl Bacto-Yeast extract 0.5 g/ A MnC1 2 ♦ 4H a 〇 2.5mg/ £ L-Cysteine· HC1 7 5 b g / _0. L - P r o 1 i n e 7 5 m g / il L-Leucin 7 5 b g / 以 4N NaOH調整 pH=7. 121P, 30min高壓殺菌處理後， -34 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 212760 A 6 B 6 五、發明説明（33) 於無菌狀態下添加下列無®液紐成物 [無®液組成] 1M MgSO 4 · 4H 2 0 1M CaC1 2 · 2H 2 0 7 . 5 a g ThiamineHC] 40¾ Glucose 2» 1 / Jl 0 . 1 b 1 / Jl 1 n 1 / il 18 . 75b 1 / jl 培餐終了後逋心分離（16000xg)收集ϋ齷，懸浮於1M 磷酸缕衝液（Ρ Η 6 . 0 ),冷室遇夜後對1 0 β Μ T r i s - H C 1缓 衝液（pH8.0)透析2天。透析液達心分離（ 1 6 000xg)成上 清液輿沈澱，沈澱物重複上述操作，收集各上清液合 供下述精製操作。 (3) IL-la衍生物之精製·· 上得上清液以2MSI酸調整pH = 3後以SP-HPLC * 「Tosoh Co.使用 TSKgelSP-5PW管柱（5.5x20cb)],以 下列條件精製： 洗脱液A:50bM醋酸納，PH5. 0 洗脱液 B:50bM醋酸納，PH5.0 + 0.5M NaCl 密度梯度： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 線· 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 間（分） «Β 0 0 30 0 90 3〇 95 100 125 100 130 0 -35 本紙張尺度逍用中Η國家標準（CNS)甲4規格(210X297公着） Λ 6 Β6 stmd- 五、發明説明（為+) 流速：30ml / min 收集滯留時間70〜75分之分割，以1M Tris-HCl緩衝 液諝整 ρΗ=8·1 後，以 DEAE-HPLC[Tosoh Co . ,TSK gel DEAE-5PW管柱（5.5X20CB)],以下列條件溶出： 洗脱液 A: 20mM Tris-HCl, PH8.0 洗 0¾ 液 B : 2 0 mM Tris-HC 1 , pH8 . 0 + 0 . 5 m M NaC 1 濃度梯度： 時間（分） ％B 0 0 20 0 1 4 0 6 0 145 100 165 > 100 17 0 0 流速：3Bl/inin 收集滞留時間92〜96分之分劃，以超遇濾（YM-5薄膜） 濃縮後用凝謬過濾 HPLCCTosoh Co.，TSK gel G-2000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 本紙張尺度遑用中鼷B家樣準(CNS)甲4規格(210X297公*) 212760 Λ 6 Β6 五、發明説明（糾/i) SWG管柱（21.5x600m·)洗脫液PBS〕精製。 猜製品以2 1^猎酸調整卩11.4後用3?-1^1^(11〇8〇11€：〇.,131( gel SP-5PW (21·5 X 15〇 mm)管柱〕以下列條件溶 洗脱液A : 50mM醋酸納· 洗脱液B: 50mM醋酸納， 濃度梯度： 時間（分） 0 2 0 110 115 13 0 13 5 流速：3ml/fflin 收集滯留時間87〜90分之分劃 PH5 . 0 ρΗ5·0 + 0.5·Μ NaC 1 % B 0 0 4 5 10 0 10 0 0 以超過濾（YM-5薄膜 (請先閲讀背而之注意事項再塡寫本頁) -裝- 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 ,20·Μ磷酸納缓衝液（PH7.0)濃縮得精製品。 (4)IL-1«衍生物之確認： -3 6 -A- 本紙張炙度遑用中國國家楳毕(CNS)T4規格(210X297公*) 212760 Λ 6 Β6 五、發明説明（35) (a)上得精製品之氨基酸分析依參考例l,(4)(a)之方法 進行。以Phe為7所得結果如第5表所示。 第5表 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 氣基酸 克分子置比 Asp 18.6 Thr 11.4 S e r 7.7 G 1 u 17.2 G 1 y 5,7 A 1 a ϋ 〇 1 13.2 V a i Met 0 ♦ δ 2.8 lie 10.9 Leu 14.1 Ty r 5.9 Phe (7) L y s 9.9 His 3.0 A r g 3 . 1

