TW202306982A - 具有改善的穩定性的抗tslp fab - Google Patents

Abstract

本揭露關於具有改善的穩定性的抗TSLP Fab、編碼所述Fab的核酸、包含所述核酸的宿主細胞和載體、以及使用所述Fab治療TSLP相關病症之方法。

Description

具有改善的穩定性的抗TSLP　FAB

本揭露關於具有改善的穩定性的抗TSLP Fab、編碼所述Fab的核酸、包含所述核酸的宿主細胞和載體、以及使用所述Fab治療疾病之方法。

胸腺基質淋巴球生成素（TSLP）係通過異二聚體受體進行傳訊的細胞介素，該異二聚體受體由IL-7Ra亞基及與常見y受體樣鏈具有同源性的獨特組分TSLP-R組成（Pandey等人, Nat. Immunol. [自然免疫學] 2000, 1(1):59-64）。TSLP由胸腺、肺、皮膚、腸和扁桃腺中的上皮細胞以及氣道平滑肌細胞、肺成纖維細胞和基質細胞表現（Edwards, 2008, Drug news & perspectives [藥物新聞與觀點] 21, 312-316；He和Geha, 2010, Annals of the New York Academy of Sciences [紐約科學學術年報] 1183, 13-24；Reche等人, 2001, Journal of immunology [免疫學雜誌] 167, 336-343）。

該等細胞回應於促炎性刺激而產生TSLP，並且TSLP通過其對許多先天免疫細胞的活性驅動過敏性炎症反應，該等先天免疫細胞包括樹突狀細胞（Soumelis等人, 2002, Nature Immunology [自然免疫學] 3, 673-680）、單核細胞（Reche等人, 2001, Journal of Immunology [免疫學雜誌] 167, 336-343）和肥大細胞（Allakhverdi等人, 2007, The Journal of Experimental Medicine [實驗醫學雜誌] 204, 253-258）。已知TSLP-R和IL-7Ra兩者表現最高的細胞群係髓樣樹突狀細胞（Reche等人, 2001, Journal of immunology [免疫學雜誌] 167, 336-343）。

TSLP可以促進初始T細胞的增殖並驅動它們分化成表現高水平的iL-4、IL-5和IL-13的Th2細胞（Omori和Ziegler, 2007, Journal of immunology [免疫學雜誌] 178, 1396-1404）。已在氣喘性肺上皮細胞和慢性特應性皮炎病變中發現高水平的TSLP表現，這表明TSLP在過敏性炎症中發揮作用（Ziegler和Artis, 2010, Nature immunology [自然免疫學] 11, 289-293）。較新的證據表明TSLP參與Thl7細胞的分化和Thl7驅動的炎性過程（Hartgring等人, 2011, Arthritis and rheumatism [關節炎和風濕病] 63, 1878-1887；Tanaka等人, 2009, Clinical and experimental allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology [臨床和實驗過敏學：英國過敏和臨床免疫學學會雜誌] 39, 89-100；Wu等人, 2014, Journal of molecular and cellular cardiology [分子與細胞心臟病學雜誌] 76, 33-45）。慢性過敏性（特應性）氣喘通常以Th2型炎症為特徵，而非過敏性氣喘炎症以嗜中性球浸潤為主，伴有混合的Thl和Thl7細胞介素環境。氣喘中慢性炎症的後果包括支氣管高反應性（BHR）、黏液產生過度、氣道壁重塑和氣道狹窄（Lambrecht和Hammad, 2014, Nature immunology [自然免疫學] 16, 45-56）。已顯示TSLP參與過敏性氣喘回應的啟動和維持/增強（Wang等人, 2006, Immunity [免疫學] 24, 827-838）。近來，還發現TSLP傳訊係記憶T細胞對局部抗原激發的回憶回應所需的（Wang等人, 2015, The Journal of allergy and clinical immunology [過敏與臨床免疫學雜誌] 135, 781-791 e783）。

特折魯單抗（Tezepelumab）係人免疫球蛋白G2（lgG2）單株抗體（mAb），其與TSLP結合，從而阻止其與TSLP受體複合物的相互作用。在輕度特應性氣喘患者中進行的概念驗證研究表明，在吸入了過敏原激發物後特折魯單抗抑制了早期和晚期氣喘反應，並阻抑了Th2炎症的生物標記物。在患有嚴重不受控氣喘的成人和青少年中評估特折魯單抗的研究（NCT03347279）最近結束並符合其降低氣喘年發作率（AERR）的主要終點[時間範圍：基線至第52週]。

CSJ117係針對人胸腺基質淋巴球生成素（TSLP）的強效中和抗體片段，將其配製為硬膠囊中的PulmoSol™工程化粉末以經由乾粉吸入器遞送到肺部（Gauvrea等人 歐洲呼吸學會（ERS） 2020 56: 增刊64, 3690）。

因此，在炎性障礙（如氣喘）的治療中，靶向TSLP係臨床有效的。鑒於大多數氣喘患者習慣於通過吸入進行自我治療，因此經由吸入投與TSLP拮抗劑係令人感興趣的。

本揭露旨在建立在這種新興藥物類別的現有的治療選擇上，特別是經由吸入。

本揭露令人驚訝地發現，在特折魯單抗的CH1結構域中進行多個突變並將該分子轉化為Fab減少了加速穩定性條件下（在1 x PBS中，在45°C下兩週）的聚集。1 x PBS中的加速穩定性研究有時用作對體內血清穩定性的粗略估計。

大多數用於治療而投與的抗體的半衰期超過14天（兩週）。對於吸入遞送，Fab可能比mAb更較佳，因為它們較小的尺寸和氣霧化後肺中改善的生物分佈。儘管經由吸入投與，但對於投與於肺的基於蛋白質的拮抗劑，血清穩定性仍然是相關因素，因為大多數活性劑可能最終分配到血清中。因此，當用於治療TSLP相關病症時，示例性Fab加速穩定性的改善可能是有利的。

因此，在一個方面，本揭露提供了一種Fab，其包含含有SEQ ID NO:1中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO:2中列出的胺基酸序列的輕鏈。

在另一方面，本揭露提供了一種Fab，其包含具有SEQ ID NO:1中列出的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:2中列出的胺基酸序列的輕鏈。

在另一方面，本揭露提供了一種Fab，其包含由SEQ ID NO:1中列出的胺基酸序列組成的重鏈和由SEQ ID NO:2中列出的胺基酸序列組成的輕鏈。

在另一方面，本揭露提供了一種核酸，其編碼本文所述之Fab。

在另一方面，本揭露提供了一種載體，其包含本文所述之核酸。

在另一方面，本揭露提供了一種宿主細胞，其包含本文所述之核酸或載體。

在另一方面，本揭露提供了一種治療方法，該方法包括向受試者投與治療有效量的本文所述之Fab。

在另一方面，本揭露提供了用於在療法中使用的本文所述之Fab。

在另一方面，本揭露提供了本文所述之Fab在療法中之用途。

在另一方面，本揭露提供了本文所述之Fab在製造用於在療法中使用的藥物中之用途。

定義

應注意，術語「一個/種（a或an）」實體係指一個/種或多個/種所述實體；例如，「抗TSLP Fab」應理解為表示一或多種抗TSLP Fab。

「抗體」在最廣泛的意義上使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們表現出所希望的抗原結合活性。

