TW202426057A - 用於治療癌症之組合療法 - Google Patents

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克麗絲塔 金尼爾
比拉爾 奧瑪
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Abstract

本文提供了在人受試者中治療癌症之方法，該等方法包括向該受試者投與：i) 抗體-藥物軛合物（ADC），該抗體-藥物軛合物包含抗體、可切割連接子和細胞毒性劑，以及ii) 雙特異性檢查點抑制劑。本文進一步提供了套組，該等套組包含i) 抗體-藥物軛合物（ADC），該抗體-藥物軛合物包含抗體、可切割連接子和細胞毒性劑，以及ii) 雙特異性檢查點抑制劑。

Description

用於治療癌症之組合療法
本揭露提供了在人受試者中治療癌症之方法，該等方法包括向該受試者投與抗體-藥物軛合物（ADC）和雙特異性結合蛋白。本揭露進一步提供了包含ADC和雙特異性結合蛋白的套組（kit）。
單獨或組合的手術、放射療法和化學療法係最為傳統和最廣泛使用的癌症治療方法。雖然該等治療方法可有效去除或殺傷癌細胞，但它們通常會給受治療的患者帶來不希望的副作用，如脫髮、貧血、嚴重噁心和健康細胞死亡。該等局限使得急需創新性的且危害較小的癌症治療方法。基於抗體的癌症療法依賴於抗體-藥物軛合物對癌細胞上特定蛋白質的識別和結合。抗體藥物軛合物（ADC）可以利用軛合物抗體部分的特異性將高毒性藥劑直接遞送至待殺傷的細胞。將抗體或ADC癌症療法與其他基於小分子的癌症療法組合使用可以藉由以不止一種方式攻擊惡性細胞和腫瘤來改善治療結果。
本揭露提供了在有需要的人受試者中治療癌症之方法，該方法包括向該人受試者投與：a) 抗體-藥物軛合物（ADC），該抗體-藥物軛合物包含：i) 結合B7-H4多肽的抗體或其抗原結合片段，ii) 可切割連接子，以及iii) 細胞毒性劑；以及b) 具有特異性結合計畫性細胞死亡蛋白1（PD-1）的第一結合結構域的雙特異性結合蛋白。
在一些方面，本揭露關於在有需要的人受試者中治療癌症之方法，該方法包括向該人受試者投與：a) 抗體-藥物軛合物（ADC），該抗體-藥物軛合物包含：i) 抗體或其抗原結合片段，ii) 可切割連接子，以及iii) 細胞毒性劑；其中該細胞毒性劑係具有式 I之化合物： ， 及其鹽和溶劑化物，其中R L係該可切割連接子，該連接子選自： ， 其中Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； 其中X係： ，其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，至少b1或b2 = 0，至少c1或c2 = 0；並且 其中G L係用於連接該抗體或抗原結合片段的連接子；以及 ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團，並且e係0或1；以及b) 具有與PD-1特異性結合的第一結合結構域的雙特異性結合蛋白。
在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含：分別含有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈CDR1（HCDR1）、重鏈CDR2（HCDR2）、重鏈CDR3（HCDR3）、輕鏈CDR1（LCDR1）、輕鏈CDR2（LCDR2）和輕鏈CDR3（LCDR3），或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體；或者分別含有SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體；或者含有SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120和SEQ ID NO: 121的胺基酸序列的在第一結合臂中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；以及含有SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126和SEQ ID NO: 127的胺基酸序列的在第二結合臂中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含：分別含有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體。在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段係雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120和SEQ ID NO: 121的胺基酸序列的在第一結合臂中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；以及含有SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126和SEQ ID NO: 127的胺基酸序列的在第二結合臂中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含：分別含有SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 33和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 47和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 31和SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 37和SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；或者分別含有SEQ ID NO: 39和SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；或者分別含有SEQ ID NO: 128和SEQ ID NO: 130的胺基酸序列的在第一結合臂中的VH鏈和VL鏈，或其功能變體，以及分別含有SEQ ID NO: 132和SEQ ID NO: 134的胺基酸序列的在第二結合臂中的VH鏈和VL鏈，或其功能變體。
在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含：分別含有SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體。在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段結合OVCAR4細胞系。在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 41的胺基酸序列的重鏈恒定區。
在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段係雙特異性抗體或其抗原結合片段，並且包含分別含有SEQ ID NO: 128和SEQ ID NO: 130的胺基酸序列的在第一結合臂中的VH鏈和VL鏈，或其功能變體，以及分別含有SEQ ID NO: 132和SEQ ID NO: 134的胺基酸序列的在第二結合臂中的VH鏈和VL鏈，或其功能變體。
在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含分別含有SEQ ID NO: 129和SEQ ID NO: 131的胺基酸序列的在第一結合臂中的重鏈和輕鏈，或其功能變體，以及分別含有SEQ ID NO: 133和SEQ ID NO: 135的胺基酸序列的在第二結合臂中的重鏈和輕鏈，或其功能變體。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 52的胺基酸序列的重鏈恒定區。在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 42的胺基酸序列的輕鏈恒定區。在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 51的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈。在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 48的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈。
在該等方法的一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段係單株抗體。在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段係人源化單株抗體。在該等方法的一些方面，ADC的可切割連接子係mp-PEG8-val-ala連接子。在該等方法的一些方面，ADC的細胞毒性劑係拓樸異構酶抑制劑（TOP1i）、微管溶素衍生物、吡咯并苯并二氮呯、或其組合。在一些方面，ADC的細胞毒性劑係拓樸異構酶抑制劑。
在一些方面，細胞毒性劑係拓樸異構酶抑制劑，並且其中ADC的ii) 可切割連接子和iii) 細胞毒性劑包含具有式 I之化合物： 及其鹽和溶劑化物，其中R L係該可切割連接子，該連接子選自： ， 其中Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； 其中X係： ，其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，至少b1或b2 = 0，至少c1或c2 = 0；並且 其中G L係用於連接該抗體或抗原結合片段的連接子；以及 ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團，並且e係0或1。
在一些方面，R L具有式Ia。
在一些方面，Q係： (a) 選自以下的胺基酸殘基：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg、和Trp；或者 (b) 選自以下的二肽殘基： NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Ala- C=O、 NH-Val-Lys- C=O、 NHAla-Lys- C=O、 NH-Val-Cit- C=O、 NH-Phe-Cit- C=O、 NH-Leu-Cit- C=O、 NH-Ile-Cit- C=O、 NH-Phe-Arg- C=O、 NH-Trp-Cit- C=O、和 NH-Gly-Val- C=O；或者 (c) 選自以下的三肽殘基： NH-Glu-Val-Ala- C=O、 NH-Glu-Val-Cit- C=O、 NH-αGlu-Val-Ala- C=O、和 NH-αGlu-Val-Cit- C=O；或者 (d) 選自以下的四肽殘基： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O、 和 NH-Gly-Phe-Gly-Gly C=O。
在一些方面，a係：(a) 0至3；或 (b) 0或1；或 (c) 0。
在一些方面，b1係：(a) 0至8；或 (b) 0；或 (c) 2；或 (d) 3；或 (e) 4；或 (f) 5；或 (g) 8。
在一些方面，b2係：(a) 0至8；或 (b) 0；或 (c) 2；或 (d) 3；或 (e) 4；或 (f) 5；或 (g) 8。
在一些方面，(a) c1係0或1；(b) c2係0或1；並且 (c) c1和c2中的至少一個係0。
在一些方面，d係：(a) 0至3；或 (b) 1或2；或 (c) 2；或 (d) 5。
在一些方面： (a) a係0，b1係0，c1係1，c2係0並且d係2，並且b2係0、2、3、4、5或8；或者 (b) a係1，b2係0，c1係0，c2係0並且d係0，並且b1係0、2、3、4、5或8；或者 (c) a係0，b1係0，c1係0，c2係0並且d係1，並且b2係0、2、3、4、5或8；或者 (d) b1係0，b2係0，c1係0，c2係0，a和d中的一個係0，並且a和d中的另一個係1或5；或者 (e) a係1，b2係0，c1係0，c2係1，d係2，並且b1係0、2、3、4、5或8。
在一些方面，G L選自：
(G L1-1) (G L6)
(G L1-2) (G L7)
(G L2) (G L8)
(G L3-1) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L9)
(G L3-2) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L10)
(G L3-3) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L11)
(G L3-4) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L12)
(G L4) 其中Hal = I、Br、Cl (G L13)
(G L5) (G L14)
其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，並且X表示C 1-4烷基。
在一些方面，G L選自G L1-1和G L1-2。
在一些方面，R L具有式Ib，並且： (a) R L1和R L2兩者均為H；或者 (b) R L1係H並且R L2係甲基；或者 (c) R L1和R L2兩者均為甲基；或者 (d) 其中R L1和R L2與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯基團；或者 (e) 其中R L1和R L2與它們所結合的碳原子一起形成環丁烯基團。
在一些方面，ADC具有式IV： L - (D L) p(IV) 或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物， 其中L係該i) 抗體或其抗原結合片段，D L係包含該ii) 可切割連接子和該iii) 細胞毒性劑的藥物連接子單元，並且D L具有式III： 其中R LL係選自以下的可切割連接子： (ia')： ，其中Q和X如以上所定義，並且G LL係連接至該抗體或抗原結合片段的連接子；以及 (ib')： ，其中R L1和R L2如以上所定義；並且 p係1至20的整數。
在一些方面，G LL選自：
(G LL1-1) (G LL8-1)
(G LL1-2) (G LL8-2)
(G LL2) (G LL9-1)
(G LL3-1) (G LL9-2)
(G LL3-2) (G LL10)
(G LL-4) (G LL11)
(G LL5) (G LL12)
(G LL6) (G LL13)
(G LL7) (G LL14)
其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，並且X表示C 1-4烷基。
在一些方面，G LL選自G LL1-1和G LL1-2。
在該等方法的一些方面，細胞毒性劑對抗體或抗體結合片段的載藥量（p）係從1至約10的整數。
在該等方法的一些方面，拓樸異構酶抑制劑係具有式A之化合物： 該化合物呈單個鏡像異構物或呈鏡像異構物富集的形式。
在該等方法的一些方面，拓樸異構酶抑制劑係具有式VI之化合物： 其中Q如上所定義。
在該等方法的一些方面，ii) 連接子和iii) 細胞毒性劑一起包含以下化合物： （SG3932）。
在該等方法的一些方面，雙特異性結合蛋白包含：a) 第一結合結構域，該第一結合結構域特異性結合PD-1；以及b) 第二結合結構域，該第二結合結構域特異性結合具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（TIGIT）、含有T-細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域的蛋白質-3（TIM-3）或細胞毒性T-淋巴球相關抗原-4（CTLA 4）。在該等方法的一些方面，第一結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 57的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的LCDR3。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 7的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有與SEQ ID NO: 64的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的輕鏈。在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 63的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈和具有與SEQ ID NO: 65的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。在該等方法的一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的LCDR3。在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有SEQ ID NO: 72的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 72的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有與SEQ ID NO: 74的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 75的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 73的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈和具有與SEQ ID NO: 75的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。
在該等方法的一些方面，第二結合結構域特異性結合TIM-3的免疫球蛋白可變（IgV）結構域的C’C’’和DE環或結合TIM-3的IgV結構域的PS結合槽（FG和CC’環）。在一些方面，第二結合結構域包含以下CDR：分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和89或者分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和90的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIM-3的IgV結構域上的表位，並且該等表位包括TIM-3（SEQ ID NO: 102）的N12、L47、R52、D53、V54、N55、Y56、W57、W62、L63、N64、G65、D66、F67、R68、K69、D71、T75和E77。
在一些方面，第一結合結構域包含一組CDR：分別包含SEQ ID NO: 56、57、58、59、60和61的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些方面，第一結合結構域包含含有SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的第一重鏈VH和含有SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的第一輕鏈VL，並且第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的第二重鏈可變結構域（VH）和含有SEQ ID NO: 94的胺基酸序列的第二輕鏈可變結構域（VL）。在一些方面，第一結合結構域包含含有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的第一重鏈和含有SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的第一輕鏈，並且第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的第二重鏈和含有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的第二輕鏈。在該等方法的一些方面，第二結合結構域特異性結合CTLA-4。在一些方面，雙特異性結合蛋白結合人PD-1和CTLA-4。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含MEDI5752的序列的抗PD-1和抗CTLA-4重鏈可變區（VH）CDR1、VH CDR2、VH CDR3、輕鏈可變區（VL）CDR1、VL CDR2、和VL CDR3。在一些方面，第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 109的胺基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO: 111的胺基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO: 112的胺基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO: 113的胺基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO: 114的胺基酸序列的VL CDR3。在一些方面，雙特異性檢查點抑制劑包含含有SEQ ID NO: 105中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 104中列出的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，雙特異性結合蛋白包含：(a) 含有SEQ ID NO: 106的胺基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO: 107的胺基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO: 108的胺基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的VL CDR3；以及 (b) 含有SEQ ID NO: 109的胺基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO: 111的胺基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO: 112的胺基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO: 113的胺基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO: 114的胺基酸序列的VL CDR3。
在一些方面，雙特異性結合蛋白包含：(a) 含有SEQ ID NO: 63中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 65中列出的胺基酸序列的輕鏈；以及 (b) 含有SEQ ID NO: 105中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 104中列出的胺基酸序列的輕鏈。
