TW202322792A

TW202322792A - 軟骨再生組成物

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Publication number: TW202322792A
Application number: TW111141427A
Authority: TW
Inventors: 水品善之; 戶口田淳也; 金永輝
Original assignee: 日商小林製藥股份有限公司; 國立大學法人京都大學
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2022-10-31
Publication date: 2023-06-16
Also published as: JPWO2023074893A1; WO2023074893A1

Abstract

本發明之目的在於提供一種軟骨再生促進劑。一種軟骨再生促進劑，包含：(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、玻尿酸及其鹽、蛋白聚醣以及其等之構成醣所構成之群組的醣。

Description

軟骨再生組成物

本發明係有關於一種軟骨再生組成物。

背景技術因軟骨之退化性變性而產生的變形性關節症、因外傷所造成之軟骨損傷等軟骨損傷所引起的關節痛等係限制日常生活活動之很大的主要原因，在高齡社會中，其對應係越來越重要的課題。目前並不存在有針對軟骨損傷的根本性保守治療，而作為針對疼痛之對症療法，現已有採用非類固醇性消炎劑(NSAID)之口服投予、類固醇之關節內注入。又，現亦有廣泛地進行軟骨之重要成分醣胺聚醣(GAG)之一--玻尿酸之關節內注入，雖確認到其對於疼痛有一定的效果，但對於軟骨再生之效果則並不確定。

葡萄糖胺係構成GAG的胺基糖之一。葡萄糖胺係包含於蝦/蟹等甲殻類、獨角仙等昆蟲類、真菌類之細胞壁等，係作為幾丁質之構成單位而廣泛存在於自然界的單醣類之1種。又，至今研究到其在生物體內作為黏多醣之構成醣存在等在生物體內的重要角色。葡萄糖胺不僅是可成為軟骨、結締組織之成分，亦有報告指出其以嗜中性球為中介之抗炎症作用，且有報告指出其可作為對關節炎有效的成分(專利文獻1)。

雖然並不清楚經口服攝取的葡萄糖胺可參與關節軟骨代謝至何種程度，但目前以軟骨損傷之治療或預防效果為目的，已有積極地嘗試將葡萄糖胺利用在食品、準醫藥品或醫藥品中。舉例而言，現已有提案將包含膠原蛋白、甲基磺醯基甲烷、葡萄糖胺及軟骨素之關節痛改善用組成物之包含每日2000mg以上攝取量膠原蛋白的組成物，作為可減輕/治療/預防關節炎等關節痛症狀之關節痛改善用組成物、關節痛改善劑或食品(專利文獻2)。

另一方面，已知藤黃屬之果皮所含有的羥基檸檬酸可抑制過剩攝取的醣質作為體脂肪儲存，且可促進脂肪之消費。又，有報告指出藉由作成在藤黃屬抽出萃取物中組合咖啡因而成的組成物，可更有效地促進脂肪代謝(專利文獻3)。習知技術文獻專利文獻

[專利文獻1]日本專利特表2004-529860號公報 [專利文獻2]日本專利特開2009-051833號公報 [專利文獻3]日本專利特開2001-258506號公報

發明概要發明欲解決之課題葡萄糖胺在軟骨損傷之治療或預防中的效果係廣受矚目，而已有研究各種含有葡萄糖胺之組成物，但其效果仍難謂有充分的水準。因此，本發明人認為，若作為具有促進軟骨再生作用的成分，可期待其在軟骨損傷之治療或預防上有進一步的效果。

本發明之目的在於提供一種具有優異的軟骨再生促進作用之軟骨再生促進劑。用以解決課題之手段

本發明人發現到，藉由將羥基檸檬酸及/或其鹽，與指定的軟骨成分組合，可發揮優異的軟骨再生促進作用。本發明係基於如此的見解且藉由進一步反覆研究而完成者。

亦即，本發明提供下述所揭態樣之發明。項1.　一種軟骨再生促進劑(軟骨再生組成物)，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。項2.　如項1所記載之軟骨再生促進劑，其中前述構成醣係選自於由以下所構成之群組的亦可經N-乙醯基化的己糖胺：葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺硫酸及其鹽、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺，以及N-乙醯基半乳糖胺硫酸及其鹽。項3.　如項1或2所記載之軟骨再生促進劑，其中，相對於前述(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，前述(B)成分的總量之含量為0.001~6重量份。項4.　如項1~3中任一項所記載之軟骨再生促進劑，含有包含前述(A)成分之植物萃取物。項5.　如項4所記載之軟骨再生促進劑，其中前述植物萃取物為藤黃屬萃取物。項6.　如項4或5所記載之軟骨再生促進劑，其中，相對於前述植物萃取物1重量份，前述(B)成分的總量之含量為0.0015~10重量份。項7.　如項1~6中任一項所記載之軟骨再生促進劑，其中前述(B)成分為硫酸軟骨素。項8.　一種自未分化細胞往軟骨細胞之分化促進劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。項9.　一種變形性膝關節症治療劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。項10.　一種軟骨之分解抑制劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。項11.　一種用於維持軟骨厚度之保護劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。項12.　一種關節之疼痛、不協調感及/或不適感之緩和劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。發明效果

依據本發明，可提供一種具有優異軟骨再生促進作用之軟骨再生促進劑。再者，依據本發明，亦可提供一種自未分化細胞往軟骨細胞之分化促進劑、變形性膝關節症治療劑、軟骨之分解抑制劑、用於維持軟骨厚度之保護劑，以及關節之疼痛、不協調感及/或不適感之緩和劑。

用以實施發明之形態 1.軟骨再生促進劑本發明之軟骨再生促進劑之特徵在於包含：(A)羥基檸檬酸及/或其鹽(於以下亦記載為「(A)成分」或「羥基檸檬酸類」。)；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣以及其等之構成醣所構成之群組之醣(於以下亦記載為「(B)成分」或「指定的醣」。)。

(A)羥基檸檬酸類本發明之軟骨再生促進劑包含羥基檸檬酸及/或其鹽來作為(A)成分。

羥基檸檬酸係具有2個不對稱中心之α-羥基三元酸(1,2-二羥基丙烷-1,2,3-三羧酸)，且形成2對之非鏡像異構物或4個不同的異構物。具體而言，作為羥基檸檬酸，可列舉(-)羥基檸檬酸、(+)羥基檸檬酸、(-)別(allo)-羥基檸檬酸及(+)別(allo)-羥基檸檬酸。該等異構物可單獨使用1種，又亦可組合2種以上使用。於該等異構物之中，從獲得進一步更佳的軟骨再生促進效果的觀點來看，較佳為(-)羥基檸檬酸及(+)別(allo)-羥基檸檬酸。

羥基檸檬酸及其鹽，具體而言，係以下述通式(I)及(II)表示。

[化1]

[化2]

於本發明中，羥基檸檬酸及其鹽之中亦將前述式(I)所表示的化合物記載為「非內酯體」或「自由體(free form)」，且將式(II)所表示的化合物(亦即，自由體之脫水縮合環化物)記載為「內酯體(lactone form)」。

當前述式(I)及(II)中所示化合物為羥基檸檬酸時，前述式(I)及(II)中，M ¹、M ²及M ³皆為氫原子。

當前述式(I)及(II)中所示化合物為羥基檸檬酸之鹽時，前述式(I)中的M ¹、M ²及M ³不同時成為氫原子，且前述式(II)中的M ¹及M ²不同時成為氫原子。又，作為羥基檸檬酸之鹽，只要是藥學上或香妝學上容許之物即無特別限制。

