TW202342068A - 製備高濃度液體原料藥之方法 - Google Patents

製備高濃度液體原料藥之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202342068A
TW202342068A TW112107029A TW112107029A TW202342068A TW 202342068 A TW202342068 A TW 202342068A TW 112107029 A TW112107029 A TW 112107029A TW 112107029 A TW112107029 A TW 112107029A TW 202342068 A TW202342068 A TW 202342068A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
solution
concentration
oligonucleotide compound
oligonucleotide
salt
Prior art date
Application number
TW112107029A
Other languages
English (en)
Inventor
納迷塔 史旺特
賽 普拉尚 查瑪西
亞諾 Ｊ 麥奧利
史瓦葛特 薩胡
Original Assignee
美商安進公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商安進公司 filed Critical 美商安進公司
Publication of TW202342068A publication Critical patent/TW202342068A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本文提供了製備包含寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物之方法。在示例性實施方式中，該方法包括藉由滲濾將起始溶液中的寡核苷酸化合物交換至滲濾（DF）溶液中以獲得中間溶液，其中該起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低並且該DF溶液包含一或多種鹽；以及藉由超濾將該中間溶液中的寡核苷酸化合物濃縮以獲得高濃度液體組成物，其中該高濃度液體組成物中的寡核苷酸化合物的濃度大於約150 mg/mL。

Description

製備高濃度液體原料藥之方法
無
寡核苷酸藥物產品正在增加，因為獲批用於商業治療用途的寡核苷酸數量在過去五年中增加了超過一倍，並且在過去十年中開發中的寡核苷酸項目數量增加了兩倍（Muslehiddinoglu等人, Nucleic Acid Therapeutics [核酸療法] 30(4): 189-197 (2020)）。目前市場上所有寡核苷酸藥物產品都配製用於腸胃外投與，包括玻璃體內、靜脈內、鞘內、肌內或皮下投與。對於許多產品來說，用於藥物產品（DP）製造的寡核苷酸原料藥（DS）係凍乾粉末。凍乾原料藥易於運輸和儲存，微生物生長風險低，並且在冷藏和冷凍條件下表現出超過三年的穩定性。然而，凍乾係一種能源密集、耗時且昂貴的製程。從批次產量和循環時間的角度來看，凍乾可以使製造製程增加多達五天的時間，從而降低了整個製程的效率。此外，由於凍乾藥物產品需要用配製緩衝液進行重構、溶解、複合（compounding）和稀釋，因此當包括凍乾時，製造製程的整體複雜性會增加（Muslehiddinoglu等人, 2020, 同上）。
圖1A中示出了來自粉末（凍乾）DS的寡核苷酸化合物的傳統製造製程之流程圖。將寡核苷酸DS製造為可以在2°C-8°C或-20°C下儲存的凍乾粉末。在DP製造製程中，DS粉末被解凍到受控室溫。解凍後，粉末被稱重並轉移到複合容器中，以與配製緩衝液進一步重構到期望的濃度，然後進行充分混合，以製造可以進行過濾和填充操作的半成品（final bulk）藥物產品。
作為凍乾粉末的替代物，寡核苷酸DS水溶液已被認為是更有效的製造到投與途徑（Muslehiddinoglu等人, 2020, 同上）。液體DS溶液將允許更簡單的DP製造製程流程，其涉及解凍冷凍DS溶液，然後進行混合，過濾和填充製程，而無需粉末處理和重構。圖1B中示出了來自液體原料藥的寡核苷酸化合物的示例性製造製程之流程圖。除了簡化了整個製造製程外，製造成本也會降低。
溶液DS和DP並非沒有挑戰，因為可能會出現穩定性問題和微生物污染風險。大量溶液的運輸也可能導致複雜的供應鏈問題，尤其是在冷凍儲存溶液的情況下。另外，溶液DS或DP的製造典型地涉及超濾/滲濾（UF/DF）。與UF/DF相關的挑戰可能包括通量低，製程時間長，機械回收率和損失，操作員干預或處理密集，傳質速率低，能源效率低以及濃縮設備的液壓限制。雖然用UF/DF可以在溶液中實現40-150 mg/mL的活性藥物成分（API）濃度（Muslehiddinoglu等人, 2020, 同上），但寡核苷酸與膜相互作用導致膜污染，其限制了用UF/DF可實現的寡核苷酸化合物的最大濃度。較高的目標API濃度可能會導致膜污染，使得水和較小離子通過膜的轉移減慢，如果完全不對目標API濃度的實現加以阻止，這會進而使得達到期望濃度的時間變長。增加UF/DF中使用的膜的截留分子量（MWCO）可以促進該製程，但也可能導致寡核苷酸的回收率降低。該等挑戰可能限制了使用液體DS製造高濃度寡核苷酸DP的實現。
因此，需要一種用於製備作為液體組成物（例如，溶液）的高濃度寡核苷酸化合物（例如寡核苷酸DS）之新製程。例如，該製程可以製備包含濃度大於約150 mg/mL的寡核苷酸化合物的液體組成物。理想情況下，這樣的製程會避免對凍乾的需要，從而無需對DS粉末進行重構和溶解。
本文呈現了證實用於製備包含寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物之方法的可行性的數據。如本文所詳述，該方法實現了包含濃度高達約150 mg/mL的寡核苷酸化合物的液體組成物的製備，並且在各種情況下，該方法實現了甚至更高的寡核苷酸化合物濃度。如本文所述，例如，該方法獲得了包含如下濃度的寡核苷酸化合物的液體組成物：大於約150 mg/mL、大於約160 mg/mL、大於約170 mg/mL、大於約180 mg/mL、大於約190 mg/mL、大於約200 mg/mL、大於約210 mg/mL、大於約220 mg/mL、或大於約230 mg/mL。
不受特定理論的束縛，這樣的高濃度液體組成物的獲得至少部分歸因於在超濾期間包含寡核苷酸化合物的溶液，在示例性方面，這涉及該方法中使用的滲濾（DF）溶液。不受理論的束縛，在超濾期間包含寡核苷酸化合物的溶液、或用於滲濾的DF溶液包含以穩定寡核苷酸化合物和/或增加其流體動力學直徑的方式與寡核苷酸化合物相互作用的一或多種鹽。不受特定理論的束縛，溶液（例如DF溶液）的一或多種鹽經由氫鍵、金屬配位、靜電相互作用與寡核苷酸化合物的氧原子和/或硫原子相互作用。不受特定理論的束縛，寡核苷酸化合物與一或多種鹽之間的相互作用越多，可以實現的寡核苷酸化合物濃度就越高。此類相互作用與該方法中使用的膜的污染的消除或最小化相關。
因此，本文提供了用於製備包含寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物之方法，其中該液體組成物包含如下濃度的寡核苷酸化合物：大於約150 mg/mL、大於約160 mg/mL、大於約170 mg/mL、大於約180 mg/mL、大於約190 mg/mL、大於約200 mg/mL、大於約210 mg/mL、大於約220 mg/mL。在示例性實施方式中，製備高濃度液體組成物之方法包括：(a) 在包含一或多種鹽的第一溶液中製備寡核苷酸化合物，其中該第一溶液中的該寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低，並且該第一溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM，以及 (b) 藉由超濾將該第一溶液濃縮以獲得高濃度液體組成物，該液體組成物包含濃度約150 mg/mL或更高的寡核苷酸化合物。在各個方面，第一溶液藉由用DF溶液滲濾來製備。在各個方面，除第一溶液包含寡核苷酸化合物而DF溶液不包含寡核苷酸化合物外，第一溶液與DF溶液係相同的。在各種情況下，滲濾實現了將包含約140 mg/mL或更低的寡核苷酸化合物的起始溶液交換至包含一或多種鹽且具有25 mM至約800 mM的總鹽濃度的DF溶液中。因此，在示例性實施方式中，製備高濃度液體組成物之方法包括：(a) 藉由滲濾將起始溶液中的寡核苷酸化合物交換至DF溶液中以獲得中間溶液，其中該起始溶液中的該寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低，並且該DF溶液包含一或多種鹽，以及 (b) 藉由超濾將該中間溶液中的該寡核苷酸化合物濃縮以獲得高濃度液體組成物，其中該高濃度液體組成物中的該寡核苷酸化合物的濃度係約150 mg/mL或更高。在示例性情況下，DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM。在示例性情況下，該方法包括藉由切向流過濾進行的連續滲濾和/或超濾。在各個方面，該方法採用聚醚碸（PES）膜或穩定的纖維素膜進行滲濾和/或超濾。視需要，膜的截留分子量（MWCO）小於10 kDa，並且在示例性情況下，MWCO係約5 kDa或約3 kDa。
本文還提供了藉由超濾將包含低濃度的寡核苷酸化合物的第一溶液濃縮以獲得包含高濃度的寡核苷酸化合物的第二溶液之方法，其中該第二溶液的寡核苷酸化合物濃度大於約150 mg/mL、大於約160 mg/mL、大於約170 mg/mL、大於約180 mg/mL、大於約190 mg/mL、大於約200 mg/mL、大於約210 mg/mL、大於約220 mg/mL。在示例性方面，第一溶液的寡核苷酸化合物濃度小於約140 mg/mL、小於約130 mg/mL、小於約120 mg/mL、小於約110 mg/mL、小於約100 mg/mL、小於約90 mg/mL、小於約80 mg/mL、小於約70 mg/mL、小於約60 mg/mL、或小於約50 mg/mL。在各個方面，第二溶液係超濾後獲得的滲餘物。在各個方面，滲餘物在超濾1或2小時後獲得。在示例性情況下，寡核苷酸化合物係雙股的。在示例性情況下，第一溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM。視需要，第一溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM或約25 mM至約250 mM。在各個方面，第一溶液只包含一種鹽。視需要，該一種鹽係無機鹽，例如，本文所述之無機鹽中的任一種。在各個方面，第一溶液不包含任何醋酸鹽。在示例性情況下，濃縮之方法在用DF溶液滲濾後進行。在各個方面，除第一溶液包含寡核苷酸化合物而DF溶液不包含寡核苷酸化合物外，第一溶液與DF溶液係相同的。在各種情況下，滲濾用包含一或多種鹽的DF溶液進行，並且DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM或約25 mM至約250 mM。在示例性方面，濃縮之方法在用DF溶液滲濾前進行。在各種情況下，寡核苷酸化合物係雙股寡核苷酸化合物，視需要，siRNA。
本文進一步提供了製備包含寡核苷酸化合物API的溶液API之方法，其中該寡核苷酸化合物API以大於150 mg/mL的濃度存在於溶液中。在各個方面，寡核苷酸化合物API係雙股的，視需要，siRNA。在示例性實施方式中，製備溶液API之方法包括本文揭露的藉由超濾將包含低濃度的寡核苷酸化合物的第一溶液濃縮以獲得包含高濃度的寡核苷酸化合物的第二溶液之方法。在各種情況下，製備溶液API之方法包括 (i) 藉由例如固相合成來合成寡核苷酸化合物、或其股，(ii) 進行層析法、滲濾和退火中的一或多種，以及 (iii) 根據本文揭露的藉由超濾將包含低濃度的寡核苷酸化合物的第一溶液濃縮以獲得包含高濃度的寡核苷酸化合物的第二溶液之方法藉由超濾進行濃縮。在各個方面，第二溶液的寡核苷酸化合物濃度大於約150 mg/mL、大於約160 mg/mL、大於約170 mg/mL、大於約180 mg/mL、大於約190 mg/mL、大於約200 mg/mL、大於約210 mg/mL、大於約220 mg/mL，並且第一溶液的寡核苷酸化合物濃度小於約140 mg/mL、小於約130 mg/mL、小於約120 mg/mL、小於約110 mg/mL、小於約100 mg/mL、小於約90 mg/mL、小於約80 mg/mL、小於約70 mg/mL、小於約60 mg/mL、或小於約50 mg/mL。在各個方面，第二溶液係超濾後獲得的滲餘物。在各個方面，滲餘物在超濾1或2小時後獲得。在製備包含寡核苷酸化合物API的溶液API之方法的示例性方面，在方法期間的任何時候都不凍乾寡核苷酸API。有利地，製備溶液API之方法係無需任何凍乾的方法。因此，本揭露的製備溶液API之方法無需凍乾，並且提供了更具時間和成本效益的製備寡核苷酸化合物API之方式。在各種情況下，將藉由本文揭露的方法製備的溶液API直接用於製備包含寡核苷酸化合物API的溶液DP。視需要，溶液API係無菌過濾的，並且將其填充至小瓶或預填充注射器或自動注射器中。因此，提供了生產包含含有寡核苷酸化合物API的溶液API的DP（例如，溶液DP）之方法。在各個方面，生產DP之方法無需任何凍乾。在生產DP之方法的各個方面，在方法期間的任何時間都不進行寡核苷酸化合物API的凍乾。
在示例性方面，本揭露的方法產生高濃度液體組成物，其中該高濃度液體組成物中的該寡核苷酸化合物的濃度係約150 mg/mL或更高。在示例性方面，藉由本文揭露的方法獲得的高濃度液體組成物包含大於80%的起始溶液的寡核苷酸化合物。在示例性情況下，該方法實現了70%或80%的起始溶液的寡核苷酸化合物回收率。在示例性方面，膜通量在方法期間，例如，在滲濾和/或超濾期間基本上維持。在各種情況下，膜通量基本上維持至少6小時、至少8小時、或大於9小時。在示例性方面，在方法期間，例如，在滲濾和/或超濾期間，發生很少的膜污染或不發生膜污染。在示例性情況下，獲得了包含濃度約150 mg/mL或更高的寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物，並且膜通量降低不超過穩態膜通量的50%，視需要維持至少4小時或更長時間。
本揭露還提供了藉由本揭露的方法製備的高濃度液體組成物。在各種情況下，高濃度液體組成物包含如下濃度的寡核苷酸化合物：約150 mg/mL或更高，例如，約175 mg/mL、約180 mg/mL、約185 mg/mL、約190 mg/mL、約195 mg/mL、約200 mg/mL、約205 mg/mL、約210 mg/mL、約215 mg/mL、約220 mg/mL、約225 mg/mL、約230 mg/mL、約235 mg/mL、約240 mg/mL、約245 mg/mL、約250 mg/mL或更高。另外提供了藉由將本文揭露的液體組成物儲存在低於0°C的溫度下製備的冷凍製劑。在示例性方面，冷凍製劑不是凍乾或冷凍乾燥的製劑。
本揭露進一步提供了製造包含寡核苷酸化合物的藥物之方法。在示例性實施方式中，該方法包括進行本揭露的方法以獲得包含大於約150 mg/mL的寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物，將該高濃度液體組成物與藥學上可接受的賦形劑一起配製，以及將該配製的高濃度液體組成物填充至容器中。
此外提供了治療患有疾病的受試者之方法。在示例性實施方式中，該方法包括以有效治療該受試者的該疾病的量向該受試者投與本揭露的液體組成物，例如，液體DP。視需要，該藥物藉由注射或輸注投與。
此外提供了本揭露的高濃度液體組成物在製造用於治療受試者疾病的藥物中之用途。
相關申請的交叉引用
根據35 U.S.C. §119(e)特此要求2022年2月25日提交的美國臨時專利申請案號63/313,840的權益，並且將其揭露內容藉由引用特此併入本文。 藉由引用併入以電子方式提交的材料
藉由引用以其全文併入的係與本文同時提交的電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表，並且其標識如下：名稱為「A-2897-WO01-SEC_Seq_Listing.xml」的20.5 KB文件；創建於2023年2月17日。