在該等方法的一些方面，雙特異性結合蛋白包含無糖基化的Fc區。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含去糖基化的Fc區。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含具有減少的岩藻糖基化或係無岩藻糖基化的Fc區。在一些方面，雙特異性結合蛋白係人源化雙特異性抗體或其抗原結合片段。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含IgG重鏈恒定區。在一些方面，恒定區包括在L234F、L235E和P331S處的突變。在一些方面，IgG重鏈恒定區係IgG1重鏈恒定區。在一些方面，雙特異性結合蛋白係抗體。在一些方面，雙特異性結合蛋白係全長抗體。在一些方面，抗體係IgG抗體。在一些方面，抗體係IgG1抗體。在一些方面，抗體係人的或人源化的。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含κ輕鏈恒定區。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含λ輕鏈恒定區。
在該等方法的一些方面，癌症包含表現B7-H4多肽的癌細胞。在一些方面，癌症選自卵巢癌、乳癌、子宮癌、睪丸癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色素瘤、腎細胞癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮頸癌、血液學癌症、子宮內膜癌、膽管細胞癌、NSCLC（鱗狀和/或腺癌）、胃腸癌（如胃癌和結直腸癌）、和肺癌。在一些方面，癌症係乳癌，其選自激素受體陽性（HR+）乳癌、人表皮生長因子受體2陽性（HER2+）乳癌和三陰性乳癌（TNBC）。在一些方面，癌症係同源重組缺陷（HRD）癌症。在一些方面，癌症包含具有選自以下的HRD基因的突變的一或多種細胞： BRCA1、 BRCA2、 ATM、 BRIP1、 BARD1、 CDK12、 CHEK1、 CHEK2、 FANCL、 PALB2、 PPP2R2A、 RAD51B、 RAD51C、 RAD51D和 RAD54L。在一些方面，突變的HRD基因選自 BRCA1、 BRCA2和 ATM 。
本揭露還提供了藥物組成物，該藥物組成物包含：1) 抗體-藥物軛合物和2) 雙特異性檢查點抑制劑，其中該抗體-藥物軛合物包含抗體或其抗原結合片段、以及由以下式表示的藥物-連接子： （SG3932）， 並且其中該藥物-連接子與該抗體或其抗原結合片段軛合。在一些方面，抗體或其抗原結合片段係抗B7H4抗體。在一些方面，抗體或其抗原結合片段結合B7-H4並且包含：含有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些方面，抗體或其抗原結合片段包含分別含有SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體。在一些方面，抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 51的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 48的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈。在一些方面，雙特異性檢查點抑制劑包含：a) 第一結合結構域，該第一結合結構域特異性結合PD-1或PD-L1；以及b) 第二結合結構域，該第二結合結構域特異性結合具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（TIGIT）、含有T-細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域的蛋白質-3（TIM-3）或細胞毒性T-淋巴球相關抗原-4（CTLA 4）。在一些方面，第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 57的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的LCDR3。
在一些方面，第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些方面，第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有與SEQ ID NO: 62的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有與SEQ ID NO: 64的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些方面，第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的輕鏈。在一些方面，第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有與SEQ ID NO: 63的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈和具有與SEQ ID NO: 65的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的LCDR3。在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有SEQ ID NO: 72的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有與SEQ ID NO: 72的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有與SEQ ID NO: 74的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 75的胺基酸序列的輕鏈。在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有與SEQ ID NO: 73的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈和具有與SEQ ID NO: 75的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIM-3。在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIM-3，並且其中該第二結合結構域特異性結合TIM-3的免疫球蛋白可變（IgV）結構域的C’C’’和DE環或結合TIM-3的IgV結構域的PS結合槽（FG和CC’環）。
在一些方面，第二結合結構域包含以下互補決定區（CDR）：分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和89或者分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和90的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIM-3的IgV結構域上的表位，並且該等表位包括TIM-3（SEQ ID NO: 102）的N12、L47、R52、D53、V54、N55、Y56、W57、W62、L63、N64、G65、D66、F67、R68、K69、D71、T75和E77。在一些方面，第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的重鏈可變結構域（VH）、和含有SEQ ID NO: 94的胺基酸序列的輕鏈可變結構域（VL）。
在一些方面，第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的輕鏈。在一些方面，第二結合結構域特異性結合CTLA-4。在一些方面，第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 109的胺基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO: 111的胺基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO: 112的胺基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO: 113的胺基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO: 114的胺基酸序列的VL CDR3。在一些方面，雙特異性檢查點抑制劑包含含有SEQ ID NO: 105中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 104中列出的胺基酸序列的輕鏈。
本揭露還關於包含以上藥物組成物中的任一種的套組。本揭露還關於抗體-藥物軛合物在製造用於與雙特異性檢查點抑制劑組合使用的藥物中之用途，其中該抗體-藥物軛合物和該雙特異性檢查點抑制劑如本文所定義的用於治療癌症。本揭露還關於雙特異性檢查點抑制劑在製造用於與抗體-藥物軛合物組合使用的藥物中之用途，其中該雙特異性檢查點抑制劑和該抗體-藥物軛合物如本文所定義的用於治療癌症。在一些方面，藥物組成物用於在治療癌症中使用。在一些方面，癌症選自卵巢癌、乳癌、子宮癌、睪丸癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色素瘤、腎細胞癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮頸癌、血液學癌症、子宮內膜癌、膽管細胞癌、NSCLC（鱗狀和/或腺癌）、胃腸癌（如胃癌和結直腸癌）、和肺癌。
相關申請的交叉引用
本申請要求於2022年7月28日提交的美國臨時申請案號63/369,718的優先權權益，將該臨時申請藉由引用以其全文併入本文。 藉由引用併入以電子方式提交的材料
藉由引用以其全文併入本文的電腦可讀的核苷酸/胺基酸序列表與此同時提交，並確定如下：一個名為「ADCIO-101-WO-PCT.xml」、創建於2023年7月24日的137,421位元組的檔。
除非本文另有定義，否則本揭露中使用的科學和技術術語應具有熟悉該項技術者通常理解的含義。另外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數形式，並且複數術語應包括單數形式。
如本文所用，「一個/一種（a或an）」可以意指一個/一種或多個/多種。如本文所用，當與單詞「包含（comprising）」結合使用時，單詞「一個/一種」可以意指一個/一種或多於一個/一種。如本文所用，「另一（another）」或「另外的（a further）」可以意指至少第二個/第二種或更多個/更多種。
申請專利範圍中使用術語「或」用於意指「和/或」，除非明確指示僅指替代方案或替代方案係相互排斥的，儘管本揭露支持僅是指替代方案和「和/或」的定義。
如本文所用，術語「包含（comprising）」（以及包含的任何變體或形式，如「包含（comprise和comprises）」）、「具有（having）」（以及具有的任何變體或形式，如「具有（have和has）」）、「包括（including）」（以及包括的任何變體或形式，如「包括（includes和include）」）或者「含有（containing）」（以及含有的任何變體或形式，如「含有（contains和contain）」）係包括性的或開放式的，並且不排除另外的未列舉的元素或方法步驟。
在整個本申請中，術語「約」用於指示值包括被採用以確定值的方法/裝置的誤差的固有變化，或者研究受試者之間存在的變化。典型地，術語「約」意指涵蓋近似於或小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%或更高的可變性（「大於」或「小於」指示值），這取決於具體情況。在一些方面，熟悉該項技術者將理解由術語「約」指示的可變性水平，這是由於其在本文中使用的上下文。還應理解，術語「約」的使用也包括特別列舉的值。
術語「例如（for example）」及其對應的簡稱「例如（e.g.）」（無論是否斜體）的使用意指所列舉的特定術語係本揭露的代表性實例和方面，並不旨在限於所引用或列舉的特定實例，除非另有明確說明。
本文提供的任何類型的範圍包括所述特定範圍內的所有值以及關於特定範圍端點的值。如本文所用，「之間」係包括範圍末端的範圍。例如，x與y之間的數值明確地包括數值x和y、以及落在x和y內的任何數值。
術語「治療（treating或treatment）」係指向動物投與化合物或藥物組成物，以便實現該動物的疾病、障礙或病症的改變或改善。在一些方面，本揭露的治療方法包括一或多個投與步驟，該一或多個投與步驟選自口服、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸、或陰道、吸入、局部投與，或其組合。在較佳的方面，投與係靜脈內或動脈內（例如，藉由注射或滴注）投與或其組合。
術語「劑量」意指在單次投與中、或在指定的時間段內提供的化合物或藥劑的指定量。在一些方面，劑量可以按兩個或更多個推注劑、片劑或注射劑投與。例如，在一些方面，在希望皮下投與的情況下，所希望的劑量可以要求不是藉由單次注射容易地提供的體積。在這樣的方面，可以使用兩次或更多次注射達到所希望的劑量。在一些方面，劑量可以按兩次或更多次注射投與，以使個體體內的注射部位反應最小化。在其他方面，經延長的時間段或連續地藉由輸注投與化合物或藥劑。可以將劑量指明為每小時、每天、每週或每月的藥劑的量。
術語「受試者」、「個體」和「患者」在本文中可互換使用以指哺乳動物受試者。在一個方面，「受試者」係人、家畜、農場動物、競賽動物和動物園動物，例如人、非人靈長類動物、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛等。在一個方面，受試者係石蟹獼猴（cynomolgus monkey）（食蟹獼猴（ Macaca fascicularis））。在較佳的方面，受試者係人。在本發明之方法中，受試者先前可能未被診斷為患有癌症。可替代地，受試者可能先前已被診斷為患有癌症。受試者也可為展現出疾病風險因素的人、或沒有癌症症狀的人。受試者也可為患有癌症或有患癌症的風險的人。因此，在一個方面，本發明之方法可用於確認受試者中癌症的存在。例如，受試者可能先前已藉由可替代的手段被診斷出患有癌症。在一個方面，受試者先前已經投與癌症療法。
術語「功效」意指產生所希望的效果的能力。
術語「副作用」意指除所希望的作用以外的可歸因於治療的生理疾病和/或病症。在一些方面，副作用包括注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝毒性、腎毒性、中樞神經系統異常、肌病、以及不適。例如，血清中的轉胺酶水平增加可以指示肝毒性或肝功能異常。例如，膽紅素增加可以指示肝毒性或肝功能異常。
本文揭露了包括與雙特異性結合蛋白一起投與抗體-藥物軛合物（ADC）之方法、組合和套組。如本文所述，方法、組合和套組可用於在受試者中治療癌症。
本文的方法、組合和套組意在藉由以不同方式靶向癌細胞來提供改善的癌症治療。在一些方面，本文所述之ADC增加腫瘤細胞對藉由另一機制殺傷的敏感性。在一些方面，本文所述之ADC增加腫瘤細胞的抗原性。在一些方面，雙特異性結合蛋白靶向腫瘤細胞用於藉由受試者的免疫系統進行殺傷。在一些方面，ADC藉由增加腫瘤細胞本身或抗原呈遞細胞（如樹突細胞）上一或多種細胞表面標誌物抗原的可用性來增加腫瘤細胞的抗原性，同時雙特異性結合蛋白結合該一或多種細胞表面標誌物抗原，從而觸發攻擊腫瘤細胞的免疫響應。 組合方法
在一些方面，本揭露提供了在有需要的人受試者中治療癌症之方法，該方法包括向該人受試者投與：a) 抗體-藥物軛合物（ADC），該抗體-藥物軛合物包含：i) 結合B7-H4多肽的抗體或其抗原結合片段，ii) 可切割連接子，以及iii) 細胞毒性劑；以及b) 雙特異性檢查點抑制劑。在一些方面，檢查點抑制劑係具有特異性結合計畫性細胞死亡蛋白1（PD-1）的第一結合結構域的雙特異性結合蛋白。
在另外的方面，本揭露關於在有需要的人受試者中治療癌症之方法，該方法包括向該人受試者投與：a) 抗體-藥物軛合物（ADC），該抗體-藥物軛合物包含：i) 抗體或其抗原結合片段，ii) 可切割連接子，以及iii) 細胞毒性劑；其中該細胞毒性劑係具有式 I之化合物： ， 及其鹽和溶劑化物，其中R L係該可切割連接子，該連接子選自： ， 其中Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基；其中X係： ，其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，至少b1或b2 = 0，至少c1或c2 = 0；並且其中G L係用於連接該抗體或抗原結合片段的連接子；以及 ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團，並且e係0或1；以及b) 雙特異性檢查點抑制劑。在一些方面，檢查點抑制劑係具有特異性結合計畫性細胞死亡蛋白1（PD-1）的第一結合結構域的雙特異性結合蛋白。 結合 B7-H4 的抗體 - 藥物軛合物
ADC的抗體或其抗原結合片段可以用於靶向癌細胞。在一些方面，抗體或抗原結合片段在體外和體內均對B7-H4多肽具有高親和力，並且因此可以有利地在用於靶向或檢測B7-H4表位之方法中使用。
B7-H4（也稱為含V-set結構域T細胞激活抑制劑1，由VTCN1基因編碼）係共刺激蛋白B7家族的跨膜多肽。B7-H4被理解為在抗原呈遞細胞的表面上表現，用於與免疫細胞（例如，T淋巴球，其中CD28為潛在的配體）的配體相互作用。已觀察到B7-H4在多種癌症類型的細胞上高度表現，並被認為是腫瘤相關抗原。此外，B7-H4的表現不限於特定的癌症類型，因此它代表了用於治療廣譜癌症類型的靶抗原。
在一些方面，本文提及的癌症係以B7-H4分子的表現（較佳的是過表現）為特徵的癌症。換言之，本文提及的癌症可以包含表現B7-H4多肽的癌性細胞。癌性細胞可包含在腫瘤內。在一些方面，B7-H4多肽包含在B7-H4多肽序列或其片段內。「B7-H4多肽」可包含B7-H4的全長多肽序列（例如，SEQ ID NO:55），或可包含B7-H4的全長多肽序列的任何長度的B7-H4片段（例如，包含B7-H4的全長多肽序列的5%、15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%或95%的多肽序列），該片段包含可以結合（例如，被結合）本揭露的抗體或抗原結合片段的表位。B7-H4多肽可包含與SEQ ID NO:55的序列具有75%、80%、85%、90%或90%序列同一性的序列。較佳的是，B7-H4多肽包含SEQ ID NO.: 55的序列。
術語「抗體」涵蓋單株抗體及其片段（例如，表現出所希望的生物活性）。在較佳的方面，本揭露的抗體係單株抗體。在更較佳的方面，抗體係完全人單株抗體。在一些方面，本揭露的方法可以使用多株抗體。特別地，抗體係包含至少一個或兩個重（H）鏈可變區（本文縮寫為VHC）以及至少一個或兩個輕（L）鏈可變區（本文縮寫為VLC）的蛋白質。VHC和VLC區可以進一步細分為被稱為「互補決定區」（CDR）的高變區，其間插有被稱為「框架區」（FR）的更保守的區域。框架區和CDR的範圍已經得到明確定義。較佳的是，每個VHC和VLC由三個CDR和四個FR構成，從胺基末端到羧基末端按照以下順序排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體的VHC或VLC鏈可以進一步包含所有的或部分的重鏈或輕鏈恒定區。在一些方面，抗體係兩個重免疫球蛋白鏈和兩個輕免疫球蛋白鏈的四聚體，其中重和輕免疫球蛋白鏈由例如二硫鍵相互連接。
重鏈恒定區包含三個結構域，即CH1、CH2和CH3。輕鏈恒定區由一個結構域CL構成。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。術語「抗體」包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM類型（及其亞型）的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可為κ或λ類型。如本文所用，術語抗體還指與上述標誌物之一結合的抗體的一部分，例如，其中一或多個免疫球蛋白鏈不是全長但與標誌物結合的分子。涵蓋在術語抗體中的結合部分之實例包括 (i) Fab片段，其為由VLC、VHC、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii) F(ab')2片段，其為包含兩個在絞鏈區處由二硫橋連接的Fab片段的二價片段；(iii) 由VHC和CH1結構域組成的Fc片段；(iv) 由抗體單臂的VLC和VHC結構域組成的Fv片段；(v) 由VHC結構域組成的dAb片段（Ward等人, Nature [自然] 341: 544-546, 1989）；以及 (vi) 具有足以發生結合的框架的分離的互補決定區（CDR），例如，可變區的抗原結合部分。輕鏈可變區的抗原結合部分和重鏈可變區的抗原結合部分（例如Fv片段的兩個結構域VLC和VHC）可以使用重組方法藉由合成連接子連接，該合成連接子允許它們成為單個蛋白鏈，其中VLC和VHC區配對形成單價分子（稱為單鏈Fv（scFv）；參見例如，Bird等人 (1988) Science [科學] lAl-ATi-Alβ；以及Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 85: 5879-5883）。這樣的單鏈抗體也涵蓋在術語抗體內。該等部分可使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得，並且以與完整抗體相同的方式針對效用來篩選該等部分。
在一些方面，抗體或抗原結合片段係選自以下中的一或多種：鼠抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、多特異性抗體、或其組合。
在一些方面，抗原結合片段係選自以下中的一或多種：Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dsFv片段、scFv片段、sc(Fv)2片段、或其組合。在一些方面，本揭露的抗體或其抗原結合片段（例如，mAb）係scFV。
在一些方面，抗體或其抗原結合片段可以跨物種結合B7-H4分子，例如，該抗體或片段可以結合小鼠B7-H4、大鼠B7-H4、兔、人B7-H4和/或石蟹獼猴B7-H4。在一些方面，抗體或片段可以結合人B7-H4和石蟹獼猴B7-H4。在一些方面，抗體或抗原結合片段還可以結合小鼠B7-H4。