具體而言，當前述式(I)及(II)中所示化合物為羥基檸檬酸之鹽時在前述式(I)中的M ¹、M ²及M ³，以及前述式(II)中的M ¹及M ²，係分別獨立表示鹼金屬或鹼土金屬或有機鹼。作為鹼金屬，可列舉鉀、鈉。作為鹼土金屬，可列舉鈣。作為有機鹼，可列舉單乙醇胺基、二乙醇胺基、三乙醇胺基、胺基甲基丙醇基、胺基甲基丙烷二醇基。該等鹽可單獨使用1種，又亦可組合2種以上使用。

在本發明之軟骨再生促進劑中，作為羥基檸檬酸類，可使用自由體及內酯體之中任一者，亦可組合兩者來使用，又，可自前述自由體及內酯體之中選擇1種使用，亦可組合2種以上使用。於該等羥基檸檬酸類之自由體及內酯體之中，從要得到更加優異的軟骨再生促進效果的觀點來看，較佳可舉自由體。

又，在本發明之軟骨再生促進劑中，作為羥基檸檬酸類，可在羥基檸檬酸及羥基檸檬酸之鹽之中使用任一者，亦可組合兩者來使用，又，可從前述羥基檸檬酸及羥基檸檬酸之鹽之中選擇1種使用，亦可組合2種以上使用。於該等羥基檸檬酸及其鹽之中，從要得到更加優異的軟骨再生促進效果的觀點來看，較佳可舉羥基檸檬酸之鹽，更佳可列舉鹼金屬鹽及鹼土金屬鹽，又更佳可舉鹼土金屬鹽，特佳可舉鈣鹽。

在本發明之軟骨再生促進劑中，羥基檸檬酸類可為從天然物取得者，亦可為經化學合成者。作為天然物，可列舉金絲桃科藤黃屬之藤黃種(作為具體例可列舉藤黃果( Garcinia cambogia)、印度藤黃( Garcinia indica)、酸黃果( Garcinia atroviridis)、山竹( Garcinia mangostana)、菲島福木( Garcinia subelliptica)等。)、錦葵科木槿屬之木槿( HibiscusL.)等植物，較佳可列舉藤黃屬，又更佳可列舉藤黃果( Garcinia cambogia)。植物可為藉由栽培而生產者，亦可為自天然採取者。所使用的植物之部位，雖只要是包含羥基檸檬酸類之部位即無限制，但較佳可舉果皮。從植物取得羥基檸檬酸類之方法係迄今眾所皆知。本發明之軟骨再生促進劑可包含來自天然物之羥基檸檬酸類的分離純化物，亦可包含來自天然物之羥基檸檬酸類的粗純化物。

作為羥基檸檬酸類的粗純化物之範例，可舉前述植物之加工處理物，更佳可舉果皮之加工處理物。作為前述植物之加工處理物的具體態樣，可列舉植物乾燥物、植物粉碎物(包含新鮮及乾燥物)、植物萃取物。作為植物之加工處理物，可使用來自於單一植物者，亦可組合2種以上來自於不同的植物者來使用。在該等植物之加工處理物之中，較佳可舉植物萃取物。

上述植物之加工處理物之粗純化物之中，從要得到更加優異的軟骨再生促進效果的觀點來看，較佳可舉植物萃取物，更佳可列舉自藤黃屬得到的萃取物(藤黃屬萃取物)(特佳為自藤黃果( Garcinia cambogia)得到的萃取物)及自錦葵科木槿屬得到的木槿屬萃取物，又更佳可舉藤黃屬萃取物。植物萃取物只要是搾汁、溶劑萃取物、溶劑萃取物之包含羥基檸檬酸類的分餾物即可。得到植物萃取物之方法雖未特別限定，但例如可如以下般進行來得到。植物萃取物，例如，可將藤黃種等植物之果皮在原樣新鮮狀態下準備，或以藤黃種等植物之果皮的乾燥物之狀態下來準備，可以原樣的大小或進一步因應需要裁斷或粉碎後，遵循溶劑萃取、超臨界萃取等慣用的萃取方法來製備。作為萃取溶劑，可列舉水(包含溫水及熱水)、有機溶劑(甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇等碳數1~4之低級醇；丙二醇、1,3-丁二醇等多元醇；丙酮等酮類；二乙基醚、二噁烷、乙腈、乙酸乙酯等酯類；二甲苯、苯、氯仿等)、其等之混合物，較佳可列舉水、低級醇、其等之混合物，更佳可列舉溫水、熱水等之加熱水，更佳可舉熱水。該等溶劑可單獨使用1種，亦可組合2種以上使用。

再者，作為使用包含羥基檸檬酸之原料植物來得到包含羥基檸檬酸鹽之植物萃取物的方法，可列舉在鹼金屬鹽及/或鹼土金屬鹽(例如，在擬得到包含羥基檸檬酸鈣鹽之植物萃取物的情況下，可列舉碳酸鈣、乳酸鈣、蛋殼鈣等鈣鹽)之存在下進行萃取操作的方法，以及在得到包含羥基檸檬酸之植物萃取物之後，以鹼金屬及/或鹼土金屬之鹼性化合物處理植物萃取物，藉此使萃取物中的羥基檸檬酸變化成鹽的方法。

在使所得到的植物萃取物(搾汁、溶劑萃取物、溶劑萃取物之包含羥基檸檬酸類的分餾物等)包含於軟骨再生促進劑時，該植物萃取物可為原樣的未經濃縮之非濃縮萃取物的態樣，亦可為經濃縮的液狀軟萃取物的態樣，且亦可為將非濃縮萃取物或軟萃取物進一步供以乾燥處理而得到的萃取物粉末的態樣。作為乾燥處理，可列舉噴霧乾燥處理及凍結乾燥處理。

作為前述羥基檸檬酸類之粗純化物(較佳為植物之加工處理物，更佳為植物萃取物)之乾燥重量換算量100重量%中的羥基檸檬酸類之量，可舉例如10重量%以上，較佳為30重量%以上，更佳為50重量%以上，又更佳為55重量%以上。作為乾燥重量換算量100重量%中的羥基檸檬酸類之量的上限雖未特別限定，但可舉例如80重量%以下或70重量%以下。

作為得到羥基檸檬酸類的分離純化物之方法雖未特別限定，但可舉將上述萃取物之包含羥基檸檬酸類之分餾物進一步進行純化處理的方法。作為純化處理，只要是可分離羥基檸檬酸類而更為提高純化度的方法即可，而可遵循一般方法來進行。例如，可列舉層析法等分離處理、再結晶處理等。

關於本發明之軟骨再生促進劑中(A)成分之摻合量雖無特別限制，但可舉例如以羥基檸檬酸換算總量計為20~99重量%，較佳為30~90重量%，更佳為35~80重量%，又更佳為38~70重量%。

(B)指定的醣本發明之軟骨再生促進劑包含選自於由以下所組成之群組之指定的醣來作為(B)成分：(B1)硫酸軟骨素及其鹽(於以下亦記載為「(B1)成分」。)；(B2)蛋白聚醣(於以下亦記載為「(B2)成分」。)；(B3)玻尿酸及其鹽(於以下亦記載為「(B3)成分」。)；以及(B4)其等之構成醣(於以下亦記載為「(B4)成分」。)。