「抗體片段」包括抗體的抗原結合部分，尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、結構域抗體（dAb）、互補決定區（CDR）片段、CDR移植抗體、單鏈抗體（scFv）、單鏈抗體片段、嵌合抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、線性抗體；螯合重組抗體、三鏈抗體（tribady）或雙鏈抗體（bibody）、胞內抗體（intrabody）、奈米抗體（nanobody）、小模組免疫藥物（small modular immunopharmaceutical, SMIP）、抗原結合結構域免疫球蛋白融合蛋白、單結構域抗體（包括駱駝化抗體）、含有VHH的抗體、或其變體或衍生物，以及含有免疫球蛋白的至少一部分的多肽，該免疫球蛋白的至少一部分足以使特異性抗原與多肽結合，如一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR序列，只要該抗體保留所希望的生物活性。

「Fab」係指包含配對的VH-CH1和VL-CL的抗體片段。該術語涵蓋包含非規範序列（non-canonical sequence）變體的Fab，該等非規範序列變體係如典型地與高序列變異性相關的序列區外的Fab內的胺基酸取代、缺失或插入。例如，Fab變體包括在VH或VL構架區或CH1或CL結構域中包含非規範胺基酸或序列改變的Fab。此類改變可以包括非規範半胱胺酸或其它可衍生的胺基酸的存在，其可用於將所述Fab變體與異源部分軛合。其它此類改變包括非規範多肽連接子的存在，該等非規範多肽連接子係在兩個結構域之間共價橋接的多肽序列。例如，Fab變體可包含將CH1結構域共價附接至VL結構域或將CL結構域共價附接至VH結構域的連接子多肽，使得Fab可表現為單一多肽鏈。

「宿主細胞」係指具有使用重組DNA技術構建並且編碼至少一個異源基因的載體的細胞。在從重組宿主分離抗TSLP Fab的過程的描述中，術語「細胞」和「細胞培養物」可互換使用以表示抗TSLP Fab的來源，除非另外明確說明。換言之，從「細胞」回收多肽可意指從旋轉沈降的全細胞、或從含有培養基和懸浮細胞兩者的細胞培養物回收。

「分離的」係指呈自然界中未發現形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物。分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物包括已經被純化至它們不再呈自然界中發現形式的程度的那些。在一些方面，分離的抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物係基本上純的。

「藥物組成物」係指一種呈允許活性成分（例如，本文所揭露的抗TSLP Fab）的生物活性有效的這樣的形式的，並且不含有對於該組成物將投與的受試者而言具有不可接受毒性的另外組分的製劑。這樣的組成物可為無菌的。

如本文中可互換使用的「多核苷酸」或「核酸」係指具有任何長度的核苷酸聚合物，並且包括DNA和RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾的核苷酸或鹼基，和/或它們的類似物，或可以藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和它們的類似物。前述說明適用於本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

「重組」多肽或蛋白質係指經由重組DNA技術產生的多肽或蛋白質。如同已經藉由任何合適的技術分離、分級或部分純化或基本上純化的天然或重組多肽一樣，出於本發明之目的，在工程化宿主細胞中表現的重組產生的多肽和蛋白質也被視為是分離的。本文所揭露的多肽可以使用本領域已知的方法重組產生。可替代地，本文所揭露的蛋白質和肽可以化學合成。

「受試者」或「個體」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意指需要診斷、預後或治療的任何受試者，特別是哺乳動物受試者，除非受試者被定義為「健康受試者」的情況。哺乳動物受試者包括人；家畜；農場動物；如狗、貓、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、馬、牛、母牛等。較佳的是，受試者係人。

「治療（treat或treatment）」係指治療性處理和防治性或預防性措施，其中目標係預防或減緩（減輕）不希望的生理變化或障礙。有益的或所希望的臨床結果包括但不限於症狀緩解、疾病程度減輕、疾病狀態穩定化（即，未惡化）、疾病進展延遲或減緩、疾病狀態改善或緩和以及減輕（無論是部分減輕還是全部減輕），無論是可檢測的還是不可檢測的。「治療」還可以意指當與未接受治療時的預期存活相比，延長存活。需要治療的那些包括已患有病症或障礙的那些以及易於患上病症或障礙的那些或打算預防病症或障礙的那些。

「治療有效量」係指本文所揭露的抗TSLP Fab或其他藥物有效「治療」受試者或哺乳動物的疾病或障礙的量。

「TSLP」係指胸腺基質淋巴球生成素。TSLP係通過異二聚體受體進行傳訊的細胞介素，該異二聚體受體由IL-7Ra亞基及與常見g受體樣鏈具有同源性的獨特組分TSLP-R組成（Pandey等人, Nat. Immunol. [自然免疫學] 2000, l(l):59-64）。TSLP由胸腺、肺、皮膚、腸和扁桃腺中的上皮細胞以及氣道平滑肌細胞、肺成纖維細胞和基質細胞表現（Edwards, 2008, Drug news & perspectives [藥物新聞與觀點] 21, 312-316；He和Geha, 2010, Annals of the New York Academy of Sciences [紐約科學學術年報] 1183, 13-24；Reche等人, 2001, Journal of immunology [免疫學雜誌] 167, 336-343）。該等細胞回應於促炎性刺激而產生TSLP，並且TSLP通過其對許多先天免疫細胞的活性驅動過敏性炎症反應，該等先天免疫細胞包括樹突狀細胞（Soumelis等人, 2002, Nature Immunology [自然免疫學] 3, 673-680）、單核細胞（Reche等人, 2001, Journal of Immunology [免疫學雜誌] 167, 336-343）和肥大細胞（Allakhverdi等人, 2007, The Journal of Experimental Medicine [實驗醫學雜誌] 204, 253-258）。已知TSLP-R和IL-7Ra兩者表現最高的細胞群係髓樣樹突狀細胞（Reche等人, 2001, Journal of immunology [免疫學雜誌] 167, 336-343）。