在一些方面，抗體或其抗原結合片段可以特異性結合B7-H4，例如人B7-H4和石蟹獼猴B7-H4，但不特異性結合人B7-H1、B7-H2和/或B7-H3。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含分別含有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈CDR1（HCDR1）、重鏈CDR2（HCDR2）、重鏈CDR3（HCDR3）、輕鏈CDR1（LCDR1）、輕鏈CDR2（LCDR2）和輕鏈CDR3（LCDR3），或其功能變體。包含所述序列的抗體或其抗原結合片段在本文中可稱為「ZY0EQD-E02」或「EQD-E02」。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含分別含有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體。包含所述序列的抗體或其抗原結合片段在本文中可稱為「ZY0EPQ-E02」或「EPQ-E02」。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含分別含有SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體。包含所述序列的抗體或其抗原結合片段在本文中可稱為「ZY0EOB-F05」或「EOB-F05」。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含分別含有SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體。包含所述序列的抗體或其抗原結合片段在本文中可稱為「ZY0EO5-E07」或「EO5-E07」。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含分別含有SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體。包含所述序列的抗體或其抗原結合片段在本文中可稱為「ZY0EP0-C07」或「EP0-C07」。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段係雙特異性抗體，並且包含含有SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120和SEQ ID NO: 121的胺基酸序列的在第一結合臂中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；以及含有SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126和SEQ ID NO: 127的胺基酸序列的在第二結合臂中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些方面，具有含有上文揭露的胺基酸序列的CDR的抗體或其抗原結合片段具有有益的優勢，如對癌細胞表面上的B7-H4肽的高靶向特異性或結合活性。
另外或可替代地，本文所述之抗體或其抗原結合片段可以藉由其可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈來描述。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含：分別含有SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 33和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 47和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 31和SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；分別含有SEQ ID NO: 37和SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；或者分別含有SEQ ID NO: 39和SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含：(i) 含有與SEQ ID NO: 31、33、35、37或39的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的可變重鏈，或其功能變體；以及 (ii) 含有與SEQ ID NO: 32、34、36、38或40的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的可變輕鏈，或其功能變體。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含：(i) 含有與SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、43、45、46或47的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的可變重鏈，或其功能變體；以及 (ii) 含有與SEQ ID NO: 32、34、36、38或40的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的可變輕鏈，或其功能變體。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段可包含：(i) 含有與SEQ ID NO: 33的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的可變重鏈，或其功能變體；以及 (ii) 含有與SEQ ID NO: 34的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的可變輕鏈，或其功能變體。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段可包含：(i) 含有與SEQ ID NO: 45的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的可變重鏈，或其功能變體；以及 (ii) 含有與SEQ ID NO: 34的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的可變輕鏈，或其功能變體。
有利地，本揭露已經證明與報告的靶向B7-H4的現有（商業上）可獲得的抗體相比，申請專利範圍中的抗體或抗原結合片段可以靶向更廣譜的表現B7-H4的細胞。因此，本揭露不僅提供了對臨床相關靶標具有親和力和特異性的抗體（或其抗原結合片段），而且還證明了與其相關的獨特優勢（例如，意想不到的技術效果）。
在一些方面，本文所述之抗體或其抗原結合片段能夠結合作為癌細胞的不可或缺的組分的B7-H4（例如，B7-H4作為癌細胞的細胞膜的不可或缺的組分）。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段結合OVCAR4細胞系。在一些方面，本文所述之抗體或其抗原結合片段可結合OVCAR4細胞系和/或CHO細胞系（例如，其可缺乏編碼B7-H4的外源核酸）。例如，抗體或其抗原結合片段結合OVCAR4細胞系和/或CHO細胞系（例如，其可缺乏編碼B7-H4的外源核酸）的B7-H4（例如，B7-H4表位）。
在一些方面，與一或多種選自E Biosciences 14-5949抗人B7H4小鼠IgG、US biological B0000-35B抗人B7H4小鼠IgG、R and D systems AF2514抗小鼠B7H4山羊IgG1、Sigma SAB2500141抗B7H4山羊IgG1、同種型1 CAT004 SP06-003、同種型2 R and D正常山羊IgG對照（AB-108C）、AdD serotec MCA2632、Epitomics 2516-1、eBiosciences 145972-82、eBioscience 145970-85的抗體、或其組合的抗體相比，該抗體或其抗原結合片段以更高的親和力結合OVCAR4細胞系和/或CHO細胞系（例如，其可缺乏編碼B7-H4的外源核酸）。親和力（例如結合親和力）可以藉由本文所述之任何合適的測量結合親和力之方法來測量。
OVCAR4細胞系係人卵巢癌細胞系，CHO細胞系係源自中國倉鼠的卵巢的上皮細胞系，並且可廣泛獲得。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 41的胺基酸序列的重鏈恒定區。在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 52的胺基酸序列的重鏈恒定區。在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 42的胺基酸序列的輕鏈恒定區。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 51的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 48的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段係單株抗體。
在一些方面，ADC的抗體或其抗原結合片段係人源化單株抗體。 連接子
在一些方面，抗體或其抗原結合片段藉由連接子與細胞毒性劑連接。在一些方面，抗體或其抗原結合片段藉由連接子與細胞毒性劑軛合。如本文所用，「軛合」意指經由共價鍵或離子鍵連接。在一些方面，連接子以可切割的方式附接（例如，軛合）至胺基殘基，例如，ADC的抗體或抗原結合片段的胺基酸。在一些方面，ADC的可切割連接子係mp-PEG8-val-ala連接子。
在一些方面，連接子由R L表示，並且較佳的是選自： (Ia)： ，其中 Q與細胞毒性劑連接並且具有式： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X係： ， 其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，其中至少b1或b2 = 0（即，b1和b2中只有一個可以不是0）並且至少c1或c2 = 0（即c1和c2中只有一個可以不是0）； G L係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段的連接子；以及 (Ib)： ，其中 R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團；並且e係0或1。
在一些方面，Q係胺基酸殘基。胺基酸可為天然胺基酸或非天然胺基酸。例如，Q可以選自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg、和Trp，其中Cit係瓜胺酸。
在一些方面，Q包含二肽殘基。二肽中的胺基酸可為天然胺基酸和非天然胺基酸的任何組合。在一些方面，二肽包含天然胺基酸。當連接子係組織蛋白酶不穩定連接子時，二肽係組織蛋白酶介導的切割的作用位點。然後，二肽係組織蛋白酶的識別位點。
在一些方面，Q選自： NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Ala- C=O、 NH-Val-Lys- C=O、 NH-Ala-Lys- C=O、 NH-Val-Cit- C=O、 NH-Phe-Cit- C=O、 NH-Leu-Cit- C=O、 NH-Ile-Cit- C=O、 NH-Phe-Arg- C=O、 NH-Trp-Cit- C=O、和 NH-Gly-Val- C=O；其中Cit係瓜胺酸。較佳的是，Q選自： NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Ala- C=O、 NH-Val-Lys- C=O、 NH-Ala-Lys- C=O、和 NH-Val-Cit- C=O。更較佳的是，Q選自 NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Cit- C=O和 NH-Val-Ala- C=O。
其他合適的二肽組合包括： NH-Gly-Gly- C=O、 NH-Gly-Val- C=O、 NH-Pro-Pro- C=O、和 NH-Val-Glu- C=O。可以使用其他二肽組合，包括由Dubowchik等人, Bioconjugate Chemistry[生物軛合化學], 2002, 13, 855-869描述的那些，將其特此藉由引用併入本文。
在一些方面，Q係三肽殘基。三肽中的胺基酸可為天然胺基酸和非天然胺基酸的任何組合。在一些方面，三肽包含天然胺基酸。當連接子係組織蛋白酶不穩定連接子時，三肽係組織蛋白酶介導的切割的作用位點。然後，三肽係組織蛋白酶的識別位點。特別感興趣的三肽連接子係： NH-Glu-Val-Ala- C=O、 NH-Glu-Val-Cit- C=O、 NH-αGlu-Val-Ala- C=O、和 NH-αGlu-Val-Cit- C=O。
在一些方面，Q係四肽殘基。四肽中的胺基酸可為天然胺基酸和非天然胺基酸的任何組合。在一些方面，四肽包含天然胺基酸。當連接子係組織蛋白酶不穩定連接子時，四肽係組織蛋白酶介導的切割的作用位點。然後，四肽係組織蛋白酶的識別位點。特別感興趣的四肽連接子係： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O、和 NH-Gly-Phe-Gly-Gly C=O。較佳的是，四肽係： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O。
在上述肽殘基的表示中， NH-表示殘基的N末端，並且- C=O表示殘基的C末端。C末端與例如細胞毒性劑的NH結合。
Glu表示麩胺酸的殘基，即： αGlu表示當經由α鏈結合時的麩胺酸的殘基，即：
在一些方面，在適當的情況下，胺基酸側鏈被化學保護。側鏈保護基團可為如上所討論的基團。被保護的胺基酸序列可被酶切割。例如，包含Boc側鏈保護的Lys殘基的二肽序列可被組織蛋白酶切割。在一些方面，胺基酸側鏈的保護基團係熟知的，並且描述於Novabiochem公司目錄中，並且如上所述。
在X的一些方面，a可為0、1、2、3、4或5。較佳的是，a係0至3。更較佳的是，a係0或1。更較佳的是，a係0。在一些方面，b1可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。較佳的是，b1係0至12。更較佳的是，b1係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。在一些方面，b2可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。較佳的是，b2係0至12。更較佳的是，b2係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。在一些方面，c1可為0或1。在一些方面，c2可為0或1。較佳的是，c1和c2中只有一個可以不是0。在一些方面，d可為0、1、2、3、4或5。較佳的是，d係0至3。更較佳的是，d係1或2。在一方面，d係2。在一方面，d係5。
在X的一些方面，a係0，b1係0，c1係1，c2係0並且d係2，並且b2可為0至8。在一些方面，b2係0、2、3、4、5或8。在X的一些方面，a係1，b2係0，c1係0，c2係0並且d係0，並且b1可為0至8。在一些方面，b1係0、2、3、4、5或8。在X的一些方面，a係0，b1係0，c1係0，c2係0並且d係1，並且b2可為0至8。在一些方面，b2係0、2、3、4、5或8。在X的一些方面，b1係0，b2係0，c1係0，c2係0並且a和d中的一個係0。a和d中的另一個係1至5。在一些方面，a和d中的另一個係1。在一些方面，a和d中的另一個係5。在X的一些方面，a係1，b2係0，c1係0，c2係1，d係2，並且b1可為0至8。在一些方面，b2係0、2、3、4、5或8。
如上所述，R L1和R L2可以獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團。
在一些方面，R L1和R L2均是H。在一些方面，R L1係H並且R L2係甲基。在一些方面，R L1和R L2均是甲基。在一些方面，R L1和R L2與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯基團。在一些方面，R L1和R L2與它們所結合的碳原子一起形成環丁烯基團。
在式Ib中，在一些方面，e係0。在一些方面，e係1並且硝基基團可以在環的任何可用位置。在一些方面，它在鄰位。在一些方面，它在對位。
在一些方面，G L可以選自：
(G L1-1) (G L6)
(G L1-2) (G L7)
(G L2) (G L8)
(G L3-1) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L9)
(G L3-2) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L10)
(G L3-3) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L11)
(G L3-4) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L12)
(G L4) 其中Hal = I、Br、Cl (G L13)
(G L5) (G L14)
其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，例如伸苯基，並且X表示C 1-4烷基。
在一些方面，G L選自G L1-1和G L1-2。在一個方面，G L係G L1-1。
在一些方面，R L選自：
(i)
(ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
(vii)
(viii)
(ix)
在一些方面，連接子由R LL表示，並且較佳的是選自： (Ia')： ，其中 Q和X如以上所定義，並且G LL係連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子；以及 (Ib')： ，其中 R L1和R L2如以上所定義；並且p係1至20的整數。
在一些方面，G LL可以選自：
(G LL1-1) (G LL8-1)
(G LL1-2) (G LL8-2)
(G LL2) (G LL9-1)
(G LL3-1) (G LL9-2)
(G LL3-2) (G LL10)
(G LL-4) (G LL11)
(G LL5) (G LL12)
(G LL6) (G LL13)
(G LL7) (G LL14)
其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，例如伸苯基，並且X表示C 1-4烷基。
在一些方面，G LL選自G LL1-1和G LL1-2。在一個方面，G LL係G LL1-1。
在一些方面，R LL係源自上述R L基團的基團。
在其中以單個鏡像異構物或以鏡像異構物富集的形式提供本文所述之化合物的一些方面，鏡像異構物富集的形式具有大於60 : 40、70 : 30、80 : 20或90 : 10的鏡像異構物比率。在一些方面，鏡像異構物比率大於95 : 5、97 : 3或99 : 1。 載藥量
來自軛合反應的ADC製劑中每個抗體的平均藥物數量可以藉由常規手段進行表徵，該等手段如UV、逆相HPLC、HIC、質譜、ELISA測定和電泳。也可以確定依據p的ADC的定量分佈。藉由ELISA，可以確定特定ADC製劑中p的平均值（Hamblett等人 (2004) Clin. Cancer Res. [臨床癌症研究] 10:7063-7070；Sanderson等人 (2005) Clin. Cancer Res. [臨床癌症研究] 11:843-852）。然而，藉由ELISA的抗體-抗原結合和檢測限制不能辨別p（藥物）值的分佈。而且，用於檢測抗體-藥物軛合物的ELISA測定不能確定藥物部分在何處附接至抗體，例如重鏈或輕鏈片段或特定的胺基酸殘基。在一些情況下，均質ADC（其中p係來自具有其他載藥量的ADC的某個值）的分離、純化和表徵可藉由如逆相HPLC或電泳的手段實現。這樣的技術也適用於其他類型的軛合物。
典型地，在軛合反應期間，與抗體軛合的藥物部分少於理論最大值。抗體可以含有例如許多不與藥物連接子反應的離胺酸殘基。僅最具反應性的離胺酸基團可與胺反應性連接子試劑反應。而且，僅最具反應性的半胱胺酸硫醇基團可以與硫醇反應性連接子試劑反應。通常，抗體不含有許多（如果有的話）可與藥物部分連接的游離和反應性半胱胺酸硫醇基團。化合物的抗體中的大多數半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋形式存在，並且必須在部分或全部還原條件下用還原劑（如二硫蘇糖醇（DTT）或TCEP）還原。ADC的負荷量（藥物/抗體比）可以以幾種不同的方式進行控制，該等方式包括：(i) 限制藥物連接子相對於抗體的莫耳過量，(ii) 限制軛合反應時間或溫度，以及 (iii) 部分或限制用於半胱胺酸硫醇修飾的還原條件。
某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱胺酸橋。藉由用還原劑例如DTT（二硫蘇糖醇）處理，可使抗體具有反應性以與連接子試劑進行軛合。因此，每個半胱胺酸橋理論上將形成兩個反應性硫醇親核體。通過離胺酸與2-亞胺基硫烷（尤特奇試劑（Traut's reagent））反應，可以將另外的親核基團引入抗體，從而導致胺轉化為硫醇。可藉由對一個、兩個、三個、四個或更多個半胱胺酸殘基進行工程化（例如，製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基的突變抗體），將反應性硫醇基團引入抗體（或其片段）。US 7521541教導了藉由引入反應性半胱胺酸胺基酸對抗體進行工程化。
半胱胺酸胺基酸可在抗體中的反應性位點處被工程化，並且不形成鏈內或分子間二硫鍵（Junutula等人, 2008b Nature Biotech. [自然生物技術], 26(8):925-932；Dornan等人 (2009) Blood [血液] 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO 2009/052249）。工程化的半胱胺酸硫醇可以與具有硫醇反應性的親電基團（例如順丁烯二醯亞胺或α-鹵代醯胺）的本發明之藥物連接子反應，以形成具有半胱胺酸工程化的抗體的ADC。因此，可以設計、控制和知道藥物單元的位置。由於工程化的半胱胺酸硫醇基團典型地以高產率與藥物-連接子試劑反應，因此可以控制載藥量。藉由在重鏈或輕鏈上的單個位點處進行取代，對IgG抗體進行工程化以引入半胱胺酸胺基酸，在對稱抗體上給出兩個新的半胱胺酸。 細胞毒性劑
ADC的細胞毒性劑在本文中可稱為「藥劑」或「活性劑」。在一些方面，細胞毒性劑係藥物。在一些方面，ADC的細胞毒性劑係拓樸異構酶抑制劑、微管溶素衍生物、吡咯并苯并二氮呯、或其組合。
在一些方面，拓樸異構酶抑制劑係具有式A之化合物： 該化合物呈單個鏡像異構物或呈鏡像異構物富集的形式。
在一些方面，本揭露提供了包含以下拓樸異構酶抑制劑衍生物（A*，藥物單元）的軛合物：
本揭露提供了經由以上所述之連接子（連接單元）與ADC的配體單元連接的ADC的細胞毒性劑（藥物單元）。配體單元較佳的是抗體或其抗原結合片段。在一些方面，本揭露還提供了具有附接的連接子的A*、和用於其合成的中間體、以及釋放的彈頭。
在一些方面，細胞毒性劑係拓樸異構酶抑制劑，並且其中ADC的可切割連接子和細胞毒性劑一起包含具有式 I之化合物： 及其鹽和溶劑化物。R L係以上所述之可切割連接子。
在一些方面，ADC具有式IV： L - (D L) p(IV) 或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物， 其中L係該i) 抗體或其抗原結合片段，D L係包含該ii) 可切割連接子和該iii) 細胞毒性劑的藥物連接子單元，並且D L具有式III： 其中該可切割連接子R LL如上所述。
在一些方面，細胞毒性劑對抗體或抗體結合片段的載藥量（p）係從1至約10的整數。
在一些方面，拓樸異構酶抑制劑係具有式VI之化合物： 其中如上所述之Q與連接子R L相關。
在一些方面，連接子和細胞毒性劑一起包含以下化合物： （SG3932）。