(B1)成分之硫酸軟骨素係作為在將N-乙醯基半乳糖胺(指N-乙醯基-D-半乳糖胺。以下相同。)及葡萄糖醛酸(指D-葡萄糖醛酸。以下相同。)或艾杜糖醛酸(iduronic acid)(指L-艾杜糖醛酸。以下相同。)之2糖作為重複結構單元之醣鏈上結合硫酸而成的酸性黏多醣而眾所皆知的化合物。

作為硫酸軟骨素，可列舉硫酸軟骨素A(構成2糖為葡萄糖醛酸及乙醯基半乳糖胺4硫酸)、硫酸軟骨素B(構成2糖為艾杜糖醛酸2硫酸及乙醯基半乳糖胺4硫酸；亦稱為硫酸皮膚素(dermatan sulfate))、硫酸軟骨素C(構成2糖為葡萄糖醛酸及乙醯基半乳糖胺6硫酸)、硫酸軟骨素D(構成2糖為葡萄糖醛酸2硫酸及乙醯基半乳糖胺6硫酸)、硫酸軟骨素E(構成2糖為葡萄糖醛酸及乙醯基半乳糖胺4,6二硫酸)。該等硫酸軟骨素可單獨使用1種，亦可組合2種以上使用。本發明中所使用的硫酸軟骨素較佳係至少包含硫酸軟骨素A。

作為硫酸軟骨素之鹽雖未特別限定，但可舉例如鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；銨鹽；精胺酸、離胺酸、組胺酸、鳥胺酸等鹼性胺基酸鹽；單乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽等胺鹽等。該等鹽可單獨使用1種，亦可組合2種以上使用。

又，作為(B1)成分，可使用硫酸軟骨素及硫酸軟骨素之鹽中任一者，亦可組合硫酸軟骨素及硫酸軟骨素之鹽兩者來使用。其等之中，較佳可列舉硫酸軟骨素。

作為硫酸軟骨素及其鹽，可使用經化學合成之物，亦可為從來自於天然物的材料萃取或純化等而得之物。又，作為硫酸軟骨素或其鹽，亦可使用作為試劑市售的硫酸軟骨素或其鹽。

作為從來自於天然物的材料進行萃取或純化等而製造硫酸軟骨素或其鹽的方法並未特別限定，可舉從來自於天然物的材料以眾所皆知的方法萃取、純化等方法。作為用來萃取硫酸軟骨素之來自於天然物的材料，例如可列舉豬、牛等哺乳動物之軟骨；雞等鳥類之軟骨；鮭魚、魟魚、鯊魚等魚類之軟骨等，較佳可舉哺乳動物之軟骨，更佳可舉豬軟骨。

(B2)成分之蛋白聚醣係黏多醣與蛋白質之複合體。蛋白聚醣之構成黏多醣只要是由亦可經N-乙醯基化的己糖胺，以及葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸之重複結構組成的多醣即可。作為亦可經N-乙醯基化的己糖胺，可列舉葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺硫酸及其鹽、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺硫酸及其鹽。作為該黏多醣之範例，可列舉硫酸軟骨素(作為前述(B1)成分記載的酸性黏多醣)、硫酸乙醯肝素(將葡萄糖胺以及葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸作為重複結構單元之醣鏈上結合硫酸而成的酸性黏多醣)、肝素(將葡萄糖胺及葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸作為重複結構單元之醣鏈上結合硫酸而成的酸性黏多醣)及硫酸角質素(keratan sulfate)(將N-乙醯基葡萄糖胺及半乳糖作為重複結構單元之醣鏈上結合硫酸而成的酸性黏多醣)。作為前述鹽，可列舉鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽、鈣、鎂等鹼土金屬鹽、鋁等金屬鹽等。

蛋白聚醣可單獨使用1種，亦可組合2種以上使用。

作為蛋白聚醣，可使用經化學合成之物，亦可為從來自於天然物的材料萃取或純化等而得之物。又，作為蛋白聚醣，亦可使用作為試劑市售的蛋白聚醣。

從來自於天然物的材料萃取或純化等而製造作為蛋白聚醣的方法，並未特別限定，可舉以眾所皆知的方法從來自於天然物的材料萃取、純化等方法。作為用以萃取蛋白聚醣之來自於天然物的材料，例如可列舉豬、牛等哺乳動物之軟骨；雞等鳥類之軟骨；鮭魚、魟魚、鯊魚等魚類之軟骨等，較佳可舉魚類之軟骨，更佳可舉鮭魚之軟骨。

(B3)成分之玻尿酸，係作為將N-乙醯基葡萄糖胺(指N-乙醯基-D-葡萄糖胺。以下相同。)及葡萄糖醛酸之2糖作為重複結構單元之直線狀醣鏈的酸性黏多醣而眾所皆知的化合物。

作為玻尿酸之鹽雖未特別限定，但可舉例如鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；銨鹽；精胺酸、離胺酸、組胺酸、鳥胺酸等鹼性胺基酸鹽；單乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽等胺鹽等。該等鹽可單獨使用1種，亦可組合2種以上使用。

又，作為(B3)成分，可使用玻尿酸及玻尿酸之鹽中任一者，亦可組合玻尿酸及玻尿酸之鹽兩者來使用。其等之中較佳可舉玻尿酸。

作為玻尿酸及其鹽，可使用經化學合成之物，亦可為從來自於天然物的材料萃取或純化等而得之物。又，作為玻尿酸或其鹽，亦可使用作為試劑市售的玻尿酸或其鹽。

作為從來自於天然物的材料萃取或純化等而製造玻尿酸或其鹽的方法，並未特別限定，可列舉藉由微生物進行的發酵法，以及以眾所皆知的方法從來自於天然物的材料萃取、純化等之方法。作為於發酵法使用的微生物，例如可列舉乳酸菌及納豆菌等。作為用以萃取玻尿酸之來自於天然物的材料，例如可列舉豬、牛等哺乳動物之軟骨及皮膚；雞冠；鮭魚、遠東多線魚、鱈魚、鯊魚等魚類之眼球及軟骨等，較佳可舉雞冠。

身為(B4)成分之構成醣，只要是前述(B1)成分、前述(B2)成分或前述(B3)成分之構成醣即未特別限定。(B4)成分中含有醣鏈及單醣之兩者。於此之中，醣鏈係前述(B2)成分之構成醣鏈之黏多醣。關於作為(B4)成分之黏多醣之具體例，可列舉在前述(B2)成分所述中的(B1)成分及(B3)成分以外的多醣。又，作為單醣，可列舉葡萄糖醛酸及艾杜糖醛酸、以及選自於以下所構成之群組的亦可經N-乙醯基化的己糖胺：葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺硫酸及其鹽、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、以及N-乙醯基半乳糖胺硫酸及其鹽。該等醣可單獨使用1種，亦可組合2種以上使用。於該等醣之中，從進一步提高本發明效果的觀點來看，較佳可舉亦可經N-乙醯基化的己糖胺，更佳可列舉葡萄糖胺、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺，或N-乙醯基半乳糖胺硫酸及其鹽，又更佳可列舉N-乙醯基半乳糖胺硫酸及其鹽。