TSLP可以促進初始T細胞的增殖並驅動它們分化成表現高水平的IL-4、IL-5和IL-13的Th2細胞（Omori和Ziegler, 2007, Journal of immunology [免疫學雜誌] 178, 1396-1404）。已在氣喘性肺上皮細胞和慢性特應性皮炎病變中發現高水平的TSLP表現，這表明TSLP在過敏性炎症中發揮作用（Ziegler和Artis, 2010, Nature immunology [自然免疫學] 11, 289-293）。較新的證據表明TSLP參與Th17細胞的分化和Th17驅動的炎性過程（Hartgring等人, 2011, Arthritis and rheumatism [關節炎和風濕病] 63, 1878-1887；Tanaka等人, 2009, Clinical and experimental allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology [臨床和實驗過敏學：英國過敏和臨床免疫學學會雜誌] 39, 89-100；Wu等人, 2014, Journal of molecular and cellular cardiology [分子與細胞心臟病學雜誌] 76, 33-45）。慢性過敏性（特應性）氣喘通常以Th2型炎症為特徵，而非過敏性氣喘炎症以嗜中性球浸潤為主，伴有混合的Th1和Th17細胞介素環境。氣喘中慢性炎症的後果包括支氣管高反應性（BHR）、黏液產生過度、氣道壁重塑和氣道狹窄（Lambrecht和Hammad, 2014, Nature immunology [自然免疫學] 16, 45-56）。已顯示TSLP參與過敏性氣喘回應的啟動和維持/增強（Wang等人, 2006, Immunity [免疫學] 24, 827-838）。近來，還發現TSLP傳訊係記憶T細胞對局部抗原激發的回憶回應所需的（Wang等人, 2015, The Journal of allergy and clinical immunology [過敏與臨床免疫學雜誌] 135, 781-791 e783）。

「載體」意指一種構建體，其在宿主細胞中能夠遞送一或多個目的基因或序列，並且在一些方面，能夠表現一或多個目的基因或序列。載體的實例包括但不限於：病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏接質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合的DNA或RNA表現載體、封裝在脂質體中的DNA或RNA表現載體、以及某些真核細胞（如生產細胞）。 抗 TSLP Fab

本揭露提供了一種Fab，其包含含有SEQ ID NO:1中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO:2中列出的胺基酸序列的輕鏈。

在另一方面，本揭露提供了一種Fab，其包含含有SEQ ID NO:1中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO:2中列出的胺基酸序列的輕鏈。

在另一方面，本揭露提供了一種Fab，其包含含有SEQ ID NO:1中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO:2中列出的胺基酸序列的輕鏈。

實例顯示，具有該等序列特徵的Fab與具有相似VH和VL結構域序列的全長抗體相比，在加速穩定性研究條件下具有改善的穩定性。具有改善的穩定性的示例性Fab在本文中稱為Fab 1。

在一些情況下，本揭露提供了具有與Fab 1同等的穩定性的Fab。在一些情況下，同等的穩定性係在加速穩定性研究條件下的同等的穩定性。在一些情況下，加速穩定性研究條件係在45°C下1 X PBS持續兩週。在一些情況下，在加速研究條件下Fab的濃度為約0.8 mg/ml。

在一些情況下，Fab包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的重鏈。在一些情況下，Fab包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的重鏈。在一些情況下，Fab包含與Fab 1同等的穩定性。

在一些情況下，Fab包含與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的輕鏈。在一些情況下，Fab包含與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的輕鏈。在一些情況下，Fab包含與Fab 1同等的穩定性。

在一些情況下，Fab包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的重鏈和與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的輕鏈。在一些情況下，Fab包含與Fab 1同等的穩定性。

在一些情況下，Fab包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的重鏈和與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的輕鏈。在一些情況下，Fab包含與Fab 1同等的穩定性。

在一些情況下，本揭露提供了包含SEQ ID NO:1的重鏈的抗原結合片段。

在一些情況下，本揭露提供了抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的重鏈。在一些情況下，抗原結合片段包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的重鏈。在一些情況下，抗原結合片段包含與Fab 1同等的穩定性。

在一些情況下，抗原結合片段包含與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的輕鏈。在一些情況下，抗原結合片段包含與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的輕鏈。在一些情況下，抗原結合片段包含與Fab 1同等的穩定性。

在一些情況下，抗原結合片段包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的重鏈和與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列同一性的輕鏈。在一些情況下，抗原結合片段包含與Fab 1同等的穩定性。

在一些情況下，抗原結合片段包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的重鏈和與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的輕鏈。在一些情況下，抗原結合片段包含與Fab 1同等的穩定性。 核苷酸

本揭露還提供了編碼本文所揭露的Fab和抗原結合片段的核酸（或「多核苷酸」）。

本文所揭露的多核苷酸可進一步包括另外的核酸，其編碼例如訊息肽以指導本文所述之經編碼的多肽的分泌。

多核苷酸可藉由本領域已知的任何方法產生或製造。例如，如果Fab的核苷酸序列係已知的，則編碼抗TSLP Fab的多核苷酸可以從化學合成的寡核苷酸組裝（例如，如在Kutmeier等人, Bio Techniques [生物技術] 17:242 (1994)中所述），簡而言之，這涉及合成含有編碼抗TSLP Fab的序列部分的重疊寡核苷酸，退火並且連接那些寡核苷酸，然後藉由PCR擴增所連接的寡核苷酸。

可替代地，編碼抗TSLP Fab的多核苷酸可以由來自合適來源的核酸生成。如果含有編碼Fab的核酸的殖株不可獲得，但Fab的序列係已知的，則編碼Fab的核酸可化學合成或從合適來源獲得，例如藉由使用可與序列的3’端和5’端雜交的合成引物進行PCR擴增或藉由使用對特定目的序列具有特異性的寡核苷酸探針進行選殖。然後可以使用本領域熟知的任何方法將藉由PCR生成的擴增核酸選殖到可複製的選殖載體中。

一旦確定Fab的核苷酸序列和相應胺基酸序列，其核苷酸序列可以使用本領域熟知的用於操作核苷酸序列的方法進行操作，例如重組DNA技術、定點誘變、PCR等（參見，例如以下文獻中所描述的技術：Sambrook等人 (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual [分子選殖：實驗手冊] (第2版; 冷泉港實驗室, 冷泉港, 紐約)；和Ausubel等人, 編輯 (1998) Current Protocols in Molecular Biology [當代分子生物學實驗指南] (約翰威利父子公司（John Wiley & Sons）, 紐約)，將兩者均藉由引用以其全文併入本文），以生成具有不同胺基酸序列的Fab，例如產生胺基酸取代、缺失和/或插入。

編碼Fab的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸構成，其可為未修飾的RNA或DNA或經修飾的RNA或DNA。例如，編碼抗TSLP Fab的多核苷酸可由單股和雙股DNA、作為單股和雙股區的混合物的DNA、單股和雙股RNA以及作為單股和雙股區的混合物的RNA、包含DNA和RNA的雜交分子（DNA和RNA可為單股的或更典型地雙股的或單股和雙股區的混合物）構成。另外，編碼所述Fab的多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三股區構成。編碼抗TSLP Fab的多核苷酸還可含有一或多個經修飾的鹼基或出於穩定性或其他原因而修飾的DNA或RNA骨架。「經修飾」的鹼基包括例如三苯甲基化鹼基和不常見鹼基如肌苷。可以對DNA和RNA進行多種修飾；因此，「多核苷酸」包括以化學、酶促或代謝方式修飾的形式。

可藉由以下方式產生編碼源自免疫球蛋白（例如，免疫球蛋白重鏈部分或輕鏈部分）的多肽的非天然變體的分離的多核苷酸：將一或多個核苷酸取代、添加或缺失引入到免疫球蛋白的核苷酸序列中使得將一或多個胺基酸取代、添加或缺失引入到所編碼的蛋白質中。突變可藉由標準技術引入，如定點誘變和PCR介導的誘變。較佳的是，在一或多個非必需胺基酸殘基處進行保守胺基酸取代。 製造方法