在一些方面，連接子和細胞毒性劑一起包含以下化合物中的一個： （SG4010）； （SG4057）； （SG4052）；和/或 。
細胞毒性劑典型地連接至抗體或抗原結合片段或「負載到」抗體或抗原結合片段上。藥劑負荷量（p）係每個抗體或抗原結合片段（例如，配體單元）上的一或多種藥劑的平均數量。
來自軛合反應的ADC製劑中每個抗體（或抗原結合片段）上的平均藥劑數量可以藉由常規手段進行表徵，該等手段如UV、逆相HPLC、HIC、質譜、ELISA測定和電泳。也可以確定依據p的ADC的定量分佈。藉由ELISA，可以確定特定ADC製劑中p的平均值（Hamblett等人 (2004) Clin. Cancer Res. [臨床癌症研究] 10:7063-7070；Sanderson等人 (2005) Clin. Cancer Res. [臨床癌症研究] 11:843-852）。在一些情況下，均質ADC（其中p係來自具有其他載藥量的ADC的某個值）的分離、純化和表徵可以藉由如逆相HPLC或電泳的手段來實現。這樣的技術也適用於其他類型的軛合物。
半胱胺酸胺基酸可在抗體（或其抗原結合片段）中的反應性位點處被工程化，並且較佳的是不形成鏈內或分子間二硫鍵（Junutula等人, 2008b Nature Biotech. [自然生物技術], 26(8):925-932；Dornan等人 (2009) Blood [血液] 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO 2009/052249）。工程化的半胱胺酸硫醇可以與藥劑（例如，具有以下式I）內的連接子反應以形成具有半胱胺酸工程化的抗體的ADC，該連接子可以具有硫醇反應性親電基團（如順丁烯二醯亞胺或α-鹵代醯胺）。因此，可以設計、控制和知道藥物單元的位置。由於工程化的半胱胺酸硫醇基團典型地以高產率與藥物-連接子試劑反應，因此可以控制載藥量。藉由在重鏈或輕鏈上的單個位點處進行取代，對IgG抗體進行工程化以引入半胱胺酸胺基酸，在對稱抗體上給出兩個新的半胱胺酸。可以達到接近2的載藥量，其中軛合產物ADC接近均質性。
當抗體或其抗原結合片段的多於一個的親核或親電基團與藥劑反應，則所得產物可為ADC化合物的混合物，其中附接至抗體的藥劑單元分佈為例如1、2、3等。液相層析法（如聚合逆相（PLRP）和疏水交互作用（HIC））可以藉由藥劑負載值來分離混合物中的化合物。可以分離具有單一藥劑負載值（p）的ADC製劑。
因此，本揭露的抗體-藥物軛合物組成物可以包括抗體-藥物軛合物的混合物，其中抗體或其抗原結合片段具有一或多個藥劑部分，並且其中該等藥劑部分可以在各個胺基酸殘基處附接至該抗體或其抗原結合片段。
在一些方面，每個抗體（或其抗原結合片段）上的平均藥劑數量在1至20的範圍內。在一些方面，該範圍選自1至10、2至10、2至8、2至6、以及4至10。在一些方面，每個抗體（或其抗原結合片段）上存在一個藥劑。在一些方面，每個抗體（或其抗原結合片段）上的藥劑數量可以表示為藥劑（即，藥物）與抗體的比率。這個比率被稱為藥物與抗體比率（DAR）。DAR係連接至每個抗體的藥物（即，藥劑）的平均數量。在本揭露的一些方面，DAR在1至20的範圍內。在一些方面，DAR的範圍選自1至10、2至10、2至8、2至6、以及4至10。在一些方面，DAR在約1與約8之間。在本揭露的特定方面，DAR約為8。在本揭露的特定方面，DAR為8。
在一些方面，ADC係AZD8205。AZD 8205係與拓樸異構酶抑制劑（TOPO）彈頭軛合的抗B7H4 Ab。在一些方面，AZD 8205靶向卵巢癌和膽管細胞癌（CCA）。在一些方面，AZD 8205靶向三陰性乳癌（TNBC）。在一些方面，ADC係WO公開案號WO 2022/053650中描述的ADC，該公開的揭露內容特此藉由引用以其全文併入。在一些方面，抗體具有特異性CDR和結合特異性。在一些方面，抗體序列在WO公開案號WO 2022/053650中發現，並且該抗體或其抗原結合片段包括包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、和SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3，和/或包含SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 34（種系化的）的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，和/或包含SEQ ID NO: 51的胺基酸序列的重鏈，以及包含SEQ ID NO: 44（種系化的）的胺基酸序列的輕鏈。在一些方面，ADC命名為E02-GL-SG3932。 雙特異性結合蛋白
術語「雙特異性結合蛋白」意指對至少兩個獨立的抗原（或靶標）或同一抗原內的不同表位具有結合特異性的蛋白質。示例性雙特異性結合蛋白可以結合至一個靶標的兩個不同的表位，或者可以結合兩個不同的靶標。其他這樣的結合蛋白可以將另一個靶標的第一靶結合位點與第二結合位點相組合。在一些方面，雙特異性結合蛋白係雙特異性抗體。在一些方面，雙特異性結合蛋白係雙特異性檢查點抑制劑。
在本揭露中，術語「雙特異性檢查點抑制劑」係指具有雙特異性的檢查點抑制劑。如本文所用，雙特異性檢查點抑制劑對至少兩個獨立的抗原（或靶標）或同一抗原內的不同表位具有結合特異性。示例性雙特異性結合蛋白可以結合至一個靶標的兩個不同的表位，或者可以結合兩個不同的靶標。其他這樣的結合蛋白可以將另一個靶標的第一靶結合位點與第二結合位點相組合。檢查點抑制劑（或「免疫腫瘤（IO）藥劑」）係抑制免疫遏制系統和激活抗腫瘤免疫的藥劑（Menon S.等人, Cancers [癌症] (2016) 8, 106；Pardoll DM., Nat Rev Cancer [癌症自然評論] (2012) 12, 252-264；Wolchok JD., Cell [細胞] (2015) 162, 937）。腫瘤學中免疫介導療法的靶標包括PD-1（計畫性細胞死亡蛋白-1）和CTLA-4（細胞毒性T淋巴球相關蛋白4）。TIGIT（具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體）係存在於一些T細胞和自然殺手細胞（NK）上的免疫受體，其連同白血病抑制因子（LIF）係另一靶標。已知的免疫檢查點抑制劑之實例包括抗PD-1抗體納武單抗（WO 2006/121168）和派姆單抗（WO 2008/156712）；抗PD-L1抗體阿特珠單抗（WO 2010/077634）、德瓦魯單抗（WO 2011/066389）、和阿維魯單抗（WO 2013/079174）；以及抗CTLA-4抗體伊匹單抗（WO 2001/014424）和曲美木單抗（WO 2000/037504），以及抗LIF抗體例如h5D8（美國專利案號10,583,191），將其每一個特此藉由引用以其全文併入。在一些方面，在投與單個製成的分子的情況下，雙特異性抗體提供由同時靶向兩個抗原而獲得的累加的和/或協同的治療效果。
在一些方面，本文提供的抗體係單價雙特異性抗體（MBab）。本文描述的單價雙特異性抗體支架提供優異的平臺用於產生雙特異性抗體，該等雙特異性抗體實現與雙特異性抗體相關聯的所有益處，而同時降低上文提及的因它們的單價性質所致的潛在的治療風險。另外，本文提供的MBab係容易表現的、穩定的並且可能具有低免疫原性。如本文所用，術語「單價雙特異性」（其可以縮寫為「MBab」）係指雙特異性抗體，其中每個臂可以特異性結合至不同的靶抗原，並且對於給定的一對不同靶抗原（A和B），MBab可以結合其中的每一個。在一些方面，單價雙特異性抗體可以特異性結合兩個獨立的抗原（或靶標）或同一抗原上的兩個獨立的表位。典型地，單價雙特異性抗體包含兩個不同的可變區。在一些方面，對兩個獨立的抗原的結合親和力大約是相同的。在一些方面，對兩個獨立的抗原的結合親和力係不同的。
在一些方面，雙特異性結合蛋白包含：(a) 第一結合結構域，該第一結合結構域特異性結合PD-1；以及 (b) 第二結合結構域，該第二結合結構域特異性結合具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（TIGIT）、含有T-細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域的蛋白質-3（TIM-3）或細胞毒性T-淋巴球相關抗原-4（CTLA 4）。 PD-1 和 PD-L1 結合結構域
術語計畫性細胞死亡蛋白1（PD-1）係指大約31 kD的I型膜蛋白，該膜蛋白係T細胞調節子的擴展的CD28/CTLA4家族的成員（參見Ishida等人, 「Induced Expression of PD-1, A Novel Member of the Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death [計畫性細胞死亡誘導的PD-1（免疫球蛋白基因超家族的新成員）的表現]」, EMBO J.[歐洲分子生物學組織雜誌] 11: 3887-95 (1992)）。PD-1在激活的T細胞、B細胞和單核球上表現，並且在自然殺手（NK）T細胞中以低水平表現。計畫性死亡配體1（PD-L1）係PD-1的配體。當PD-L1與T細胞上的PD-1結合時，它阻止T細胞殺傷展現PD-L1的細胞（參見Han等人, 「PD-1/PD-L1 pathway: current researches in cancer [PD-1/PD-L1途徑：目前在癌症中的研究]」 Am J. Cancer Res. [美國癌症研究雜誌], 10(3):727-742 (2020)）。PD-L1係大約33 kD的1型跨膜糖蛋白，該跨膜糖蛋白係B7家族的成員（參見Sanmamed等人 「Inducible expression of B7-H1 (PD-L1) and its selective role in tumor site immune modulation [B7-H1（PD-L1）的誘導表現及其在腫瘤部位免疫調節中的選擇性作用]」. Cancer J. [癌症雜誌] 20:256-261 (2014)）。拮抗性抑制PD-1/PD-L1相互作用增加T細胞激活，從而增強宿主免疫系統對腫瘤細胞的識別和消除。這樣的拮抗性抑制PD-1/PD-L1相互作用可以使用與PD-1或PD-L1結合的藥劑阻斷該相互作用來實現。人PD-1蛋白的胺基酸序列以UNIPROT ID號Q15116提供，而人PD-L1的胺基酸序列以UNIPROT ID號Q9NZQ7提供。
計畫性死亡配體1（PD-L1）亦為涉及控制T細胞激活的受體和配體的複雜系統的一部分。在正常組織中，PD-L1在T細胞、B細胞、樹突細胞、巨噬細胞、間葉系幹細胞、骨髓來源肥大細胞以及多種非造血球上表現。它的正常功能係通過與其兩個受體（計畫性死亡蛋白1（也稱為PD-1或CD279）和CD80（也稱為B7-1或B7.1））的相互作用來調節T細胞激活與耐受之間的平衡。PD-L1還被腫瘤表現並且在多個位點上起作用以幫助腫瘤避開由宿主免疫系統進行的檢測和消除。PD-L1在範圍廣泛的癌症中高頻率地表現。在一些癌症中，PD-L1的表現與生存率降低和不良預後相關。阻斷PD-L1與其受體之間的相互作用的抗體能夠在體外減輕PD-L1依賴性免疫遏制作用並且增強抗腫瘤T細胞的細胞毒性活性。德瓦魯單抗係針對人PD-L1的能夠阻斷PD-L1與PD-1和CD80受體兩者的結合的人單株抗體。已經提出使用抗PD-L1抗體來治療感染和腫瘤並增強適應性免疫響應（參見美國專利案號8,779,108和9,493,565，將其藉由引用以其全文併入本文）。
如本文所用，術語「MEDI5752」係指包含SEQ ID NO: 45的輕鏈和SEQ ID NO: 46的重鏈（PD-1）以及SEQ ID NO: 47的輕鏈和SEQ ID NO: 48的重鏈（CTLA-4）的抗PD-1/CTLA-4雙特異性抗體。MEDI5752揭露於美國專利案號10,457,732（將其藉由引用以其全文併入本文）中。
在一些方面，第一結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 57的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的LCDR3。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 62的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 64的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 63的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的重鏈。在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 65的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含由SEQ ID NO: 76的核酸序列編碼的重鏈可變結構域和由SEQ ID NO: 78的核酸序列編碼的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含由與SEQ ID NO: 76至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的重鏈可變結構域和由與SEQ ID NO: 78至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含由SEQ ID NO: 77的核酸序列編碼的重鏈和由SEQ ID NO: 79的核酸序列編碼的輕鏈。
在一些方面，特異性結合PD-1的第一結合結構域包含由與SEQ ID NO: 77至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的重鏈和由與SEQ ID NO: 79至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的輕鏈。 TIGIT 結合結構域
術語具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（TIGIT）係指存在於一些T細胞和自然殺手細胞（NK）上的免疫受體。TIGIT由免疫細胞上調，該等免疫細胞包括激活的T細胞、自然殺手細胞和調節性T細胞。
在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIGIT。在一些方面，第二結合結構域包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的LCDR3。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有SEQ ID NO: 72的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 72的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域。在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 74的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 75的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 73的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的重鏈。在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含具有與SEQ ID NO: 75的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含由SEQ ID NO: 80的核酸序列編碼的重鏈可變結構域和由SEQ ID NO: 82的核酸序列編碼的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含由與SEQ ID NO: 80至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的重鏈可變結構域和由與SEQ ID NO: 82至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的輕鏈可變結構域。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含由SEQ ID NO: 81的核酸序列編碼的重鏈和由SEQ ID NO: 83的核酸序列編碼的輕鏈。
在一些方面，特異性結合TIGIT的第二結合結構域包含由與SEQ ID NO: 26至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的重鏈和由與SEQ ID NO: 28至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列編碼的輕鏈。 TIM-3 結合結構域
術語含有T-細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域的蛋白質-3（TIM-3）係指I型細胞表面糖蛋白，該糖蛋白包含N末端免疫球蛋白（Ig）樣結構域、接近於膜的具有O連接的糖基化並具有N連接的糖基化的黏蛋白結構域、單個跨膜結構域、以及具有一或多個酪胺酸磷酸化模體的細胞質區域。TIM-3係T細胞/跨膜、免疫球蛋白和黏蛋白（TIM）基因家族的成員。人TIM-3的IgV結構域的胺基酸序列顯示為SEQ ID NO: 102。人TIM-3蛋白（包括訊息肽）的胺基酸序列顯示為SEQ ID NO: 103。
在一些方面，本揭露提供了包含如美國專利案號10,457,732中所述之單株抗體O13-1（TIM-3）和LO115（PD-1）的序列的命名為「AZD7789」的抗TIM-3/PD-1雙特異性結合蛋白。雙特異性結合蛋白包含含有SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的第一輕鏈、和含有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的第二重鏈、和含有SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的第二輕鏈。抗TIM-3單株抗體O13-1和殖株62的序列也揭露於同一美國專利案號10,457,732中。
在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIM-3的免疫球蛋白可變（IgV）結構域的C’C’’和DE環或結合TIM-3的IgV結構域的PS結合槽（FG和CC’環）。在一些方面，特異性結合TIM-3的第二結合結構域包含互補決定區（CDR）：分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和89或者分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和90的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些方面，特異性結合TIM-3的第二結合結構域包含分別與SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和89或者分別與SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和90的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些方面，第二結合結構域特異性結合TIM-3的IgV結構域上的表位，並且該等表位包括TIM-3（SEQ ID NO: 102）的N12、L47、R52、D53、V54、N55、Y56、W57、W62、L63、N64、G65、D66、F67、R68、K69、D71、T75和E77。
在一些方面，特異性結合TIM-3的第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的第二重鏈可變結構域（VH）和含有SEQ ID NO: 94的胺基酸序列的第二輕鏈可變結構域（VL）。在一些方面，特異性結合TIM-3的第二結合結構域包含與SEQ ID NO: 91的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的第二重鏈可變結構域（VH）和與SEQ ID NO: 94的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的第二輕鏈可變結構域（VL）。在一些方面，第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的第二重鏈、和含有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的第二輕鏈。在一些方面，第二結合結構域包含與SEQ ID NO: 92的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的第二重鏈和與SEQ ID NO: 95的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的第二輕鏈。
在一些方面，第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 96的胺基酸序列的第一重鏈、和含有SEQ ID NO: 97的胺基酸序列的第一輕鏈。在一些方面，第二結合結構域包含與SEQ ID NO: 96的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的第一重鏈和與SEQ ID NO: 97的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的第一輕鏈。在一些方面，第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 98的胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 99的胺基酸序列的第一輕鏈。在一些方面，第二結合結構域包含與SEQ ID NO: 98的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的第一重鏈、與SEQ ID NO: 99的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的第一輕鏈。 CTLA-4 結合結構域
如本文所用，術語「細胞毒性T淋巴球相關抗原-4」、「CTLA-4」、「CD152」和「hCTLA-4」可互換使用，並且包括人CTLA-4的變體、同種型、物種同源物。完全CTLA-4序列可以在NCBI參考序列：NG_011502.1下找到。人CTLA-4蛋白的胺基酸序列係：
MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN（SEQ ID NO: 115）。細胞毒性T淋巴球相關蛋白4（CTLA-4）在激活的T細胞上表現，並在CD28介導的T細胞激活後作為共抑制劑以保持對T細胞響應的檢查。CTLA-4被認為在TCR接合之後調節初始和記憶性T細胞的早期激活幅度，並且係影響抗腫瘤免疫和自體免疫兩者的中央抑制途徑的一部分。CTLA-4僅在T細胞上表現，並且其配體CD80（B7.1）和CD86（B7.2）的表現主要限於抗原呈遞細胞、T細胞、和其他免疫介導的細胞。據報告，阻斷CTLA-4傳訊途徑的拮抗性抗CTLA-4抗體增強T細胞激活。