作為前述構成醣，可使用經化學合成之物，亦可為從來自於天然物的材料萃取或純化等而得之物。又，作為前述構成醣，亦可使用作為試劑市售的醣。

作為從來自於天然物的材料萃取或純化等來製造前述構成醣的方法，並未特別限定，可舉以眾所皆知的方法從來自於天然物的材料萃取、純化等的方法。作為用以萃取前述構成醣之來自於天然物的材料，例如可列舉豬、牛等哺乳動物之軟骨；雞等鳥類之軟骨；鮭魚、魟魚、鯊魚等魚類之軟骨等，特別是在黏多醣的情況時，可舉雞等鳥類之軟骨。

在本發明中，作為(B)成分，在前述(B1)成分、(B2)成分、(B3)成分及(B4)之4型式之成分中，可僅使用單獨型式，亦可組合複數型式來使用。於本發明中，從進一步提高本發明效果的觀點來看，較佳可舉(B1)成分。

在本發明之軟骨再生促進劑中，作為(B)成分之含量雖未特別限定，但可例如，相對於(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，作為(B)成分之總量，可舉0.0001~6重量份，從進一步提高本發明效果的觀點來看，較佳可舉0.0002~4重量份，更佳可舉以下所舉含量。又，在將(B)成分與包含有(A)成分之植物萃取物一起使用時，作為相對於植物萃取物1重量份(乾燥重量換算量)之(B)成分之量，可舉0.0001~3.6重量份，從進一步提高本發明效果的觀點來看，較佳可舉0.0001~2.4重量份，更佳可舉以下所舉含量。

在使用(B1)的情況下：相對於(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，作為(B1)成分之量，較佳可舉0.001~2重量份，更佳可舉0.0014~1.5重量份，又更佳可舉0.005~0.5重量份，進一步更佳可舉0.01~0.2重量份，又進一步更佳可舉0.02~0.15重量份，且特佳可舉0.03~0.1重量份(再者，下限值亦可在0.044重量份以上、0.05重量份以上或0.06重量份以上，上限值亦可在0.095重量份以下、0.09重量份以下或0.085重量份以下。)。該等(B1)之較佳量，在使用包含(A)之植物萃取物的情況及不使用該植物萃取物的情況(例如，作為(A)成分，使用作為試劑的羥基檸檬酸及/或其鹽之情況)之任一者中皆適用。又，在使用包含(A)成分之植物萃取物時，作為相對於植物萃取物1重量份(乾燥重量換算量)之(B1)成分之量，較佳可舉0.0008~1重量份，更佳可舉0.005~0.15重量份，又更佳可舉0.007~0.1重量份，又進一步更佳可舉0.02~0.07重量份(再者，下限值亦可在0.025重量份以上、0.03重量份以上或0.03重量份以上，上限值亦可在0.08重量份以下、0.06重量份以下或0.05重量份以下)。

在使用(B2)的情況下：相對於(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，作為(B2)成分之量，較佳可舉0.0003~0.4重量份，更佳可舉0.0035~0.2重量份，又更佳可舉0.0015~1重量份，進一步更佳可舉0.002~0.3重量份，又進一步更佳可舉0.01~0.05重量份。該等(B2)之較佳量，在使用包含(A)之植物萃取物的情況及不使用該植物萃取物的情況(例如，作為(A)成分，使用作為試劑的羥基檸檬酸及/或其鹽之情況)之任一者中皆適用。又，在使用包含(A)成分之植物萃取物時，作為相對於植物萃取物1重量份(乾燥重量換算量)之(B2)成分之量，較佳可舉0.0002~0.5重量份，更佳可舉0.0008~0.3重量份，又更佳可舉0.002~0.2重量份，進一步更佳可舉0.008~0.13重量份。

在使用(B3)的情況下：相對於(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，作為(B3)成分之量，以總量計，較佳可舉0.0015~3重量份。相對於(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，作為(B3)成分之量，以總量計，較佳可舉0.01~2重量份，又更佳可舉0.1~1重量份，進一步更佳可舉0.2~0.6重量份。又，在使用包含(A)成分之植物萃取物時，作為相對於植物萃取物1重量份(乾燥重量換算量)之(B3)成分之量，以總量計，較佳可舉0.0009~1.8重量份，更佳可舉0.0009~1.2重量份。

在使用(B4)的情況下：相對於(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，作為(B4)成分之量，以總量計，較佳可舉0.0015~3重量份。此外，在(B4)成分為葡萄糖胺時，相對於(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，作為(B4)成分之量，較佳雖可舉0.0015~2重量份，但又更佳可舉0.01~1重量份，進一步更佳可舉0.01~0.5重量份，又進一步更佳可舉0.04~0.3重量份。此外，在(B4)成分為葡萄糖胺以外時，相對於(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，作為(B4)成分之量，以總量計，較佳可舉0.01~2重量份，又更佳可舉0.1~1重量份，進一步更佳可舉0.2~0.6重量份。又，在使用包含(A)成分之植物萃取物時，作為相對於植物萃取物1重量份(乾燥重量換算量)之(B4)成分之量，以總量計，較佳可舉0.0009~1.8重量份，更佳可舉0.0009~1.2重量份。此外，在(B4)成分為葡萄糖胺時，作為相對於植物萃取物1重量份(乾燥重量換算量)之(B4)成分之量，較佳可舉0.001~1重量份，進一步更佳可舉0.006~0.3重量份，又進一步更佳可舉0.01~0.2重量份。

關於本發明之軟骨再生促進劑中的(B)成分之具體的摻合量，並無特別限制，較佳地，其與(A)成分之摻合量的比率可設定成為前述比率。作為具體的(B)成分之摻合量之範例，可舉0.01~10重量%，較佳可舉0.1~5重量%，更佳可舉0.3~4重量%，又更佳可舉1~3重量%。

其他成分本發明之軟骨再生促進劑，在前述(A)成分及前述(B)成分之外，於不損及本發明效果的範圍內，可因應適用形態含有其他成分，亦可不含有其他成分。作為如此的其他成分，例如可列舉生理活性物質及添加物等。

作為生理活性物質，較佳可列舉對軟骨、關節之改善有效的成分，具體而言，例如可列舉膠原蛋白、II型膠原蛋白、非變性活性2型膠原蛋白、膠原蛋白胜肽、甲基磺醯基甲烷(MSM)、S-腺苷基甲硫胺酸、肌酸、茶胺酸、胡椒鹼、山楂酸、5-胺基乙醯丙酸磷酸鹽、鉤藤、黑薑、齒葉乳香樹( Boswellia serrata)、朝鮮薊、胺基酸、維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素C、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素K、葉酸、來自於鰹魚的彈性蛋白胜肽、咪唑二胜肽、槲皮素配醣體、來自於磷蝦油的EPA・DHA、來自於辣木種子的辣木芥子油苷(glucomoringin)、虎杖、魔鬼爪(devil’s claw)、來自於雞腳的玻尿酸產生促進劑(HAS-II)、大豆異黃酮、β-隱黃素、蛋黃多肽(bonepep)、濃縮乳清活性蛋白質(CBP)、3-羥基-3-甲基丁酸鹽(HMB)、雙-3-羥基-3-甲基丁酸鈣單水合物(HMB鈣)、麥芽糖酸鈣、鈣、鎂、鋅、鐵、硒、鉀、雌激素、降鈣素、阿斯匹靈、類固醇性消炎劑、非類固醇性消炎劑等。該等生理活性物質可選擇1種使用，亦可組合2種以上使用。