本文提供了用於製備包含寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物之方法。在示例性實施方式中，該方法需要製備包含高濃度（例如，大於或約150 mg/mL）的寡核苷酸化合物的液體組成物，並且該方法包括：(a) 製備包含寡核苷酸化合物和一或多種鹽的第一溶液，其中第一溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低，並且第一溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM，以及 (b) 藉由超濾將第一溶液濃縮以獲得包含濃度大於約150 mg/mL的寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物。在各個方面，第一溶液藉由滲濾製備，其中將起始溶液中的寡核苷酸化合物交換至第一溶液或滲濾（DF）溶液中以獲得中間溶液，然後將中間溶液藉由超濾濃縮以獲得高濃度液體組成物。在各個方面，除第一溶液包含寡核苷酸化合物而DF溶液不包含寡核苷酸化合物外，第一溶液與DF溶液係相同的。第一溶液可以與本文所述之任何DF溶液相同，但還包括低濃度（例如，小於約140 mg/mL）的寡核苷酸化合物。在示例性實施方式中，該方法包括：(a) 藉由滲濾將起始溶液中的寡核苷酸化合物交換至滲濾（DF）溶液中以獲得中間溶液，其中起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低，並且DF溶液包含一或多種鹽，以及 (b) 藉由超濾將中間溶液中的寡核苷酸化合物濃縮以獲得高濃度液體組成物，其中該高濃度液體組成物中的寡核苷酸化合物的濃度係約150 mg/mL或更高。在示例性方面，藉由本文揭露的方法獲得的高濃度液體組成物包含如下濃度的寡核苷酸化合物：約150 mg/mL或更高，例如，約160 mg/mL或更高、約170 mg/mL或更高、約180 mg/mL或更高、約190 mg/mL或更高、約200 mg/mL或更高、約210 mg/mL或更高、約220 mg/mL或更高、約230 mg/mL或更高、約240 mg/mL或更高、約250 mg/mL或更高、約260 mg/mL或更高、約270 mg/mL或更高、約280 mg/mL或更高、約290 mg/mL或更高、約300 mg/mL或更高。在示例性情況下，本文揭露的方法實現了對起始溶液中存在的寡核苷酸化合物的高回收率。在各種情況下，該方法實現了至少70%或至少80%的起始溶液的寡核苷酸化合物回收率。在各個方面，該方法實現了對起始溶液中存在的寡核苷酸化合物的至少85%（例如，至少90%、至少95%、至少98%）的回收率。在示例性方面，藉由本文揭露的方法獲得的高濃度液體組成物包含大於80%的起始溶液中存在的寡核苷酸化合物。在各種情況下，藉由本文揭露的方法獲得的高濃度液體組成物包含大於85%（例如，大於90%、大於95%、大於98%）的起始溶液中存在的寡核苷酸化合物。不受理論的束縛，本揭露的方法實現了如此高水平的寡核苷酸化合物回收率，以及獲得的液體組成物中的如此高的寡核苷酸化合物濃度，因為在沒有實質性膜污染的情況下，發生滲濾和/或超濾。在各種情況下，膜通量在滲濾和/或超濾期間基本上維持。在各個方面，膜通量基本上維持至少6小時、至少8小時、至少10小時、至少12小時、或更長時間。在各個方面，膜通量在滲濾和/或超濾期間達到穩態水平並且降低不超過50%（視需要，不超過60%、不超過70%、不超過80%、不超過90%）。鑒於膜通量基本上維持而沒有實質性膜污染，本揭露的方法有利地更有效。在各個方面，與因實質性膜污染而減慢的不同方法相比，維持的膜通量以及無實質性膜污染導致在更短的時間段內獲得高濃度液體組成物。因此，本揭露的方法有利地具有以下特點：用更短的製程時間獲得高濃度液體組成物。在各個方面，獲得高濃度液體組成物的製程時間係小於36小時、小於32小時、小於30小時、小於28小時、小於26小時、小於24小時、小於22小時、小於20小時、小於18小時、小於16小時、小於14小時、小於12小時、或小於10小時。不受任何特定理論的束縛，本揭露的方法提供了將包含寡核苷酸化合物的起始溶液緩衝液交換至DF溶液中並且將DF溶液中的寡核苷酸化合物濃縮的有效方式，該方式沒有任何實質性膜污染，沒有顯著損失寡核苷酸化合物（例如，具有良好的寡核苷酸化合物回收率），並且/或者在相對短的時間段（例如，約10小時或更少）內完成。本文揭露的方法有利地避免了對能源密集且耗時的寡核苷酸化合物凍乾的需要，並且因此更有效。
在示例性實施方式中，該方法包括藉由滲濾將起始溶液中的寡核苷酸化合物交換至滲濾（DF）溶液中以獲得中間溶液。在各個方面，寡核苷酸化合物最初存在於包含第一組分或第一組分組的起始溶液中，並且該方法包括將寡核苷酸化合物從起始溶液轉移到滲濾溶液中，該滲濾溶液與起始溶液的組成不同並且包含不同的組分或組分組。在各個方面，從起始溶液至滲濾溶液的這一交換在本領域稱為「緩衝液交換」，並且藉由滲濾實現。術語「滲濾」或「DF」係指用於將大分子產物從一種溶液或緩衝液交換至另一種溶液或緩衝液的製程。通常採用DF進行緩衝液交換。在各個方面，進行滲濾以將起始溶液交換為DF溶液（所以寡核苷酸化合物最初存在於起始溶液中並且有效轉移至DF溶液中）以獲得中間溶液。在各個方面，中間溶液包含寡核苷酸化合物和DF溶液。視需要，中間溶液包含起始溶液中存在的寡核苷酸化合物的量的至少70%。在各個方面，中間溶液包含起始溶液中存在的寡核苷酸化合物的量的至少75%、至少80%、至少85%、或至少90%。在各種情況下，滲濾實現了至少70%或至少80%的起始溶液的寡核苷酸化合物回收率。在各個方面，該方法實現了對起始溶液中存在的寡核苷酸化合物的至少85%（例如，至少90%、至少95%、至少98%）的回收率。
在示例性實施方式中，該方法包括將中間溶液中的寡核苷酸化合物濃縮。在示例性實施方式中，該方法包括藉由濃縮來提高中間溶液的寡核苷酸化合物的濃度，並且濃縮藉由超濾實現。術語「超濾」或「UF」係指出於將包含大分子化合物的溶液脫鹽或濃縮之目的，使用膜將小分子組分（例如，水、陽離子、陰離子）與大分子化合物分離的製程。
本領域已充分描述了UF和DF。參見，例如，Millipore Mechanical Brief: Protein Concentration and Diafiltration by Tangential Flow Filtration [Millipore機械簡介：藉由切向流過濾的蛋白質濃縮和滲濾]，可在chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/viewer.html?pdfurl=http%3A%2F%2Fwolfson.huji.ac.il%2Fpurification%2FPDF%2Fdialysis%2FMILLIPORE_TFF.pdf&clen=2842762&chunk=true獲得。參見，例如，Cheryan, M. Ultrafiltration Handbook [超濾手冊], Technomic Publishing Co., Inc. [經濟技術出版有限公司], 賓夕法尼亞州 (1986)；Koros等人, Pure & Appl Chem [純粹與應用化學] 68: 1479-1489；Ng等人, Separation Science [分離科學] 2: 499-502 (1976)；Tkacik和Michaels, Bio/Technol [生物技術] 9: 941-946 (1991)；van Reis等人, Biotech Bioeng [生物技術與生物工程] 56: 71-82 (1997)；van Reis等人, J Membrane Sci [膜科學雜誌] 130: 123-140 (1997)；van Reis和Zydney, Protein Ultrafiltration [蛋白質超濾], 於M.C. Flikinger, S.W. Drew (編輯), Encyclopedia of Bioprocess Technology [生物製程技術百科全書]中, John Wiley and Sons, Inc. [約翰威立父子公司], 紐約 (1999)；Zeman和Zydney, Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications [微濾和超濾：原理和應用], Marcel Dekker [馬塞爾德克爾公司], 紐約 (1996)；美國專利申請公開案號2006/0051347和2014/0370003；Maruthamuthu等人, Trends in Biotechnology [生物技術趨勢], 38(10): 1169-1186 (2020)；Kovács, Z. (2016). Continuous Diafiltration: Cocurrent and Countercurrent Modes [連續滲濾：並流和逆流模式]. 於：Drioli, E., Giorno, L. (編輯) Encyclopedia of Membranes [膜百科全書]. Springer [施普林格公司], 柏林, 海德堡.https://doi.org/10.1007/978-3-662-44324-8_638；以及Schwartz, L., Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications [實驗室和製程開發應用中的切向流過濾介紹]，將該等文獻中的每一個的內容藉由引用併入本文。在各個方面，在圖2中示出的示例性UF/DF系統中進行DF和UF。在各個方面，UF/DF系統包含使溶液沿箭頭方向移動的泵（未在圖2中示出）。在示例性情況下，在將DF溶液添加到滲餘物容器中的起始溶液中以產生混合物時，泵使滲餘物容器中的溶液移動穿過膜以獲得包含寡核苷酸化合物的滲餘物、以及滲透物。泵使滲余物向滲餘容器移動，並使滲透物向滲透物容器移動。溶液以這種方式繼續移動，直到添加到滲餘物容器中的DF溶液的體積與滲透物容器中收集的滲透物的體積基本相同。在各種情況下，添加到滲餘物容器中的DF溶液的體積約為起始溶液的體積的3倍。視需要，DF溶液的體積約為起始溶液的體積的4倍或5倍。在各個方面，起始溶液的體積稱為「滲濾體積」，並且視需要，添加至滲餘物容器中的DF溶液的體積係3、4或5個滲濾體積。在各種情況下，添加至滲餘物容器中的DF溶液的體積係6、7、8、9、或10個滲濾體積。總體上，滲濾體積的數量越大，經由滲濾完成的交換百分比就越高。在示例性情況下，該方法包括藉由切向流過濾進行的連續滲濾和/或超濾。在各個方面，採用膜進行滲濾和超濾。在各種情況下，使用了包含乙酸纖維素、聚偏二氟乙烯（PVDF）、或聚醚碸（PES）的膜。視需要，用於滲濾和/或超濾的膜係聚醚碸（PES）膜或穩定的纖維素膜。在各個方面，膜的截留分子量（MWCO）小於10 kDa，並且在示例性情況下，MWCO係約5 kDa。在各個方面，膜係具有3 kDa MWCO的纖維素膜。因此，在示例性方面，該方法包括 (a) 將包含一或多種鹽的滲濾（DF）溶液添加至包含濃度為140 mg/mL或更低的寡核苷酸化合物的起始溶液中以產生混合物；(b) 使混合物穿過膜以獲得滲餘物和滲透物，其中滲餘物包含寡核苷酸化合物，以及 (c) 減少滲餘物的體積以獲得最終滲餘物，其中最終滲餘物中寡核苷酸化合物的濃度係至少約150 mg/mL。在各種情況下，在 (a) 之前，起始溶液容裝在滲餘物容器中，並且該方法包括將DF溶液添加至滲餘物容器中以產生混合物。視需要，從DF溶液容器中將DF溶液添加至滲餘物容器中以產生混合物。在示例性實施方式中，DF溶液的總體積在至少30分鐘、至少60分鐘、至少2小時、至少4小時、至少6小時或至少8小時內添加。在各個方面，該方法包括 (b1) 使滲餘物流至滲餘物容器並且使滲透物流至滲透物容器，其中將滲餘物容器中的滲餘物與DF溶液和起始溶液混合以產生摻和物。在各種情況下，該方法包括 (b2) 使摻和物穿過膜以獲得滲餘物和滲透物。視需要，該方法包括重複 (b1) 和 (b2) 至少一次或兩次，或者重複 (b1) 和 (b2) 至少兩次或更多次，直到滲透物容器中的滲透物的體積與添加至滲餘物容器中的DF溶液的體積基本相同。在各個方面，(a)、(b)、(b1)、和 (b2) 中的兩個或更多個同時發生。在示例性方面，DF溶液容器、滲餘物容器、滲透物容器、和膜係超濾/滲濾（UF/DF）系統的一部分。在某些方面，UF/DF系統進一步包含泵，並且泵使 (i) DF溶液從DF溶液容器移動到滲餘物容器，(ii) 滲餘物容器的溶液移動穿過膜，(iii) 滲餘物從膜移動到滲餘物容器，(iv) 滲透物移動到滲透物容器，或 (v) 其組合。視需要，DF溶液移動到滲餘物容器中的速率與滲透物的收集速率相似或相同。在各個方面，該方法包括包括當滲透物容器中收集的滲透物的體積與從DF溶液容器移動到滲餘物容器中的DF溶液的體積基本相同時，減少滲餘物容器中的溶液的體積。在各種情況下，藉由使DF溶液從DF溶液容器向滲餘物容器的移動停止來減少滲餘物容器中的溶液的體積。視需要，該膜係膜包的一部分。本揭露的方法包括減少滲餘物容器中的滲餘物的體積以獲得最終滲餘物。在各個方面，經由超濾來減少體積，其中滲餘物的體積藉由如下來減少：在不將DF溶液輸送至滲餘物容器的情況下使滲餘物移動至/穿過膜，同時在滲透物容器中收集滲透物。滲透物容器中收集的滲透物的體積與輸送至滲餘物容器的DF溶液的體積相當，並且最終滲餘物中的寡核苷酸的濃度係150 mg/mL或更高。在示例性方面，滲餘物的體積相對於起始溶液的體積減少至少50%。在各種情況下，該方法包括減少滲餘物的體積以獲得最終滲餘物，其中最終滲餘物中寡核苷酸化合物的濃度大於或約為150 mg/mL。在各個方面，最終滲餘物包含如下濃度的寡核苷酸化合物：至少155 mg/mL、至少160 mg/mL、至少165 mg/mL、至少170 mg/mL、至少175 mg/mL、至少180 mg/mL、至少185 mg/mL、至少190 mg/mL、至少195 mg/mL、或至少200 mg/mL。在各種情況下，最終滲餘物包含如下濃度的寡核苷酸化合物：至少210 mg/mL、至少220 mg/mL、至少230 mg/mL或更高。在各種情況下，最終滲餘物包含如下濃度的寡核苷酸化合物：至少250 mg/mL、至少275 mg/mL、至少300 mg/mL、至少325 mg/mL、至少350 mg/mL、至少375 mg/mL、至少400 mg/mL或更高。視需要，最終滲餘物的寡核苷酸化合物的濃度比起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度高至少2倍。在各個方面，最終滲餘物的寡核苷酸化合物的濃度比起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度高至少3倍或至少4倍。在示例性情況下，最終滲餘物的寡核苷酸化合物的濃度比起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度高至少5倍。
本文揭露的用於製備寡核苷酸化合物的高濃度液體之方法使用起始溶液和DF溶液。在各個方面，起始溶液包含的寡核苷酸化合物的濃度低於高濃度液體組成物的濃度。在各個方面，起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度小於150 mg/mL、小於140 mg/mL、小於130 mg/mL、小於120 mg/mL、小於110 mg/mL、小於100 mg/mL、小於90 mg/mL、小於80 mg/mL、小於70 mg/mL、小於60 mg/mL、或小於50 mg/mL（例如，小於45 mg/mL、小於40 mg/mL、小於35 mg/mL、小於30 mg/mL、小於25 mg/mL、小於20 mg/mL、小於15 mg/mL、小於10 mg/mL、小於5 mg/mL）。在各個方面，起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係約30 mg/mL至約140 mg/mL、約30 mg/mL至約130 mg/mL、約30 mg/mL至約120 mg/mL、約30 mg/mL至約110 mg/mL、約30 mg/mL至約100 mg/mL、約30 mg/mL至約90 mg/mL、約30 mg/mL至約80 mg/mL、約30 mg/mL至約70 mg/mL、約30 mg/mL至約60 mg/mL、約30 mg/mL至約50 mg/mL、約30 mg/mL至約40 mg/mL、約40 mg/mL至約140 mg/mL、約50 mg/mL至約140 mg/mL、約60 mg/mL至約140 mg/mL、約70 mg/mL至約140 mg/mL、約80 mg/mL至約140 mg/mL、約90 mg/mL至約140 mg/mL、約100 mg/mL至約140 mg/mL、約110 mg/mL至約140 mg/mL、約120 mg/mL至約140 mg/mL、或約130 mg/mL至約140 mg/mL。在各個方面，起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係約30 mg/mL至約100 mg/mL。在各個方面，起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係約50 mg/mL至約140 mg/mL、約50 mg/mL至約130 mg/mL、約50 mg/mL至約120 mg/mL、約50 mg/mL至約110 mg/mL、約50 mg/mL至約100 mg/mL、約50 mg/mL至約90 mg/mL、約50 mg/mL至約80 mg/mL、約50 mg/mL至約70 mg/mL、約50 mg/mL至約60 mg/mL、約60 mg/mL至約140 mg/mL、約70 mg/mL至約140 mg/mL、約80 mg/mL至約140 mg/mL、約90 mg/mL至約140 mg/mL、約100 mg/mL至約140 mg/mL、約110 mg/mL至約140 mg/mL、約120 mg/mL至約140 mg/mL、或約130 mg/mL至約140 mg/mL。在各個方面，起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係約50 mg/mL至約100 mg/mL。在示例性情況下，起始溶液包含水或緩衝液。在示例性情況下，起始溶液不含緩衝液。有利地，本揭露的方法不限制於起始溶液的組分。