將編碼抗TSLP Fab或抗原結合片段的多核苷酸典型地插入表現載體中使得引入可用於產生所希望數量的Fab的宿主細胞中。因此，本文涵蓋了包含編碼本文所定義的Fab的多核苷酸的表現載體和包含所述表現載體的宿主細胞。

Fab或抗原結合片段的重組表現需要構建含有編碼Fab的多核苷酸的表現載體。一旦已經獲得了編碼本揭露之Fab的多核苷酸，便可以使用本領域熟知的技術藉由重組DNA技術生產用於產生該Fab的載體。

編碼Fab的DNA序列可根據熟知方法同時或分別使用反轉錄酶和DNA聚合酶製得。PCR可以藉由共有恒定區引物或藉由更具有特異性的引物基於公開的DNA和胺基酸序列來起始。PCR還可用於分離編碼抗體可變輕鏈和重鏈的DNA殖株。在這種情況下，文庫可藉由共有引物或較大同源性探針（諸如小鼠恒定區探針）來篩選。

因此，本文描述了藉由表現含有編碼Fab的核苷酸序列的多核苷酸來製備蛋白質之方法。熟悉該項技術者熟知的方法可用於構建含有抗TSLP Fab編碼序列以及適當的轉錄和翻譯控制訊息的表現載體。該等方法包括例如體外重組DNA技術、合成技術、以及體內基因重組。因此，本揭露提供了包含編碼本揭露之Fab的核苷酸序列（可操作地連接至啟動子）的可複製載體。

出於本揭露之目的，可使用許多表現載體系統。例如，一種類別的載體利用源自動物病毒的DNA元件，該等動物病毒係如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘瘡病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒（RSV、MMTV或MOMLV）或SV40病毒。其他病毒涉及使用具有內部核糖體結合位點的多順反子系統。另外，已經將DNA整合到染色體中的細胞可藉由引入一或多個標記物來選擇，該等標記物允許選擇所轉染的宿主細胞。標記物可以提供對營養缺陷型宿主的原營養、殺生物劑抗性（例如抗生素）或對重金屬（例如銅）的抗性。可選擇標記物基因可以直接連接至有待表現的DNA序列，或藉由共轉化來引入同一細胞中。mRNA的最佳合成還可能需要另外的元件。該等元件可以包括訊息序列、剪接訊息以及轉錄啟動子、強化子和終止訊息。

能夠在真核細胞中引出表現的任何表現載體可以用於本揭露中。合適載體的實例包括但不限於質體pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF 1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl和pZeoSV2（可從加利福尼亞州聖達戈市的英傑公司（Invitrogen）獲得），以及質體pCI（可從威斯康辛州麥迪森市的普洛麥格公司（Promega）獲得）。通常，針對表現的那些細胞對大量轉化細胞進行篩選。

更通常地，一旦已製備編碼Fab的載體或DNA序列，則可以將表現載體引入到適當的宿主細胞中。將質體引入到宿主細胞中可以藉由熟悉該項技術者熟知的不同技術來完成。該等技術包括但不限於轉染（包括電泳和電穿孔）、原生質體融合、磷酸鈣沈澱、與包膜的DNA的細胞融合、顯微注射以及以完整病毒來感染。參見Ridgway (1988) 「Mammalian Expression Vectors [哺乳動物表現載體]」於Vectors [載體]中, Rodriguez和Denhardt編輯, (Butterworths [巴特沃斯出版社], 波士頓, 麻塞諸塞州), 第24.2章, 第470-472頁。典型地，質體引入宿主中係經由電穿孔。攜帶表現構建體的宿主細胞在適於產生抗TSLP Fab的條件下生長，並測定蛋白質合成。示例性測定技術包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定（RIA）或螢光活化細胞分選儀分析（FACS）、免疫組織化學等。

將表現載體藉由常規技術轉移至宿主細胞中，然後藉由常規技術培養所轉染的細胞以產生用於在本文所述之方法中使用的抗TSLP Fab。因此，本揭露包括如下宿主細胞，該等宿主細胞含有編碼本揭露之Fab（例如，重鏈或輕鏈、或者可變重鏈或可變輕鏈）、可操作地連接至異源啟動子的多核苷酸。

在一種情況下，提供了包含所述宿主細胞的培養基。在一種情況下，提供了包含所述培養基的發酵容器。

在一些情況下，培養基和發酵容器適用於執行產生本文所定義的Fab之方法。

多種宿主表現載體系統可用於表現本文所述之抗TSLP Fab。此類宿主表現系統代表可以產生並隨後純化目的編碼序列的媒劑，而且還代表當用適當的核苷酸編碼序列轉化或轉染時，原位表現本揭露之分子的細胞。該等包括但不限於微生物，例如用含有編碼序列的重組噬菌體DNA、質體DNA或黏接質體DNA表現載體轉化的細菌（例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌）；用含有編碼序列的重組酵母表現載體轉化的酵母（例如，酵母（Saccharomyces）、畢赤酵母（Pichia））；用含有編碼序列的重組病毒表現載體（例如，桿狀病毒）感染的昆蟲細胞系統；用重組病毒表現載體（例如，花椰菜鑲嵌病毒（cauliflower mosaic virus）CaMV；菸草鑲嵌病毒（tobacco mosaic virus）TMV）感染的或用含有編碼序列的重組質體表現載體（例如，Ti質體）轉化的植物細胞系統；或具有含有源自哺乳動物細胞基因組的啟動子（例如，金屬硫蛋白啟動子）或源自哺乳動物病毒的啟動子（例如，腺病毒晚期啟動子；痘瘡病毒7.5K啟動子）的重組表現構建體的哺乳動物細胞系統（例如，COS、CHO、BLK、293、3T3細胞）。

細菌細胞如大腸桿菌並且更較佳的是真核細胞用於表現Fab。例如，哺乳動物細胞例如中國倉鼠卵巢細胞（CHO），與載體例如來自人巨細胞病毒的主要立即早期基因啟動子元件相結合係抗體的有效表現系統（Foecking等人, Gene [基因] 45: 101 (1986)；Cockett等人, Bio/Technology [生物技術] 8:2 (1990)）。

用於蛋白質表現的宿主細胞系經常具有哺乳動物來源；熟悉該項技術者被認為能夠優先確定最適合於有待在其中表現的所希望的基因產物的特定宿主細胞系。示例性宿主細胞系包括但不限於CHO（中國倉鼠卵巢）、DG44和DUXB13（中國倉鼠卵巢細胞系，DHFR減）、HELA（人子宮頸癌）、CVI（猴腎細胞系）、COS（具有SV40 T抗原的CVI的衍生物）、VERO、BHK（幼倉鼠腎）、MDCK、293、WI38、R1610（中國倉鼠成纖維細胞）BALBC/3T3（小鼠成纖維細胞）、HAK（倉鼠腎細胞系）、SP2/0（小鼠骨髓瘤）、P3.x 63-Ag3.653（小鼠骨髓瘤）、BFA-lclBPT（牛內皮細胞）、RAJI（人淋巴球）以及293（人腎）。宿主細胞系典型地可從商業服務機構（美國組織培養物保藏中心）或從公開的文獻獲得。