作為添加物，可列舉藥學上或食品學上容許的賦形劑、崩解劑、稀釋劑、潤滑劑、香味劑、著色劑、甘味劑、調味劑、懸浮劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、輔助劑、防腐劑、緩衝劑、結合劑、穩定劑、增量劑、增黏劑、pH調整劑、界面活性劑、塗布劑、營養成分等。該等添加物可選擇1種使用，亦可組合2種以上使用。

製劑型態本發明之軟骨再生促進劑只要是包含前述(A)成分及前述(B)成分，其形態及性狀即未特別限定。

作為本發明之軟骨再生促進劑之投予形態，包含口服投予形態及非口服投予形態之任一者。因此，本發明之軟骨再生促進劑可作為口服劑、注射劑、點滴劑、點鼻劑、經皮吸收劑(外用劑)等來製備。本發明之軟骨再生促進劑，由於是以使軟骨再生之目的來使用，因此較佳為易於日常性及/或持續性投予(攝取)的口服劑。

又，本發明之軟骨再生促進劑之性狀可為液狀，亦可為固狀。作為液狀之範例，可列舉包含液劑、飲料劑、乳劑、懸浮劑、酒精劑、糖漿劑、酏劑、包含軟萃取物劑等)等，作為固狀之範例，可列舉錠劑、丸劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、膠囊劑(包含硬膠囊及軟膠囊)、口含劑(troche)、咀嚼劑等。當本發明之軟骨再生促進劑為固狀時，亦可作成持續性或緩釋性之劑型，亦可作成使其在投予(攝取)時與水等混合。

本發明之軟骨再生促進劑可作為一般飲食品、保健機能食品(包含特定保健用食品、營養機能食品、機能性表示食品、補充劑等)、病患用食品、醫藥品、準醫藥品來使用。因此，本發明之軟骨再生促進劑，其實體可作成包含前述(A)成分及前述(B)成分之食品或醫藥組成物來製備。特別是，從使其日常性及/或持續性隨意地攝取的觀點來看，較佳係作成補充劑來使用。

製造方法本發明之軟骨再生促進劑之製造方法係使用前述(A)成分及前述(B)成分以及因應需要摻合的其他成分，因應各種形態及性狀以及使用目的，遵循迄今眾所皆知的通常製劑手續即可。

用途本發明之軟骨再生促進劑，藉由投予(攝取)來促進軟骨之再生。軟骨之再生係指，藉由合成軟骨，亦即藉由使未分化細胞往軟骨細胞分化並使其增殖而合成軟骨基質，來將缺損或變性的軟骨組織於正常軟骨組織(透明軟骨)上進行重建之意。軟骨之再生的促進係指，促進前述軟骨之再生，且抑制軟骨組織之進一步分解，而促進軟骨組織之重建之意。

因此，本發明之軟骨再生促進劑，可使用於以下目的：藉由抑制及/或再生軟骨之磨損、提高軟骨製造力、促進軟骨成分(具體而言為軟骨基質)之產生來對須有軟骨再生力的對象進行幫助，及/或維持健康的軟骨狀態。作為本發明之軟骨再生促進劑之前述目的之更具體的範例，可列舉有助於(即進行幫助)步行時(特別是，於一定時間步行長距離時)、上下階梯時、穿脫襪子時、站立時、坐下時、蹲下時、撿拾落在地板上之物時及/或一般時候的活動中膝關節之彎曲伸展(即膝關節動作的順暢度)、柔軟性、可動性及/或狀況不佳之緩和。

作為須有軟骨再生力之對象的動物種，較佳可舉哺乳類，更具體而言，可列舉人類；犬、貓等寵物動物；馬、牛等經家畜化的動物。

由於本發明之軟骨再生促進劑的有效成分羥基檸檬酸類不僅具有軟骨合成促進作用，亦具有軟骨分解抑制作用，故有鑑於如此的本發明效果，作為本發明之軟骨再生促進劑之較佳適應之一態樣，可舉對具有軟骨損傷的對象(須有軟骨再生力之對象之範例)於軟骨損傷之治療目的上進行適用。於軟骨損傷之治療中，不僅包含軟骨損傷之完全治癒亦包含軟骨損傷之減低。作為軟骨損傷，只要是因軟骨之缺損或變性而產生的病態即未特別限定，可列舉變形性關節症、外傷性軟骨損傷、因各種原因造成的關節炎等。作為成為對象的軟骨部位雖未特別限定，但可舉例如膝關節、髖關節、肘關節、肩關節、手腕關節、腳踝關節、顳顎關節之體內各種關節部位。

又，由於本發明之軟骨再生促進劑的有效成分羥基檸檬酸類具有優異的軟骨合成促進作用及軟骨分解抑制作用，故有鑑於如此的本發明效果，作為本發明之軟骨再生促進劑之較佳適應之一態樣，可舉對具有軟骨損傷風險的對象(須有軟骨再生力之對象之範例)於軟骨損傷之預防目的上進行適用。作為具有軟骨損傷風險之對象，在人類的情況中，可列舉具有50歳以上(特別是65歳以上)中多數確認到的變形性關節症之風險的高齡者、具有在運動性傷害中確認到的軟骨損傷之風險之運動愛好者或職業運動選手、其他在日常中過度使用關節的人或產生隨著年齡增長之軟骨自然磨損的人，較佳可舉產生隨著年齡增長之軟骨自然磨損的人。在對產生隨著年齡增長之軟骨自然磨損的人適用本發明之軟骨再生促進劑時，可基於以下目的來使用：利用本發明之軟骨再生促進劑所造成的軟骨組織之分解抑制作用及重建促進作用，較佳來維持隨著年齡增長而變薄膝軟骨之厚度，並減輕日常生活中膝蓋之疼痛、不協調感及/或不適感之目的。

本發明之軟骨再生促進劑的有效成分羥基檸檬酸類亦具有自未分化細胞往軟骨細胞分化之作用。有鑑於如此的本發明效果，作為本發明之軟骨再生促進劑之較佳適應之一態樣，可舉對如被認定為軟骨本身的缺損(即軟骨缺損症)般的具有重度軟骨損傷的對象(須有軟骨再生力之對象之範例)於再生軟骨本身之治療目的上進行適用。重度之軟骨損傷的治療中，不僅包含軟骨損傷之完全治癒亦包含軟骨損傷之減低。作為重度之軟骨損傷之具體例，可列舉因運動或交通事故等產生的外傷性軟骨缺損症。

用量作為本發明之軟骨再生促進劑之用量，作為對人類之用量，以羥基檸檬酸換算量計，可舉例如0.1g/日/60kg以上，較佳為0.2g/日/60kg以上，更佳為0.25g/日/60kg以上。作為該用量的上限雖未特別限定，但可舉例如18g/日/60kg以下，較佳為10g/日/60kg以下，更佳為2g/日/60kg以下，又更佳為1g/日/60kg以下，進一步更佳為0.6g/日/60kg以下，又進一步更佳為0.4g/日/60kg以下。在含有藤黃屬萃取物之軟骨再生促進劑的情況下，作為對人類之用量，藤黃屬萃取物以乾燥萃取物換算量計，可舉例如0.16g/日/60kg以上，較佳為0.3g/日/60kg以上，更佳為0.45g/日/60kg以上。作為該用量的上限雖未特別限定，但可舉例如20g/日/60kg以下，較佳為10g/日/60kg以下，更佳為5g/日/60kg以下，又更佳為2.5g/日/60kg以下，進一步更佳為1.2g/日/60kg以下，又進一步更佳為0.8g/日/60kg以下，且特佳為0.6g/日/60kg以下。