DF溶液（也可以稱為替換溶液，或在一些情況下，替換緩衝液或滲濾緩衝液）包含至少一種鹽。在各個方面，DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM或約50 mM至約800 mM。在示例性方面，DF溶液的總鹽濃度係約50 mM至約750 mM、約50 mM至約700 mM、約50 mM至約650 mM、約50 mM至約600 mM、約50 mM至約550 mM、約50 mM至約500 mM、約50 mM至約450 mM、約50 mM至約400 mM、約50 mM至約350 mM、約50 mM至約300 mM、約50 mM至約250 mM、約50 mM至約200 mM、約50 mM至約150 mM、約50 mM至約100 mM、約50 mM至約75 mM、約75 mM至約800 mM、約100 mM至約800 mM、約150 mM至約800 mM、約200 mM至約800 mM、約250 mM至約800 mM、約300 mM至約800 mM、約350 mM至約800 mM、約400 mM至約800 mM、約450 mM至約800 mM、約500 mM至約800 mM、約550 mM至約800 mM、約600 mM至約800 mM、約650 mM至約800 mM、約700 mM至約800 mM、或約750 mM至約800 mM。在示例性方面，總鹽濃度小於500 mM。視需要，總鹽濃度係約25 mM至約500 mM、約25 mM至約400 mM、約25 mM至約300 mM、約25 mM至約250 mM、約25 mM至約200 mM、或約25 mM至約150 mM。在各個方面，DF溶液包含含有一價陽離子的無機鹽，基本上由其組成，或由其組成，並且DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM、約25 mM至約400 mM、約25 mM至約300 mM、約25 mM至約250 mM、約25 mM至約200 mM、或約25 mM至約150 mM。在各個方面，總鹽濃度係約75 mM至約500 mM、約75 mM至約400 mM、約75 mM至約300 mM、約75 mM至約250 mM、約75 mM至約200 mM、或約75 mM至約150 mM。在各個方面，DF溶液包含含有一價陽離子的無機鹽，基本上由其組成，或由其組成，並且DF溶液的總鹽濃度係約75 mM至約500 mM、約75 mM至約400 mM、約75 mM至約300 mM、約75 mM至約250 mM、約75 mM至約200 mM、或約75 mM至約150 mM。在各種情況下，DF溶液的總鹽濃度係約125 mM至約500 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度係約150 mM至約500 mM、約175 mM至約500 mM、約200 mM至約500 mM、約225 mM至約500 mM、約250 mM至約500 mM、約275 mM至約500 mM、約300 mM至約500 mM、約325 mM至約500 mM、約350 mM至約500 mM、約375 mM至約500 mM、約400 mM至約500 mM、約425 mM至約500 mM、約450 mM至約500 mM、約475 mM至約500 mM、約125 mM至約475 mM、約125 mM至約450 mM、約125 mM至約425 mM、約125 mM至約400 mM、約125 mM至約375 mM、約125 mM至約350 mM、約125 mM至約325 mM、約125 mM至約300 mM、約125 mM至約275 mM、約125 mM至約250 mM、約125 mM至約225 mM、約125 mM至約200 mM、約125 mM至約175 mM、或約125 mM至約150 mM。在示例性方面，DF溶液的總鹽濃度係約140 mM至約300 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度係約140 mM至約280 mM、約140 mM至約260 mM、約140 mM至約240 mM、約140 mM至約220 mM、約140 mM至約200 mM、約140 mM至約180 mM、約140 mM至約160 mM、約160 mM至約300 mM、約180 mM至約300 mM、約200 mM至約300 mM、約220 mM至約300 mM、約240 mM至約300 mM、約260 mM至約300 mM、或約280 mM至約300 mM。在各種情況下，DF溶液的總鹽濃度係約50 mM至約900 mM、約50 mM至約875 mM、約50 mM至約850 mM、約50 mM至約800 mM、約50 mM至約775 mM、約50 mM至約750 mM、或約50 mM至約700 mM，例如，約60 mM至約700 mM、約70 mM至約700 mM、約80 mM至約700 mM、約90 mM至約700 mM、約100 mM至約700 mM、約110 mM至約700 mM、約120 mM至約700 mM、約130 mM至約700 mM、約140 mM至約700 mM、約150 mM至約700 mM、約160 mM至約700 mM、約170 mM至約700 mM、約180 mM至約700 mM、約190 mM至約700 mM、約200 mM至約700 mM、約210 mM至約700 mM、約220 mM至約700 mM、約230 mM至約700 mM、約240 mM至約700 mM、約250 mM至約700 mM、約260 mM至約700 mM、約270 mM至約700 mM、約280 mM至約700 mM、約290 mM至約700 mM、約300 mM至約700 mM、約310 mM至約700 mM、約320 mM至約700 mM、約330 mM至約700 mM、約340 mM至約700 mM、約350 mM至約700 mM、約360 mM至約700 mM、約370 mM至約700 mM、約380 mM至約700 mM、約390 mM至約700 mM、約400 mM至約700 mM。在各種情況下，DF溶液的總鹽濃度係約100 mM至約900 mM、約200 mM至約900 mM、約300 mM至約900、約400 mM至約900 mM、約500 mM至約900 mM、約600 mM至約900 mM、約700 mM至約900 mM或約800 mM至約900 mM。在各種情況下，DF溶液的總鹽濃度係約100 mM至約700 mM，視需要，約100 mM至約650 mM、約100 mM至約600 mM、約100 mM至約550 mM、約100 mM至約500 mM、約100 mM至約450 mM、約100 mM至約400 mM、約100 mM至約350 mM、約100 mM至約300 mM、約100 mM至約250 mM、約100 mM至約200 mM、約100 mM至約150 mM、約150 mM至約700 mM、約200 mM至約700 mM、約250 mM至約700 mM、約300 mM至約700 mM、約350 mM至約700 mM、約400 mM至約700 mM、約450 mM至約700 mM、約500 mM至約700 mM、約550 mM至約700 mM、約600 mM至約700 mM、或約650 mM至約700 mM。在各個方面，DF溶液的總鹽濃度係約100 mM至約600 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度係約125 mM至約300 mM，視需要，約125 mM至約200 mM或約125 mM至約150 mM。在示例性方面，DF溶液的總鹽濃度係約130 mM至約140 mM。在各種情況下，DF溶液基本上不含鉀。視需要，DF溶液包含鹽（例如，基本鹽）與鉀的莫耳比約為100比1。
在示例性方面，第一溶液或DF溶液包含至少一種鹽，並且DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM或約50 mM至約800 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度小於500 mM，例如，約25 mM至約500 mM。在示例性情況下，DF溶液包含無機鹽，基本上由其組成，或由其組成。如本文所用，術語「無機鹽」係指具有離子鍵但不含有碳氫鍵的任何無機化合物。無機鹽包括但不限於，過渡金屬鹽、鹼金屬鹽、後過渡金屬鹽、類金屬鹽、鹼土金屬鹽、鑭系鹽、銨鹽、鹵素無機鹽、活性非金屬鹽、和氙鹽。合適的無機鹽包括在https://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/80013663/inorganic-salts處描述的目錄中描述的那些中的任一者，並且對於寡核苷酸化合物不是有毒性的或不穩定的。在示例性方面，無機鹽係鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽或銨鹽。在各個方面，鹼金屬鹽係包括元素週期表1a族元素的任何無機鹽。鹼金屬鹽包括例如，氯化鈉、氯化鋰、氯化鉀、溴化鈉、磷酸氫鉀、氫氧化鈉、碳酸鉀、氫氧化銫、氫氧化鋰、氫氧化鉀、磷酸二氫鈉、醋酸鈉、氟化鈉、鈦酸鉀、碳酸鈉、胺基鋰等。在各個方面，鹼土金屬鹽係包括元素週期表2族元素的任何無機鹽。鹼土金屬鹽包括例如，氯化鈣、氯化鎂、氧化鎂、碳酸鈣、氟化鍶、硫酸鋇、鉻酸鈣、DL-甘油酸鈣二水合物、錳酸鋇、矽酸鎂、氫化鈣、四水合硝酸鈣、氯化鍶六水合物、碳酸鎂五水合物、溴化鍶、硫酸鈣二水合物、鈮酸鎂、甲基氯化鎂、硫代硫酸鎂、過氯酸鎂、過氯酸鈣、醋酸鋇等。在示例性情況下，銨鹽係具有銨陽離子的任何無機鹽。銨鹽包括例如，碳酸氫銨、過硫酸銨、碳酸銨、氫氧化銨、甲酸銨、磷酸鈷(II)銨、硫酸銅(II)銨、胺基磺酸銨、草酸銨、過氯酸銨、硝酸銨、溴化銨、重鉻酸銨、磷酸二氫銨等。在各個方面，無機鹽包含一價陽離子。視需要，無機鹽包含鹼金屬，視需要，鈉、鉀、或鋰。在各個方面，無機鹽包含鹵素相對離子，視需要氯離子或溴離子。在各種情況下，無機鹽係氯化鈉、溴化鈉、氯化鉀、或氯化鋰。在一些方面，一價陽離子係銨陽離子，視需要，其中無機鹽係氯化銨。在可替代的方面，無機鹽包含二價陽離子。視需要，二價陽離子係鹼土金屬，視需要，鎂或鈣。在示例性情況下，無機鹽係氯化鎂或氯化鈣。在示例性情況下，DF溶液包含有機鹽，基本上由其組成，或由其組成。如本文所用，術語「有機鹽」係指含有有機離子的鹽，其含有至少一個碳氫鍵並且典型地只包含共價鍵。有機鹽總體上只包含碳、氫、氧、硫、氮、和磷原子中的一或多個。在示例性情況下，有機鹽包含四級銨陽離子。視需要，有機鹽係氯化膽鹼或苄基三甲基氯化銨。在各個方面，DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM、約25 mM至約250 mM、或約25 mM至約150 mM，並且DF溶液包含含有二價陽離子的無機鹽，視需要，氯化鈣或氯化鎂，基本上由其組成，或由其組成。在各種情況下，DF溶液的總鹽濃度係約75 mM至約300 mM、約75 mM至約250 mM、或約75 mM至約200 mM，並且DF溶液包含含有一價陽離子的無機鹽，基本上由其組成，或由其組成。在示例性情況下，DF溶液包含約75 mM至約300 mM氯化鈉、溴化鈉、氯化鋰、氯化鉀、或氯化銨。在各種情況下，DF溶液的總鹽濃度係約100 mM至約300 mM，並且DF溶液包含有機鹽（例如，CCl或BTMACl），基本上由其組成，或由其組成。
在各個方面，DF溶液的總鹽濃度取決於寡核苷酸化合物的淨負電荷數。例如，對於包含41個淨負電荷的寡核苷酸，總鹽濃度係約50 mM至約800 mM，或本文所述之DF溶液的總鹽濃度中的任一者。在各種情況下，將DF溶液的總鹽濃度表示為每負電荷寡核苷酸化合物的濃度（例如，mM）。因此，在各種情況下，當寡核苷酸化合物包含41個淨負電荷時，可以將每淨負電荷的濃度乘以41。例如，在各個方面，DF溶液的總鹽濃度係每負電荷約3.0 mM至18.0 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度係每負電荷約3.0 mM至17.0 mM、約3.0 mM至16.0 mM、約3.0 mM至15.0 mM、約3.0 mM至14.0 mM、約3.0 mM至13.0 mM、約3.0 mM至12.0 mM、約3.0 mM至11.0 mM、約3.0 mM至10.0 mM、約3.0 mM至9.0 mM、約3.0 mM至8.0 mM、約3.0 mM至7.0 mM、約3.0 mM至6.0 mM、約3.0 mM至5.0 mM、約3.0 mM至4.0 mM、約4.0 mM至18.0 mM、約5.0 mM至18.0 mM、約6.0 mM至18.0 mM、約7.0 mM至18.0 mM、約8.0 mM至18.0 mM、約9.0 mM至18.0 mM、約10.0 mM至18.0 mM、約11.0 mM至18.0 mM、約12.0 mM至18.0 mM、約13.0 mM至18.0 mM、約14.0 mM至18.0 mM、約15.0 mM至18.0 mM、約16.0 mM至18.0 mM、或約17.0 mM至18.0 mM。在各個方面，DF溶液的總鹽濃度係每負電荷寡核苷酸化合物至少約3.5 mM、至少約3.6、至少約3.7、至少約3.8、至少約3.9、或至少約4.0。在示例性方面，DF溶液包含一種或兩種鹽。在各種情況下，DF溶液包含超過兩種鹽，視需要，3、4、5、6、或更多種鹽。
在各種情況下，DF溶液包含多於一種鹽，並且一種鹽（以下稱為「基本鹽」）以與DF溶液的其他一或多種鹽相比顯著更高的濃度存在於DF溶液中。可替代地，DF溶液只包含可以被認為是「基本鹽」的一種鹽。在各個方面，DF溶液包含基本鹽以及至少一種其他鹽。在各個方面，基本鹽的濃度比DF溶液中存在的另一種鹽的濃度高至少2倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍。在各種情況下，基本鹽的濃度比DF溶液中存在的另一種鹽的濃度高約10倍。在各個方面，基本鹽的濃度比DF溶液中存在的所有其他鹽的濃度高至少2倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍。在各種情況下，基本鹽的濃度比DF溶液中存在的所有其他鹽的濃度高約10倍。在各種情況下，DF溶液包含緩衝液。在各個方面，緩衝液的pH低於7。在各個方面，緩衝液包含弱酸、共軛鹼、和鹽。在各個方面，緩衝液係磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。在一些方面，DF溶液中的基本鹽的濃度基於起始溶液中存在的寡核苷酸化合物的濃度。例如，起始溶液的寡核苷酸化合物與DF溶液的基本鹽的莫耳比係約1 : 2至約1 : 100或約1 : 2至約1 : 90或約1 : 2至約1 : 80。在各個方面，起始溶液的寡核苷酸化合物與DF溶液的基本鹽的莫耳比係約1 : 3至約1 : 80或約1 : 3至約1 : 75或約1 : 3至約1 : 70。視需要，起始溶液的寡核苷酸化合物與DF溶液的基本鹽的莫耳比係約1 : 5至約1 : 65。例如，莫耳比係約1 : 5至約1 : 60、約1 : 5至約1 : 55、約1 : 5至約1 : 50、約1 : 5至約1 : 45、約1 : 5至約1 : 40、約1 : 5至約1 : 35、約1 : 5至約1 : 30、約1 : 5至約1 : 25、約1 : 5至約1 : 20、約1 : 5至約1 : 15、約1 : 5至約1 : 10、約1 : 6至約1 : 65、約1 : 7至約1 : 65、約1 : 8至約1 : 65、約1 : 9至約1 : 65、約1 : 10至約1 : 65、約1 : 15至約1 : 65、約1 : 20至約1 : 65、約1 : 25至約1 : 65、約1 : 30至約1 : 65、約1 : 35至約1 : 65、約1 : 40至約1 : 65、約1 : 45至約1 : 65、約1 : 50至約1 : 65、約1 : 55至約1 : 65、或約1 : 60至約1 : 65。在各種情況下，基本鹽的濃度大於DF溶液的總鹽濃度的50%，視需要，大於總鹽濃度的55%或60%或65%或70%或75%或80%。在各種情況下，基本鹽的濃度大於DF溶液的總鹽濃度的80%，視需要，大於總鹽濃度的85%或90%。
基本鹽可為任何鹽。在各個方面，基本鹽包含一價陽離子。視需要，一價陽離子係鈉。在各個方面，基本鹽係氯化鈉。在各種情況下，基本鹽包含二價陽離子。視需要，二價陽離子係鎂或鈣。視需要，基本鹽係氯化鎂或氯化鈣。
在示例性情況下，DF溶液包含的基本鹽的量導致寡核苷酸化合物的流體動力學直徑與水中的寡核苷酸化合物的流體動力學直徑相比增加至少1.5倍或至少2倍或至少3倍。視需要，DF溶液包含的基本鹽的量導致寡核苷酸化合物的流體動力學直徑與水中的寡核苷酸化合物的流體動力學直徑相比增加2倍。在各種情況下，DF溶液包含的基本鹽的量導致寡核苷酸化合物的流體動力學直徑為約5 nm至約6 nm。在各個方面，DF溶液包含的基本鹽的量導致寡核苷酸化合物的解鏈溫度與水中的寡核苷酸化合物的解鏈溫度相比增加至少1.5倍或至少2倍。例如，解鏈溫度增加了約20度或約30度。