在一些方面，第二結合結構域特異性結合CTLA-4。在一些方面，雙特異性結合蛋白係MEDI5752。術語MEDI5752係指包含SEQ ID NO:65的輕鏈和SEQ ID NO:63的重鏈（PD-1）以及SEQ ID NO:104的輕鏈和SEQ ID NO:105的重鏈（CTLA-4）的抗PD-1/CTLA-4雙特異性抗體。MEDI5752揭露於美國專利案號10,457,732中，將其藉由引用以其全文併入本文。
在一些方面，第二結合結構域包含含有SEQ ID NO:109的胺基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:110的胺基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO:111的胺基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO:112的胺基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:113的胺基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO:114的胺基酸序列的VL CDR3。在一些方面，第二結合結構域包含與SEQ ID NO:109的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VH CDR1，與SEQ ID NO:110的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VH CDR2，與SEQ ID NO:111的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VH CDR3，與SEQ ID NO:112的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VL CDR1，與SEQ ID NO:113的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VL CDR2，和與SEQ ID NO:114的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VL CDR3。
在一些方面，第二結合結構域包含含有SEQ ID NO:105中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO:104中列出的胺基酸序列的輕鏈。
在一些方面，第二結合結構域包含與SEQ ID NO:105中列出的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重鏈和與SEQ ID NO:104中列出的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的輕鏈。
在一些方面，雙特異性結合蛋白包含IgG重鏈恒定區。在一些方面，IgG重鏈恒定區係IgG1重鏈恒定區。在一些方面，恒定區包括在L234F、L235E和P331S處的突變。在一些方面，恒定區包含杵突變和臼突變，視需要其中該杵突變在包含結合CTLA-4的可變區的重鏈中，並且該臼突變在包含結合PD-1的可變區的重鏈中。
在一些方面，雙特異性結合蛋白係人源化雙特異性抗體或其抗原結合片段。在一些方面，雙特異性結合蛋白結合人PD-1和CTLA-4。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含MEDI5752的序列的抗PD-1和抗CTLA-4重鏈可變區（VH）CDR1、VH CDR2、VH CDR3、輕鏈可變區（VL）CDR1、VL CDR2、和VL CDR3。 結合 PD-1 的雙特異性蛋白的方面
具有PD-1結構域以及TIGIT、TIM-3和CTLA-4結構域中的一個的雙特異性結合蛋白可以變化。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含無糖基化的Fc區。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含去糖基化的Fc區。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含具有減少的岩藻糖基化或係無岩藻糖基化的Fc區。在一些方面，雙特異性結合蛋白係全長抗體。在一些方面，抗體係IgG抗體。在一些方面，抗體係IgG1抗體。在一些方面，抗體係人的或人源化的。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含κ輕鏈恒定區。在一些方面，雙特異性結合蛋白包含λ輕鏈恒定區。
在一些方面，本揭露提供了核酸，該核酸包含編碼如本文所述之雙特異性結合蛋白的核苷酸序列。在一些方面，本揭露提供了包含如本文所述之核酸的宿主細胞。在一些方面，本揭露提供了包含載體的宿主細胞，該載體包含如本文所述之核酸。在一些方面，本揭露提供了宿主細胞，該宿主細胞具有整合到其基因組中的如本文所述之核酸。在一些方面，本揭露提供了由如本文所述之宿主細胞產生的雙特異性結合蛋白。 癌症的類型
在本文揭露之方法中的任一個的一些方面，該等方法用於治療癌症。在一些方面，癌症選自卵巢癌、乳癌、子宮癌、睪丸癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色素瘤、腎細胞癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮頸癌、血液學癌症、子宮內膜癌、膽管細胞癌、NSCLC（鱗狀和/或腺癌）、胃腸癌（如胃癌和結直腸癌）、和肺癌中的一或多種。在一些方面，癌症係乳癌，其選自激素受體陽性（HR+）乳癌、人表皮生長因子受體2陽性（HER2+）乳癌和三陰性乳癌（TNBC）。在一些方面，癌症係同源重組缺陷（HRD）癌症。在一些方面，癌症包含具有選自以下的HRD基因的突變的一或多種細胞： BRCA1、 BRCA2、 ATM、 BRIP1、 BARD1、 CDK12、 CHEK1、 CHEK2、 FANCL、 PALB2、 PPP2R2A、 RAD51B、 RAD51C、 RAD51D和 RAD54L。在一些方面，突變的HRD基因選自 BRCA1、 BRCA2和 ATM 。 序列 [ 表 1]
SEQ ID NO. 序列 描述
1 GYYWN ZY0EQD-E02；HCDR1
2 EINHSGSTSYNPSLKS ZY0EQD-E02；HCDR2
3 VLYNWNVDS ZY0EQD-E02；HCDR3
4 RASQDIRNDVG ZY0EQD-E02；LCDR1
5 AASRLQS ZY0EQD-E02；LCDR2
6 LQHNSYPRT ZY0EQD-E02；LCDR3
7 GYYWN ZY0EPQ-E02；HCDR1
8 EINHSGSTNYNPSLKS ZY0EPQ-E02；HCDR2
9 NLYNWNLDS ZY0EPQ-E02；HCDR3
10 RASQGIRNDLG ZY0EPQ-E02；LCDR1
11 VASSLQS ZY0EPQ-E02；LCDR2
12 LQHNSYPRT ZY0EPQ-E02；LCDR3
13 SGGYYWS ZY0EOB-F05；HCDR1
14 NIYYSGSTYYNPSLKS ZY0EOB-F05；HCDR2
15 EKALATVTPSGYENYYTVDV ZY0EOB-F05；HCDR3
16 WASQGISSYLA ZY0EOB-F05；LCDR1
17 AASTLQS ZY0EOB-F05；LCDR2
18 QHLNSYPLT ZY0EOB-F05；LCDR3
19 SGGYYWS ZY0EO5-E07；HCDR1
20 NIYYSGSTYYNPSLKS ZY0EO5-E07；HCDR2
21 EKALASVIPSGYENYYVVDV ZY0EO5-E07；HCDR3
22 WASQGIAGYLA ZY0EO5-E07；LCDR1
23 AASTLQS ZY0EO5-E07；LCDR2
24 QHLNSYPLT ZY0EO5-E07；LCDR3
25 DYYMS ZY0EP0-C07；HCDR1
26 YISSSGSTIYYTDSVKG ZY0EP0-C07；HCDR2
27 DGVGFDY ZY0EP0-C07；HCDR3
28 RASQSVSSSYLA ZY0EP0-C07；LCDR1
29 AASSRAT ZY0EP0-C07；LCDR2
30 QQYGSSPLYT ZY0EP0-C07；LCDR3
SEQ ID NO: 31 （ ZY0EPQ-E02 ，可變重鏈）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTILVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNLYNWNLDSWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 32 （ ZY0EPQ-E02 ，可變輕鏈）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGRAPKRLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 33 （ ZY0EQD-E02 ，可變重鏈，例如種系化前）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 34 （ ZY0EQD-E02 ，可變輕鏈）DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDVGWYQQKPGKAPKRLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 35 （ ZY0EOB-F05 ，可變重鏈）QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCATEKALATVTPSGYENYYTVDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 36 （ ZY0EOB-F05 ，可變輕鏈）DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHLNSYPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 37 （ ZY0EO5-E07 ，可變重鏈）QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREKALASVIPSGYENYYVVDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 38 （ ZY0EO5-E07 ，可變輕鏈）DIQLTQSPSFLSASVGGRVTITCWASQGIAGYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHLNSYPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 39 ：（ ZY0EP0-C07 ，可變重鏈）QVQLVESGGVLVKPGGSLRLSCAASGFTLSDYYMSWIRQAPGMGLEWVSYISSSGSTIYYTDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGVGFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 40 （ ZY0EP0-C07 ，可變輕鏈）EIVLTQSPGTLSLFPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQSPRLLIYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 41 （ Maia 重鏈恒定區，半胱胺酸插入帶底線）：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS CVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 42 （輕鏈恒定區）RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 43 （ ZY0EQD-E02 ，可變重鏈，例如種系化前，例如 SEQ ID NO: 33/ SEQ ID NO: 45 的變體）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGRGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRITISIDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 44 （ ZY0EQD-E02 ，輕鏈）：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDVGWYQQKPGKAPKRLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 45 （ EQD-E02_GL ，可變重鏈， GL = 種系化的）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 46 （ EQD-E02-GLY ，可變重鏈， GLY = 具有 Y 取代的種系化的）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEI YHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 47 （ EQD-E02-GLQ ，可變重鏈， GLQ = 具有 Q 取代的種系化的）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEI QHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 48 （ E02-GL-Maia- 重鏈，半胱胺酸插入帶底線）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS CVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 49 （ E02-GLY-Maia- 重鏈， GLY = 具有 Y 取代的種系化的）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEI YHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 50 （ E02-GLQ-Maia- 重鏈， GLQ = 具有 Q 取代的種系化的）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEI QHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 51 （ E02-GL-WT- 重鏈）QVQLQQWGAGLLKPSETLSLACTVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVLYNWNVDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 52 （重鏈恒定區）ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 53 （人 B7H4 核酸序列，包括 5’ 和 3’ UTR ）GCCACCatggcttccctggggcagatcctcttctggagcataattagcatcatcattattctggctggagcaattgcactcatcattggctttggtatttcagggagacactccatcacagtcactactgtcgcctcagctgggaacattggggaggatggaatcctgagctgcacttttgaacctgacatcaaactttctgatatcgtgatacaatggctgaaggaaggtgttttaggcttggtccatgagttcaaagaaggcaaagatgagctgtcggagcaggatgaaatgttcagaggccggacagcagtgtttgctgatcaagtgatagttggcaatgcctctttgcggctgaaaaacgtgcaactcacagatgctggcacctacaaatgttatatcatcacttctaaaggcaaggggaatgctaaccttgagtataaaactggagccttcagcatgccggaagtgaatgtggactataatgccagctcagagaccttgcggtgtgaggctccccgatggttcccccagcccacagtggtctgggcatcccaagttgaccagggagccaacttctcggaagtctccaataccagctttgagctgaactctgagaatgtgaccatgaaggttgtgtctgtgctctacaatgttacgatcaacaacacatactcctgtatgattgaaaatgacattgccaaagcaacaggggatatcaaagtgacagaatcggagatcaaaaggcggagtcacctacagctgctaaactcaaaggcttctctgtgtgtctcttctttctttgccatcagctgggcacttctgcctctcagcccttacctgatgctaaaaTAATAA SEQ ID NO: 54 （人 B7H4 核酸序列，編碼序列）atggcttccctggggcagatcctcttctggagcataattagcatcatcattattctggctggagcaattgcactcatcattggctttggtatttcagggagacactccatcacagtcactactgtcgcctcagctgggaacattggggaggatggaatcctgagctgcacttttgaacctgacatcaaactttctgatatcgtgatacaatggctgaaggaaggtgttttaggcttggtccatgagttcaaagaaggcaaagatgagctgtcggagcaggatgaaatgttcagaggccggacagcagtgtttgctgatcaagtgatagttggcaatgcctctttgcggctgaaaaacgtgcaactcacagatgctggcacctacaaatgttatatcatcacttctaaaggcaaggggaatgctaaccttgagtataaaactggagccttcagcatgccggaagtgaatgtggactataatgccagctcagagaccttgcggtgtgaggctccccgatggttcccccagcccacagtggtctgggcatcccaagttgaccagggagccaacttctcggaagtctccaataccagctttgagctgaactctgagaatgtgaccatgaaggttgtgtctgtgctctacaatgttacgatcaacaacacatactcctgtatgattgaaaatgacattgccaaagcaacaggggatatcaaagtgacagaatcggagatcaaaaggcggagtcacctacagctgctaaactcaaaggcttctctgtgtgtctcttctttctttgccatcagctgggcacttctgcctctcagcccttacctgatgctaaaa SEQ ID NO: 55（ 人 B7H4 多肽序列； UniProt 登錄號： Q7Z7D3 ）MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK [ 表 2] ：具有PD-1/TIGIT雙特異性的序列
SEQ ID NO    序列
56 PD1 LO115 HCDR1    DYGMH
57 PD1 LO115 HCDR2    YISSGSYTIYSADSVKG
58 PD1 LO115 HCDR3    RAPNSFYEYYFDY
59 PD1 LO115 LCDR1    SASSKHTNLYWSRHMY
60 PD1 LO115 LCDR2    LTSNRAT
61 PD1 LO115 LCDR3 QQWSSNPFT
62 PD1 LO115可變重鏈    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSS
63 PD1 LO115臼重鏈    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK   
64 PD1 LO115可變輕鏈    QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK
65 PD1 LO115 WT κ輕鏈    QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC   
66 TIGIT VAR1 HCDR1    SYAMH
67 TIGIT VAR1 HCDR2    VISYAGEVKYYADSVKG
68 TIGIT VAR1 HCDR3    DPLPLHYYGMDV
69 TIGIT VAR1 LCDR1    SGSSSNIGRRPVN
70 TIGIT VAR1 LCDR2    SQNQRPS
71 TIGIT VAR1 LCDR3    AVWDDIGRVLQ
72 TIGIT VAR1可變重鏈    QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSS
73 TIGIT VAR1杵重鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVCPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSVDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
74 TIGIT VAR1可變輕鏈    QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGRRPVNWYQQLPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLTVL   
75 TIGIT VAR1工程化λ輕鏈    QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGRRPVNWYQQLPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLTVLGQPKAAPSVTLFPPCSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEVS   
76 PD1 LO115可變重鏈    GAGGTGCAGCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACATTCTCCGACTACGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTACATCTCCTCCGGCTCCTACACCATCTACTCCGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCCCTAACTCCTTCTACGAGTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCT
77 PD1 LO115臼重鏈    GAGGTGCAGCTGGTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACATTCTCCGACTACGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTACATCTCCTCCGGCTCCTACACCATCTACTCCGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCCCTAACTCCTTCTACGAGTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAAGGTCCGAGCGTTTTTCCGCTGGCACCGAGCAGCAAAAGCACCTCTGGTGGCACCGCAGCACTGGGTTGTCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTTACCGTTTCTTGGAATAGCGGTGCACTGACCAGCGGTGTTCATACCTTTCCGGCAGTTCTGCAGAGCAGCGGTCTGTATAGCCTGTCTAGCGTTGTTACCGTTCCGAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAATGTGAATCATAAACCGAGCAATACAAAAGTTGATAAACGCGTTGAACCGAAAAGCTGTGACAAAACTCACACGTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCAGCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTCTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAGCTGCGCGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTTAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
78 PD1 LO115可變輕鏈    CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCTCCGCCTCCTCCAAGCACACCAACCTGTACTGGTCCCGGCACATGTACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACCTGACCTCTAACCGGGCCACCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
79 PD1 LO115 WT κ輕鏈    CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCTCCGCCTCCTCCAAGCACACCAACCTGTACTGGTCCCGGCACATGTACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACCTGACCTCTAACCGGGCCACCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
80 TIGIT VAR1可變重鏈    CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGCGGGGGAGGTGAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACCCGCTACCGCTACATTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
81 TIGIT VAR1杵重鏈    CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGCGGGGGAGGTGAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACCCGCTACCGCTACATTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAAGGTCCGAGCGTGTGCCCGCTGGCACCGAGCAGCAAAAGCACCTCTGGTGGCACCGCAGCACTGGGTTGTCTGGTGAAAGATTATTTTCCGGAACCGGTTACCGTTTCTTGGAATAGCGGTGCACTGACCAGCGGTGTTCATACCTTTCCGGCAGTCCTGCAGAGCAGCGGTCTGTATAGCCTGTCTAGCGTTGTTACCGTTCCGAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATTTGCAATGTGAATCATAAACCGAGCAATACCAAAGTTGATAAACGCGTTGAACCGAAAAGCGTGGACAAAACTCACACGTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCAGCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTCTACACCCTGCCCCCATGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCTTAAGCCTGTCTCCGGGTAAATGA
82 TIGIT VAR1可變輕鏈    CAGTCTGTGCTGACTCAGCCTCCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAATATCGGAAGGAGGCCTGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTCAGAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCCAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTTCTGTGCAGTTTGGGATGACATCGGCCGCGTCCTGCAGTTAGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTA
83 TIGIT VAR1工程化λ輕鏈    CAGTCTGTGCTGACTCAGCCTCCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAATATCGGAAGGAGGCCTGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTCAGAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCCAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTTCTGTGCAGTTTGGGATGACATCGGCCGCGTCCTGCAGTTAGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCGGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTGCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAAGTGTCATGA
[ 表 3] - PD-1/TIM-3 雙特異性
SEQ ID NO 描述 胺基酸序列
84 AZD 7789 TIM-3 VH CDR1 SYAMS
85 AZD 7789 TIM-3 VH CDR2 AISGSGGSTYYADSVKG   
86 AZD 7789 TIM-3 VH CDR3 GSYGTYYGNYFEY   
56 AZD 7789 PD-1 VH CDR1 DYGMH   
57 AZD 7789 PD-1 VH CDR2 YISSGSYTIYSADSVKG   
58 AZD 7789 PD-1 VH CDR3 RAPNSFYEYYFDY   
87 AZD 7789 TIM-3 VL CDR1 GGDNIGGKSVH   
88 AZD 7789 TIM-3 VL CDR2 YDSDRPS   
89 AZD 7789 TIM-3 VL CDR3 QVLDRRSDHFL   
59 AZD 7789 PD-1 VL CDR1 SASSKHTNLYWSRHMYWY   
60 AZD 7789 PD-1 VL CDR2 LTSNRAT   
61 AZD 7789 PD-1 VL CDR3 QQWSSNP   
90 TIM-3（編號62） VL CDR3 QVLDRRSDHWL   
91 AZD 7789 TIM-3 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYGTYYGNYFEYWGQGTLVTVSS
92 AZD 7789 TIM-3 HC EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYGTYYGNYFEYWGQGTLVTVSSASTKGPSVCPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSVDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
93 TIM3（編號62）可變輕VL QTVLTQPPSVSVAPGKTASISCGGDNIGGKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPQRFSGSNSGNTATLTIHRVEAGDEADYYCQVLDRRSDHWLFGGGTKLTVL
94 AZD 7789 TIM-3 VL SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIGGKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLDRRSDHFLFGGGTKLTVL
95 AZD 7789 TIM-3 LC SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIGGKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLDRRSDHFLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPCSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEVS
62 AZD 7789 PD-1 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSS
63 AZD 7789 PD-1 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK   
64 AZD 7789 PD-1 VL QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK   
65 AZD 7789 PD-1 LC QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC   
96 TIM-3重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYGTYYGNYFEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIGGKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLDRRSDHFLFGCGTKLTVL   
97 TIM-3輕鏈 可變區 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK
98 TIM-3重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYGTYYGNYFEYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIGGKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLDRRSDHFLFGCGTKLTVLGGGGSGGGGSGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
99 TIM-3輕鏈 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
100 TIM3（編號62）可變重VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYGTYYGNYFEYWGRGTLVTVSS
101 人PD-1蛋白的胺基酸序列 MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL
102 人TIM-3 IgV結構域 SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIK
103 人TIM-3蛋白 MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP
[ 表 4] ：具有 PD-1/CTLA4 雙特異性的全長輕鏈胺基酸序列
SEQ ID NO: 抗體 胺基酸序列
65 MEDI 5752 PD-1 QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSKHTNLYWSRHMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
104 MEDI 5752 CTLA-4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKGQPKAAPSVTLFPPCSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEVS
[ 表 5] ： PD-1/CTLA4 雙特異性全長重鏈胺基酸序列
SEQ ID NO: 抗體 胺基酸序列
63 MEDI 5752 PD-1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSYTIYSADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAPNSFYEYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
105 MEDI 5752 CTLA-4 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVCPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSVDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[ 表 6] . 具有 PD-1/CTLA4 雙特異性的 VH CDR 胺基酸序列
抗體 VH CDR1 （ SEQ ID NO: ） VH CDR2 （ SEQ ID NO: ） VH CDR3 （ SEQ ID NO: ）
MEDI 5752 PD-1 GFTFSDYGMH （SEQ ID NO: 106） YISSGSYTIYSADSVKG （SEQ ID NO: 107） RAPNSFYEYYFD （SEQ ID NO: 108）
MEDI 5752 CTLA-4 GFTFSSYGMH （SEQ ID NO: 109） VIWYDGSNKYYADSVKG （SEQ ID NO: 110） DPRGATLYYYYYGMDV （SEQ ID NO: 111）
1表1中的VH CDR係根據Kabat確定的。 [ 表 7] . 具有 PD-1/CTLA4 雙特異性的 VL CDR 胺基酸序列
抗體 VL CDR1 （ SEQ ID NO: ） VL CDR2 （ SEQ ID NO: ） VL CDR3 （ SEQ ID NO: ）
MEDI 5752 PD-1 SASSKHTNLYWSRHMYWY （SEQ ID NO: 59） TSNRAT （SEQ ID NO: 60） QQWSSNP （SEQ ID NO: 61）
MEDI 5752 CTLA-4 RASQSINSYLD （SEQ ID NO: 112） AASSLQS （SEQ ID NO: 113） QQYYSTP （SEQ ID NO: 114）
2表2中的VL CDR係根據Kabat確定的。
人CTLA-4蛋白 MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN（SEQ ID NO: 115）。
[ 表 8] . 具有 EGFR/cMET 雙特異性的胺基酸序列
SEQ ID NO 描述 胺基酸序列
116 INT-017 抗EGFR VH CDR1 DNDFS
117 INT-017 抗EGFR VH CDR2 AIVAVFRTETYAQKFQD
118 INT-017 抗EGFR VH CDR3 RLMSAISGPGAPLLM
119 INT-017 抗EGFR VL CDR1 TGTSSDVGGYNYVS
120 INT-017 抗EGFR VL CDR2 DVSKRPS
121 INT-017 抗EGFR VL CDR3 SSYTSSDTLEI
122 INT-017 抗cMET VH CDR1 DYYIH
123 INT-017 抗cMET VH CDR2 WMNPNSGNTGYAQKFQG
124 INT-017 抗cMET VH CDR3 GQGYTHS
125 INT-017 抗cMET VL CDR1 RASEGIYHWLA
126 INT-017 抗cMET VL CDR2 KASSLAS
127 INT-017 抗cMET VL CDR3 QQYSNYPPT
128 INT-017 抗EGFR VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSS
129 INT-017 抗EGFR HC QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSVCPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSVDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
130 INT-017 抗EGFR VL QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSDTLEIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTL
131 INT-017 抗EGFR LC QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSDTLEIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPCSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEVS
132 INT-017 抗cMET VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSS
133 INT-017 抗cMET HC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
134 INT-017 抗cMET VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPPTFGGGTKLEIK
135 INT-017 抗cMET LC DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
實例 實例 1 ： TOP1i-ADC 在多個體外模型系統中誘導腫瘤抗原性和配體表現
進行體外研究以確定抗體-藥物軛合物（ADC）是否增加腫瘤抗原性和增加某些免疫腫瘤學（IO）配體的表現。將MX1腫瘤細胞在具有10%胎牛血清（FBS）的DMEM:F-12培養基中在37°C和5% CO 2下體外培養24小時。將培養的細胞暴露於具有拓樸異構酶1抑制劑彈頭（iso-TOP1i）的對照ADC以及具有相同彈頭的靶向TROP2的ADC（抗體殖株hRS7，hRS7(TROP2)-TOP1i），濃度為1 µg/ml，持續五天。將細胞藉由胰蛋白酶化收穫，用螢光標記的抗體染色，用於各種細胞表面表現的配體，並藉由流式細胞術對測量的每種配體進行評價。所指示的比較的統計學顯著性表示為* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01。表現的幾何平均螢光強度相對於對照的倍數增加描繪在圖1A-1C中。如圖1A所示，hRS7(TROP2)-TOP1i ADC顯著增加了免疫原性和免疫原性細胞死亡標誌物MHC-I和鈣網伴護蛋白的表現（MHC-I，p = 0.008；鈣網伴護蛋白，p =0.008）。如圖1B所示，兩種ADC均顯著增加了PD-1配體PD-L1和TIM3配體磷脂醯絲胺酸的表現，如藉由螢光標記的膜聯蛋白-V（Ann-V）蛋白的結合所示（PD-L1，p = 0.029；鈣網伴護蛋白，p = 0.0029）。如圖1C所示，兩種ADC均增加了TIGIT配體CD155、連接蛋白-2和連接蛋白-4的表現，其中觀察到hRS7(TROP2)-TOP1i顯著增加CD155的表現（CD155，p = 0.008）。
測試了同一組ADC影響配體在樹突細胞上表現的能力。根據製造商的說明，使用RoboSepTM-S自動細胞分離器（幹細胞技術公司（StemCell Technologies），劍橋，麻塞諸塞州（Cambridge, MA））與EasySepTM人PBMC直接分離套組（幹細胞技術公司）的組合，從HLA-A*02:01陽性健康供體的全血中分離周邊血單核細胞（PBMC）。隨後使用基於陰性選擇磁性微珠的測定套組（美天旎生物技術公司（Miltenyi Biotec），蓋瑟斯堡，馬里蘭州（Gaithersburg, MD））從PBMC中分離單核球。未成熟的單核球來源的樹突細胞藉由在補充有10% FBS、50 ng/mL重組人介白素4和50 ng/mL重組人GM-CSF的RPMI-1640培養基中培養單核球6天而產生，其中在第3天補充培養基。然後將未成熟的樹突細胞與PC9肺腺癌細胞以1 : 1的比率在補充有10% FBS的RPMI-1640培養基中共培養6小時，該等PC9肺腺癌細胞經工程化以表現黑色素瘤抗原MART-1。將培養的細胞暴露於濃度為3 µg/mL的對照和hRS7(TROP2)-TOP1i ADC持續72小時。配體表現藉由流式細胞術測量，如實例1所述。所指示的比較的統計學顯著性表示為* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01。如圖2A所示，hRS7(TROP2)-TOP1i ADC顯著增加了CTLA4配體CD80在樹突細胞上的表現（p = 0.044）。如圖2B所示，腫瘤細胞和樹突細胞的共培養導致TIM3在樹突細胞上的表現顯著增加（p = 0.007）。如圖2C所示，hRS7(TROP2)-TOP1i顯著增加TIGIT配體連接蛋白2/CD112在樹突細胞上的表現（p = 0.006）。該等結果證明了TOP1i ADC能夠調節可以使用免疫腫瘤學療法靶向的抗原的表現。 實例 2 ： TOP1i ADC 與 AZD2936 的組合增強腫瘤 - 免疫細胞共培養模型中體外 T 細胞介導的腫瘤細胞的殺傷