作為本發明之軟骨再生促進劑之用量，作為對人類之用量，以(B)成分換算量計，可舉例如1mg/日/60kg以上，較佳為2mg/日/60kg以上，更佳為4.5mg/日/60kg以上，又更佳為7mg/日/60kg以上，進一步更佳為9mg/日/60kg以上，且特佳為12mg/日/60kg以上、18mg/日/60kg以上或23mg/日/60kg以上。作為該用量的上限，可舉例如500mg/日/60kg以下，較佳為300mg/日/60kg以下，更佳為100mg/日/60kg以下，又更佳為50mg/日/60kg以下，進一步更佳為45mg/日/60kg以下，又進一步更佳為35mg/日/60kg以下，且特佳為27mg/日/60kg以下、20mg/日/60kg以下或16mg/日/60kg以下。該用量雖可不拘於(B)成分之種類來適用，但在(B)成分為(B1)成分的情況下可特佳地適用。

本發明之軟骨再生促進劑之投予(攝取)方法雖未特別限定，但例如可以口服或非口服的方式1日進行1次或複數次，較佳為以口服的方式1日進行1次或2~3次。軟骨再生促進劑之其他形態本發明之軟骨再生促進劑，如上所述，除了係包含前述(A)成分及前述(B)的組成物之外，亦可為前述(A)成分與前述(B)成分組合而成之物(可舉例如包含(A)成分之組成物，與物理上獨立的包含(B)成分之組成物的組合形態。)，且亦可為包含前述(A)成分之組成物且預定與前述(B)成分併用之物(可舉例如包含(A)成分之組成物且附有將與(B)成分併用的資訊之物)。亦即，本發明亦提供一種軟骨再生促進劑，是組合下列而成： (A)羥基檸檬酸及/或其鹽，及 (B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣；以及提供一種包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽之軟骨再生促進劑，其併用下列(B)而可用於促進軟骨再生：(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽、以及其等之構成醣所組成的群組之醣。在該等軟骨再生促進劑中，關於有效成分(A)成分及(B)成分之細節、含有與否都無所謂的其他成分、製劑型態、製造方法、用途及用量之細節皆如上所述。

2.軟骨細胞分化促進劑如上所述，(A)成分及(B)成分之組合，由於可促進自未分化細胞往軟骨細胞之分化，因此作為軟骨細胞之分化促進劑的有效成分亦是有用的。因此，本發明亦提供一種自未分化細胞往軟骨細胞之分化促進劑，其包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。

在軟骨細胞分化促進劑中，關於有效成分(A)成分及(B)成分之細節、含有與否都無所謂的其他成分、製劑型態、製造方法、用途及用量之細節，皆與前述「1.軟骨再生促進劑」相同。

此外，軟骨細胞分化促進劑亦可用於在活體外藉由使其直接暴露於未分化細胞而促進軟骨細胞之分化之目的。於此情況中，關於軟骨細胞分化促進劑對未分化細胞暴露時之濃度雖未特別限定，但以羥基檸檬酸換算量計，可舉例如0.5~30μM，較佳為1~30μM，更佳為3~30μM，又更佳為4.5~26μM、4.5~15μM、4.5~10μM、4.5~8μM或4.5~6μM之濃度。

3.變形性膝關節症治療劑、軟骨之分解抑制劑、用於維持軟骨厚度之保護劑、關節之疼痛、不協調感及/或不適感之緩和劑如上所述，(A)成分及(B)成分之組合，由於可促進自未分化細胞往軟骨細胞之分化，因此作為變形性膝關節症治療劑、軟骨之分解抑制劑、用於維持軟骨厚度之保護劑或關節之疼痛、不協調感及/或不適感之緩和劑的有效成分亦是有用的。因此，本發明亦包含一種變形性膝關節症治療劑、軟骨之分解抑制劑、用於維持軟骨厚度之保護劑，或關節之疼痛、不協調感及/或不適感之緩和劑，其等包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。

在變形性膝關節症治療劑、軟骨之分解抑制劑、用於維持軟骨厚度之保護劑，或關節之疼痛、不協調感及/或不適感之緩和劑中，有效成分(A)成分及(B)成分之細節、含有與否都無所謂的其他成分、製劑型態、製造方法、用途及用量之細節，皆與前述「1.軟骨再生促進劑」相同。實施例

以下雖例示出實施例來更具體地說明本發明，但本發明當不受其等所限定。

試驗例1 ・培養細胞遵循PLoS ONE, (US), 2014, 9(12), e112291. DOI:10.1371/journal. pone.0112291(於以下記載為「文獻A」。)，自人類正常iPS細胞經由神經脊細胞誘導間葉系幹細胞，等量添加細胞凍害保護液CP-1(極東製藥工業製)而進行凍結保存。

・(A)成分供給源(藤黃屬萃取物) 使藤黃果( Garcinia cambogia)之果皮乾燥，添加10倍量的水及蛋殼鈣並進行熱水萃取。在過濾所得到的萃取液之後，以旋轉蒸發器進行減壓濃縮，使所得到的濃縮液進一步進行噴霧乾燥。粉碎經乾燥的萃取物，而得到粉末狀的藤黃屬萃取物。再者，於此藤黃屬萃取物中，藤黃果之果皮所含有的羥基檸檬酸((-)羥基檸檬酸)係以藉由在萃取時使用蛋殼鈣而形成鈣鹽之形態被包含。此藤黃屬萃取物中的有效成分之含量以羥基檸檬酸換算量計係60重量%。

・(B)成分為了(B)成分之摻合而使用以下材料。 (B1)軟骨素硫氧材(豬軟骨萃取物；來自於豬軟骨的硫酸軟骨素(主要的硫酸軟骨素為硫酸軟骨素A)含量84重量%) (B2)蛋白聚醣素材(鮭魚(鼻軟骨)萃取物；來自於鮭魚(鼻軟骨)的蛋白聚醣含量22.4重量%) (B3)玻尿酸鈉(來自於雞冠)包含本試驗例之全部試驗例中，簡略表示成「玻尿酸」。 (B4)葡萄糖胺(來自於蝦/蟹)

・2維培養之軟骨細胞分化及軟骨基質產生對96孔盤(Corning製)，以1×10 ⁵個/每孔的方式播種經解凍並增殖的來自於人類iPS細胞的間葉系幹細胞。24小時後去除培養上清液，取代成以文獻A為準的軟骨細胞分化誘導培養基。以最終濃度成為表1~表3中所示濃度的方式將藤黃屬萃取物及/或(B)成分((B1)~(B4)成分)作為被驗物質添加至軟骨細胞分化誘導培養基。控制組中並未添加被驗物質。在進行培養10日左右之後，以4%三聚甲醛-磷酸緩衝液(富士軟片和光純藥製)進行細胞固定。固定後，以愛爾新藍液(武藤化學製)進行染色1小時，再使用6M胍鹽酸溶液(東京化成工業製)，進行色素之溶出。將溶出液移至96孔盤，以微量盤測讀儀測量各孔在620nm之OD值，藉此測量經分化誘導的軟骨細胞所產生的基質之量。具體而言，將令控制(無被驗物質，比較例1)組中的OD值平均為1時的各組中的OD值平均，作為軟骨基質產生比率而導出。將結果示於表1~表3b。