本文還提供了藉由超濾將包含低濃度的寡核苷酸化合物的第一溶液濃縮以獲得包含高濃度的寡核苷酸化合物的第二溶液之方法，其中該第二溶液的寡核苷酸化合物濃度大於約150 mg/mL、大於約160 mg/mL、大於約170 mg/mL、大於約180 mg/mL、大於約190 mg/mL、大於約200 mg/mL、大於約210 mg/mL、大於約220 mg/mL。在示例性方面，第一溶液的寡核苷酸化合物濃度小於約140 mg/mL、小於約130 mg/mL、小於約120 mg/mL、小於約110 mg/mL、小於約100 mg/mL、小於約90 mg/mL、小於約80 mg/mL、小於約70 mg/mL、小於約60 mg/mL、或小於約50 mg/mL。在各個方面，第二溶液係超濾後獲得的滲餘物。在示例性情況下，滲餘物在超濾12小時內獲得。在示例性方面，超濾的持續時間小於12小時、小於10小時、小於8小時、小於6小時、小於4小時、小於2小時、或小於1小時。在各個方面，滲餘物在超濾1或2小時後獲得，並且寡核苷酸化合物的濃度大於150 mg/mL，視需要，大於175 mg/mL、大於200 mg/mL、或大於225 mg/mL。在示例性情況下，寡核苷酸化合物係雙股的。在示例性情況下，第一溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM。視需要，第一溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM或約25 mM至約250 mM。在各個方面，第一溶液只包含一種鹽。視需要，該一種鹽係無機鹽，例如，本文所述之無機鹽中的任一種。在各個方面，第一溶液不包含任何醋酸鹽。在示例性情況下，濃縮的方法在用DF溶液滲濾後進行。在各種情況下，滲濾用包含一或多種鹽的DF溶液進行，並且DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM或約25 mM至約250 mM。在示例性方面，濃縮的方法在用DF溶液滲濾前進行。在各種情況下，寡核苷酸化合物係雙股寡核苷酸化合物，視需要，siRNA。
另外的步驟
在各個方面，本文揭露的方法包括另外的步驟。例如，在一些方面，該等方法包括原料藥和/或藥物產品的製備中涉及的一或多個上游步驟或下游步驟。視需要，下游步驟係本文所述或本領域已知的那些下游加工步驟中的任何一個。在示例性實施方式中，該方法包括用於生產寡核苷酸化合物的步驟，包括例如，常規核酸固相合成。可以使用標準核苷酸或核苷先質（例如亞磷醯胺類），在合適的核酸合成儀上組裝寡核苷酸化合物。自動核酸合成儀係由幾個供應商進行商業銷售，包括來自應用生物系統公司（Applied Biosystems）（福斯特城，加利福尼亞州）的DNA/RNA合成儀、來自生物自動化公司（BioAutomation）（歐文市，德克薩斯州）的MerMade合成儀、和來自GE保健生命科學公司（GE Healthcare Life Sciences）（匹茲堡市，賓夕法尼亞州）的OligoPilot合成儀。2'矽基保護基可以在核糖核苷的5'位置與酸不穩定的二甲氧基三苯甲基（DMT）結合使用，從而經由亞磷醯胺化學來合成寡核苷酸。已知最終去保護條件不會顯著降解RNA產物。所有合成均可在任何自動或手動合成儀中以大、中、小規模進行。合成還可以在多個孔板、柱或載玻片中進行。各種合成步驟可以交替的順序或順序進行，以得到所期望的化合物。其他合成化學轉化、保護基團（例如對於鹼基上存在的羥基、胺基等）和可用於合成寡核苷酸的保護基團方法（保護和去保護）為本領域已知的且包括諸如以下中描述的那些：R. Larock, Comprehensive Organic Transformations [全面有機轉換], VCH Publishers [VCH出版社] (1989)；T. W. Greene和P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis [有機合成中的保護基團], 第2版, John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1991)；L. Fieser和M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis [費塞爾和用於有機合成的費塞爾試劑], John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1994)；以及L. Paquette編輯, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis [有機合成試劑百科全書], John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1995)，及其後續版本。
在示例性實施方式中，本文揭露的方法包括用於分離和/或純化寡核苷酸化合物的步驟。「純化（purify或purification）」係指減少與目標分子（例如寡核苷酸化合物）不同的並且期望地從最終液體組成物或製劑中排除的物質的量的製程。純化可為指一或多種雜質的去除。術語「雜質」係指具有與目標分子不同的結構的物質並且該術語可以包括單一的不期望的物質或幾種不期望的物質的組合。雜質可以包括在生產寡核苷酸化合物之方法中使用的材料或試劑以及寡核苷酸化合物的片段或其他不期望的衍生物或形式。在某些實施方式中，雜質包含一或多種寡核苷酸，其長度比目標寡核苷酸化合物短。在該等和其他實施方式中，雜質包含一或多個失敗序列。失敗序列可以在目標寡核苷酸的合成製程中產生並且是在將核苷酸單體逐步添加到寡核苷酸鏈期間由偶合反應的失敗產生。寡核苷酸合成反應的產物通常是不同長度的寡核苷酸的異質混合物，包括目標寡核苷酸和長度比目標寡核苷酸短的各種失敗序列（即目標寡核苷酸的截短形式）。在一些實施方式中，雜質包含一或多種製程相關的雜質。取決於生產寡核苷酸化合物的合成方法，此類製程相關的雜質可包括但不限於核苷酸單體、保護基團、鹽、酶和內毒素。在示例性方面，該方法包括用於分離包含寡核苷酸化合物的混合物的分子物質的一或多個層析法步驟。在示例性情況下，層析法係分析型層析法。在其他示例性情況下，層析法係製備型層析法。在示例性方面，混合物的每種分子物質藉由其從基質中洗脫的時間來分離。在各種情況下，混合物的每種分子物質洗脫的時間與不同分子物質洗脫的時間不同。在各個方面，分子物質藉由逆相高效液相層析法（RP-HPLC）分離。逆相層析法（例如RP-HPLC）在先前技術中進行了非常詳細的描述。參見例如 Reversed Phase Chromatography: Principles and Methods [ 逆相層析法 : 原則和方法 ], AA版, Amersham Biosciences [阿默森生物科學公司], Buckinghamshire, England [英國白金漢郡]（1999）。
在各個方面，本揭露的方法包括用於將藉由本揭露的方法獲得的高濃度液體組成物製備成藥物產品的一或多個步驟。在各個方面，該方法包括一或多個配製步驟。配製係將原料藥過渡為配製的藥物產品的製程。在各個方面，該方法包括一或多個配製步驟，以將藉由本文揭露的方法獲得的液體組成物從環境、溶劑或其他物理狀態轉化為適合於臨床投與的形式。
在各個方面，製備包含大於150 mg/mL的寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物之方法進一步包括另外的滲濾或緩衝液交換步驟，其中將寡核苷酸化合物交換至新的溶液（例如配製緩衝液）中。在示例性情況下，該方法包括 (i) 藉由滲濾將起始溶液中的寡核苷酸化合物交換至滲濾（DF）溶液中以獲得中間溶液，其中起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低，並且DF溶液包含一或多種鹽並且DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM，視需要，小於500 mM，(ii) 藉由超濾將中間溶液中的寡核苷酸化合物濃縮以獲得高濃度液體組成物，其中高濃度液體組成物中的寡核苷酸化合物的濃度係約150 mg/mL或更高，以及 (iii) 藉由滲濾將高濃度液體組成物中的寡核苷酸化合物交換至第二DF溶液中。在各個方面，第二DF溶液係配製緩衝液，並且該方法獲得了包含大於150 mg/mL的寡核苷酸化合物的高濃度液體配製物。在各個方面，該方法進一步包括將包含大於150 mg/mL的寡核苷酸化合物的高濃度液體配製物儲存在低於0°C的溫度下以獲得冷凍製劑。
在各個方面，該方法包括進行一次或多次洗滌以從膜釋放任何寡核苷酸化合物。在各個方面，該方法包括從收集容器（例如，滲餘物容器）中移出高濃度液體組成物，以及然後進行一次或多次洗滌以從膜釋放任何寡核苷酸化合物。在各種情況下，將從一次或多次洗滌中獲得的寡核苷酸化合物與從收集容器（例如滲餘物容器）中獲得的高濃度液體組成物合併。在各個方面，從一次或多次洗滌中獲得的寡核苷酸化合物與從收集容器（例如滲餘物容器）中獲得的高濃度液體組成物的組合代表大於70%的回收率，例如，大於70%的起始溶液的寡核苷酸化合物。在各種情況下，從一次或多次洗滌中獲得的寡核苷酸化合物與從收集容器（例如滲餘物容器）中獲得的高濃度液體組成物的組合包含約150 mg/mL或更高的濃度。
在示例性方面，另外的步驟不涉及寡核苷酸化合物的凍乾或冷凍乾燥。有利地，本發明之方法提供了高濃度液體組成物，其包含至少150 mg/mL的寡核苷酸化合物，使得無需並且避免了寡核苷酸化合物的凍乾或冷凍乾燥。
在各個方面，寡核苷酸化合物係包含反義股和有義股的雙股（ds）寡核苷酸化合物。在各個方面，本揭露的方法包括將有義股和反義股退火以獲得ds寡核苷酸化合物，以及然後藉由以下製備包含如本文所述之ds寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物：(i) 藉由滲濾將起始溶液中的ds寡核苷酸化合物交換至滲濾（DF）溶液中以獲得中間溶液，其中起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低，並且DF溶液包含一或多種鹽並且DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM，視需要，小於500 mM，以及 (ii) 藉由超濾將中間溶液中的ds寡核苷酸化合物濃縮以獲得高濃度液體組成物。在各個方面，起始溶液係從退火中獲得的溶液。在各個方面，ds寡核苷酸化合物以約50 mg/mL的濃度存在於起始溶液中。
液體組成物和冷凍製劑
本揭露還提供了藉由本揭露的方法製備的液體組成物。在各個方面，液體組成物相當於高濃度液體組成物，例如，最終滲餘物。在各種情況下，藉由本揭露的方法製備的液體組成物包含大於或約為150 mg/mL的寡核苷酸化合物。視需要，液體組成物中的寡核苷酸化合物的濃度係至少155 mg/mL、至少160 mg/mL、至少165 mg/mL、至少170 mg/mL、至少175 mg/mL、至少180 mg/mL、至少185 mg/mL、至少190 mg/mL、至少195 mg/mL、或至少200 mg/mL。在各種情況下，寡核苷酸化合物以如下濃度存在於液體組成物中：至少210 mg/mL、至少220 mg/mL、至少230 mg/mL或更高。本揭露還提供了藉由將本文揭露的液體組成物儲存在低於0°C的溫度下製備的冷凍製劑。在示例性方面，冷凍製劑不是凍乾或冷凍乾燥的製劑。
有利地，藉由該方法製備的液體組成物係儲存穩定的，並且/或者液體組成物對於一次或多次凍融循環係穩定的。在各個方面，在小於或等於0°C的溫度下儲存後，液體組成物包含至少95%的寡核苷酸化合物，如藉由HPLC確定的。在各個方面，在小於或等於0°C的溫度下儲存至少約1週、至少約2週或至少約4週後，液體組成物包含至少95%的寡核苷酸化合物，如藉由HPLC確定的。在示例性情況下，在小於或等於0°C的溫度下儲存至少約1週或約2週或約4週、隨後解凍至2°C-8°C後，液體組成物包含至少95%的寡核苷酸化合物，如藉由HPLC確定的。在示例性情況下，在一次或多次凍融循環後，液體組成物包含至少95%的寡核苷酸化合物，如藉由HPLC確定的。
在各個方面，液體組成物的寡核苷酸化合物未經受凍乾或冷凍乾燥。在本文揭露的液體組成物的方面，寡核苷酸化合物未經凍乾或冷凍乾燥。液體組成物不是重構的凍乾寡核苷酸化合物原料藥或藥物產品。視需要，在整個製造方法中，寡核苷酸化合物始終處於溶液或冷凍溶液中。
製造方法
本揭露進一步提供了製造包含寡核苷酸化合物的溶液藥物或溶液API（寡核苷酸API的溶液）之方法。在示例性方面，本文揭露的製造方法不包括任何凍乾。在本文揭露的製造方法的示例性情況下，API不經受凍乾。在示例性實施方式中，該方法包括進行本揭露的方法以獲得包含大於約150 mg/mL的寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物，將該高濃度液體組成物與藥學上可接受的賦形劑一起配製，以及將該配製的高濃度液體組成物填充至容器中。藥學上可接受的賦形劑可為在以下中描述的那些中的任一個： The Handbook of Pharmaceutical Excipients[藥物賦形劑手冊], 第三版, A. H. Kibbe（Pharmaceutical Press [醫藥出版社], 倫敦, 英國, 2000），或 Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明頓藥物科學], 第十六版, E. W. Martin（Mack Publishing Co.[馬克出版公司], 賓夕法尼亞州伊斯頓市 [Easton, Pa.], 1980），該等文獻各自藉由引用以其全文併入。
在示例性實施方式中，該方法包括 (a) 在包含一或多種鹽的第一溶液中製備寡核苷酸化合物，其中溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低並且溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM，以及 (b) 藉由超濾將第一溶液濃縮以獲得高濃度液體組成物，該液體組成物包含濃度約150 mg/mL或更高的寡核苷酸化合物。在各個方面，第一溶液藉由用DF溶液滲濾來製備。在各種情況下，滲濾實現了將包含約140 mg/mL或更低的寡核苷酸化合物的起始溶液交換至包含一或多種鹽且具有25 mM至約800 mM的總鹽濃度的DF溶液中。因此，在示例性實施方式中，製備高濃度液體組成物之方法包括：(a) 藉由滲濾將起始溶液中的寡核苷酸化合物交換至DF溶液中以獲得中間溶液，其中起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低，並且DF溶液包含一或多種鹽，以及 (b) 藉由超濾將中間溶液中的寡核苷酸化合物濃縮以獲得高濃度液體組成物，其中該高濃度液體組成物中的寡核苷酸化合物的濃度係約150 mg/mL或更高。在示例性情況下，DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM。在示例性情況下，該方法包括藉由切向流過濾進行的連續滲濾和/或超濾。在各個方面，該方法採用聚醚碸（PES）膜或穩定的纖維素膜進行滲濾和/或超濾。視需要，膜的截留分子量（MWCO）小於10 kDa，並且在示例性情況下，MWCO係約5 kDa或約3 kDa。
在示例性實施方式中，該方法包括藉由超濾將包含低濃度的寡核苷酸化合物的第一溶液濃縮以獲得包含高濃度的寡核苷酸化合物的第二溶液，其中該第二溶液的寡核苷酸化合物濃度大於約150 mg/mL、大於約160 mg/mL、大於約170 mg/mL、大於約180 mg/mL、大於約190 mg/mL、大於約200 mg/mL、大於約210 mg/mL、大於約220 mg/mL。在示例性方面，第一溶液的寡核苷酸化合物濃度小於約140 mg/mL、小於約130 mg/mL、小於約120 mg/mL、小於約110 mg/mL、小於約100 mg/mL、小於約90 mg/mL、小於約80 mg/mL、小於約70 mg/mL、小於約60 mg/mL、或小於約50 mg/mL。在各個方面，第二溶液係超濾後獲得的滲餘物。在各個方面，滲餘物在超濾1或2小時後獲得。在示例性情況下，寡核苷酸化合物係雙股的。在示例性情況下，第一溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM。視需要，第一溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM或約25 mM至約250 mM。在各個方面，第一溶液只包含一種鹽。視需要，該一種鹽係無機鹽，例如，本文所述之無機鹽中的任一種。在各個方面，第一溶液不包含任何醋酸鹽。在示例性情況下，濃縮之方法在用DF溶液滲濾後進行。在各種情況下，滲濾用包含一或多種鹽的DF溶液進行，並且DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM。視需要，DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM或約25 mM至約250 mM。在示例性方面，濃縮之方法在用DF溶液滲濾前進行。在各種情況下，寡核苷酸化合物係雙股寡核苷酸化合物，視需要，siRNA。