另外，可選擇調節所插入序列的表現、或以所希望的特定方式來修飾並且加工基因產物的宿主細胞株。蛋白質產物的此類修飾（例如，糖基化）和加工（例如，切割）對於蛋白質的功能來說可能是重要的。不同的宿主細胞具有針對蛋白質和基因產物的翻譯後加工和修飾的特徵性和特異性機制。可選擇適當細胞系或宿主系統以確保所表現的外源蛋白的正確修飾和加工。為此，可以使用具有用於初級轉錄物的適當加工、基因產物的糖基化和磷酸化的細胞機器（cellular machinery）的真核宿主細胞。

為了長期、高產率的產生重組蛋白，穩定表現係較佳的。例如，可以工程化穩定表現抗TSLP Fab的細胞系。代替使用含有病毒複製起點的表現載體，宿主細胞可以使用由適當表現控制元件（例如，啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、多腺苷酸化位點等）和可選擇標記物來控制的DNA來轉化。在引入外源DNA後，可以允許經工程改造的細胞在富集的培養基中生長1-2天，然後切換至選擇性培養基。在重組質體中的可選擇標記物賦予對選擇的抗性，並且允許細胞將質體穩定地整合進它們的染色體中並且生長以形成集落（foci），進而可以將該集落選殖並且擴充成細胞系。這種方法可有利地用於將穩定表現抗TSLP Fab的細胞系工程化。

可使用多種選擇系統，包括但不限於分別可以在tk-、hgprt-或aprt-細胞中使用的單純性皰疹病毒胸苷激酶（Wigler等人, Cell [細胞] 13:223 (1977)）、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（Szybalska和Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 48:202 (1992)）和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶（Lowy等人, Cell [細胞] 22:817 (1980)）基因。另外，抗代謝物抗性可以用作選擇以下基因的基礎：dhfr，它賦予對甲胺喋呤的抗性（Wigler等人, Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 77:357 (1980)；O'Hare等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 78: 1521 (1981)）；gpt，它賦予對黴酚酸的抗性（Mulligan和Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 78:2012 (1981)）；neo，它賦予對胺基糖苷G-418的抗性（Clinical Pharmacy [臨床藥學] 12:488-505；Wu和Wu，Biotherapy [生物療法] 3:87-95 (1991)；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.[藥理學與毒理學年鑒] 52:573-596 (1993)；Mulligan, Science [科學] 260:926-932 (1993)；和Morgan和Anderson, Ann. Rev. Biochem. [生物化學年鑒] 62: 191-217 (1993)；TIB TECH [生物技術趨勢] 13(5): 155-215 (1993年5月)）；以及hygro，它賦予對潮黴素的抗性（Santerre等人, Gene [基因] 30: 141 (1984)）。重組DNA技術領域中通常已知的可以使用的方法描述於Ausubel等人 (1993) Current Protocols in Molecular Biology [當前分子生物學方案], John Wiley & Sons [約翰威利父子公司], 紐約；Kriegler (1990) 「Gene Transfer and Expression [基因轉移和表現]」於A Laboratory Manual [實驗室手冊]中, Stockton Press [斯托克頓出版社], 紐約；Dracopoli等人 (編輯) (1994) Current Protocols in Human Genetics [當前人類遺傳學方案], John Wiley & Sons [約翰威利父子公司], 紐約, 第12和13章；Colberre-Garapin等人 (1981) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 150: 1，將該等藉由引用以其全文併入本文。

Fab的表現水平可以藉由載體擴增來增加（關於綜述，參見Bebbington和Hentschel (1987) 「The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning [使用基於基因擴增的載體來在DNA選殖中在哺乳動物細胞中表現選殖的基因]」 (Academic Press [學術出版社], 紐約), 第3卷）。當表現抗TSLP Fab的載體系統中的標記物可擴增時，存在於宿主細胞培養物中的抑制劑之水平的增加將使標記物基因的拷貝數量增加。由於擴增的區域與抗TSLP Fab基因相關，抗TSLP Fab的產生也將增加（Crouse等人, Mol. Cell. Biol. [分子細胞生物學] 3:251(1983)）。

體外產生允許按比例擴大以便給出大量所希望的多肽。在組織培養條件下的哺乳動物細胞培養技術在本領域中係已知的，並且包括均質懸浮培養，例如在氣升式反應器中或在連續攪拌反應器中，或固定或截留細胞培養，例如在中空纖維、微膠囊中、在瓊脂糖微珠粒或陶瓷筒上。在必要和/或希望時，多肽溶液可以藉由常規層析方法來純化，例如凝膠過濾、離子交換層析、DEAE-纖維素層析或（免疫）親和層析，例如在合成鉸鏈區多肽的優先生物合成之後或在本文中描述的HIC層析步驟之前或之後。

編碼本揭露之抗TSLP Fab的基因也可以在非哺乳動物細胞（如昆蟲、細菌或酵母或植物細胞）中表現。容易吸收核酸的細菌包括以下成員：腸桿菌科（enterobacteriaceae），例如大腸桿菌或沙門氏菌屬（ Salmonella）的菌株；芽孢桿菌科（ Bacillaceae），例如枯草芽孢桿菌；肺炎球菌屬（ Pneumococcus）；鏈球菌屬（ Streptococcus），以及流感嗜血桿菌（ Haemophilus influenzae）。應進一步理解的是在表現於細菌中時，異源多肽典型地成為包涵體的一部分。異源多肽必須經分離、純化且然後組裝成功能性分子。當希望四價形式的抗體時，則將亞單位自組裝成四價抗體（WO 02/096948 A2）。

在細菌系統中，取決於所表現的抗TSLP Fab的預期用途，可有利地選擇許多表現載體。例如，在有待產生大量的這樣的蛋白質以便生成Fab的藥物組成物時，指導容易純化的高水平的融合蛋白產物的表現的載體可為令人希望的。此類載體包括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278（Ruther等人, EMBO J. [歐洲分子生物學學會雜誌] 2: 1791 (1983)），其中編碼序列可單獨地與lacZ編碼區同框連接至載體中以使得產生融合蛋白；pIN載體（Inouye和Inouye, Nucleic Acids Res. [核酸研究] iJ:3101-3109 (1985)；Van Heeke和Schuster, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 24:5503-5509 (1989)）；等。pGEX載體也可以用於表現作為與麩胱甘肽S-轉移酶（GST）的融合蛋白的外源多肽。通常，此類融合蛋白可溶並且可以藉由吸附並且結合至基質麩胱甘肽-瓊脂糖珠粒，隨後在游離麩胱甘肽的存在下洗脫來容易地從溶解的細胞中純化。pGEX載體被設計成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位點以使得所選殖的靶基因產物可以從GST部分上釋放。