開發了共培養測定系統，該系統利用黑色素瘤抗原Melan A（MART-1）反應性T細胞和經工程化以表現MART-1抗原和綠色螢光蛋白（GFP）的PC9肺腺癌細胞。利用賽多利斯公司（Sartorius）的Incucyte活細胞分析系統評估腫瘤細胞裂解，其中GFP信號強度的損失被用作細胞死亡的替代標誌物。簡而言之，根據製造商的說明，使用胰蛋白酶從細胞培養瓶中收穫PC9-MART1-GFP細胞，將其用如實例1中定義的完全RPMI培養基洗滌一次，重懸並在37°C下在5% CO 2中添加到96孔的底部透明、壁不透明的光學板的每個孔中持續24小時。使用了濃度為2 nM的PD-1-TIGIT（AZD2936）、PD-1-TIM3（AZD7789）或PD-1-CTLA4（MEDI5752）雙特異性抗體。使用了0.05 µg/ml的hRS7(TROP2)-TOP1i ADC。將處理單獨或組合添加到孔中，然後立即靜置，根據供體以4 : 1或5 : 1的效應T細胞與靶腫瘤細胞的效應物與靶標（E : T）比率添加抗原特異性CD8+ T細胞。在添加T細胞後五天，藉由每孔的GFP強度的圖像分析，測量腫瘤細胞死亡和細胞溶解百分比。數據來自3個獨特供體的實驗。所指示的比較的統計學顯著性表示為* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，p ＜ 0.001。如圖3A-3C所示，每種雙特異性抗體以及hRS7(TROP2)-TOP1i ADC增強T細胞介導的PC9腫瘤細胞的細胞溶解。在每種情況下，雙特異性抗體和hRS7(TROP2)-TOP1i ADC的組合都達到了最高的細胞溶解程度。
抗原特異性CD8+ T-細胞在腫瘤抗原識別後分泌IFN- γ。為了評估在含有PC9-MART1-GFP腫瘤細胞和腫瘤反應性CD8+ T細胞的共培養物的上清液內檢測到的IFN-γ的量，在Nunc 96孔板（西格瑪奧德里奇公司（Sigma Aldrich））和Incucyte光學板中建立了單獨的平行共培養物。為了評估IFN-γ的釋放，在24、72和144小時後從Nunc 96孔板中的共培養物中收穫上清液。根據製造商的說明，使用人IFN-γ的Mesoscale Discovery多點ELISA測量IFN-γ。如圖4A所示，T-細胞在MART-1抗原特異性T細胞與表現抗原的腫瘤細胞共培養期間有力地誘導IFN-γ分泌，而在不存在T-細胞的情況下沒有測量到IFN-γ分泌。對於MART-1腫瘤抗原反應性T細胞-PC9肺腺癌共培養，在單獨的hRS7(TROP2)-TOP1i ADC、單獨的AZD2936和MEDI5752以及兩者與ADC的組合的存在下保留由T細胞分泌的IFN-γ（圖4C-4D）。AZD7789增強IFN-γ，與hRS7(TROP2)-TOP1i ADC的組合保留IFN-γ（圖4E）。 實例 3 ：在 EMT6-hHER2 模型中觀察 hHER2-TOP1i ADC 和抗 PD-L1 的體內組合功效
在研究第0天將經工程化以表現人HER2的EMT6鼠乳癌細胞皮下植入至雌性Balb/C小鼠的脅腹中。將小鼠保持在每籠不超過六隻動物的組中，使其對食物和水連續可及。每種療法測試九隻小鼠。向單一療法小鼠投與以下：僅媒介物、NIP228陰性對照抗體（10 mg/kg）和陰性對照ADC（NIP228-SG3932，10 mg/kg）、抗HER2 ADC（抗HER2-SG3932，10 mg/kg）、抗PD-L1抗體（10 mg/kg）和抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體（10 mg/kg）。除僅媒介物的對照外，向全部的組合療法小鼠投與抗HER2 ADC與以下的組合：媒介物、抗PD-L1抗體、抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體（每種10 mg/kg）。按照圖5A中示意性顯示的時間表完成投與，其中在第7天和第14天投與ADC和IO療法，並且在第10天和第17天僅投與IO療法。使用數位卡尺測量平均腫瘤體積，並且將平均值繪製在圖5B（單一療法）和5C（組合）中。如藉由比較圖5B和5C所示，組合療法大幅降低了平均腫瘤體積和生長。在第72天處死小鼠。
每種療法的單個小鼠腫瘤體積的圖顯示在圖6中。如該等圖中的一些圖所示，有對PD1/TIGIT雙特異性單一療法和ADC + PD-L1抗體以及ADC + PD1/TIGIT雙特異性抗體組合療法的完全響應者（CR），如該等圖旁邊的分數所指示。 實例 4 ： AZD8205 與抗 PD-L1 組合並且增強在過表現小鼠 B7H4 的結腸癌小鼠模型中的功效
在研究第0天將過表現鼠B7H4的CT26結腸癌細胞皮下植入至Balb/C小鼠的脅腹中。如實例3中所述安置和護理小鼠。如圖7A中示意性顯示，進行療法的投與，其中在第10天和第17天投與ADC，並且在第10、13、17和20天投與抗PD-L1抗體。具有TOP1i彈頭和連接子（SG3932）的靶向B7H4的ADC稱為AZD8205。向小鼠投與以下：未經處理的對照（UT）、單獨的抗PD-L1抗體（10 mg/kg）、單獨的同種型單甲基奧瑞斯他汀E（MMAE）彈頭和TOP1i（SG3932）ADC（每種7 mg/kg）、單獨的具有MMAE或TOP1i（SG3932）彈頭的靶向B7H4的ADC（每種7 mg/kg）、或抗PD-L1抗體與ADC中的一種的組合（10 mg/kg抗PD-L1，7 mg/kg ADC）。測量平均腫瘤體積並且將其繪製在圖7B中。如圖所示，與單一療法處理相比，組合處理增強了針對模型中的腫瘤細胞生長的功效。 實例 5 ： AZD8205 + 抗 PD-L1 組合在 mB7-H4 CT26 模型中顯著增加腫瘤 T 細胞和 TIGIT 表現
向來自實例4中概述的研究中的單獨的一組小鼠投與與實例4中使用的相同的處理，其中投與時間表圖8A中示意性顯示。在第10天和第17天共同投與ADC和IO組合療法，而在第13天和第20天僅投與IO療法。該組小鼠在研究第18天終止，用於腫瘤和腫瘤引流淋巴結的免疫細胞組成的藥效學（PD）評估。將腫瘤和淋巴結解離為單個細胞懸浮液，並且用螢光標記的抗體染色，該等抗體對小鼠免疫細胞群的細胞表面特性標誌物具有特異性，並藉由流式細胞術進行分析。CD45+免疫細胞的百分比藉由將CD45+細胞的數量除以活的單個細胞的總數來確定。所指示的比較的統計學顯著性表示為* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，***p ＜0.001和****p ＜ 0.0001。如圖8B所示，AZD8205和抗PD-L1的組合顯著增加了CD3+ T細胞在總CD45+免疫細胞群中的百分比（p = 0.048 AZD8205 + 抗PD-L1相對於未經處理的）。TIGIT+ CD4和TIGIT+ CD8 T細胞的百分比藉由將CD4或CD8和TIGIT雙陽性細胞的數量除以CD4或CD8陽性T細胞的總數來確定。如圖8C所示，對於CD4+和CD8+ T細胞兩者，AZD8205和抗PD-L1的組合顯著增加了TIGIT+ T細胞百分比。每組的小鼠生存率繪製在圖8D中。與單獨的AZD8205相比，AZD8205與抗PD-L1的組合顯著增加了中位生存期。 實例 6 ： B7-H4 ADC 和 PD-1-TIGIT 雙特異性的組合在 mB7-H4 CT26 模型中的穩健的抗腫瘤活性
在研究第0天將過表現鼠B7-H4的CT26結腸癌細胞皮下植入至Balb/C小鼠的脅腹中，如實例4中所述。如圖9A中示意性顯示，進行療法的投與，其中在第10天和第17天以7 mg/kg投與ADC，並且在第10、13、17和20天以10 mg/kg投與抗PD-1或PD-1-TIGIT雙特異性抗體。每種療法的單個小鼠腫瘤體積的圖顯示在圖9B中。如該等圖中的一些圖所示，有對PD-1-TIGIT雙特異性單一療法和AZD8205單一療法的完全響應者（CR），然而觀察到更多的對AZD8205與抗PD1/TIGIT雙特異性的組合的完全響應者，如圖旁邊的分數所指示。
無
以下附圖形成本說明書的一部分，並且被包括在內以進一步展示本揭露的某些方面的示例性實施方式。
[ 圖 1A-1C]示出了如實例1中所述之不同抗原在腫瘤細胞上的表現的幾何平均螢光強度（gMFI）之圖。
[ 圖 2A-2C]示出了如實例1中所述之不同抗原在樹突細胞上的表現的中值螢光強度（MFI）之圖。
[ 圖 3A-3C]示出了當暴露於腫瘤抗原特異性T細胞和以下的任一個時：PD-1-TIGIT雙特異性AZD2936（圖3A）、PD-1-TIM3雙特異性AZD7789（圖3B）、PD-1-CTLA4雙特異性MEDI5752（圖3C）、ADC hRS7(TROP2)-TOP1i或它們的組合（圖3A-3C），腫瘤細胞的細胞溶解百分比之圖。
[ 圖 4A-4B]示出了與腫瘤抗原特異性T-細胞和以下的任一個共培養的腫瘤細胞的上清液中的IFN-γ濃度之圖：PD1-TIGIT雙特異性AZD2936（圖4A）、PD-1-TIM3雙特異性AZD7789（圖4B）、PD1-CTLA4雙特異性MEDI5752（圖4C）、ADC hRS7(TROP2)-TOP1i或它們的組合（圖4A-4C）。
[ 圖 5A-5C] . 圖 5A示出了如實例3中所述之向小鼠投與ADC和免疫腫瘤（IO）藥劑之示意圖。 圖 5B-5C示出了單一療法（圖5B）和組合療法（圖5C）之圖。
[ 圖 6]示出了用圖5B-5C中所示的且如實例3中所述之每種療法處理的每隻小鼠的腫瘤體積之蜘蛛圖。
[ 圖 7A-7B] . 圖 7A示出了如實例4中所述之對小鼠的ADC和抗PD-L1抗體投與時間表之示意圖。 圖 7B示出了用如圖中所示的且在實例中所述之每種療法處理的每隻小鼠的腫瘤體積之蜘蛛圖。
[ 圖 8A-8D] . 圖 8A示出了如實例5中所述之向小鼠投與ADC和抗PD-L1抗體之示意圖。 圖 8B係示出如在實例中所述指示的處理後CD3+ T細胞的百分比之圖。 圖 8C示出了如在實例5中所述指示的處理後TIGIT+ CD4 T細胞和CD8 T細胞的百分比之圖。 圖 8D係每個處理組中小鼠的生存率的Kaplan-Meyer圖。
[ 圖 9A-9B] . 圖 9A示出了如實例6中所述之向小鼠投與ADC和IO之示意圖。 圖 9B示出了用如圖所示的每種療法處理的每隻小鼠的單個腫瘤體積之蜘蛛圖。
無
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Claims (107)

  1. 一種在有需要的人受試者中治療癌症之方法，該方法包括向該人受試者投與： a) 抗體-藥物軛合物（ADC），該抗體-藥物軛合物包含： i) 抗體或其抗原結合片段， ii) 可切割連接子，以及 iii) 細胞毒性劑； 其中該細胞毒性劑係具有式 I之化合物： ， 及其鹽和溶劑化物，其中R L係該可切割連接子，該連接子選自： ， 其中Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； 其中X係： ，其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，至少b1或b2 = 0，至少c1或c2 = 0；並且 其中G L係用於連接該抗體或抗原結合片段的連接子；以及 ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團，並且e係0或1；以及 b) 雙特異性檢查點抑制劑。
  2. 一種在有需要的人受試者中治療癌症之方法，該方法包括向該人受試者投與： a) 抗體-藥物軛合物（ADC），該抗體-藥物軛合物包含： i) 結合B7-H4多肽的抗體或其抗原結合片段， ii) 可切割連接子，以及 iii) 細胞毒性劑；以及 b) 雙特異性檢查點抑制劑。
  3. 如請求項1或請求項2所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑係具有特異性結合計畫性死亡蛋白-1（PD-1）的第一結合結構域的結合蛋白。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段包含： 分別含有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的重鏈CDR1（HCDR1）、重鏈CDR2（HCDR2）、重鏈CDR3（HCDR3）、輕鏈CDR1（LCDR1）、輕鏈CDR2（LCDR2）和輕鏈CDR3（LCDR3），或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體；或者 分別含有SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，或其功能變體；或者 含有SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120和SEQ ID NO: 121的胺基酸序列的在第一結合臂中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；以及含有SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126和SEQ ID NO: 127的胺基酸序列的在第二結合臂中的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段包含： 分別含有SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 33和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 47和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的可變重（VH）鏈和可變輕（VL）鏈，或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 31和SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體； 分別含有SEQ ID NO: 37和SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體；或者 分別含有SEQ ID NO: 39和SEQ ID NO: 40的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體，或者 分別含有SEQ ID NO: 128和SEQ ID NO: 130的胺基酸序列的在第一結合臂中的VH鏈和VL鏈，或其功能變體，以及分別含有SEQ ID NO: 132和SEQ ID NO: 134的胺基酸序列的在第二結合臂中的VH鏈和VL鏈，或其功能變體。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段包含： 分別含有SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體，或者 分別含有SEQ ID NO: 128和SEQ ID NO: 130的胺基酸序列的在第一結合臂中的VH鏈和VL鏈，或其功能變體，以及分別含有SEQ ID NO: 132和SEQ ID NO: 134的胺基酸序列的在第二結合臂中的VH鏈和VL鏈，或其功能變體。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段結合OVCAR4細胞系。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 41的胺基酸序列的重鏈恒定區。
  9. 如請求項1至7中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 52的胺基酸序列的重鏈恒定區。
  10. 如請求項1至7中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 42的胺基酸序列的輕鏈恒定區。
  11. 如請求項1至7中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 51的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈，或者其中該ADC的抗體或其抗原結合片段係雙特異性抗體或其抗原結合片段，並且包含分別含有SEQ ID NO: 129和SEQ ID NO: 131的胺基酸序列的在第一結合臂中的重鏈和輕鏈，或其功能變體，以及分別含有SEQ ID NO: 133和SEQ ID NO: 135的胺基酸序列的在第二結合臂中的重鏈和輕鏈，或其功能變體。
  12. 如請求項1至7中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 48的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段係單株抗體。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之方法，其中該ADC的抗體或其抗原結合片段係人源化單株抗體。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之方法，其中該ADC的可切割連接子係mp-PEG8-val-ala連接子。
  16. 如請求項2至15中任一項所述之方法，其中該ADC的細胞毒性劑係拓樸異構酶抑制劑、微管溶素衍生物、吡咯并苯并二氮呯、或其組合。
  17. 如請求項2至16中任一項所述之方法，其中該ADC的細胞毒性劑係拓樸異構酶抑制劑。
  18. 如請求項2至17中任一項所述之方法，其中該細胞毒性劑係拓樸異構酶抑制劑，並且其中該ADC的ii) 可切割連接子和iii) 細胞毒性劑包含具有式 I之化合物： 及其鹽和溶劑化物，其中R L係該可切割連接子，該連接子選自： ， 其中Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； 其中X係： ，其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，至少b1或b2 = 0，至少c1或c2 = 0；並且 其中G L係用於連接該抗體或抗原結合片段的連接子；以及 ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團，並且e係0或1。
  19. 如請求項1或18所述之方法，其中R L具有式Ia。
  20. 如請求項19所述之方法，其中Q係： (a) 選自以下的胺基酸殘基：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg、和Trp；或者 (b) 選自以下的二肽殘基： NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Ala- C=O、 NH-Val-Lys- C=O、 NHAla-Lys- C=O、 NH-Val-Cit- C=O、 NH-Phe-Cit- C=O、 NH-Leu-Cit- C=O、 NH-Ile-Cit- C=O、 NH-Phe-Arg- C=O、 NH-Trp-Cit- C=O、和 NH-Gly-Val- C=O；或者 (c) 選自以下的三肽殘基： NH-Glu-Val-Ala- C=O、 NH-Glu-Val-Cit- C=O、 NH-αGlu-Val-Ala- C=O、和 NH-αGlu-Val-Cit- C=O；或者 (d) 選自以下的四肽殘基： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O、以及 NH-Gly-Phe-Gly-Gly C=O。
  21. 如請求項19或20所述之方法，其中a係： (a) 0至3；或 (b) 0或1；或 (c) 0。
  22. 如請求項19至21中任一項所述之方法，其中b1係： (a) 0至8；或 (b) 0；或 (c) 2；或 (d) 3；或 (e) 4；或 (f) 5；或 (g) 8。
  23. 如請求項19至22中任一項所述之方法，其中b2係： (a) 0至8；或 (b) 0；或 (c) 2；或 (d) 3；或 (e) 4；或 (f) 5；或 (g) 8。
  24. 如請求項1和18至23中任一項所述之方法，其中： (a) c1係0或1； (b) c2係0或1；並且 (c) c1和c2中的至少一個係0。
  25. 如請求項1和18至24中任一項所述之方法，其中d係： (a) 0至3；或 (b) 1或2；或 (c) 2；或 (d) 5。
  26. 如請求項1和18至25中任一項所述之方法，其中： (a) a係0，b1係0，c1係1，c2係0並且d係2，並且b2係0、2、3、4、5或8；或者 (b) a係1，b2係0，c1係0，c2係0並且d係0，並且b1係0、2、3、4、5或8；或者 (c) a係0，b1係0，c1係0，c2係0並且d係1，並且b2係0、2、3、4、5或8；或者 (d) b1係0，b2係0，c1係0，c2係0，a和d中的一個係0，並且a和d中的另一個係1或5；或者 (e) a係1，b2係0，c1係0，c2係1，d係2，並且b1係0、2、3、4、5或8。
  27. 如請求項1和18至26中任一項所述之方法，其中G L選自： (G L1-1) (G L6) (G L1-2) (G L7) (G L2) (G L8) (G L3-1) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L9) (G L3-2) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L10) (G L3-3) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L11) (G L3-4) 其中該NO 2基團係視需要的 (G L12) (G L4) 其中Hal = I、Br、Cl (G L13) (G L5) (G L14)
    其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，並且X表示C 1-4烷基。
  28. 如請求項27所述之方法，其中G L選自G L1-1和G L1-2。
  29. 如請求項1或18所述之方法，其中R L具有式Ib，並且： (a) R L1和R L2兩者均為H；或者 (b) R L1係H並且R L2係甲基；或者 (c) R L1和R L2兩者均為甲基；或者 (d) 其中R L1和R L2與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯基團；或者 (e) 其中R L1和R L2與它們所結合的碳原子一起形成環丁烯基團。
  30. 如請求項2所述之方法，其中該ADC具有式IV： L - (D L) p(IV) 或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物， 其中L係該i) 抗體或其抗原結合片段，D L係包含該ii) 可切割連接子和該iii) 細胞毒性劑的藥物連接子單元，並且D L具有式III： 其中R LL係選自以下的可切割連接子： (ia')： ，其中Q和X如請求項1或請求項29中所定義，並且G LL係連接至該抗體或抗原結合片段的連接子；以及 (ib')： ，其中R L1和R L2如請求項1或請求項29中所定義；並且 p係1至20的整數。