本文進一步提供了製備包含寡核苷酸化合物API的溶液API之方法，其中該寡核苷酸化合物API以大於150 mg/mL的濃度存在於溶液中。在各個方面，寡核苷酸化合物API係雙股的，視需要，siRNA。在示例性實施方式中，製備溶液API之方法包括本文揭露的藉由超濾將包含低濃度的寡核苷酸化合物的第一溶液濃縮以獲得包含高濃度的寡核苷酸化合物的第二溶液之方法。在各種情況下，製備溶液API之方法包括 (i) 藉由例如固相合成來合成寡核苷酸化合物、或其鏈，(ii) 進行層析法、滲濾和退火中的一或多種，以及 (iii) 根據本文揭露的藉由超濾將包含低濃度的寡核苷酸化合物的第一溶液濃縮以獲得包含高濃度的寡核苷酸化合物的第二溶液之方法藉由超濾進行濃縮。在各個方面，第二溶液的寡核苷酸化合物濃度大於約150 mg/mL、大於約160 mg/mL、大於約170 mg/mL、大於約180 mg/mL、大於約190 mg/mL、大於約200 mg/mL、大於約210 mg/mL、大於約220 mg/mL，並且第一溶液的寡核苷酸化合物濃度小於約140 mg/mL、小於約130 mg/mL、小於約120 mg/mL、小於約110 mg/mL、小於約100 mg/mL、小於約90 mg/mL、小於約80 mg/mL、小於約70 mg/mL、小於約60 mg/mL、或小於約50 mg/mL。在各個方面，第二溶液係超濾後獲得的滲餘物。在各個方面，滲餘物在超濾1或2小時後獲得。在製備包含寡核苷酸化合物API的溶液API之方法的示例性方面，在方法期間的任何時候都不凍乾寡核苷酸API。有利地，製備溶液API的方法係無需任何凍乾的方法。因此，本揭露的製備溶液API之方法無需凍乾，並且提供了更具時間和成本效益的製備寡核苷酸化合物API之方式。在各種情況下，將藉由本文揭露的方法製備的溶液API直接用於製備包含寡核苷酸化合物API的溶液DP。視需要，溶液API係無菌過濾的，並且將其填充至小瓶或預填充注射器或自動注射器中。因此，提供了生產包含含有寡核苷酸化合物API的溶液API的DP（例如，溶液DP）之方法。在各個方面，生產DP之方法無需任何凍乾。在生產DP之方法的各個方面，在方法期間的任何時間都不進行寡核苷酸化合物API的凍乾。
在各種情況下，製造方法符合美國食品藥品監督管理局推薦的現行良好製造規範（cGMP）。因此，本文揭露的製造方法產生包含高濃度（大於約150 mg/mL）的寡核苷酸化合物的cGMP級藥物，並且該藥物係液體組成物。在各個方面，製造方法包括進行本揭露的方法以獲得包含大於約150 mg/mL的寡核苷酸化合物的cGMP級高濃度液體組成物。在示例性方面，藥物係包含大於約150 mg/mL的寡核苷酸化合物的臨床級高濃度液體組成物。在本文揭露的製造方法的方面，寡核苷酸化合物不經受任何凍乾或冷凍乾燥。在本文揭露的製造方法的方面，寡核苷酸化合物不經凍乾或冷凍乾燥。視需要，在整個製造方法中，寡核苷酸化合物始終處於溶液或冷凍溶液中。
在各個方面，寡核苷酸化合物係包含反義股和有義股的雙股（ds）寡核苷酸化合物。在各個方面，該製造方法包括將有義股和反義股退火以獲得ds寡核苷酸化合物，以及然後藉由以下製備如本文所述之高濃度液體組成物：(i) 藉由滲濾將起始溶液中的ds寡核苷酸化合物交換至滲濾（DF）溶液中以獲得中間溶液，其中起始溶液中的寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低，並且DF溶液包含一或多種鹽並且DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM，視需要，小於500 mM，以及 (ii) 藉由超濾將中間溶液中的ds寡核苷酸化合物濃縮以獲得高濃度液體組成物。
在各個方面，該方法進一步包括將最終滲餘物精加工，視需要，進一步包括將精加工的最終滲餘物填充至容器中。在各個方面，該方法進一步包括在儲存前將原料藥進行無菌過濾。在各種情況下，該方法完全沒有對寡核苷酸化合物進行凍乾。
寡核苷酸和寡核苷酸化合物
如本文所用，寡核苷酸化合物代表包含一或多種寡核苷酸的一類生物化學實體，其中寡核苷酸係核苷酸或經修飾的核苷酸的寡聚體或聚合物。例如，寡核苷酸可以包含核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、經修飾的核苷酸或其組合。視需要，寡核苷酸包含藉由磷酸二酯鍵和/或經修飾的核苷酸間鍵相互連接的核苷酸或經修飾的核苷酸。在各種情況下，寡核苷酸化合物只包含一種寡核苷酸，然而在其他情況下，寡核苷酸化合物包含兩種、三種、四種或更多種寡核苷酸。寡核苷酸可為，例如，分別包含兩個、三個和四個寡核苷酸的雙鏈體、三鏈體或四鏈體。在各個方面，寡核苷酸化合物包含兩個或更多個寡核苷酸，並且每一個寡核苷酸藉由非共價鍵與另一個寡核苷酸連接。在各個方面，寡核苷酸化合物係包含寡核苷酸及其互補股的雙鏈體，並且每一個寡核苷酸經由氫鍵與另一個寡核苷酸結合。在各種情況下，寡核苷酸化合物係單股的或雙股的。
寡核苷酸化合物的寡核苷酸組分可為幾個核苷酸的長度直至幾百個核苷酸的長度，例如，從約10個核苷酸的長度至約300個核苷酸的長度，從約12個核苷酸的長度至約100個核苷酸的長度，從約15個核苷酸的長度至約250個核苷酸的長度，從約20個核苷酸的長度至約80個核苷酸的長度，從約15個核苷酸的長度至約30個核苷酸的長度，從約18個核苷酸的長度至約26個核苷酸的長度，或從約19個核苷酸的長度至約23個核苷酸的長度。在一些實施方式中，用於本發明之方法的寡核苷酸化合物的一或多種寡核苷酸組分係約18、19、20、21、22、23、24、25、或26個核苷酸的長度。在一個實施方式中，寡核苷酸係約19個核苷酸的長度。在另一實施方式中，寡核苷酸係約20個核苷酸的長度。在又另一實施方式中，寡核苷酸係約21個核苷酸的長度。在仍另一實施方式中，寡核苷酸係約23個核苷酸的長度。
寡核苷酸化合物可為從細胞或生物體中分離的天然存在的寡核苷酸。例如，寡核苷酸化合物可來源於基因組DNA或其片段，特別是端粒或啟動子區域，或可來源於傳訊者RNA（mRNA）或其片段，特別是5'或3'非翻譯區。在一些實施方式中，寡核苷酸化合物係藉由化學合成方法或體外酶法產生的合成的寡核苷酸化合物。在一些實施方式中，寡核苷酸係單股RNA或DNA。在一些實施方式中，寡核苷酸化合物係短髮夾RNA（shRNA）、先質miRNA（pre-miRNA）、抗miRNA寡核苷酸（例如antagomir和antimiR）或反義寡核苷酸。在其他實施方式中，寡核苷酸化合物係雙股RNA分子或RNA干擾劑，例如小干擾RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）或miRNA模擬物。
在某些實施方式中，寡核苷酸化合物係治療性寡核苷酸，其設計成靶向與疾病或障礙相關的基因或RNA分子。例如，在一個實施方式中，寡核苷酸化合物係反義寡核苷酸（ASO），其包含與靶基因或mRNA序列的區域互補的單股序列。如果包含第一序列的寡核苷酸可以在某些條件下與包含第二序列的寡核苷酸雜交形成雙鏈體區，則第一序列與第二序列為「互補」。「雜交（hybridize或hybridization）」係指互補寡核苷酸的配對，典型地是經由在兩個寡核苷酸中的互補鹼基之間的氫鍵合（例如沃森-克裡克（Watson-Crick）氫鍵合、胡斯坦（Hoogsteen）氫鍵合、或反向胡斯坦（Hoogsteen）氫鍵合）而配對。若在一個或兩個核苷酸序列的整個長度上包含第一序列的寡核苷酸與包含第二序列的寡核苷酸鹼基配對而無任何錯配，則認為第一序列與第二序列完全互補（100%互補）。
在另一實施方式中，寡核苷酸化合物係包含反義股和有義股的siRNA或其他類型的雙股RNA干擾劑，其中反義股包含與靶基因或mRNA序列的區域互補的序列。包含具有與靶序列（例如靶mRNA）互補的序列的區域的siRNA或其他類型的雙股RNA干擾劑的鏈被稱為「反義股」。「有義股」係指包括與反義股的區域互補的區域的股。在一些實施方式中，有義股可以包含與靶基因或mRNA序列的區域相同的序列。
寡核苷酸化合物可以包含一或多種經修飾的核苷酸。「經修飾的核苷酸」係指具有針對核苷、核鹼基、戊糖環、或磷酸基團的一或多種化學修飾的核苷酸。這類經修飾的核苷酸可包括但不限於具有2′糖修飾（2′-O-甲基、2′-甲氧基乙基、2′-氟、去氧核苷酸等）的核苷酸、無鹼基核苷酸、反向核苷酸（3′-3′連接的核苷酸）、硫代磷酸酯連接的核苷酸、具有二環糖修飾的核苷酸（例如LNA、ENA）和包含鹼基類似物（例如通用鹼基、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶等）的核苷酸。
在某些實施方式中，經修飾的核苷酸具有核糖的修飾。該等糖修飾可以包括在戊糖環的2'和/或5'位置的修飾、以及二環糖修飾。2'-修飾的核苷酸係指具有以下戊糖環的核苷酸，該戊糖環在2'位置具有除OH以外的取代基。這類2ʹ-修飾包括，但不限於，2ʹ-H（例如去氧核糖核苷酸）、2ʹ-O-烷基（例如O-C 1-C 10或O-C 1-C 10取代的烷基）、2ʹ-O-烯丙基（O-CH 2CH=CH 2）、2ʹ-C-烯丙基、2ʹ-F、2ʹ-O-甲基（OCH 3）、2ʹ-O-甲氧基乙基（O-(CH 2) 2OCH 3）、2ʹ-OCF 3、2ʹ-O(CH 2) 2SCH 3、2ʹ-O-胺基烷基、2ʹ-胺基（例如NH 2）、2ʹ-O-乙胺和2ʹ-疊氮基。在戊糖環的5'位置處的修飾包括但不限於：5'-甲基（R或S）；5'-乙烯基、和5'-甲氧基。「二環糖修飾」係指戊糖環的修飾，其中橋將環的兩個原子連接而形成第二環從而得到二環糖結構。在一些實施方式中，二環糖修飾包含在戊糖環的4'和2'碳之間的橋。包含具有二環糖修飾的糖部分的核苷酸在本文中稱為二環核酸或BNA。示例性的二環糖修飾包括但不限於α-L-亞甲基氧基（4'-CH 2—O-2'）二環核酸（BNA）；β-D-亞甲基氧基（4'-CH 2—O-2'）BNA（也稱為鎖核酸或LNA）；乙烯氧基（4'-(CH 2) 2—O-2'）BNA；胺基氧基（4'-CH 2—O—N(R)-2'）BNA；氧基胺基（4'-CH 2—N(R)—O-2'）BNA；甲基(亞甲基氧基)（4'-CH(CH 3)—O-2'）BNA(也稱為受限乙基或cEt)；亞甲基-硫基（4'-CH 2—S-2'）BNA；亞甲基-胺基（4ʹ-CH 2-N(R)-2ʹ）BNA；甲基碳環（4'-CH 2—CH(CH 3)- 2'）BNA；丙烯碳環（4'-(CH 2) 3-2'）BNA；和甲氧基(乙烯氧基)（4'-CH(CH 2OMe)-O-2'）BNA（也稱為受限MOE或cMOE）。可以摻入寡核苷酸化合物中的該等和其他經糖修飾的核苷酸描述於美國專利案號9,181,551、美國專利公開案號2016/0122761以及Deleavey和Damha, Chemistry and Biology [化學和生物學], 第19卷: 937-954, 2012中，所有該等文獻均藉由引用以其全文特此併入。
在一些實施方式中，寡核苷酸化合物包含一或多個2'-氟修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、二環核酸（BNA）、或其組合。在某些實施方式中，寡核苷酸化合物包含一或多個2’-氟修飾的核苷酸、2’-O-甲基修飾的核苷酸、2’-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、或其組合。在一個特定實施方式中，寡核苷酸化合物包含一或多個2’-氟修飾的核苷酸、2’-O-甲基修飾的核苷酸、去氧核苷酸、或其組合。在另一特定實施方式中，寡核苷酸化合物包含一或多個2’-氟修飾的核苷酸、2’-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。
寡核苷酸化合物還可以包含一或多個經修飾的核苷酸間鍵。如本文所用，術語「經修飾的核苷酸間鍵」係指除天然3'至5'磷酸二酯鍵以外的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵係含磷的核苷酸間鍵，諸如磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯（例如甲基膦酸酯、3'-伸烷基膦酸酯）、次膦酸酯、胺基磷酸酯（例如3'-胺基胺基磷酸酯和胺基烷基胺基磷酸酯）、硫代磷酸酯（P=S）、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、琉羰基磷醯胺酯、琉羰基烷基膦酸酯、琉羰基烷基磷酸三酯、和硼烷磷酸酯。在一個實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵係2'至5'磷酸二酯鍵。在其他實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵為不含磷核苷酸間鍵，且因此可稱為經修飾的核苷間鍵。此類不含磷的鍵包括但不限於𠰌啉鍵（部分由核苷的糖部分形成）；矽氧烷鍵（—O—Si(H) 2—O—）；硫化物、亞碸和碸鍵；甲醯基和硫代甲醯基鍵；含烯烴的骨架；胺基磺酸鹽骨架；亞甲基甲基亞胺基（—CH 2—N(CH 3)—O—CH 2—）和亞甲基肼鍵；磺酸鹽和磺醯胺鍵；醯胺鍵；以及具有混合的N、O、S和CH 2組成部分的其他鍵。在一個實施方式中，經修飾的核苷間鍵為產生肽核酸或PNA的基於肽的鍵（例如胺基乙基甘胺酸），例如美國專利案號5,539,082、5,714,331、和5,719,262中所述的那些。可以摻入寡核苷酸化合物中的其他合適的經修飾的核苷酸間鍵和核苷間鍵描述於美國專利案號6,693,187、美國專利案號9,181,551、美國專利公開案號2016/0122761以及Deleavey和Damha, Chemistry and Biology [化學和生物學], 第19卷: 937-954, 2012中，所有該等文獻均藉由引用以其全文特此併入。
在某些實施方式中，寡核苷酸化合物包含一或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。寡核苷酸化合物可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在一些實施方式中，寡核苷酸化合物中的所有核苷酸間鍵均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在其他實施方式中，寡核苷酸化合物可以在3'端、5'端或3'端和5'端兩者處包含一或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。例如，在某些實施方式中，寡核苷酸化合物在3'端處包含約1至約6或更多個（例如約1、2、3、4、5、6或更多個）連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在其他實施方式中，寡核苷酸化合物在5’端處包含約1至約6或更多個（例如約1、2、3、4、5、6或更多個）連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
用於本發明之方法的寡核苷酸化合物可以使用本領域中已知的技術（例如使用常規核酸固相合成）來容易地製備。可以使用標準核苷酸或核苷先質（例如亞磷醯胺類），在合適的核酸合成儀上組裝寡核苷酸。自動核酸合成儀係由幾個供應商進行商業銷售，包括來自應用生物系統公司（福斯特城，加利福尼亞州）的DNA/RNA合成儀、來自生物自動化公司（歐文市，德克薩斯州）的MerMade合成儀、和來自GE保健生命科學公司（匹茲堡市，賓夕法尼亞州）的OligoPilot合成儀。2'矽基保護基可以在核糖核苷的5'位置與酸不穩定的二甲氧基三苯甲基（DMT）結合使用，從而經由亞磷醯胺化學來合成寡核苷酸。已知最終去保護條件不會顯著降解RNA產物。所有合成均可在任何自動或手動合成儀中以大、中、小規模進行。合成還可以在多個孔板、柱或載玻片中進行。可以經由暴露於氟離子來去除2'-O-矽基基團，該等氟離子可以包括任何氟離子源，例如含有與無機相對離子配對的氟離子的那些鹽（例如氟化銫和氟化鉀）、或者含有與有機相對離子配對的氟離子的那些鹽（例如氟化四烷基銨）。冠醚催化劑可以與無機氟化物組合用於去保護反應中。較佳的氟離子源係氟化四丁基銨、或胺基氫氟化物（例如在偶極非質子溶劑例如二甲基甲醯胺中，將水性HF與三乙胺合併）。各種合成步驟可以交替的順序或順序進行，以得到所期望的化合物。其他合成化學轉化、保護基團（例如對於鹼基上存在的羥基、胺基等）和可用於合成寡核苷酸的保護基團方法（保護和去保護）為本領域已知的且包括諸如以下中描述的那些：R. Larock, Comprehensive Organic Transformations [全面有機轉換], VCH Publishers [VCH出版社] (1989)；T. W. Greene和P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis [有機合成中的保護基團], 第2版, John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1991)；L. Fieser和M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis [費塞爾和用於有機合成的費塞爾試劑], John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1994)；以及L. Paquette編輯, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis [有機合成試劑百科全書], John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1995)，及其後續版本。