除了原核生物以外，也可使用真核微生物。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或常見麵包酵母在真核微生物中係最常使用的，但是許多其他菌株通常可利用，例如畢赤酵母。

為了在酵母中表現，通常使用例如質體YRp7（Stinchcomb等人, Nature [自然] 282:39 (1979)；Kingsman等人, Gene [基因] 7: 141 (1979)；Tschemper等人, Gene [基因] 10: 151 (1980)）。此質體已經含有TRP1基因，該基因提供缺乏在色胺酸中生長的能力的突變酵母菌株的選擇標記物，該菌株係例如ATCC編號44076或PEP4-1（Jones, Genetics [遺傳學] 85: 12 (1977)）。然後，作為酵母宿主細胞基因組的特徵的trpl缺陷區（lesion）的存在提供用於檢測藉由在不存在色胺酸的情況下的生長而進行的轉化的有效環境。

在昆蟲系統中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus；AcNPV）典型地用作表現外源基因的載體。病毒在草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細胞中生長。Fab編碼序列可單獨地選殖進病毒的非必需區（例如，多角體蛋白基因）中並且置於AcNPV啟動子（例如，多角體蛋白啟動子）的控制下。

一旦本揭露之Fab已經重組表現，就可以藉由本領域已知的用於免疫球蛋白分子的純化的任何方法將其純化，例如藉由層析（例如，離子交換層析、親和層析（特別是藉由對於蛋白質A後的特異性抗原的親和力）以及尺寸分級柱層析）、離心、差別溶解度，或者藉由用於蛋白質的純化的任何其他標準技術。可替代地，用於增加本揭露抗體的親和力的較佳方法揭露於美國專利申請公開案號2002 0123057 Al中。 治療方法

本揭露還提供了治療方法，該等方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的本文所述之抗TSLP Fab或藥物組成物。在一些情況下，該方法用於治療TSLP相關病症。

本揭露還提供了本文所述之抗TSLP Fab或藥物組成物，用於在療法中使用。在一些情況下，該療法係TSLP相關病症的治療。

本揭露還提供了抗TSLP Fab或藥物組成物在製造用於在治療疾病中使用的藥物中之用途。在一些情況下，該疾病係TSLP相關病症。

本揭露還提供了抗TSLP Fab或藥物組成物在療法中之用途。在一些情況下，該療法係TSLP相關病症的治療。

在一些情況下，TSLP相關病症為TSLP相關炎性病症。在一些情況下，TSLP相關炎性病症選自氣喘、敗血症、敗血性休克、特應性皮炎、過敏性鼻炎、過敏性鼻竇炎、過敏性結膜炎、嗜酸性食道炎、類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病（COPD）、氣喘-COPD重疊綜合症（ACOS）、慢性支氣管炎、肺氣腫、伴有或不伴有鼻息肉的慢性鼻竇炎、血管炎、GvHD、葡萄膜炎、慢性特發性蕁麻疹、竇炎或胰臟炎。

在一些情況下，TSLP相關炎性病症係氣喘。

氣喘係複雜和異質性氣道炎性疾病，其藉由可變和復發性症狀、可逆氣流堵塞和支氣管痙攣表徵。

氣喘症狀可以包括喘息、咳嗽、胸悶和呼吸短促。症狀可以藉由暴露於過敏原或刺激物觸發。氣喘可基於症狀是藉由過敏原（特應性）還是不藉由過敏原（非特應性）沈澱而分類為特應性（外源性）或非特應性（內源性）。急性氣喘惡化通常稱為「氣喘發作」。可以在氣喘發作期間發生的其他跡象包括使用呼吸輔助肌（頸部胸鎖乳突肌和斜角肌）、可能存在奇脈（在吸入期間較弱且在呼出期間較強的脈搏）和胸部過度膨脹。藍色皮膚和指甲可能因缺氧而發生。除了該等積極治療回應之外，正經受抗TSLP Fab治療的受試者可以經歷與疾病相關一或多種該等症狀的改進的有益效果。

臨床回應可以使用篩選技術評估，諸如磁共振成像（MRI）掃描、x射線照相成像、電腦斷層成像（CT）掃描、流動式細胞測量術或螢光活化細胞分選儀（FACS）分析、組織學、宏觀病理學以及血液化學，包括但不限於可藉由ELISA、RIA、層析等檢測的變化。

本文所揭露的Fab可以與用於炎性疾病的任何已知療法結合使用，包括已知可用於，或已用於或目前正用於治療炎性疾病（例如，氣喘或COPD）的任何藥劑或藥劑的組合。可以與本文所述之Fab組合投與的示例性活性劑包括但不限於吸入皮質類固醇（ICS）、支氣管擴張藥（包括長效β促效劑（LABA）、長效抗毒蕈鹼促效劑（LAMA）、短效β促效劑（SABA）和毒蕈鹼β2促效劑（MABA））、抗組胺藥、抗白三烯、PDE-4抑制劑、詹納斯（janus）激酶抑制劑和磷酸肌醇3激酶抑制劑。

術語「組合」係指呈一個劑量單位形式的固定組合，或組合投與，其中抗TSLP Fab與組合配偶體（partner）（例如另一種藥物，也稱為「治療劑」或「共藥劑（co-agent）」）可以在同一時間獨立地投與或在時間間隔內分開地投與，尤其是其中該等時間間隔允許組合配偶體顯示協作（例如協同）效應的情況下。單個組分可以包裝在一個套組（kit）中或分開包裝。可在投與之前將一種或兩種組分（例如粉末或液體）重構或稀釋至所希望的劑量。如本文所用，術語「共同投與」或「組合投與」等意指涵蓋向有需要的單個受試者（例如患者）投與所選擇的組合配偶體，並且旨在包括其中藥劑不一定藉由相同的投與途徑投與或同時投與的治療方案。如本文所用，術語「藥物組合」意指由多於一種治療劑的混合或組合所產生的產品，並且包括治療劑的固定和非固定組合兩者。術語「固定組合」意指治療劑（例如抗TSLP Fab和組合配偶物）以單一實體或劑量的形式同時投與於患者。術語「非固定組合」意指治療劑（例如，抗TSLP Fab和組合配偶體）作為分開的實體同時地、並行地或依序地投與至患者（沒有特定的時間限制），其中這樣的投與在患者體內提供治療有效水平的兩種化合物。後者也適用於雞尾酒療法，例如三種或更多種治療劑的投與。

術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療本揭露中所述之治療性病症或障礙。這樣的投與涵蓋以基本上同時的方式共同投與該等治療劑，諸如以具有固定比例的活性成分的單個膠囊投與。可替代地，這樣的投與涵蓋在多個容器中或在每種活性成分的獨立容器（例如，片劑、膠囊、粉末、和液體）中共同投與。可以將粉末和/或液體在投與之前重構或稀釋到所希望的劑量。此外，這樣的投與也涵蓋在大致相同的時間或在不同的時間順序使用每種類型的治療劑。在任何一種情況下，治療方案將在治療本文所述之病症或障礙方面提供藥物組合的有益效果。 組成物