  31. 如請求項30所述之方法，其中G LL選自： (G LL1-1) (G LL8-1) (G LL1-2) (G LL8-2) (G LL2) (G LL9-1) (G LL3-1) (G LL9-2) (G LL3-2) (G LL10) (G LL-4) (G LL11) (G LL5) (G LL12) (G LL6) (G LL13) (G LL7) (G LL14)
    其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，並且X表示C 1-4烷基。
  32. 如請求項31所述之方法，其中G LL選自G LL1-1和G LL1-2。
  33. 如請求項30至32中任一項所述之方法，其中該細胞毒性劑對該抗體或抗體結合片段的載藥量（p）係從1至約10的整數。
  34. 如請求項17至33中任一項所述之方法，其中該拓樸異構酶抑制劑係具有式A之化合物： 該化合物呈單個鏡像異構物或呈鏡像異構物富集的形式。
  35. 如請求項18至33中任一項所述之方法，其中該拓樸異構酶抑制劑係具有式VI之化合物： 其中Q如請求項1或請求項19-20所述。
  36. 如請求項1至35中任一項所述之方法，其中該ii) 可切割連接子和iii) 細胞毒性劑一起包含以下化合物： （SG3932）。
  37. 如請求項1至36中任一項所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑包含： a)     第一結合結構域，該第一結合結構域特異性結合PD-1或PD-L1；以及 b)    第二結合結構域，該第二結合結構域特異性結合具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（TIGIT）、含有T-細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域的蛋白質-3（TIM-3）或細胞毒性T-淋巴球相關抗原-4（CTLA 4）。
  38. 如請求項1至37中任一項所述之方法，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 57的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的LCDR3。
  39. 如請求項1至38中任一項所述之方法，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  40. 如請求項1至39中任一項所述之方法，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有與SEQ ID NO: 7的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有與SEQ ID NO: 64的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  41. 如請求項1至40中任一項所述之方法，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的輕鏈。
  42. 如請求項1至41中任一項所述之方法，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有與SEQ ID NO: 63的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈和具有與SEQ ID NO: 65的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。
  43. 如請求項37至42中任一項所述之方法，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的LCDR3。
  44. 如請求項37至43中任一項所述之方法，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有SEQ ID NO: 72的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  45. 如請求項37至43中任一項所述之方法，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有與SEQ ID NO: 72的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有與SEQ ID NO: 74的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  46. 如請求項37至45中任一項所述之方法，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 75的胺基酸序列的輕鏈。
  47. 如請求項37至46中任一項所述之方法，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有與SEQ ID NO: 73的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈和具有與SEQ ID NO: 75的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。
  48. 如請求項37至42中任一項所述之方法，其中該第二結合結構域特異性結合TIM-3。
  49. 如請求項48所述之方法，其中該第二結合結構域特異性結合TIM-3的免疫球蛋白可變（IgV）結構域的C’C’’和DE環或結合TIM-3的IgV結構域的PS結合槽（FG和CC’環）。
  50. 如請求項48或請求項49所述之方法，其中該第二結合結構域包含以下互補決定區（CDR）：分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和89或者分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和90的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  51. 如請求項48至50中任一項所述之方法，其中該第二結合結構域特異性結合選自以下的TIM-3的IgV結構域上的至少一個殘基：TIM-3（SEQ ID NO: 102）的N12、L47、R52、D53、V54、N55、Y56、W57、W62、L63、N64、G65、D66、F67、R68、K69、D71、T75、和E77。
  52. 如請求項51所述之方法，其中該第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的第二重鏈可變結構域（VH）和含有SEQ ID NO: 94的胺基酸序列的第二輕鏈可變結構域（VL）。
  53. 如請求項51所述之方法，其中該第二結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 91的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的第二重鏈可變結構域（VH）和含有與SEQ ID NO: 94的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的第二輕鏈可變結構域（VL）。
  54. 如請求項52或請求項53所述之方法，其中該第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的第二重鏈、和含有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的第二輕鏈。
  55. 如請求項37至42中任一項所述之方法，其中該第二結合結構域特異性結合CTLA-4。
  56. 如請求項55所述之方法，其中該第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 109的胺基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO: 111的胺基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO: 112的胺基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO: 113的胺基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO: 114的胺基酸序列的VL CDR3。
  57. 如請求項55或請求項56所述之方法，其中該第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 105中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 104中列出的胺基酸序列的輕鏈。
  58. 如請求項1至57中任一項所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑係人或人源化雙特異性抗體或其抗原結合片段。
  59. 如請求項1至58中任一項所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑包含IgG重鏈恒定區。
  60. 如請求項59所述之方法，其中該IgG重鏈恒定區包含L234F、L235E和P331S。
  61. 如請求項59或60所述之方法，其中該IgG重鏈恒定區係IgG1重鏈恒定區。
  62. 如請求項1至61中任一項所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑包含無糖基化的Fc區。
  63. 如請求項1至61中任一項所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑包含去糖基化的Fc區。
  64. 如請求項1至61中任一項所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑包含具有減少的岩藻糖基化或係無岩藻糖基化的Fc區。
  65. 如請求項1至64中任一項所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑包含κ輕鏈恒定區。
  66. 如請求項1至64中任一項所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑包含λ輕鏈恒定區。
  67. 如請求項1至66中任一項所述之方法，其中該雙特異性檢查點抑制劑係抗體。
  68. 如請求項67所述之方法，其中該抗體係IgG抗體。
  69. 如請求項68所述之方法，其中該抗體係IgG1抗體。
  70. 如請求項67至69中任一項所述之方法，其中該抗體係人源化的。
  71. 如請求項1至70中任一項所述之方法，其中該癌症包含表現B7-H4的癌細胞。
  72. 如請求項1至71中任一項所述之方法，其中該癌症選自卵巢癌、乳癌、子宮癌、睪丸癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色素瘤、腎細胞癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮頸癌、血液學癌症、子宮內膜癌、膽管細胞癌、NSCLC（鱗狀和/或腺癌）、胃腸癌如胃癌和結直腸癌、和肺癌。
  73. 如請求項1至72中任一項所述之方法，其中該癌症係乳癌，其選自激素受體陽性（HR+）乳癌、人表皮生長因子受體2陽性（HER2+）乳癌和三陰性乳癌（TNBC）。
  74. 如請求項1至72中任一項所述之方法，其中該癌症係同源重組缺陷（HRD）癌症。
  75. 如請求項74所述之方法，其中該癌症包含具有選自以下的HRD基因的突變的一或多種細胞： BRCA1、 BRCA2、 ATM、 BRIP1、 BARD1、 CDK12、 CHEK1、 CHEK2、 FANCL、 PALB2、 PPP2R2A、 RAD51B、 RAD51C、 RAD51D和 RAD54L。
  76. 如請求項75所述之方法，其中該突變的HRD基因選自 BRCA1、 BRCA2、和 ATM 。
  77. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含：1) 抗體-藥物軛合物和2) 雙特異性檢查點抑制劑，其中該抗體-藥物軛合物包含抗體或其抗原結合片段、以及由以下式表示的藥物-連接子： （SG3932）， 並且其中該藥物-連接子與該抗體或其抗原結合片段軛合。
  78. 如請求項77所述之藥物組成物，其中該抗體或其抗原結合片段係抗B7H4抗體。
  79. 如請求項78所述之藥物組成物，其中該抗體或其抗原結合片段結合B7-H4並且包含：含有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  80. 如請求項79所述之藥物組成物，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別含有SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的VH鏈和VL鏈，或其功能變體。
  81. 如請求項80所述之藥物組成物，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 51的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈。
  82. 如請求項80所述之藥物組成物，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有SEQ ID NO: 48的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 44的胺基酸序列的輕鏈。
  83. 如請求項77至82中任一項所述之藥物組成物，其中該雙特異性檢查點抑制劑包含： a)     第一結合結構域，該第一結合結構域特異性結合PD-1或PD-L1；以及 b)    第二結合結構域，該第二結合結構域特異性結合具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體（TIGIT）、含有T-細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域的蛋白質-3（TIM-3）或細胞毒性T-淋巴球相關抗原-4（CTLA 4）。
  84. 如請求項83所述之藥物組成物，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 56的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 57的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 59的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 60的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的LCDR3。
  85. 如請求項84所述之藥物組成物，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有SEQ ID NO: 62的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  86. 如請求項84所述之藥物組成物，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有與SEQ ID NO: 62的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有與SEQ ID NO: 64的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  87. 如請求項84所述之藥物組成物，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 65的胺基酸序列的輕鏈。
  88. 如請求項84所述之藥物組成物，其中該第一結合結構域特異性結合PD-1並且包含具有與SEQ ID NO: 63的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈和具有與SEQ ID NO: 65的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。
  89. 如請求項77至88中任一項所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO: 68的胺基酸序列的HCDR3，該輕鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 70的胺基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO: 71的胺基酸序列的LCDR3。
  90. 如請求項77至89中任一項所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有SEQ ID NO: 72的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  91. 如請求項77至89中任一項所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有與SEQ ID NO: 72的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈可變結構域和具有與SEQ ID NO: 74的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
  92. 如請求項77至91中任一項所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有SEQ ID NO: 73的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO: 75的胺基酸序列的輕鏈。
  93. 如請求項77至91中任一項所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域特異性結合TIGIT並且包含具有與SEQ ID NO: 73的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈和具有與SEQ ID NO: 75的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。
  94. 如請求項77至88中任一項所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域特異性結合TIM-3。
  95. 如請求項94所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域特異性結合TIM-3，並且其中該第二結合結構域特異性結合TIM-3的免疫球蛋白可變（IgV）結構域的C’C’’和DE環或結合TIM-3的IgV結構域的PS結合槽（FG和CC’環）。
  96. 如請求項94或請求項95所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域包含以下互補決定區（CDR）：分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和89或者分別包含SEQ ID NO: 84、85、86、87、88和90的胺基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  97. 如請求項94至96中任一項所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域特異性結合TIM-3的IgV結構域上的表位，並且該等表位包括TIM-3（SEQ ID NO: 102）的N12、L47、R52、D53、V54、N55、Y56、W57、W62、L63、N64、G65、D66、F67、R68、K69、D71、T75和E77。
  98. 如請求項97所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 91的胺基酸序列的重鏈可變結構域（VH）和含有SEQ ID NO: 94的胺基酸序列的輕鏈可變結構域（VL）。
  99. 如請求項98所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 92的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的輕鏈。
  100. 如請求項77至88中任一項所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域特異性結合CTLA-4。
  101. 如請求項100所述之藥物組成物，其中該第二結合結構域包含含有SEQ ID NO: 109的胺基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO: 110的胺基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO: 111的胺基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO: 112的胺基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO: 113的胺基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO: 114的胺基酸序列的VL CDR3。
  102. 如請求項100或請求項101所述之藥物組成物，其中該雙特異性檢查點抑制劑包含含有SEQ ID NO: 105中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO: 104中列出的胺基酸序列的輕鏈。
  103. 一種套組，該套組包含如請求項77至102中任一項所述之藥物組成物。
  104. 抗體-藥物軛合物在製造用於與雙特異性檢查點抑制劑組合使用的藥物中之用途，其中該抗體-藥物軛合物和該雙特異性檢查點抑制劑如請求項1至102中任一項所定義的用於治療癌症。
  105. 雙特異性檢查點抑制劑在製造用於與抗體-藥物軛合物組合使用的藥物中之用途，其中該雙特異性檢查點抑制劑和該抗體-藥物軛合物如請求項1至102中任一項所定義的用於治療癌症。
  106. 如請求項88至102中任一項所述之藥物組成物，該藥物組成物用於治療癌症。
  107. 如請求項104至106中任一項所述之用途，其中該癌症選自卵巢癌、乳癌、子宮癌、睪丸癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色素瘤、腎細胞癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮頸癌、血液學癌症、子宮內膜癌、膽管細胞癌、NSCLC（鱗狀和/或腺癌）、胃腸癌如胃癌和結直腸癌、和肺癌。
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