如熟悉該項技術者可以理解的，合成寡核苷酸化合物的其他方法對於熟悉該項技術者而言係顯而易見的。例如，寡核苷酸可以使用酶在體外系統中合成，例如以Jensen和Davis, Biochemistry [生物化學], 第57卷: 1821-1832, 2018中描述的方法合成。可以使用常規方法從細胞或生物體中分離天然存在的寡核苷酸。寡核苷酸的定制合成還可自幾個商業供應商處獲得，包括Dharmacon公司（Dharmacon, Inc.）（拉斐特，科羅拉多州）、Axo實驗室股份有限公司（AxoLabs GmbH）（庫爾姆巴赫，德國）和Ambion公司（Ambion, Inc.）（福斯特城，加利福尼亞州）。
在各個方面，寡核苷酸化合物包含5ʹ - UCGUAUAACAAUAAGGGGCUG - 3ʹ（SEQ ID NO: 2）的序列或由其組成。在一些此類實施方式中，寡核苷酸化合物包含根據5’ - usCfsgUfaUfaacaaUfaAfgGfgGfcsUfsg - 3’（SEQ ID NO: 4）的序列的經修飾的核苷酸的序列或由其組成，其中a、g、c和u分別是2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基鳥苷、2'-O-甲基胞苷和2'-O-甲基尿苷；Af、Gf、Cf和Uf分別是2'-去氧-2'-氟（「2'-氟」）腺苷、2'-氟鳥苷、2'-氟胞苷和2'-氟尿苷；並且s係硫代磷酸酯鍵。在各種情況下，寡核苷酸化合物的互補寡核苷酸包含5ʹ - CAGCCCCUUAUUGUUAUACGA - 3ʹ（SEQ ID NO: 1）的序列或由其組成。在相關實施方式中，互補寡核苷酸包含根據5' - csagccccuUfAfUfuguuauacgs(invdA) - 3'（SEQ ID NO: 3）的序列修飾的核苷酸序列或由其組成，其中a、g、c和u分別是2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基鳥苷、2'-O-甲基胞苷和2'-O-甲基尿苷；Af、Gf、Cf和Uf分別是2'-去氧-2'-氟（「2'-氟」）腺苷、2'-氟鳥苷、2'-氟胞苷和2'-氟尿苷；invdA係反向去氧腺苷（3'-3'連接的核苷酸），並且s係硫代磷酸酯鍵。 在各種情況下，寡核苷酸化合物包含雙鏈體，該雙鏈體包含有義股和反義股。
在一些實施方式中，寡核苷酸化合物可以包含除寡核苷酸組分外的另外的組分。例如，寡核苷酸化合物的寡核苷酸組分可以與以下共價連接：糖、聚合物、胺基酸、脂肪酸、膽固醇部分、維生素、類固醇、葉酸部分、肽、多肽或蛋白質。在某些實施方式中，寡核苷酸化合物的寡核苷酸組分與將寡核苷酸化合物遞送至特定組織或細胞類型的靶向部分共價連接。靶向部分可以包含與靶細胞類型（例如肝細胞）表面表現的受體特異性結合的抗體或其抗原結合片段。可替代地，靶向部分可以包含在寡核苷酸化合物將被遞送到的靶細胞或組織的表面上表現的受體的配體。在一個這樣的實施方式中，靶向部分包含在肝細胞表面上表現的去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）的配體。ASGPR的配體可以包含半乳糖、半乳糖胺、或N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）。在某些實施方式中，ASGPR配體包含多價半乳糖或多價GalNAc部分，如三價或四價半乳糖或GalNAc部分。此類多價半乳糖和GalNAc部分係熟悉該項技術者已知的。可以與用於本發明之方法的寡核苷酸化合物共價連接的示例性GalNAc部分在圖3中示出為R1。
在某些實施方式中，寡核苷酸化合物包含含有根據SEQ ID NO: 3的經修飾的核苷酸的序列的有義股和含有根據SEQ ID NO: 4的經修飾的核苷酸的序列的反義股。示例性寡核苷酸化合物的結構在圖3中示出，並且進一步在實例中描述。在示例性情況下，寡核苷酸化合物係雙股的並且/或者包含雙螺旋結構。視需要，寡核苷酸化合物係siRNA。在各種情況下，寡核苷酸係雙股的。在各個方面，寡核苷酸化合物包含雙鏈體，該雙鏈體包含反義寡核苷酸和正義寡核苷酸。在示例性方面，反義寡核苷酸和正義寡核苷酸中的每一個獨立地包含至少11個核苷酸，視需要，約15至約30個核苷酸、約18至約26個核苷酸、約19至約23個核苷酸、或約19至約21個核苷酸。視需要，寡核苷酸化合物的分子量大於約7,000道爾頓或大於約10,000道爾頓或大於約15,000道爾頓。在某些實施方式中，寡核苷酸化合物係單股反義寡核苷酸。在此類實施方式中，反義寡核苷酸包含約15至約25個核苷酸、約18至約22個核苷酸、或約20個核苷酸。
在各個方面，寡核苷酸化合物通過一系列過程調節基因表現，該等過程包括RNAi、藉由RNA酶H介導的切割進行的靶降解、剪接調節、非編碼RNA抑制、基因激活以及程式性基因編輯。視需要，寡核苷酸化合物係在Roberts等人, Nature Reviews Drug Discovery [自然綜述藥物發現] 19: 673-694 (2020)中描述的那些中的任一種。在示例性方面，寡核苷酸係ASO。在各種情況下，ASO係約18至約30個核苷酸的單股。視需要，寡核苷酸化合物選自由以下組成之群組：米泊美生（mipomersen）、哌加他尼（pegaptanib）、去纖苷（defibrotide）、帕替西蘭（patisiran）、庫司替森（custirsen）、福米韋森（fomivirsen）、奧利莫森（oblimersen）、依特立生（eteplirsen）、諾西那生（nusinersen）、佩拉卡森（pelacarsen）、伊諾特森（inotersen）、吉沃西蘭（givosiran）、戈洛迪森（golodirsen）、和維托拉生（viltolarsen）。視需要，寡核苷酸化合物係在Roberts等人, 2020, 同上的表2中描述的那些中的任一個，例如，英克西蘭（inclisiran）、蒂瓦尼西蘭（tivanisiran）、米拉維生（miravirsen）、GF012、TF-101、科博馬森（cobomarsen）、雷姆拉生（remlarsen）、SLN124、MTL-CEPBA、蘇沃迪爾生（suvodirsen）、菲圖西蘭（fitusiran）、盧馬西蘭（lumasiran）、武特裡西蘭（vutrisiran）、雷武西蘭（revusiran）、凱西梅生（casimersen）、托弗森（tofersen）等。在各個方面，寡核苷酸係雙股siRNA，例如，帕替西蘭、吉沃西蘭、奧爾帕西蘭（olpasiran）。
治療方法
此外提供了治療患有疾病的受試者之方法。在示例性實施方式中，該方法包括以有效治療受試者的疾病的量向受試者投與本揭露的液體組成物。視需要，該藥物藉由注射或輸注投與。如本文所用，術語「治療」以及與其相關的詞語不一定暗示100%或完全治療。更確切些，存在本領域中普通技術者認為具有潛在益處或治療作用的不同程度的治療。在此方面，本揭露的治療方法可提供任何量或任何水平的治療。此外，由本揭露的方法提供的治療可以包括治療所治療疾病的一或多種病狀或症狀或體征。另外，由本揭露的方法提供的治療可以涵蓋減緩疾病的進展。例如，該等方法可以藉由減少疾病的體征和症狀來治療疾病，阻止或減緩疾病進展，減少疾病復發的頻率，延緩疾病的發作等。在示例性方面，該等方法借助於使疾病發作或復發延緩1天、2天、4天、6天、8天、10天、15天、30天、兩個月、4個月、6個月、1年、2年、4年或更長時間而進行治療。
在各個方面，根據本發明之方法待治療或待改善的疾病、病症、或障礙係與異常靶基因表現或活性相關的疾病、病症、或障礙，例如，其中基因產品的過表現導致病理表型。液體組成物中包含的寡核苷酸化合物所靶向的示例性靶基因包括但不限於： LPA、 PNPLA3、 ASGR1、 F7、 F12、 FXI、 APOCIII、 APOB、 APOL1、 TTR、 PCSK9、 SCAP、 MARC1、 KRAS、 CD274、 PDCD1、 C5、 ALAS1、 HAO1、 LDHA、 ANGPTL3、 SERPINA1、 AGT、 HAMP、 LECT2、 EGFR、 VEGF、 KIF11、 AT3、 CTNNB1、 HMGB1、 HIF1A、和 STAT3。靶基因還可以包括病毒基因，例如B型肝炎和C型肝炎病毒基因、人類免疫不全病毒基因、皰疹病毒基因等。在一些實施方式中，靶基因係編碼人微RNA（miRNA）的基因。在一些實施方式中，疾病係心血管疾病，例如，動脈粥樣硬化性心血管疾病。在其他實施方式中，疾病係癌症。在某些其他實施方式中，疾病係肝病，例如非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化。在各種情況下，受試者係成年人。
給出以下實例僅用於說明本發明，而不以任何方式限制其範圍。 實例 實例1
此實例描述了對用於經由超濾/滲濾（UF/DF）來濃縮包含原料藥的溶液的不同膜的評估。
本研究之目的係鑒定具有適合於濃縮滲餘物中的雙鏈體siRNA的截留分子量（MWCO）的膜。在本研究中，雙股siRNA分子用作模型寡核苷酸化合物。siRNA的每條股長度為21個核苷酸並且含有具有化學修飾的核苷酸。包含N-乙醯基半乳糖胺的靶向配體連接到有義股的5'端，用於選擇性靶向肝臟。圖3提供了siRNA分子的結構。
實驗室規模的UF/DF系統用於siRNA樣本的緩衝液交換（經由滲濾）和濃度（經由超濾）。系統配備了表1中所述之幾種不同膜類型中的一種。將包含siRNA（30 mg/mL）和水的起始溶液交換至包含12 mM磷酸氫二鉀（K 2HPO 4）、8 mM磷酸二氫鉀（KH 2PO 4）、40 mM氯化鈉（NaCl）、和注射用水的滲濾（DF）溶液中。進行了UV分析（在260 nm處）以測量最終滲餘物中的siRNA雙鏈體濃度。表1提供了對MWCO膜、起始溶液、DF溶液、和滲餘物的siRNA雙鏈體濃度的總結。表1也提供了每次運行的觀察記錄。 [表1]
膜類型 膜的 MWCO 起始溶液 滲濾溶液 最終滲餘物 siRNA 濃度 （ mg/mL ） 觀察記錄
Millipore Pellicon®，100 cm 2 10 kDa 在Milli-Q水中的30 mg/mL siRNA 12 mM K 2HPO 4、8 mM KH 2PO 4、40 mM NaCl、和注射用水 0 滲透物中siRNA雙鏈體大量流通，導致回收率低。
Sartocon Slice 200 Hydrosart®，20 cm 2 2 kDa 在Milli-Q水中的30 mg/mL siRNA 12 mM K 2HPO 4、8 mM KH 2PO 4、40 mM NaCl、和注射用水 88 通量降至零阻止了進一步濃縮。流速太慢
Sartocon Slice 200 Hydrosart®，20 cm 2 5 kDa 在Milli-Q水中的30 mg/mL siRNA 12 mM K 2HPO 4、8 mM KH 2PO 4、40 mM NaCl、和注射用水 136 通量降至零阻止了進一步濃縮。
Sartocon Slice 200 Hydrosart膜，100 cm 2 5 kDa 在Milli-Q水中的30 mg/mL siRNA 12 mM K 2HPO 4、8 mM KH 2PO 4、40 mM NaCl、和注射用水 109 起始溶液的體積不足，並且通量降低阻止了進一步濃縮。
用於實驗的siRNA分子的分子量係16.3 kDa，並且因此選擇10-kDa過濾膜。然而，在UF/DF後，大多數siRNA係在滲透物中而不是在滲餘物中檢測到的。因此，使用10 kDa MWCO膜不被認為是好的選擇。鑒於以上結果，評估了具有更小MWCO（例如，＜ 10 kDa MWCO）的膜。分析了具有2 kDa或5 kDa的MWCO的Hydrosart膜（每個尺寸為20 cm 2）。如表1所示，與用具有2-kDa MWCO的膜所實現的濃度相比，具有5-kDa MWCO的膜導致更高的滲餘物siRNA濃度。2-kDa MWCO膜還顯示非常慢的流速（＜ 4 mL/min）。在這兩種情況下，通量降至零，這阻止了滲餘物中的siRNA的進一步濃縮。評估了另一種5-kDa MWCO膜（Sartocon Slice 200 Hydrosart膜，尺寸為100 cm 2）。用該膜實現的滲餘物siRNA濃度係109 mg/mL。更低的濃度可能是由於相比於與表1中另一5-kDa MWCO膜一起使用的起始溶液體積，在此實驗中使用的起始溶液體積更小。綜合而言，本研究的結果表明5-kDa MWCO膜顯示對siRNA分子的UF/DF的最高的適用性。
在所有情況下，無論使用何種膜，都觀察到通量下降，這限制了滲餘物中的siRNA濃度。不受任何特定理論的束縛，通量下降係膜污染的結果。進行了另外的研究以解決這一問題。 實例2
此實例描述了滲濾（DF）溶液鹽濃度對UF/DF後滲餘物中的siRNA濃度的影響。
為了檢查DF溶液鹽濃度對滲餘物siRNA濃度的影響，進行了一系列UF/DF運行以濃縮siRNA原料藥溶液。簡而言之，使用了配備有5 kDa MWCO Sartorius Hydrosart膜的Ambr切向流高通量小規模UF/DF系統。將包含在水中的30 mg/mL的siRNA分子（與實例1中使用的相同）的起始溶液（約25 mL）輸送至UF/DF系統中。將該起始溶液交換至10個滲濾體積的DF溶液中。DF溶液係1x PBS、0.5x PBS、或水。1x PBS包含以下組分：2.67 mM氯化鉀（KCl）、1.47 mM磷酸二氫鉀（KH 2PO 4）、137.93 mM氯化鈉（NaCl）、和8.06 mM磷酸氫二鈉（Na 2HPO 4-7H 2O）。0.5x PBS藉由用相等體積的水稀釋1xPBS而製備。在滲濾後，停止輸送滲濾溶液以啟動濃縮滲餘物中的siRNA的超濾製程。在與滲餘物不同的容器中收集滲透物溶液。當滲餘物體積減少至大約5 mL時或當滲透物流停止時，超濾製程完成。然後收穫滲餘物並且使其經受UV分析（在260 nm處）以確定siRNA雙鏈體濃度。表2總結了實驗條件和結果。 [表2]
起始溶液 DF 溶液 DF 溶液的 NaCl 濃度（ mM ） DF 溶液的總鹽濃度 滲餘物 siRNA 濃度（ mg/mL ）
在Milli-Q水中的30 mg/mL siRNA 水 無 0.000 31.8
在Milli-Q水中的30 mg/mL siRNA 0.5x PBS 69 85.1 111.4 
在Milli-Q水中的30 mg/mL siRNA 1x PBS 138 170.2 148.4 
如表2所示，增加DF溶液鹽濃度與增加的滲餘物siRNA濃度相關。使用1X PBS作為DF溶液，在滲餘物中實現了約150 mg/mL的siRNA分子濃度。最終滲余物中siRNA分子的回收率%係 ＞ 85%。而且，當1X PBS用作DF溶液時，維持通量的持續時間更長（相對於其他DF溶液）。當DF溶液係水時，觀察到通量的突然增加。通量的突然變化表示由高膜壓力/污染引起了膜破裂。該等結果顯示更高的DF溶液鹽濃度與滲餘物中更高的siRNA濃度以及膜通量維持的較長時間相關。 實例3
此實例描述了對用於UF/DF的PES膜的評估。
UF/DF基本上如實例2中所述進行，只是所用的膜係5-kDa Sartorius聚醚碸（PES）膜。起始溶液包含在水中的siRNA分子（30 mg/mL），並且DF溶液包含1X PBS。在該等條件下，滲餘物的siRNA濃度從30 mg/mL增加到151.7 mg/mL，增加了5倍。最終滲余物中siRNA分子的回收率%係 ＞ 85%。該等結果表明PES膜，和5 kDa MWCO穩定的纖維素一樣，也適用於siRNA分子的UF/DF。 實例4
此實例描述了DF溶液中的高鹽濃度的影響。
為了進一步評估DF溶液鹽濃度與滲餘物siRNA濃度之間的相關性，用包含更高鹽濃度的DF溶液進行了實例2的研究。在本研究中測試的DF溶液的氯化鈉濃度的範圍係40 mM至690 mM。包含最高氯化鈉濃度的DF溶液（5X PBS）藉由稀釋杜爾貝科（Dulbecco）10x磷酸鹽緩衝鹽水（dPBS）製備。dPBS包含以下：9.0 mM氯化鈣、4.9 mM氯化鎂、26.7 mM氯化鉀、14.7 mM磷酸二氫鉀、1379.3 mM氯化鈉、和80.6 mM磷酸氫二鈉。還藉由稀釋dPBS製備了包含中間氯化鈉濃度的DF溶液（2X PBS）。包含最低氯化鈉濃度的DF溶液係包含20 mM磷酸鹽緩衝液和40 mM氯化鈉的緩衝溶液。
在本研究中，使用了配備有5 kDa MWCO PES膜的UF/DF系統。起始溶液包含在水中的50 mg/mL ± 10 mg/mL siRNA（如實例1和圖3中所述之相同分子）。進行了約5個滲濾體積以確保完全交換至DF溶液中。促進超濾製程所需的製程參數（包括跨膜壓（TMP））在所有實驗中保持一致。使用UV光譜儀在260 nm處測量每次運行實現的滲餘物siRNA濃度。結果總結在表3中。 [表3]
起始溶液 DF 溶液 DF 溶液的 NaCl 濃度（ mM ） 1 DF 溶液的總鹽濃度（ mM ） 滲餘物 siRNA 濃度（ mg/mL ）
在Milli-Q水中的50 mg/mL siRNA 緩衝溶液* 40 84 130.4
在Milli-Q水中的50 mg/mL siRNA 1x PBS 138 170.0 149.0
在Milli-Q水中的50 mg/mL siRNA 2x PBS 276 340.4 194.3
在Milli-Q水中的50 mg/mL siRNA 5x PBS 690 850.0 172.9
*具有40 mM NaCl的20 mM磷酸鹽緩衝液
對於每次UF/DF，最終滲餘物中的siRNA雙鏈體的回收率%係 ＞ 80%。