本文所揭露的醫學用途和方法中的抗TSLP Fab可以藥物組成物的形式投與至受試者。

在一些情況下，本文對「抗TSLP Fab」的任何提及也可以指包含抗TSLP Fab的藥物組成物。

在一些情況下，抗TSLP Fab或其藥物組成物可以根據前述治療方法/醫學用途以足以產生治療效果的量投與至人或其他動物。

在一些情況下，抗TSLP Fab或其藥物組成物可以按常規劑型投與至這樣的人或其他動物，該劑型藉由根據已知技術將抗TSLP Fab與常規藥學上可接受的載劑或稀釋劑組合來製備。

熟悉該項技術者應認識到，藥學上可接受的載體或稀釋劑的形式和特徵藉由與其組合的活性成分的量、投與途徑以及其他熟知變數來確定。

在一些情況下，藥物組成物被配製為包含藥學上可接受的、無毒性的、無菌的載體，諸如生理鹽水、無毒性的緩衝劑、防腐劑等。在一些情況下，藥物組成物可以包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液以及乳液。用於本文所揭露的治療方法的適合配製物描述於Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明頓氏藥物科學] (Mack Publishing Co. [麥克出版公司]) 第16版 (1980)。

在一些情況下，抗TSLP Fab或其藥物組成物的投與途徑可為例如口服、腸胃外、吸入或局部。在一些情況下，如本文所用的術語腸胃外包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸或經陰道投與。

在一些情況下，抗TSLP Fab或其藥物組成物可以藉由經鼻氣霧劑或吸入投與。

在一些情況下，可以將用於製備所述藥物組成物的如本文所述之組分以套組的形式包裝和出售。在一些情況下，這樣的套組將具有標籤或包裝說明書以指示相關藥物組成物可用於治療患有或傾向於患有疾病或障礙的受試者。 實例 實例 1

在4°C或45°C下在1 x PBS中對特折魯單抗進行穩定性研究。將包含1 mg/ml特折魯單抗的溶液在每種條件下儲存兩週。

結果顯示在D-PBS中在45°C下2週後觀察到10%的單體損失（圖1）。藉由定量HP-SEC層析圖的曲線下面積（AUC）來計算單體損失%，聚集體%和片段化%。基於洗脫體積將峰指定為單體、聚集體或片段化產物。可以使用設置有HP SEC分析軟體的標準分析工具計算AUC。

構建包含特折魯單抗重和輕互補決定區（CDR）的Fab，該Fab在CH1結構域中具有多個突變。此Fab在本文中稱為Fab 1。如上文所述針對特折魯單抗分析Fab 1穩定性。結果示於圖2中。

令人驚訝的是，當以0.8 mg/ml儲存兩週時，Fab 1在加速穩定性研究條件（1 x PBS，在45°C）下顯示出改善的穩定性特性。 實例 2 - Fab ₁ 與具有 pM 親和力的人和食蟹猴 TSLP 結合 藉由BIAcore確定Fab ₁與TSLP結合的親和力

使用Biacore 8K SPR儀器（通用醫療集團（GE Healthcare），小查爾方特（Little Chalfont），英國巴克斯）確定Fab 1對表現重組哺乳動物細胞的人和食蟹猴TSLP的特異性和親和力。

S系列C1生物傳感晶片、胺偶合套組、基於hepes緩衝鹽水的緩衝液和再生緩衝液均獲得自通用醫療集團，並根據製造商的說明書來使用。使用凍乾的鏈黴親和素（用D-PBS重構）來製備鏈黴親和素表面。簡而言之，將鏈黴親和素在10 mM乙酸鈉（pH 4.5）中稀釋至4 μg mL-1，並藉由標準胺偶合方法共價固定至S系列C1生物傳感晶片的三個流通池表面。實現了170個回應單位（RU）的最終鏈黴親和素表面。胺偶合試劑還用於製備對照空白表面（沒有固定的鏈黴親和素），以用作每個流通池內的參考表面。然後將N-末端標記的生物素化TSLP（人和食蟹猴）滴定到每個鏈黴親和素表面上，以使 ＜ 100 RU的Fab1在飽和狀態下結合（Rmax）。低水平的分析物結合確保了質量轉移誘導的假像最小化，尤其是與在動力學測量步驟期間使用的相對較快的50 μL min-1測定流速組合時。以50 μL min-1測定流速注入單體化（monomerized）Fab1的稀釋液（多循環動力學）（在HBS-EP + 緩衝液中2倍稀釋，範圍在1.25至20 nM之間），締合2分鐘，並且解離10分鐘。在整個實驗中，在相同條件下進行多次僅緩衝液注射，以允許對最終傳感圖集進行雙重參考處理。

晶片表面藉由流動兩個30秒的10 mM甘胺酸（pH 1.7）的脈衝完全再生。使用1 : 1朗繆爾（Langmuir）模型確定結合親和力和動力學。

表1中所示的結果證明，Fab ₁以相似親和力（2倍以內；分別為46 pM和88 pM）與固定的人和食蟹猴TSLP結合。 [ 表 1] 使用 BIAcore 的 Fab 1 對人和食蟹猴 TSLP 的親和力

分析物	k a （ M -1s -1 ）	k d （ s -1 ）	K D （ pM ）
人TSLP	2.39 E6	1.11 E-4	46.3
食蟹猴TSLP	1.75 E6	1.55 E-4	88.4

藉由動力學排除測定（KinExA）確定結合親和力。

還使用KinExA 3200儀器（美國愛達荷州博伊西的薩皮蒂尼儀器公司（Sapidyne Instruments））來確定Fab 1對人和食蟹猴TSLP的溶液相結合親和力（K _D），並使用KinExA Pro軟體版本4.1.11處理所得數據。已經綜述了KinExA方法（Darling和Brault, 2004）。

將Fab 1與不同濃度的每種人和食蟹猴TSLP預混合，直到達到平衡（使用2倍系列稀釋法來製備至少12個濃度的每種人和食蟹猴TSLP）。然後使用KinExA儀器，藉由用人TSLP包被的珠粒捕獲游離Fab、洗去未結合的物質、並且用商業的物種特異性抗體（Alexa Fluor 647標記的小鼠抗人重鏈和輕鏈特異性抗體（傑克遜免疫研究公司（Jackson Immunoresearch）209-605-088））來螢光檢測結合的Fab 1，從而測量游離Fab 1的量。藉由總體1 : 1擬合將Fab 1對人TSLP的K _D提取到三個數據集，這三個數據集衍生自人TSLP滴定成1000 pM（實心菱形）、500 pM（倒置實心三角形）或40 pM（空心正方形）固定Fab ₁濃度溶液（圖3）。藉由總體1 : 1擬合將Fab 1對食蟹猴TSLP的K _D提取到兩個數據集，這兩個數據集衍生自食蟹猴TSLP滴定成1000 pM（實心菱形）或40 pM（空心正方形）固定Fab ₁濃度溶液（圖4）。