[表1]

[表2a]

[表2b]

[表2c]

[表2d]

[表3a]

[表3b]

如表1~3b所示，藉由組合藤黃屬萃取物與硫酸軟骨素、葡萄糖胺、玻尿酸或蛋白聚醣，會顯著提升軟骨基質產生比率。此亦顯示，在軟骨基質再生之前，藤黃屬萃取物與硫酸軟骨素、葡萄糖胺、玻尿酸或蛋白聚醣之組合已將來自於人類iPS細胞的間葉系幹細胞顯著地分化誘導成產生軟骨基質的軟骨細胞。

試驗例2 ・培養細胞遵循Tissue Engineering, (US), 2010, 16(1), p81-91. DOI:10.1089=ten.tec. 2008.0693，以專用培養基自人類正常骨髓分離間葉系幹細胞之後，使細胞增殖。回收經增殖的細胞，等量添加細胞凍害保護液CP-1(極東製藥工業)而進行凍結保存。

・(A)成分供給源使用試驗例1所製備的藤黃屬萃取物。・(A)成分 (-)羥基檸檬酸-3鈣(HCA・Ca)(Sigma-Aldrich製) ・(B)成分供給源使用與試驗例1所使用者相同的材料。

・藉由3維培養之軟骨細胞分化誘導已知以2維培養軟骨細胞會引起去分化。作為更接近自然的軟骨細胞之培養系，已有採用所謂3維培養之手法。將經解凍並增殖的來自於人類骨髓間葉系幹細胞，以每2.5×10 ⁵個分注至15mL管(TPP製)中，於室溫以1000rpm進行離心3分鐘。去除上清液，並交換成以文獻A為準的軟骨細胞分化誘導培養基0.5mL。同時，以表4~表11中所示濃度添加藤黃屬萃取物、HCA・Ca及/或(B)成分((B1)~(B4)成分)來作為被驗物質。進行21日培養之後，以4%三聚甲醛-磷酸緩衝液固定12小時後，以70%乙醇進行脫水再進行石蠟包埋後，製作標本。經製作的標本係進行藉由番紅O之軟骨基質(即酸性多醣類)的染色，之後使用光學顯微鏡(倍率為10倍)，觀察經分化的軟骨細胞之形態。再者，針對藉由番紅O染色呈現紅色的面積，亦使用影像解析軟體Image J，導出令於控制組(比較例1)之該面積為1時的相對面積(分化軟骨細胞面積比)。將結果示於表4~表11。

[表4]

[表5]

[表6]

[表7]

[表8]

[表9]

[表10]

[表11]

由表4~表11所清楚表示，藤黃屬萃取物或羥基檸檬酸鈣單獨雖可呈現軟骨細胞分化誘導活性但其程度有限，且玻尿酸單獨幾乎不呈現軟骨細胞分化誘導活性，而硫酸軟骨素、葡萄糖胺或蛋白聚醣單獨不僅不呈現軟骨細胞分化誘導活性，反倒還使其減低，僅管如此，確認到藉由組合藤黃屬萃取物或羥基檸檬酸鈣，與硫酸軟骨素、葡萄糖胺、玻尿酸或蛋白聚醣，可顯著地促進軟骨細胞分化誘導活性。

・軟骨基質產生活性將表4~表11之比較例及實施例所得到的軟骨細胞塊(小粒)以消化酵素木瓜蛋白酶溶液(藉由100mM磷酸緩衝液pH7.4、5mM L-半胱胺酸鹽酸鹽單水合物(L-cystein hydrochloride monohydrate)、10mM EDTA將Sigma-Aldrich製的木瓜蛋白酶可溶化)分解之後，使用GAG定量套組(Blyscan製)針對GAG(醣胺聚醣)量進行測量。成為GAG量越多則軟骨基質產生量越多的指標。將結果示於圖1~圖4。(再者，於圖3中，比較例35’、實施例40’及實施例42’分別表示除了將玻尿酸量變更為0.05μg/mL之外，與比較例35、實施例40及實施例42進行相同操作的結果。)

如圖1~圖4所示，藤黃屬萃取物或羥基檸檬酸鈣單獨雖可呈現軟骨基質產生活性但其程度有限，且玻尿酸單獨幾乎不呈現軟骨細胞分化誘導活性，而硫酸軟骨素、葡萄糖胺或蛋白聚醣單獨不僅不呈現軟骨基質產生活性，反倒還使其減低，僅管如此，確認到藉由組合藤黃屬萃取物或羥基檸檬酸鈣，與硫酸軟骨素、葡萄糖胺、玻尿酸或蛋白聚醣，可顯著地促進軟骨基質產生活性。

試驗例3 除了使用表12(a)及表12(b)所示成分((B4)成分)來作為(B)成分，及將(A)成分及(B)成分((B4)成分)之添加量設為如表12(a)及表12(b)所示者之外，進行與試驗例2相同的操作，且進行分化軟骨細胞面積比之導出及GAG量之測量。將分化軟骨細胞面積比之結果示於表12(a)及表12(b)，且將GAG量之測量結果示於圖5。

再者，本試驗例所使用的(B4)成分之細節係如以下所述。 D-(+)-葡萄糖胺鹽酸鹽(Sigma-Aldrich製) 於圖5中係簡略記載為「葡糖胺」。 N-乙醯基-D-葡萄糖胺(Sigma-Aldrich製) 於圖5中係簡略記載為「N乙醯・葡糖胺」。 N-乙醯基-D-葡萄糖胺6-硫酸鈉(Sigma-Aldrich製) 於圖5中係簡略記載為「N乙醯・葡糖胺硫酸」。 D-葡萄糖醛酸(Sigma-Aldrich製) D-(+)-半乳糖胺鹽酸鹽(Sigma-Aldrich製) 於圖5中係簡略記載為「半乳糖胺」。 N-乙醯基-D-半乳糖胺(Sigma-Aldrich製) 於圖5中係簡略記載為「N乙醯・半乳糖胺」。 N-乙醯基-D-半乳糖胺6-硫酸鈉(Sigma-Aldrich製) 於圖5中係簡略記載為「N乙醯・半乳糖胺硫酸」。

[表12a]

[表12b]

由表12(a)、表12(b)及圖5所清楚表示，(A)成分單獨雖呈現軟骨細胞分化誘導活性但其程度有限，且(B4)成分單獨係使軟骨細胞分化誘導活性減低或僅呈現軟骨細胞分化誘導活性，儘管如此，確認到藉由組合(A)成分與(B4)成分，可顯著促進軟骨細胞分化誘導活性。再者，可知在使用葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺6硫酸鈉、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺或N-乙醯基半乳糖胺硫酸鈉等亦可經N-乙醯基化的己糖胺作為(B4)成分時，軟骨細胞分化誘導活性的促進程度更大，特別是，在使用N-乙醯基半乳糖胺或N-乙醯基半乳糖胺6硫酸鈉作為(B4)成分時，軟骨細胞分化誘導活性的促進程度係特別大。

試驗例4 ・試驗對象遵循Osteoarthritis Cartilage, 2012, 20(8), 887-895. DOI:10.1016/j.joca. 2012.04.012，使用跑步機裝置(帶式運送機，室町機械製)，在20m/分、20分/日的條件下，使小鼠強制歩行傾斜15度的上坡2週，而促進膝關節軟骨之變性。藉此，構築模擬人類隨著年齡增長的軟骨變性症狀(變形性膝關節症)(亦即膝軟骨磨損症狀)之無外科手術的動物實驗模式。

・(A)成分供給源使用於試驗例1製備的藤黃屬萃取物。・(B1)成分供給源使用與試驗例1所使用者相同的硫酸軟骨素。

・試驗日程及試驗法以表13中所示用量口服投予藤黃屬萃取物及/或硫酸軟骨素8週。再者，藤黃屬萃取物之用量102.5mg/日/kg換算成人類等價用量(使用對小鼠之除數12.3，令人類每1人60kg)為0.5g/日，羥基檸檬酸換算量之用量61.5mg/日/kg換算成人類等價用量(使用對小鼠之除數12.3，令人類每1人60kg)為0.3g/日。8週之投予結束後進行解剖並採血，針對右大腿骨的關節軟骨組織製作番紅O染色標本。將組織標本解析之結果示於圖6A。再者，基於組織標本的染色，將軟骨變性進行計分並評定(Gerwin et al. Osteoarthritis Cartilage. 2010 Oct;18 Suppl 3:S24-34)，將結果示於圖6B。再者，於圖6A及圖6B中，將硫酸軟骨素簡略記載為「軟骨素」，且將藤黃屬萃取物簡略記載為「藤黃」。

又，解剖時從小鼠採血而製備血清，使用市售套組(IBEX公司)定量軟骨合成標記CPII及軟骨分解標記C2C。將軟骨合成標記CPII測量結果示於圖7，且將軟骨分解標記C2C測量結果示於圖8。

[表13]

・結果由圖6A所清楚顯示，在將羥基檸檬酸與硫酸軟骨素組合投予時(實施例56~實施例59)，確認到在單獨投予藤黃屬萃取物時(比較例49)及單獨投予硫酸軟骨素時(比較例48)所未觀察到的顯示透明軟骨之形成及關節軟骨組織之顯著再生的染色圖案，特別是，在以實施例58及實施例59之比率組合兩成分時確認到顯示特別顯著的再生之染色圖案。此等圖6A所示結果，亦反映在圖6B之結果中。

又，由圖7所清楚顯示，藤黃屬萃取物單獨雖呈現軟骨合成標記之增加效果但其程度有限(比較例49)，且硫酸軟骨素即便是高用量，單獨仍幾乎不呈現軟骨合成標記之增加(比較例48)，儘管如此，僅在藤黃屬萃取物中組合少量的硫酸軟骨素，可確認到軟骨合成標記顯著增加(實施例56~59)，該效果特別是在以實施例58及實施例59比率組合兩成分時更顯著。

此外，由圖8所清楚顯示，藤黃屬萃取物單獨雖呈現軟骨分解標記之減低效果但其程度有限(比較例49)，且硫酸軟骨素即便是高用量，單獨仍不會呈現軟骨分解標記之減低效果(比較例48)，儘管如此，僅在藤黃屬萃取物中組合少量的硫酸軟骨素，可確認到軟骨分解標記顯著減低(實施例56、59)，反映出與軟骨合成標記相關的圖7之逆相關傾向。

依據Stem Cells International, 2017, Article ID 9312329, DOI: 10.1155/2017/9312329，已證明人類之膝關節及髖關節之滑膜及關節液中存在有間葉系幹細胞(MSC)。認為在無外科的手術之藉由小鼠強制歩行之膝關節軟骨變性促進模式中，依據藉由投予藤黃屬萃取物與硫酸軟骨素之組合而使滑膜及關節液中的MSC分化成軟骨細胞，有呈現軟骨組織再生的可能性。由以上可認為，即便在人類之年齡增長性的自然軟骨磨損中，藉由組合攝取藤黃屬萃取物及硫酸軟骨素可促進軟骨組織再生。

無

[圖1]顯示來自於人類骨髓間葉系幹細胞之3維培養中由羥基檸檬酸類及/或硫酸軟骨素引起的往軟骨細胞之分化誘導所造成的軟骨基質產生之結果。 [圖2]顯示來自於人類骨髓間葉系幹細胞之3維培養中由羥基檸檬酸類及/或葡萄糖胺引起的往軟骨細胞之分化誘導所造成的軟骨基質產生之結果。 [圖3]顯示來自於人類骨髓間葉系幹細胞之3維培養中由羥基檸檬酸類及/或玻尿酸引起的往軟骨細胞之分化誘導所造成的軟骨基質產生之結果。 [圖4]顯示來自於人類骨髓間葉系幹細胞之3維培養中由羥基檸檬酸類及/或蛋白聚醣引起的往軟骨細胞之分化誘導所造成的軟骨基質產生之結果。 [圖5]顯示來自於人類骨髓間葉系幹細胞之3維培養中由羥基檸檬酸類及/或指定的醣引起的往軟骨細胞之分化誘導所造成的軟骨基質產生之結果。 [圖6A]顯示經投予藤黃屬萃取物及/或硫酸軟骨素之由小鼠變形性膝關節症誘發模式製作的膝大腿骨之軟骨之截面標本的染色影像。 [圖6B]顯示基於圖6A將軟骨變性進行計分評定的結果。 [圖7]顯示經投予藤黃屬萃取物及/或硫酸軟骨素之小鼠變形性膝關節症誘發模式的血中軟骨合成標記(CPII)量之測量結果。 [圖8]顯示經投予藤黃屬萃取物及/或硫酸軟骨素之小鼠變形性膝關節症誘發模式的血中軟骨分解標記(C2C)量之測量結果。

Claims

一種軟骨再生促進劑，包含：(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。
如請求項1之軟骨再生促進劑，其中前述構成醣係選自於由以下所構成之群組的亦可經N-乙醯基化的己糖胺：葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺硫酸及其鹽、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺，以及N-乙醯基半乳糖胺硫酸及其鹽。
如請求項1之軟骨再生促進劑，其中，相對於前述(A)成分之羥基檸檬酸換算總量1重量份，前述(B)成分的總量之含量為0.001~6重量份。
如請求項1之軟骨再生促進劑，含有包含前述(A)成分之植物萃取物。
如請求項4之軟骨再生促進劑，其中前述植物萃取物為藤黃屬萃取物。
如請求項4之軟骨再生促進劑，其中，相對於前述植物萃取物1重量份，前述(B)成分的總量之含量為0.0015~10重量份。
如請求項1之軟骨再生促進劑，其中前述(B)成分為硫酸軟骨素。
一種自未分化細胞往軟骨細胞之分化促進劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。
一種變形性膝關節症治療劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。
一種軟骨之分解抑制劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。
一種用於維持軟骨厚度之保護劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。
一種關節之疼痛、不協調感及/或不適感之緩和劑，包含(A)羥基檸檬酸及/或其鹽；及(B)選自於由硫酸軟骨素及其鹽、蛋白聚醣、玻尿酸及其鹽，以及其等之構成醣所組成的群組之醣。