圖4係一對圖，其示出了當DF溶液係具有20 mM磷酸鹽緩衝液和40 mM氯化鈉的緩衝溶液（紅色）或1X PBS（藍色）時，在UF/DF期間隨時間變化的示例性膜通量（上）和跨膜壓（下）。如圖4所示，與具有較高鹽濃度的DF溶液（150.2 mM總鹽濃度的1xPBS – 藍線）相比，當DF溶液具有較低的鹽濃度（60 mM總鹽濃度的配製緩衝液 – 紅線）時，在時間過程期間更早觀察到通量和TMP的巨大變化。該圖證實更高的DF溶液鹽濃度與膜通量維持的較長時間相關。
如表3所示，增加DF溶液的鹽濃度與滲餘物siRNA濃度的增加相關。使用包含高鹽濃度的DF溶液進行的每次UF/DF產生約150 mg/mL或更高的滲餘物siRNA濃度。有趣的是，2X PBS DF溶液導致比用5X PBS DF溶液所實現的濃度更高的滲餘物siRNA濃度（約194.3 mg/mL，相比於172.9 mg/mL）。不希望受任何特定理論的束縛，假設一旦帶負電荷siRNA分子的活性官能基被與陽離子的離子相互作用飽和，鹽濃度的進一步增加對於提高滲餘物濃度和DS溶液鹽濃度影響平臺期沒有幫助。綜合而言，該等結果表明通常較高的DF溶液鹽濃度導致更高的滲餘物siRNA濃度，並且因此增加DF溶液的鹽濃度係獲得高濃度寡核苷酸化合物溶液的有效方法。 實例5
此實例描述了對DF溶液中二價陽離子鹽的評估。
在實例2至實例4中，DF溶液的鹽濃度基於氯化鈉含量，因為相對於DF溶液中存在的其他鹽的量，該鹽以主導量存在。為了評估DF溶液中鹽的類型對滲餘物中siRNA濃度的影響，使用了包含在水中的二價鹽氯化鎂的DF溶液。除了DF溶液包含在水中的138 mM氯化鎂之外，UF/DF條件與實例4中所述之那些係相同的。表4提供了此實驗的細節和所得滲餘物siRNA濃度。 [表4]
起始溶液 DF 溶液 MgCl 2 濃度（ mM ） 滲餘物 siRNA 濃度（ mg/mL ）
在水中的40 ± 10 mg/mL siRNA 在水中的138 mM氯化鎂 138.0 209.1
最終滲餘物中的siRNA雙鏈體的回收率%係 ＞ 85%。如表4所示，使用包含138 mM的二價陽離子鹽的DF溶液產生了更高的滲餘物siRNA濃度（約209.1 mg/mL）。這一滲餘物siRNA濃度高於用相同濃度的一價陽離子鹽氯化鈉所實現的濃度（149.0 mg/mL；參見表3）。綜合而言，該等結果證實二價鹽在超濾製程期間示出對siRNA濃度的顯著影響。 實例6
此實例描述了針對siRNA分子的穩定性和結構對DF溶液中鹽濃度的評估。
為了更好地瞭解增加的滲餘物siRNA濃度與DF溶液中高鹽濃度之間的關係，在存在和不存在鹽的情況下評估了siRNA分子的所選物理特性。該等實驗中使用了實例1和圖3中所述之相同siRNA分子。分別使用微差掃描熱量法（DSC）和Malvern粒度分析儀（Malvern Mastersizer）測量siRNA雙鏈體展開溫度（T m）和流體動力學直徑（d h）。結果示出在圖5和圖6中。如圖5所示，展開溫度隨著鹽濃度的增加而增加。由於展開溫度指示了使siRNA雙鏈體變性所需的能量，該等數據表明siRNA雙鏈體的穩定性隨著DF溶液中的鹽濃度的增加而增加。
如圖6所示，增加的鹽濃度（高達約600 mM）與增加的流體動力學直徑相關，這表明該鹽與siRNA分子相互作用的方式使流體動力學直徑增加，並且導致結構與不存在任何鹽的情況下的此分子的結構不同。不受特定理論的束縛，據推測在存在鹽的情況下siRNA雙鏈體的結構差異允許改善膜通量，從而導致更高的滲餘物siRNA濃度。 實例7
此實例描述了對用於製備高濃度寡核苷酸化合物溶液的各種無機鹽溶液的評估。
我們早期研究的結果證實，包含約138 mM至約850 mM的總鹽濃度的鹽溶液可用作UF/DF中的DF溶液，以獲得包含高濃度（大於150 mg/mL）寡核苷酸化合物的滲餘物。為了更好地瞭解可用於此目的的鹽的類型，製備了包含不同無機鹽的溶液，並且將其用於濃縮（經由超濾）低濃度寡核苷酸化合物溶液。
在本研究中，使用配備有3 kDa纖維素膜的高通量液體分配儀器進行超濾和滲濾。藉由將小體積的siRNA儲備溶液添加至包含無機鹽的溶液中製備包含200 mM無機鹽和濃度小於140 mg/mL的siRNA的起始溶液。每個起始溶液的最終siRNA濃度和最終無機鹽濃度分別是84 mg/mL和200 mM。將每個起始溶液的等分試樣放置於多孔板的孔中，並且進行超濾。每個起始溶液受壓通過位於每個孔底部的膜，然後水和無機鹽作為滲透物收集在滲透物容器中，siRNA則保留在孔中。藉由儀器的基於雷射的檢測器監測多孔板的每個孔的體積，並且當檢測到的體積低於預選定的體積時，儀器將DF溶液添加至孔中。DF溶液與起始溶液相同，只是不含siRNA。繼續此過程直到所有樣本達到目標體積。運行時間典型地是約12小時。本研究中所使用的siRNA與實例1中所述之siRNA相同（以下稱為「siRNA #1」）。樣本一式三份運行。在運行12小時後使用UV光譜儀在260 nm處測量siRNA濃度。表5總結了全部溶液和所得siRNA濃度（報告為三個數據點的平均值）。最右邊一列提供了標準差。 [表5]
起始溶液 DF 溶液 平均滲餘物 siRNA #1 濃度（ mg/mL ） 標準差
在 200 mM NH 4Cl 中的 84 mg/mL siRNA #1 200 mM NH 4Cl 182.1 21.2
在 200 mM KCl 中的 84 mg/mL siRNA #1 200 mM KCl 220.7 32.1
在 200 mM LiCl 中的 84 mg/mL siRNA #1 200 mM LiCl 186.8 2.4
在 200 mM NaBr 中的 84 mg/mL siRNA #1 200 mM NaBr 204.6 7.2
如表5所示，將包含200 mM無機鹽和84 mg/mL siRNA的每種起始溶液成功濃縮至大於150 mg/mL的siRNA濃度。包含鹼金屬鹽KCl和LiCl的起始溶液很好地適用於此目的。包含溴化鈉的起始溶液也實現了高siRNA濃度，這表明該無機鹽可以具有除氯離子以外的相對離子。此外，氯化銨溶液很好地獲得了高siRNA濃度滲餘物，這證實鹼金屬鹽以外的無機鹽可以用於濃縮siRNA。
基於表5所呈現的結果，計算了每種鹽實現150 mg/mL滲餘物寡核苷酸濃度所需的理論最小濃度。KCl和LiCl的理論最小濃度分別是83.3 mM和111.7 mM，而氯化銨和溴化鈉的理論最小濃度分別是117.3 mM和94.8 mM。 實例8
此實例描述了對用於製備高濃度寡核苷酸化合物溶液的含二價陽離子無機鹽的評估。
在較早的研究（實例5）中，使用包含濃度為138 mM的含二價陽離子無機鹽的DF溶液實現了209 mg/mL的寡核苷酸化合物濃度。為了確定其他含二價陽離子的無機鹽是否可以用於獲得高濃度寡核苷酸滲餘物，製備了包含氯化鈣的溶液。本研究中所使用的寡核苷酸化合物係siRNA #1。由於在200 mM氯化鈣中觀察到siRNA溶解度低，因此在50 mM氯化鈣中製備siRNA。對包含在50 mM氯化鈣中的84 mg/mL siRNA的起始溶液的濃縮基本上如實例7所述的進行。樣本一式三份運行。在運行12小時後使用UV光譜儀在260 nm處測量siRNA #1濃度。表6總結了全部溶液和所得siRNA濃度（報告為三個數據點的平均值）。最右邊一列提供了標準差。 [表6]
起始溶液 DF 溶液 平均滲餘物 siRNA #1 濃度（ mg/mL ） 標準差
在 50 mM CaCl 2 中的 84 mg/mL siRNA #1 50 mM CaCl 2 176.84 22.5
如表6所示，將包含50 mM氯化鈣和84 mg/mL siRNA的起始溶液成功濃縮至大於150 mg/mL的siRNA濃度。基於表6所呈現的結果，經計算，氯化鈣實現150 mg/mL siRNA濃度所需的理論最小濃度為31 mM。該等結果表明DF溶液的總鹽濃度可以低至31 mM即可得到包含約150 mg/mL siRNA的滲餘物。 實例9
此實例描述了對用於製備高濃度寡核苷酸化合物溶液的有機鹽溶液的評估。
為了確定有機鹽是否可以用於獲得高濃度寡核苷酸滲餘物，使用包含氯化膽鹼（CCl）、四甲基氯化銨（TMACl）和苄基三甲基氯化銨（BTMACl）的溶液來製備包含低濃度的siRNA的起始溶液。本研究中所使用的siRNA係siRNA #1。對包含在200 mM CCl、TMACl或BTMACl中的84 mg/mL siRNA的起始溶液的濃縮基本上如實例7所述的進行。樣本一式三份運行。在運行12小時後使用UV光譜儀在260 nm處測量siRNA濃度。表7總結了全部溶液和所得siRNA濃度（報告為三個數據點的平均值）。最右邊一列提供了標準差。 [表7]
起始溶液 DF 溶液 平均滲餘物 siRNA #1 濃度（ mg/mL ） 標準差
在 200 mM CCl 中的 84 mg/mL siRNA #1 200 mM CCl 195.3 17.3
在 200 TMACl 中的 84 mg/mL siRNA #1 200 mM TMACl 111.5 5.2
在 BTMACl 中的 84 mg/mL siRNA #1 200 mM BTMACl 140.4 3.8
如表7所示，只有CCl溶液將siRNA成功濃縮至大於150 mg/mL。基於表7所呈現的結果，計算了每種鹽實現150 mg/mL滲餘物寡核苷酸濃度所需的理論最小濃度。CCl、TMACl和BTMACl的理論最小濃度係102.9 mM、460.0 mM和209.2 mM，這表明更高濃度的BTMACl或TMACl可以導致150 mg/mL的siRNA濃度。 實例10
此實例描述了用不同寡核苷酸化合物進行的研究。
到目前為止，本文所述之實驗使用siRNA #1進行。在本研究中，使用了不同的siRNA（siRNA #2）。siRNA #2係雙股siRNA分子，其選擇性靶向含馬鈴薯糖蛋白（patatin）樣磷脂酶結構域3（PNPLA3）。siRNA #2的有義股長度為21個核苷酸，反義股長度為23個核苷酸。與siRNA #1一樣，siRNA #2含有幾種經修飾的核苷酸以及連接到有義股的5’端的包含N-乙醯基半乳糖胺的靶向配體（用於選擇性靶向肝臟）。
製備包含80 mg/mL siRNA #2和200 mM NaCl的起始溶液，並且對該起始溶液的濃縮基本上如實例7所述的進行。樣本一式三份運行。在運行12小時後使用UV光譜儀在260 nm處測量siRNA濃度。表8總結了全部溶液和所得siRNA濃度（報告為三個數據點的平均值）。最右邊一列提供了標準差。 [表8]
起始溶液 DF 溶液 平均滲餘物 siRNA 濃度（ mg/mL ） 標準差
在 200 mM NaCl 中的 80 mg/mL siRNA #2 200 mM NaCl 213.2 7.1
如表8所示，將包含低濃度的siRNA #2的起始溶液成功濃縮至大於150 mg/mL。基於表8所呈現的結果，計算了每種鹽實現150 mg/mL滲餘物寡核苷酸濃度所需的理論最小濃度。NaCl的理論最小濃度係88.3 mM。該等結果表明DF溶液的總鹽濃度可以低至88 mM即可得到包含約150 mg/mL siRNA的滲餘物。 實例11
此實例描述了製備包含寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物的示例性方法。
如下製備包含雙股（ds）siRNA的高濃度液體組成物：有義股和反義股中的每一個經由固相合成製備。在將合成股從固體支持物切割以及對雜環鹼基和骨架進行去保護中後，進行第一次UF/DF以濃縮鏈並且將其交換到適合於層析法的新緩衝液中。然後使緩衝液交換的鏈經受層析分離以去除雜質。進行第二次UF/DF以濃縮鏈並且將其交換至適合於鏈退火過程的新緩衝液中。將有義股和反義股合併用於鏈退火過程以獲得ds siRNA。在鏈退火過程後ds siRNA的濃度範圍典型地是25 mg/mL至50 mg/mL。進行最終的UF/DF以將雙股siRNA濃縮至大於150 mg/mL的濃度。在該最終的UF/DF中，使用了如下的滲濾溶液，該滲濾溶液包含約50 mM至約150 mM的含二價陽離子鹽或約75 mM至約500 mM的含一價陽離子鹽。將包含ds siRNA的高濃度液體組成物冷凍儲存或使其經受一系列用於降低生物負載和滅菌的過濾，然後填充至注射器、自動注射器、或小瓶中。然後儲存填充的注射器、自動注射器、或小瓶直至運輸。圖7中提供了製程之簡化示意圖。
以上方法不包括凍乾步驟，並且因此提供了耗能少且更具成本效益的獲得包含高濃度的寡核苷酸化合物原料藥的液體（例如水溶液）之方式。 序列表
SEQ ID NO: 簡稱 序列（ 5’ → 3’ ） 說明
1 有義股 未經修飾的序列 CAG CCC CUU AUU GUU AUA CGA
2 反義股 未經修飾的序列 UCG UAU AAC AAU AAG GGG CUG
3 有義股 經修飾的序列 CAG CCC CUU AUU GUU AUA CGA 其中： •  1-8 和 12-20 位的每個核苷酸均為 2'-O- 甲基核苷酸 •  9-11 位的每個核苷酸均為 2'- 去氧 -2'- 氟核苷酸 •  21 位的核苷酸係去氧核苷酸 •  1 和 2 位的核苷酸藉由硫代磷酸酯鍵連接 •  20 和 21 位的核苷酸藉由硫代磷酸酯鍵連接 •  1 位的核苷酸藉由硫代磷酸酯鍵附接至 R1 ，其中 R1 係 N- 乙醯基半乳糖胺糖肽 •  20 和 21 位的核苷酸藉由 3′-3′ 鍵連接
4 反義股 經修飾的序列 UCG UAU AAC AAU AAG GGG CUG 其中： •  1 、 3 、 5 、 7-11 、 13 、 15 、 17 、 19 和 21 位的每個核苷酸均為 2'-O- 甲基核苷酸 •  2 、 4 、 6 、 12 、 14 、 16 、 18 和 20 位的每個核苷酸均為 2'- 去氧 -2'- 氟核苷酸 •  1 和 2 位的核苷酸藉由硫代磷酸酯鍵連接 •  2 和 3 位的核苷酸藉由硫代磷酸酯鍵連接 •  19 和 20 位的核苷酸藉由硫代磷酸酯鍵連接 •  20 和 21 位的核苷酸藉由硫代磷酸酯鍵連接
本文所引用的所有參考文獻（包括出版物、專利申請、和專利）均藉由引用在此併入，引用的程度如同每個參考文獻被單獨地並且明確地指示藉由引用併入並且以其全文在本文闡述。
除非本文中另外指示或上下文明顯相矛盾，否則在描述本揭露的上下文中（特別是在以下請求項的上下文中）使用術語「一個/一種（a/an）」和「該（the）」以及類似指示物將視為涵蓋單數與複數兩者。除非另外指明，否則術語「包含/包括」、「具有」、「包括」和「含有」將視為包括指明的一或多個組分但是不排除其他成分的開放性術語（即意指「包括，但不限於」）。
在本文引證數值的範圍僅旨在用作單獨地提及每個單獨的數值落在該範圍內和每個端點的速記的方法，除非本文另外說明，並且每個單獨的數值和端點被併入本說明書中就像它被單獨地在本文引證一樣。
除非本文中另外指示或與上下文另外明顯相矛盾，否則本文所述之所有方法均可按任何合適的順序進行。除非另外要求保護，否則關於本文提供的任何和所有實例或示例性語言（如「例如」）的使用僅旨在更好地描述本揭露，而非對本揭露的範圍施加限制。說明書中的語言不應當被解釋為指示任何未要求保護的要素為實踐本揭露所必需的。
本文描述了本揭露之較佳的實施方式，包括諸位發明人已知用於實施本揭露之最佳方式。在閱讀以上描述後，那些較佳的實施方式的變化對於本領域中普通技術者係顯而易見的。諸位發明人預期熟練技術者視情況採用此類變化，且諸位發明人旨在以除本文特別描述外的方式實施本揭露。因此，本揭露包括所附申請專利範圍中敘述的主題的為適用法律所允許的所有修改和等同物。此外，除非本文中另外指示或上下文另外明顯相矛盾，否則本揭露涵蓋上述要素以其所有可能變化的任何組合。
無
[圖1A]係用粉末原料藥製造藥物產品之製程流程圖。圖1B係用散裝液體原料藥製造藥物產品之製程流程圖。
[圖2]係用於製備包含寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物的示例性方法之圖。溶液的移動方向用黑色實心箭頭示出。
[圖3]示意性地描繪了模型寡核苷酸化合物的結構。按5’至3’方向列出的上股係有義股（SEQ ID NO: 3），並且按3'至5'方向列出的下股係反義股（SEQ ID NO: 4）。黑色圓圈代表具有2'-O-甲基修飾的核苷酸，白色圓圈代表具有2'-去氧-2'-氟（「2'-氟」）修飾的核苷酸，並且灰色圓圈代表經由3'-3'鍵與相鄰核苷酸連接的去氧腺苷核苷酸（即，反向的）。連接圓圈的灰色線代表磷酸二酯鍵，而連接圓圈的黑色線代表硫代磷酸酯鍵。具有所描繪結構的三價GalNAc部分由R1代表，並且藉由硫代磷酸酯鍵與有義股的5'端共價附接。
[圖4]係示出在Ambr切向流系統設置中使用以下兩種不同的DF溶液通過5 kDa Hydrosart穩定的纖維素膜的膜通量（上）和壓力（下）之層析圖：(i) 1x PBS以及 (ii) 包含20 mM磷酸鹽緩衝液和40 mM NaCl的緩衝溶液。
[圖5]係置於包含各種鹽濃度的DF溶液的寡核苷酸化合物的展開溫度之圖。
[圖6]係置於包含各種鹽濃度的DF溶液的寡核苷酸化合物的流體動力學直徑之圖。
[圖7]係包含有義股和反義股的雙股寡核苷酸化合物的示例性製造製程之簡化示意圖。在將有義股和反義股退火前，將每條股單獨合成，並且隨後經由層析法和/或UF/DF純化，緩衝液交換，和/或濃縮。退火後，將雙股寡核苷酸化合物經由UF/DF進行緩衝液交換並濃縮以獲得高濃度原料藥（雙股寡核苷酸化合物）溶液，其中該雙股寡核苷酸化合物的濃度大於150 mg/mL。將高濃度原料藥溶液用於製備DP，並且進行無菌過濾並填充至容器中。視需要，在無菌過濾和填充前，將高濃度原料藥溶液交換至配製緩衝液中。視需要，在無菌過濾和填充後將DP儲存。在該製程期間的任何時候都不進行凍乾。
無