將在每種人和食蟹猴TSLP濃度下檢測到的游離Fab 1的量對TSLP的滴定濃度作圖（分別為圖3和4）。KinExA軟體用於計算平衡解離常數（KD）。表2中所示的結果證明，在游離溶液中Fab ₁與人TSLP結合的親和力比其與食蟹猴TSLP結合的親和力高1.7倍。 [ 表 2] 使用 KinExA 的 Fab ₁ 對人和食蟹猴 TSLP 的可溶相親和力

配體	親和力（ K D ） pM
人TSLP	8.0（95%信賴區間6.27-10.01 pM）
食蟹猴TSLP	13.6（95%信賴區間9.07-19.22 pM）

實例 3-Fab1 和特折魯單抗以相似結合特徵與 TSLP 結合

將Fab 1與人TSLP的結合特徵直接與特折魯單抗進行比較。

使用基於均相螢光共振能量轉移（FRET）均相時間分辨螢光（HTRF®，Cis生物國際公司（Cisbio International））的TSLP:mAb結合測定來測定Fab 1的體外結合效力。鏈黴親和素穴狀化合物用於檢測生物素化的TSLP。簡而言之，將未標記的Fab 1的樣本滴定到HTRF測定中，以與DyLight標記的特折魯單抗競爭與生物素化的His-Avi人TSLP的結合。還使用未標記的特折魯單抗和DyLight標記的特折魯單抗（作為陽性對照）進行了競爭測定。

結果表明，Fab 1與特折魯單抗競爭與人TSLP的結合，並以與特折魯單抗相似的效力與人TSLP結合（IC50: Fab ₁- 0.38 nM；特折魯單抗 - 0.23 nM - 圖5）。 實例 4- 在周邊血單核細胞（ PBMC ）測定中 Fab 1 中和 TSLP 活性

接下來，藉由在用Fab 1治療後測量TSLP誘導的從PBMC的CCL17釋放來確定Fab 1與TSLP的結合在原代細胞測定中是否具有功能性阻斷活性。

根據英國劍橋米迪繆尼有限公司（MedImmune）建立的獻血者程序，從健康供體獲取血液。藉由標準程序使用ficoll梯度分離周邊血單核細胞。簡而言之，將20 ml用PBS稀釋的血液（10 ml血液 : 30 ml PBS）鋪層在15 ml ficoll上。將管在室溫下以400 g旋轉40 min，無制動。收集PBMC層，並用50 ml PBS洗滌細胞兩次。將PBMC用血球計數器和錐蟲藍進行計數以排除死細胞，然後重懸於培養基（含10%胎牛血清和1%青黴素/鏈黴素的RPMI）中，然後鋪板到96孔板中。在TSLP結合抗體片段Fab ₁的存在下，用TSLP（0.5 ng/ml）刺激細胞48 h。還使用TSLP結合抗體特折魯單抗（作為陽性對照）進行測定。48 h後，根據製造商的方案，去除上清液並使用R&D duoset ELISA測定CCL17的產生。在三個獨立的實驗中使用六個供體進行實驗。

結果表明，Fab 1抑制了從PBMC產生CCL17，其中IC ₅₀為1.39 nM（圖6）。 序列

SEQ ID NO:1（Fab 1重鏈）

SEQ ID NO:2（Fab 1輕鏈）

無

[ 圖 1]示出了在4°C（A）和45°C（B）下在1 x PBS中的約1 mg/ml特折魯單抗的2週加速穩定性測定。該圖示出了在每個溫度下孵育指定時間後特折魯單抗的HP-SEC跡線。表（C）指定了特折魯單抗的單體損失%和聚集體形成%，以及IgG1同型對照NIP228的結果。

[ 圖 2]示出了在4°C（A）和45°C（B）下在1 x PBS中的約0.8 mg/ml Fab 1的2週加速穩定性測定。該圖示出了在每個溫度下孵育指定時間後Fab 1的HP-SEC跡線。表（C）指定了Fab 1的單體損失%和聚集體形成%，以及Fab同型對照R347的結果。

[ 圖 3]示出了如藉由KinExA所測量的與人TSLP結合的Fab 1。

[ 圖 4]示出了如藉由KinExA所測量的與食蟹猴TSLP結合的Fab ₁。

[ 圖 5]示出了如使用HTRF測定所測量的Fab 1與人TSLP的競爭性結合。

[ 圖 6]示出了Fab 1抑制由TSLP激發的從PBMC的CCL17釋放。

無


          <![CDATA[<110>  英商梅迪繆思有限公司（MEDIMMUNE LIMITED）]]>
          <![CDATA[<120>  具有改善的穩定性的抗TSLP FAB]]>
          <![CDATA[<130>  008231433]]>
          <![CDATA[<140>  111114769]]>
          <![CDATA[<141>  2022-04-19]]>
          <![CDATA[<150>  EP 21169183.7]]>
          <![CDATA[<151>  2021-04-19]]>
          <![CDATA[<160>  2     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  227]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  FAB1重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ala Pro Gln Trp Glu Leu Val His Glu Ala Phe Asp Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys 
          225         
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  FAB1輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Leu Gly Ser Lys Ser Val 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Trp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Gly Glu Ala Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 
                          85                  90                  95      
          Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 
                      100                 105                 110         
          Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 
              130                 135                 140                 
          Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 
                  195                 200                 205             
          Ala Pro Thr Glu Cys Ser 
              210                 
          

Claims (16)

1. 一種Fab，其包含含有SEQ ID NO:1中列出的胺基酸序列的重鏈和含有SEQ ID NO:2中列出的胺基酸序列的輕鏈。
2. 一種Fab，其包含具有SEQ ID NO:1中列出的胺基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:2中列出的胺基酸序列的輕鏈。
3. 一種Fab，其包含由SEQ ID NO:1中列出的胺基酸序列組成的重鏈和由SEQ ID NO:2中列出的胺基酸序列組成的輕鏈。
4. 如請求項1至3中任一項所述之Fab，其中該Fab係IgG1 Fab。
5. 如請求項1至4中任一項所述之Fab，其中該Fab在45°C下穩定至少兩週的時間。
6. 如請求項5所述之Fab，其中該Fab在1 X PBS中在0.8 mg/ml的濃度下穩定。
7. 如任一項前述請求項所述之Fab，其中在45°C下在1 X PBS中孵育2週後，該Fab顯示小於10%的單體損失，其中藉由HP-SEC確定單體。
8. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至7中任一項所述之Fab。
9. 一種核酸，其編碼如請求項1至7中任一項所述之Fab。
10. 一種載體，其包含如請求項9所述之核酸。
11. 一種宿主細胞，其包含如請求項9所述之核酸或如請求項10所述之載體。
12. 一種產生如請求項1至7中任一項所述之Fab之方法，該方法包括培養如請求項7所述之宿主細胞，表現該Fab並純化該Fab。
13. 一種Fab，其可獲得自如請求項12的方法。
14. 如請求項1至7中任一項所述之Fab，用於在療法中使用。
15. 如請求項1至7中任一項所述之Fab，用於在TSLP相關的病症的治療中使用。
16. 用於如請求項15所述使用的Fab，其中該TSLP相關的病症係氣喘。

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