(b )依參考例1〆4 ) ( b >之方法分析上得I L - 1 α衍生物N 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 212760 Λ 6 Β6 經濟部中夬漂準局員工消費合作社印製 五、發明説明（3t〇 末端氛基酸序列，結果其N末端領域15傾氨基酸序 列如下： Met Arg lie lie Lys Tyr Glu Phe lie Leu Asn Asp Ala Leu Asn5 10 15 可確認所得衍生物為以序列蹁號2代表之IL-lct- 親基酸序列中缺失第卜15位氨基酸序列。 參考例5 : I L - 1/8衍生物[2 4 - 1 5 3 ]之裂造 (1 >調製表現質驩： 利用含编碼人IL-lyQ基因之質鼸P trp GIF-cr [參照 歃洲專利公開第0 1 87991號.被其轉形之大腸赭以 Escherichia coli X1776/ p trp GIF-α 之名託存於微 工研（ 1985.12.1 2 )，託存纗號PERM BP-949 ]依下述方法 構築多胜呔表現霣體。 P trp GIF-a以Adel , Sail切躕後，用瓊脂糖凝隈 霣泳分離含編碼IL-1/9第24位以後氨基酸序列領域之781 bp DNA片段，並用DNA聚合鷗I Uleno*片段）使Ndel , Sail切斷部位成為平端。 另取 5'-CGATAATG-3’與 5’-CATTAT-3’，將其 5’末端以 T4聚核甘酸瀲酸化後，用T4DHA粘接酶連結於上述 平端，再以Clal, BanHI切斷後，瓚脂耱凝驂電泳分 離 510bP DNAH 段。 質體pTHI以CUI , 切斷後用瓊脂糖凝膠電泳 分離含trp起動基因之約4.4kbP DHA片段，用T4DNA粘 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -55. 本紙張尺度遑用中《國家標準< CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 21S760 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（37) 接藤與先前所得51〇bp dial _Ba*HI達結’轉化大賭® HB101,侬Boiling法所得霣艚DNA之限制酶分析灌擇目 標轉形體[Maniatis et al·， Molecular Cloning· PP 366 (1982), Cold Spring Harbor Lab . ] 〇 (2>轉形驩之培餐： 上得轉形嫌（E.co 丨 i HBlOl/p trp GIF-ot -24-153)於 含安比西林丨，色親酸2〇wg/·丨之LB培餐基 (lXTrypton, Yeast ex, 0.5%113(：1)10瞧1中振播培 餐過夜（37Ή )，取其1·丨接_於含安比西林g/ϋΐ， 151酿蛋白ft基酸之M9最少培餐基[〇.6ΧΗβ2ΗΡ〇4 · 〇·3Χ Κ Η 2 Ρ 0 4 , 0 . 0 5 % Ν a C 1 , 0 . 1 % Η Η 4 C 1 , 2酿Μ Μ g S 0 a， 0.2XGlucose, 0.1»MCaC 丨 2 ]50»1，於 37*C 振衋培餐至 550nn吸光度（0D)為1·〇時收集菌驩•懸浮於15XSucrose -50«iMTris-HCL(pH8.0>-50«»MEDTA(pH8.0> 溶液 5_1，加 (以 1〇·Μ Tris-HCl，PH8.0 溶解之溶液） 500 w 1.再加 0.3XTriton X 1 00 - 1 87,5ΜEDTA ( ρΗ 8.0>-150iMTris-HC丨（ρΗ8.0)溶掖5·1,放置室湛15分鐮後， 再度懸浮，並以逋心分離得具GIP活性蘭鐮抽出物上淸 液。 (3 > I L - 1 /9衍生物之精製輿皤定： 依參考例1,(3)(4)之方法進行色析操作精製，求得濃 縮精製品之等霣黏，氨基酸組成，氛基_序列，確認本 衍生物為具有以序列編號3代表之IL-1/9氡基酸序列中 -39- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝< 訂 -線， 本紙張尺度遑用中困國家橾準(CNS)中4規格(210x297公釐) 212760 Λ 6 Β 6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（38) 之第24-153位氨基酸序列之多胜呔。 參考例6:IL-l/9衍生物[1-82]之製造 (1)調製表現質體： 以PvuII切斷p trp GIF-α (如參考例5),用瓊脂耱凝 謬霄泳分離含编碼IL-1/9第1-82位氨基_序列領域之約 2.9kbp DNAH 段。 另以T4聚核甘酸激酶使Xbal _結子[5’-CTCTAGAG-3’] 之5’末端磷酸化，用T4DNA粘接酶與上得DNA片段連結 ，再以Clal, Xbal切斷，電泳分離250bp DNA片段。 質體pTMI以BamHI切斷後用DNA聚合酶I UlenowH段） 使該切斷部位成平端，再用T4DNA粘接酶連結T4聚核甘 酸激_蔽£硝酸化之Xbal聯結子[5'-CTCTAGAG-3’]於此 平端，以Clal, Xbal切斷後電泳分離含trp起動基因 之DNA片段。 將此Η段與先前所得250bPH段以T4DNA粘接_連結， 轉化大陽豳HB101,依BoiHng法所得質艤DNA之限制酶 分析選擇目樣轉形體。 (2>轉形體之培養： 上得轉形醱依參考例5方法培蓍播得具GIF活性之菌 體抽出物上清液。 (3) IL-1/9衍生物之精製輿鑑定： 依參考例5,(3)之方法精製，求得濃縮精製品之等電 —4 0 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· --=s . 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格(210x297公*) 212*Ϊ60 A 6 Β 6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（39) 點，氨基酸組成，氨基酸序列，確認本衍生物為具有序 列编號3代表之U-1厶氬基酸序列中之第卜82位氨基酸 序列之多胜呔。 參考例7 : 依歃洲專利公鬭第237073號，得36D· 141S· IL-la 。又依歐洲專利公開第237967號，得71S· IL-1/8。 實施例1:肝炎治療劑之調製 對參考例2所得IL-la衍生物[IL-lct · △(l-H)· 36D· 141S]之生理食鼸水溶液（ixi06unit/el GIF活 性）加人血清白蛋白使成0.5¾，以0.22« β薄膜過濾後， 於無菌狀態下分注於小玻阀（毎版lml),以冷凍乾燥調 製成注射用製劑。此製劑使用時以注射用蒸皤水Ini溶 解之。 實施例2:藥理效果試驗 於本實例試驗本發明之肝炎治療劑有效成分之藥理效 果。 使用於本試驗之多胜呔為依日本專利特開平1-168286 號公報記載之方法製得之家EIL-lc(。使用家鼠IL-lot 之原因為對家鼠長期投與人IL-la時可能産生抗髑等問 題。 使用於本試驗之家鼠為遣傅性肝炎家鼠（LEC家鼠： Long— Evans with cinnanon-like coat color),為 1987年在日本北海道大學實驗動物中心所開發，建立者 -4 1 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂_ 本紙張尺度逍用中國《家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐) 212760 A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（40) 。其為Long-Evans糸之自然突變種，於生後約16-17週 1 0 0 «發生肝炎，其中約7 0 - 8 0 %變為慢性肝炎，而於1〜 1.5年後轉為肝癌之動物模式[Yoshida et al,, J. Hered, 2i:36 1 -365(1987)]。本試驗使用將其 SPP 化 (Specific pathogen free,無待定病原體感染）之LEC 家鼠（以下簡寫為SPF-LEC/otk)。 SPF-LEC/otk分為溶劑投藥組（鼠血清白蛋白100w g/ in 1 ,穴 1 半 2 )與鼠 I L - 1 α 投藥組（1 0 « g / b 1 / d a y ,孕 3 ), 此二組於8-20週齡間，以毎週投藥5日休止2日之間隔 進行皮下注射投動物在室溫23±2t,濕度55±5S! 條件下飼育，試料（C R F - 1 ,東方酵母社製品）輿水則自 由供給。 每2週由動物尾靜脈採血〗次，毎次0.5b丨，遠心分 離（3 00〇rp«, 5»irO 後測定血淸中之 GPT, GOT, 7-GT。 酵素之測定使用GPTopt· monotest, GOTopt· monotest ，7 -GT monotestlO(均 Boeringer Manhein Co.製品） 等測定組件。體重則毎遇測定1次。其結果如第1圖， 第2圖所示。 各圖均以LEC肝炎棋式家鼠之週齡與蕖物投_期間為 横軸表示各組家鼠之GPT測定結果（第1圖，單位IU/L) 及G0T_定結果（第2圖，單位IU/L)。各圖中（Α),(Β), (C)為屬投蕖組之3隻，而（D>,(E),(F)則騰溶劑組之3 隻家鼠。 -42 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂_ 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格(210x297公釐） 212760 Λ 6 Β 6 五、發明説明（41) 由第1圖與第2圖中可知溶劑投藥組之全部家鼠於16 週齡前後表現GPT與GOT活性之急激上升，而鼠IL-la投 _組刖於投藥期間（20週齡為止）其GPT與GOT活性均位於 正常範圍。 另於同試驗中16〜20遇之各組家鼠體重輿症狀變遷列 如第6表： 第6表 試驗組 第16〜20週期間 溶劑投_組 全數出現黃疸，體重減少，3隻中2隻死亡 I L -〗α投藥組 全數無特別變化 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂_ 經濟部中央懔準局員工消費合作社印製 由此可知溶劑投藥組覼察得肝炎典型症狀之黃疸與體 重減少且2隻死亡，而於鼠IL-la投藥組未見任何肝炎 症狀之出現且金數生存。 至於7 -GT在兩投_組間未見有顯著差異。 由上可知於逋傳性肝炎模式家鼠，IL-〗a具有顯著抑 止肝炎發病作用。 實施例3:藥效藥理試驗（手量依存性） 取雌性SPF-LEC/otk分為溶劑投藥組（鼠血清白蛋白 100U g/»l)|l| 鼠 IL-Ια 投藥組（lw g/kg 及 10u g/kg), -43- 本紙張尺度通用中B國家標準(CNS)甲4規格(210X297公釐) 212760 A 6 B6 五、發明説明（42) 以5天投藥2天休息自8遇齡開始連鑛進行皮下注射投 各組均使用3隻動物，飼育條件同實施例2 。由8 遇齡開始毎週测定體重1次，每2週測定血淸中GPT, G 0 Τ活性做為肝炎發病標記。 家鼠尾靜脈血液150W 1以肝素（heparin)處理之毛細 管採取，以遠心分離（2500rpn, 5nin)血漿.用GPTopt • monotest 輿 GOTopt · nonotes.t (均為 Boeringer Manheim山之内社製品）測定血漿中GPT, GOT值。其結果 如第3圖，第4圖所示。 由匾中可知溶劑投藥紐於第16週齡前後即表現GPT, GOT活性之急激上升，而於第18遇死亡。至於鼠IL-la 投_組，無論lw g/kg或10« g/kg均至第18週未顯現GPT ,GOT活性之上升，尤其10Wg/kg投藥組之有效性顯著 » π 因此，依據本發明可提供肝炎之預防及治療劑。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 -44- 本紙張尺度遑用中Η Η家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙) A 6 B6 212760 五、發明説明（43) 序列ifl號：1 序列長度：1 5 9 序列型式：《基酸 幾何形勢：不明 序列種類：胜呔 序列

Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg 5 10 15

He He Lys Tyr Glu Phe lie Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gin Ser lie 2〇 25 30

He Arg Ala Asn Asp Gin Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu 35 40 45

Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp 50 55 * 60

Asp Ala Lys lie Thr Val lie Leu Arg lie Ser Lys Thr Gin Leu Tyr 65 7〇 75 «Ο

Val Thr Ala Gin Asp Glu Asp Gin Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro 85 90 95

Glu lie Pro Lys Thr lie Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe 100 105 no

Trp· Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro 115 120 125

Asn Leu Phe lie Ala Thr Lys Gin Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly 130 135 140

Gly Pro Pro Ser lie Thr Asp Phe Gin lie Leu Glu Asn Gin Ala 145 15〇 155 45 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 装- 訂· -線. 經濟郎中央標準局员工消费合作社印製 太认糈K疳ΙΛ m屮珀珀它捸谁⑴阳）平4妈柊（210x297公修） 212760 A 6 B6 經濟部屮央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（44) 序列编铖：2 序列長度：159 序列型式：氬基酸 幾何形勢：不明 序列種類：胜呔 序列 Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg 5 !〇 15 lie lie Lys Tyr Glu Phe lie Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gin Ser lie 20 25 30 He Arg Ala Xaa Asp Gin Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu 35 40 45 Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp , 50 -55 60 Asp Ala Lys lie Thr Val He Leu Arg lie Ser Lys Thr Gin Leu Tyr M 70 75 80 Val Thr Ala Gin Asp Glu Asp Gin Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro 85 90 95 Glu lie Pro Lys Thr lie Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe 100 105 no Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro 115 120 125 Asn Leu Phe lie Ala Thr Lys Gin Asp Tyr Trp Val Xaa Leu Ala Gly 130 135 HO Gly Pro Pro Ser He Thr Asp Phe Gin lie Leu Glu Asn Gin Ala —46 — « (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂. 太《.张 K iA 用 Ψ 闽《 «:捸SfCNS) V4姐格（210x297公货） 經濟部屮央標準局β工消費合作社印製 212760 Αβ A 6 ______Η6_·< 五、發明説明（4¾ 1 仏 150 155 序列鏞狨：3 序列長度：153 序列型式：氨基酸 幾何形勢：不明 序列種類：胜呔 序列 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gin Gin Lys 5 10 15 Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gin 20 25 30 Gly Gin Asp Met Glu Gin Gin Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gin 35 40 45 , Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys He Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu 5〇 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gin Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys lie Glu lie Asn Asn Lys Leu Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ala Gin Phe Pro Asn Trp Tyr lie Ser Thr Ser Gin Ala Glu 115 120 125 Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gin Asp lie Thr 130 135 140 一* 47 一 1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 ——— 212760 A 6 B6 經濟部屮央標準局β工消費合作社印製 五、發明説明（46) Asp Phe Thr Met Gin Phe Val Ser Ser 145 150 序列編號：4 序列畏度：116 序列型式：氬基酸 幾何形勢：不明 序列種類：胜呔 序列 Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser 5 l〇 15 Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gin Met 20 . 25 30 Lys Cys Ser Phe Gin Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly lie 35 40 45 Gin Leu Arg lie Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gin Ala 50 55 60 Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro 65 70 75 80 Cys Pro Gin Thr Phe Gin Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe 85 90 95 lie Phe Glu Glu Glu Pro lie Phe Phe Asp Tlii Trp Asp Asn Glu Ala 100 105 no Tyr Val His Asp 115 —48 — (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝. 訂· 線· 太WH?燎1Λ闲Ψ困®1¾:锶谁iCNS)咿4組格f2]〇y297公婊）

Claims (1)

1. ^2Ι276(Γ I補充 A7 B7 C7 D7 第80106334號「肝炎預防治療劑」専利案 (82年7月；U日修正） 杰申諳専利範園： 1. 一種用於預防慢性肝炎之藥學組成物，含白血球間素 (Interleukin)-l活性物為有效成分。 2. 如申請專利範圍第1項之預防慢性肝炎之藥學組成物 ，其中之白血球間素-1活性物為由16G· 36D· 141S· IL-Ια , 36D · 1 41S ♦ IL - 1 α ,Δ (1-14) · 36D ♦ 141S· IL - Ια , Δ (1-15) · IL - Ια ,Δ (1-15) * 36D ♦ 141S. IL-lct , (24 - 1 53) ♦ ΪΙ-Ιβ , (1-82) · I L - 1 /9 , 71S· IL-1/3 等中遘取之。 (請先閱讀背面之注意事項再滇寫本頁) •装· •訂· •線· 甲 4(210X297 公尨） 78. 8. 3,000 r