TW202342068A_112107029_SEQL.xml

Claims (66)

  1. 一種製備包含寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物之方法，所述方法包括： a.      藉由滲濾將起始溶液中的寡核苷酸化合物交換至滲濾（DF）溶液中以獲得中間溶液，其中該起始溶液中的該寡核苷酸化合物的濃度係140 mg/mL或更低，並且該DF溶液包含一或多種鹽 並且該DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約800 mM，以及 b.     藉由超濾將該中間溶液中的該寡核苷酸化合物濃縮以獲得高濃度液體組成物，其中該高濃度液體組成物中的該寡核苷酸化合物的濃度大於約150 mg/mL。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該滲濾係連續滲濾以及/或者該超濾係藉由切向流過濾進行的超濾。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中該方法採用聚醚碸（PES）膜或穩定的纖維素膜進行該滲濾和/或超濾。
  4. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該膜的截留分子量（MWCO）小於10 kDa。
  5. 如請求項4所述之方法，其中該膜的MWCO係約5 kDa或小於5 kDa。
  6. 如請求項5所述之方法，其中該膜的MWCO係約3 kDa。
  7. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該DF溶液包含無機鹽，基本上由其組成，或由其組成。
  8. 如請求項7所述之方法，其中該無機鹽包含一價陽離子。
  9. 如請求項7或8所述之方法，其中該無機鹽包含鹼金屬，視需要，鈉、鉀、或鋰。
  10. 如請求項7至9中任一項所述之方法，其中該無機鹽包含鹵素相對離子，視需要氯離子或溴離子。
  11. 如請求項7至10中任一項所述之方法，其中該無機鹽係氯化鈉、溴化鈉、氯化鉀、或氯化鋰。
  12. 如請求項8所述之方法，其中該一價陽離子係銨陽離子，視需要，其中該無機鹽係氯化銨。
  13. 如請求項7所述之方法，其中該無機鹽包含二價陽離子。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該二價陽離子係鹼土金屬，視需要，鎂或鈣。
  15. 如請求項14所述之方法，其中該無機鹽係氯化鎂或氯化鈣。
  16. 如請求項1至6中任一項所述之方法，其中該DF溶液包含有機鹽，基本上由其組成，或由其組成。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該有機鹽包含四級銨陽離子，視需要，其中該有機鹽係氯化膽鹼或苄基三甲基氯化銨。
  18. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約500 mM。
  19. 如請求項18所述之方法，其中該DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約250 mM。
  20. 如請求項19所述之方法，其中該DF溶液的總鹽濃度係約25 mM至約150 mM。
  21. 如請求項18所述之方法，其中該DF溶液包含含有二價陽離子的無機鹽，視需要，氯化鈣或氯化鎂，基本上由其組成，或由其組成。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該DF溶液的總鹽濃度係約75 mM至約300 mM。
  23. 如請求項18所述之方法，其中該DF溶液的總鹽濃度係約75 mM至約250 mM。
  24. 如請求項22或23所述之方法，其中該DF溶液包含含有一價陽離子的無機鹽，基本上由其組成，或由其組成。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該DF溶液包含約75 mM至約300 mM氯化鈉、溴化鈉、氯化鋰、氯化鉀、或氯化銨。
  26. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該DF溶液的總鹽濃度係每負電荷該寡核苷酸化合物約3.0 mM至18.0 mM。
  27. 如請求項26所述之方法，其中該DF溶液的總鹽濃度係每負電荷該寡核苷酸化合物至少約3.0 mM或約3.5 mM。
  28. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該DF溶液包含基本鹽以及至少一種其他鹽。
  29. 如請求項28所述之方法，其中該基本鹽的濃度比該DF溶液的其他一或多種鹽的濃度高至少2倍。
  30. 如請求項29所述之方法，其中該基本鹽的濃度比該DF溶液的其他一或多種鹽的濃度高至少3倍。
  31. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該DF溶液包含緩衝液。
  32. 如請求項31所述之方法，其中該緩衝液係磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。
  33. 如請求項28-32中任一項所述之方法，其中該DF溶液中的基本鹽的濃度基於該起始溶液中存在的寡核苷酸化合物的濃度。
  34. 如請求項28至33中任一項所述之方法，其中該起始溶液的寡核苷酸化合物與該DF溶液的基本鹽的莫耳比係約1 : 2至約1 : 100、約1 : 3至約1 : 80、或約1 : 5至約1 : 65。
  35. 如請求項28至34中任一項所述之方法，其中該DF溶液的該基本鹽的濃度係該DF溶液的總鹽濃度的至少80%。
  36. 如請求項35所述之方法，其中該DF溶液的該基本鹽的濃度係該DF溶液的總鹽濃度的至少90%。
  37. 如請求項28-36中任一項所述之方法，其中該DF溶液的基本鹽濃度係約50 mM至約500 mM。
  38. 如請求項37所述之方法，其中該DF溶液的基本鹽濃度係約100 mM至約600 mM。
  39. 如請求項38所述之方法，其中該DF溶液的基本鹽濃度係至少125 mM。
  40. 如請求項39所述之方法，其中該DF溶液的基本鹽濃度係至少130 mM。
  41. 如請求項40所述之方法，其中該DF溶液的基本鹽濃度係至少140 mM。
  42. 如請求項28-41中任一項所述之方法，其中該基本鹽包含一價陽離子。
  43. 如請求項42所述之方法，其中該一價陽離子係鈉。
  44. 如請求項43所述之方法，其中該基本鹽係氯化鈉。
  45. 如請求項28-44中任一項所述之方法，其中該基本鹽包含二價陽離子。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該二價陽離子係鎂。
  47. 如請求項46所述之方法，其中該基本鹽係氯化鎂。
  48. 如請求項1至8、10、12-24和26-47中任一項所述之方法，其中該DF溶液基本上不含鉀。
  49. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中最終滲餘物包含該起始溶液的該寡核苷酸化合物的量的至少80%。
  50. 如請求項49所述之方法，其中最終滲餘物包含該起始溶液的該寡核苷酸化合物的量的至少85%。
  51. 如前述請求項中任一項所述之方法，該方法進一步包括將最終滲餘物精加工或精製，其中該方法視需要進一步包括收集最終滲餘物並且將該最終滲餘物填充至容器中，寡核苷酸總回收率大於80%。
  52. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法不包括該寡核苷酸化合物的凍乾。
  53. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該寡核苷酸化合物係雙股的或單股的。
  54. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該寡核苷酸化合物係siRNA。
  55. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該寡核苷酸化合物係反義寡核苷酸（ASO）。
  56. 如請求項53所述之方法，其中該雙股的寡核苷酸化合物包含反義寡核苷酸和正義寡核苷酸，其中該等反義寡核苷酸和正義寡核苷酸中的每一個獨立地包含至少11個核苷酸，視需要約20-30個核苷酸或約20-25個核苷酸。
  57. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該寡核苷酸化合物的分子量大於約7,000道爾頓。
  58. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在該滲餘物容器中該最終滲餘物的寡核苷酸化合物的濃度比該起始溶液的寡核苷酸化合物濃度高至少2倍。
  59. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在該滲餘物容器中該最終滲餘物的寡核苷酸化合物的濃度比該起始溶液的寡核苷酸化合物濃度高至少3倍。
  60. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在該滲餘物容器中該最終滲餘物的寡核苷酸化合物的濃度比該起始溶液的寡核苷酸化合物濃度高至少4倍。
  61. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在該滲餘物容器中該最終滲餘物的寡核苷酸化合物的濃度比該起始溶液的寡核苷酸化合物濃度高至少5倍。
  62. 一種高濃度液體組成物，該高濃度液體組成物藉由如前述請求項中任一項所述之方法製備。
  63. 一種冷凍製劑，該冷凍製劑藉由將如請求項62所述之液體組成物儲存在低於0°C的溫度下，視需要，儲存在-20°C下製備。
  64. 一種製造包含寡核苷酸化合物的藥物之方法，該方法包括進行如請求項1-61中任一項所述之方法以獲得包含至少150 mg/mL的該寡核苷酸化合物的高濃度液體組成物，將該高濃度液體組成物與藥學上可接受的賦形劑一起配製，以及將該配製的高濃度液體組成物填充至容器中。
  65. 一種治療患有疾病的受試者之方法，所述方法包括以有效治療該受試者的該疾病的量向該受試者投與藉由如請求項64所述之方法製造的藥物，視需要，其中該藥物藉由注射或輸注投與。
  66. 如請求項62所述之高濃度液體組成物在製造用於治療受試者的疾病的藥物中之用途。
TW112107029A 2022-02-25 2023-02-24 製備高濃度液體原料藥之方法 TW202342068A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202263313840P 2022-02-25 2022-02-25
US63/313,840 2022-02-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202342068A true TW202342068A (zh) 2023-11-01

Family

ID=85800639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW112107029A TW202342068A (zh) 2022-02-25 2023-02-24 製備高濃度液體原料藥之方法

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202342068A (zh)
WO (1) WO2023164631A1 (zh)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US6693187B1 (en) 2000-10-17 2004-02-17 Lievre Cornu Llc Phosphinoamidite carboxlates and analogs thereof in the synthesis of oligonucleotides having reduced internucleotide charge
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US20060051347A1 (en) 2004-09-09 2006-03-09 Winter Charles M Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof
EP3730619A1 (en) 2013-06-21 2020-10-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of target nucleic acids
CN107873055B (zh) * 2015-05-29 2021-09-17 库瑞瓦格房地产有限公司 包括至少一个切向流过滤步骤的产生和纯化rna的方法
MX2022010310A (es) * 2020-02-21 2023-01-24 Biogen Ma Inc Métodos de preparación de composiciones de oligonucleótidos utilizando ultrafiltración / diafiltración.

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023164631A1 (en) 2023-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6141770B2 (ja) アンチセンス核酸
KR102335801B1 (ko) 안티센스 핵산
JP6231029B2 (ja) マイクロｍｉｒ
JP6328603B2 (ja) 転写因子ｅ３（ｔｆｅ３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｔｆｅ３およびインスリン受容体基質２（ｉｒｓ２）関連疾患の処置
JP5904935B2 (ja) デルタ様１ホモログ（ｄｌｋ１）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｄｌｋ１関連疾患の治療
US20160122760A1 (en) Compositions and methods for modulating foxp3 expression
JP2024038104A (ja) アンチセンス核酸
WO2013173637A1 (en) Compositions and methods for modulating gene expression
KR20240027890A (ko) 지질양이온성 덴드리머 및 이의 용도
EP3620519A1 (en) Use of isolated milk extracellular vesicles for delivering oligonucleotides orally
CN113710353A (zh) 涡流混合器及其相关方法、系统和装置
WO2017135397A1 (ja) 補体ｂ因子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド
WO2019204451A1 (en) Enhanced lipid nanoparticle drug delivery using a negatively charged polymer
CA3060090A1 (en) P-ethoxy nucleic acids for igf-1r inhibition
TW202342068A (zh) 製備高濃度液體原料藥之方法
CA3057974A1 (en) P-ethoxy nucleic acids for igf-1r inhibition
WO2017181026A1 (en) Selective modulation of foxp3 expression
AU2018255352B2 (en) P-ethoxy nucleic acids for STAT3 inhibition
IL255180B1 (en) Antisense oligonucleotides for the treatment of vesicular dissolution of dystrophic skin
KR20160108494A (ko) β2GPI의 발현을 억제하는 핵산
JP2023533124A (ja) 二本鎖オリゴヌクレオチド及びこれを含むコロナウイルス感染症－１９（ｃｏｖｉｄ－１９）治療用組成物
WO2012075114A2 (en) Nucleic acid-polymer conjugates and uses thereof
CA3165961A1 (en) Antisense nucleic acid that induces skipping of exon 50
TW202200162A (zh) 誘導外顯子５１跳讀的反義核酸
WO2021099394A1 (en) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer